CN110184292B - 一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法 - Google Patents

一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法，属于抗体工程技术领域。本发明采用一种新型三启动子Fab表面展示载体来共表达内质网分子伴侣蛋白Pdi或Kar2和Infliximab的VH‑CH1以及VL‑CL两个结构域。其中VH‑CH1和VL‑CL两个结构域通过氨基端的内质网定位信号肽定位在内质网内组装成天然Fab形式片段，再通过Aga1‑Aga2酵母细胞展示系统展示到细胞表面。本发明通过共表达内质网分子伴侣蛋白Pdi或Kar2，促进了Infliximab Fab片段的VH‑CH1和VL‑CL两个结构域在内质网内的折叠组装效率，明显提高了酵母细胞表面展示Infliximab Fab片段的抗原结合能力。

Description

一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法
技术领域
本发明涉及一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法，属于抗体工程技术领域。
背景技术
单克隆抗体是目前最具有经济价值的生物治疗药物之一，被广泛用于治疗病毒感染、免疫疾病和癌症等。酵母细胞表面展示技术因是真核表达宿主，并且可以结合流式细胞仪的高通量筛选技术等优势，被广泛用于多种形式的抗体文库的改造和筛选。目前抗体酵母展示片段主要有两种形式，包括scFv和Fab。ScFv是由抗体重链和轻链可变区通过15-20个氨基酸短肽连接而成的具有抗体活性的最小功能结构。而Fab是由重链的VH-CH1结构域与完整的轻链VL-CL通过分子内的二硫键连接组成的抗原结合片段。Fab结构相比于scFv更稳定，更接近成熟的抗体形式，从而对抗原有较高的亲和力。
目前利用Aga1-Aga2酵母细胞展示系统产生Fab片段的方法主要有以下两种：(1)酵母双杂交法：将Fab的重链VH-CH1结构域和完整的轻链分别构建在两个酵母表达质粒上，再分别转入酵母两个单倍体细胞中，通过酵母杂交使两条链在体内组装最终将完整的Fab展示到细胞表面[Weaver-Feldhaus J.M.et al.,“Yeast mating for combinatorial Fablibrary generation and surface display”,FEBS letters,2004,564(1-2):24-34]；(2)将Fab的重链VH-CH1结构域和完整的轻链分别构建在酵母表达质粒的双启动子的下游，再将构建好的质粒转入酵母细胞诱导表达，在体内组装成完整的Fab最后展示到细胞表面[Sivelle C.et al.,“Fab is the most efficient format to express functionalantibodies by yeast surface display”,mAbs,2018,10(5):720-729]。上述两种方法虽然都能达到Fab片段在酵母细胞表面展示的目的，但也存在不足之处。方法1操作繁琐，需要构建两套酵母质粒和表达体系，细胞杂交效率低的情况下会降低Fab的展示效率；方法2虽然操作简易，但是由于Fab的VH-CH1结构域和VL-CL结构域在内质网内的折叠和组装时间不足或效率不够，可能导致二硫键等形成不足，从而存在细胞表面展示的功能性Fab效率偏低问题。因此，对于Fab酵母细胞表面展示方法，特别是稳定性差和低活性的Fab展示方法，需要进一步优化，以提高功能性的Fab展示。
肿瘤坏死因子(TumorNecrosis Factor，TNF-α)是一种促炎症细胞因子，在炎症、自身免疫疾病和肿瘤发生中起着重要作用。目前针对TNF-α引起的疾病治疗主要是抗体药物，包括Adalimumab，Infliximab和Etanercept等[Taylor,P.C.,“Anti-TNFalpha therapyfor rheumatoid arthritis:an update”,Intern.med.,2003,42(1):15-20]。其中Infliximab是Johnson&Johnson公司开发的针对TNF-α的单抗药物，2017年销售额为82亿美元。最近Sivelle等人利用两个GAL1启动子同时表达Infliximab的VH-CH1结构域和VL-CL结构域，并在内质网内折叠组装后将完整的Fab片段展示到酵母细胞表面，但是发现Infliximab的功能性Fab酵母展示效率相对较弱[Sivelle C.,Sierocki R.,Ferreira-Pinto K.,et al.,“Fab is the most efficient format to express functionalantibodies by yeast surface display”,mAbs,2018,10(5):720-9]，这可能与Fab的VH-CH1结构域和VL-CL结构域在内质网内的有效组装和折叠不充分有关。因此，如何有效促进功能性Fab片段的酵母细胞表面展示，这是目前亟需解决的问题。
发明内容
鉴于现有技术的不足，功能性Fab片段的酵母细胞表面展示效率较低与其重链的VH-CH1结构域和L链在内质网内的有效组装和折叠有关。由于分子伴侣蛋白能够协助新合成的蛋白质多肽链进行正确的折叠并防止它们的聚集，从而维持蛋白质进行功能性的表达和分泌[Hartl F.U.,Hayer-Hartl M.,“Molecular chaperones in the cytosol:fromnascent chain to foldedprotein”,Science,2002,295(5561):1852-1858]。因此，本发明目的是提供一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示Fab片段抗原结合能力的重组载体。
为了实现本发明的目的，本发明人设计了一种三启动子的Fab表面展示载体pFab-2，来共表达内质网分子伴侣蛋白和Fab片段，从而促进Fab片段在酵母内质网内的有效组装和折叠。具体地，本发明利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法的技术方案概况如下：
一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法，其采用一种三启动子的Fab表面展示重组载体，来共表达内质网分子伴侣蛋白和Fab片段，该重组载体的结构为pESE-GAL1-ERMC---HA-CL-VL-GAL1-GAL10-VH-CH1-FLAG-Aga2，所述的ERMC为内质网分子伴侣，所述的HA或FLAG为荧光抗体标签，所述的GAL1-GAL10为控制Fab两条链表达的双向启动子，所述的Aga2为酵母细胞表面展示蛋白。
进一步优选地，如上所述利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性InfliximabFab片段的方法，其中的内质网分子伴侣选自Pdi1或Kar2。
进一步优选地，如上所述利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性InfliximabFab片段的方法，其中的内质网分子伴侣由单独的GAL1启动子控制表达。
进一步优选地，如上所述利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性InfliximabFab片段的方法，其中的重组载体的序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
需要说明的是，pFab-2载体的构建可以采用如下方法步骤：
1)采用PCR克隆方法得到酿酒酵母分子伴侣蛋白的基因片段；
2)将步骤1)获得的PCR产物回收后，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，再与经同样双酶切的pESE载体酶连，酶连产物转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落PCR验证和测序确认后得到重组质粒pESE-GAL1-ERMC；
3)采用PCR克隆方法得到Infliximab的VH-CH1-FLAG-Aga2复合体的基因片段；
4)将步骤3)获得的VH-CH1-FLAG-Aga2复合体的PCR产物回收后，用PstⅠ和BamHⅠ双酶切和琼脂糖凝胶回收后，再分别与经同样双酶切的pESE-GAL1-ERMC载体酶连，酶连产物转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落PCR验证和测序确认后得到含Infliximab VH-CH1基因的重组质粒pESE-GAL1-ERMC---GAL10-VH-CH1-FLAG-Aga2；
5)采用PCR克隆方法得到Infliximab的VL-CL-HA复合体的基因片段。
6)将步骤5)获得的VL-CL-HA复合体的PCR产物回收后，用SalⅠ和NdeⅠ双酶切和琼脂糖凝胶回收后，再分别与经同样双酶切的步骤4)得到的重组质粒酶连，酶连产物转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落PCR验证和测序确认后得到重组质粒pESE-GAL1-ERMC---HA-CL-VL-GAL1-GAL10-VH-CH1-FLAG-Aga2。
与现有技术相比，本发明利用一种新型三启动子的Fab表面展示载体来共表达内质网分子伴侣蛋白Pdi或Kar2和Infliximab的Fab片段，促进了Fab片段的VH-CH1和VL-CL两个结构在内质网中的折叠组装效率，明显提高了酵母细胞表面展示Fab片段的抗原结合能力(图2)。当共表达分子伴侣Pdi或Kar2时，Infliximab的Fab片段针对TNF-α抗原结合能力分别提高了3.6倍或2.6倍，提高了Infliximab Fab片段在酵母细胞表面的功能性展示。而共表达分子伴侣Lhs1时，Infliximab的Fab片段针对TNF-α抗原结合能力却没有发生变化。总之，本发明利用共表达分子伴侣Pdi或Kar2的Fab展示方法更适用于低表达和低活性的功能性Fab酵母细胞表面展示，为抗体工程中Fab的改造方法提供了一种优化策略。
附图说明
图1：重组质粒pFab-2的构建流程图；
图2：分子伴侣共表达对酵母细胞表面展示的Fab片段结合TNF-α能力的影响。A：重组质粒pFab-2，分子伴侣Kar2、Pdi1、Lhs1由单独的GAL1启动子控制表达。B：将含有分子伴侣Kar2、Pdi1、Lhs1的Infiximab Fab展示载体分别转入酵母细胞诱导表达，再使用0.1nM 6×His-TNF-α反应，最后利用Anti-6×His-iFluor 647荧光抗体标记和流式细胞仪检测分子伴侣Kar2、Pdi1、Lhs1共表达时不同Infiximab Fab片段的TNF-α结合能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神下可以对技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
另外，以下实施例利用本发明含有分子伴侣的质粒pFab-2，构建基因工程菌进行Fab酵母细胞表面展示以及活性检测的方法，具体步骤如下：
1)将上述构建好的pFab-2质粒通过化学转化法转入酿酒酵EBY100(URA+,leu-,trp-)感受态细胞中，涂布YNB-CAA-Glucose平板；
2)将上述酵母转化子接种于YNB-CAA-Glucose液体培养基中，于30℃过夜培养至OD600为3.0-4.0，换YNB-CAA-Galactose培养液诱导，起始OD600为0.8，于18℃诱导48h；
3)每个样品取两份，一份用于Fab展示效率检测，另一份用于活性检测。分别取106个酵母细胞，先用溶液A洗一次，再用溶液B洗一次，4℃，3000rpm，离心2min。将其中一份用于Fab活性检测的细胞与不同浓度的6×His-TNF-α于25℃孵育30min，再用溶液B洗两次，最后用荧光抗体Anti-6×His-iFluor 647(GenScript公司，0.5μg/μl)标记。将另外一份用于Fab展示效率检测的细胞直接与荧光抗体Anti-HA-FITC(GenScript公司，0.5μg/μl)标记。
4)将标记好的细胞于3000rpm，离心2min，去掉上清。再用溶液B洗一次，最后用1×PBS重悬细胞，重悬的细胞用于CytoFLEX流式细胞仪分析，检测的荧光信号通道分别为525/40nm(FITC)波长通道和660/20nm(iFluor 647)波长通道。
所述培养基及洗细胞溶液组成成分如下：
YNB-CAA-Glucose：20g/L葡萄糖,6.7g/L YNB,5.4g/L Na2HPO4,8.6g/L NaH2PO4·H2O,5g/L casamino acids,pH7.4；
YNB-CAA-Galactose：20g/L半乳糖,6.7g/L YNB,5.4g/L Na2HPO4,8.6g/LNaH2PO4·H2O,5g/L casamino acids,pH7.4；
溶液A：1X PBS，0.5％BSA，1mM EDTA，pH7.4；
溶液B：1X PBS，0.5％BSA，pH7.4。
实施例1：含质粒pFab-2的基因工程菌构建
采用PCR克隆方法得到酿酒酵母EBY100的分子伴侣PDI1、KAR2、LHS1的基因片段；
PCR反应体系：10×KOD buffer，5μl；dNTP(2.5mM)，4μl；引物F(10μM)，3μl；引物R(10μM)，3μl；Pfu聚合酶，2μl；模板，1μl；加ddH2O至50μl。PCR扩增体系：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，25个循环；72℃，5min；12℃，10min；
将上述获得的分子伴侣的PCR产物分别用0.8％的琼脂糖凝胶回收后，用EcoRⅠ和XhoⅠ，酶切体系为：XhoⅠ，1μl；EcoRⅠ，1μl；10×Cutsmart buffer，5μl；PCR回收产物，30μl，加ddH2O至50μl。37℃酶切5h后，用0.8％的琼脂糖凝胶回收；
再与经过限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后的pESE载体酶连。酶连体系为：酶切片段，1.2μl；酶切载体，0.3μl；T4DNA连接酶缓冲液(NEB公司)，1μl；T4DNA连接酶(NEB公司)，0.3μl；加ddH2O至10μl，于22℃酶连1h。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD(Invitrogen公司)感受态细胞中，经菌落PCR验证和测序确认后得到重组质粒pESE-GAL1-ERMC；
采用PCR克隆方法得到Infliximab的VH-CH1-FLAG-Aga2和VL-CL-HA复合体的基因片段；
PCR反应体系：10×KOD buffer，5μl；dNTP(2.5mM)，4μl；引物F(10μM)，3μl；引物R(10μM)，3μl；Pfu聚合酶，2μl；模板，1μl；加ddH2O至50μl。PCR扩增体系：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，25个循环；72℃，5min；12℃，10min；
将上述获得的VH-CH1-FLAG-Aga2复合体的PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶回收后，用限制性内切酶PstⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切体系为：PstⅠ，1μl；BamHⅠ，1μl；10×Cutsmartbuffer，5μl；PCR回收产物，30μl，加ddH2O至50μl。37℃酶切5h后，用0.8％的琼脂糖凝胶回收；
再分别与经过限制性核酸内切酶PstⅠ和BamHⅠ双酶切后的pESE-GAL1-PDI1和pESE-GAL1-KAR2载体酶连。酶连体系为：酶切片段，1.2μl；酶切载体，0.3μl；T4DNA连接酶缓冲液(NEB公司)，1μl；T4DNA连接酶(NEB公司)，0.3μl；加ddH2O至10μl，于22℃酶连1h。酶连产物直接转化到大肠杆菌XL-GOLD(Invitrogen公司)感受态细胞中，经菌落PCR验证和测序确认后得到含Infliximab的VH-CH1基因的重组质粒pESE-GAL1-ERMC---GAL10-VH-CH1-FLAG-Aga2；
将上述获得的VL-CL-HA-ERS复合体的PCR产物回收后，用SalⅠ和NdeⅠ双酶切和琼脂糖凝胶回收后，再与经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切和琼脂糖凝胶回收的pESE-GAL1-ERMC---GAL10-VH-CH1-FLAG-Aga2载体酶连。酶连产物转化到大肠杆菌XL-GOLD感受态细胞中，经菌落PCR验证和测序确认后得到重组质粒pFab-2(pESE-GAL1-ERMC---HA-CL-VL-GAL1-GAL10-VH-CH1-FLAG-Aga2)；
将构建好的重组质粒pFab-2，通过化学转化法转入酿酒酵母EBY100(URA+,leu-,trp-)中，然后涂布于YNB-CAA-Glucose平板，于30℃培养3-4天。
实施例2：含质粒pFab-2的基因工程菌的Fab诱导表达
将实施例1转化有pFab-2质粒的酵母转化子接种于YNB-CAA-Glucose液体培养基中，于30℃过夜培养至OD600为3.0-4.0，换YNB-CAA-Galactose培养液诱导，起始OD600为0.8，于18℃诱导48h。
实施例3：含质粒pFab-2的基因工程菌的Fab酵母细胞表面展示效率以及活性检测
将实施例2中诱导好的酵母细胞，每个样品取两份，一份用于Fab展示效率检测，另一份用于活性检测。分别取106个酵母细胞，先用溶液A洗一次，再用溶液B洗一次，4℃，3000rpm，离心2min。将其中一份用于Fab活性检测的细胞分别与不同浓度的6×His-TNF-α(大肠杆菌表达纯化)于25℃孵育30min，再用溶液B洗两次，最后用20μl溶液B和0.15μl荧光抗体Anti-6×His-iFluor 647重悬。将另外一份用于Fab展示效率检测的细胞直接与20μl溶液B和0.15μl荧光抗体Anti-HA-FITC重悬。将重悬好的细胞先置于4℃min，再室温放置30min，整个过程避光操作。
将标记好的细胞于3000rpm，离心2min，去掉上清。再用溶液B洗一次，最后用400μl1×PBS重悬细胞，重悬的细胞用于CytoFLEX流式细胞仪分析，检测的荧光信号通道分别为525/40nm(FITC)波长通道和660/20nm(iFluor 647)波长通道。试验结果参见图2所示。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10568
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga 60
taataatggt ttcttaggac ggatcgcttg cctgtaactt acacgcgcct cgtatctttt 120
aatgatggaa taatttggga atttactctg tgtttattta tttttatgtt ttgtatttgg 180
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gagcgcacga gggagcttcc aggggggaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 2280
cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcc gagcctatgg 2340
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tattgaattt tcaaaaattc ttactttttt tttggatgga cgcaaagaag tttaataatc 3000
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actgactc 10568
<210> 2
<211> 11048
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ccgtaaacaa catgttttcc catgtaatat ccttttctat ttttcgttcc gttaccaact 5820
ttacacatac tttatatagc tattcacttc tatacactaa aaaactaaga caattttaat 5880
tttgctgcct gccatatttc aatttgttat aaattcctat aatttatcct attagtagct 5940
aaaaaaagat gaatgtgaat cgaatcctaa gagaattgag ctccaattcg ccctatagtg 6000
agtcgtatta caattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 6060
ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccccttcgc cagctggcgt aatagcgaag 6120
aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcgacg 6180
cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 6240
cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 6300
tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 6360
ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 6420
cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 6480
tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 6540
ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 6600
cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcctgatg cggtattttc tccttacgca 6660
tctgtgcggt atttcacacc gcaggcaagt gcacaaacaa tacttaaata aatactactc 6720
agtaataacc tatttcttag catttttgac gaaatttgct attttgttag agtcttttac 6780
accatttgtc tccacacctc cgcttacatc aacaccaata acgccattta atctaagcgc 6840
atcaccaaca ttttctggcg tcagtccacc agctaacata aaatgtaagc tttcggggct 6900
ctcttgcctt ccaacccagt cagaaatcga gttccaatcc aaaagttcac ctgtcccacc 6960
tgcttctgaa tcaaacaagg gaataaacga atgaggtttc tgtgaagctg cactgagtag 7020
tatgttgcag tcttttggaa atacgagtct tttaataact ggcaaaccga ggaactcttg 7080
gtattcttgc cacgactcat ctccatgcag ttggacgata tcaatgccgt aatcattgac 7140
cagagccaaa acatcctcct taggttgatt acgaaacacg ccaaccaagt atttcggagt 7200
gcctgaacta tttttatatg cttttacaag acttgaaatt ttccttgcaa taaccgggtc 7260
aattgttctc tttctattgg gcacacatat aatacccagc aagtcagcat cggaatctag 7320
agcacattct gcggcctctg tgctctgcaa gccgcaaact ttcaccaatg gaccagaact 7380
acctgtgaaa ttaataacag acatactcca agctgccttt gtgtgcttaa tcacgtatac 7440
tcacgtgctc aatagtcacc aatgccctcc ctcttggccc tctccttttc ttttttcgac 7500
cgaattaatt cttaatcggc aaaaaaagaa aagctccgga tcaagattgt acgtaaggtg 7560
acaagctatt tttcaataaa gaatatcttc cactactgcc atctggcgtc ataactgcaa 7620
agtacacata tattacgatg ctgtctatta aatgcttcct atattatata tatagtaatg 7680
tcgtttatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg 7740
acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg gggccatccg 7800
cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat 7860
cacccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta 7920
cgccagctga attggagcga cctcatgcta tacctgagaa agcaacctga cctacaggaa 7980
agagttactc aagaataaga attttcgttt taaaacctaa gagtcacttt aaaatttgta 8040
tacacttatt ttttttataa cttatttaat aataaaaatc ataaatcata agaaattcgc 8100
ttatttagaa gtgtcaacaa cgtatctacc aacgatttga cccttttcca tcttttcgta 8160
aatttctggc aaggtagaca agccgacaac cttgattgga gacttgacca aacctctggc 8220
gaagaattgt taattaagga tccgagctca aaaaacatac tgtgtgttta tggggctgcc 8280
tttgctagtt gttgaggggt gagaaccgca attactgaca aacgttactg atttgtaata 8340
ttcaaaaact ccttgcattg ccttcccgtt ggccaaaata gtagtcgttg acaaagagta 8400
cggcgtcgat tctaaagttg gtgaggggat ttgctcgcat atagttgtca gttcctgcga 8460
ccctccgcct ccgctaccgc ctccaccaga gcctcctcca cctttatcgt cgtcatcttt 8520
ataatcactg ccactacccg tcttgtcaca tgattttggc tctacttttt tatctacctt 8580
cgtatttgaa ggtttatgat ttacattaca tatataggtt tgagttccta agctggatga 8640
cggtacagtg acaacagaag ataatgaata caacccggaa gattgcagga cagcggggaa 8700
cgtgtgtacc ccacttgtca aagcaccgct gttccagcta accgtaacag gctcggggaa 8760
gtaatctttc accaaacagc caagggcagc agtcccaccg gatgtactct tggaagaggg 8820
cgccagcggg aaaactgatg gacccttcgt gcttgcagaa ctaactgtta gtgttgtccc 8880
ttgcccccag tagtcgtatg tagaaccgta gtaatttcta ctacagtagt acactcctgt 8940
atcctcggtc ctcaggtccg tcatctgaag gtacaccgca gattttgagt cgtccctgga 9000
gattgtgaac cttcccttaa cagattcggc ataatgagta gcagagttaa tacttttaga 9060
cctaatttcc gcaacccatt ccaacccctt ctccgggctc tgcctgaccc agttcatcca 9120
gtgattggag aatatgaaac cagatgcaac gcatgataat ttcattgagc cccctggctg 9180
aacaagtccg ccgccactct cttctaattt tacctctgct aaaactgaag caataacaga 9240
aaatattgaa aaacagcgaa gtaactgcat cgatgctagc ctgcagacta gtgcggccgc 9300
cctttagtga gggttgaatt ttcaaaaatt cttacttttt ttttggatgg acgcaaagaa 9360
gtttaataat catattacat ggcattacca ccatatacat atccatatac atatccatat 9420
ctaatcttac ttatatgttg tggaaatgta aagagcccca ttatcttagc ctaaaaaaac 9480
cttctctttg gaactttcag taatacgctt aactgctcat tgctatattg aagtacggat 9540
tagaagccgc cgagcgggcg acagccctcc gaaggaagac tctcctccgt gcgtcctcgt 9600
ctcaccggtc gcgttcctga aacgcagatg tgcctcgcgc cgcactgctc cgaacaataa 9660
agattctaca atactagctt ttatggttat gaagaggaaa aattggcagt aacctggccc 9720
cacaaacctt caaatgaacg aatcaaatta acaaccatag gatgataatg cgattagttt 9780
tttagcctta tttctggggt aattaatcag cgaagcgatg atttttgatc tattaacaga 9840
tatataaatg caaaaactgc ataaccactt taactaatac tttcaacatt ttcggtttgt 9900
attacttctt attcaaatgt aataaaagta tcaacaaaaa aattgttaat atacctctat 9960
actttaacgt caaggagaaa aaccccgtaa tacgactcac tatagggccc gggcgtcgac 10020
atgcaacttt tgagatgctt cagtattttc agcgtcatcg ccagtgtgct ggccgatatt 10080
ttattgacac aaagcccagc gatcctaagt gttagtccag gtgagagagt ttcctttagt 10140
tgtcgtgcgt cacagtttgt tgggagtagt atccactggt atcagcaaag aaccaacggg 10200
tctcctagac ttctgataaa gtacgccagc gagtctatga gtgggatacc atctcgtttt 10260
agcgggtctg gctctggtac ggacttcaca ttatccatca acaccgttga gtcagaagac 10320
atcgctgatt actattgcca acaatcccat tcatggccgt ttacgtttgg ttcaggcacc 10380
aacctggaag ttaagagaac tgtcgctgcc ccgagtgtat tcatcttccc cccttccgat 10440
gaacaattga agtctggaac cgccagtgtc gtgtgtcttc ttaataactt ctatccgaga 10500
gaagcgaaag tgcaatggaa agttgacaac gcactgcagt ctggcaatag tcaggaatcc 10560
gtcaccgagc aggactccaa agactccacg tactccttat ccagcacttt gactttatcc 10620
aaagcagatt acgaaaaaca caaggtttac gcttgtgagg taacccacca agggttaagt 10680
tcccctgtaa ccaaaagctt caatagagga gaatgcggta gtggcagtta cccatacgac 10740
gttccagact acgcttaagc tcatatgtag atccgctctc taaccgaaaa ggaaggagtt 10800
agacaacctg aagtctaggt ccctatttat ttttttatag ttatgttagt attaagaacg 10860
ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt 10920
atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga agatccagct gcattaatga 10980
atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc 11040
actgactc 11048

Claims (4)

1.一种利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法，其特征在于，该方法采用一种三启动子的Fab表面展示重组载体，来共表达内质网分子伴侣蛋白和Fab片段，所述的Fab表面展示重组载体的结构为pESE-GAL1-ERMC---HA-CL-VL-GAL1-GAL10-VH-CH1-FLAG-Aga2，所述的ERMC为内质网分子伴侣，所述的内质网分子伴侣选自Pdi或Kar2，所述的HA或FLAG为荧光抗体标签，所述的GAL1-GAL10为控制Fab两条链表达的双向启动子，所述的Aga2为酵母细胞表面展示蛋白。
2. 根据权利要求1所述利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法，其特征在于，所述的内质网分子伴侣由单独的GAL1启动子控制表达。
3. 根据权利要求1所述利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性Infliximab Fab片段的方法，其特征在于，所述重组载体的序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。
4. 根据权利要求1或2所述利用分子伴侣提高酵母细胞表面展示功能性InfliximabFab片段的方法，其特征在于，该方法的重组载体构建包括如下步骤：
1）采用PCR克隆方法得到酿酒酵母分子伴侣PDI1、KAR2的基因片段；
2）将步骤1)获得的PCR产物回收后，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，再与经同样双酶切的pESE载体酶连，酶连产物转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落PCR验证和测序确认后得到重组质粒pESE-GAL1-ERMC；
3）采用PCR克隆方法得到Infliximab的VH-CH1-FLAG-Aga2复合体的基因片段；
4）将步骤3）获得的VH-CH1-FLAG-Aga2复合体的PCR产物回收后，用PstⅠ和BamHⅠ双酶切和琼脂糖凝胶回收后，再分别与经同样双酶切的pESE-GAL1-ERMC载体酶连，酶连产物转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落PCR验证和测序确认后得到含Infliximab VH-CH1基因的重组质粒pESE-GAL1-ERMC ---GAL10-VH-CH1-FLAG-Aga2；
5）采用PCR克隆方法得到Infliximab的VL-CL-HA复合体的基因片段；
6）将步骤5）获得的VL-CL-HA复合体的PCR产物回收后，用SalⅠ和NdeⅠ双酶切和琼脂糖凝胶回收后，再分别与经同样双酶切的步骤4）得到的重组质粒酶连，酶连产物转化大肠杆菌感受态细胞，经菌落PCR验证和测序确认后得到重组载体pESE-GAL1-ERMC---HA-CL-VL-GAL1-GAL10-VH-CH1-FLAG-Aga2。
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