CN114395576B

CN114395576B - 一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法

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Publication number: CN114395576B
Application number: CN202210071825.7A
Authority: CN
Inventors: 柳东; 葛士凯; 应汉杰; 王振宇; 曹幸园; 陈勇; 牛欢青; 刘庆国
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2020-08-31
Filing date: 2020-08-31
Publication date: 2023-11-14
Anticipated expiration: 2040-08-31
Also published as: CN111909945A; CN114807194A; CN111909945B; CN114395576A; CN114807194B

Abstract

本发明公开了一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法，将目标蛋白与核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的非经典分泌蛋白融合，在丙酮丁醇梭菌CGMCC No.5234中进行蛋白表达。与现有技术相比，本发明提供了一种全新的方法提高重组蛋白在梭菌中的蛋白表达效率，为优化梭菌中重组蛋白的制备与应用奠定了技术基础。

Description

一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法。

背景技术

梭菌(Clostridium acetobutylicum)属革兰氏阳性菌，作为发酵生产ABE(丙酮-丁醇-乙醇)的传统菌株，目前广泛应用于生物能源的生产工艺研发和代谢工程改造中。在该菌株中利用基因工程手段表达目标蛋白的技术已经非常成熟。在大肠杆菌等模式菌株中，研究者可以通过融合一些熟知的蛋白标签、分子伴侣或者其他辅助蛋白的方法来提高目标蛋白的可溶性、稳定性或表达水平，从而提高目标蛋白的表达效率。但是在梭菌中，以往的研究无论是表达单个蛋白还是表达多个蛋白，其蛋白本身的基因只是被简单地进行独自表达，并没有融合辅助蛋白提高表达效率的报道。

根据实验室前期的研究以及相关文献的报道表明，梭菌具有在很多介质表面形成生物被膜的特性，生物被膜是以胞外蛋白质和多糖等为主体的大分子聚合基质，其形成表明细胞具有大量合成、分泌胞外蛋白质的能力。

大多数分泌到细胞外环境中的蛋白质都包含有信号肽分泌序列，但是在细胞外培养基中仍然存在一部分蛋白质不包含任何已知信号或明显的信号肽分泌序列，例如GroES、GroEL、Dna K、Etf A等都是已报道的不包含信号肽序列的分泌蛋白。并且根据相关的报道证明这些普遍存在于细胞外且不包含信号肽的蛋白质并非是通过细胞裂解而出现在胞外环境中。由于蛋白质从细胞内分泌至细胞外的分泌途径尚不明确，因此该类蛋白质被称为非经典分泌蛋白。

通过对梭菌胞外蛋白质组学分析研究发现，其胞外存在大量的蛋白质，利用SignalP在线分析系统分析，发现仅有少部分的蛋白质包含经典的分泌信号肽，而大多数胞外蛋白质并属于非经典分泌蛋白。本发明通过将非经典分泌蛋白与目标蛋白进行融合表达，可有效地提高目标蛋白在梭菌中的表达效率，进而提升梭菌在工业化生产中的应用价值。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法，即利用基因工程手段将目标蛋白与非经典分泌蛋白融合，在梭菌中进行蛋白表达，以提高目标蛋白在梭菌中的表达效率。

其中，所述的非经典分泌蛋白是指能够存在于细胞外而其编码基因中不含有信号肽序列的蛋白质。本发明中非经典分泌蛋白的分离鉴定方法为：收集梭菌形成的生物被膜(biofilm)，采用专利(中国发明专利ZL 201610580986.3)所述的方法分离出胞外蛋白，或者收集梭菌细胞的培养液，离心后收集含有胞外蛋白的上清液；对所得到的蛋白样品采用蛋白质双向电泳(2D)或蛋白质组学分析技术进行鉴定，最终得到能够存在于细胞外而编码基因中不含信号肽序列的蛋白质。

其中，本发明鉴定的梭菌非经典分泌蛋白质见表3、图1和表4，即所述的非经典分泌蛋白的编码基因位点选自CA_C2703、CA_C3597、CA_C2710、CA_C0709、CA_C2452、CA_C1555、CA_C1747、CA_C3136、CA_C2990、CA_C1834、CA_C3125、CA_C2712、CA_C1807、CA_C3211、CA_P0164、CA_C2704、CA_C3145、CA_C3076、CA_C1281、CA_C1282、CA_C2229、CA_C2641、CA_C3075、CA_C2873、CA_P0165、CA_P0162、CA_C0711、CA_C0940、CA_C1023、CA_C2565、CA_C3083、CA_C0662、CA_C2449、CA_C2575、CA_C0022、CA_C3713、CA_C0568、CA_C3018、CA_C3600、CA_C2658、CA_C2203、CA_C3314、CA_C3334、CA_C1775、CA_C3309或CA_C0827。

其中，所述的编码基因位点均为一段氨基酸序列，可在公共资源库KEGG(https://www.genome.jp/kegg/)或NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行检测。

优选地，所述的非经典分泌蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1～4所示中的任意一种。

其中，氨基酸序列为SEQ ID NO.1～4对应的编码基因位点分别为CA_C3597(赤藓素蛋白)、CA_C2575(赤藓素蛋白)、CA_C2704(GroES)和CA_C2703(GroEL)；前述四种非经典分泌蛋白的含量较大。

其中，所述的目标蛋白为绿色荧光蛋白。

优选地，将绿色荧光蛋白优化后再与非经典分泌蛋白进行融合表达；其中，优化后的绿色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

其中，所述的融合表达为将非经典分泌蛋白融合于目的蛋白的基因序列，并分别置于目标蛋白的N端或C端。

其中，所述的梭菌为丙酮丁醇梭菌；优选地，所述的丙酮丁醇梭菌B3(C.acetobutylicum B3)的保藏编号为CGMCC No.5234，该菌株的信息在申请号为201210075094.X的中国专利中详细公开。

优选地，将绿色荧光蛋白与非经典分泌蛋白融合，得到融合蛋白；所得融合蛋白在丙酮丁醇梭菌中表达，得到重组丙酮丁醇梭菌；其中，所述的非经典分泌蛋白的编码基因位点选自CA_C2703、CA_C3597、CA_C2710、CA_C0709、CA_C2452、CA_C1555、CA_C1747、CA_C3136、CA_C2990、CA_C1834、CA_C3125、CA_C2712、CA_C1807、CA_C3211、CA_P0164、CA_C2704、CA_C3145、CA_C3076、CA_C1281、CA_C1282、CA_C2229、CA_C2641、CA_C3075、CA_C2873、CA_P0165、CA_P0162、CA_C0711、CA_C0940、CA_C1023、CA_C2565、CA_C3083、CA_C0662、CA_C2449、CA_C2575、CA_C0022、CA_C3713、CA_C0568、CA_C3018、CA_C3600、CA_C2658、CA_C2203、CA_C3314、CA_C3334、CA_C1775、CA_C3309或CA_C0827；优选地，所述的非经典分泌蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1～4所示中的任意一种。

其中，所述的重组丙酮丁醇梭菌的构建方法包括如下步骤：构建重组表达质粒，将重组表达质粒甲基化后，电击转化至丙酮丁醇梭菌CGMCC No.5234中，筛选得到构建成功的重组丙酮丁醇梭菌。

具体地，包括如下步骤：

(1)将绿色荧光蛋白优化后克隆至pSY8质粒载体，构建到pSY8-GFP质粒；

(2)提取对数生长中后期的丙酮丁醇梭菌基因组DNA，以其为模板，分别以各非经典分泌蛋白设计得到的引物为上下游引物，进行PCR扩增，得到非经典分泌蛋白N端或C端融合片段的基因序列；

(3)以步骤(1)构建的pSY8-GFP质粒为模板，以SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列为上、下游引物，进行PCR扩增，得到绿色荧光蛋白的基因序列；

(4)以步骤(2)提取的基因组DNA为模板，将步骤(2)和步骤(3)得到的基因序列重叠PCR，得到非经典分泌蛋白-N/C-绿色荧光蛋白的融合片段；

(5)将步骤(4)得到的融合片段纯化后与经Nde I酶切线性化的载体片段连接，并转化至第一大肠杆菌中以扩增质粒，再转化至第二大肠杆菌甲基化；

(6)将步骤(5)构建的甲基化后重组表达质粒电击转化至丙酮丁醇梭菌，即构建得到重组丙酮丁醇梭菌。

步骤(1)中，所述的pSY8质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

步骤(5)中，所述的第一大肠杆菌为E.coli DH5α；所述的第二大肠杆菌为E.coliTop10。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

本发明通过将非经典分泌蛋白与目标蛋白进行融合表达，可有效地提高目标蛋白在梭菌中的表达效率，进而提升梭菌在工业化生产中的应用价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为生物被膜中胞外蛋白质的双向凝胶电泳。其中含有非经典分泌蛋白的是1，预测膜蛋白质(CA_C3309)；2–7，分子伴侣GroEL(CA_C2703)；14-15，电子转移性黄素etfB(CA_C2710)；16-18，果糖二磷酸醛缩酶(CA_C0827)；19-24，赤藓素(CA_C3597)；25-26，分子伴侣GroES(CA_C2704)；27，未知(失败)；28，冷休克蛋白(CA_C2990)；29–30，3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC(CA_C0709)。

图2为相对荧光强度测定结果，其中，WT-B3为C.acetobutylicum B3,B3-GFP为C.acetobutylicum B3-GFP,B3-2575N为C.acetobutylicum B3-2575N-GFP,B3-2575C为C.acetobutylicum B3-2575C-GFP,B3-3597N为C.acetobutylicum B3-3597N-GFP,B3-3597C为C.acetobutylicum B3-3597C-GFP,B3-2703N为C.acetobutylicum B3-2703N-GFP,B3-2703C为C.acetobutylicum B3-2703C-GFP,B3-2704N为C.acetobutylicum B3-2704N-GFP,B3-2704C为C.acetobutylicum B3-2704C-GFP。

图3为365nm紫外灯下的1为B3、2为B3-GFP、3为B3-2575N-GFP、4为B3-2575C-GFP、5为B3-2703N-GFP、6为B3-2703C-GFP、7为B3-3597N-GFP、8为B3-3597C-GFP荧光对比图。

图4为pSY8-2575N-GFP质粒图谱。pSY8-3597N-GFP、pSY8-2703N-GFP、pSY8-2704N-GFP质粒图谱仅与其目的基因不同，其他均一致，故不再作详述。

图5为pSY8-2575C-GFP质粒图谱。pSY8-3597C-GFP、pSY8-2703C-GFP、pSY8-2704C-GFP质粒图谱仅与其目的基因不同，其他均一致，故不再作详述。

具体实施方式

根据下述实施例，本领域的技术人员容易理解。实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

在本发明所述的技术方案为前提进行实施，实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程。下属实施例中所用试剂均可从商业途径获得。

下列实施例以绿色荧光蛋白(GFP)为代表性目标蛋白，以赤藓素蛋白(编码基因为CA_C3597)、赤藓素蛋白(编码基因为CA_C2575)、GroES(编码基因为CA_C2704)、GroEL(编码基因为CA_C2703)为代表性非经典分泌蛋白，详细阐明本发明方法。

下列实施例中所使用的丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum B3)的保藏编号为CGMCC No.5234，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；该菌株的信息在申请号为201210075094.X的中国专利中详细公开。

下列实施例所需培养基如下表1,2所示(常规培养基不作详述)：

表1.P2种子液培养基组分(溶剂为水)

表2.P2发酵培养基组分(溶剂为水)

实施例1：生物被膜中非经典分泌蛋白鉴定

(1)菌株活化：取保藏于-80℃的C.acetobutylicum B3(丙酮丁醇梭菌b3)甘油菌液200μL，于无菌超净工作台中均匀涂布至P2固体平板培养基，置于37℃恒温厌氧环境中静止培养36h后，转接至新鲜的P2固体平板培养基，于37℃恒温厌氧环境中静止培养培养12h。

(2)种子培养：取适量上述已活化的菌泥，于无菌超净工作台中转接至50mL P2液

体种子培养基中，置于37℃恒温厌氧环境中静止培养12h(OD₆₀₀＝2.2)即为种子液，待用。

(3)发酵培养：C.acetobutylicum B3发酵实验所用培养基为P2发酵培养基。发酵实验体系：以100mL蓝盖螺口试剂瓶作为发酵装置，其装液量为50mL，于每发酵装置中添加一块棉毛巾(2cm×3cm)作为载体。于无菌超净工作台中将已培养至OD₆₀₀＝2.2的种子液按照10％的体积比接种至已灭菌的P2发酵培养基中，置于厌氧环境中37℃恒温静止培养。

(4)蛋白质提取：发酵培养48h后，取出棉毛巾载体后，按照专利(中国发明专利ZL201610580986.3)所述的方法分离出梭菌生物被膜中的胞外蛋白。

(5)LC-MS/MS分析：将收集的生物被膜中的胞外蛋白进行LC-MS/MS分析鉴定。利用MASCOT2.3(http://www.matrixscience.com/，MatrixScience,UK)对NCBI-C.acetobutylicum数据库进行蛋白质鉴定。根据蛋白质的相对丰度指数(emPAI)从高到低进行排序，表3列出了生物被膜中的非经典分泌蛋白。

表3.梭菌生物被膜中非经典分泌蛋白质的鉴定

实施例2：蛋白质双向电泳技术鉴定生物被膜中非经典分泌蛋白质

采用实施例1中步骤(4)所得的生物被膜中的胞外蛋白，通过蛋白质双向电泳(2DE)以及质谱分析技术分析鉴定生物被膜中的胞外蛋白。所鉴定出的非经典分泌蛋白见图1。

实施例3：丙酮丁醇梭菌培养上清液中的非经典分泌蛋白鉴定

取实施例1中的梭菌的发酵培养液，进行离心后收集的上清液样品，经质谱分析处理后进行信号肽分析：利用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析系统分析胞外蛋白质是否包具有经典的分泌信号肽序列。表4给出了丙酮丁醇梭菌中培养基上清液中的非经典分泌蛋白，并对其蛋白丰度(emPAI)做了一定比较。

表4.梭菌培养基上清液的非经典分泌蛋白

实施例4：绿色荧光蛋白重组表达质粒的构建

(1)根据相关文献^[1]获得绿色荧光蛋白(GFP)的基因序列，并将其基因序列做密码子优化处理，使其更适合以丙酮丁醇梭菌为宿主表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

(2)步骤(1)所述的优化后的基因序列送至苏州金唯智生物科技有限公司合成，并克隆至pSY8质粒载体(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)上NdeI酶切位点，得到pSY8-GFP质粒；

(3)步骤(2)得到的构建成功的质粒，热激转化至E.coli Top10(含pAN2质粒，该质粒有一个枯草芽抱杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，可实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化)感受态中，具体操作如下所述：20μL质粒与200μLE.coli Top10感受态混合，冰上放置30min；42℃水浴锅中热激90s；冰上放置5min；加入新鲜的LB培养基800μL；37℃，200rpm摇床复苏45min；取复苏后的菌液200μL涂布至含有氨苄青霉素和四环素抗性的LB固体平板培养基(含1.5％琼脂粉)上，37℃静止培养12h；挑取单菌落在LB液体培养基中扩大培养，之后提取质粒，所得质粒即为甲基化质粒。

实施例5：融合蛋白重组表达质粒的构建

(1)采用细菌基因组提取试剂盒(TaKaRa Code：DV810A)提取对数生长中后期的丁醇梭菌C.acetobutyicum B3(CGMCC No.5234)基因组DNA；利用Snap Gene软件，设计合理的PCR扩增引物，其序列如表5所示，其中F代表正向引物，R代表反向引物。

(2)2575N-GFP、3597N-GFP、2703N-GFP、2704N-GFP融合片段的构建：

(i)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，分别以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20所示的核苷酸序列为上、下游引物PCR扩增，获得目标蛋白N端融合片段2575N、3597N、2703N、2704N基因序列；

(ii)以实施例4中所构建的pSY8-GFP质粒为模板，以SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.24所示的核苷酸序列为上、下游引物进行PCR扩增，获得目标蛋白GFP的基因序列；

(iii)分别以SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列为下游引物，以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，Overlap PCR扩增，获得2575N-GFP、3597N-GFP、2703N-GFP、2704N-GFP融合片段。其中，两个基因的连接部位添加了氨基酸序列为GGGGS或GSGGGS的柔性连接肽；

(3)2575C-GFP、3597C-GFP、2703C-GFP、2704C-GFP融合片段的构建:

(i)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，分别以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21和SEQ IDNO.22所示的核苷酸序列为上、下游引物PCR扩增，获得目标蛋白C端融合片段2575C、3597C、2703C、2704C基因序列；

(ii)以实施例4中所构建的pSY8-GFP质粒为模板，以SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26所示的核苷酸序列为上、下游引物进行PCR扩增，获得目标蛋白GFP的基因序列；

(iii)分别以SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列为上游引物，以SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列为下游引物，以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，Overlap PCR扩增，获得2575C-GFP、3597C-GFP、2703C-GFP、2704C-GFP融合片段。其中，两个基因的连接部位添加了氨基酸序列为GGGGS或GSGGGS的柔性连接肽；

(4)使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0胶回收试剂盒，分别纯化回收步骤(2)和(3)中Overlap PCR扩增的片段；

(5)按照ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒说明书，将步骤(4)纯化回收得到的基因片段分别与经过Nde I酶切线性化的载体片段连接。

(6)将步骤(5)所得到的一步克隆产物分别按照热激转化的方法转化至E.coliDH5α中以扩增质粒，具体操作如下所述：一步克隆产物与200μL E.coli DH5α感受态混合，冰上放置30min；42℃水浴锅中热激90s；冰上放置5min；加入新鲜的LB培养基800μL；37℃，200rpm摇床复苏45min；取复苏后的菌液200μL涂布至含有氨苄青霉素抗性的LB固体平板培养基(含1.5％琼脂粉)上，37℃静止培养12h；挑选出的阳性转化子接种至液体LB培养基中扩大培养，之后提取质粒，酶切验证后送至金唯智基因测序公司测序。

(7)步骤(6)得到的构建成功的质粒分别热激转化至E.coli Top10(含pAN2质粒，该质粒有一个枯草芽抱杆菌噬菌体基因，能编码甲基转移酶，可实现外源质粒在大肠杆菌中的甲基化)感受态中，具体操作如下所述：20μL质粒与200μL E.coli Top10感受态混合，冰上放置30min；42℃水浴锅中热激90s；冰上放置5min；加入新鲜的LB培养基800μL；37℃，200rpm摇床复苏45min；取复苏后的菌液200μL涂布至含有氨苄青霉素和四环素抗性的LB固体平板培养基(含1.5％琼脂粉)上，37℃静止培养12h；挑取单菌落在LB液体培养基中扩大培养，之后提取质粒，所得质粒即为甲基化质粒。p SY8-2575N-GFP及p SY8-2575C-GFP质粒图谱见图4、图5，其余质粒除目的基因不一致均相同，故不作详述。

表5.PCR扩增引物

表10.PCR体系

本实施例所用PCR循环程序：94℃,10min；94℃，3min；54℃，30s；72℃，1min(延伸时间根据片段长度而变化)。

实施例6：重组丙酮丁醇梭菌的构建

(1)厌氧条件下，取2×YTG培养基中在37℃培养至对数中期(OD₆₀₀＝1.1)的C.acetobutylicum B3(CGMCC No.5234)培养液60mL。

(2)4℃，5000rpm离心10min后弃掉上清液，加入适量的已经预冷的电转缓冲液EPB(270mM蔗糖，5mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4)，洗涤两次，并用2.3mL EPB重悬。

(3)然后取570μL步骤(2)所述的重悬菌液，加入4mm电转杯放置在冰浴中冷却，并加入20μL实施例4和实施例5中构建完成的各甲基化质粒，冰上放置2min。2.0kV电压，25uF电容进行电转化。

(4)将步骤(3)电转后的菌液加入到5mL 2xYTG培养基中，37℃复苏培养4h，离心收集细胞100μL并将细胞涂布于含有20ug/mL甲砜氯霉素的新鲜P2固体平板培养基(含1.5％琼脂粉)中。

(5)用菌落PCR(所用引物如表5所示)的方法，筛选出构建成功的重组菌株，并将菌落PCR的产物送至生物科技公司进行测序，以确保所筛选的重组菌株构建正确，各菌株纯化培养后用已配置好的30％的甘油进行保菌，储存于-80℃超低温冰箱。

实施例7：重组菌株成功表达绿色荧光蛋白

(1)取实施例6中所保藏的基因工程菌株C.acetobutylicum B3-GFP、C.acetobutylicum B3-2575N-GFP、C.acetobutylicum B3-2575C-GFP、C.acetobutylicumB3-3597N-GFP、C.acetobutylicum B3-3597C-GFP、C.acetobutylicum B3-2703N-GFP、C.acetobutylicum B3-2703C-GFP、C.acetobutylicum B3-2704N-GFP、C.acetobutylicumB3-2704C-GFP以及野生型菌株C.acetobutylicum B3各200μL，涂布至P2固体平板培养基中(其中，重组菌株需添加20μg/L甲砜氯霉素)，放置于厌氧箱中于37℃，培养时间为24h。

(2)将平板培养的菌体转接至P2液体培养基中(含有20μg/L甲砜氯霉素)，于37℃静置培养至OD₆₀₀＝2.2；

(3)将步骤(2)所述的以及种子培养基按10％的体积比，接种量转接至二级P2种子培养基中，30℃培养箱中静止培养36h后收集处理样品；

(4)将步骤(3)所述的所收集的样品，4℃，8000rpm离心，收集上清液和沉淀(菌体细胞)，所收集的上清液即为重组丙酮丁醇梭菌分泌至细胞外的物质；

(5)用10mL Tris-HCl缓冲液重悬洗涤后的菌体细胞，于超声细胞破碎仪中破碎菌体细胞18min(280W，超声开3s,关5s)；

(6)将步骤(5)破碎后的菌体细胞在8000g，4℃条件下离心10min，分别收集破碎后的上清液即为细胞内提取物，破碎后的沉淀为细胞碎片；

(7)步骤(6)所收集的细胞碎片，用20mL磷酸盐缓冲液(pH 6.0)重悬洗涤一次后，4℃，8000rpm离心，收集沉淀；

(8)步骤(7)所述的细胞碎片用10mL磷酸盐缓冲液(pH 6.0)重悬后，储存于4℃冰箱，待用。

实施例8：多功能酶标仪测定目标蛋白的荧光强度

使用多功能酶标仪分别测定各菌株细胞外、细胞内以及细胞碎片的相对荧光强度，其具体实验操作如下：分别取200μL实施例7步骤(4)的上清液、实施例7步骤(6)的细胞内提取物和实施例7步骤(8)的细胞碎片样品滴加至黑色96孔板中，在激发光与发射光的波长分别设置为485nm和540nm的条件下测定各荧光强度，该实验共设置3组平行对照，以纯水作为空白对照。相对荧光强度按照((重组转化菌荧光强度-野生菌荧光强度)/(野生菌荧光强度))的方法计算。各重组菌株中目标蛋白质(细胞外、细胞内以及细胞碎片)的相对荧光强度如图2所示。

实施例9：紫外灯下观察目标蛋白的荧光亮度

取一定量实施例7步骤(6)所得细胞内提取物至1.5mL离心管中，在紫外灯下观察荧光亮度。图3为紫外灯下的照射结果，亮度越高表明目标蛋白表达效率越高。

本发明提供了一种在梭菌中通过融合蛋白来提高蛋白总表达量的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

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序列表

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 181

<212> PRT

<213> 赤藓素蛋白(CA_C3597 )

<400> 1

Met Lys Lys Phe Lys Cys Val Val Cys Gly Tyr Ile Tyr Thr Gly Glu

1 5 10 15

Asp Ala Pro Glu Lys Cys Pro Val Cys Gly Ala Gly Lys Asp Lys Phe

20 25 30

Val Glu Val Lys Asp Glu Gly Glu Gly Trp Ala Asp Glu His Lys Ile

35 40 45

Gly Ile Ala Lys Gly Val Asp Lys Glu Val Leu Glu Gly Leu Arg Ala

50 55 60

Asn Phe Thr Gly Glu Cys Thr Glu Val Gly Met Tyr Leu Ala Met Ala

65 70 75 80

Arg Gln Ala Asp Arg Glu Gly Tyr Pro Glu Val Ala Glu Ala Tyr Lys

85 90 95

Arg Ile Ala Phe Glu Glu Ala Glu His Ala Ser Lys Phe Ala Glu Leu

100 105 110

Leu Gly Glu Val Val Val Ala Asp Thr Lys Thr Asn Leu Gln Met Arg

115 120 125

Val Asp Ala Glu Lys Gly Ala Cys Glu Gly Lys Lys Glu Leu Ala Thr

130 135 140

Leu Ala Lys Lys Leu Asn Tyr Asp Ala Ile His Asp Thr Val His Glu

145 150 155 160

Met Cys Lys Asp Glu Ala Arg His Gly Ser Ala Phe Arg Gly Leu Leu

165 170 175

Asn Arg Tyr Phe Lys

180

<210> 2

<211> 195

<212> PRT

<213> 赤藓素蛋白(CA_C2575)

<400> 2

Met Lys Ser Leu Lys Gly Thr Lys Thr Ala Glu Asn Leu Met Lys Ala

1 5 10 15

Phe Ala Gly Glu Ser Gln Ala Arg Asn Arg Tyr Thr Phe Tyr Ser Asn

20 25 30

Thr Ala Lys Lys Glu Gly Tyr Val Gln Ile Ser Asn Ile Phe Leu Glu

35 40 45

Thr Ala Glu Asn Glu Arg Met His Ala Lys Arg Phe Phe Lys Phe Leu

50 55 60

Ser Glu Gly Leu Asp Asp Glu Ala Val Glu Ile Asn Gly Ala Ser Tyr

65 70 75 80

Pro Thr Thr Leu Gly Asp Thr Lys Lys Asn Leu Ile Ala Ala Ala Lys

85 90 95

Gly Glu Asn Glu Glu Trp Thr Asp Leu Tyr Pro Ser Phe Ala Lys Thr

100 105 110

Ala Glu Asp Glu Gly Phe Lys Gly Val Ala Ala Ala Phe Arg Leu Ile

115 120 125

Ala Ala Val Glu Lys Glu His Glu Lys Arg Tyr Asn Ala Leu Leu Lys

130 135 140

Asn Ile Glu Glu Asn Lys Val Phe Glu Lys Asp Glu Val Lys Phe Trp

145 150 155 160

Lys Cys Ile Lys Cys Gly Tyr Ile Phe Glu Gly Lys Thr Ala Pro Lys

165 170 175

Val Cys Pro Ala Cys Leu His Pro Gln Ala Tyr Phe Glu Ile Leu Ser

180 185 190

Glu Asn Tyr

195

<210> 3

<211> 95

<212> PRT

<213> GroES(CA_C2704)

<400> 3

Met Lys Ile Arg Pro Leu Gly Asp Arg Val Val Ile Lys Arg Leu Glu

1 5 10 15

Ala Glu Glu Thr Thr Lys Ser Gly Ile Val Leu Pro Ser Ser Ala Lys

20 25 30

Glu Lys Pro Gln Met Ala Glu Val Val Ala Val Gly Pro Gly Gly Val

35 40 45

Val Asp Gly Lys Glu Ile Gln Met Gln Val Lys Thr Gly Asp Lys Val

50 55 60

Phe Phe Ser Lys Tyr Ser Gly Thr Glu Ile Lys Val Asp Asn Glu Glu

65 70 75 80

Leu Leu Ile Leu Arg Gln Asp Asp Ile Leu Gly Ile Val Glu Glu

85 90 95

<210> 4

<211> 543

<212> PRT

<213> GroEL(CA_C2703)

<400> 4

Met Ala Lys Gln Ile Leu Tyr Gly Glu Glu Ala Arg Arg Ser Met Gln

1 5 10 15

Lys Gly Val Asp Lys Leu Ala Asp Thr Val Lys Val Thr Leu Gly Pro

20 25 30

Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Asp Lys Lys Phe Gly Ala Pro Leu Ile

35 40 45

Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro

50 55 60

Tyr Glu Asn Met Gly Ala Gln Leu Val Lys Glu Val Ala Thr Lys Thr

65 70 75 80

Asn Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Leu Leu Ala Gln

85 90 95

Ala Ile Ile Arg Glu Gly Leu Lys Asn Val Thr Ala Gly Ala Asn Pro

100 105 110

Met Leu Ile Arg Asn Gly Ile Arg Leu Ala Val Asp Lys Thr Val Glu

115 120 125

Gly Leu Lys Lys Val Ser Lys Asn Val Asn Gly Lys Glu Asp Ile Ala

130 135 140

Arg Val Ala Ser Ile Ser Ala Ala Asp Pro Glu Ile Gly Lys Leu Ile

145 150 155 160

Ala Asp Ala Met Glu Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu

165 170 175

Glu Ser Lys Ser Met Gly Thr Glu Leu Asp Val Val Glu Gly Met Gln

180 185 190

Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Met Val Thr Asp Gln Glu Lys

195 200 205

Met Glu Ala Val Leu Asp Asp Pro Tyr Ile Leu Ile Thr Asp Lys Lys

210 215 220

Ile Ala Asn Ile Gln Glu Ile Leu Pro Leu Leu Glu Gln Ile Val Gln

225 230 235 240

Gln Gly Lys Lys Leu Leu Ile Ile Ala Asp Asp Val Glu Gly Glu Ala

245 250 255

Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Lys Leu Arg Gly Thr Phe Asn Cys Val

260 265 270

Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Asp Met Leu Arg

275 280 285

Asp Ile Ala Ile Leu Thr Gly Gly Glu Val Ile Ser Glu Glu Leu Gly

290 295 300

Lys Asp Leu Lys Asp Val Lys Val Glu Asp Leu Gly Ser Ala Glu Ser

305 310 315 320

Val Lys Ile Ser Lys Glu Asn Thr Thr Ile Val Asn Gly Arg Gly Asp

325 330 335

Lys Ser Ala Ile His Asp Arg Val Ala Gln Ile Arg Gly Gln Ile Glu

340 345 350

Glu Thr Thr Ser Asp Phe Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala

355 360 365

Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Val Lys Val Gly Ala Ala Ser Glu

370 375 380

Thr Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ile Glu Asp Ala Leu Ala Ala

385 390 395 400

Thr Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Ile Ala Gly Gly Gly Thr Ala

405 410 415

Tyr Ile Asn Val Leu Pro Glu Val Arg Glu Leu Thr Ser Asp Glu Pro

420 425 430

Asp Val Gln Val Gly Ile Asn Ile Ile Val Lys Ala Leu Glu Glu Pro

435 440 445

Val Arg Gln Ile Ala Ala Asn Ala Gly Leu Glu Gly Ser Val Ile Ile

450 455 460

Glu Lys Ile Ile Asn Ser Glu Lys Gly Ile Gly Phe Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Glu Lys Tyr Val Asp Met Leu Ser Val Gly Ile Val Asp Pro Thr Lys

485 490 495

Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Val Ala Ser Thr Phe

500 505 510

Leu Thr Thr Glu Cys Ala Val Ala Asp Ile Pro Glu Lys Asp Lys Pro

515 520 525

Glu Met Pro Gly Gly Ala Pro Gly Met Gly Met Gly Gly Met Tyr

530 535 540

<210> 5

<211> 447

<212> DNA

<213> 绿色荧光蛋白(GFP)

<400> 5

atgataaatg ctaaattatt acaattaatg gttgaacata gtaatgatgg aatagttgtt 60

gcagaacaag aaggaaatga atcaattctt atatatgtta atccagcatt tgaaagatta 120

acaggatatt gtgcagatga tatattatat caagatgcta gatttttaca gggagaagat 180

cacgatcagc ctggaatagc aataataaga gaagcaataa gagagggaag accttgctgc 240

caggttttaa gaaattatag aaaagatgga agtttatttt ggaatgaatt aagtataaca 300

ccagttcata atgaagcaga tcaattaaca tattatatag gaatacaaag agatgttaca 360

gcacaagttt ttgcagaaga gagagttaga gagcttgagg cagaggttgc agagcttaga 420

aggcaacaag gacaagcaaa acattaa 447

<210> 6

<211> 4040

<212> DNA

<213> 质粒载体(pSY8)

<400> 6

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 60

ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 120

caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtttatgtt 180

acagtaatat tgacttttaa aaaaggattg attctaatga agaaagcaga caagtaagcc 240

tcctaaattc actttagata aaaatttagg aggcatatca aatgaacttt aataaaattg 300

atttagacaa ttggaagaga aaagagatat ttaatcatta tttgaaccaa caaacgactt 360

ttagtataac cacagaaatt gatattagtg ttttataccg aaacataaaa caagaaggat 420

ataaatttta ccctgcattt attttcttag tgacaagggt gataaactca aatacagctt 480

ttagaactgg ttacaatagc gacggagagt taggttattg ggataagtta gagccacttt 540

atacaatttt tgatggtgta tctaaaacat tctctggtat ttggactcct gtaaagaatg 600

acttcaaaga gttttatgat ttataccttt ctgatgtaga gaaatataat ggttcgggga 660

aattgtttcc caaaacacct atacctgaaa atgctttttc tctttctatt attccatgga 720

cttcatttac tgggtttaac ttaaatatca ataataatag taattacctt ctacccatta 780

ttacagcagg aaaattcatt aataaaggta attcaatata tttaccgcta tctttacagg 840

tacatcattc tgtttgtgat ggttatcatg caggattgtt tatgaactct attcaggaat 900

tgtcagatag gcctaatgac tggcttttat aaatcgatta tgtcttttgc gcattcactt 960

cttttctata taaatatgag cgaagcgaat aagcgtcgga aaagcagcaa aaagtttcct 1020

ttttgctgtt ggagcatggg ggttcagggg gtgcagtatc tgacgtcaat gccgagcgaa 1080

agcgagccga agggtagcat ttacgttaga taaccccctg atatgctccg acgctttata 1140

tagaaaagaa gattcaacta ggtaaaatct taatataggt tgagatgata aggtttataa 1200

ggaatttgtt tgttctaatt tttcactcat tttgttctaa tttcttttaa caaatgttct 1260

ttttttttta gaacagttat gatatagtta gaatagttta aaataaggag tgagaaaaag 1320

atgaaagaaa gatatggaac agtctataaa ggctctcaga ggctcataga cgaagaaagt 1380

ggagaagtca tagaggtaga caagttatac cgtaaacaaa cgtctggtaa cttcgtaaag 1440

gcatatatag tgcaattaat aagtatgtta gatatgattg gcggaaaaaa acttaaaatc 1500

gttaactata tcctagataa tgtccactta agtaacaata caatgatagc tacaacaaga 1560

gaaatagcaa aagctacagg aacaagtcta caaacagtaa taacaacact taaaatctta 1620

gaagaaggaa atattataaa aagaaaaact ggagtattaa tgttaaaccc tgaactacta 1680

atgagaggcg acgaccaaaa acaaaaatac ctcttactcg aatttgggaa ctttgagcaa 1740

gaggcaaatg aaatagattg acctcccaat aacaccacgt agttattggg aggtcaatct 1800

atgaaatgcg attaagcttg gctgcaggtc gacggatccc cgggaattct ataaaatata 1860

aataattttc taaaaaactt aacttcatgt gaaaagtttg ttaaaatata aatgagcacg 1920

ttaatcattt aacatagata attaaatagt aaaagggagt gtcgacatat ggtgcactct 1980

cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc 2040

tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 2100

ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa 2160

gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac 2220

gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat 2280

acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg 2340

aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 2400

attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga 2460

tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga 2520

gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg 2580

cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc 2640

tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 2700

agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact 2760

tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca 2820

tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg 2880

tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact 2940

acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg 3000

accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg 3060

tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat 3120

cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc 3180

tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat 3240

actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt 3300

tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc 3360

cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt 3420

gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac 3480

tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt 3540

gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct 3600

gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga 3660

ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac 3720

acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg 3780

agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt 3840

cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 3900

tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg 3960

gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc 4020

ttttgctcac atgttctttc 4040

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 上游引物(2575N-F)

<400> 7

atagtaaaag ggagtgtcga catatgatga aatcacttaa aggtac 46

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 下游引物(2575N-R)

<400> 8

acttccgcct cctccatagt tttcacttaa tattt 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 上游引物(2575C-F)

<400> 9

ggaggaggcg gaagtatgaa atcacttaaa ggtac 35

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 下游引物(2575C-R)

<400> 10

agattgtact gagagtgcac catatgttaa tagttttcac ttaata 46

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 上游引物(3597N-F)

<400> 11

atagtaaaag ggagtgtcga catatgatga aaaaatttaa atgtgt 46

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 下游引物(3597N-R)

<400> 12

acttccgcct cctcctttga aatatctgtt taata 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 上游引物(3597C-F)

<400> 13

ggaggaggcg gaagtatgaa aaaatttaaa tgtgt 35

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 下游引物(3597C-R)

<400> 14

agattgtact gagagtgcac catatgctat ttgaaatatc tgttta 46

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 上游引物(2703N-F)

<400> 15

atagtaaaag ggagtgtcga catatgatgg caaagcaaat attata 46

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 下游引物(2703N-R)

<400> 16

acttccgcct cctccacttc cgtacattcc gcccattccc a 41

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 上游引物(2703C-F)

<400> 17

ggaagtggag gaggcggaag tatggcaaag caaatattat a 41

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 下游引物(2703C-R)

<400> 18

agattgtact gagagtgcac catatgttag tacattccgc ccattc 46

<210> 19

<211> 46

<212> DNA

<213> 上游引物(2704N-F)

<400> 19

atagtaaaag ggagtgtcga catatgatga aaattagacc acttgg 46

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 下游引物(2704N-R)

<400> 20

acttccgcct cctccacttc cttcttctac aattcctaaa a 41

<210> 21

<211> 41

<212> DNA

<213> 上游引物(2704C-F)

<400> 21

ggaagtggag gaggcggaag tatgaaaatt agaccacttg g 41

<210> 22

<211> 46

<212> DNA

<213> 下游引物(2704C-R)

<400> 22

agattgtact gagagtgcac catatgttat tcttctacaa ttccta 46

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 上游引物(GFP-F1)

<400> 23

ggaggaggcg gaagtatgat aaatgctaaa ttatt 35

<210> 24

<211> 46

<212> DNA

<213> 下游引物(GFP-R1)

<400> 24

agattgtact gagagtgcac catatgttaa tgttttgctt gtcctt 46

<210> 25

<211> 46

<212> DNA

<213> 上游引物(GFP-F2)

<400> 25

atagtaaaag ggagtgtcga catatgatga taaatgctaa attatt 46

<210> 26

<211> 41

<212> DNA

<213> 下游引物(GFP-R2)

<400> 26

acttccgcct cctccacttc catgttttgc ttgtccttgt t 41

Claims

1.一种提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，将目标蛋白与核苷酸序列如SEQID NO.3所示的非经典分泌蛋白融合，在丙酮丁醇梭菌CGMCC No.5234中进行蛋白表达，来提高蛋白总表达量。

2.根据权利要求1所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，所述的目标蛋白为绿色荧光蛋白。

3.根据权利要求2所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，将绿色荧光蛋白优化后再与核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的非经典分泌蛋白进行融合表达；其中，优化后的绿色荧光蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，所述的融合为将非经典分泌蛋白融合于目的蛋白的N端或C端。

5.根据权利要求3所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)以从丙酮丁醇梭菌中提取的DNA为模板，进行PCR扩增，得到非经典分泌蛋白N端或C端融合片段的基因序列；

(3)以步骤(1)构建的pSY8-GFP质粒为模板，进行PCR扩增，得到绿色荧光蛋白的基因序列；

(4)将步骤(2)和步骤(3)得到的基因序列重叠PCR，得到非经典分泌蛋白-N/C-绿色荧光蛋白的融合片段；

6.根据权利要求5所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的pSY8质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

7.根据权利要求5所述的提高梭菌中蛋白表达效率的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的第一大肠杆菌为E.coliDH5α；所述的第二大肠杆菌为E.coliTop10。