JP2003334073A

JP2003334073A - 蛋白質の製造方法

Info

Publication number: JP2003334073A
Application number: JP2002143172A
Authority: JP
Inventors: Junichi Hata; 純一秦; Masahiro Furuya; 昌弘古谷; Akiko Tougi; 彰子東儀
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2002-05-17
Filing date: 2002-05-17
Publication date: 2003-11-25

Abstract

(57)【要約】【課題】目的蛋白質とシャペロニンとの複合体を安定
化させ、目的蛋白質をシャペロニンの立体構造内部に完
全に納めることにより、目的蛋白質が宿主細胞に対して
何らかの毒性を有する場合であっても安定して目的蛋白
質を大量に得ることのできる蛋白質の製造方法を提供す
る。【解決手段】少なくとも、同一宿主内で共存・複製可
能な２種の異なるプラスミドに、シャペロニンと目的蛋
白質との融合蛋白質をコードする遺伝子及びコシャペロ
ニンをコードする遺伝子とをそれぞれ組み込む工程と、
前記遺伝子が組込まれた２種のプラスミドを同一宿主に
導入する工程と、前記プラスミドが導入された宿主内で
前記融合蛋白質と前記コシャペロニンとを共発現させる
工程とを有する蛋白質の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、目的蛋白質とシャ
ペロニンとの複合体を安定化させ、目的蛋白質をシャペ
ロニンの立体構造内部に完全に納めることにより、目的
蛋白質が宿主細胞に対して何らかの毒性を有する場合で
あっても安定して目的蛋白質を大量に得ることのできる
蛋白質の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまでにバクテリア、酵母、昆虫、動
植物細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニッ
ク植物等多くの宿主生物での組み換え蛋白質発現系が検
討されてきた。なかでもバクテリアを宿主細胞とした組
み換え蛋白質の製造方法は、その増殖速度の速さ等から
医薬品原料の工業スケール生産の標準システムとなって
いる。

【０００３】しかし、これらの従来の組み換え蛋白質発
現系では、活性型蛋白質を大量に得ることが困難な場合
が多くあった。例えば、目的蛋白質が宿主細胞に対して
何らかの毒性を有する場合には、発現が抑制されて発現
量が低下したり、細胞増殖量が低下したりする。また、
目的蛋白質が可溶性蛋白質として発現する場合には、宿
主のプロテアーゼによって分解されてしまい生産量が極
めて少なくなることがあった。更に、目的蛋白質が発現
しても折り畳みがうまくいかない場合には、可溶化が困
難な封入体を形成してしまい、人工的に可溶化して再折
り畳みを行っても最終的に得られる活性型蛋白質の量は
極めて少なくなってしまうことがあった。

【０００４】目的蛋白質が宿主細胞に対して何らかの毒
性を有する場合の対策としては、例えば、発現誘導剤や
温度によって目的蛋白質の発現を厳密に制御可能なベク
ターを用いた方法が検討されている。これは、目的蛋白
質を発現していない状態で宿主細胞を定常期まで増殖さ
せた後、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシ
ド（ＩＰＴＧ）等の発現誘導物質を添加したり、培養温
度を変化させたりすることによって、菌体内で目的蛋白
質を発現させる二段階培養法である。しかしながら、こ
の方法では菌体増殖ステージにおいて、目的蛋白質の発
現を完全に抑制することは困難であり、微量に目的蛋白
質が発現することによって菌体増殖や発現量が低下する
ことがあるという問題があった。

【０００５】目的蛋白質が宿主のプロテアーゼによって
分解されてしまう場合の対策としては、例えば、ｌｏ
ｎ、ｏｍｐＴのようなプロテアーゼ構造遺伝子の一部を
欠損させた大腸菌を宿主として用いる方法が考案されて
いる。しかしながら、大腸菌において現在判明している
プロテアーゼは３０種類以上あるため、一部の構造遺伝
子を欠損させただけではプロテアーゼ分解の影響を回避
することは困難であり、また、宿主のプロテアーゼを全
て欠損させてしまうと他の弊害が起こるため、根本的な
解決法とはなっていない。

【０００６】目的蛋白質が封入体を形成する場合の対策
としては、目的蛋白質をグルタチオン−Ｓ−トランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ）やチオレドキシン−マルトース結合
蛋白質等との融合蛋白質として発現させる方法；大腸菌
が宿主である場合には、ペリプラズム内に目的蛋白質を
発現させる方法等が考案されている。しかしながら、こ
れらの方法でも、封入体の形成を高効率で解消するのは
困難であった。また、蛋白質の折り畳み反応を支援する
蛋白質群である分子シャペロンと共発現させ、可溶性画
分への発現量を増大させる方法も考案されている。しか
しながら、活性型蛋白質の量は飛躍的には増加しないの
が現状であった。

【０００７】これに対して、目的蛋白質をヒートショッ
クプロテインの１種であるシャペロニンとの融合蛋白質
としてシャペロニンの立体構造内部に納めることによ
り、目的蛋白質の宿主への毒性発現、封入体形成、プロ
テアーゼによる分解の問題を解消し、目的蛋白質を可溶
性蛋白質として大量に発現させる方法が提案されてい
る。この方法によれば、用いる宿主や目的蛋白質ごとに
発現条件を試行錯誤で検討する必要もなく、大量の目的
蛋白質を得ることができる。しかしながら、シャペロニ
ン−目的蛋白質の融合蛋白質は、分子量が巨大であるた
め宿主細胞内で不安定となりやすく、シャペロニン内部
に目的蛋白質が完全には納まらないことがあり、とりわ
け目的蛋白質が宿主細胞に対して何らかの毒性を有する
場合には発現量が低下する傾向があり、シャペロニンを
安定化させる方法が求められていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記現状に
鑑み、目的蛋白質とシャペロニンとの複合体を安定化さ
せ、目的蛋白質をシャペロニンの立体構造内部に完全に
納めることにより、目的蛋白質が宿主細胞に対して何ら
かの毒性を有する場合であっても安定して目的蛋白質を
大量に得ることのできる蛋白質の製造方法を提供するこ
とを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、少なくとも、
同一宿主内で共存・複製可能な２種の異なるプラスミド
に、シャペロニンと目的蛋白質との融合蛋白質をコード
する遺伝子及びコシャペロニンをコードする遺伝子とを
それぞれ組み込む工程と、前記遺伝子が組込まれた２種
のプラスミドを同一宿主に導入する工程と、前記プラス
ミドが導入された宿主内で前記融合蛋白質と前記コシャ
ペロニンとを共発現させる工程とを有する蛋白質の製造
方法である。以下に本発明を詳述する。

【００１０】本発明の蛋白質の製造方法は、シャペロニ
ンと目的蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子及び
コシャペロニンをコードする遺伝子を２種の異なるプラ
スミドに組み込み、これを同一宿主に導入するシャペロ
ニンと目的蛋白質との融合蛋白質とコシャペロニンとを
共発現させるものである。上記シャペロニンとは、細胞
に熱ショック等のストレスを与えることにより誘導され
る分子シャペロンと呼ばれる蛋白質群のなかで、分子量
が約６０ｋＤａのもののことであり、バクテリア、古細
菌、及び真核生物の全ての生物に存在し、蛋白質の折り
畳み支援や変性防御の機能を有するものである。

【００１１】上記シャペロニンは、グループ１型とグル
ープ２型とに大別される。バクテリアや真核生物のオル
ガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類さ
れ、いずれも１４量体のホモオリゴマーで、コシャペロ
ニンと称される分子量約１０ｋＤａの蛋白質の環状７量
体を補因子とする。一方、グループ２型シャペロニン
は、真核生物の細胞質や古細菌にみられるが、それらの
構造や機能に関しては不明な点が多く残されており、グ
ループ１型のコシャペロニンに相当する蛋白質も現在の
ところ見つかっていない。

【００１２】グループ１型シャペロニンのなかでも研究
が最も進んでいるのが大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏ
ＥＬである。ＧｒｏＥＬは、補因子であるコシャペロニ
ンＧｒｏＥＳとともに働き、蛋白質の折り畳みを助ける
作用をしており、それらの構造及び機能が近年、明らか
にされつつある。以下に、シャペロニンＧｒｏＥＬとコ
シャペロニンＧｒｏＥＳとを例として、本発明の蛋白質
の製造方法の機構を説明する。

【００１３】シャペロニンＧｒｏＥＬは、分子量約６０
ｋＤａのサブユニット7つからなるリングがうしろ向き
に結合した１４量体構造をとっており、それぞれのリン
グの中央に内径４５Å、高さ７０Åの空洞を有する構造
となっている。シャペロニンＧｒｏＥＬの１つのサブユ
ニットは、頂上、中間、赤道ドメインの３つのドメイン
から構成されており、コシャペロニンＧｒｏＥＳ及び蛋
白質の結合部位は頂上ドメインにあり、ＡＴＰの結合部
位は赤道付近に存在している。

【００１４】シャペロニンＧｒｏＥＬとコシャペロニン
ＧｒｏＥＳとによる蛋白質の折り畳みの機構は、現在の
ところ以下のように考えられている。すなわち、まず、
シャペロニンＧｒｏＥＬに蛋白質が結合する。次に、Ａ
ＴＰが同じ側のリング（シスリング）に結合するとコシ
ャペロニンＧｒｏＥＳがシスリングに結合し、シャペロ
ニンＧｒｏＥＬの構造変化が起こりＧｒｏＥＬ−Ｇｒｏ
ＥＳ複合体の内部に内径８０Å、高さ８０Åの巨大な空
洞ができ、内容積はコシャペロニンＧｒｏＥＳ結合前の
約２倍となる。このＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ複合体の構
造内部に蛋白質が閉じ込められ、親水的な空洞内部にお
いてポリペプチドは折り畳みを開始する。折り畳みの過
程において、ＡＴＰは徐々にＡＤＰへ加水分解される
（Ｗｅｉｓｓｍａｎｅｔａｌ．，１９９６，Ｃｅｌ
ｌ，８４，４８１−４９０，Ｚｈａｏｈｕｉｅｔａ
ｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ，３８８，７４１−７５
０）。

【００１５】上記シャペロニンＧｒｏＥＬのＸ線結晶構
造解析によって明らかにされた立体構造は、Ｎ末端及び
Ｃ末端はともにキャビティ側に位置し、フレキシビリテ
ィの高い構造となっている（Ｂｒａｉｇｅｔａ
ｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ，３７１，５７８−５８
６）。特にＣ末端の２３残基は結晶内で決まった構造を
とっていないため結晶解析で見えていないが、空洞内部
に張り出し、フレキシビリティの高い構造をとってい
る。一方、コシャペロニンＧｒｏＥＳはＮ末端及びＣ末
端が共にリングの外側に位置しており、サブユニットの
Ｃ末端は隣接するコシャペロニンＧｒｏＥＳサブユニッ
トのＮ末端と約６Åの距離で近接している（Ｈｕｎｔ
ｅｔａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３７９，３７
−４５）。

【００１６】本発明の蛋白質の製造方法は、上述のシャ
ペロニンとコシャペロニンとの複合体の構造内部に蛋白
質が閉じ込められることを利用して、目的蛋白質を確実
にシャペロニン−コシャペロニン複合体の空洞内部に納
めることにより、目的蛋白質の宿主への毒性、プロテア
ーゼによる分解、封入体の形成の問題を解消し、可溶性
蛋白質として大量発現させる方法である。すなわち、目
的蛋白質が宿主生物にとって重要な自然機構を阻害する
性質を有するものであっても、シャペロニン−コシャペ
ロニン複合体により生体内環境から仕切られているため
阻害作用を発現することもない。また、強力なプロモー
ターによって発現が誘導された時に見られるように、蛋
白質の折り畳み中間体同士が多数会合することなく個々
にシャペロニン−コシャペロニン複合体のキャビティに
固定されるため、封入体の形成も抑えられる。更に、シ
ャペロニンは宿主生物の細胞質又は体液等の可溶性画分
へ発現するため、シャペロニン−コシャペロニン複合体
内部に格納された蛋白質が膜結合性又は膜貫通性の蛋白
質であっても膜へ移行し宿主生物の膜構造を破壊するこ
ともなく、宿主生物に対する毒性は発現しない。また、
いかなる蛋白質も同一のシャペロニンリングに格納され
ているため、同一条件で発現制御及び精製が可能であ
る。更に、本来シャペロニン−コシャペロニン複合体は
単に外部環境から仕切られたスペースを提供するだけで
なく、蛋白質折り畳み機能を有するため、目的蛋白質の
折り畳みも正常に行われ、かつ構造が安定することも期
待できる。本発明の蛋白質の製造方法により製造される
蛋白質であって、シャペロニン及びコシャペロニンから
なる構造の内部に、シャペロニンとペプチド結合を介し
て封入されている蛋白質もまた、本発明の１つである。

【００１７】本発明の蛋白質の製造方法において用いら
れるシャペロニンとしては特に限定されないが、コシャ
ペロニンが発見されているバクテリア及び真核生物に由
来するものが好適である。また、コシャペロニンとして
は、選択したシャペロニンに対応するものを用いる。

【００１８】本発明の蛋白質の製造方法においては、目
的蛋白質はまずシャペロニンとの融合蛋白質として得ら
れる。上記融合蛋白質におけるシャペロニンと目的蛋白
質の連結パターンとしては、目的蛋白質がシャペロニン
−コシャペロニン複合体のキャビティ内に確実に納まる
ように、目的蛋白質はシャペロニンのＮ末端、Ｃ末端又
はシャペロニン同士の間にペプチド結合を介して連結さ
れていることが好ましい。また、目的蛋白質の宿主に対
する毒性が極めて高い又は宿主のプロテアーゼによる消
化を極めて受けやすい場合には、目的蛋白質は、複数の
シャペロニン連結間に連結されることがより好ましい。

【００１９】通常、シャペロニン−コシャペロニン複合
体の蛋白質折り畳み反応は、基質蛋白質（シングルポリ
ペプチドとして）と１：１で起こるため、シャペロニン
による折り畳み機能を発現させるには、シャペロニン−
コシャペロニン複合体に1個の目的蛋白質が格納される
よう融合蛋白質を設計することが好ましい。

【００２０】また、グループ１型シャペロニン複合体の
構造については、いずれもシャペロニンリングのサブユ
ニット数は７個であり、シャペロニン複合体の構造形成
のしやすさからシャペロニン：目的蛋白質の数比が１：
１又は７：１となるように融合蛋白質を設計することが
好ましい。すなわち、融合蛋白質においては、シャペロ
ニンはそのＮ回連結体（Ｎは１〜２０）となるように設
計することが好ましい。同様に、コシャペロニンも、Ｎ
回連結体（Ｎは1〜２０）となるように設計することが
好ましい。ただし、目的蛋白質の形状や分子量によって
は上記以外の数比としてもかまわない。

【００２１】本発明の蛋白質の製造方法は、同一宿主内
で共存・複製可能な２種の異なるプラスミドに、シャペ
ロニンと目的蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子
及びコシャペロニンをコードする遺伝子をそれぞれ組み
込む工程を有する。

【００２２】上記プラスミドとしては、宿主細胞内で高
効率で発現可能なものであれば特に限定されない。ま
た、２種のプラスミドは、異なる薬剤耐性及び複製領域
を有することが好ましい。これにより、２種類の薬剤の
存在下で共発現することにより、シャペロニン−コシャ
ペロニン複合体の構造を制御することが可能となる。例
えば、シャペロニンと目的蛋白質の数比が７：１である
融合蛋白質を生産する場合においては、シャペロニン遺
伝子を７個連結し、更にその５’側又は３’側に目的蛋
白質をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドと、コ
シャペロニンをコードする遺伝子を組み込んだプラスミ
ドとを作製する。このプラスミドを同一宿主内で共発現
させることにより、宿主細胞内で空洞内部に目的蛋白質
を収納したシャペロニン−コシャペロニン複合体が発現
できる。

【００２３】本発明の蛋白質の製造方法では、次いで、
上記遺伝子が組込まれた２種のプラスミドを、同一宿主
に導入する。上記宿主としては特に限定ないが、例え
ば、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細
胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体等が好適である。
なかでも、培養コストが安価であり、培養日数が短く、
培養操作が簡便な点から、バクテリア又は酵母がより好
適である。

【００２４】本発明の蛋白質製造方法において発現され
る蛋白質複合体は、分子量が６５〜６００ｋＤａと巨大
であるため、転写されたｍＲＮＡの特定のリボヌクレア
ーゼによる分解、翻訳された融合蛋白質のプロテアーゼ
による分解と、２段階の切断を受ける可能性がある。か
かる場合には、例えば、ｍＲＮＡの分解に関与するリボ
ヌクレアーゼをコードするＲＮａｓｅＥ遺伝子を欠損さ
せた宿主を用いることでｍＲＮＡの分解は抑制可能であ
る。また、翻訳後のプロテーゼによる分解を抑制するた
めには、１５〜２５℃の低温で発現させたり、ｌｏｎ、
ｏｍｐＴ等のプロテアーゼの構造遺伝子を欠損させた大
腸菌を宿主として用いることが好ましい。

【００２５】また、本発明の蛋白質の製造方法では、ベ
クターとして用いるプラスミドにシャペロニン又はコシ
ャペロニンの繰返し配列が含まれるため、プラスミドが
不安定となったり、特に宿主細胞とシャペロニン又はコ
シャペロニンの由来生物が同じであるときにはプラスミ
ドＤＮＡとゲノムＤＮＡの相同組換えが起こったりする
可能性がある。しかし、宿主として大腸菌を用いる場合
は、遺伝子の相同組換えに関する遺伝子であるＲｅｃＡ
を欠損させた宿主を用いることで、プラスミドの安定性
を向上させ、相同組換えを抑制することができる。

【００２６】本発明の蛋白質の製造方法では、次いで、
上記プラスミドが導入された宿主内で融合蛋白質とコシ
ャペロニンとを共発現させる。これにより、シャペロニ
ン−コシャペロニン複合体の構造内部に目的蛋白質が閉
じ込められた複合体が得られる。プラスミドを導入した
宿主内で融合蛋白質を発現させる方法としては特に限定
されず、公知の方法を用いることができ、例えば、予め
プラスミドにコードされていた薬剤耐性遺伝子に対応す
る薬剤を含有する培地中で宿主を培養する方法等が挙げ
られる。また、２種のプラスミドにコードされる薬剤耐
性遺伝子がそれぞれ異なっている場合には、この２種類
の薬剤の存在下で宿主を培養することにより、効率よ
く、融合蛋白質を発現させることができる。

【００２７】このようにして融合蛋白質を発現させた
後、細胞を回収し破砕し、上清を回収して、精製を行
う。融合蛋白質は分子量が約８４０〜９６０ＫＤａの巨
大蛋白質であるため、４０％飽和程度の硫安塩析によっ
て沈殿させることができる。塩析により沈殿した融合蛋
白質を回収した後、適当な緩衝液に溶解し、疎水クロマ
トグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーによって
融合蛋白質の存在するフラクションを回収する。これら
を限外ろ過によって濃縮した後、濃縮液を５〜５０ｍＭ
程度の塩化マグネシウム及び５０〜３００ｍＭ程度の塩
化ナトリウム又は塩化カリウムが含有された緩衝液を展
開液としてゲルろ過を行い、排除限界直後のピークを回
収することによって融合蛋白質を精製することができ
る。

【００２８】融合蛋白質のＮ末端又はＣ末端に６〜１０
個のヒスチジンが並んだヒスチジンタグを連結させた場
合には、ニッケル等の金属キレートカラムを用いれば、
融合蛋白質の回収はより簡便で効率的である。また、用
いるシャペロニンに対する抗体を用いて、免疫沈降又は
アフィニティクロマトグラフィーを行うことによっても
迅速・簡便に精製することが可能である。ただし、リン
グ構造を形成した融合蛋白質のみを回収するためには、
これらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過を組
み合わせることが好ましい。融合蛋白質のリング構造が
不安定な場合は、精製の過程でマグネシウム及びＡＴＰ
を存在させておくことで、リング構造である融合蛋白質
を効率的に回収することが可能である。なお、目的蛋白
質の回収のみが目的である場合は、融合蛋白質は必ずし
も均一に精製する必要はなく、粗精製サンプルにＥＤＴ
Ａ処理を施した後、プロテアーゼを作用させ、目的蛋白
質に応じた精製操作を施せば良い。目的蛋白質にメチオ
ニンが存在しない場合は、シャペロニンと目的蛋白質と
の間にメチオニンを存在させることによって、ＣＮＢｒ
によって切断可能なので、融合蛋白質をＥＤＴＡ処理及
び透析するという操作は必要ない。

【００２９】次いで、精製した融合蛋白質から目的蛋白
質を切り出す。シャペロニンのサブユニット間の会合
は、マグネシウムイオン及びＡＴＰによって安定化され
ている。従って得られた融合蛋白質から目的蛋白質のみ
を分離する場合には、上記のようにして回収した画分を
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理した後、マ
グネシウム及びＡＴＰが入っていない緩衝液に対して透
析を行いマグネシウム及びＡＴＰを取り除く。これによ
ってシャペロニンサブユニット間の相互作用は解除され
立体構造は壊れ、目的蛋白質が露出する。

【００３０】大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬを用
いた場合には、隣接するサブユニット間の会合が強固で
あるため、立体構造を崩し、目的蛋白質を露出すること
が困難である場合がある。この場合、サブユニット間の
会合は、疎水的相互作用及び静電相互作用によって引き
起こされるため、これらに寄与するアミノ酸をいくつか
改変したシャペロニンサブユニットを用いることによっ
て、隣接サブユニット間の会合を弱めることが可能であ
る。

【００３１】また、透析内液にトロンビン等の限定分解
型プロテアーゼを作用させ、目的蛋白質とシャペロニン
との切断を行ってもよい。この反応液をイオン交換クロ
マトグラフィーや疎水クロマトグラフィー、又は、抗体
を用いるアフィニィティクロマトグラフィーに供するこ
とによって容易に高純度の目的蛋白質を回収することが
できる。

【００３２】目的蛋白質が膜結合性又は膜貫通性蛋白質
である場合には、目的蛋白質とシャペロニンの切断によ
って不溶化することもあるが、不溶化物のみを遠心分離
によって回収した後、疎水性アルキル鎖がオクチル（Ｃ
８）からドデシル（Ｃ１２）あたりの長さである非イオ
ン性界面活性剤等を用いると、ミセルの直径がほぼ生体
膜の相応し、可溶化しやすい。上記非イオン性界面活性
剤としては、例えば、β−オクチルグルコシド、Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０、Ｔｗｅｅ
ｎ２０等が挙げられる。

【００３３】本発明の蛋白質の製造方法の対象となる目
的蛋白質としては特に限定されないが、例えば、Ｂ型肝
炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＨＩＶ、インフルエン
ザ等の病原性ウィルスゲノムにコードされる蛋白質（外
被蛋白質、コア蛋白質、プロテアーゼ、逆転写酵素、イ
ンテグラーゼ等）；ｓｃＦＶ（単鎖抗体）、Ｆａｂ、
（Ｆａｂ）₂ 及び完全抗体型である治療・診断用抗
体；７回膜貫通型受容体（Ｇ蛋白質共役型受容体）、血
小板増殖因子、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子、
トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、
線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子等の成長因
子に属するもの、腫瘍壊死因子、インターフェロン、イ
ンターロイキン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺
激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミ
ン、ヒト成長ホルモン等に属するもの等が挙げられる。
その他にも、ヒト、マウス等高等動物由来の疾病関連遺
伝子産物の全てが本発明の蛋白質の製造方法の目的蛋白
質となり得る。また、化学プロセス食品加工、その他の
産業分野に有効な酵素、蛋白質も本発明の蛋白質の製造
方法の対象である。

【００３４】本発明の蛋白質の製造方法によれば、従来
の方法では目的蛋白質が宿主細胞に対して何らかの毒性
を有していたり、宿主のプロテアーゼによって分解され
てしまったり、可溶化が困難な封入体を形成してしまっ
たりすることにより大量発現が困難であった蛋白質であ
っても、容易に大量に製造することができる。

【００３５】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００３６】（実施例１）（大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ連結体融合ＨＢｓ抗原
及びＧｒｏＥＳの共発現）大腸菌Ｋ１２株ゲノムを鋳型
とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅ
ａｃｔｉｏｎ）法によって、大腸菌シャペロニンＧｒｏ
ＥＬ遺伝子をクローニングした。このＧｒｏＥＬ遺伝子
を用いて、ＧｒｏＥＬ遺伝子がそれぞれ一方向に１、
２、３、４、５、６又は７回連結した遺伝子断片が挿入
されたｔｒｃプロモーター、ｐＢＲ３２２由来複製領域
及びアンピシリン耐性遺伝子を有する発現ベクターｐＴ
ｒｃ（ＧｒｏＥＬ）_n（ｎは１〜７）を構築した。

【００３７】得られた発現ベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥ
Ｌ）_nを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入しカルベニ
シリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地
（バクトトリプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣ
ｌ５ｇ／Ｌ）で２３℃、１１０ｒｐｍで２４時間回転培
養し、シャペロニン連結体を発現させた。培養終了後、
回収した菌体を超音波で破砕した。遠心分離で上清を回
収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した結果、（Ｇｒ
ｏＥＬ）ｎが可溶性画分に大量発現していることが確
認できた。

【００３８】同様に、鋳型として大腸菌Ｋ１２株を用い
て、大腸菌由来コシャペロニンＧｒｏＥＳ遺伝子をクロ
ーニングした。得られたＧｒｏＥＳ遺伝子断片を、ｔｒ
ｃプロモーターを有する発現ベクターに挿入し、更にこ
のプロモーター及びｒｒｎＢターミネーター領域を含む
ＧｒｏＥＳ発現領域を、ｐ１５Ａ由来の複製領域及びク
ロラムフェニコール耐性遺伝子を有するベクターに挿入
することによってＧｒｏＥＳ発現ベクターｐＡＣＹＣＧ
ｒｏＥＳを構築した。

【００３９】得られた発現ベクターｐＡＣＹＣＧｒｏＥ
Ｓを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、クロラムフ
ェニコール（７５μｇ／ｍＬ）を含む２ＸＹ．Ｔ．培地
で２３℃、１１０ｒｐｍで２４時間回転培養し、Ｇｒｏ
ＥＳの発現を行った。培養終了後、菌体を回収し、超音
波で破砕した。遠心分離で上清を回収後、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分析した結果、ＧｒｏＥＳが可溶性画分に
大量発現していることが確認できた。

【００４０】Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓ）遺伝
子をＰＣＲ法によって５’末端にＮｈｅＩサイトを、
３’末端にＸｈｏＩサイトを設け、ＮｈｅＩ及びＸｈｏ
Ｉ処理が施されたｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）₇に導入し、
ＧｒｏＥＬ７量体とＨＢｓ（Ｃ末端に６残基のヒスチジ
ンが導入される）の融合蛋白質を合成する発現ベクター
ｐＴｒｃ（ＧｒｏＥＬ）₇・ＨＢｓを構築した。

【００４１】得られた発現ベクターｐＴｒｃ（ＧｒｏＥ
Ｌ）₇・ＨＢｓ及びｐＡＣＹＣＧｒｏＥＳをＢＬ２１
（ＤＥ３）株に形質転換した後、カルベニシリン（１０
０μｇ／ｍＬ）とクロラムフェニコール（７５μｇ／ｍ
Ｌ）とを含む２ＸＹ．Ｔ．培地で２３℃、１１０ｒｐｍ
で２４時間回転培養し、ＧｒｏＥＬ−ＨＢｓ抗原融合蛋
白質とＧｒｏＥＳとの共発現を行った。

【００４２】大腸菌破砕物の可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分離後、クマシーブリラントブルー染色に
よって分析した結果、ＧｒｏＥＬ−ＨＢｓ抗原融合蛋白
質に相当するサイズのバンドが検出された。また、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ後、ブロッティングメンブランに転写し、
抗ＨＢｓ抗原ポリクローナル抗体を用いてウエスターン
ブロッティングを行った結果、ＧｒｏＥＬ７量体のみを
発現させた大腸菌抽出液では陰性であったが、融合蛋白
質の場合のみ、そのサイズ相当（約４４０ＫＤａ）の陽
性バンドが検出された。このことからＨＢｓ抗原がＧｒ
ｏＥＬ７量体との融合蛋白質として大腸菌可溶性画分に
発現することがわかった。ＨＢｓ抗原単独での発現実験
では、大腸菌の可溶性画分にも沈殿画分にも同様のウエ
スターンブロッティングで陰性であった。また、コント
ロールとしてＧｒｏＥＬとＨＢｓ抗原の融合蛋白質のみ
を発現させた場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスターンブ
ロッティングの結果から、ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ共発
現法に比べてはるかに発現量は少ないと判断できた。

【００４３】以上のことから、シャペロニンとＨＢｓ抗
原の融合蛋白質とコシャペロニンは互いに集合すること
によって複合体を形成し、ＨＢｓ抗原をキャビティ内部
に完全に格納することによってＨＢｓを大量発現させる
ことができるが、融合蛋白質のみでは立体障害やシャペ
ロニンリング構造の不安定さによってＨＢｓ抗原の大腸
菌に対する毒性が生じ、発現に抑制がかかったと考えら
れる。本実施例の発現法によって大腸菌培養液１Ｌ当た
り約７０ｍｇのＨＢｓが可溶性画分に発現していた。

【００４４】

【発明の効果】本発明によれば、目的蛋白質とシャペロ
ニンとの複合体を安定化させ、目的蛋白質をシャペロニ
ンの立体構造内部に完全に納めることにより、目的蛋白
質が宿主細胞に対して何らかの毒性を有する場合であっ
ても安定して目的蛋白質を大量に得ることのできる蛋白
質の製造方法を提供できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA20 BA80 CA07 GA11 HA01 HA20 4B064 AG01 CA19 CC24 DA01 4H045 AA10 AA20 BA41 CA11 EA60 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも、同一宿主内で共存・複製可
能な２種の異なるプラスミドに、シャペロニンと目的蛋
白質との融合蛋白質をコードする遺伝子及びコシャペロ
ニンをコードする遺伝子とをそれぞれ組み込む工程と、
前記遺伝子が組込まれた２種のプラスミドを同一宿主に
導入する工程と、前記プラスミドが導入された宿主内で
前記融合蛋白質と前記コシャペロニンとを共発現させる
工程とを有することを特徴とする蛋白質の製造方法。
【請求項２】融合蛋白質においては、シャペロニンは
そのＮ回連結体（Ｎは１〜２０）であり、目的蛋白質は
前記シャペロニンのＮ末端、Ｃ末端又はシャペロニン同
士の間にペプチド結合を介して連結されていることを特
徴とする請求項１記載の蛋白質の製造方法。
【請求項３】コシャペロニンは、Ｎ回連結体（Ｎは1
〜２０）であることを特徴とする請求項１又は２記載の
蛋白質の製造方法。
【請求項４】シャペロニンは、バクテリア又は真核生
物に由来することを特徴とする請求項１、２又は３記載
の蛋白質の製造方法。
【請求項５】宿主は、バクテリア、酵母、動物細胞、
植物細胞、昆虫細胞、動物個体、植物個体又は昆虫個体
であることを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の
蛋白質の製造方法。
【請求項６】請求項１、２、３、４又は５記載の蛋白
質の製造方法により製造される蛋白質であって、シャペ
ロニン及びコシャペロニンからなる構造の内部に、シャ
ペロニンとペプチド結合を介して封入されていることを
特徴とする蛋白質。