JP2001294599A - 組み換えｂ型肝炎ウィルス表面抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アジア人、特に日本人の抗ＨＢｓ抗体検出に
有効であり、安定した品質を有し、更に安価である組み
換えＨＢｓ抗原を提供する。 【解決手段】 組み換えａｄｒ型Ｂ型肝炎ウィルス表面
抗原及び組み換えａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原か
らなる組み換えＢ型肝炎ウィルス表面抗原。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗Ｂ型肝炎ウィル
ス抗体検査に使用可能で安価に提供でき得る組み換えＢ
型肝炎ウィルス表面抗原に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（以下、ＨＢ
ｓ抗原という）には大きく分けてａｄｒ、ａｄｗ、ａｙ
ｒ、ａｙｗの４つのサブクラスの存在が知られており、
アジア、特に日本人から検出されるＨＢｓ抗原の７０％
をａｄｒ型が占めており、残り３０％はａｄｗ型であ
る。

【０００３】Ｂ型肝炎ウィルス感染の検定法の一つに血
液中の抗ＨＢｓ抗体を検出する方法がある。これには、
患者プール血清から精製されたＨＢｓ抗原を用いる方法
が行われているが、この方法には、抗原の品質が不安定
である、感染の危険性がある、また、高価であるといっ
た問題がある。

【０００４】このため、酵母や動物細胞を宿主として生
産させた組み換えＨＢｓ抗原を用いる方法が提案された
が、従来は単一のサブクラスのＨＢｓ抗原で構成された
組み換えＨＢｓ抗原しかなく、アジア人、特に日本人の
抗ＨＢｓ抗体検査では偽陰性と判断されることがあり不
向きであった。

【０００５】

【本発明が解決する課題】本発明は、上記現状に鑑み、
アジア人、特に日本人の抗ＨＢｓ抗体検出に有効であ
り、安定した品質を有し、更に安価である組み換えＨＢ
ｓ抗原を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決する手段】本発明は、組み換えａｄｒ型Ｂ
型肝炎ウィルス表面抗原及び組み換えａｄｗ型Ｂ型肝炎
ウィルス表面抗原からなる組み換えＢ型肝炎ウィルス表
面抗原である。以下に本発明を詳述する。

【０００７】本発明の組み換えＨＢｓ抗原は、組み換え
ａｄｒ型ＨＢｓ抗原及び組み換えａｄｗ型ＨＢｓ抗原か
らなる。本発明の組み換えＨＢｓ抗原としては、組み換
えａｄｒ型ＨＢｓ抗原サブユニット及び組み換えａｄｗ
型ＨＢｓ抗原サブユニットが含まれていれば特に限定さ
れず、ＨＢｓ抗原Ｓ領域のみならず、Ｓ領域上流のＰｒ
ｅ−Ｓ１、Ｐｒｅ−Ｓ２領域のタンパク質を有していて
もよく、有していなくてもよい。本発明の組み換えＨＢ
ｓ抗原としては、ホモ組み換えａｄｒ型ＨＢｓ抗原粒子
及びホモ組み換えａｄｗ型ＨＢｓ抗原粒子からなる混合
物（以下、ａｄｒ／ｗＨＢｓという）や、組み換えａｄ
ｒ型ＨＢｓ抗原サブユニットと組み換えａｄｗ型ＨＢｓ
抗原サブユニットとから構成されるヘテロ組み換えＨＢ
ｓ抗原粒子（以下、ａｄｒｗＨＢｓという）等が挙げら
れる。

【０００８】天然型のＨＢｓ抗原は、同一のＨＢｓ抗原
サブユニットが複数集合してなる直径約２０〜２５ｎｍ
の球状粒子であり、本発明の組み換えＨＢｓ抗原もホモ
又はヘテロなサブユニットが集合して類似の粒子構造を
形成する。上記ホモ組み換えａｄｒ型ＨＢｓ抗原粒子
は、組み換えａｄｒ型ＨＢｓ抗原サブユニットのみの集
合体からなるものであり、ホモ組み換えａｄｗ型ＨＢｓ
抗原粒子は、組み換えａｄｗ型ＨＢｓ抗原サブユニット
のみの集合体からなるものである。上記ヘテロ組み換え
ＨＢｓ抗原粒子は、組み換えａｄｒ型ＨＢｓ抗原サブユ
ニットと組み換えａｄｗ型ＨＢｓ抗原サブユニットとが
混在して抗原粒子を構成してなるものである。

【０００９】本発明の組み換えＨＢｓ抗原を調製する方
法としては、例えば、以下ような方法が挙げられる。ま
ず、発現ベクターのプロモーター下流に組み換えａｄｒ
型ＨＢｓ抗原又は組み換えａｄｗ型ＨＢｓ抗原をコード
する遺伝子を各々挿入し、発現プラスミドを得る。得ら
れた発現プラスミドにより宿主を形質転換し形質転換体
を得る。得られた形質転換体にて組み換えａｄｒ型ＨＢ
ｓ抗原サブユニットと組み換えａｄｗ型ＨＢｓ抗原サブ
ユニットを別々に発現させる。

【００１０】ａｄｒ／ｗＨＢｓを調製する場合は、得ら
れた組み換えａｄｒ型ＨＢｓ抗原サブユニットと組み換
えａｄｗ型ＨＢｓ抗原サブユニットとを精製後、それら
を混合するか、又は、得られた組み換えａｄｒ型ＨＢｓ
抗原サブユニットと組み換えａｄｗ型ＨＢｓ抗原サブユ
ニットとを、別々に、変性剤で変性後、希釈又は透析す
ることによって、各抗原サブユニットを再構成する。各
抗原サブユニットは、再構成後、自発的に集合し抗原粒
子を形成する。

【００１１】ａｄｒｗＨＢｓを調製する場合は、得られ
た組み換えａｄｒ型ＨＢｓ抗原サブユニットと組み換え
ａｄｗ型ＨＢｓ抗原サブユニットとを変性剤で変性後、
両者を混合し、希釈又は透析することによって、各抗原
サブユニットを再構成する。

【００１２】ａｄｒｗＨＢｓを発現産物として直接得る
方法としては、ａｄｒ型ＨＢｓ抗原サブユニット発現ユ
ニットとａｄｗ型ＨＢｓ抗原サブユニット発現ユニット
とを同一発現プラスミド上で連結させ、宿主にて発現さ
せることが挙げられる。又は、互いに異なる複製領域と
薬剤耐性遺伝子を含む２種の発現ベクターに、ａｄｒ型
ＨＢｓ抗原サブユニット発現ユニットとａｄｗ型ＨＢｓ
抗原サブユニット発現ユニットとをそれぞれ単独で挿入
し、２種の発現プラスミドを作製し、得られた２種の発
現プラスミドで単一の宿主を形質転換し、２種の薬剤の
存在化で両プラスミドを安定的に複製させ、同一宿主内
で両遺伝子を発現させることによってもａｄｒｗＨＢｓ
が発現産物として得られる。

【００１３】上記の組み換えａｄｒ型ＨＢｓ抗原又は組
み換えａｄｗ型ＨＢｓ抗原遺伝子としては、感染患者か
ら分離されるＢ型肝炎ウイルスのゲノムＤＮＡからクロ
ーン化したものを用いることが可能である。また、化学
合成と遺伝子工学的手法との組み合わせによって調製さ
れる合成遺伝子を使用することも可能である。

【００１４】本発明の組み換えＨＢｓ抗原遺伝子を調製
する方法としては特に限定されず、例えば、ＰＣＲを用
いる方法等が挙げられ、ゲノムＤＮＡからクロー化する
場合は、例えば、ゲノムＤＮＡを鋳型として、適当な制
限酵素サイトを含むように一部の塩基配列を合成してＰ
ＣＲ用プライマーを作製し、それを用いたＰＣＲ法によ
って調製する方法等を用いることができる。

【００１５】本発明の組み換えＨＢｓ抗原の調製におい
て、上記宿主としては特に限定されず、例えば、大腸菌
等の細菌、酵母、昆虫、動物細胞等が挙げられる。なか
でも、培養日数が短い点及び培養操作が簡便で、安価に
生産できる点から、細菌又は酵母が好ましい。

【００１６】上記宿主として大腸菌を用いる場合、例え
ば、Ｔ７、ｌａｃ、ｔｒｃ等のプロモーターを有する発
現ベクターに、クローン化した組み換えＨＢｓ抗原遺伝
子を挿入し、発現プラスミドを作製することができる。

【００１７】上記宿主として酵母を用いる場合、酵母と
してはメタノール資化性酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｌｉｓを用いるのが好ましい。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｌｉｓによりＨＢｓ抗原遺伝子を発現させる方法とし
ては、酵母のアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモー
ター（ＰＡＯＸ）及びターミネーターを含む大腸菌・酵
母シャトルベクターにＨＢｓ抗原遺伝子を挿入したプラ
スミドベクターを大腸菌により調製し、得られたプラス
ミドベクターを適当な制限酵素にて一本鎖化した後、そ
れを用いて酵母を形質転換し、ＰＡＯＸ領域を介して、
酵母ゲノム上にＨＢｓ抗原遺伝子を挿入する方法等が挙
げられる。

【００１８】また、ａｄｒ型ＨＢｓ抗原遺伝子又はａｄ
ｗ型ＨＢｓ抗原遺伝子を一旦、別々のプラスミドベクタ
ーに挿入し、それぞれを一本鎖化した後に一回目の形質
転換はａｄｒＨＢｓ遺伝子を含む断片で、２回目の形質
転換はａｄｗＨＢｓ遺伝子を含む断片でというように形
質転換操作を更に繰り返し行うことによって、異なるサ
ブクラスの抗原遺伝子を複数同時に発現させる酵母を育
種することが可能となる。更に、形質転換操作を繰り返
したり、発現ユニットを複数有するシャトルベクターを
用いることによって発現効率を高めることができる。

【００１９】発現した組み換えＨＢｓ抗原を精製する方
法としては特に限定されず、例えば、硫安分画、ゲル濾
過カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマ
トグラフィー、疎水カラムクロマトグラフィー等の常法
により行うことができる。上記変性剤としては特に限定
されず、例えば、尿素、塩酸グアニン等が挙げられる。
変性したＨＢｓ抗原の透析は、常法に従い行うことがで
きる。

【００２０】本発明の組み換えＨＢｓ抗原の調製方法に
おいては、組み換えＨＢｓ抗原に高次構造を形成させる
際に、タンパク質折り畳み因子を作用させることが好ま
しい。上記タンパク質折り畳み因子としては、タンパク
質ジスルフィド結合異性化酵素（以下、ＰＤＩとい
う）、分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストラン
スイソメラーゼ（以下、ＰＰＩａｓｅという）等が挙げ
られる。これらのタンパク質折り畳み因子は単独で用い
ても、２種以上を併用してもよい。

【００２１】上記の種々のタンパク質折り畳み因子を作
用させる１の態様としては、本発明の組み換えＨＢｓ抗
原とタンパク質折り畳み因子とを宿主中で共発現させる
ことが挙げられる。タンパク質折り畳み因子はタンパク
質の正常な立体構造形成の効率を向上させるので、タン
パク質折り畳み因子と本発明の組み換えＨＢｓ抗原とを
宿主中で共発現させることにより、正しい構造を有する
抗原を高収率で得ることが可能となる。なお、本明細書
中において、共発現とは２種以上の遺伝子を宿主中で発
現させることを意味する。

【００２２】上記宿主として大腸菌を使用する場合、例
えば、クローン化した組み換えＨＢｓ抗原遺伝子をｐＢ
Ｒ系のＴ７プロモーター等を有する発現ベクターに挿入
してＨＢｓ抗原発現プラスミドを作製し、一方、ｐＢＲ
系ベクターと共存可能であるｐＡＣＹＣベクター等に、
Ｔ７プロモーター、ターミネーター等とともにＰＩＤ遺
伝子、ＰＰＩａｓｅ遺伝子、シャペロン遺伝子等のタン
パク質折り畳み因子の遺伝子を導入する。ＨＢｓ遺伝子
発現プラスミド及びタンパク質折り畳み因子の遺伝子発
現プラスミドに、互いに異なる任意の薬剤耐性遺伝子を
導入することによって、２種の発現プラスミドを大腸菌
内で維持させることが可能となる。

【００２３】上記の種々のタンパク質折り畳み因子を作
用させる他の態様としては、変性剤で変性させた本発明
の組み換えＨＢｓ抗原を再構成させる際に、上記の種々
のタンパク質折り畳み因子を共存させることが挙げられ
る。本発明の組み換えＨＢｓ抗原を再構成させる際に上
記の種々のタンパク質折り畳み因子を共存させることに
よって再構成の効率を向上させることができる。本発明
の組み換えＨＢｓ抗原とタンパク質折り畳み因子とを共
存させる方法としては、例えば、透析を行う際に、本発
明の組み換えＨＢｓ抗原に上記タンパク質折り畳み因子
を加えることにより、上記タンパク質折り畳み因子の存
在下で本発明の組み換えＨＢｓ抗原の再構成を行うこと
等が挙げられる。

【００２４】上記タンパク質ジスルフィド結合異性化酵
素は、酸化還元剤存在下でタンパク質のジスルフィド結
合の組み換えを促進する。上記タンパク質ジスルフィド
結合異性化酵素は、ほとんど全ての生物に存在し、数多
くのその遺伝子がクローン化されており、これらを利用
することが可能である。例えば、真核生物では、プロテ
ィンジサルフィドイソメラーゼがあり、バクテリアで
は、プロティンジサルフィドイソメラーゼの活性モチー
フを有するチオレドキシンであるＤｓｂファミリーが存
在する。

【００２５】上記Ｄｓｂファミリーとは、分泌タンパク
質に正しいジスルフィド結合を架けるために働く因子群
（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒ）であり、大腸菌の細胞質膜及びペリプ
ラズムには、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ
が存在している。ＤｓｂＡはジスルフィド結合導入触媒
因子、ＤｓｂＢはＤｓｂＡのリサイクリング因子、Ｄｓ
ｂＣはジスルフィド結合異性化因子、ＤｓｂＤはＤｓｂ
Ｃ因子の還元因子として分類されている（曾根、伊藤
蛋白質・核酸・酵素 ４３ １９９８）。上記ＤｓｂＡ
は、１８９残基からなるペリプラズムタンパク質であ
り、チオレドキシンの酸化還元活性部位に類似した配列
を有する。精製されたＤｓｂＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで
様々なタンパク質のジスルフィド結合を促進する（Ａｋ
ｉｙａｍａ，Ｙ．，Ｋａｍｉｔａｎｉ，Ｓ．，Ｋｕｓｕ
ｋａｗａ，Ｎ．ａｎｄ Ｉｔｏ，Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６７，１９９２）。上記ＤｓｂＣは、シ
ステイン４個をもつぺリプリズムタンパク質で、２量体
として存在する（Ｍｉｓｓｉａｋａｓ，Ｄ．，Ｇｅｒｏ
ｇｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．，Ｒａｉｎａ，Ｓ．，ＥＭＢＯ
Ｊ．，１３，１９９４）。精製されたＤｓｂＣタンパ
ク質には、高いジスルフィド結合異性活性が認められて
いる（Ｚａｐｕｎ，Ａ．，Ｍｉｓｓｉａｋａｓ，Ｄ．，
Ｒａｉｎａ，Ｓ．ａｎｄ Ｃｒｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．
Ｅ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１９９５）。

【００２６】上記タンパク質ジスルフィド結合異性化酵
素遺伝子を調製する方法としては、上記ＨＢｓ抗原遺伝
子の調製方法として例示した方法等が挙げられる。例え
ば、ゲノムＤＮＡを鋳型として、適当な制限酵素サイト
を含むように一部の塩基配列を合成してＰＣＲ用プライ
マーを作製し、それを用いたＰＣＲ法によって調製する
ことができる。

【００２７】上記タンパク質ジスルフィド結合異性化酵
素遺伝子の塩基配列としては、例えば、哺乳類由来のＰ
ＤＩがＥｄｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｌ．，Ｂｌ
ａｃｈｅｒ，Ｒ．Ｗ．ＺＲｏｔｈ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｒ
ｕｔｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１７，１９８
５等に報告されている。

【００２８】上記ＰＰＩａｓｅとは、プロリン残基のＮ
末端側ペプチド結合の回転を促進する作用を有する酵素
である。上記ＰＰＩａｓｅは、ほとんど全ての生物に存
在し、その遺伝子の数多くのものがクローン化されてい
るので、これらを利用することが可能である。ゲノム解
析の結果から、古細菌は、１つの生物で１種又は２種の
ＰＰＩａｓｅしか有していないことがわかっているのに
対して、大腸菌では少なくとも７種類のＰＰＩａｓｅを
有するので、古細菌由来のＰＰＩａｓｅは、種々のタン
パク質の折り畳み反応に適応できるものと推測できる。
従って、本発明の組み換え型ＨＢｓ抗原の調製方法にお
いては、古細菌由来のＰＰＩａｓｅ遺伝子が好ましい。

【００２９】上記古細菌としては特に限定されず、例え
ば、スルホロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスル
ホロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、
ピロディクティム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）属、サー
モフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモプロ
テウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、ピロバキュ
ラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｍ）属、ピロコッカス（Ｐｙ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、メサノバクテリウム（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノコッカス（Ｍｅ
ｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メサノピラス（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｐｙｒｕｓ）属、メサノサーマス（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、アーキアブロブス（Ａｒｃｈａ
ｅｏｇｌｏｂｕｓ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メサノプラナス（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｐｌａｎｕｓ）属、メサノスピリラム（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、メサノサルシア（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属等が挙げられる。上記古細菌
由来のＰＰＩａｓｅのなかでも、メタノコッカス属であ
るメタノコッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈ
ｉｃｕｓ）及びメタノコッカス・ボルタエ（Ｍｅｔｈａ
ｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ）由来のＰＰＩａｓｅ
は、他のＰＰＩａｓｅが有するペプチジルプロリンシス
−トランス異性化作用及びポリペプチド鎖の折り畳み作
用だけでなく、シャペロニン様のタンパク質の不可逆的
凝集抑制作用も併せ持ち、組み換えＨＢｓ抗原を安定化
する効果が大きいので好ましい。

【００３０】上記ＰＰＩａｓｅ遺伝子を調製する方法と
しては、上記ＨＢｓ抗原遺伝子の調製方法として例示し
た方法等が挙げられる。例えば、上記古細菌由来のＰＰ
Ｉａｓｅ遺伝子として、メタノコッカス・サーモリソト
ロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｕｕｓ ｔｈｅｒｍ
ｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ：ＡＴＣＣ３５０９
７）由来のものを使用する場合、そのＤＮＡ配列は特開
平１０−９１号公報に記載されており、それを利用する
ことができる。また、工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ Ｐ−１５６２２として寄託されているプ
ラスミドｐＵＦＫＣ１を鋳型として、適当な制限酵素サ
イトを含むように一部の塩基配列を合成してＰＣＲ用プ
ライマーを作製し、それを用いたＰＣＲ法によって、メ
タノコッカス・サーモリソトロフィカス由来ＰＰＩａｓ
ｅ遺伝子を得ることもできる。

【００３１】上記分子シャペロンは、熱ショックタンパ
ク質の一種であり、細胞が温度変化等の様々な環境スト
レスに曝された際に生産され、ＡＴＰ存在下、タンパク
質の折り畳みや安定化に関与することが知られている。
上記分子シャペロンとしては、バクテリア型のＧｒｏｕ
ｐＩ型、並びに、真核生物及び古細菌型のＧｒｏｕｐＩ
Ｉ型シャペロンが知れられているが、ＧｒｏｕｐＩ型シ
ャペロンであるＧｒｏＥＬは別の因子であるＧｒｏＥＳ
の助けを必要とする。一方、ＧｒｏｕｐＩＩ型のなかで
も古細菌由来の分子シャペロンは、ＧｒｏＥＳ分子がな
くても充分にその機能を発現することができる（Ｆｕｒ
ｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２７３，２８３９９−２８４０７）ので、
古細菌由来のものを用いることが好ましい。

【００３２】上記古細菌としては特に限定されず、例え
ば、スルホロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）属、デスル
ホロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、
ピロディクティム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）属、サー
モフィラス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ）属、サーモプロ
テウス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ）属、ピロバキュ
ラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｍ）属、ピロコッカス（Ｐｙ
ｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、メサノバクテリウム（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノコッカス（Ｍｅ
ｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、メサノピラス（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｐｙｒｕｓ）属、メサノサーマス（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｔｈｅｒｍｕｓ）属、アーキアブロブス（Ａｒｃｈａ
ｅｏｇｌｏｂｕｓ）属、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メサノプラナス（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｐｌａｎｕｓ）属、メサノスピリラム（Ｍｅｔｈａｎ
ｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、メサノサルシア（Ｍｅｔｈ
ａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属等が挙げられる。

【００３３】上記分子シャペロン遺伝子を調製する方法
としては、上記ＨＢｓ抗原遺伝子の調製方法として例示
した方法等が挙げられる。例えば、上記古細菌由来のシ
ャペロン遺伝子として、上記メタノコッカス属のメタノ
コッカス・サーモリソトロフィカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃ
ｏｃｕｕｓ ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕ
ｓ：ＡＴＣＣ３５０９７）由来のものを使用する場合、
「Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，２８３９９」に記
載のＤＮＡ塩基配列を利用することができる。

【００３４】また、上記古細菌メタノコッカス・サーモ
リソトロフィカスについては、工業技術院生命工学工業
技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ―１６４３８として
寄託されているプラスミドｐＥＴＴＳＩを鋳型として、
適当な制限酵素サイトを含むように一部の塩基配列を合
成してＰＣＲ用プライマーを作製し、それを用いたＰＣ
Ｒ法によって、メタノコッカス・サーモリソトロフィカ
ス由来シャペロン遺伝子を得ることもできる。

【００３５】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。

【００３６】実施例１ 配列番号１に示されるａｄｒ型ＨＢｓ抗原Ｓ領域をコー
ドする遺伝子をＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断後、同制限
酵素処理が施されたＴ７プロモーターを有する発現ベク
ターに導入し、ｐＴｒＨＢを作製した。配列番号２に示
されるａｄｗ型ＨＢｓ抗原Ｓ領域をコードする遺伝子を
ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断後、同制限酵素処理が施さ
れたＴ７プロモーターを有する発現ベクターに導入し、
ｐＴｗＨＢを作製した。ｐＴｗＨＢをＢｇｌＩＩ−Ｂａ
ｍＨＩ処理することによってａｄｗ型ＨＢｓ遺伝子の発
現ユニットを切り出し、回収した。これと、ＢａｍＨＩ
処理及び、大腸菌由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡ
Ｐ）による脱リン酸化処理が施されたｐＴｒＨＢをリガ
ーゼによって連結することによって両サブユニット遺伝
子を同時に発現させる発現ベクターｐＴｒｗＨＢを作製
した。

【００３７】一方、大腸菌ＤｓｂＡ遺伝子を含有するＴ
７プロモーター系の発現ベクターｐＴＤＡをＢｇｌＩＩ
−ＢａｍＨＩ処理することによって本酵素遺伝子発現系
を切り出し、回収した。これと、ＢｇｌＩＩ処理及び、
大腸菌由来アルカリフォスファターゼによる脱リン酸化
処理が施されたｐＴｒｗＨＢをリガーゼによって連結さ
せることによって、ａｄｒ型ＨＢｓ遺伝子、ａｄｗ型Ｈ
Ｂｓ遺伝子及びＤｓｂＡ遺伝子を同時に発現させる発現
ベクターｐＴｒｗＨＢＤＡを作製した。

【００３８】発現ベクターｐＴｒｗＨＢＤＡを保持する
大腸菌をカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２
ＸＹＴ培地（トリプトン２０ｇ、酵母エキス８ｇ、Ｎａ
Ｃｌ５ｇ／Ｌ）にてＯＤ６００ｎｍが０．６−１．０ま
で３７℃で培養した後、０．１ｍＭＩＰＴＧを添加する
ことによって発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後、更に４
時間培養を行い、菌体を回収した。

【００３９】大腸菌を回収後、超音波破砕によって破砕
し、上清を回収した。上清に３５％飽和硫安を添加し、
４℃で３時間放置した後、遠心分離によって沈殿画分を
回収する。沈殿画分を２０％硫安を含む、５０ｍＭＫ２
／Ｋリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、フェニルセ
ファロース担体による疎水クロマトグラフィーによって
分離した。各画分について「ＨＢｓ抗原測定用ＥＩＡキ
ット、エンザイグノストＨＢｓＡｇｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ」（ヘキスト・ベーリングダイアグノティック社）を
用いるＥＩＡによってＨＢｓの存在する画分を回収し
た。回収したＨＢｓ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
を行った結果、ほぼ純粋なＨＢｓタンパク質であること
が判明した。

【００４０】本実施例で得られた組み換えａｄｒｗＨＢ
ｓ抗原が固相化された９６穴プレートを用いてＢ型肝炎
感染患者抗体陽性血清５０件体について抗ＨＢｓ抗体検
査を行った。検査結果を表１に示す。組み換え型ａｄｒ
ｗＨＢｓ抗原によって１００％の確率で抗ＨＢｓ抗体が
検出可能であった。５０件体Ｂ型肝炎感染患者抗体陽性
血清は患者プール血清から精製された固相化ＨＢｓ抗原
を用いるＥＩＡによって陽性であったものを用いた。こ
のことから、本発明によって得られる組み換えａｄｒｗ
ＨＢｓ抗原は、診断薬として患者由来ＨＢｓ抗原と同レ
ベルの性能を示すことがわかった。

【００４１】実施例２ 古細菌メタノコッカス・サーモリソトロフィックス由来
ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ遺伝子
（Ｆｕｒｕｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１９９８，１９０，３８８−３９４）を含有する
Ｔ７プロモーター系の発現ベクターｐＴＭｔＣｐｎをＢ
ｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ処理することによってＰＰＩａｓ
ｅ遺伝子発現系を切り出し、回収した。これと、Ｂａｍ
ＨＩ処理及び、大腸菌由来アルカリフォスファターゼ
（ＢＡＰ）による脱リン酸化処理が施された実施例１で
得られたｐＴｒｗＨＢＤＡをリガーゼによって連結する
ことによって両サブユニット、ＤｓｂＡ及びＰＰＩａｓ
ｅ遺伝子を同時に発現させる発現ベクターｐＴｒｗＨＢ
ＤＡＦＫを作製した。

【００４２】得られた発現ベクターｐＴｒｗＨＢＤＡＦ
Ｋを保持する大腸菌を実施例１と同様にして培養し、菌
体を回収した。大腸菌を回収後、実施例１と同様にして
ＨＢｓの存在する画分を回収した。回収したＨＢｓ画分
をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、ほぼ純粋
なＨＢｓタンパク質であることが判明した。可溶性画分
でのＨＢｓの発現量は実施例１での発現ベクターｐＴｒ
ｗＨＢＤＡを用いる場合より上昇した。

【００４３】本実施例で得られた組み換えａｄｒｗＨＢ
ｓ抗原が固相化された９６穴プレートを用いてＢ型肝炎
感染患者抗体陽性血清５０件体について抗ＨＢｓ抗体検
査を行った。検査結果を表１に示す。組み換え型ａｄｒ
ｗＨＢｓ抗原によって１００％の確率で抗ＨＢｓ抗体が
検出可能であった。５０件体Ｂ型肝炎感染患者抗体陽性
血清は患者プール血清から精製された固相化ＨＢｓ抗原
を用いるＥＩＡによって陽性であったものを用いた。こ
のことから、本発明によって得られる組み換えａｄｒｗ
ＨＢｓ抗原は、診断薬として患者由来ＨＢｓ抗原と同レ
ベルの性能を示すことがわかった。

【００４４】実施例３ 配列番号１に示されるａｄｒ型ＨＢｓ抗原Ｓ領域をコー
ドする遺伝子をＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断後、同制限
酵素処理が施されたＴ７プロモーターを有する発現ベク
ターに導入し、ｐＴｒＨＢを作製した。大腸菌ＤｓｂＡ
遺伝子を含有するＴ７プロモーター系の発現ベクターｐ
ＴＭｔＦＫをＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ処理することによ
って本酵素遺伝子発現系を切り出し、回収した。これ
と、ＢｇｌＩＩ処理及び、大腸菌由来アルカリフォスフ
ァターゼによる脱リン酸化処理が施されたｐＴｒＨＢを
リガーゼによって連結させることによって、ａｄｒ型Ｈ
Ｂｓ遺伝子及び、ＤｓｂＡ遺伝子を同時に発現させる発
現ベクターｐＴｒＨＢＤＡを作製した。

【００４５】配列番号２に示されるａｄｗ型ＨＢｓ抗原
Ｓ領域をコードする遺伝子をＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切
断後、同制限酵素処理が施されたＴ７プロモーターを有
する発現ベクターに導入し、ｐＴｗＨＢを作製した。大
腸菌ＤｓｂＡ遺伝子を含有するＴ７プロモーター系の発
現ベクターｐＴＭｔＦＫをＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ処理
することによって本酵素遺伝子発現系を切り出し、回収
した。これと、ＢｇｌＩＩ処理及び、大腸菌由来アルカ
リフォスファターゼによる脱リン酸化処理が施されたｐ
ＴｒＨＢをリガーゼによって連結させることによって、
ａｄｗ型ＨＢｓ遺伝子及び、ＤｓｂＡ遺伝子を同時に発
現させる発現ベクターｐＴｗＨＢＤＡを作製した。

【００４６】得られた発現ベクターｐＴｒＨＢＤＡを保
持する大腸菌を実施例１と同様にして培養し、菌体を回
収した。大腸菌を回収後、実施例１と同様にしてＨＢｓ
の存在する画分を回収した。回収したＨＢｓ画分をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、ほぼ純粋なａｄ
ｒＨＢｓタンパク質であることが判明した。

【００４７】得られた発現ベクターｐＴｗＨＢＤＡを保
持する大腸菌も、また、実施例１と同様にして培養し、
菌体を回収した。大腸菌を回収後、実施例１と同様にし
てＨＢｓの存在する画分を回収した。回収したＨＢｓ画
分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、ほぼ純
粋なａｄｗＨＢｓタンパク質であることが判明した。

【００４８】このようにして得られた、組み換え型ａｄ
ｒＨＢｓ及びａｄｗＨＢｓを２：１で混合し、ａｄｒ／
ｗＨＢｓ抗原とした。本実施例で得られる、組み換えａ
ｄｒ／ｗＨＢｓ抗原が固相化された９６穴プレートを用
いてＢ型肝炎感染患者抗体陽性血清５０件体について抗
ＨＢｓ抗体検査を行った。検査結果を表１に示す。組み
換え型ａｄｒ／ｗＨＢｓ抗原によって１００％の確率で
抗ＨＢｓ抗体が検出可能であった。５０件体Ｂ型肝炎感
染患者抗体陽性血清は患者プール血清から精製された固
相化ＨＢｓ抗原を用いるＥＩＡによって陽性であったも
のを用いた。このことから、本発明によって得られる組
み換えａｄｒ／ｗＨＢｓ抗原は、診断薬として患者由来
ＨＢｓ抗原と同レベルの性能を示すことがわかった。

【００４９】実施例４ 酵母・大腸菌シャトルベクターｐＡＯ８１５（インビト
ロジェン社）のＥｃｏＲＩ切断部位にａｄｒＨＢｓ遺伝
子が導入されたベクターｐＡｒＨＢｓを構築した。本プ
ラスミドを大量回収後、ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩによっ
て切断し、ａｄｒＨＢｓ遺伝子発現ユニットを電気泳動
によって分離回収した。回収された発現ユニット断片を
リガーゼによる連結反応を行った後、ＢｇｌＩＩ−Ｂａ
ｍＨＩにように切断を行い、Ｈｅａｄ ｔｏ Ｔａｉｌ
で発現ユニットが３つ連結した約６．５Ｋｂの遺伝子を
得た。これを電気永動で分離回収後、ＢａｍＨＩ処理及
びＢＡＰ処理が施されたｐＡｒＨＢｓに導入し、ａｄｒ
ＨＢｓ遺伝子発現ユニットが一方向に４回連結したベク
ターｐＡ４ｒＨＢｓを得た。

【００５０】一方、酵母・大腸菌シャトルベクターｐＡ
Ｏ８１５のＥｃｏＲＩ切断部位にａｄｗＨＢｓ遺伝子が
導入されたベクターｐＡｗＨＢｓを構築した。本プラス
ミドを大量回収後、ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩによって切
断し、ａｄｗＨＢｓ遺伝子発現ユニットを電気泳動しよ
って分離回収した。回収された発現ユニット断片をリガ
ーゼによる連結反応を行った後、ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨ
Ｉにようる切断を行い、Ｈｅａｄ ｔｏ Ｔａｉｌで発
現ユニットが３つ連結した約６．５Ｋｂの遺伝子を得
た。これを電気永動で分離回収後、ＢａｍＨＩ処理及び
ＢＡＰ処理が施されたｐＡｗＨＢｓに導入し、ａｄｗＨ
Ｂｓ遺伝子発現ユニットが一方向に４回連結したベクタ
ーｐＡ４ｗＨＢｓを得た。

【００５１】このように構築されたｐＡ４ｗＨＢｓを大
量調製後、ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ切断し、４回繰り返
される約９．５ＫｂのａｄｗＨＢｓ遺伝子発現ユニット
を電気泳動によって分離回収した。これを、ＢａｍＨＩ
処理及びＢＡＰ処理が施されたｐＡｒ４ＨＢｓに導入
し、ａｄｒＨＢｓ遺伝子発現ユニット及びａｄｗＨＢｓ
遺伝子発現ユニットがともに一方向に４回連結したベク
ターｐＡ４ｒｗＨＢｓを得た。

【００５２】構築されたベクターｐＡ４ｒｗＨＢｓを大
量調製し、ＳａｃＩによる切断によって一本鎖とした。
得られた一本鎖ｐＡ４ｒｗＨＢｓをメタノール資化性酵
母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５株に形質
転換を行いヒスチジンを含まない完全合成培地にてクロ
ーンを選択した。生育したクローンＰ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓＧＳ４ｒｗＨＢをＭＤ培地（１．３４％Ｙｅａｓｔ
ｎｉｔｒｏｇｅｎｂａｓｅ，４Ｘ１０−５Ｂｉｏｔｉ
ｎ，２％ｄｅｘｔｒｏｓｅ）にて培養後、ゲノムを回収
し、ゲノムをＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩで完全消化した
後、ジオキシゲニン標識されたａｄｗＨＢｓ遺伝子をプ
ローブとして用いるサザンハイブリダイゼーションによ
って、約１８〜１９ｋＤａの単一遺伝子バンドが強く検
出された。これによって、ａｄｒＨＢｓ遺伝子発現ユニ
ット及びａｄｗＨＢｓ遺伝子発現ユニットがともに一方
向に４回連結した領域がゲノムに取り込まれていること
が確認できた。

【００５３】Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ４ｒｗＨＢ株を
ＭＧＹ培地（１．３４％Ｙｅａｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｂ
ａｓｅ，１％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，４Ｘ１０−５Ｂｉｏｔ
ｉｎ）にてＯＤ６００ｎｍが２．０になるまで３０℃で
培養した後、ＭＭ培地（１．３４％Ｙｅａｓｔ ｎｉｔ
ｒｏｇｅｎｂａｓｅ，４Ｘ１０−５Ｂｉｏｔｏｉｎ，
０．５％Ｍｅｔｈａｎｏｌ）にて３０℃で培養を５日間
行った。ＭＭに移植してから、毎日最終濃度０．５％の
メタノールを培地に添加した。

【００５４】培養終了後、２５ｍｌの培養液から菌体を
遠心分離で回収し、菌体を３ｍｌのＫ２／Ｋリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）にけん濁し、約同量の酸処理されたガ
ラスビーズを添加し、振とうすることによて菌体を破砕
した。遠心分離によって上清を回収し、上清を２ｍｇ／
ｍｌ濃度にＫ２／Ｋリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈
した後、３５％飽和硫安を添加し、４℃で５時間放置し
た。塩析後、遠心分離によって沈殿を回収し、２０％飽
和硫安を含む５０ｍＭＫ２／Ｋリン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に溶解後、フェニルセファロース担体による疎水ク
ロマトグラフィーによって分離した。各画分について
「ＨＢｓ抗原測定用ＥＩＡキット、エンザイグノストＨ
ＢｓＡｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ」を用いるＥＩＡによっ
てＨＢｓの存在する画分を回収した。回収したＨＢｓ画
分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、ほぼ純
粋なＨＢｓタンパク質であることが判明した。

【００５５】本実施例で得られる、組み換えａｄｒｗＨ
Ｂｓ抗原が固相化された９６穴プレートを用いて、Ｂ型
肝炎感染患者血清５０件体について抗ＨＢｓ抗体検査を
行った。検査結果を表１に示す。酵母で作製した組み換
え型ａｄｒｗＨＢｓ抗原によって１００％の確率で抗Ｈ
Ｂｓ抗体が検出可能であった。このことから、本発明に
よって得られる組み換えａｄｒ／ｗＨＢｓ抗原は、診断
薬として患者由来ＨＢｓ抗原と同レベルの性能を示すこ
とがわかった。

【００５６】実施例５ 実施例１と同様にしてａｄｒ型ＨＢｓ抗原及びａｄｗ型
ＨＢｓ抗原の両サブユニット遺伝子を同時に発現させる
発現ベクターｐＴｒｗＨＢを作製した。一方、古細菌メ
タノコッカス・サーモリソトロフィックス由来ペプチジ
ルプロリルシストランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）
遺伝子（Ｆｕｒｕｔａｎｉ ｅｔａｌ．，１９９８，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９８，１９０，３８８
−３９４）を含有するＴ７プロモーター系の発現ベクタ
ーｐＴＭｔＦＫをＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ処理すること
によって本酵素遺伝子発現系を切り出し、回収した。こ
れと、ＢｇｌＩＩ処理及び、大腸菌由来アルカリフォス
ファターゼによる脱リン酸化処理が施されたｐＴｒｗＨ
Ｂをリガーゼによって連結させることによって、ａｄｒ
型ＨＢｓ遺伝子、ａｄｗ型ＨＢｓ遺伝子及びＰＰＩａｓ
ｅ遺伝子を同時に発現させる発現ベクターｐＴｒｗＨＢ
ＦＫを作製した。

【００５７】得られた発現ベクターｐＴｒｗＨＢＦＫを
保持する大腸菌を実施例１と同様にして培養し、菌体を
回収した。大腸菌を回収後、実施例１と同様にしてＨＢ
ｓの存在する画分を回収した。回収したＨＢｓ画分をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、ほぼ純粋なＨ
Ｂｓタンパク質であることが判明した。

【００５８】本実施例で得られた組み換えａｄｒｗＨＢ
ｓ抗原が固相化された９６穴プレートを用いてＢ型肝炎
感染患者抗体陽性血清５０件体について抗ＨＢｓ抗体検
査を行った。検査結果を表１に示す。組み換え型ａｄｒ
ｗＨＢｓ抗原によって１００％の確率で抗ＨＢｓ抗体が
検出可能であった。５０件体Ｂ型肝炎感染患者抗体陽性
血清は患者プール血清から精製された固相化ＨＢｓ抗原
を用いるＥＩＡによって陽性であったものを用いた。こ
のことから、本発明によって得られる組み換えａｄｒｗ
ＨＢｓ抗原は、診断薬として患者由来ＨＢｓ抗原と同レ
ベルの性能を示すことがわかった。

【００５９】実施例６ 古細菌メタノコッカス・サーモリソトロフィックス由来
分子シャペロン、ＨＳＰ６０遺伝子（Ｆｕｒｕｔａｎｉ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９
８，２７３，２８３９９−２８４０７）を含有するＴ７
プロモーター系の発現ベクターｐＴＭｔＣｐｎをＢｇｌ
ＩＩ−ＢａｍＨＩ処理することによってＨＳＰ６０遺伝
子発現系を切り出し、回収した。これと、ＢａｍＨＩ処
理及び、大腸菌由来アルカリフォスファターゼ（ＢＡ
Ｐ）による脱リン酸化処理が施された実施例５で得られ
たｐＴｒｗＨＢＦＫをリガーゼによって連結することに
よって両サブユニット、ＰＰＩａｓｅ及びＨＳＰ６０遺
伝子を同時に発現させる発現ベクターｐＴｒｗＨＢＦＫ
Ｃｐｎを作製した。

【００６０】得られた発現ベクターｐＴｒｗＨＢＦＫＣ
ｐｎを保持する大腸菌を実施例１と同様にして培養し、
菌体を回収した。大腸菌を回収後、実施例１と同様にし
てＨＢｓの存在する画分を回収した。回収したＨＢｓ画
分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、ほぼ純
粋なＨＢｓタンパク質であることが判明した。可溶性画
分でのＨＢｓの発現量は実施例５での発現ベクターｐＴ
ｒｗＨＢＦＫを用いる場合より上昇した。

【００６１】本実施例で得られた組み換えａｄｒｗＨＢ
ｓ抗原が固相化された９６穴プレートを用いてＢ型肝炎
感染患者抗体陽性血清５０件体について抗ＨＢｓ抗体検
査を行った。検査結果を表１に示す。組み換え型ａｄｒ
ｗＨＢｓ抗原によって１００％の確率で抗ＨＢｓ抗体が
検出可能であった。５０件体Ｂ型肝炎感染患者抗体陽性
血清は患者プール血清から精製された固相化ＨＢｓ抗原
を用いるＥＩＡによって陽性であったものを用いた。こ
のことから、本発明によって得られる組み換えａｄｒｗ
ＨＢｓ抗原は、診断薬として患者由来ＨＢｓ抗原と同レ
ベルの性能を示すことがわかった。

【００６２】実施例７ 配列番号１に示されるａｄｒ型ＨＢｓ抗原Ｓ領域をコー
ドする遺伝子をＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切断後、同制限
酵素処理が施されたＴ７プロモーターを有する発現ベク
ターに導入し、ｐＴｒＨＢを作製した。古細菌メタノコ
ッカス・サーモリソトロフィックス由来ペプチジルプロ
リルシストランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）遺伝子
を含有するＴ７プロモーター系の発現ベクターｐＴＭｔ
ＦＫをＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ処理することによって本
酵素遺伝子発現系を切り出し、回収した。これと、Ｂｇ
ｌＩＩ処理及び、大腸菌由来アルカリフォスファターゼ
による脱リン酸化処理が施されたｐＴｒＨＢをリガーゼ
によって連結させることによって、ａｄｒ型ＨＢｓ遺伝
子及び、ＰＰＩａｓｅ遺伝子を同時に発現させる発現ベ
クターｐＴｒＨＢＦＫを作製した。

【００６３】配列番号２に示されるａｄｗ型ＨＢｓ抗原
Ｓ領域をコードする遺伝子をＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩで切
断後、同制限酵素処理が施されたＴ７プロモーターを有
する発現ベクターに導入し、ｐＴｗＨＢを作製した。古
細菌メタノコッカス・サーモリソトロフィックス由来ペ
プチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（ＰＰＩａ
ｓｅ）遺伝子を含有するＴ７プロモーター系の発現ベク
ターｐＴＭｔＦＫをＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ処理するこ
とによって本酵素遺伝子発現系を切り出し、回収した。
これと、ＢｇｌＩＩ処理及び、大腸菌由来アルカリフォ
スファターゼによる脱リン酸化処理が施されたｐＴｒＨ
Ｂをリガーゼによって連結させることによって、ａｄｗ
型ＨＢｓ遺伝子及び、ＰＰＩａｓｅ遺伝子を同時に発現
させる発現ベクターｐＴｗＨＢＦＫを作製した。

【００６４】得られた発現ベクターｐＴｒＨＢＦＫを保
持する大腸菌を実施例１と同様にして培養し、菌体を回
収した。大腸菌を回収後、実施例１と同様にしてＨＢｓ
の存在する画分を回収した。回収したＨＢｓ画分をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、ほぼ純粋なａｄ
ｒＨＢｓタンパク質であることが判明した。

【００６５】発現ベクターｐＴｗＨＢＦＫを保持する大
腸菌も、また、実施例１と同様にして培養し、菌体を回
収した。大腸菌を回収後、実施例１と同様にしてＨＢｓ
の存在する画分を回収した。回収したＨＢｓ画分をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる分析を行った結果、ほぼ純粋なａｄ
ｗＨＢｓタンパク質であることが判明した。

【００６６】このようにして得られた、組み換え型ａｄ
ｒＨＢｓ及びａｄｗＨＢｓを２：１で混合し、ａｄｒ／
ｗＨＢｓ抗原とした。本実施例で得られた組み換えａｄ
ｒ／ｗＨＢｓ抗原が固相化された９６穴プレートを用い
てＢ型肝炎感染患者抗体陽性血清５０件体について抗Ｈ
Ｂｓ抗体検査を行った。検査結果を表１に示す。組み換
え型ａｄｒ／ｗＨＢｓ抗原によって１００％の確率で抗
ＨＢｓ抗体が検出可能であった。５０件体Ｂ型肝炎感染
患者抗体陽性血清は患者プール血清から精製された固相
化ＨＢｓ抗原を用いるＥＩＡによって陽性であったもの
を用いた。このことから、本発明によって得られる組み
換えａｄｒ／ｗＨＢｓ抗原は、診断薬として患者由来Ｈ
Ｂｓ抗原と同レベルの性能を示すことがわかった。

【００６７】比較例１ 実施例４で調製されたｐＡ４ｒＨＢ由来ＨＢｓ遺伝子発
現系が導入された酵母での発現産物が固相化された９６
穴プレートを用いてＢ型肝炎感染患者抗体陽性血清５０
件体について抗ＨＢｓ抗体検査を行った。検査結果を表
１に示す。ａｄｒＨＢｓのみを用いると９４％の確率で
抗ＨＢｓ抗体が検出可能であったが、偽陰性が出現する
ことがわかった。

【００６８】比較例２ 実施例４で調製されたｐＡ４ｗＨＢ由来ＨＢｓ遺伝子発
現系が導入された酵母での発現産物が固相化された９６
穴プレートを用いてＢ型肝炎感染患者抗体陽性血清５０
件体について抗ＨＢｓ抗体検査を行った。検査結果を表
１に示す。ａｄｗＨＢｓのみを用いると８８％の確率で
抗ＨＢｓ抗体が検出可能であったが、ａｄｒＨＢを用い
る場合より偽陰性が出現しやすくなることがわかった。

【００６９】

【表１】

【００７０】表１に記載の結果より、実施例の組み換え
ＨＢｓ抗原は陽性の血清全てと反応したが、比較例１及
び２では、反応しない血清があり、ａｄｒ型又はａｄｗ
型のいずれかの抗原のみを用いた抗体検査では偽陰性が
出現することが示された。

【００７１】

【発明の効果】本発明は、上述の構成よりなり、アジア
人、特に日本人の抗ＨＢｓ抗体検出に有効であり、安定
した品質を有し、更に安価である組み換えＨＢｓ抗原を
提供することができる。

【００７２】

【配列表】 <110> 積水化学工業株式会社 SEKISUI CHEMICAL CO., LTD. <120> 組み換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原 <130> 00P00735 <160> 2 <210> 1 <211> 678 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 1 atg gaa aac act act tct ggt ttc ctg ggt ccg ctg ctg gta ctg cag 48 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gca ggt ttc ttc ctg ctg aca cgt atc ctc aca att cca cag tct ctg 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tct tgg tgg act tct ctc aat ttt ctg ggt ggt gca ccg act tgc 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 cct ggc caa aat tct cag tcc cca acc tcc aat cac tct cca acc tct 192 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgc cct cca att tgc cct ggc tat cgc tgg atg tgc ctg cgt cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc att ttc ctc ttc atc ctg ctg ctg tgc ctc atc ttc ctg ctg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gac tac caa ggt atg ctg cca gtt tgc cct ctg ctt cca ggt 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 aca tct acc acc agc act ggt cca tgc aag acc tgc act att cct gct 384 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 caa ggt acc tct atg ttt ccg tct tgc tgc tgc aca aaa cct tct gac 432 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 ggt aac tgc act tgc att ccg atc cca tct tcc tgg gct ttc gca cgt 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg 145 150 155 160 ttc ctg tgg gag tgg gcc tct gtc cgt ttc tcc tgg ctc tct ctg ctg 528 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggt ctg tct ccg act gtt tgg ctg 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tct gtt att tgg atg atg tgg tat tgg ggt cca tct ctg tac aac atc 624 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 ctg tct ccg ttt ctg cct ctg ctg cca att ttc ttc tgc ctt tgg gta 672 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att 678 Tyr Ile 225 <210> 2 <211> 678 <212> DNA <213> Type B hepatitis virus <220> <221> CDS <222> 1..678 <400> 2 atg gaa aac act act tct ggt ttc ctg ggt ccg ctg ctg gta ctg cag 48 Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 gca ggt ttc ttc ctg ctg aca cgt atc ctc aca att cca cag tct ctg 96 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 gac tct tgg tgg act tct ctc aat ttt ctg ggt ggt gca ccg act tgc 144 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys 35 40 45 cct ggc caa aat tct cag tcc cca acc tcc aat cac tct cca acc tct 192 Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 tgc cct cca att tgc cct ggc tat cgc tgg atg tgc ctg cgt cgt ttt 240 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 atc att ttc ctc ttc atc ctg ctg ctg tgc ctc atc ttc ctg ctg gtt 288 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 ctt ctg gac tac caa ggt atg ctg cca gtt tgc cct ctg ctt cca ggt 336 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly 100 105 110 aca tct acc acc agc act ggt cca tgc aag acc tgc act att cct gct 384 Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala 115 120 125 caa ggt acc tct atg ttt ccg tct tgc tgc tgc aca aaa cct tct gac 432 Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp 130 135 140 ggt aac tgc act tgc att ccg atc cca tct tcc tgg gct ttc gca aaa 480 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 ttc ctg tgg gag tgg gcc tct gtc cgt ttc tcc tgg ctc tct ctg ctg 528 Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggt ctg tct ccg act gtt tgg ctg 576 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 tct gtt att tgg atg atg tgg tat tgg ggt cca tct ctg tac aac atc 624 Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile 195 200 205 ctg tct ccg ttt ctg ccg ctg ctg cca att ttc ttc tgc ctt tgg gta 672 Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 tac att 678 Tyr Ile 225

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA14 BA33 CA03 DA06 DA12 EA04 FA02 FA15 4B064 AG33 BA14 CA02 CA06 CA19 CC24 DA15 4H045 AA11 BA10 BA41 CA02 DA86 EA53 FA73 FA74 HA05

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 組み換えａｄｒ型Ｂ型肝炎ウィルス表面
   抗原及び組み換えａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原か
   らなる組み換えＢ型肝炎ウィルス表面抗原。
2. 【請求項２】 ホモ組み換えａｄｒ型Ｂ型肝炎ウィルス
   表面抗原粒子及びホモ組み換えａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィル
   ス表面抗原粒子からなることを特徴とする請求項１記載
   の組み換えＢ型肝炎ウィルス表面抗原。
3. 【請求項３】 組み換えａｄｒ型Ｂ型肝炎ウィルス表面
   抗原サブユニットと組み換えａｄｗ型Ｂ型肝炎ウィルス
   表面抗原サブユニットとから構成されるヘテロ抗原粒子
   からなることを特徴とする請求項１記載の組み換えＢ型
   肝炎ウィルス表面抗原。