JPH1084967A - Ｂ型肝炎のｅ抗原 - Google Patents
Ｂ型肝炎のｅ抗原Info
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- JPH1084967A JPH1084967A JP8248421A JP24842196A JPH1084967A JP H1084967 A JPH1084967 A JP H1084967A JP 8248421 A JP8248421 A JP 8248421A JP 24842196 A JP24842196 A JP 24842196A JP H1084967 A JPH1084967 A JP H1084967A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、安全かつ大量に調製でき、かつ、
HBe陽性血清に対する特異性の高い完全なHBe抗原を提供
することを課題とする。 【解決手段】 HBe遺伝子を含むDNAを単離するために、
ヒト血清より単離したHBVゲノムクローンを鋳型とし
て、PCR法を行い、得られたPCR産物をプラスミドに挿入
し、大腸菌に形質転換した。さらに、得られた形質転換
体をIPTGで処理して導入遺伝子の発現を誘導し、ウエス
タンブロッティング法により、目的のHBe抗原が得られ
ているかを確認したところ、HBe抗体陽性血清に特異的
に反応するタンパク質のバンドが、推定されるHBe抗原
の分子量の位置に検出された。
HBe陽性血清に対する特異性の高い完全なHBe抗原を提供
することを課題とする。 【解決手段】 HBe遺伝子を含むDNAを単離するために、
ヒト血清より単離したHBVゲノムクローンを鋳型とし
て、PCR法を行い、得られたPCR産物をプラスミドに挿入
し、大腸菌に形質転換した。さらに、得られた形質転換
体をIPTGで処理して導入遺伝子の発現を誘導し、ウエス
タンブロッティング法により、目的のHBe抗原が得られ
ているかを確認したところ、HBe抗体陽性血清に特異的
に反応するタンパク質のバンドが、推定されるHBe抗原
の分子量の位置に検出された。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質工学の
分野に属する。
分野に属する。
【０００２】
【従来の技術】B型肝炎は、現在、肝疾患の中で最も多
い疾患であり、B型肝炎ウイルス（HBV）がヒトに感染す
ることにより引き起こされるウイルス性肝炎である。
い疾患であり、B型肝炎ウイルス（HBV）がヒトに感染す
ることにより引き起こされるウイルス性肝炎である。
【０００３】このB型肝炎ウイルスの本体は、直径42nm
の二重構造の球形粒子の形状をとっている「デーン（da
ne）粒子」と称される粒子である。デーン粒子は、その
表面がHBs抗原と称される表面抗原で覆われており,さら
に内部には、HBc抗原、HBe抗原、及びウイルス遺伝子を
コードする環状二重鎖DNAを含む直径27nmのコア構造が
存在することが知られている。
の二重構造の球形粒子の形状をとっている「デーン（da
ne）粒子」と称される粒子である。デーン粒子は、その
表面がHBs抗原と称される表面抗原で覆われており,さら
に内部には、HBc抗原、HBe抗原、及びウイルス遺伝子を
コードする環状二重鎖DNAを含む直径27nmのコア構造が
存在することが知られている。
【０００４】これら抗原は、ウイルス感染の予防や診断
のための薬剤開発の標的とされてきた。例えば、HBs抗
原に関しては、DNA組換え技術によって、HBs抗原遺伝子
を酵母に導入し、HBs抗原を生産・精製し、ワクチンの
有効成分として用いられてきた。また、HBc抗原に関して
は、遺伝子工学的手法を用いて大腸菌に発現させたC遺
伝子を精製し、得られたHBc抗原がHBc抗体検査に用いら
れてきた。
のための薬剤開発の標的とされてきた。例えば、HBs抗
原に関しては、DNA組換え技術によって、HBs抗原遺伝子
を酵母に導入し、HBs抗原を生産・精製し、ワクチンの
有効成分として用いられてきた。また、HBc抗原に関して
は、遺伝子工学的手法を用いて大腸菌に発現させたC遺
伝子を精製し、得られたHBc抗原がHBc抗体検査に用いら
れてきた。
【０００５】一方、HBe抗原については、HBe抗原が分泌
型タンパク質であり、血中HBV量とよく一致するという
特徴を有し、HBV増殖のマーカー及び肝炎の持続性等の
指標としての利用が考えられることから、HBe抗原活性
を有するポリペプチドを得ようとする試みがなされてき
た。例えば、ヒト血清より精製してHBe抗原活性を得る試
みが行われている（Journal of Immunology 128 69-72
(1982)）。また、HBc抗原及びHBe抗原の双方をコードし
ているpreC-C遺伝子のうち-10〜149番目のアミノ酸に相
当する領域がヒト培養細胞より分泌されるHBe抗原をコ
ードしているとの報告がなされている（Michael Nassal
and Andrea Rieger.,J.of Vilorogy 674307-4315(199
3)）。
型タンパク質であり、血中HBV量とよく一致するという
特徴を有し、HBV増殖のマーカー及び肝炎の持続性等の
指標としての利用が考えられることから、HBe抗原活性
を有するポリペプチドを得ようとする試みがなされてき
た。例えば、ヒト血清より精製してHBe抗原活性を得る試
みが行われている（Journal of Immunology 128 69-72
(1982)）。また、HBc抗原及びHBe抗原の双方をコードし
ているpreC-C遺伝子のうち-10〜149番目のアミノ酸に相
当する領域がヒト培養細胞より分泌されるHBe抗原をコ
ードしているとの報告がなされている（Michael Nassal
and Andrea Rieger.,J.of Vilorogy 674307-4315(199
3)）。
【０００６】さらに、HBe抗原のアミノ酸組成がHBc抗原
のアミノ酸配列のN末端側の配列と一致するとの知見を
利用した、HBe抗原の調製についても報告されている。
例えば、HBc抗原をプロナーゼで処理して切断すること
によりHBe抗原を得る方法（J.of Medical Virology 8 2
37-243(1981)）や、HBc抗原をコードするDNAの3'末端側
を欠失させてHBe抗原を発現するように構築した変異体
からHBe抗原を調整する方法（特公平8-4507号公報）が
報告されている。
のアミノ酸配列のN末端側の配列と一致するとの知見を
利用した、HBe抗原の調製についても報告されている。
例えば、HBc抗原をプロナーゼで処理して切断すること
によりHBe抗原を得る方法（J.of Medical Virology 8 2
37-243(1981)）や、HBc抗原をコードするDNAの3'末端側
を欠失させてHBe抗原を発現するように構築した変異体
からHBe抗原を調整する方法（特公平8-4507号公報）が
報告されている。
【０００７】しかし、血清から精製する方法やHBc抗原
をプロナーゼ処理する方法では、安全かつ大量にHBe抗
原を調製することは困難であった。また、HBc抗原遺伝
子のC末端側を欠損させた変異体を利用する方法では、
得られたポリペプチドがHBc抗原内のHBe抗原に対応する
配列を完全に含むものではなく、さらにポリペプチドの
C末端には本来HBe抗原にはない配列が付加されていた。
このため、このようなHBe抗原を用いて抗体検出系を組
んだ場合、HBe抗体陽性血清においても有意な陽性応答
を呈しない可能性があり、さらに、非特異的な反応を引
き起こす可能性があった。
をプロナーゼ処理する方法では、安全かつ大量にHBe抗
原を調製することは困難であった。また、HBc抗原遺伝
子のC末端側を欠損させた変異体を利用する方法では、
得られたポリペプチドがHBc抗原内のHBe抗原に対応する
配列を完全に含むものではなく、さらにポリペプチドの
C末端には本来HBe抗原にはない配列が付加されていた。
このため、このようなHBe抗原を用いて抗体検出系を組
んだ場合、HBe抗体陽性血清においても有意な陽性応答
を呈しない可能性があり、さらに、非特異的な反応を引
き起こす可能性があった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、安全かつ大
量に調製でき、かつ、HBe陽性血清に対する特異性の高
い完全なHBe抗原を提供することを課題とする。
量に調製でき、かつ、HBe陽性血清に対する特異性の高
い完全なHBe抗原を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、完全なHB
e抗原をリコンビナント分子として産生させるために、m
RNA転写の開始点と目的遺伝子を挿入する制限酵素部位
との間にATGという配列のないベクターを選び、3'側プ
ライマーに終始コドンが入るようにプライマーを設計
し、ヒト血清より単離したHBVゲノムクローンを鋳型と
して、PCR法を行った。 次いで、得られたPCR産物を遺
伝子導入部位の制限酵素で処理し、目的遺伝子をプラス
ミドpW6A（図２）に挿入することによって、図１に示す
アミノ酸配列1〜149番からなるペプチドが過不足なく翻
訳されるように構築した。なお、該プラスミドには、導
入遺伝子を大量に発現させるために、IPTGで誘導される
強力なプロモーターであるT7プロモーターを用いてい
る。次いで、HBe遺伝子を組み込んだプラスミドで大腸
菌BL21(DE3)(Brookhaven National Laboratoryより入
手)を形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体３種
を得た。
e抗原をリコンビナント分子として産生させるために、m
RNA転写の開始点と目的遺伝子を挿入する制限酵素部位
との間にATGという配列のないベクターを選び、3'側プ
ライマーに終始コドンが入るようにプライマーを設計
し、ヒト血清より単離したHBVゲノムクローンを鋳型と
して、PCR法を行った。 次いで、得られたPCR産物を遺
伝子導入部位の制限酵素で処理し、目的遺伝子をプラス
ミドpW6A（図２）に挿入することによって、図１に示す
アミノ酸配列1〜149番からなるペプチドが過不足なく翻
訳されるように構築した。なお、該プラスミドには、導
入遺伝子を大量に発現させるために、IPTGで誘導される
強力なプロモーターであるT7プロモーターを用いてい
る。次いで、HBe遺伝子を組み込んだプラスミドで大腸
菌BL21(DE3)(Brookhaven National Laboratoryより入
手)を形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体３種
を得た。
【００１０】さらに、得られた形質転換体をIPTGで処理
して導入遺伝子の発現を誘導し、ウエスタンブロッティ
ング法により、目的のHBe抗原が得られているかを確認
したところ、HBe抗体陽性血清に特異的に反応するタン
パク質のバンドが、推定されるHBe抗原の分子量の位置
に検出された。
して導入遺伝子の発現を誘導し、ウエスタンブロッティ
ング法により、目的のHBe抗原が得られているかを確認
したところ、HBe抗体陽性血清に特異的に反応するタン
パク質のバンドが、推定されるHBe抗原の分子量の位置
に検出された。
【００１１】即ち、本発明は、（１） 配列番号１、配
列番号２若しくは配列番号３に記載のアミノ酸配列から
なるタンパク質、またはそれらのタンパク質のアミノ酸
配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつB型
肝炎のｅ抗原の抗原性を示すタンパク質、（２）
（１）に記載のタンパク質をコードするDNA、（３）
（２）に記載のDNAを含むベクター、（４） （３）に
記載のベクターを保持する形質転換体、に関する。
列番号２若しくは配列番号３に記載のアミノ酸配列から
なるタンパク質、またはそれらのタンパク質のアミノ酸
配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置
換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつB型
肝炎のｅ抗原の抗原性を示すタンパク質、（２）
（１）に記載のタンパク質をコードするDNA、（３）
（２）に記載のDNAを含むベクター、（４） （３）に
記載のベクターを保持する形質転換体、に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明におけるタンパク質は、B
型肝炎のｅ抗原の抗原性を示すタンパク質であり、HBe
抗体陽性血清に対し高い反応性を有するものである。B
型肝炎のｅ抗原の抗原性を示す限り、タンパク質のアミ
ノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタン
パク質も本発明の範囲に含まれる。なお、「１若しくは
数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加」は、出
願時には既に周知技術である部位特異的変異誘発法（Me
thods Enzymol.85,2763-2766(1988)）などによって行う
ことができる程度のものをいう。
型肝炎のｅ抗原の抗原性を示すタンパク質であり、HBe
抗体陽性血清に対し高い反応性を有するものである。B
型肝炎のｅ抗原の抗原性を示す限り、タンパク質のアミ
ノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタン
パク質も本発明の範囲に含まれる。なお、「１若しくは
数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加」は、出
願時には既に周知技術である部位特異的変異誘発法（Me
thods Enzymol.85,2763-2766(1988)）などによって行う
ことができる程度のものをいう。
【００１３】これらタンパク質は、対応するDNAを調製
し、これを適当なベクターに組み込み、さらに該ベクタ
ーを適当な宿主に導入して、宿主内で発現させる方法に
より調製することが可能である。ここで、DNAを調整す
る方法としては、例えば、文献（T.Mania et al. Molec
ular Cloning(1989)）記載の方法が挙げられる。調製し
たDNAを導入するベクターとしては、特に制限はない
が、本発明における実施例で用いたプラスミドpW6Aの
他、pET（Promega社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、p
YEX（和光純薬社製）、pYEUra3（Clontech社製）、pMAM
neo（Clontech社製）、pSV2neoなどのベクターが好適に
用いられる。ベクターは、エレクトロポレーション法、
Hanahan法、酢酸リチウム法、リポフェクション法など
によって、宿主に導入して形質転換体を得ることが可能
である。ベクターの導入される宿主としては制限はない
が、大腸菌、酵母、哺乳類細胞などを用いることが可能
である。更に、宿主内で発現されたタンパク質を精製す
るには、硫安分画法、密度勾配遠心法、ゲル濾過、イオ
ン交換法、アフィニティー法等が用いられる。
し、これを適当なベクターに組み込み、さらに該ベクタ
ーを適当な宿主に導入して、宿主内で発現させる方法に
より調製することが可能である。ここで、DNAを調整す
る方法としては、例えば、文献（T.Mania et al. Molec
ular Cloning(1989)）記載の方法が挙げられる。調製し
たDNAを導入するベクターとしては、特に制限はない
が、本発明における実施例で用いたプラスミドpW6Aの
他、pET（Promega社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、p
YEX（和光純薬社製）、pYEUra3（Clontech社製）、pMAM
neo（Clontech社製）、pSV2neoなどのベクターが好適に
用いられる。ベクターは、エレクトロポレーション法、
Hanahan法、酢酸リチウム法、リポフェクション法など
によって、宿主に導入して形質転換体を得ることが可能
である。ベクターの導入される宿主としては制限はない
が、大腸菌、酵母、哺乳類細胞などを用いることが可能
である。更に、宿主内で発現されたタンパク質を精製す
るには、硫安分画法、密度勾配遠心法、ゲル濾過、イオ
ン交換法、アフィニティー法等が用いられる。
【００１４】
[実施例１] HBe抗原の調製及びHBe抗体陽性血清に対す
る特異性の検討 ヒト血清より、文献（T.Mania et al. Molecular Cloni
ng(1989)）記載の方法で単離した３種類のHBVゲノムク
ローン（3.2kb）を鋳型分子として、5'-CTTCATATGGACAT
TGACACGTATAAA−3'（配列番号：４）及び5'-TCGGAATTCT
TAAACAACAGTAGTTTC−3'（配列番号：５）をプライマー
として用い、３種類のHBe抗原のアミノ酸配列「HBV-r1
1」、「HBV-r21」、「HBV-w7'」（図１／それぞれ順に
配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列に対応）をコー
ドする塩基配列を有するDNA断片（それぞれ順に配列番
号：１〜３に記載のDNAに対応）をPCR法にて増幅した。
る特異性の検討 ヒト血清より、文献（T.Mania et al. Molecular Cloni
ng(1989)）記載の方法で単離した３種類のHBVゲノムク
ローン（3.2kb）を鋳型分子として、5'-CTTCATATGGACAT
TGACACGTATAAA−3'（配列番号：４）及び5'-TCGGAATTCT
TAAACAACAGTAGTTTC−3'（配列番号：５）をプライマー
として用い、３種類のHBe抗原のアミノ酸配列「HBV-r1
1」、「HBV-r21」、「HBV-w7'」（図１／それぞれ順に
配列番号：１〜３に記載のアミノ酸配列に対応）をコー
ドする塩基配列を有するDNA断片（それぞれ順に配列番
号：１〜３に記載のDNAに対応）をPCR法にて増幅した。
【００１５】これにより得られたPCR産物を制限酵素Eco
RIとNdeIで水解し、次いで、1％アガロースゲル電気泳
動により、HBe抗原領域を含むDNA断片（460bp）を分離
した。このDNA断片を発現用プラスミド「PW6A」（図
２）のNdeI-EcoRI部位に挿入した後、該プラスミドを用
いて大腸菌BL21(DE3)(Brookhaven National Laboratory
より入手)を形質転換させ、アンピシリン耐性の３つの
形質転換体（Escherichiacoli BL21(DE3)/PW6A r11・14
9）、（Escherichia coli BL21(DE3)/PW6A r21・149）、
（Escherichia coli BL21(DE3)/PW6A w7'149）を得た。
RIとNdeIで水解し、次いで、1％アガロースゲル電気泳
動により、HBe抗原領域を含むDNA断片（460bp）を分離
した。このDNA断片を発現用プラスミド「PW6A」（図
２）のNdeI-EcoRI部位に挿入した後、該プラスミドを用
いて大腸菌BL21(DE3)(Brookhaven National Laboratory
より入手)を形質転換させ、アンピシリン耐性の３つの
形質転換体（Escherichiacoli BL21(DE3)/PW6A r11・14
9）、（Escherichia coli BL21(DE3)/PW6A r21・149）、
（Escherichia coli BL21(DE3)/PW6A w7'149）を得た。
【００１６】得られた形質転換体を50μg/mlのアンピシ
リンを含むLB培地2ml中、37℃で培養し、O.Dユニット
（600nmの光学濃度）が0.6〜0.8の時、IPTGを240μg/ml
の濃度に加えて培養をさらに2時間続けた。1.5ml量の菌
体培養液を5000rpmで2分間遠心分離して菌体を集め、10
0μlの緩衝液（10mM Tris・HCl(pH8.0),0.1M NaCl,1mMED
TA）に懸濁し、15分間の超音波破砕により完全に菌体を
破壊し、これを菌体試料とした。
リンを含むLB培地2ml中、37℃で培養し、O.Dユニット
（600nmの光学濃度）が0.6〜0.8の時、IPTGを240μg/ml
の濃度に加えて培養をさらに2時間続けた。1.5ml量の菌
体培養液を5000rpmで2分間遠心分離して菌体を集め、10
0μlの緩衝液（10mM Tris・HCl(pH8.0),0.1M NaCl,1mMED
TA）に懸濁し、15分間の超音波破砕により完全に菌体を
破壊し、これを菌体試料とした。
【００１７】菌体試料8μlに3倍濃度のSDSポリアクリル
アミド緩衝液（0.15M Tris・HCl(pH6.8),6% SDS,24%グリ
セロール,6mM EDTA,2% 2-メルカプトエタノール,0.003%
ブロモフェノールブルー）4μlを加え、十分撹拌した
後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲ
ル上で分離されたポリペプチド鎖をニトロセルロースフ
ィルターに転写した後、緩衝液（0.2μg/ml KH2PO4,3.0
μg/ml Na2HPO4・12H2O,8.8μg/ml NaCl）で200倍に希釈
したHBc抗体陽性ヒト血清及びHBe抗体陽性ヒト血清をニ
トロセルロースフィルター上のポリペプチド鎖と25℃で
1時間反応させた。さらに、上記緩衝液で1000倍に希釈
したペルオキシターゼ酵素標識された抗ヒトIgGウサギ
ポリクロナール抗体（Dako社製）を25℃で1時間反応さ
せ、上記緩衝液で洗浄後、10mlの基質発色液（0.01%過
酸化水素水,0.6mg/ml 4-クロロ-1-ナフトール）を添加
し、発色させた。
アミド緩衝液（0.15M Tris・HCl(pH6.8),6% SDS,24%グリ
セロール,6mM EDTA,2% 2-メルカプトエタノール,0.003%
ブロモフェノールブルー）4μlを加え、十分撹拌した
後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲ
ル上で分離されたポリペプチド鎖をニトロセルロースフ
ィルターに転写した後、緩衝液（0.2μg/ml KH2PO4,3.0
μg/ml Na2HPO4・12H2O,8.8μg/ml NaCl）で200倍に希釈
したHBc抗体陽性ヒト血清及びHBe抗体陽性ヒト血清をニ
トロセルロースフィルター上のポリペプチド鎖と25℃で
1時間反応させた。さらに、上記緩衝液で1000倍に希釈
したペルオキシターゼ酵素標識された抗ヒトIgGウサギ
ポリクロナール抗体（Dako社製）を25℃で1時間反応さ
せ、上記緩衝液で洗浄後、10mlの基質発色液（0.01%過
酸化水素水,0.6mg/ml 4-クロロ-1-ナフトール）を添加
し、発色させた。
【００１８】この結果を図３に示す。図３に示されるよ
うに大腸菌（BL21(DE3)/PW6A r11・149）の菌体試料はHB
c抗体陽性血清でほとんど反応を示さないが、HBe抗体陽
性血清ではHBe抗原の推定分子量（17kDa）の位置に陽性
応答が認められた。同様の結果が大腸菌（BL21(DE3)/PW
6A r21・149）および大腸菌（BL21(DE3)/PW6A w7'149）
の菌体試料においても得られた。以上のことから大腸菌
（BL21(DE3)/PW6A r11・149）、（BL21(DE3)/PW6A r21・1
49）、及び（BL21(DE3)/PW6A w7'149）の菌体抽出物
は、HBe抗体陽性血清に特異的に反応することが示され
た。
うに大腸菌（BL21(DE3)/PW6A r11・149）の菌体試料はHB
c抗体陽性血清でほとんど反応を示さないが、HBe抗体陽
性血清ではHBe抗原の推定分子量（17kDa）の位置に陽性
応答が認められた。同様の結果が大腸菌（BL21(DE3)/PW
6A r21・149）および大腸菌（BL21(DE3)/PW6A w7'149）
の菌体試料においても得られた。以上のことから大腸菌
（BL21(DE3)/PW6A r11・149）、（BL21(DE3)/PW6A r21・1
49）、及び（BL21(DE3)/PW6A w7'149）の菌体抽出物
は、HBe抗体陽性血清に特異的に反応することが示され
た。
【００１９】
【発明の効果】本発明により、安全かつ大量に調製で
き、かつ、HBe陽性血清に対する特異性の高い完全なHBe
抗原が提供された。本発明のHBe抗原は、B型肝炎の予防
や診断などに利用が期待される。
き、かつ、HBe陽性血清に対する特異性の高い完全なHBe
抗原が提供された。本発明のHBe抗原は、B型肝炎の予防
や診断などに利用が期待される。
【００２０】
配列番号 : 1 配列の長さ : 450 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : genomic DNA 配 列 ATG GAC ATT GAC ACG TAT AAA GAA TTT GGA GCT TCT GTG GAG TTA CTC 48 Met Asp Ile Asp Thr Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 TCT TTT TTG CCT TCT GAC TTC TTT CCT TCT ATT CGA GAT CTC CTC GAC 96 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 ACC GCC TTT GCT CTG CAT CGG GAG GCC TTA GAG TCT CCG GAA CAT TGT 144 Thr Ala Phe Ala Leu His Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 TCA CCT CAC CAT ACA GCA CTC AGG CAA GCT ATT GTG TGT TGG GGT GAG 192 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Val Cys Trp Gly Glu 50 55 60 TTG ATG AAT CTG GCC ACC TGG GTG GGA AGT AAT TTG GAA GAC CCA GCA 240 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 TCC AGG GAA TTG GTA GTC AGC TAT GTC AAT GTT AAT ATG GGC CTA AAA 288 Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 ATC AGA CAA CTA TTG TGG TTT CAC ATT TCC TGT CTT ACT TTT GGA AGA 336 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 GAA ACG GTT CTT GAG TAT TTG GTA TCT GTT GGA GTG TGG ATT CGC ACT 384 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Val Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 CCT CAA GCC TAC AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATC TTA TCA ACA CTT CCG 432 Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 GAA ACT ACT GTT GTT TAA 450 Glu Thr Thr Val Val 145 配列番号 : ２ 配列の長さ : 450 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : genomic DNA 配 列 ATG GAC ATT GAC CCG TAT AAA GAA TTT GGA GCT TCT GCG GAG TTA CTC 48 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Ala Glu Leu Leu 1 5 10 15 TCT TTT TTG CCT TCT GAC TTC TTT CCT TCT ATT CGA GAT CTC CTC GAC 96 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 ACC GCC TCT GCT CTG TAT CGG GAG GCC TTA GAG TCT CCG GAA CAT TGT 144 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 TCA CCT CAC CAT ACA GCA CTC AGG CAA GCT ATT CTC TGT TGG GGT GAG 192 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 TTG ATG AAT CTG GCC ACC TGG GTG GGA AGT AAT TTG GAA GAT CCA GCA 240 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 TCC AGG GAA TTA GTA GTC AGC TAT GTC AAT GTT AAT ATG GGC CTA AAA 288 Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 CTC AGA CAA ATA TTG TGG TTT CAC ATT TCC TGT CTT ACT TTT GGA AGA 336 Leu Arg Gln Ile Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 GAA ACT GTT CTT GAG TAT TTG GTG TCT TTT GGA GTG TGG ATT CGC ACT 384 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 CCT ACC GCC TAC AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATC TTA TCA ACA CTT CCG 432 Pro Thr Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 GAA ACT ACT GTT GTT TAA 450 Glu Thr Thr Val Val 145 配列番号 : ３ 配列の長さ : 450 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : genomic DNA 配 列 ATG GAC ATT GAC ACG TAT AAA GAA TTT GGA GCT ACT GTG GAG TTA CTC 48 Met Asp Ile Asp Thr Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 TCG TTT TTG CCT TCT GAC TTC TTT CCT TCC GTC AGA GAT CTC CTA GAC 96 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 ACC GCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCT CCT GAG CAT TGC 144 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTC AGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA 192 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 TTG ATG ACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG GAA GAT CCA GCA 240 Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 TCC AGG GAT CTA GTA GTC AAT TAT GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG 288 Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 ATC AGG CAA CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT GGA AGA 336 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT TTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT 384 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 CCT CCA GCC TAT AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATC TTA TCA ACA CTT CCG 432 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 GAA ACT ACT GTT GTT TAA 450 Glu Thr Thr Val Val 145 配列番号 : ４ 配列の長さ : 27 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 CTTCATATGG ACATTGACAC GTATAAA 27 配列番号 : ５ 配列の長さ : 27 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 一本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : 他の核酸 合成DNA 配 列 TCGGAATTCT TAAACAACAG TAGTTTC 27
【図１】本発明において得られた３種類のHBe抗原ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を示す図である。なお、図中の
アミノ酸配列は、生化学事典第２版1468ページに記載の
1文字記号に従った。
ペプチドのアミノ酸配列を示す図である。なお、図中の
アミノ酸配列は、生化学事典第２版1468ページに記載の
1文字記号に従った。
【図２】HBe抗原ポリペプチドを発現させるために用い
たプラスミド「PW6A」の構造を示す図である。
たプラスミド「PW6A」の構造を示す図である。
【図３】本発明において得られたHBe抗原ポリペプチド
（r11.149）をウエスタンブロティング法により検出し
た図である。図左は、HBc陽性HBe陰性血清を用いて検出
した図であり、図左は、Hbe陽性血清を用いて検出した
図である。なお、対照としてHBc抗原ポリペプチドを用
いた。
（r11.149）をウエスタンブロティング法により検出し
た図である。図左は、HBc陽性HBe陰性血清を用いて検出
した図であり、図左は、Hbe陽性血清を用いて検出した
図である。なお、対照としてHBc抗原ポリペプチドを用
いた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ // Ａ６１Ｋ 39/29 ＡＤＹ Ａ６１Ｋ 39/29 ＡＤＹ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/576 33/576 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 岡田 政久 東京都新宿区西新宿２丁目７番１号 富士 レビオ株式会社内
Claims (4)
- 【請求項１】 配列番号１、配列番号２若しくは配列番
号３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または
それらのタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは
数個のアミノ酸配列が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつB型肝炎のｅ抗原の抗原性を
示すタンパク質。 - 【請求項２】 請求項１に記載のタンパク質をコードす
るDNA。 - 【請求項３】 請求項２に記載のDNAを含むベクター。
- 【請求項４】 請求項３に記載のベクターを保持する形
質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8248421A JPH1084967A (ja) | 1996-09-19 | 1996-09-19 | Ｂ型肝炎のｅ抗原 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8248421A JPH1084967A (ja) | 1996-09-19 | 1996-09-19 | Ｂ型肝炎のｅ抗原 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1084967A true JPH1084967A (ja) | 1998-04-07 |
Family
ID=17177881
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8248421A Pending JPH1084967A (ja) | 1996-09-19 | 1996-09-19 | Ｂ型肝炎のｅ抗原 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1084967A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018536433A (ja) * | 2015-11-04 | 2018-12-13 | ホオキパ バイオテック エージー | Ｂ型肝炎ウイルスに対するワクチン |
| US11266727B2 (en) | 2015-11-12 | 2022-03-08 | Hookipa Biotech Gmbh | Arenavirus particles as cancer vaccines |
-
1996
- 1996-09-19 JP JP8248421A patent/JPH1084967A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018536433A (ja) * | 2015-11-04 | 2018-12-13 | ホオキパ バイオテック エージー | Ｂ型肝炎ウイルスに対するワクチン |
| JP2021182922A (ja) * | 2015-11-04 | 2021-12-02 | ホオキパ バイオテック ジーエムビーエイチ | Ｂ型肝炎ウイルスに対するワクチン |
| US11214598B2 (en) | 2015-11-04 | 2022-01-04 | Hookipa Biotech Gmbh | Vaccines against hepatitis B virus |
| US11266727B2 (en) | 2015-11-12 | 2022-03-08 | Hookipa Biotech Gmbh | Arenavirus particles as cancer vaccines |
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