KR890001130B1 - 포유동물 세포시스템에서 b형 간염 바이러스 표면항원을 고역가로 발현시키는 방법 - Google Patents

포유동물 세포시스템에서 b형 간염 바이러스 표면항원을 고역가로 발현시키는 방법 Download PDF

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Abstract

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Description

포유동물 세포시스템에서 B형 간염 바이러스 표면항원을 고역가로 발현시키는 방법
제1도는 B형 간염 바이러스 게놈의 pBR 322내로의 크로닝을 도시한 도면.
제2도는 pTHB 1의 제조 공정 개략도.
제3도는 pHPS 1의 제조 공정 개략도.
제4도는 pHPS 3의 제조 공정 개략도.
제5도는 pHPS 5의 제조 공정 개략도.
제6도는 pHPS 7의 제조 공정 개략도.
제7도는 pHPS 11의 제조 공정 개략도.
제8도는 pHB 1의 제한 효소 지도.
제9도는 pCS 1의 제한 효소 지도.
제10도는 pCS 2의 제한 효소 지도.
제11도는 pCS 3의 제한 효소 지도.
제12도는 pTHB 1의 제한 효소 지도.
제13도는 pHPS 5의 제한 효소 지도이다.
본 발명은 포유 동물 세포시스템에서 B형 간염 바이러스 표면 항원을 고역가로 발현시킬 수 있는 재조합 플라스미드의 제조 방법 및 이를 이용하여 B형 간염 바이러스 표면항원을 제조하는 방법에 관한 것이다.
좀 더 상세히 설명하면, 본 발명은 Pre-S부분을 포함하는 B형 간염 바이러스 표면항원의 유전자를 강력프로모터에 연결시킨 다음, 이를 포유동물 세포내에서 발현시킴으로써 고역가의 B형 간염 바이러스 표면항원을 제조하는 방법에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스에 간염된 사람의 혈장에서는 42nm의 데인 입자가 발견되는데, 이는 혈청학적 및 생화학적 연구결과 B형 간염 바이러스의 본체라는 것이 밝혀지게 되었다.
이러한 데인 입자에는 DNA가 존재하나, 혈장에서 발견되는 22nm의 구형 입자와 27nm의 구형입자 그리고 봉형의 B형 간염 바이러스 표면 항원의 절편에는 DNA가 존재하지 않는 다는 것도 또한 밝혀지게 되었다. 데인 입자에 포함되어 있는 DNA는 부분적으로 이중 나선 구조를 갖는 환상의 DNA로, 3200개 정도의 염기쌍으로 구성되어 있으며 이중 나선의 길이는 경우에 따라서 다양하게 나타나며 이들중 길이가 더 긴 나선의 5'말단부에는 단백질이 공유 결합되어 있는데, 이는 폴리머라제로서 바이러스 DNA의 단일선 구조를 완전한 이중나선 구조로 회복시키는데 관여한다.
B형 간염 바이러스 DNA의 염기서열 분석결과, B형 간염 바이러스는 염기서열이 서로 다른 여러 아형이 있음을 시사하고 있으며, 이러한 B형 간염 바이러스는 염색체는 B형 간염 바이러스의 코아 단백질 또는 B형 간염 코아 항원(HBc Ag)으로 둘러싸여 있다.
B형 간염 바이러스의 염색체를 둘러싸고 있는 표면 단백질로는 그 크기 및 성분이 약간씩 다른 P22,GP26,GP33,GP36,P39 및 GP42가 있는데, 226개의 아미노산 (S)으로 구성된 P22와 이로부터 글리코실레이트된 GP26이 이러한 표면 단백질의 주종을 이루고 있다. GP33과 GP36은 GP26과 P22(S)의 아미노산 말단에 55개의 아미노산(Pre S2)을 더 갖는 것이며, P39와 GP42는 S의 아미노산 말단에 162개의 아미노산(Pre S1과 Pre S2)을 더 갖는 것이다.
S부분만을 포함하는 B형 간염 바이러스 표면 항원의 Pre S1과 Pre S2를 포함하는 B형 간염 바이러스 표면 항원보다 양적으로는 더 많이 존재하는 표면 단백질이나, 면역 생성력은 Pre-S를 포함하는 B형 간염 바이러스 표면 항원이 더 높은 것으로 나타났다.
또한, Pre-S부분은 사람의 알부민 중합체에 대한 수용체로서 B형 간염 바이러스가 간 세포에 부착하는 것을 용이하게 하는 것으로, 이는 Pre-S부분에 대한 항체가 바이러스의 복제를 억제할 뿐만 아니라 바이러스가 숙주 세포에 부착하는 것을 방해하는 것으로써 알 수 있었다.
B형 간염 백신을 제조하는 종래의 방법으로는 혈장으로부터 B형 간염 바이러스 표면 항원을 직접 분리 정제하는 방법과 유전자 조작에 의하여 박테리아나 효모로부터 B형 간염 바이러스 표면 항원을 얻는 방법이 있다.
그러나, 혈장으로부터 분리 정제하는 방법은 공혈 지원자의 부족으로 인하여 그 공급에 제한성이 있는 단점이 있을 뿐만 아니라, 적합한 공혈자의 선별 및 혈장 정제에 많은 경비가 소요됨을 물론, 그 혈장에 HTLV III등 다른 질병을 일으키는 물질이 포함되었을 위험성도 배제할 수 없는 것이다.
한편, 박테리아에 의한 방법은 박테리아에 의해서는 프로테인 프로세싱(protein processing) 즉, 글리코실레이션(glycosylation)이 일어나지 못하므로 고역가의 면역 생성력을 나타내는 B형 간염 바이러스 표면항원을 얻을 수 없으며, 효모를 이용할 경우에는, 생성된 B형 간염 바이러스 표면 항원을 포함하는 단백질이 세포밖으로 나오지 못하므로 세포를 파괴시켜야만 얻을 수 있어 B형 간염 바이러스 표면 항원의 수득률이 낮아지는 단점이 있었다.
따라서 본 발명은 종래 기술에서의 이러한 단점들을 해결한 것으로, B형 간염 바이러스 표면 항원을 포유 동물 세포내에서 발현시킴으로써 글리코실레이션이 방해를 받지 않게함과 동시에 Pre-S부분을 포함하는 B형 간염 바이러스 표면 항원이 세포를 파괴시키지 않아도 세포외로 분비될 수 있게 하는 것을 그 목적으로 하며 또한, 이러한 세포들을 혈청 농도가 낮은 배지에서 배양하므로써 단백질의 정제를 더욱 용이하게 할 수 있는 것이 본 발명의 특징이다.
또한, 본 발명에서는 B형 간염 바이러스 표면 항원을 고 역가로 발현시키기 위하여 다음과 같은 이상적인 조건의 벡터를 재조합하여 사용하였다.
즉, 본 발명의 재조합 벡터는
(1) 숙주로 사용되는 박테리아와 포유 동물 세포에서 모두 증식되어야 한다.
(2) 적어도 2개 이상의 표식인자(selectable maker)를 가지고 있어야 한다.(하나는 형질전환된 박테리아를 선별하기 위한 것이고, 또 다른 하나는 형질전환된 포유 동물 세포를 선별 하기 위한 것이다.)
(3) B형 간염 바이러스 표면 항원의 전사를 위한 매우 강력한 프로모터를 가지고 있어야 하며, 이러한 프로모터를 유발시켜야 하는 경우에 이를 위한 유발자(inducer )는 B형 간염 바이러스 표면 항원을 생산하는 세포를 대량으로 배양할 수 있도록 가격이 비싸지 않은 것이어야 한다.
(4) 숙주 세포내에서 다량으로 반복 복제될 수 있는 것으로, B형 간염 바이러스 표면 항원 유전자로부터의 총 전사량(transcription level)이 많아야 한다.
상기한 바와 같은 조건을 갖는 이상적인 벡터는 다음과 같이 제조하였다.
1. pTHB 1의 제조
B형의 간염 보균자의 혈청으로부터 데인 입자를 분리 정제한 후, 이중 나선D NA를 회복시키는 폴리머라아제 기능을 위하여 인큐베이션 하였다. 그런다음, 데인 입자로부터 DNA를 분리하여 BamH 1으로 절단한 후, BamH 1부위를 절단한 pBR 322내로 클로닝 하였다(제1도 참조).
클로닝된 DNA가 B형 간염 바이러스 표면 항원을 암호하는 기능을 가졌는지의 여부를 알아 보기 위하여, 이 DNA를 발현시킨 다음, ELISA법으로 단백질의 생성을 검사하여 확인하였다.
즉, 클로닝된 벡터 DNA를 BamH 1으로 절단하여 B형 간염 바이러스 DNA를 분리정제한 후, 라이게이션하여 다시 환상으로 연결시킨 다음, 다시 Bg1 2로 절단하였다. 절단된 Bg1 2파면 중 긴 파편을 벡터 SV40내에서 메탈로치오 네인 프로모터에 따라서 조절되도록 Bg1 2부위를 절단한 pCS 1에 연결시켜 pTHB 1을 제조하였다(제2도 참조).
완전한 SV40게놈을 갖는 pTHB 1을 CV-1 세포에 형질 전환시킨 후, 배지로 분비된 B형 간염 바이러스 표면 항원 유전자의 존재를 확인하였다.
2. 이상적인 벡터의 제조
상술한 바와같은 이상적인 벡터의 조건에 근접시키기 위하여, 다음과 같은 부분을 갖는 안정한 벡터를 재조합하였다.
(1) pBR 322의 대장균내에서 복제되는 부분과 앰피실린내성을 갖는 유전자 부분.
(2) 마우스 세포내에서 다량 반복 복제(multiple copy)되는 보바인 파필로마 바이러스 DNA(Bovine Papilloma Virus DNA)부분.
(3) B형 간염 바이러스 표면 항원 유전자를 강력히 전사시키는 쥐의 메탈로치오네인 프로모터를 갖는 부분.
(4) 카드미늄 존재하에서 마우스 세포를 선별하기 위한 표식(marker)인 휴먼 메탈로치오네인 유전자(Human metallothionein gene)를 갖는 부분.
이상과 같은 부분을 포함하도록 제조합한 본 발명의 재조합 벡터는 다음과 같은 조건에 따라 발현된다.
(1) 인헨서(enhancer)의 존재여부.
(2) 5'미해독 부위(5'untranslated region)의 크기.
(3) 3'미해독 부위의 크기
본 발명에서는 발현 레벨에 손상을 주지 않는 한도내에서 가능한 한 작은 DNA를 삽입함으로써 발현 시스템에 불필요한 정보가 삽입되지 않게 함과 동시에 DNA조작을 더욱 용이하게 하였다.
본 발명에 따라서 제조한 재조합 벡터는 각각 pHPS 1, pHPS 3, pHPS 5, pHPS 7 및 pHPS 11이라 명명하였으며, 이러한 상이한 구조의 벡터들 각각을 쥐의 C 127세포에 형질전환시킨 다음, 각각으로부터 안정한 형질전환 세포를 선별하여 클론한 후, 각 클론으로부터 RIA, ELISA법으로 B형 간염 바이러스 표면항원의 생성량을 검사하였다.
본 발명의 재조합 벡터의 구조는 각각 다음과 같다.
(1) pHPS 1은 완전한 BPV게놈과 쥐 메탈로 치오네인(mMT) 유전자 및 86%의 HBV DNA를 포함하는 구조이다(제3도 참조).
HBV게놈에 의하여 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBs Ag)의 발현을 위한 폴리아데닐레이션(polyadenylation)이 일어나며, HBV게놈에 포함된 거대 트랜스크립트 (transcript)중 단지 일부만이 B형 간염 바이러스 표면 항원에 대한 암호 부분(Coding region)이 된다. 또한, 프로모터가 없는 마우스 MT(mMT)유전자 역시 이 구조물 내에 포함된다.
(2) pHPS 3는 pHPS 1의 유도체로서 HBV DNA의 폴리아데닐레이션 부위인 3'미해독 부위의 대부분과 가외의 mMT DNA(extra mMT DNA) 부위가 제거된 것이다(제4도 참조).
(3) pHPS 5는 pHPS 3를 보다 단축시킨 것으로, 단지 65%의 BPV DNA만을 포함하는 것이다(제5도 참조).
(4) pHPS 11은 pHPS 3의 유도체로서 B형 간염 바이러스 표면 항원에 대한 암호 부분(HBs Ag coding region) 다음에 SV 40 DNA를 연결시켜 폴리 아데닐레이션 시그널을 첨가한 것이다(제7도 참조).
상기한 재조합 벡터들에서의 B형 간염 바이러스 표면 항원 유전자의 전사는 B형간염 바이러스 표면항원(HBs Ag)의 초기 암호 부분으로부터 상당한 길이의 염기 ( 450base)를 제거했으므로 그 다음부터 시작되는 것이다.
(5) pHPS 7은 Pre-S초기 암호 부분부터 전사 시키기 위하여 절단된 5'-미해독 부위를 포함시킨 것이다(제6도 참조).
3. 재조합 플라스미드의 쥐 C 127 세포내로의 형질전환.
10%혈청을 포함하는 DMEM배지가 들어 있는 10cm 디쉬속에서 쥐 C 127세포를 단일층으로 배양하였다. 그런다음, CsCI 구배에 의하여 2회 정제한 플라스미도 DNA를 디쉬당 30ng가하고, 인산칼슘 침전법을 이용하여 세포를 형질전환 시켰다. 형질전환 시킨 후 4시간 경과 후에 배지를 새것으로 교환하였다.
다음날, 세포들은 1:3의 비율로 나누어 플레이트에 부착시킨 후, 10μM 카드미늄 클로라이드를 포함하는 새배지로 교환하여 주었다.
세포가 MT를 발현하지 않는 한, 카드미늄은 세포에 독성을 나타내어 3~4일 동안 많은 세포들이 죽게되기 때문에 3~4일 동안 매일 배지를 교환해 주었다. 2~3일 후에 카드미늄 농도는 20μM로 증가하며, 20μM 카드미늄에 저항성을 갖는 군락을 눈으로 확인할 수 있었다.
MT는 카드미늄과 결합하여 세포독성 물질인 카드미늄을 무해하게 하므로 MT유전자를 포함하는 플라스미드를 갖고 있는 세포들 만이 살아남게 되며, 이러한 MT프로모터의 조정하에 있는 플라스미드들은 카드미늄의 존재에 의하여 B형 간염 바이러스 표면 항원을 유발시킨다.
선별한 형질전환된 세포들은 페트리디쉬에서 배양한 후, 각 집락으로부터의 B형 간염 표면 항원의 양을 아보트키트(Abott's Kit)를 사용하여 정량하였다. 각각의 플라스미드를 포함하는 4~5개의 집락을 선별하여 이 집락으로부터의 B형 간염 바이러스 표면 항원의 양을 아보트키트(Abott's Kit)를 사용하여 정량하였다. 각각의 플라스미드를 포함하는 4~5개의 집락을 선별하여 이 집락으로부터의 B형 간염 바이러스 표면 항원의 생산량을 24시간 당 106개의 세포가 분비하는 표면 항원의 양을 측정하여 결정하였다.
Figure kpo00001
[실시예 1]
pTHB 1의 제조
20μg의 pHB 1(제8도 참조)을 BamH 1으로 절단한 후, 아가로오즈 겔 상에서 HBV 특이적 DNA(HBV Specific DNA)를 분리 정제하였다. 분리한 HBV DNA를 T4리가제를 사용하여 다시 연결시키고, 연결된 DNA를 Bg1 2로 다시 절단한 후, 절단된 파편중 긴 파편을 씨 프라그(Sea plague) 아가로오즈 겔상에서 분리정제하였다. 분리한 긴 파편을 Bg1 2위치를 절단한 pCS 1 DNA(제9도 참조)에 T4리가 제를 사용하여 연결시켰다(제2도 참조).
Bg1 2부위는 마우스의 MT 프로모터 하부와 MT 유전자의 스타트 코돈(AUG)의 하부에 위치하는 것으로, HBV 파편은 MT유전자에 의하여 그 발현이 조절되게 된다.
연결 반응 후에 반응액에 에탄올을 가하여 생성된 DNA를 침전시킨 다음, 침전된 DNA를 TE(TE, 10mM 트리스 pH8.0, 1mM EDTA)에 이행시켰다. 이 DNA를 HB 101세포에 형질전환 시킨 후, 앰피실린 평판상에서 형질 전환된 군주를 선별하였다. 선별한 집략을 37℃에서 하룻밤 배양한 후, 미니 플라스미드로 처리하고 여러 효소로 절단하여 삽입된 DNA의 크기와 삽입방향(orientation)을 조사하였다.
옳바른 방향의 집락을 선벽하여 pTHB 1(제12도 참조)이라 명명하였다.
선별한 pTHB 1집락을 배양한 후, CsC1 구배상에서 플라스미드 DNA를 분리 정제하였다. 분리한 DNA를 CV-1세포에 형질 전환시킨 후, 2일후에 상등액을 ELISA법으로 검사하여 세포들이 분비한 B형 간염 바이러스 표면항원(HBs Ag)의 양을 측정하였다.
B형 간염 바이러스 표면 항원의 양을 감지할 수는 있었으나 매우 낮은 농도 였다.
[실시예 2]
pHPS 1의 제조
pTHB 1을 Eco R5와 Sal 1으로 절단한 후, 박테라아 알카린 포스파타제(BAP)로 처리하여 포스페이트기를 제거하고 씨 프라그(Sea plague)아가로오즈 겔 상에서 8.9Kb의 DNA파편으로 분리 정제하였다.
pCS 2(제10도 참조)를 Eco R5와 Sal 1으로 절단한 후, 10.25Kb의 DNA파편을 분리 정제하였다. 분리 정제한 8.9Kb의 DNA 파편과 10.25Kb의 DNA 파편을 서로 연결시켜 pHPS 1을 제조하였다(제3도 참조).
그런다음, HB 101에 형질 전환시키고, 미니 플라스미드로 만든 후, 여러 효소로 절단하여 분석하였다.
[실시예 3]
pHPS 3의 제조
pTHB 1을 BamH 1으로 절단한 후, BAP로 처리하고, 페놀로 추출한 다음, 에탄올로 침전시켰다. 침전된 DNA를 Sal 1과 EcoR5으로 다시 절단한 후, 씨 프라그 아가로오즈 겔 상에서 6.4Kb 파편을 분리 정제하였다.
pCS 2를 BamH 1으로 절단한 후, 아가로오즈 겔 상에서 2.0Kb의 HuMT 유전자와 14.5Kb 의 DNA 파편으로 분리 정제하였다. 분리한 파편중 14.5Kb의 DNA 파편을 BAP로 처리한 후, 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨 다음, 침전된 DNA를 Sal 1과 Xho 1으로 절단하여 7.9Kb의 DNA 파편(Sal 1/BamH 1 파편)을 분리 정제하였다.
분리한 7.9Kb의 DNA 파편에 2.0Kb의 HuMT 파편과 pTHB 1으로부터 얻은 6.4Kb의 DNA 파편을 가하고 혼합하여 서로 연결시켰다(제4도 참조).
연결된 재조합 DNA를 HB 101에 형질전환 시킨 후, 미니 플라스미드를 제조하고 여러 제한 효소로 절단하여 삽입된 파편의 방향과 복제수(copy number)를 확인하였다.
올 바른 방향과 올바른 복제수를 갖는 집락을 선별하여 pHPS 3이라 명명하였다.
상기한 공정중, 포스페이트기를 제거하는 반응은 파편의 한쪽끝에서만 일어나므로, 올바른 방향으로 연결되는 기화와 멀티머(multimer)생성 기회를 증가시켜 준다.
[실시예 4]
pHPS 5의 제조
pTHB 1과 pCS3(제11도 참조)를 BamH 1, BAP 및 Sac 1으로 각각 처리하였다. pCS 3로부터의 9.8Kb의 DNA 파편(Sac 1/BamH 1)과 pTHB 1으로부터의 2.4K b의 DNA 파편(BamH 1/Sac 1)을 아가로오즈 겔 상에서 정제하였다. pCS 2로부터의 2.0Kb의 HuMT 파편을 실시예 3에서와 같이 정제한 다음, 상기한 3종류의 파편을 실시예 3에서와 같이 혼합하여 서로 연결시켰다(제5도 참조).
정방향이면서 복제수가 큰 플라스미드를 선별하여 pHPS 5(제13도 참조)라 명명하였다.
[실시예 5]
pHPS 7의 제조
pHB 1을 Bg1 2와 Hha 1으로 절단한 후, 아가로오즈 겔 상에서 전기 영동하여 가장 큰 1.35Kb의 밴드를 분리 정제하였다.
pCS 2를 Xho 1으로 절단한 후, 포스페이트기를 제거하였다. Hha 1파편과 Xho 1으로 절단한 pCS 2를 동량으로 혼합한 후, 4개의 데옥시 리보 뉴클레오타이드와 T4 폴리머라제를 가하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다.
T4 폴리머라제1으로 인큐베이션하여 Hha 1에 의하여 형성된 3' 돌출부와 Xho 1에 의하여 형성된 5' 돌출부를 모두 제거한 후, 65℃로 10분간 가온하고 페놀로 추출한 다음, 에탄올로 침전시키고 라이게이션 완충용액에 용해시켜 서로 연결시켰다(제6도 참조).
연결된 플라스미드 DNA를 HB 101에 형질 전환시킨 후, 형질 전환된 집락을 선별하여 미니 플라스미드를 만든 다음, 제한 효소로 절단하여 정방향의 단일 삽입부만을 갖는 플라스미드를 선별하여 pHPS 7이라 명명하였다.
[실시예 6]
pHPS 11의 제조
pTHB 1을 BamH 1과 Pst 1으로 절단한 후, 671 Bp의 DNA 분리 정제하였다. 분리 정제한 671 Bp의 DNA 파편을 Sau 3A로 다시 절단하여 237Bp의 SV 40 DNA (Sau 3A/BamH 1)를 분리하였다.
pHPS 5를 BamH 1으로 전달한 후, 12.2Kb의 BamH 1/BamH 1 파편을 분리 정제하였다. 237Bp의 DNA 파편과 12.2Kb의 DNA 파편을 서로 연결시킨 후, 정방향의 플라스미드를 선별하여 pHPS 9라 명명하였다.
BamH 1과 Sau 3A 말단은 서로 상보적인 구조를 가지므로 연결되어지나, Ba mH 1/BamH 1 말단부는 연결되지 않고 그대로 남아있게 된다. 이 BamH 1/ BamH 1 연결부위를 BamH 1으로 다시 절단한 후, pCS 2로부터의 2.0Kb의 HuMT 파편 (Bam H 1/BamH 1)을 이 부위에 삽입하였다(제7도 참조)
최종의 플라스미드를 선별하여 pHPS 11이라 명명하였다.

Claims (7)

  1. B형 간염 바이러스 표면 항원을 포유 동물 세포에서 발현시키는 데 적합한 플라스미드 DNA(pHPB 1, pHPS 1, pHPS 3, pHPS 5, pHPS 7 및 pHPS 11)를 제조하여 마우스 세포에 형질 전환시킨 다음, 형질 전환된 마우스 세포군(HV-0-1(KFCC-10221), HV-1-1(KFCC-10222), HV-1-3(KFCC-10223), HV-1-5(KFCC-10224), HV-1-7(KFCC-10225), HV-1-11(KFCC-10226)으로 부터 B형 간염 바이러스 표면 항원을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, pTHB 1은 pHBV 1를 BamH 1으로 절단한 후, HBV 특이적 DNA를 분리 정제하여 T4리가제를 사용하여 다시 연결시킨 다음, 이를 Bg1 2로 다시 절단하고 절단된 Bg1 2 파편중 긴 파편을 T4리가제의 도움으로 pCS 1 DNA의 Bg1 2위치에 삽입시켜 제조한 것임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, pHPS 1은 pTHB 1을 EcoR 5와 Sal 1으로 절단한 후, 박테리아 알카린 포스파타제로 처리하여 포스페이트기를 제거하고, 8.9Kb의 DNA 파편으로 분리 정제한 다음, pCS 2를 EcoR5와 Sal 1으로 절단하여 분리 정제한 10.25Kb의 DNA 파편과 서로 연결시켜 제조한 것임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, pHPS 3은 pTHB 1을 BamH 1과 박테리아 알카린 포스파타제로 처리한 후, 다시 Sal 1과 EcoR5로 절단하여 6.4K의 DNA 파편으로 분리 정제한 다음, pCS 2를 BamH 1으로 절단하여 2.0Kb의 HuMT 파편과 14.5Kb의 DNA 파편을 얻은 후, 14.5Kb의 DNA 파편을 다시 박테라아 알카린 포스파타제로 처리하고 Sal 1과 Xho 1으로 절단하여 7.9Kb의 DNA 파편을 얻은 다음, 이를 상기한 6.4Kb의 DNA 파편 및 2.0Kb의 HuMT 파편과 혼합하여 서로 연결시켜 제조한 것임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, pHPS 5는 pTHB 1과 pCS 3를 BamH 1과 박테리아 알카린 포스파타제 및 Sac 1으로 각각 처리하여 pCS 3로 부터 9.8Kb의 DNA 파편을 pTHB 1으로부터 2.4Kb의 DNA 파편을 각각 얻은 후, 이를 pCS 2로부터 얻은 2.0Kb의 HuMT 파편과 혼합하여 서로 연결시켜 제조한 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, pHPS 7은 pHB 1을 Bg1 2와 Hha 1으로 절단하여 1.35Kb의 DNA 단편을 분리정제한 후, Xho 1 부위를 절단하여 포스페이트기를 제거한 pCS 2파편과 동량으로 혼합한 다음, 4개의 데옥시 뉴클레오티드와 37℃에서 30분동안 T4 폴리머라제로 반응시킨 다음, 65℃에서 10분간 처리하여 서로 연결시켜 제조한 것임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, pHPS 11은 pTHB 1을 BamH 1과 Pst 1으로 처리하여 671 Bp의 DNA 파편을 분리 정제한 후, 이를 다시 Sau 3 A로 처리하여 237 Bp의 SV40 DNA(Sau3A/BamH 1)을 분리 정제한 다음, pHPS 5를 BamH 1으로 처리하여 얻은 12.2Kb의 DNA 파편과 연결시켜 pHPS 9을 제조한 다음, 이를 BamH 1으로 절단하여 2.0Kb의 HuMT 파편과 연결시켜 제조한 것임을 특징으로 하는 방법.
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