JPS6128391A - 単純ヘルペスウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド、形質転換酵母および単純ヘルペスウイルス蛋白質の製法 - Google Patents

単純ヘルペスウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド、形質転換酵母および単純ヘルペスウイルス蛋白質の製法

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JPS6128391A
JPS6128391A JP15176684A JP15176684A JPS6128391A JP S6128391 A JPS6128391 A JP S6128391A JP 15176684 A JP15176684 A JP 15176684A JP 15176684 A JP15176684 A JP 15176684A JP S6128391 A JPS6128391 A JP S6128391A
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plasmid
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Chikahide Nozaki
周英 野崎
Yoichiro Kino
洋一郎 城野
Tatsuo Eto
辰男 衛藤
Keiichi Makikado
啓一 牧角
Shinya Otomo
信也 大友
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Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
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Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、単純ヘルペスウィルス感染症の予防用ワクチ
ンの製造に有用な単純ヘルペスウィルス蛋白質の生産に
際して遺伝子工学技術を応用することにより所望の蛋白
質を高純度に生産させることを目的とするものであって
、単純ヘルペスウィルス遺伝子を組込んだ組換えプラス
ミド、それを用いて形質転換を行った酵母、およびその
形質転換酵母を用いた単純ヘルペスウィルス蛋白質の生
産方法に関する。
さらに詳しくは、大腸菌および酵母の両方で増殖しつる
、いわゆるシャトルベクターを用い、そのベクターに担
われた抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域（以
下、酸性ホスファターゼプロモーターまたは酸性ホスフ
ァターゼ遺伝子というつの下流に、単純ヘルペスウィル
ス（以下、Ｈ５Ｖと略す）の遺伝子、ことにＨ５ＶｇＢ
遺伝子を組込んだ組換えプラスミドを得、これを酵母に
与えて形質転換を起こさせて形質転換酵母とし、この酵
母を通常の培養条件韮たは酸性ホスファターゼプロモー
ターが抑制されない条件下に培養してＨ８Ｖ蛋白質、と
くにＨ８Ｖ膜蛋白質ｇＢを高純度に大量生産させる方法
に関する。
最近、先進国に２いてはＨ８Ｖに対する抗体保有人口が
減少してきており、そのような国では。
性器ヘルペス、新生児ヘルペス、ヘルペス脳炎などのＨ
５Ｖｇ染症が大きな問題となりつつある。
このようなＨ８Ｖ［染症の防御にはワクチンが有効であ
り、すでに弱毒化Ｈ８Ｖからなる弱毒化ワクチンやＨ８
ＶＤＮＡを含む不活化ワクチンが提案されている。しか
しながら、Ｈ５Ｖには潜伏感染や発癌性の危険があるこ
とが仰られており、従来の弱毒化ワクチンや不活化ワク
チンではかかる副作用の危険が残り実用上問題がある。
一方、Ｉｌ　Ｓ　Ｖが細胞に感染すると数種の糖蛋白質
（ｇＢ、ｇＣ，ｇＤ、ｇＥなど。なお、従来のｇＡ、ｇ
Ｂ（１））称呼は　１９８３年Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌＨｅｒｐｅｓ　　Ｖｉｒｕｓ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　
（オックスフォード。
英国）にてｇＢと統一された）が産生され、これらの糖
蛋白質がＨ５Ｖの感染防御抗原として重要なことが明ら
かにされるとともに、これら糖蛋白質を成分とす仝いわ
ゆるコンポーネントワクチンについての研究が行なわれ
ている。例えば、キャペルらはｌ−１ｓＶ７Ｅ染細胞ま
たはウィルス粒子より抽出して得られる糖蛋白質が感染
防御抗原として有効であることを報告している〔Ｃａｐ
ｐｅｌ　　ｅｔ　ａｌｏ、Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、、　
７３　ｒ　６１　（１９８２）　〕。
しかしながら、かかるＨ　Ｓ　Ｖ［柔細胞やウィルス粒
子から抽出した糖蛋白質からなるコンポーネントワクチ
ンでは、宿主細胞の多くの蛋白質を含んでいるため、そ
れら不要な蛋白質に起因する創作用が問題である。した
がって、副作用のないコンポーネントワクチンを得るた
めには、高度に精製された糖蛋白質を用いる必要がある
。このような観点から、本発明者らはＨ５Ｖの糖蛋白質
の１種であるｇＢに着目し、それを高度に精製し、マウ
スでの実験でその有効性を確認している〔城野。
細胞工学、３，１２０（１９８４）Ｊ。
ところでこのような糖蛋白質ｇＢを得るには培養細胞に
ウィルスを接種し、それを培養することによって産生さ
せる方法か採られるが、かかる方法では、感染性の因子
を扱うためその操作が困難であり工程もきわめて煩雑と
なるうえ、発癌遺伝子を担うＤ　Ｎ　Ａを完全に除去し
たことを証明することは不可能に近く、結局、かかる天
然の糖蛋白質ｇＢを用いて実用性のある安全なコンポー
ネントワクチンを製造することはきわめて困難である。
発明の目的 上記のような事情のもとに１本発明者らは、該ｇＢの遺
伝子を単離し、それを酵母で発現することができれば、
発癌遺伝子を含まない安全なワクチンを得ることができ
ると考え、鋭意研究を重ねた結果、所望のｇＢ遺伝子の
単離し、酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵
母の抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子を担った特定のプ
ラスミドベクターに、該ホスファターゼプロモーターの
制御下に、該１−Ｉ　Ｓ　Ｖ遺伝子を組込んで新しい組
換えＩ）　Ｎ八を調製し、それによって酵母を形質転換
させ、かかる形質転換酵母を培養することにより所望の
ＨＳ　Ｖ蛋白質（すなわちＴ（ＳＶｇＢ）を産生させる
ことに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち５本発明は、Ｉ−ｌ−１ｓＶ遺伝子を組込んだ
新規な組換えプラスミド、それによる形質転換酵母およ
び該酵母によるＨ　Ｓ　Ｖ　ｇＢの生産方法を提供する
ものである。
本発明の組換えプラスミドは、大腸菌および酵母の両方
の遺伝子を備え、それらのいずれでも増殖しうるシャト
ルベクターを用い、そのベクターに担われた酸性ホスフ
ァターゼプロモーターの下流において、酸性ホスファタ
ーゼ構造遺伝子の一部または全部もしくはさらにその上
流の一定部位までを除去したのちにＨＳ　Ｖ　ｇＢ遺伝
子を組み込んで得られる。このようにして得られるＨ５
Ｖ遺伝子発現プラスミドを常法により酵母に作用させて
形質転換を起こさせることにより所望の形質転換酵母が
得られる。この形質転換酵母を、好ましくは酸性ホスフ
ァターゼプロモーターが抑制されない条件下に培養する
ことにより所望のＨ８ＶｇＢが量産される。
以下に、本発明のＭｉ換えＤＮＡ、形質転換酵母囃晴井
２よびそれによるＨ８Ｖ蛋白質の生産についてさらに詳
細に説明する。
（１］ＨＳ　Ｖ　ｇＢ遺伝子含有フラグメントの調製Ｈ
５Ｖ（Ｋ２Ｓ株）のｇＢ遺伝子は、ブチクらにより、ウ
ィルスＤＮＡ上の位置（０，３４８〜０．３６６マツプ
ユニツト）とその塩基配列が決定されている（　Ｄａｖ
ｉｄ　　Ｊ、　Ｂｊｉｋ　　ｅｔａｌ、、　　Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ。
１３３．３０１−３１４（１９８４）を参照）。
本発明で用いられるシャトルベクターに組込むためのＨ
５ＶｇＢ遺伝子は、Ｈ８ＶＤＮＡ、Ｂ制限酵素Ｂａｍ　
Ｉ且で処理して切出される約ＢＫｂ（０，３４５〜０．
３９９マツプユニツト）のフラグメント（Ｂａｍ　ＨＩ
−Ｇフラグメントという）中に存在する。
■−Ｉ　Ｓ　Ｖ　ｇＢ遺伝子含有フラグメントの調製は
、下記のように、Ｈ５ＶＤＮＡ　　を制限酵素Ｂａｍ　
Ｈｌで切断して得られるＢ　ａｍＨＩ　−Ｇフラグメン
トをクローン化して行なわれる。
Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞うで増殖させ
たＨ５ＶからウィルスＤＮＡを分離し、このウィルスＤ
ＮＡ１制限酵素ＢａｍＨＩで切断し。
アガロース電気泳動によりＢａｍ　ＨＩ　−Ｇ　　フラ
グメントを分離、抽出する。このＢａｍＨＩ−Ｇフラグ
メン・トを、あらかじめＢａｍＨＩ処理した大腸菌プラ
スミド　ＢＲ３２２とＴ４リガーゼにより結合反応させ
る。この反応液にて大腸菌、Ｘｌ　７７６を形質転換し
、その形質転換体のうち、アンピシリン耐性（Ａｐｒ）
でかつテトラサイタリン感受性（Ｔｃりの菌を選択、培
養することにより、この菌体からＲａｍ　ＦＩ　Ｉ　−
Ｇフラグメントを含むプラスミドｐＧを得る。このプラ
スミド、Ｇは第１図に示す構造を有する。
上記プラスミドＰＧをＢａｍＨＩとＸｈｏ■の両制限酵
素で切断するとＨ５ＶｇＢ遺伝子を含む３，５Ｋｂのフ
ラグメントが得られる。このフラグメントを分離、抽出
後、あらかじめＢａｍＨＩとＸ　１１　ｏ　Ｉで処理し
た大腸菌プラスミド、ＡＣＹＣＩ７７の２．６Ｋｂフラ
グメントとＴ４リガーゼにより結合反応を行なわせる。
この反応液にて大腸菌を形質転換し、得られるアンピシ
リン耐性の形質転換体を培養することにより、その菌体
からＨ８ＶｇＢ遺伝子を含有するプラスミド、、ＧＢＸ
Ｂ得る。このプラスミド、ＧＢＸは第２図に示す構造を
有する。このプラスミＦ　ｐ　Ｇ　Ｂ　Ｘ　（７）　Ｘ
　ｈ　ｏ　１部位からＨ５ＶＤＮＡ側約３００　ｂｐの
塩基配列をジデオキシ法（蛋白質・核酸・酵素、Ｖｏ（
１，２９，Ｎ１１４．２９４〜３（１６（１９８４）を
参照）により決定したところ、第３図に示すような塩基
配列を有し、これは前記ブチクらの塩基配列とほぼ一致
する。
上記プラスミドＰＧＢＸ　では、ＸｈＯ工　部位からｇ
Ｂ遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧまで約２５０ｂｐ離れ
ているが、このＡＴＧの上流−１４ｂｐ〜−１９ｂＰ　
　にＡ、１部位が存在するため、このプラスミド、ＧＢ
Ｘを制限酵素Ａ　ｐ　ａ　Ｉで部分切断し、ＤＮＡポリ
メラーゼ反応により平滑木端（ｆｌｕｓｈｅｎｄ　）に
変換後、ＸｈＯＩリンカ−を結合させて再環状化して、
−１４ｂｐ　〜＝１９ｂｐのＡｐａＩ部位のみがＸｈｏ
Ｉ部位に変換されたプラスミドｐＧＡＢを得る。このプ
ラスミド、ＧＡＢ　　は第４図に示す構造を有している
。このＨ５ＶＤＮＡを大腸菌によりクローニングして増
幅したのち、通常は適当な制限酵素で処理して所定のフ
ラグメントとして。
後述のプラスミド構築に供する。
（２）シャトルベクタ一 本発明で用いられるシャトルベクターは、酵母の遺伝子
と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制性酸性ホスフ
ァターゼ遺伝子を担ったプラスミドベクターである。
この酵母の遺伝子としては、一般に、プラスミドが酵母
中で染色体と独立して増殖するのに必要なＤＮＡ配列、
例えば酵母の自律増殖に必要なＤＮＡ配列（ａｒｓｌ　
）と２μｒｒＬＤＮＡの複製ｔコ必要なＤＮＡ配列（２
μ０ｒｉ）　　があり、所望により、さらに形質転換酵
母の選択マーカーとなる遺伝子が含まれる。この選択マ
ーカーとしては、ロイシン産生遺伝子、ヒスチジン産生
遺伝子、トリプトファン産生達伝子、ウラシル産生遺伝
子、アデニン産生遺伝子などが含まれ。これらの１種ま
たは２種以上が用いられる。
大腸菌側の遺伝子としては大腸菌体内においてプラスミ
ドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、例えばＣｏ１Ｅ
Ｉ系のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、好ま
しくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺伝
子を含む。この選択マーカーの遺伝子としてはアンピシ
リン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイ
クリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子な
どが挙げられ、これらの遺伝子の１種または２種以上が
用いられる。このような大腸菌ＤＮＡとしてアンピシリ
ン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するｐ
ＢＲ３２２が一般に汎用されている。
本発明で用いるシャトルベクターは酵母の抑制性酸性ホ
スファターゼプロモーターを担っていることが特徴であ
り、この酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスフ
ァターゼを構成する６０．０００ダルトンのポリペプチ
ド（ｐ６０）のプロモーターである。
このようなシャトルベクターの代表的な例は、特開昭５
９−３１７９９号ζこ開示されている、酵母側の遺伝子
としてａｒｓｌ、２μｏｒｉおよびロイシン耐性遺伝子
（Ｌｅｕ　２）を有する酵母ＤＮＡと大腸菌プラスミド
ｐＢＲ３２２とを組合せたシャトルベクターｐＡＴ７７
から、その酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部または
全部と、さらに上流の一１００ｂｐの前までの適当な部
位まで、通常＋１〜−１００　ｂｐ、好ましくは＋１〜
−５　ｏｂｐまで除去したプラスミド、例えば−３３ｂ
ｐまで除去したシャトルベクターｐＡＭ８２である。
このＰＡＭ８２は酸性ホスファターゼプロモーター下流
にＸｈｏＩ部位、さら１こその下流にＰｖｕ■部位が存
在しており、本発明のＨ５Ｖ　ｇ　Ｂ遺伝子（Ｘｂｏ　
Ｉ　−ＢａｍＩ−ＩＩ処理フラグメント）を挿入するた
め（こ、このＰＡＭ８２を制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩで切断
して平滑末端（ｆｌｕｓｈ　ｅｎｄ）に変換し、その部
位にＢａｍＨＩ　＋Ｊンカーを結合し、再環状化して、
第５図に示すような構造を有するプラスミドｐＯＮＹ１
とする。
このプラスミドｐＯＮＹｌは酸性ホスファターゼプロモ
ーターの制御下に外来遺伝子を純粋な形で発現させ得る
シャトルベクターで、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏ
Ｉ　　で処理することにより容易にその組込み部位を開
裂させることができ、所望の遺伝子を組込むのに適して
いる。
（３１Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　ｇ　Ｂ遺伝子発現プラスミドの
構築本発明の組換えプラスミド、すなわちＨＳ　Ｖ遺伝
子を組込んだプラスミドの調整は、まず前記シャトルベ
クターｐＯＮＹｌを制限酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩおよびＸ
ｈｏｌ　で処理して開裂させ、これに前記Ｉ−Ｉ　Ｓ　
ＶｇＢ遺伝子（プラスミドｐＧＡＢをＢ　ａ　ｍＩ−Ｉ
　ＩおよびＸｈｏ　Ｉ　で切断したｇＢ遺伝子を含む３
．３ｋｂのフラグメント）を作用させて連結させる。こ
れを太腸閉番こて増幅し、第６図に示す構造の組換えプ
ラスミドｐＯＮＹＧＢ　を得る。
（４）酵母の形質転換 形質転換されるべき酵母としては、プラスミド！″−担
われた形質転換酵母の選択マーカー遺伝子によって相補
される変異を持った変異株、例えばロイシン要求性変異
株であるサツカロミセス・セレビシエ　（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２また
はＡＨ２２ｐｈ０８０　（ａ　　Ｉｅｕ　　２　ｈｉｓ
４　Ｃａｎｅ、Ｃｉ十）を用いる。上記組換えプラスミ
ドを大腸菌にて増殖させたのち、該酵母変異株に常法に
より作用させ、例えばスフェロプラスト化したのちカル
シウム処理した菌体とプラスミドＤＮＡを混合して形質
転換を起させる。このように処理された酵母をベクター
上に担われている宿主酵母の変異を相補する遺伝子、例
えばロイシン産生遺伝子の発現を指標として形質転換酵
母を選択し、分離する。
なお、酵母としてはロイシン要求性変異株のほかに、ヒ
スチジン要求性変異株、トリプトファン要求性変異株、
ウラシル要求性変異株、アデニン要求性変異株などが挙
げられる。
（５）形質転換酵母の培養およびＨＳ　Ｖ　ｇ　Ｂの生
産上記の方法で得られた形質転換酵母をリン酸を含む培
地にて通常の培養条件下に前培養し、対数増殖期ｌこあ
る菌体をリン酸を含まない培地ｔζ移しかえて酸性ホス
ファターゼプロモーターが抑制されない条件下に培養す
る。培養後、常法により集菌し、溶菌処理し、所望のＨ
Ｓ　Ｖ　ｇ　Ｂを多量に含む溶菌液を得る。
なお、用いる酵母の種類により、例えびＰｈ。
８０変異株を用いた場合には、酸性ホスファターゼプロ
モーターを抑制しない条件をとくに採用する必要はなく
、該形質転換酵母を直接培養して所望のｔＩ　Ｓ　Ｖ　
ｇ　Ｂを多量に産生きせることができる。
上記培養によって得られるＨ５ＶｇＢを通常の蛋白質精
製法により精製する。例えば、抗ｇＢ抗体を結合したゲ
ルを充填したカラム番こ該ｇＢ含有抽出液を通し、３Ｍ
ＫＳＣＮで溶出してｇＢを単離する。
上記の方法で得られるｇＢはＨ５Ｖ　感染細胞から得ら
れる天然ｇＢと免疫学的に全く同一であり、ＨＳ　Ｖワ
クチンまたは診断用試薬として利用し得る。
つぎに実施例を挙げて本発明の組換えプラスミド、形質
転換酵母、およびＨ５ＶｇＢの生産についてさらに具体
的に説明する。
実施例 ｆｌ）１４ｓＶｇＢ遺伝子含有ＤＮＡ（７）調製（ｉ）
ＬＩＳＶ−Ｉ　ＤＮＡの調製 Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）（約５Ｘ１
０８ｃｅｌ１ｇ）に単純ヘルペスウィルス１型（Ｉ（Ｓ
Ｖ−１）（Ｋ２Ｓ株）を０．５　ＮＩＰＦＵ／ｃｅ１１
　の量で感染させ、３７℃で２０〜２４時間培養して、
細胞変性が充分に起きた時点で２８．００Ｏｒｐｍ　に
て１時間遠心して感染細胞と上溝を分離して、感染細胞
のペレット（２〜３−）を得る。
これをリン酸緩衝液−生理食塩液（ｐＨ７，２）　　（
以下、ｐＢｓと略記する）６．０〜ｌ、に懸濁し、この
懸濁液を超音波処理（９ＫＨｚ、２００Ｗ、５分間処理
）または凍結融解（−５０℃（アセ１−７−ドライアイ
ス）と３７℃にて３回凍結融解を繰返す〕を行って細胞
を破壊し、細胞残渣を低速遠心分離（３，ｏｏｏｒｐｍ
、２０分間月こより除去する。得られる溶液をグリセロ
ールクッション（５％、４０％）（こ重層し、３５００
０ｒｐｍにて１時間遠心分離する。得られたペレット０
．５〜ｌ−をＰＢ５１〜２ｍ１．ｉこ懸濁し、これにＤ
Ｎａ　ｓ　ｅ　１０　μｇ／−およびＲＮａ　ｓ　ｅ　
Ｑ、３　ｍＶｒｒｌを３７℃で１時間作用させ、ついで
１１５量の５ＸＳＴＥＰ（Ｑ、５％ＳＤＳ、５　Ｑ　ｍ
Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＩ！、ＰＨ７，５，０，４
ＭＥＤＴＡ１０．１％プロテイナーゼＫ）を加え、５０
℃で３０分間作用させる。この処理液を等量のフェノー
ル、フェノール−クロロホルム ロホルムで順に抽出し、ＤＮＡを含む水層を得る。
この水層をＴＥ緩衝液（　２　Ｑ　ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　
ｓ　−ＨＣｊ’、１　ｍＭＥＤＴＡ，　ｐｉ−Ｉ７．５
　）　　に透析したのち、冷エタノールを加えてＤＮＡ
を沈殿させる。このＤＮＡを沖取し、真空下で乾燥後、
塩化セシウム水溶液（Ｒｆｌ．３８８５、エチジウムブ
０　７　イＦ　Ｏ．０４係、ラウロイルサルコツネート
０．４％を添加）５ｄに溶解し、４０００ｒＰｍ　で７
２時間遠心分離し、Ｉ（ＳＶ−ＩＤＮＡのバンドを形成
させる。このバンドを回収し、イソプロピルアルコール
で洗浄シテエチジヮムブロマイドを除去後、ＴＥｐ衝液
に透析する。これに冷タノールを加えて沈殿させてＨＳ
Ｖ−Ｉ　ＤＮＡを得る。
（ｉ）Ｉ（ＳＶ−Ｉ　ＤＮＡのＢ　ａ　ｍ　Ｈ　Ｉ切断
Ｇフラグメントのクローン化 上記の方法で調製したＨＳＶ−Ｉ　ＤＮＡ約１００μｇ
を、７　３ｍＭＴｒｉｓ　−ｒ−ｔｃｚ　（ｐＨ８．０
）、　７ｒｎＭ　Ｍｇ　Ｃ　ｊ’　２、１００ｍＭＮａ
Ｃｌ！、２　ｍＭ　２−メルカプトエタノールの混液ｏ
．７５ｄ中で、制限酵素Ｂａｍｌ−ＩＩ　　により３７
℃、６時間処理したのち、０、７％アガロース電気泳動
によって各断片を分離し、Ｇフラグメント（０．３４５
〜０．３９９マツプユニツト〕に相当する部分のゲルを
切り取り、電気泳動的にＧフラグメントを回収スル。
前記と同様にして制限酵素ＢａｍＨＩ　により開裂され
たｐ　Ｂ　Ｒ　３　２　２プラスミド１／１０モル量と
上記Ｇフラグメント約２μｇとを、５ＱｍＭＴ　ｒ　ｉ
　ｓ　−ＨＣ　ｆ　、　ｐｉ４　７．９、１０ｍＭＭｇ
Ｃ１２、２０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ　
混液中にて、Ｔ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用いて１６
℃で約１６時間反応させる。
高木康敬編著「遺伝子操作実験法」第１６１項に記載の
方法で大腸菌メ１７７６の培養液を調製し、その菌液０
．１〜ｌに上記反応液を加えてよく混合させ、０℃で４
５分間放置したのち、アンピシリン１００μｇ／ｒｎ！
．を含む寒天プレート上に塗沫し、３７℃で一夜培養す
る。出現したコロニーについて、アンピシリン１００μ
ｇ／ｒｎｌを含む寒天プレートとテトラサイクリン１０
０μｇ／ｒｎ１．を含む寒天プレートにそれぞれ塗沫し
、同様に培養してアンピシリンを含む寒天プレートでの
み増殖したコロニーを選択する。ｐＢＲ３２２はアンピ
シリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有す
るがテトラサイクリン耐性遺伝子中にあるＢａｍＨ　Ｉ
部位にＨＳＶ−ＩＤＮＡ断片が挿入されることによりテ
トラサイクリン耐性が消失されるため、上記選択された
コロニーはＰＢＲ３　２２−ＨＳＶＤＮＡのＢａｍＨＩ
Ｇ７ラグメントの組換えＤＮＡを保持していることにな
る。
上記の方法で得られたコロニーについて、「代謝」第１
７巻、第４号、第８１〜８９頁（　１９８０）「プラス
ミドＤＮＡの調製」に記載される方法にしたがってプラ
スミドを調製する。得られたプラスミドを種々の制限酵
素（ＢａｍＨＩ、ＢｓｔＥ■、ＫｐｎＩ，ＳａｌＩ，５
ＳＬＩ，ＸｈＯ．Ｉ）にてその切断パターンを分析する
ことにより、ＨＳＶ−ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（７）　Ｂ　ａ
　ｍ　Ｉ−Ｉ　Ｉ　ＧフラグメントがＰＢＲ３２２に組
込まれたＰＢＲ３２２−ＢａｎｉＨＩ−Ｇ　　フラグメ
ントの組換えＤＮＡ（プラスミドＰＧ）を得る。
＠）プラスミドｐ　Ｇ　Ｂ　Ｘの調製 上記の方法で得られたプラスミドＰＧＩＯμｇを、６ｍ
Ｍ　　トリス−Ｉ４ＣＪ（ｐＨ７，５）、５ｍＭＭ　ｇ
　ＣＺ　２．６ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１５
　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣｊ）ノ混液１００μｌに加え、これ
に制限酵素ＢａｍＩ（ＩＩＱ　単位およびＸｈｏＩＩＱ
単位を加えて、３７℃で２時間反応させる。この反応液
を、高木座敷著「遺伝子操作マニュアル」３３〜３４頁
に記載の方法により、１係アガロースゲルにて電気泳動
により３，５ｋｂ　フラグメントＤＮＡを分離、抽出す
る。
得らレタ３．５　ｋｂ　−ｙ　７グメントＤＤＮＡ１０
０ｎと大腸菌プラスミドｐＡｃＹｃ１７７（ＢａｍＨＩ
　　およびＸｈｏＩ　で処理して開裂したもの）　１０
０ｇとを、Ｔ４リガーゼ０．１単位、６６　ｍＭ　ト’
ｌＪ　ス−ＨＣ：ｌ！（ｐＨ７，５）、６．６　ｍＭ　
Ｐｉ（ｇＣｐ　２．１０　ｍＭジチオスレイトールとの
混液１０μｌを用いて１６℃で８時間反応させる。この
反応液を用い、高木座敷編著「遺伝子操作実験法」１６
１〜１６２頁に記載の方法（こより、大腸菌ｚ　ｌ　７
７６を形質転換させ、その形質転換体からアンピシリン
耐性菌を選択し、この菌から、上記「代謝」第１７巻、
第４号、第８１〜８９頁（１９８０）に記載の方法にし
たがってｇ　Ｉ３遺伝子を含むプラスミドＰＧＢＸを得
る。
（ｉｖ）プラスミドｐＧＢＸのＸｈｏＩ−５ａ、ＪＩ　
　領域（１，２ｋｂ）　　の塩基配列 上記得られたプラスミドｐＧＢＸＩＱμｇ　を・６．１
１Ｍ　　ト　リ　ス　−トｉｃ、／（ｐｌ−１７，９）
　、　　６　　ｍＭ　　ＭｇＣＪ２．６ｍＭ２−メルカ
プトエタノールの混液１００μｌにとかし、これに制限
酵素５ａｐＨＱ単位およびＸｈｏｌｌＱ単位を加えて３
７℃で２時間反応させる。この反応液を上記と同様にし
て１％アガロース電気泳動に付して１．２ｋｂのフラグ
メントを分離、抽出する。
得られたｌ、２ｋｂフラグメントをクローニングヘクタ
ーＭ１３ｒｌ’ｌＰ　１１　（ファルマソア・ジャパン
（株９販売）のＳａｄ　Ｉ部位に挿入し、ジデオキシ法
（蛋白質・核酸・酵素、ＶＯ１２９、＆、４．２９４〜
３（１６（１９８４）ｒジデオキシ法によるＩ）ＮＡの
塩基配列決定法」を参照用こよりその塩基配列をしらべ
たところ、第３図に示すような塩基配列を有し、ｇＢ遺
伝子の翻訳開始コドンＡＴＧとＸ　１１ｏ　Ｉ　部位は
約２５０　ｂｐ離れており、またそのＡＴＧから１４ｂ
Ｐ〜１９ｂＰ上流にＡｐａＩ部位が存在していた。
（ｖ）プラスミドｐ　Ｇ　、Ａ　Ｂの調製上記プラスミ
ドｐ　Ｇ　Ｂ　Ｘを下記のように処理してｇＢ遺伝子翻
訳開始コドンＡＴＧ上流のＡ’ｐａ■部位のみをＸｈｏ
Ｉ　　部位に変換する。
プラ：７．−．　ドｐＧＢＸ２μｇ　、Ａｐａ　Ｉ　Ｑ
、ｌ単位、６ｍＭ　トリス−ＨＣ７３（ｐＩ−Ｉ　７，
５　）、５　ｍＭＮａＣ／、５ｍＭ　ＭｇＣｊ？２．６
ｍＭ　２−メルカプトエタ／　−ルの混液５０μｌを３
７℃、５分間反応後、フエ／−ル処理、エタノール沈殿
を行なう。そのＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ０．１
単位、２００μＭｄＡＴＰ）ｄｃ：ＴＰ、ｄＧＴＰｌ、
ｄＴＴＰ、、５７　ｍＭ　トリス−ＨＣ１！（ｐ）Ｉ３
．５　）、６．７　ｒｎＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ！２、ｌ　Ｑ
　ｍＭ２−メルカプトエタノールペ　１６．７ｍＭ（Ｎ
Ｈ４）２Ｓ　Ｏ、ｔ　　の混液５０μｌ中で３７℃、３
００分間反応後フェノール処理、エタノール沈殿を行な
う。
こ（７）ＤＮＡ　１ｐｍｏｌｅを、Ｔ４リガーゼ０．１
単位、６６ｍＭ　　トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，６）、６
．６　ｍＭＭｇＣＺｚ、１０ｍＭ　ジチオスレイトール
、５５μＭＡＴＰおよび１０　ｐｍｏ　Ｉ　ｅ　Ｘ１１
ｏ　Ｉ　　リンカ−の混液１０ｔｔｌ中で１６℃、８時
間反応させる。
この反応液にて、前記高木座敷編著「遺伝子操作実験法
」１６１〜１６２頁に記載の方法により、大腸ｍ’Ｘ−
１７７６を形質転換させる。アンピッリン含有プレート
に成育してくるクローンを複数選択し、これらの菌体か
ら前記と同様の方法ｌこよりプラスミドを調製する。こ
れらのプラスミドを各々制限酵素ＸｈｏＩ　　て処理し
、その電気泳動パターンによりｇＢ遺伝子翻訳開始コド
ノＡＴＧ上流のＡｐａｌ　　部位のみがＸｈＯ■部位に
変換されたプラスミドｇ　Ｇ　Ａ　Ｂを選択する。
（２）シャトルベクターｐＯＮＹｌの調製特開昭５９−
３１７９９号に記載の方法と同様にして調製したプラス
ミドＰＡＭ８２を用い、これを下記のように処理してそ
のＰｕｖＩＩ部位をＢａｍＨＩ部位に変換する。
プラスミドＰＡＭ８２をＸｈｏＩ　　で処理して切断し
たフラグメント２μｇを、２００μＭ（７）ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む６７ｍＭ　ト
リｘ　−ＨＣｌ　（ｐＨ８，６）　、６．７　ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ３２．１０ｍＭ２−メルカプトＩ−１／−／ｌ／
、６．７　μＭＥＤＴＡオヨヒ１６．７　ｍＭ　（ＮＨ
４）　２Ｓｏ４の混液５０μｌ中で、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ０．１単位と３７℃にて３０分間反応させる。こ
の反応液をフェノール抽出、エタノール沈殿に付したの
ち、得られるＤＮＡとＢａｍＨＩリンカ−を１：１０モ
ル比ｉコテＴ４リガーゼｌこより１６℃、８時間結合反
応を行なう。
この反応液を用い、前記プラスミドｐ　Ｇ　Ｂ　Ｘの調
製の場合と同様に、高木東歌編著「遺伝子操作実験法」
１６１〜１６２頁に記載の方法により、大腸菌プラスミ
ド％１７７６を形質転換し、アンピシリン耐性菌を培養
し、その菌体から前記と同様の方法にてＰＡＭ８２のＰ
ｖｕ　１１部位がＢａｍＨＩ部位ｔこ変換されたプラス
ミドｐＯＮＹ　ｌを単離する。
（３１Ｈ３ＶｇＢ遺伝子発現プラスミドの調製前記（１
）（Ｖ）で得られたＨ　Ｓ　Ｖ　ｇ　Ｂ遺伝子全体を含
有するプラスミドｐＧＡＢ　１０μｇを、５ｍＭ１−リ
ス−ＨＣｆ　（ＰＨ７，５）、５　ｒｎＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ
７３２、６ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１５０ｍ
ＭＮａＣ１、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ１０単位　Ｘｈｏ１１０
単位の混液１００μｌ中で３７℃、２時間反応後、１チ
アガロース電気泳動により前記と同様の方法にてＨＳ　
Ｖ　ｇ　Ｂ遺伝子を含む３．３ｋｂのＤＮＡフラグメン
トを分離抽出する。
一方、上記（２）で得られたシャトルベクター１０μｇ
を上記と同様にして制限酵素Ｂ　ａ　ｍＨＩおよびＸｈ
ｏ　Ｉで処理し、１％アガロース電気泳動により酸性ホ
スファターゼプロモーターを含む１ＱｋｂのＤＮＡフラ
グメントを分離抽出する。
上記で得られた３、３ｋｂフラグメントｌｏＯｎｇと１
０ｋｌ）７ラグメ７ト１ｏｎｇとを、５５ｍＭト！７ス
ー１−ＩＣＩ！（ｐＨ７，６）、６．６　ＩｎＭ　Ｍ　
ｇ　ＣＩ！２．１０ｍＭジチオスレイトールおよび６６
μＭＡＴＰ（Ｄ混液１０μＥ中、Ｔ４リガーゼ０．１単
位にて１６℃、８時間結合反応させる。
、この反応液を用い、前記プラスミドｐ　Ｇ　Ｂ　Ｘの
調製の場合と同様に、高木東歌編著「遺伝子操作実験法
」１６１〜１６２頁に記載の方法により、大腸菌プラス
ミド’Ｘ−１７７６を形質転換し、アンピシリン耐性菌
を選択培養し、上記と同様の方法にて、その菌体から、
酸性ホスファターゼプロモーター下流にＨＳ　Ｖ　ｇ　
Ｂ遺伝子が結合された組換えプラスミドｐ　ＯＮ　Ｙ　
Ｇ　Ｂ　を単離する。
（４）形質転換酵母の調製 酵母としてサツカロミセス・セレビシェＡｌ−Ｉ２２　
Ｃａ　１ｅｕ２　ｈｉｓ４　Ｃａｎ１　（Ｃｉｒ＋）　
：ｌ］　（微工研条寄第３１２号〕を用い、これをＹＰ
Ｄ培地（２％ポリペプトン、１％イーストエキス、２％
グルコース）１００ｒｎｔに接種し、３０℃で一晩培養
したのち、遠心して集菌する。滅菌水２０ｒｎｌにて菌
体を洗浄し、°ついで１．２Ｍソルビトールおよび１０
０μｇ／ｍ！、チモリアーゼ６０．０００　（生化学工
業部〕の溶液５−に懸濁させ、３０℃で約３０分間保ち
、町−イ＋□−＋１１１＋□１　＋ｈ□　、−９゜□−
ストを１．２Ｍソルビトール溶液で３回洗浄したのち、
２Ｍソルビトール、１０　ｒｎＭ　Ｃａ　（：ｌ　２お
よび１０ｍＭトリｘ　−１４ＣＩ　（ｐＩ−Ｉ　７．５
　）　ＣＤｍ液０．６−に懸濁させ、その６０μｌずつ
を小試験管に分注する。これに前記（３）で調製した組
換えプラスミドｐＯＮＹＧＢ　　１０μｇ　を加え、充
分混合し、ざらに０、Ｉ　Ｍ　ＣａＣ１２（３μｌり加
えて最終濃度Ｉ　ＱｍＭＣａ　Ｃｌ　２とし、室温に５
〜１０分間放置する。ついでこれ（こ、２０％ポリエチ
レングリコール４０００、ｌ　ＯｍＭｃａｃ１２　およ
び１０ｍＭ１−リス−［−１ＣＩ　（ｐＨ７，５）溶液
１ｒｎ１．ずつを加えて混合し、室温に約２０分間放置
する。この混合液０．２　ｒｎ！、ずつを４５℃に保温
された再生培地（２２％ソルビトール、２％グルコース
、０．７％イーストニトロゲンベースアミノ酸、２チＹ
ＰＤ、２０μｇ／−ｉヒスチジン、３％寒天）１０−に
加え、軽く混合させ、予め準備された１、２Ｍソルビト
ール含有最小培地（０，７％イーストニトロゲンベース
アミノ酸、２チグルコース、２０μｇ／ｎ１．ヒスチジ
ン、２チ寒矢）プレートに重層し、固化させたのち、３
０℃で培養してロイシン非要求性酵母のコロニーを得る
。
このコロニーを２０μｇ／−４ヒスチジンを含むバルク
ホルダーミニマルメデ４　＋７　ム（Ｔｏｈｅ、Ａ、ｅ
ｔ　ａｌ　：Ｊ、Ｂａｃｈｔｅｒｏｌ、、　１１３　、
７２７〜７３８　（１９７３）を参照〕にて培養して形
質転換酵母サツカロミセス・セレビシェＹＧＢを得る。
（５）形質転換酵母によるＨ　Ｓ　Ｖ　ｇ　Ｂの製法前
記（４）で得られた形質転換酵母のコロニーをさらに２
０μｇ／ｍ７！ヒスチジンを含むバルクホルダーミニマ
ルメデイウムの寒天プレート上ｌこ塗布し、３０℃にて
培養してコロニーを形成させる（ロインン非要求性とな
った形質転換体の再確認のため〕。ついてこのコロニー
から菌体を分離し、２０μｇ／ｍ７ヒスチジンを含むバ
ルクホルダーミニマルメティウム１０ｒｎｌに接種し、
３０’Ｃｆごて培養を行なう。約２４時間後、対数増殖
期にある菌体を遠心して集菌し、これをリン酸を含まな
い最小培地（バルクホルダーミニマルメデイウムに含ま
れるＫＨ２ＰＯ４をＫＣｌで置換し、サラニ２０　ｔｔ
ｇｙｍｔ　ヒスチジンを加えたもの）１０−に菌数約’
４Ｘ１（１６ｃｅｌｌｓ、々になるように懸濁し、３０
℃にて約２４時間培養を続けたのち、４，０００回転、
１０分間の遠心により菌体を集める。この菌体を１．２
Ｍソルヒトール、５　Ｑ　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
２）、１４ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００．ｃ
＋ｇ汐ザイモリエース６０．０００の溶液３ｍｌに懸濁
させ、３０℃にて３０分間ゆるやか番こ振盪してスフェ
ロプラスト化し、遠心分離によりこれを集める。このス
フェロプラストを１％トリトンＸ−１００を添加した５
９ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，２）１ｒｎ１．に懸濁し
、グラスビーズを加えて撹拌して菌体を破砕する。この
破砕液を５００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、上清を酵素
抗体法によりｇＢ抗原活性を測定した。その結果を第１
表に示す。
また、上記破砕液を５匹のモルモットｌこ１ｒｎＩずつ
１週問おきに４回皮下接種すると、すべてのモルモット
に中和抗体が出現することが認められた。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明で用いられるＨ　Ｓ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａ
のＢａｍＨＩ−Ｇフラグメントを含むプラスミドＰＧの
構造、第２図は同プラスミドｐ　Ｇ　Ｂ　Ｘの構造、第
３図はＨ５ＶｇＢ遺伝子とその上流領域の塩基配列、第
４図はプラスミドｐ　Ｇ　Ｂ　ＸのＡｐａＩ部位をＸｈ
ｏｌ　部位に転換したプラスミドｐ　Ｇ　Ａ　Ｂの構造
、第５図はシャトルベクターｐＯＮＹｌの構造、第６図
は本発明のＨＳ　Ｖ　ｇ　Ｂ遺伝子を組込んだ組換えプ
ラスミドｐＯＮＹＧＨの構造を示す。 特許出願人　財団法人化学及血清療法研究折代　理　人
　弁理士前出　葆はか１名 第４図 ８ｏｍＨＩ 第５図 フーロそ一夕−Ｘｈｏｒ 第６凶 ７）７モーター　　　Ｘｈｏ工

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母
    の抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域を担つた
    プラスミドベクターに、該ホスファターゼプロモーター
    の制御下に単純ヘルペスウィルス遺伝子を組込んだこと
    を特徴とする組換えプラスミド。
  2. （２）該抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域が
    ホスファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリ
    ペプチド（Ｐ６０）の遺伝子であり、その構造遺伝子の
    一部または全部もしくはさらにその上流の種々の部位ま
    でが除去されている前記第（１）項の組換えプラスミド
    。
  3. （３）酵母の遺伝子がａｒｓ１および２μｏｒｉである
    前記第（１）項の組換えプラスミド。
  4. （４）酵母の遺伝子としてａｒｓ１、２μｏｒｉならび
    に形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子を有する前
    記第（１）項の組換えプラスミド。
  5. （５）該選択マーカーとなる遺伝子がロイシン産生遺伝
    子、ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子
    、ウラシル産生遺伝子およびアデニン産生遺伝子から選
    ばれる１種または２種以上である前記第（４）項の組換
    えプラスミド。
  6. （６）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
    ために必要なＤＮＡ配列である前記第（１）項の組換え
    プラスミド。
  7. （７）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
    ために必要なＤＮＡ配列ならびに形質転換大腸菌の選択
    マーカーとなる遺伝子である前記第（１）項の組換えプ
    ラスミド。
  8. （８）該選択マーカーとなる遺伝子が、アンピシリン耐
    性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン
    耐性遺伝子およびクロラムフエニコール耐性遺伝子から
    選ばれる１種または２種以上である前記第（７）項の組
    換えプラスミド。
  9. （９）該組込み単純ヘルペスウィルス遺伝子がアミノ酸
    ９０３個に相当する単純ヘルペスウィルスｇＢ遺伝子全
    体を含むフラグメントである第（１）項の組換えプラス
    ミド。
  10. （１０）該ｇＢ遺伝子全体を含むフラグメントが制限酵
    素Ａｐａ I およびＢａｍＨ I で処理して得られるフラ
    グメントである第（９）項の組換えプラスミド。
  11. （１１）酵母に、前記第（１）項の組換えプラスミドを
    作用させて形質転換させてなる形質転換酵母。
  12. （１２）該酵母がロイシン要求性変異株、ヒスチジン要
    求性変異株、トリプトファン要求性変異株、ウラシル要
    求性変異株およびアデニン要求性変意株から選ばれる１
    種である前記第（１１）項の形質転換酵母。
  13. （１３）該酵母がロイシン要求性変異株のサツカロミセ
    ス・セレビシエＡＨ２２ａｌｅｕ２　ｈｉｓ４Ｃａｎ１
    （Ｃｉｒ＾＋）である前記第（１１）項の形質転換酵母
    。
  14. （１４）第（１１）項の形質転換酵母を培養して単純ヘ
    ルペスウィルス糖蛋白質を産生させ、それを収集するこ
    とを特徴とする単純ヘルペスウィルス蛋白質の製法。
  15. （１５）該形質転換酵母の培養を、酸性ホスファターゼ
    プロモーターが抑制されない条件下に行なう前記第（１
    ４）項の製法。
  16. （１６）該単純ヘルペスウィルス蛋白質が単純ヘルペス
    ウィルスの膜蛋白質ｇＢである第（１４）項の製法。
JP15176684A 1984-07-20 1984-07-20 単純ヘルペスウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド、形質転換酵母および単純ヘルペスウイルス蛋白質の製法 Pending JPS6128391A (ja)

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AT85109042T ATE61819T1 (de) 1984-07-20 1985-07-19 Rekombinante dns, enthaltend ein herpes-simplex- virus-gen oder ein fragment davon, hefe transformiert mit dieser rekombinanten dns und verfahren zur herstellung von herpes-simplex- virus-proteinen.
EP85109042A EP0170169B1 (en) 1984-07-20 1985-07-19 Recombinant dna containing a herpes simplex virus gene or a fragment thereof, yeast transformed with said recombinant dna, and method for the production of herpes simplex virus proteins
DE8585109042T DE3582200D1 (de) 1984-07-20 1985-07-19 Rekombinante dns, enthaltend ein herpes-simplex-virus-gen oder ein fragment davon, hefe transformiert mit dieser rekombinanten dns und verfahren zur herstellung von herpes-simplex-virus-proteinen.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2019044927A1 (ja) * 2017-08-30 2020-08-20 Ｋｍバイオロジクス株式会社 改変型ＨＳＶ ｇＢタンパク質及びこれを含むＨＳＶワクチン

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2019044927A1 (ja) * 2017-08-30 2020-08-20 Ｋｍバイオロジクス株式会社 改変型ＨＳＶ ｇＢタンパク質及びこれを含むＨＳＶワクチン
US11421002B2 (en) 2017-08-30 2022-08-23 Km Biologics Co., Ltd. Modified HSV gB protein and HSV vaccine including same

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