KR890000096B1 - B형 간염 비루스 표면항원의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

B형 간염 비루스 표면항원의 제조방법.
제1도는 본 발명에서 사용되는 HBV유전자를 함유하는 HBV DNA 단편의 구조도.
제2도 (1),(2),(3)은 HBS유전자의 아미노산 배열도.
제3도는 세틀벡터 PAT 77 및 AM 82의 규조도.
제4도는 세틀벡터의 산성 포스파티아제 촉진유전자 부근의 유전자 지도.
제5도는 Bst EII-Sal I 영역의 염기배열도.
제6도는 본 발명에서 얻어지는 효모용균액에 관한 평행선 검정법에 의한 항원량 및 항원의 반응성을 표시하는 그래프.
본 발명은 B형 간염 비루스 표면항원의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 B형 간염 비루스(HBV) 표면항원(이하, "HBs 항원", "HBsAg 또는 "S 항원"이라고 칭함)을 대장균(Escherichiacoli 및 효모의 양쪽에서 증식할 수 있는 셔틀벡터를 사용해서 벡터에 담겨진 억제성 산성 포스파타아제 유전자의 형질 발현(發現) 조절영역(이 영역을 이하 "산포스파타아제 촉진 유전자" 또는 "산포스파타아제 유전자"라고 칭함)의 하류에서 삽입시켜서 얻어지는 조환 플라스미드, 전술한 조환 플라스미드에 의해서 형질 전환된 효모, 그리고 산성 포스파타아제, 촉진 유전자가 억제되지 않는 조건하의 적당한 배지에서 전술한 형질 전화효모를 배양하는 것으로 된 면역학적으로 활성인 HBs 항원(HBaAg)의 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로 HBV 양성환자의 혈액의 수혈이나 기타로 기인되는 B형 간염은 치료가 곤란하고 또 완전한 치료에 적합한 약제가 없다. 가장 적합한 예방은 HBs 항원으로 된 왁찐이다. 그러나, HBsAg 왁찐을 양산하는 것은 극히 곤란하다.
그 이유는 HBV가 사람과 침판지에만 감염되기 때문이고 (배양세포를 HBV로 감염시키는 것은 성공하지 못하였다) 그리고 이같은 HBV의 특수성 때문에 HBsAg는 인간 혈청에서 얻어야만 한다.
최근 인간혈청 대신에 제조합 DNA를 사용해서 대장균(E.Coli)으로 HBsAg를 만드는 방법이 제안되었다. (참조 : 1980년 일본국 특허공개공고 제 104887호).
그러나 대장균을 사용하는 이같은 방법에 따르면 필요로 하는 HBsAg를 대량으로 생산하기 곤란하다.
그 이유는 생산된 HBsAg가 대장균세포내에서 쉽게 분해하고 또 더 나아가서는 생산된 HBsAg에 의해서 대장균의 생장이 억제되어 HBsAg의 저생산성을 초래하게 된다. 아주 최근에는 HBs 항원입자가 효모를 사용하여 성공적으로 생산된다는 것이 보고되고 있다[참조 Nature, 298권, 제 347-350면(1982년 7월 22일)]. 이 보고에는 효모에 의한 인터페론이 생산에서 통상적으로 사용되는 알코올 탈수소효소(ADH1) 촉진유전자의 하류에서 HBs 단백질을 대장균-효모셔틀벡터에 접촉시켜서 유전자를 조환하는 방법이 기재되어 있다. 그러나 이 방법에 의하면 HBs 단백질량이 너무 적고 그로 인해서 필요로 하는 HBs 항원으로 대량으로 생산하는데는 만족스럽지 못하였다.
본 발명자드른 HBsAg를 대량으로 생산하는 개량된 방법에 관해서 집중적으로 연구하였다. 그 결과, 효모유전자와 대장균 유전자를 함유하고, 또 포스파라아제 촉진 유전자를 함유하는 효모의 억제성 산성 포스파타아제 유전자가 담겨져 있는 특정한 플라스미드벡터에 HBs 항원 유전자를 조환하고, 이같이 해서 얻은 조환 DNA로 효모를 형질 전환시키고 또 이 전환효모를 배양하여 필요로 하는 HBsAg를 대량으로 생산할 수 있으며 또 이같이 해서 제조된 HBsAg가 인간혈장으로부터 제조된 HBsAg의 특성과 동일한 면역특성을 갖게됨을 알았다.
본 발명의 목적은 HBs 항원유전자를 삽입한 신규 재조합 플라스미드를 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 앞에서 설명한 바와같이 신규 조환 플라스미드로서 효모를 형질 전환시켜서 생산되는 형질 전환 효모를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 HBsAg를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 이같은 또 다른 목적과 장점들은 다음의 설명으로 본 기술분야에 숙달된 사람에게는 명백할 것이다.
본 발명의 HBV 유전자를 삽입한 제조합 플라스미드는 대장균유전자와 효모유전자 양쪽을 함유하며 또 이중 어느쪽 유전자에서도 증식할 수 있는 셔틀벡터를 이용하고, 그리고 산성 포스파타아제의 일부 또는 전부의 구조 유전자나 또는 포스파타아제 구조 유전자의 상류의 일정영역이 호적하게 제거되는 벡터에 담겨진 산성 포스파타아제의 촉진유전자의 하률에서 HBs 항원유전자를 벡터로 조환해서 얻는다. 형질 전환된 효모는 종래의 방법으로 전술한 바와같이 하여서 얻은 HBs 유전자를 함유하는 플라스미드로 효모를 형질 전환시켜서 제조한다. 필요로 하는 HBs 단백질은 형질 전환효모를 적당한 배지에서 호적하게는 산성 포스파타아제 촉진유전자가 억제되지 않는 조건항서 배양하여 생산할 수 있다. 조환 플라스미드, 형질 전환효모 및 이 형질전환효모에 의한 HBsAg의 제법을 보다 상세하게 아래에 설명한다.
(1) HBV 유전자 : 셔틀벡터에 삽입될 HBV 유전자는 일본과 또한 동남아세아 각국에서 흔히 볼 수 있는 그리고 또 대장균으로 무성생식할 수 있는 서브타이프(Subtype)adr의 HBV DNA이다. HBV DNA는 제한효소 Xho I과 BamHI의 인식부위를 각각 1개씩 가지고 있다. 이 단편, 예컨대, Xho I로 소화시켜서 얻는 말단에 Xho I을 가진 단편은 HBs 유전자와 HBc 유전자가 동일방향으로 존재하고 있고, 또 첨부도면 제1도에 표시된 바와같은 구조를 가지고 있다.
제1도에 표시한 바와같이 HBs 코우딩(Coding) 배열은 Xho I로 절단된 5'-말단에서 28번째의 누클레오티드로 부터 개시하여 226개의 아미노산에 상응하는 누클레오티드와 또한 그 하류에 동일방향의 HBs 유전자를 함유하고 있다. HBs 유전자의 이 단편 (3.2kg의 HBV DNA)은 BamHI로 처리하면 HBs 유전자를 함유한 단편(약 1.3kg)과 HBc 유전자를 함유한 단편(약 1.9kg)으로 분활된다. 이 HBs 유전자의 누클레오티드 배열은 본 발명자들에 의해서 결정되고 첨부도면 제2도에 표시된 바와같다(구라파제국과 미국에서 흔히 볼 수 있는 서브타이브 adw의 HBV의 유전자의 DNA배열은 이미 알려져 있다).
HBs 유전자 및 HBc 유전자는 다같이 전연 개재(介在) 배열을 갖지않는다. 제2도에서 상위선은 "S"항원을 결정하는 영역의 누클레오티드 배열을 의미하고 또 제2선은 이것으로 코우드된 아미노산 배열을 의미한다. 그리고 누클레오티드 배열위에 표시한 숫자는 "S"항원의 N-말단으로부터 계산한 아미노산의 수를 의미한다. 하단의 3개의 선드른 각각 ad/yw형(1979년 발행, 자연, 제282권, 제575-579면의 파세크(Pasek)의 수인의 분석), adw형(1979년 발생,자연, 제280권, 제815-819면의 바렌즈에타(Valenzuela)의 수인의 분석) 및 ayw형(1979년 발행, 미국, Proc, Natl, Acad, Sci., 제76권 제 2222-2226면의 챠아네이(Charnay)의 수인의 분석)의 데이터를 의미한다.
HBV DNA는 다음 방법으로 제조된다.
비루스입자(Dane 입자)는 종래의 방법에 의해서 HBc 항원을 가진 사람의 혈액에서 분리한다. HBV DNA(3.200bp)는 통상적으로 이중 고리환상구조를 갖는데 이것의 약 15 내지 50%영역은 단일고리이다. 따라서 단일고리영역을 유전자를 무성생식시키기에 적합한 이중고리로 변하게 하기 위에서 세트터(Sattler) 및 토빈슨(Robinson)의 방법으로 내인성 DNA 중합효소로 처리한다(참조 : 에프. 세트리 및 더블유.에스.토빈슨,비르스학 DNA 분자는 응집끝을 갖는다"1979년 발행).
모든 영역을 이중고리로 복구시킨 후에 DNA를 추출하고 대장균에 의한 무성생식으로 증식하고 이어서 적당한 제한효소로 처리해서 필요로 하는 플라스미드의 제조에 사용되는 단편을 얻는다. HBV DNA는 일본과 기타 동남아세아 국가들에서 흔히 보이는 서프타이프 adr가 호적한다. 그러나 구라파제국과 미국에서는 흔히 볼 수 있는 HBV 서브타이프 adw 및 ayw 라도 좋다.
(2)셔틀벡터 : 본 발명에서 사용되는 셔틀벡터는 효소유전자와 대장균유전자를 다같이 함유하고 또 효소, 예컨데 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces Cerevisiae)의 억제성 산성포스포타아제 유전자가 담겨져 있는 플라스미드벡터이다. 효소유전자는 통상적으로 염색체와 독립해서 효소에서 플라스미드의 증식에 필요한 예컨대 효소의 자율증식에 필요한 DNA 배열("ars 1"이라고 칭한다), 그리고 2㎛ DNA(2μori라 칭함)의 증식에 필요한 DNA 결합배열인 DNA 배열을 함유하며 또 임의로 형질 전환효소의 선택표시 유전자로서 유용한 유전자를 함유한다. 이 선택표식유전자에는 예컨데 로이신 생산유전자 히스티딘 생산유전자, 트립토판 생산유전자, 우라실 생산유전자, 아데닌 생산유전자 또는 기타 유전자가 포함된다. 이것들은 단독이나 물 또는 그 이상을 결합해서 사용할 수 있다. 대장균유전자는 대장균의 세포내에서 플라스미드를 증식하는데 필요한 DNA 배열, 예컨대 Col ET에 플라스미드의 증식 개시영역의 DNA 배열을 함유하고 호적하게도 형질 전환대장균의 선택표식 유전자로서 유용한 유전자를 함유한다. 선택유전자에는 예컨대 암피실린 내성유전자, 카나마이신 내성유전자, 테트라시이클린 내성유전자, 클로람페니클 내성유전자 또는 기타 유전자가 포함하고 이것들은 단독이나 또는 물 또는 그 이상의 결합으로 사용될 수 있다.
보통 사용되는 대장균 DNA는 암피실린 내성유전자 및 테트라시클린 내성유전자를 함유하는 PBR322이다.
본 발명에서 사용되는 셔틀벡터는 효소의 억제성 산성 포스파타아제 촉진유전자가 담겨진 것이 특징이다. 이 산성포스파타아제 촉진유전자는 통상적으로 포스파타아제를 구성하는 60,000 달톤(dalton)(P60)의 폴리팹티드 촉진 유전자이다.
셔틀벡터의 대표적인 예는 ars. 1.2μori 및 효소의 유전자로서 로이신 생산유전자(Leu 2)를 함유하는 효소 DNA를 대장균 플라스미드 PER322로 조화시켜서 본 발명자들에 의해서 제조된다. 이 셔틀벡터를 "PAT 77"라고 칭하고 다음과 같이 제조한다. 억제성 산성 포스파타아제를 구성하는 60,000달톤의 폴리펩티드(P60)의 유전자를 함유하는 약 8,000 누클레오티드 쌍(8kb)의 EcoRI 단편(참조 : 1980년 발행, PNAS, 제77권, 제6541-6545면 및 1982년 발행, PNAS, 제79권, 제2157-2161면)을 알려진 대장균 플라스미드 pBR 322의 EcoRI 부위에 삽입하여 플라스미드를 얻는다. 이것은 출발재료로서 사용된다.
전술한 EcoRI 단편(8kb DNA 단편)은 약 2.8kb의 단편에 pBR322의 암피실린 내성유전자가 있는 약 2.8kb와 약 5.2kb에 분할하는 위치에 제한효소 Sal I의 단일인식 부위를 함유한다.
출발재료는 제한효소 Sal I로 소화되고 또 T4 DNA 리가아제로 제차 폴림처피되어 Sal I부위에서 산성 포스파타아제 유전자 단편 5.2kb 까지 결핍된 플라스미드를 얻는다(전술한 플라스미드는 "pAT 25"라고 칭한다).
전술한 pAT 25는 임피실린 내성유전자와 EcoRI 부위에서 효소산성 포스파타아제 유전자의 Sal I부위까지의 단편(약 2.8kb)을 함유하는 EcoRI 부위에서 pBR322의 Sal I 부위까지의 단편(약 3.7kb)으로 된 플라스미드이다. 여기서 양쪽 단편들은 이것의 각개 대응말단에서 결합한다.
전기한 pAT 25의 EcoRI부위에 효소(ars 1)와 효소의 Trp 1 유전자의 자율증식기에 필요한 DNA 배열을 함유한 EcoRI 단편(1.4kb)을 삽입한다(참조 : 1979년 발행, PNAS, 제76권, 제1035-1039면).
전술한 ars 1-Trp 1 단편은 전술한 Trp 1 유전자 내에 제한효소 Hind III의 단일인식부위를 가지고 있다.
상기 pAT 26의 Hind III 부위에 2μm DNA(2μori)의 증식에 필요한 로이신 생산유전자와 DNA배열을 함유한(토해, 에이.겔리, 피, 비체너, 알.비 : 세균 저어널, 제141권, 제413-416면, 1980년 발행(Tohe, A., Guerry,P.,Wichener, R.B. : J.Bacteriol., 141,413-416, 1980년)을 참조) Hind III단편을 삽입하여 소망의 세틀벡터 pAT 77을 얻는다.
pAT 77 및 다음에 설명하는 전기한 것에서 유도된 pAT 82는 첨부도면 제3도에 표시한 바와 같은 구조를 가지고 있다.
제3도에서 굵은 선의 영역은 대장균플라스미드 pBR 322에서 개시되는 유전자이고 또 주의 영역은 효소의 유전자이다. 보다 상세하게는 pAT 77은 대장균의 유전자로서 pBR 322(Apr) 암피실린 내성유전자를 함유한 EcoRI 부위에서 Sal I 부위까지의 단편과 ars 1, 2μori 및 Ler 2 유전자들의 순서로 그리고 포스파타아제 유전자의 상류를 토해서 pBR322와 결합된 EcoRI 부위에서 Sal I 부위까지의 단편을 포함한다. 여기서 대장균과 효모의 유전자는 EcoRI부위와 Sal I 부위에서 결합한다. 이 pAT 77은 pBR 322유전자의 존재로 인해서 대장균 세포내에서 증식할 수 있으며 또한 ars 1 및 2μori 유전자의 존재로 인해서 효모내에서 증식할 수 있다. 그 위에도 이 플라스미드는 전환선택유전자로서 대장균측에 암피실린 내성유전자(Apr)와 효모측에서는 로이신 생산유전자(Leu 2)를 가지고 있어서 셔틀벡터로서의 만족할만한 특성들을 가지고 있다.
셔틀벡터는 대장균을 사용해서 조환 플라스미드를 제조하는데 요구된다. 그리고 효모가 조환 플라스미드로 전환될 때에는 대장균의 유전자는 필요하지 않으나 이것에서 제거될 수 있다.
셔틀벡터 77의 산성 포스타파아제 촉진유전자 부근의 유전자지도는 첨부도면 제4도에 표시된다. 이 셔틀벡터의 BstEII-Sal I영역의 누클레오리드 배열은 본 발명자들이 결정하며 첨부도면 제5도에 표시된다. 제4도 및 제5도에 표시된 ATG 코든은 산성 포스파타아제의 개시코든이다 보다 상세하게는 이 벡터의 억재성 산성 포스파타아제 유전자 단편(약 2.8kb)은구조유전자의 상류에서 약 2.7kb로부터 구조유전자의 82번째 누클레오티드 쌍(82bp) 까지에 이르는 영역을 가지고 있다.
셔틀벡터 pAT 77는 엑소누클레오제 BAL 31에 의한 처리가 수반되는 제한효소 Sal I에 의한 처리로 개열되는데 이 처리로 제4도 및 제5도에 표시된 산성 포스파타아제의 구조유전자의 일부 또는 전부와 그리고 더 나아가서는 임의로 이것으로 부터의 상류이 여러 영역을 제거한다.
이 제거는 산성 포스파타아제 촉진유전자영역 : TATATAA(Hogness box), 예컨데-100bp 앞까지의 적당한 영역까지 행하여진다. 제거될 영역은 엑소누클레아제에 의한 처리를 위한 조건에 의해서 조절될 수 있으며 또 통상적으로 +1 내지 100bp, 호적하게는 +1 내지 -50bp 범위내에서 행해진다. 제거가 상류의 광범위, 즉 -100bp 이상에서 행하여지면 산성 포스파타아제 촉진유전자를 조절하기가 곤란하게 되고 전환효모세포의 배양에서 소망의 HBsAg의 수율을 저감시키게 된다. 일방으로, 제거가 불충분하게 이루어지는 경우에는 산성 포스파타아제 구조유전자의 일부는 남게되고 HBs 항원및 포스파타아제 팹티드의 잡종이 불리하게 생기는 것이다.
전술한 산성 포스파타아제 구조유전자의 일부나 전부 및 임의로 이것으로 부터이 상류의 어떤 영역을 제거한 후에 합성 또는 천연링커, 예컨데 Sal I 링커 또는 Xho I링커가 이것에 조환되어 환상 플라스미드를 셔틀벡터를 얻는다. 이 셔틀벡터는 종래의 효소, 즉 Sal I이나 Xho I로 처리하면 조환될 부위에서 용이하게 계열된다. 그래서 소망의 유전자와 조환하기 위해서 호적하게 사용된다.
(3) HBs 유전자 발현 플라스미드 구축 : 본 발명 조환 플라스미드, 즉 HBs 유전자와 조환된 플라스미드는 사용된 링커, 예컨데, Sal I 또는 Xho I에 대응하는 제한효소로 상기 세틀벡터를 개열시켜서 제조하고 이어서 이같이 하여 개열된 단편을 기재한 HBV DNA와 조환한다. 이같이 얻은 플라스미드는 대장균으로 증식하고 또 정확한 방향으로 조환되는 소망의 플사스미드만을 제한효소인 Xho I (조립), EcoRI 및 Xho I (조립의 방향)에 의한 소화로 분석해서 선택한다.
(4) 효모의 형질 전환 : 전환될 효모는 플라스미드에 날려진 전환효모의 선택유전자를 보충할 수 있는 효모의 돌연변이 균주, 예컨대 로이신 요구성 균주인 사카로미세스 세레비시아에 AH22[a, leu 2, his 4, Can 1(Cir4)](참조 : 1978년 발행, 힌넨에이.(Hinnen A.)의 수인 저술, Pric. Natl, Acad. Sci., 미국, 제75권, 제2157-2161면)을 함유하고 있다. 대장균을 증식한 후에 조환 플라스미드를 통상의 방법, 예컨대 스페로플라스트로 전화시켜서 얻은 세로와 플라스미드 DNA를 혼합하고 이어서 칼슘으로 처리하여 효소의 돌연변이 균주에 작용시키면 전환이 이루어진다. 소망의 전환효모가 벡터에 날라진 숙주효모의 돌연변이로 보정할 수 있는 유전자의 발현, 예컨대 로이신 생산유전자의 발현에 의거해서 처리한 효모배양으로 선택 및 분리된다.
상기한 로이신 요구성균주, 각종의 다른 돌연변이 균주의 히스티딘 요구성균주, 트립토판 요구성균주, 우라실 요구성균주, 아데닌 요구성균주 또는 그 유사균들이 효모로서 사용될 수 있다. 다른 균주의 일에는 에스.세레비시아에(S.Cerevisiae) SHY3(a,ste-VC9, ura 3, trp 1, leu 2, his 3, ade 1, Can 1)이다.
(5) 전환효모의 배양 및 HBsAg의 생산 : 상기의 얻어진 전환효모는 통상의 방법으로 인산을 함유한 배지에서 배양한다. 그리고 대수발육상의 배양세포를 무기인산 유리배지에 옮기고 이어서 산성 포스파타아제 촉진유전자가 억제되지 않는 조건하에 배양한다. 배양후, 생산된 세포를 통상방법으로 수집하여 용균처리해서 대량의 소망 HBsAg을 함유한 용균세포액을 얻는다.
효모의 종류에 따라서 예컨대, Pho 80돌연변이 균주(참조 : 1981년 발행, 토오, 메이.(Thoe, A.)의 수인 저술, 세균 저어널, 제145권, 제221-232면)을 사용할 때에는 배양을 산성 포스파타아제가
[실시예 1]
(1) HBV DNA의 조제
(i) HBsAg(서브타이프 adr)와 HBsAg에서 양성인 10사람으로 부터 얻은 푸올혈청(700ml)을 20분 동안 5,000r.p.m으로 원심분리하여 비용해물을 제거한다. 이같이 한 용액을 8시간 동안 18,000r.p.m로 4℃에서 원심분리하고 생성된 침전물을 10mM Tris-HCI, 0.1M NaCI 및 1mM EDTA의 10ml의 완충액(pH 7.5)으로 제차 용해시킨다. 이 용액을30%의 당류를 함유한 원신분리관의 정상부에서 첨가해서 4시간 동안 4℃에서 39,000r.p.m로 원심분리한다. 생성된 침전물을 전술한 동일 완충액으로 재차 용해시킨다.
다음의 작업을 용이하게 하기 위해서 완충액을 67mM Tris-HCI (pH 7.5), 80mM NH4CI, 25mM MgCI2, 0.5% NP40(테르지톨(tergitol), 시그마(Sigma 회사제품), 0.1% 2-메르캅토에탄올, 330μMdCTP(디옥시시티딘트리포스페이트), dGTP(디옥시구아노신트리포스페이트) 및 dATP(디옥시아데노신트리포스페이트), 0.5μM α-[32p]dTTP(디옥시티미딘트리포스페이트),의 혼합물(500μ1에서 3시간 동안 37℃로 처리해서 HBV DNA 폴리메타아제에 의하여 반응을 시킨다. 그리고 이 반응혼합물에 동일량의 100mM EDTA 용액을 첨가한다. 상기한 DNA 폴리메타아제 폴리메타아제 반응으로 DNA의 단일고리영역은 전체적 이중고리로 수복되어 [32p]라벨의 재료를 얻는다. 이 재료는30%, 20% 및 10%의 당류의 수용액의 순서대로 중층(重層)시킨 원심분리관이 정상부에 첨가해서 4.5시간 동안 4℃에서 39,000r.p.m으로 원심분리시킨다.
DNA에 강력하게 결합된 단백질을 소화하기 위해서 위에서 얻은 침전물을 1mg/ml의 프로나아제 E(Kaken Kagaku K.K제조) 및 0.2% 황산라우나트륨 수용액의 혼합물(200μl)로 두번 추출하고 이 DNA 함유 추출물을 에테르로 세척해서 페놀 용매를 제거하여 HBV DNA 용액을 얻는다. 이같이 얻은 DNA는 2.5×107cpm/μg의 비방사활성을 가지고 있으며 또 제한효소에 의한 소화에 사용할 수 있다.
(ii) HBV DNA의 클로우닝(Cloning) : 위에서 얻은 이종고리환상 HBV DNA를 벡터로서 λ-파지 Sharon 16A DNA를 벡터로서 알려진 플라스미드 pACYC177을 사용해서 다시 다음과 같이 클로운화한다.
(A) λ-파지 Sharon 16A 숙주 벡터시스템에서의 클로우닝 : HBV DNA(20ng)를 10mM Tris-HCI(pH 7.4), 7mM MgCI2, 100mM NaCI 및 7mM 2- 메르캅토에탄올의 혼합물에서 2시간 동안 37℃로 내인성 누클레아제 Xho I로 처리한다. 생성된 혼합물을 페놀과 그리고 또한 에테르로 추출한다. 그리고 그 수성층에 2배량의 냉각 에탄올을 첨가해서 DNA를 침전시킨다. 혼합물을 1시간 동안 - 70℃에 유지하고 이어서 5분 동안 10,000r.p.m으로 원심분리한다. 이어서 첨가된 DNA를 회수한다. 이같이 분리한 침전물을(5μl)의 10mM Tris-HCI(pH 7.4) 및 1mM EDTA의 혼합물로 용해한다.
전술한 바와 동일한 방법으로 내인성 누클레아제 Xho I에 의한 개열로 얻은 HBV DNA 및 등몰량의 λ-페이지 Sharon 16A DNA (Xho I의 하나의 인식부위를 가진) 18시간 동안 4℃에서 DNA 리가아제[50mM Tris-HCI(pH 7.4), 10mM 디티오르레이롤, 10μg/ml 송아지혈청 암부민, 0.5mM ATP 및 0.5μl 효소조제(T4 리가아제, 다카라 생체의학(Takara biomedicals) 제품, 1-5×103단위/ml)와 반응시킨다. 반응혼합물을 페놀 및 에테르로 추출하고 이어서 위에 기재한 동일방법으로 에탄올에 의한 침전처리를 한다. 이같이 얻은 침전물을 (10μl)의 10mM Tris-HCI(pH 7.4) 및 1mM EDTA의 혼합물로 용해시킨다.
이같이 어니일링 처리된 DNA를 효소학의 방법 "제68권, 제299-309면에 기재한 동일방법으로 유리포장작업으로 처리해서 λ-페이지를 형성시키고 또 다시 이것에서 플라크(plaques)(104)를 L-한천평판(23cm×23cm)에서 지시약으로서 대장균 DP50 SupE (참조 : 브라트너 에프.알.(Blattner, F.R.)의 수인 저술, 과학, 제196권, 제161면, 1977년 발행)를 사용하여 형성시킨다.
이 플라크들을 HBV DNA를 가진 페이지로 부터 형성된 플라크를 선택하기 위해서 시험으로 위에서 조제한 32P라벨을 한 HBV DNA를 사용하여 교배처리를 한다. 이리하여 복수의 소망 파지를 분리시킨다.
(B) 벡터로서 플라스미드 pACY177를 사용한 재클로우닝 : 위의 (A)에서 얻은 HBV DNA를 가진 플라크토 파지 DNA를 1979년 발행의 "효소학의 방법"제68권, 제245-378면에 기재된 동일방법으로 감염될 세균으로서 대장균 DP50-SupF를 사용해서 조재한다.
이같이 얻은 DNA는 2시간 동안 위에서 기재한 바와 동일한 조건하에서 Xho I로 소화시킨다. 그리고 생성된 반응 혼합물을 0.75% 아가로우즈 겔로 전기 이동처리를 해서 HBV DNA(3.2kb)를 분리한다. HBV DNA는 벡터 DNA로부터 분리하기 위해서 DEAE(디에틸아미노에틸셀룰로오스)종이 (Toyo Roshi 제품 일본)에 흡수되고 이어서 1M NaCl 수용액으로 용출되어 양단이 Xho I말단이 된 HBV DNA를 얻는다.
별도로 카나마이신 내성유전자 내에 하나의 Xho I절단 부위를 가진 플라스미드 pACYC177(참조 : 1978년 발행, 창, 에이.시.화, 코헨, 에스.엔(Chang, A.C.Y., Cohen, S.N.)저술, 세균, 저어널, 제134권 제1141-1156면)을 Xho I로 소화하고 전술한 동일방법으로 그 생성물을 페놀추출, 에테르 처리 및 에탄올 침전으로 정제한다.
이같이 얻은 Xho I로 개열된 pACYC177을 전술한 바와 같이 얻은 Xho I-말단 HBV DNA와 분자비 1:5로 혼합한다. 그리고 이 혼합물을 위해 설명한 바와 같이 18시간 T4 DNA 리가아제로 어니일링 처리를 한다.
위와같이 얻은 어니일링 처리된 DNA 조제물(10μl)를 엠.브이 늘가아드(M.V. Norgard) 저술의 "유전자"제3권, 제279면(1978년 발행)에 기재된 방법으로 대장균 x1776의 배양액(참조 : R. III. Curtiss의 수인 저술"조환 DNA eds.의 분자 무성생식" 더블유. 에이. 스코트 및 암.우너(W.A. Scott 및 R.Werner)제99면, 아카데미 프레스(Academie Press)(1977년 발행)을 처리하여 조제되는 대장균액(0.1ml)에 첨가하고 이 혼합물을 잘 혼합하여 25분 동안 0℃에 방치한다.
이 혼합물을 암피실린(20μg/ml), α-비오린(1μg/ml), 다아미노피델산(100μg/ml), 및 티민(20μg/ml)을 함유한 L함천 평판에 도포하여 하룸밤 37℃에서 배양한다.
이같이 된 콜로니들을 카나마이신(20μg/ml)을 함유한 한편 평판과 그리고 암피시린(20μg/ml)을 함유한 한천 평판의 양쪽에 도포한다. 암피실린을 함유한 한천 평판에서만 생장하는 콜로니들을 선택한다.
pACYC177은 암피실린 내성유전자와 카나마이신 내성유전자를 가지고 있으나 카나마이신 내성유전자의 Xho I 부위에서 HBV DNA를 삽입할 때에는 카나마이신 내성을 상실한다. 따라서 선택된 클로니들은 pACYC177-HBV DNA의 조환 DNA를 갖는다. 이같이 얻은 콜로니로부터 플라스미드를 케이. 마즈바라(K.Matsubara)(비롤(virol) 저어널, 제16권, 제479면, 1975년 발행)가 설명한 방법으로 조제한다. 이같이 얻은 플라스미드, 즉 pACYC177-HBV DNA의 조환 DNA(이것을 "pHBV"라고 칭한다)를 위에 설며한 바와 동일한 조건하에 Xho I로 처리해서 전체 HBV DNA 단편(3.2kb)을 얻는다.
그밖에도 Xho I 및 BamHI로 처리될 때에는 HBsAg 유전자를 함유한 단편(약 1.3kb)를 얻는다.
(2) 셔틀벡터 pAM81,82,83 및 84의 조제 : 억제성 산성 포스파타아제를 구성하는 60,000달톤의 폴리펩티드(P60) 유전자를 함유한 약 8,000누클레오티드 쌍(8kb)의 EcoRI 단편(효모 S288C 유전자 은행, 클라아크, 엘. 및 카아본, 제이.(Clarke, L. and J., Cell) 저술, 세포 제9권, 제91-99면, 1976년 발행)을 공지의 대장균 플라스미드 pBR322의 EcoRI 부위에 삽입하여 출발재료로 사용되는 플라스미드를 얻는다.
이 출발재료를 제한효소 Sal I로 소화하고 T4 DNA 리가아제로 재차 어니일링 처리를 하여 Sal I부위에서 산성 포스파타아제 유전자 단편 5.2kb 까지 결핍된 플라스미드 pAT 25를 얻는다(전술한 플라스미드는 암피실린 내성유전자를 함유한 pBR322의 EcoRI 부위에서 Sal I부위까지의 단편(약 3.7b)과 효모의 산성 포스파타아제 유전자의 EcoRI 부위에서 Sal I부위까지의 단편(약 2.8kb)으로 구성된 플라스미드이다. 여기서 두 단편들은 이것의 각개 대응말단에 결합된다.)
상기한 pAT 25의 EcoRI 부위에 플라스미드 YRP 7를 EcoRI로 처리하여 조재하는 ars I 및 Trp 1 유전자를 함유한 EcoRI 단편(1.4kb)을 삽입한다(참조 : 스트루을, 케이.(Struhl, K.)의 수인 저술, Proc. Natl. Acad.Sci. 미국, 제76권, 제1035-1039면, 1979년 발행). 전술한 ars 1-Trp 1 단편은 Trp 1 유전자내에 제한효소 Hind III의 한개의 의식부위를 갖고 있다. 전술한 pAT 26의 Hind III 부위에 플라스미드 pSLE 1를 Hind III으로 처리하여 제조하는 Leu 2 및 2ori를 함유한 Hind III단편을 삽입하여 소망의 셔털 벡터 pAT 77를 얻는다(참조 : 토오, 에이(Tohe, A.)의 수인 저술, 세균 저어널, 제141권, 제413-416면, 1980년 발행).
사카로미세스 세레비사아에(즉, 사카로미세스 세레비시아에 AH 22/pAT 77)에 나르어진 pAT 77은 "FERM BP-324"라는 부타베스트 협약하에 일본국, 산업과학기술능인 발효연구소에 보관되어 있다.
이 같이 얻은 pAT 77(1μg)은 Sal I로 개열되고 이어서 30초 내지 1분 동안 20mM Tris-HC1 (pH 8.2), 12mM CaCl2, 12mM MgCl2, o.2M NaCl 및 1mM EDTA의 용액에서 엑소누클레아제 BAL 31(0.1U)로 처리한다. 반응혼합물을 위에서 설명한 동일방법으로 페놀추출 및 에탄올 침전처리를 한다. 생성된 침전물을 12시간 동안 위에서 설명한 동일 조건하에 Xho I 링커(1pmol)의 수인 저술 "조환 DNA eds의 분자 클로우닝", 더블유 에이. 스코트 및 암.우너 제99면, 아카데미 프레스(1977년 발행)에 설명된 방법으로 상기의 반응혼합물로 처리하여 암피실린 내성전환제를 얻는다. 생성된 전환 체콜로니로 부터 플라스미드 DNA를 K.Matsubara가 설명한 방법으로 제조한다(J.Virol., 제16권, 제479면, 1975년 발행).
막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법(참조 : Maxam A. & Gillbert, W., Pro. N.A.S., 제74권, 제560-564면)에 의거해서 전술한 바와 같이 해서 된 DNA들이 누클레오티드 결합서열을 결정한다. 그리고 다시 BAL 31로 제거된 산성 포스파타아제 유전자의 영역을 결정한다. 이들 DNA중에서 포스파타아제의 전체구조 유전자가 완전히 결핍된 소망의 플라스미드 pAM 81, pAM 82, pAM 83 및 pAM 84를 선택 및 분리한다.
포스파타아제 구조 유전자의 생성물 P60의 최초의 아미노산(메티오닌)을 부호화하는 코든 ATG이 "A"를 "+1"이라고 하고 다음의 영역들, 즉 pAM=÷2 까지, pAM 82 ; -33까지, pAM : -50까지 및 pAM 84 : -51까지 이들 셔틀벡터에서 제거된다.
사카로미세스 세레비시아에(즉, 사카로미세스 세레비시아에 AH 22/pAM 81, AH/ 22/ pAM 82, AH 22/ pAM 83 및 AH 22/pAM 84, 각각에 나르어진 pAM 81, pAM 82, pAM 83 및 pAM 84는 각개 "FERM BP-313", "FERM BP-325", FERM BP-327" 및 FERM BP-326"에 관한 Budapest 협정하에 일본국의 산업과학기술기능인 발효연구소에 보관되어 있다.
(3) HBsAg 유전자 엑제 플라스미드의 조제 :
(i) 전체 HBV DNA를 삽입한 플라스미드의 조제 : Xho I로 플라스미드 pHBV(pACYC177-HBV DNA)를 처리하여서 얻은 HBV DNA를 Xho I개열 셔틀벡터, pAM 81, pAM 82, pAM 83 및 pAM 84로 분자비 5:1로 T4 DNA 리가아제로 위에서 설명한 동일 조건하에 어니일링 처리하여 조환한다.
대장균 x1776은 반응혼합물에 의해서 전환되고 또 플라스미드 DNA는 암피실린 내성전환체에서 앞에서 설명한 동일방법으로 조제한다.
이같이 조재한 DNA는 각종 제한효소, 즉 Xho I, Xba I 및 Hind III으로 분석되어서 벡터에의 HBV DNA의 삽입과 그 방향이 결정된다.
이같이 얻은 HBsAg 유전자 억제 플라스미드는 포스파타아제 촉진유전자의 하류에 HBs 유전자, HBc를 이 순서대로 가지고 있고, 셔틀벡터, pAM81, pAM 82, pAM 83 및 pAM 84에 의해서 조환된 플라스미드들은 각각 pAH 201 pAH 203, pAH 205 및 pAH 207로 칭해진다.
(ii) HBsAg 유전자 단편을 삽입한 플라스미드의 조제 : BamHI로 플라스미드 pHBV를 개열하여서 조제한 HBsAg 유전자 단편(3g)을 200μMαTTP, αCTP, αTTP 및 μMαGTP를 함유한 67mM TrIS-HCl(pH 8.6), 6.7mM MgCl2, 10mM 2-메르캅토에탄올, 6.7mM EDTA 및 16.7mM (NH4)SO4의 용액(100μl)에서 T4 DNA 폴리메라아제(0.2U)로 BamHI절단 말단을 메우기 위해서 30분 동안 처리한다. 반응혼합물을 위에서 설명한 바와 같은 페놀추출 및 에탄올 침전처리를 한다.
생성된 첨전물을 앞에서 동일한 조건하에 T4 DNA 리가아제를 사용해서 분자비 1:10으로 Xho I링커로 결합반응시킨다. 페놀 추출과 에탄올 침전후에 생성된 플라스미드를 Xho I로 처리해서 양단이 Xho I 절단 말단이 된 HBsAg 유전자 단편(약 1.3kb)을 얻는다. 이같이 얻은 단편은 T4 DNA 리가아제를 사용하여 분자비 5:1로 Xho I로 계열된 셔틀벡터 PAM 82로 어니일링 처리하고 또 대장균 X1766을 위에서 얻은 반응혼합물로 위에 설명한 동일방법으로 전환시켜서 플라스미드 DNA를 얻는다. 이같이 얻은 플라스미드는 벡터 PAM 82의 포스파타아제 촉진유전자의 하류에서 정확한 방향으로 HBsAg를 삽ㄹ입하고 이 플라스미드를 PAS101이라고 칭한다.
(4) 형질 전환효모의 조제 : 출발 효소는 "FERM BP-312"에 관한 부다페스트 협정하의 일본국의 산업 과학기술기능인 발효연구소에 보관되어 있고 1983년 6월 1일 한국과학기술원에 고유번호 KCTC1556으로 보관되어 있는 사카로미세스 세레비시아에 AH 22[a, leu 2, his 4 can 1(cir+)]이다.
이 출발효소를 2% 폴리펩톤, 1% 효소추출물 및 2% 글루코오스로 된 YPD 배지(100ml)에 접종하고 이 혼합물을 하룻밤 30℃로 배양한 후에 세포를 원심분리로 회수한다. 이같이 수집한 세포를 멸균수(20ml)로 세척하고 1.2M 소르비톨 및 100μg/ml 지몰리아제-60,000(일본, 세이가가구 고오교오 가부시기 가이샤 제품)의 용액(5ml)에 현탁시키며 또 이 현택을 30분 동안 30℃에 방치하여 스페로플 라스트를 얻는다. 이같이 제호나 스페로플라스트를 1.2M 소르비톨 용액으로 세번 세척하고 이어서 0.6ml의 2M 소르비톨, 10mM CaCl2및 10mM Tris-HCl(pH 7.5)의 용액(0.6ml)에 현탁시킨다. 이같이 제조한 현탁액을 60μl량으로 작은 시험관에 나누어 넣는다. 이 현탁액을 저술한 (3)에서 제조한 조환 플라스미드 pAH230(30μl)의 용액을 첨가한다. 잘 혼합한 후에 이것에 0.1M CaCl2(3μl)를 최종농도 10mM CaCl2가 되게 첨가하고 이 혼합물을 5 내지 10분 동안 실온에 방치한다.
생성된 혼합물에 각각 1ml의 20% 폴리에틸렌그리콜 4,000 10mM CaCl2및 10mM Tris-HCl(pH 7.5)을 첨가하며 이 혼합물을 약 20분 동안 실온에 방치한다. 생성된 혼합물(각각 0.2ml)을 45℃ 항온에 보관된 22% 소르비톨, 2% 글루코오스, 0.7% 효모질소 염기아미노산, 2% YPD, 20μg/ml 히스티딘 및 3% 한천으로 된 배지(10ml)에 첨가한다. 서서히 혼합한 후에 혼합물을 미리 준비한 0.7% 효모질소 염기아미노산, 2% 글로코오스, 20μg/ml 히스티딘 및 2% 한천으로 된 1.2M 소르비톨을 함유한 최소배지 평판 위에 층이 되게 첨가하여 이에 고화시킨다. 이 평판을 30℃에서 배양하여 뉴우신비요구성 효모의 콜로니를 얻는다. 이 콜로니를 히스트딘(20μg/ml)을 보충한 버크 홀더(Burk Holder) 최소배지(참조 : 토오, 에이. 외 수인 저술 : : 세균 저어널, 제113권, 제727-738면, 1973년 발행)에서 배양하여 소망의 전환효모 사카로미세스 세레비시아에 pAH 203을 얻는다.
위에서 설명한 동일방법으로 조환 플라스미드를 제외하고 pAS 101, pAH 201 및 pAH 205를 조환 pAH 203 대신에 사용하여 다음의 전환효소들을 제조한다 :
사카로미세스 세레비시아에 pAS 101
사카로미세스 세레비시아에 pAS 201
사카로미세스 세레비시아에 pAS 205
(5) 전환효모에 의한 HBsAg의 제조 : 위의 (4)에서 얻은 각개 전환효모의 콜로니를 히스티딘(20μg/ml)을 보충한 Bruk Holder 최소배지의 한천 평판에 도포해서 30℃로 배양하여 콜로니를 형성시킨다(모이신비요구성 전환체를 확인하기 위하여).
생성된 세포를 콜로니에서 분리하고 히스티딘(20μg/ml)을 보충한 버크 홀더 최소배지에 30℃로 접종한다. 약 24시간 후에 대수발유기에 있는 세포를 원심분리로 수집하고 인산을 함유하지 않은 최소배지(10ml)(이것은 20 μg/ml 히스티딘을 보충하는 것이 수반되는 버크 홀더 최소배지 중의 KH2PO4를 KCl로 치환하여서 제조한 것)에 현탁하여 세포농도가 약 4×106세포/ml가 되게 한다.
약 24시간 동안 30℃에서 배양한 후에 배양액을 4,000r.p.m으로 원심분리하여 세포를 수집한다. 이같이 분리한 세포를 1.2M 소르비톨, 50mM 인산완충액(pH 7.2), 14mM 2-메르캅토에탄올 및 100μg/ml 지몰리아제-60,000(일본, 세이 가가구 고오교오 가부시기 가이샤 제품)의 용액에 현탁시킨다. 그리고 이 혼합물을 서서히 30분 동안 30℃에서 진탕하여 스페로플라스트를 얻는다. 이 스페로 플라스트를 원심분리로 수집하여 1ml의 0.1% 트리톤 X-100 및 50mM 인산완충액(pH 7.2)의 용액(1ml)에 잘 현탁시키고 강렬하게 교반하여서 10분 동안 7,000r.p.m으로 원심분리하고 생성된 효모용균액으로서 채취한다.
이같이 얻은 용균액(20μl)을 HBs 항원 RIA kit(미국 abbott 제품)을 사용해서 그 HBs 항원성을 시험한다. 그 결과를 제1표에 표시한다.
[표 1]
Figure kpo00001
*) 이 벡터는 HBV 또는 HBs 유전자가 없으며 음성대조로 사용된다. RIA Kit의 음서대조는 310cpm의 활동성을 가지며, 또 이것의 양성 대조는 17,500cpm의 활동성을 가지고 있다.
효모용균액(S. 세레비시아에 AH 22/ pAH 203에서 상기와 같이 얻은 것)에 관해서 항원의 반응성 및 항원량을 전술한 바와 같은 HBsAg를 검출하기 위해서 kit를 사용하여 평행성 검정법에 따라서 추정한다(참조 : 핀니, 디.제이. (Finnet, D.J.,) 1964년 발행 생물검정의 통계적 방법, 제2판, 그리핀(Griffin)출판사, 런던), 여기서 인간 혈청에서 얻은 정제 HBsAg를 대조항원으로 사용한다. 결과는 첨부도면 제6도에 표시한다. 제6도에서 명백히 표시된 바와 같이 전환 쥐세포의 배양에서의 항원량은 2μg/ml라는 비교적 높은 것이다. 그 위에 대조항원의 평행성에 근거하여도 본 발명으로 생산된 HBsAg가 인간혈장에 존재하는 반응성(항원성, 면역유전성 등등)에 유사한 반응성이 있다.
위와 같이 얻은 용균액(각각 0.4ml)을 기니아 돼지(암컷, 300-380g 체중, 10마리)의 피하에 1주에 1회로 3주간 접종하였고 혈장의 항체를 항 HBs항체를 검출하기 위해서 kit로 측정하였다.
그 결과 모든 동물에서 항 HBs 항체가 관찰되었다. 그래서 본 발명의 숙주 벡터 및 이것의 HBs 항원의 제조가 B형간염 유발물질(Dane 입자)에 대항하는 항원제조에 극히 유용하고 또 본 발명으로 제조된 HBs 항원이 HBV 왁찐 및 진단시약에 제조에 유용한 것이다.

Claims (2)

  1. 효모 유전자가, 로이신 생산유전자, 히스티딘 생산유전자, 트립토판 생산유전자, 우라실 생산유전자 및 아데닌 생산유전자로 된 군에서 선택한 전환효모의 표식유전자(marker gene)와 ars 1 및 2μori를 함유한 및 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyes cenreviciae) 효모유전자와 : 대장균 플라스미드 유전자가 약 3.7kb 이고, 암피실린 내성유전자, 카나마이신 내성유전자, 테트라사이클린 내성유전자 및 클로람페니콜 내성유전자로 된 군에서 선택한 전환 대장균의 표식유전자를 함유한 대장균 플라스미드 pBR 322 유전자를 함유하며 : 효모의 억제성 산성 포스파타아제 유전자의 발현 조절영역을 보유하고 이 조절영역은 포스파타아제를 구성하는 60,000달톤의 폴리펩티드의 유전자로서, 82bp인 포스파타아제 구조유전자의 일부나 전부 또는 상류 +1(ATG) 및 내지 -100bp 부위를 제거하여, 포스파타아제 프로모터조정(control) 하에 B형 간염 비루스 유전자를 조합하고, 1.3kb의 단편으로 이루어진 재조합 플라스미드를 형질 전환시킨 효모를 배양하고, 형질전환 효모의 발현 유전자 생성물을 수집하고, 생성물로부터 목적하는 단백질을 회수함을 특징으로 하는 B형 간염 비루스 표면항원을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 포스파타아제 구조 유전자 상류의 제거되는 영역이 +1 내지 -50bp부위인 B형 간염 비루스 표면항원을 제조하는 방법.
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