JPS61139391A - 単純ヘルペスウィルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミドおよび形質転換酵母 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産寒紐１Ｖけ１ 本発明は、単純ヘルペスウィルス感染症の予防用ワクチ
ンの製造に有用な単純ヘルペスウィルス蛋白質の生産に
際して遺伝子工学技術を応用することにより所望の蛋白
質を高純度に生産させることを目的とするものであって
、単純ヘルペスワイルス遺伝子を組込んだ組換えプラス
ミド、それを用いて形質転換を行った酵母、およびその
形質転換酵母を用いた単純ヘルペスウィルス蛋白質の生
産方法に関する。

さらに詳しくは、大腸菌および酵母の両方で増殖しうる
、いわゆるシャトルベクターを用い、そのベクターに担
われた抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調ｎ頒域（以
下、酸性ホスファターゼプロモーターまたは酸性ホスフ
ァターゼ遺伝子という）の下流に、単純ヘルペスウィル
ス（以下、Ｈ８■と略す）の遺伝子、ことにＨ３Ｖ　ｇ
Ｂ遺伝子を組込んだ組換えプラスミドを得、これを酵母
に与えて形質転換を起こさせて形質転換酵母とし、この
酵母を通常の培養条件または酸性ホスファターゼプロモ
ーターが抑制されない条件下に培養してＨ８Ｖ蛋白質、
とくにＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ膜蛋白質ｇＢを高純度に大量生産
させる方法に関する。

技術的背景と粒氷扶に 最近、先進国においてはｌｌ５Ｖに対する抗体保有人口
が減少してきており、そのような国では、性器ヘルペス
、新生児ヘルペス、ヘルペス脳炎すどのＨ３Ｖ患染症が
大きな問題となりつつある。

このようなＨ３Ｖ感染相、のｎ）ｊ　ａｌｌにはワクチ
ンが有効であり、すでに弱毒化Ｈ６Ｖからなる弱毒性ワ
クチンやＦ（ＳＶＤＮＡを含む不活性ワクチンが提案さ
れている。しかしながら、ｌｌ５Ｖには潜伏感染や発癌
性の危険があることが知られており、従来の弱毒化ワク
チンや不活性ワクチンではかがる副作用の危険が残り実
用上問題がある。

一方、Ｈ３Ｖが細胞に感染すると数種の糖蛋白質（ｇＢ
、ｇＣ，ｇＤ、ＨＥなど、なお、従来のｇＡ、ｇＢ　の
称呼は１９８３年１ｎＬｐｒｎａＬｉｏｎａｌ　Ｈｅｒ
ｐｅｓＶｉｒｕｓ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　（オックス７　
ｔ　−１′、英国）にてｇＢと統一された）のり）ｒＩ
ｌ、、され、二１１らの糖蛋白質がＨ３Ｖの感染防御抗
原として重要なことが明らかにされるとともに、これら
糖蛋白質を成分とするいわゆるコンポーネントワクチン
（二ついでの研究が行なわれている６例えば、キャベル
らはＨ３Ｖ感染細胞またはウィルス粒子より抽出して得
られる糖蛋白質が感染防御抗原として有効であることを
報告している［Ｃａｐｐｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｒｃ
ｈ。

Ｖｉｒｏｌ、　、７３．６１（１９８２）］、　Ｉ、か
しなが呟かかるＨ３Ｖ感染細胞やウィルス粒子から抽出
した糖蛋白質からなるコンポーネントワクチンでは、宿
主細胞の多くの蛋白質を含んでいるため、それら不要な
蛋白質に起因する副作用が問題である。

したがって、諺１イ乍用のないコンポーネントワクチン
を得るためには、高度に精製された糖蛋白質を用いる必
要がある。このような観点から、本発明者らはＨ３Ｖの
糖蛋白質の１種であるｇＢに着目し、それを高度に精製
し、マウスでの実験でその有効性を確認している［城野
、細胞工学、１．１２０（１９８４）］。

ところで、このような糖蛋白質ｇＢを得るには培養細胞
にウィルスをＪｔ傾し、それｔ−培養することによって
産生させろ方法が採られるが、かかる方法では、感染性
の因子を扱うためその操作が困難であり、工程らきわめ
て煩雑となろうえ、発癌遺伝子を担うＤＮＡを完全に除
去したことを証明することは不可能に近く、結局、かが
る天然の糖蛋白質ｇＢを用いて実用性のある安全なコン
ポーネントワクチンを製造することはきわめて困難であ
る。

上記のような事情のらとに、本発明者らは、該ｇＢの遺
伝子を単離し、それを酵母で発現することができれば、
発癌遺伝子を含まない安全なワクチンを得ることができ
ると考え、鋭、ｆｊｌｌ究を重ねた結果、所望のｇＤ遺
伝子を１１離し、酵ｌｆｔの遺伝子と大腸菌の遺伝子と
を含み、かつＭＩＪの抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子
を担った特定のプラスミドベクターに、該ホスファター
ゼプロモーターの制御下に、該Ｈ３Ｖ遺伝子を組込んで
新しい組換えＤＮＡを調製し、それによって酵母を形質
転換させ、かかる形質転換酵母を培養することにより所
望のＨ９Ｖ蛋白質（すなわちＨＳＶ　ｇＢ）を産生させ
ることに成功し、すでに特許出願した（特願昭５９−１
５１７６６号を参照）。

３堡ｎ１カ 本発明者らは、上記Ｈ３Ｖ　ｇＢ遺伝子岨込みプラスミ
ドについて研究を重ねた結果、制御酵素Ｓａｃ　　Ｉで
処理して得られるｉＢ遺伝子の尾部領域な欠失Ｆせな、
全ｇＢ遺伝子の約９割に相当する遺伝子を上記抑制性酸
性ホスファターゼ遺伝子を担ったプラスミドベクターの
５ａｅｌｌｔｌｌ裂部位に同様にして岨込んだ組換えプ
ラスミＶ’ｅ１４ｕＩ、、それにより酵母を形質転換さ
せたところ、該形質転換酵母の培養により、ＨＳＶ　ｇ
Ｂ蛋白質がキメラ蛋白質として発現され、該キメラ蛋白
質がｇＢ活性を有し、単純ヘルペスウィルスワクチンな
どに用い得ることを知り、本発明を完成するに至った。

ｔなわ九、本発明は、尾部領域を欠失したＨＳＶｇＢ遺
伝子を組込んだ新規な組換えプラスミド、それによる形
質転換酵母および該酵母によるＨ６ｖｇＢの生産方法を
提供するものである。

本発明の組換えプラスミドは、大腸菌および酵母の両方
の遺伝子を備え、それらのいすＫでも増殖しうるシャト
ルベクターを用い、そのベクターに担われた酸性ホスフ
ァターゼプロモーターの下流において、酸性ホス７Ｔタ
ーゼ閘造遺（１、子の一部または全部もしくはさらにそ
の−１−流の一定部位まで除去したのへに、尾部領域を
欠失したＨ３ＶｇＢ遺伝子をを組込んで得られる。この
ようにして得ら八るＨ８Ｖ８Ｖ遺伝子プラスミドを常法
により酵母に作用させて形質転換を起こさせることによ
り、所望の形質転換酵母が得られる。この形質転換酵母
を、好ましくは酸性ホスファターゼプロモーターが抑制
されない条件下に培養することにより、所望のＨ８Ｖキ
メラ蛋白質が安定に量産される。　以下に、本発明の組
換えＤ　Ｎ　Ａ、形質転換酵母およびそれによるｌｌ５
Ｖキメラ蛋白質の生産についてさらに詳細に説明する。

春 （１）Ｈ８ＶｇＢ遺伝子含有７ラグメントのクローニン
グと塩基配列 ＨＳＶ（Ｋ２Ｓ株）のｇＢ遺伝子は、ブチクらにより、
ウィルスＤＮＡ上の位！！（０，３４８〜０゜３６６マ
ツプユニツト）とその塩基配列が決定されている（Ｄａ
ｖｉｄ　Ｊ、　　Ｂｊｉｋ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ。

上主ユ、３０１〜３１４（１９８４＞を参照）。

本発明で用いられるシャトルベクターに岨込むｈｒ＞の
Ｈ９Ｖ　ｇＢＩＬ伝子は、ＨＳＶＤＮＡを制御酵素Ｂ＋
ｎＨＩで処理して切出される約８Ｋｂ（０゜３４５〜０
．３９９マツプエニー／））の７ラグメン）（Ｂｉ論Ｈ
１−Ｇ７ラグメントという）中に存在する。

ＨＳＶ　ｇＢ遺伝子含有７ラグメントの１ｌｌｉ！は、
下記のように、ＨＳＶＤＮＡを制御酵素Ｂａ８）ＬＩで
切断して得られるＢａｍＨＩ−Ｇ７ラグメントをクロー
ン化して行なわれる。

Ｖ　ｅｒｏ繍胞（７７リカミドリザル腎細ｋｉ）で増殖
させたＨＳＶからウィルスＤＮＡを分離し、このウィル
スＤＮＡを制御酵素ＢａｍＨＩで切断し、７がロース電
×泳動によりＢａ醜ＨＥ−Ｇフラグメントを分離、抽出
する。このＢ−ａ＋ａＨＩ　−Ｇ　７ラグメントを、あ
らかじめｎａｍｌＩＩ処理した大腸ＩＷプラスミドＤＢ
Ｒ３２２とＴ４す〃−ゼにより結合反応させる。この反
応液にて大腸菌χ１７７６を形質転換させ、その形質転
換体のうち、アンピシリン耐性（Ａｐｒ）でかつテトラ
サイクリン感受性（Ｔａｓ）の菌を選択、培養すること
により、この菌体からＢａｍＨＩ−Ｇ７ラグメントを倉
むプラスミドルｃを得る。このプラスミドＩ）には第１
ＵｉｉＪに示す構造を有する。

次に、このプラスミドｐｃを材料として、ｇＢ遺伝子を
含む５ｓａＩ−９ａｅｌ領域（約３　、３１ｔｂ）の塩
基配列をジデオキシ法（蛋白質・核酸・酵素。

Ｖｏｌ、２９．Ｎｏ、４．２９４−３０６（１９８４）
を参照）により決定する。つまり、第２図に示すように
、５ｅａｌ−６ｅａｌ断片を各種制御酵素により小断片
に分断し、各断片（−一部）を各々塩基配列決定用Ｍ１
３ベクター（７アルマシ７・ツヤパン−ＫＫ）に挿入し
、シーフェンスを行なう。

その結果、５−ｍｌ−８ａｃｌ領域には、第３図（Ａ）
〜（Ｅ）に示すように、２７１２１＋ｐのオーブンリー
ディングフレーム（ＡＴＧからＴＧＡ）が存在し、７ミ
／酸９０３個をツーＶしている二とが判る。この塩基配
列は、前記ブチクらの塩基配列と比較すると、６個所°
の塩基が異なり、アミノ酸レベルでは２個所が異なって
いる。塩基配列の結果から、ｇＢ遺伝子の尾部領域には
塩基性アミノ酸が局在していることが判る。そこで、ｇ
Ｂ遺伝子を酵母で発現させろために、この尾部領域を除
いた領域を酵母内発現用プロモーター（酸性水スフアタ
ーゼプロモーター）下流ｌこ結合するようにデザインす
る。

すなわち、上記プラスミドρＧを制御酵素５ａｃＩで処
理して尾部領域を除いた２、７ｋｂの７ラグメント（Ｓ
ａｃＩ７ラグメントという）を得ろ、このものはｇＢ遺
伝子約９割を含み、７ミ／酸８１６個をコードする。こ
れを後記Ｈ３ＶｇＢ遺伝子発現プラスミドの構築に用い
る。

（２）　シャトルベクタ一 本発明で用いられるシャトルベクターは、酵母の遺伝子
と大腸菌の遺伝子とを含み、かつ酵母の抑制性酸性ホス
ファターゼ遺伝ｒ・を担ったプラスミドベクターである
。

この酵母の遺伝子としては、一般に、プラスミドが酵母
中で染色体と独立して増殖するのに必要なＤＮＡ配列、
例えば酵母の自律増殖に必要なＤＮＡ配列（ａ’ｒｓ　
１　）と２μ輪ＤＮＡの複製に必要なＤＮＡ配列（２μ
ｏ「１）があり、所望により、さらに形質転換酵母の選
択マーカーとなる遺伝子が含まれる。この選択マーカー
としては、ロイシン産生遺伝子、ヒスチジン産生遺伝子
、トリプトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝子、ア
デニン産生遺伝子などが含まれる、これらの１種または
２種以上が用いられる。

大腸画側の遺伝子としては大腸菌体内においてプラスミ
ドが増殖するために必要なｌ）　Ｎ　Ａ配列、例えばＣ
ｏ１ＥＩ系のプラスミドの撲製起、弘のＤＮＡ配列を有
し、好ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーと
なる遺伝子を含む、この選択マーカーの遺伝子としては
アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テ
トラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性
遺伝子などが挙げられ、これらの遺伝子の１種または２
種以上が用いられる。このような大１６１１　Ｄ　Ｎ　
Ａとジチアンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐
性遺伝子を有するｐＢＲ３２２が一般に汎用されている
。

本発明で用いろシャトルベクターは酵母の抑制性酸性ホ
スファターゼプロモーターを担っていることがＩ徴であ
り、この酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスフ
ァターゼを構成する６０゜０００ダルトンのポリペプチ
ド（ｐ６０）のプロモーターである。

このようなシャトルベクターの代表的な例は、特開昭５
９−３１７９９号に開示されている。酵母側の遺伝子と
してａｒｓ　１．２μｏｒｉ　およびロイシン耐性遺伝
子（Ｌｅｕ２）を有する酵母ＤＮＡと大腸菌プラスミド
、ＢＲ３２２とを組合せたシャトルベクターｐＡＴ７７
から、その酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部または
全部と、さらに上流の一１００ｂ９の前までの適当な部
位まで１通常、＋１〜−ｔｏｏｂｐ、好ましくは＋１〜
−５０ｂｐまで除去したプラスミド、例んぼ一３３ｂμ
まで除去したシャトルベクターＩ＋　Ａ　Ｍ　＋３２で
ある。

このｐＡＭ８２は酸性ホスファターゼプロモーター下流
にＸｈｏｆ部位が存在してす（す、この部位に、本発明
のＨ３ＶｇＲｉｔ伝子（Ｓａｃ　Ｉ　７ラグメン）：２
．７ｋｂ）を挿入するために、このｐＡＭ８２を制御酵
′ＪｋＸｈｏｌで切断し、Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ反応
にて平滑末１（ｆｌｕｓｈ　ｃｎｄ）に変換し、その部
位に５ａｃＩリンカ−を結合し、１１環状化して、第４
図に示すようなＩ１ｇＩ造を有ｒるブラスミＶｐＡＭ８
２（Ｓａｃ）とする。

このプラスミドａＡＭ８２（Ｓａｃ）は酸性ホスファタ
ーゼプロモーターの制御下に外米遺伝子を純粋な形で発
現させ得るシャトルベクターで、制御酵素５ａｃＩで処
理することにより、容易にその組込み部位を開裂させる
ことができ、５ａｃＴ部位を持つＤＮＡ７ラグノントを
その個所に挿入できる。

（釦　Ｈ３Ｖ　ｇＢ遺伝子発現プラスミＦの構築本発明
の組換えプラスミド、すなわち尾部領域を除いたＨ３Ｖ
遺伝子を組込んだプラスミドの調製（ズ、まず前記シャ
トルベクターｐＡＭ　３２　（Ｓａｃ）を制御酵素５ａ
ｃｌで処理して開裂させ、これに前記Ｈ９Ｖ　ｇＢ遺伝
子（ＳａｃＩ７ラグメント２　、７　ｋｂ）を作用させ
て連結させる。こｈを大腸菌にて増幅し、第５図に示す
構造の組換えプラスミドｐＡＭＧＢＩを得る。

このプラスミドでは、酸性ホスファターゼプロモーター
下流にｇＢ遺伝子が結合し、七のｇＢ遺伝子にはアミノ
酸８１６個がフードされ、そのあとに同じ７レームでベ
クター側の塩基配列を利用して、さらに４個のアミノ酸
がニーＶされたのち、ＴＧＡでその７レームは停止し、
合計８２０個のアミノ酸がコードされることになる（第
６図を参照）。

（４１！母の形質転換 形質転換されるべき酵母としては、プラスミＶに担われ
た形質転換酵母の選択マーカー遺伝子によって相補され
る変異を持った変異株、例史ぼロイシン要求性変異株で
あるサツカロミセス・セレビシ！　（Ｓａｃｃｈａｒｏ
Ｂｃｅｓ　ｃｐｒｅｖｉ引ａＰ）　Ａ　）＋　２２また
はＡＨ２２ｐｈｏ８０　（ａ　ｌｅｕ　２　ｈｉｓ４　
Ｃａｎ１゜Ｃｌ２）を用いる。上記組換えプラスミドを
大腸菌にて増殖させたのち、該＃は変異株に常法により
作用させ、例えばス７ヱロブラスト化したのも、カルシ
ウム処理した菌体とプラスミドＤＮＡを混合して形質転
換を起こさせる。この上うに処理された酵母をベクター
上に担われている宿主酵母の変異を相補する遺伝子、例
えばロイシン産生遺伝子の発現を指標として形質転換酵
母を選択し、分離する。

なお、酵母としてはロイシン要求性変異株のほかに、ヒ
スチノン要求′Ｆ１′変異株、トリプトファン要求性変
異株、ウラシル要求性変異株、７ゲニン要求性変異株な
どが挙げられる。

（５）形質転１’ＡＨＰＪ（ｎｌＱｌｌ封Ｊ：　ヒｔｌ
　Ｓ　Ｖ　ｇＢ）生産 上記の方法で得られた形質転換酵母をリン酸を含む培地
にて通常の培養条件に前培養し、対数増殖化にある菌体
をリン酸を含まない培地に移しかえて酸性ホスファター
ゼプロモーターが抑制されない条件下に培養する。＠養
後、常法により集菌し、溶菌処理し、所望のＨ３Ｖキメ
ラ蛋白質を多量に含む溶菌液を得る。

なお、用いる酵母の種類により、例えばｐｈｏ　８０変
異株を用いた場合には、酸性ホスファターゼプロモータ
ーを抑制しない条件をとくに採用する必要はなく、該形
質転換酵母を直接培養して所望のＨ３Ｖキメラ蛋白質を
多量に産生させることができる。

上記培養によって得られるキメラ蛋白質を通常の蛋白質
精製法により精製する０例えば、抗ｇＢ抗体を結合した
ゲルを充填したカラムに該ｇＢ含有抽出液を通し、３Ｍ
ＫＳＣＮで溶出してキメラ蛋白質を単離する。

上記の方法で得らｈるＨ３Ｖキメラ蛋白質はＨ８ｖ感染
細胞から得られる天然ｇＢと免疫学的に全く同一であり
、ＨＳ　Ｖワクチンまたは診断用試薬として利用し得る
。

つぎに実施例を挙げて本発明の組換えプラスミド、形質
転換酵母、お上ＶｌｌｓＶキメラ蛋白質の生産について
さらに具体的に説明する。

実施例 （１）　ＨＳＶ　ｇＢｉｌｆ７’：／含イ１１１Ｎ　パ
ノ９　ａ−ニングと塩基配列 （ｉ）ＨＳＶ−ＩＤＮＡの＋ｌＩ％！ Ｖｅｒｏ細胞（７７リカミドリザル腎細胞）（約５Ｘ　
１８”　ｃｅｌｌｓ）に単純ヘルヘ又ウィルスｌＩ！Ｊ
（）（ＳＶ−１）ｆＫＯ８株）を０．５−　Ｉ　Ｐ　Ｆ
　ＩＪ／ｃｐｌ　ｌの量で感染させ、３７゛Ｃで２０〜
２４時間培養して、細胞変性が充分に起きた時点で２８
，０００ｒｐ−にて１時間遠心して感染細胞と上清を分
離し・で、感染細胞のベレット（２〜３噛Ｃ）を得る。

二九をリン酸緩衝液−生理食塩液（ｐＨ７，２）（以下
、ＰＢＳと略記する）　６　、　Ｏｍ　ｅ　ｌ：懸濁し
、この懸濁液を超音波処Ｅｌｊ（９Ｋ　Ｈｚ、２０　＋
１　Ｗ、５分間処理）または凍結融解（−５０℃（７セ
トンーｒライアイス）と３７℃にて３回凍結融解を＃！
返す）を（ｊって細胞を破壊し、細胞残渣を低速遠心分
離（３，０００ｒｐｍ、２０分間）により除去する。得
られる溶液をグリセロールクソシタン（５％、４０％）
に重層し、３Ｓ＋０００ｒｐ−にて１時間遠心分離する
。得られたベレット０．５〜１ｍ夕をＰＢＳ　１〜２Ｊ
に懸濁し、これにＤＮａｓｅ１０μｇ／−でおよびＲＮ
ａｓｅＯ，３＋ｓｇ／＋ｓＮを３７°Ｃで１時間作用さ
せ、ついで、１１５１の５ｘＳＴＥＰ（０，５％ＳＤＳ
、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，０、４Ｍ
　Ｅ　ＤＴＡ、０．１％プロティナーゼＫ）を加疋、５
０℃で３０分間作用させる。この処理液を等量の７エノ
ール、フェノール−クロロホルム（１：１）およびクロ
ロホルムで順に抽出し、ＤＮＡを含む水層を得る。

二の水層をＴＥ緩衝液（２０ｓ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、１＋＊Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，ｓ）に透析したのち、
冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させる。このＤＮＡ
な戸数し、真空下乾燥後、塩化センラム水溶液（Ｒｆ　
１．３８８５、ｓ−＋）’）ムｌｏマイＶ０．０４％、
ラウロイルサルコシネート０．４％を添加’）Ｓｍｌに
溶解し、４０００ｒｐ−で７２時間遠心分離し、ＨＳＶ
−ＩＤＮＡのバンドを形成させる。このバンドを回収し
、イソプロピルフルフールで洗浄してエチジウムブロマ
イドを除去後、ＴＥ緩衝液に透析する。これに冷エタノ
ールを加えて沈殿させてＨＳＶ−Ｉ　ＤＮＡを得る。

（ｉｉ）ＨＳＶ−ＩＤＮＡのＢａｍＨＩ切断Ｇ７ラグメ
ントのクローン化 上記の方法で調製したＨＳＶ−ＩＤＮＡ約１００μｇ　
を、　７３ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）、
７ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ、　１００ｍＭ　　ＮａＣ！、　
２−Ｍ　２−メルカプトエタノールの混液０．７５−で
中で、制御酵素ＢａｍＨＩにより３７℃、６時間処理し
たのち、０．７％アブロース電気泳動によって各断片を
分離し、Ｇ７ラグメント（０，３４５〜０．３９９マツ
プユニツト）に相当する部分のゲルを切り取り、電気泳
動的に０７ラグメントを回収する。

前記と同様にして制御酵素ＢａｍＨＩによ１）ＩＩＩ］
裂されたｐＢＲ３２２プラスミド１／１０モル量と上記
Ｇ７ラグメント約２μｇとを、５０閤Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７，９，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ　２．２゜―Ｍ
ノチオスレイトール、１＋＊Ｍ　ＡＴＰ混液中にて、Ｔ
、ＤＮＡりが一ゼを用いて１６℃で約１６時間反応させ
ろ。

高木康敬編着「遺伝子操作実験法ＪＪ１６１頁に記載の
方法で大腸菌２１７７６の培！！液を調製し、その菌液
０．１ｍｊ７に上記反応液を加えてよく混合させ、０℃
で４５分間放置したのち、アンピシリン１００μｇ／−
１を含む寒天プレート上に塗抹シ、３７℃で一夜培養す
る。出現したコロニーについて、アンピシリン１１００
ｕ／−ρを含む寒天プレートとテトラサイクリン１００
４ｇ／鴫乏を含む寒天プレートにそれぞれ塗抹し、同様
に培養してアンピシリンを含む寒天プレートでのみ増殖
したコロニーを選択する。ｐＢＲ３２２は７ンビシリン
耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するが、
テトラサイクリン耐性遺伝子中にあるＢａｍＨＩ部位に
ＨＳＶ−ＩＤＮＡ断片が挿入されることによりテトラサ
イクリン耐性が消失されるため、上記選択されたコロニ
ー１！ｐＢＲ３２２−Ｈ８Ｖ　　ＤＮへのＩ（ａｍｌｌ
　ｌ　Ｇ　７ラグメントノｊｌｔ換えＤＮＡを保持して
いることになる。

上記の方法で得られたコロニーに−］い′乙　］代謝」
第１７巻、第４号、第８１〜８９１１（１（）８０）［
プラスミドＤＮＡの４１ｉ製１に記載される方法にした
がってプラスミドをＩｇＭする。得られたプラスミドを
種々の制御酵素（ＢａｍＨＩ、ｎｒ＋ＬＥＩＩ、Ｋｐｎ
ｌ、５ａｉｌ、５ｓｔＴ、Ｘｌ＋ｏＩ）にてその切断パ
ターンを分析することにより、Ｈ８Ｖ−ＩＤＮＡのＢａ
＋５ＨＩＧ７ラグメントがｐＢＲ３２２に組込まれたｐ
ＢＲ３２２−Ｂａｍｌｌ［−（’；７ラグメントの組換
えＤＮＡ（プラスミドｐＧ）を得る。

（ｉｉｉ）　Ｈ８Ｖ　ｇＲ遺伝子の塩基配列上記ＨＳＶ
　ｇＢ遺伝子を含むブラスミＰｐＧの塩基配列を以下の
ようにして決定・ｒる。

プラスミドｐＧ　　Ｉ　ＯμＨをＳＩＩ＠ｌとＳａｃ　
　１の制御酵素反応混液１　ｆｌ　＋）μｅにとがし、
これに制御酵素Ｓ＋ｓａ　Ｉ　　Ｉ　（ｌ　１ｊｔｌ、
γおよび５ｉｃｌ　　日）ｍ位を作用させて該ｇＢ遺伝
子を含む５ｅａｌ−８ａｃ■領域の７ラグメントを得る
。

このＳｍ１Ｉ−３ａｃｌフラグメントを各制御酵素反応
場液中にて、各種の制御ｉＳ！′＠、Ｓａｄ、Ｂａｍｌ
ｌ％　５ｓａＩ　、　Ｐｓｔｉ、　　５ａ１１．　　Ｐ
ＶＬＩ　　ＩＩ、　　５ａｕ３Ａおよび Ｎａｒｌを作用させて、第２図に示すような小断片（４
−→印の断片）に分解し、これら各小断片をクローニン
グベ９Ｆ−Ｍ１３纏ａｌｌ（７ｙルマシア・ツヤパン（
株）販売）のＳａｌ　Ｉ部位に挿入し、ノブオキシ法（
蛋白質・核酸・酵素、Ｖｏｌ、　２９、Ｎｏ。

４．２９４〜３０６（１９８４）ｒノブオキシ法による
ＤＮＡの塩基配列決定法」を参照）によりその塩基配列
を調べたところ、該Ｓ霞ａｌ−Ｓａｃｌｉｉ域は、第３
図に示すような塩基配列およ１それによってフードされ
るｇＢ蛋白質のアミノ酸配列を有することが判明した。

これによろと該ｇＢ遺伝子は９０３個のアミノ酸からな
ることがわかる。

（ｉｖ）　　尾邪領域を除いた５ａｃＩ７ラグメントの
調製 前記（ｉｉ）で得られたプラスミドｐＧ１０＃ｇを、６
＋Ｍ）　　リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、　６ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２．６ｍＭ２−フルカプトエタノール、１５０
−Ｍ　ＮａＣｌ２および５ａｃｌ１０単位の混液１００
μ！中で３７°Ｃにて２時間反応後、１％アがロース電
気泳動により、前記と同様の方法で、ｇＢ遺伝子の約９
割を含む２．７ｋｌ＋のｌ）Ｎへ７ラグメン）（Ｓａｃ
Ｉ７ラグメント）を分離、抽出する。

（２）　シャトルベクターｐＡＭ８２（Ｓａｃ）の調製 特開昭５９−３１７９９号に記載の方法と同様にして調
製したプラスミド＋＋ＡＭ８２を用い、こ八を下記のよ
うに処理してそのＸｈｏ１部位を５ａｃＩｎ位に変換す
る。

プラスミドｐＡＭ８２をＸＩ＋ｏｌで処理して切断した
７ラグメント２μｇを、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰおよび、１ＴＴＰを含む６７ａＭ　　）　
　リス−Ｈ（、ｅ（＋＋１−１８．６＞、　６．７−Ｍ
ＭｇＣｌｘ、１０＋１Ｍ　２−メルカプトエタ／−ル、
６．７　ｕ　Ｍ　　Ｅ　Ｄ　Ｔ　ＡおよびＩ　６，７＋
ｉＭ（ＮＨ＋）２ＳＯ１のｌ昆液５０μ！中で、Ｔ、１
）ＮＡポリメラーゼ０．１単位と３７“Ｃにて３（）分
間反応させる。

この反応液を７１ノール抽出、エタノール沈殿に付した
のち、得られるＤＮＡとＳ皐ｃｌリンカ−を１：１０モ
ル比にてＴ、リプーゼにより１６℃、８時Ｍ結合反応を
行なう。

この反応液を用い、前記プラスミドＤＧＢＸの調製の場
合と同様に、高木康敬纒着「遺伝子操作実験法」１６１
〜１６２頁に記載の方法により、大腸菌ブラ入ミドχ１
７７６を形質転換し、７ンビシリン耐性菌を＠豊し、そ
の菌体から前記と同様の方法にて、ＡＭ８２のＸｈｏＩ
部位が５ａｃＩ部位に変換されたプラスミドｐＡＭ８２
（Ｓａｃ）を単離する。

（３）、Ｈ３Ｖ　ｇＢ遺伝子発現プラスミドの調製前記
（２）で得られたプラスミドｐＡＭ８２（Ｓａｃ）、１
、ｕｇを、６−Ｍ　トリ基−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、６
−Ｍ　ＭｇＣ１！、６−Ｍ　２−メルカプトエタン−ｌ
し、＋（Ｘｌ １５０ｍＭ　ＮａＣ１，５ａｃＩ　　１０単位の混液ｕ
ｌ八 中で３７℃、２時間反応させ、その反応液を７エノール
抽出、エタノール沈殿に付す。

上記で得られた７ラグメン）１０ｎｇと前記（１）（ｉ
ｖ）で得られた２、　７ｋｂ　Ｓａｃ　Ｉ　７ラグメン
ト１１００ｎとを、６６ｗＭ）リス−１１ｃｊ’、（ｐ
ｉ−１７，６＞、６．６ｍＭ　ＭｇＣ１−１１０噛Ｍノ
チオスレイトールおよび６６μＭ　ＡＴＰの）昆ン夜１
０μｅ中、Ｔす〃−ゼ０．１単位にて１６°Ｃ１８時間
結合反応させる。

この反応液を用い、高木庫敬編著「遺伝子操作実験法」
　１６１〜１Ｇ２ｉＴに記載の方法により、大腸菌プラ
スミドχ１７７１ｉを形質転換し、アンピシリン耐性薗
を選択培養し、１−記と同様の方法にて、その菌体か１
酸性ホスファターゼプロモーター下流に尾部領域を欠失
したｌｌ５Ｖ、Ｂ遺伝子（ｇＢ全遺伝子の約９割、７ミ
／酸８１６個）とその下流にベクター白米遺伝子（アミ
ノ酸・を個）と・が結合さ枕た組換えプラスミドジノ＼
Ｍ（ｉＢｌを単離する。

（４）　形質転換酵母のｉｉｌ製 酵母としてサツカロミセス・セレビシェＡＨ２２Ｅｘ　
Ｉｅｕ２　ｈｉｓ４　Ｃａｎｔ（Ｃｉｒ’）］　（微工
研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（２％ポ
リペプトン、１％イーストエキス、２％グルコース００
０ｍ１に接種し、３０℃で一晩培養したのち、遠心して
集菌する。滅菌水２０Ｊにて菌体を洗浄し、ついで、１
．２Ｍソルビトールおよび１００μｇ／■乏チモリアー
ゼ６０，０００（生化学工業製）の溶液５Ｊｌ：懸濁さ
せ、３０’Ｃで約３０分間保ち、スフェロプラスト化す
る。ついで、スフェロプラストを１．２Ｍ　ソルビトー
ル溶液で３回洗浄したのち、２Ｍソルビトール、１０ｍ
ＭＣａＣ１−および１０ｍＭ）すｙ、−ＨＣ，ｆ２（ｐ
Ｈ７゜５）の溶ｔ０．６ｍｌに懸濁させ、その６０μＮ
ｆつを小試験管に分注する。これに前記（３）で調製し
た組換えプラスミドｐＡＭＧＢ１　１０μｇを加え、充
分混合し、さらに０．１Ｍ　ＣａＣ，Ｌ　（３ｕｌ）加
えて最終濃度１０ｍＭ　ＣａＣＬとし、室温に５〜１０
分間放置する。ついでこれに、２０％ポリエチレングリ
コール４０００．１０鴫ＭＣａＣ１，および１０論Ｍ　
トリス−ＨＣｐ（ｐＨ７，５）溶液１ｍｌずつを加えて
混合し、室温に約２０分間放置する。この混合液０．２
−ずつを４５℃に保温された再生培地（２２％ソルビト
ール、２％グルコース、０．７％イーストニドａデンベ
ースアミノ酸、２％ＹＰＤ、２ｔｌ／ＩＨ／ｗｅヒス＋
ノン、３％寒天）１０ｍｌに加え、軽く混合させ、予め
準備された１、２Ｍソルビトール含有最小培地（０゜７
％イーストニトロゲンベースアミ／ａ、２％グルコース
、２０μｇ／ｍｊ！ヒ入チジン、２％寒天）プレートに
重層し、固化させたのら、３０℃で培養してロイシン非
要求性酵母のコロニーを得る。

このコロニーを２０μｇ／−，ｅヒスチノンを含むバル
ク水ｌレグーミニマルメディウム（Ｔｏｈｅ、Ａ。

ｅｔ　ａｌ　：　　Ｊ、　ＢａｃｈＬｅｒｏｌ、＋　　
Ｉ　ｌ　３．７２１〜７３８（１９７３）を参照ｌにて
培養して形質転換酵母サツカロミセス・セレビシェを得
る。

（５）形質転換酵母によるＨ３Ｖ　ｇＢの製法前記（４
）で得らｈた形質転換ＰＵ’４のコロニーをさらに２０
μ［１／ｖａ　４ヒスチノンを含むバルクホルダーミニ
マルメディウムの寒天プレート上に塗布し、３０℃ｌこ
で培養してコロニーを形成させる（ロイシン非要求性と
なった形質転換体の再確認のため）、ついで、このフロ
ニーから菌体を分離し、２０μｇ／ｖＢｌヒスチジンを
含むパルクホルダーミニマルメデイウム１０−１に接種
し、３０℃にて培養を行なう、約２４時間後、対数増殖
期にあろ菌体を遠心して集菌し、これをリン酸を含まな
い最小培地（バルクホルダーミニマルメディウムに含ま
れろＫＨ，ＰＯ，をＫＣｐで置換し、さらに２０μｇ／
―！ヒスチジンを加えたもの）１０論ｌに菌数的４Ｘ１
０’ｃｅｌｌｓ／−になるように懸濁し、３０℃にて約
２４時間培養を続けたのも、４，０００回転、１０分間
の遠心により菌体な集める。この菌体な１．２Ｍソルビ
トール、ＳＯ＋＊Ｍ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）、
１４＋ｍＭ２−メルカプトエタノール、１．００μｇ／
Ｉｌｌザイモリエース６０，０００の溶液３ｍ、９１：
ＦＪ濁させ、３０℃にて３０分間ゆるやかに振盪してス
７二ａプラスト化し、遠心分離によりこれを集める。こ
のスフェロプラストを１％トリトンＸ−１００を添加し
た５０い１リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）ＩＪを懸濁し、
グラスビーズを加えて攪拌して菌体を破砕する。この破
砕液な５．０００ｒ１）１１で１０分間遠心し、上清を
酵素抗体法により８Ｂ抗原活＋！１を測定した。その結
果を第１表に示す。

また、上記破砕液を５匹のモルモットに１ｓｊＴｈずつ
１週問おきに４回皮下核種すると、すべてのモルモット
に中和抗体が出現することが認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に用いられるｌｌ５ＶＤＮＡのＢａｍ
ＨＩ−Ｇフラグメン）を含むプラスミドＥＩＧの構造、
第２図は６Ｂ遺伝子を含むｌｉ’Ｊ域の制御酵素地図、
第３図（Ａ）−（Ｅ）はＨ８Ｖ　ｇＢＩｔ（ｒ、子の塩
基配列、１４図はプラスミドｐＡＭ８２（Ｓａｃ）の構
造、第５図はプラスミドｐＡＭＧＴ３１の構造、第６図
はプラスミドｐＡＭＧＢ１の８Ｌ遺伝子−ベクター結合
部分の塩基配列を示す。 特許出願人　財団法人化学及血清療法碩究所代理　人　
弁理士前出　葆はか１名 第１図 ＢａｍＨ工

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母
   の抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域を担った
   プラスミドベクターに、該ホスファターゼプロモーター
   の制御下に、制御酵素Ｓａｃ I で処理して得られる尾
   部領域を欠失した単純ヘルペスウィルス遺伝子を組込ん
   だことを特徴とする組換えプラスミド。
2. （２）該抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域が
   ホスファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリ
   ペプチド（ＰＧＯ）の遺伝子であり、その構造遺伝子の
   一部または全部らしくはさらにその上流の種々の部位ま
   でが除去されている前記第（１）項の組換えプラスミド
   。
3. （３）酵母の遺伝子がａｒｓ１および２μｏｒｉである
   前記第（１）項の組換えプラスミド。
4. （４）酵母の遺伝子としてａｒｓ１、２μｏｒｉならび
   に形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子を有する前
   記第（１）項の組換えプラスミド。
5. （５）該選択マーカーとなる遺伝子がロイシン産生遺伝
   子、ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子
   、ウラシル産生遺伝子およびアデニン産生遺伝子から選
   ばれる１種または２種以上である前記第（４）項の組換
   えプラスミド。
6. （６）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
   ために必要なＤＮＡ配列である前記第（１）項の組換え
   プラスミド。
7. （７）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
   ために必要なＤＮＡ配列ならびに形質転換大腸菌の選択
   マーカーとなる遺伝子である前記第（１）項の組換えプ
   ラスミド。
8. （８）該選択マーカーとなる遺伝子が、アンピシリン耐
   性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン
   耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子から
   選ばれる１種または２種以上である前記第（７）項の組
   換えプラスミド。
9. （９）酵母に、前記第（１）項の組換えプラスミドを作
   用させて形質転換させてなる形質転換酵母。
10. （１０）該酵母がロイシン要求性変異株、ヒスチジン要
    求性変異株、トリプトファン要求性変異株、ウラシル要
    求性変異株およびアデニン要求性変異株から選ばれる１
    種である前記第（９）項の形質転換酵母。
11. （１１）該酵母がロイシン要求性変異株のサッカロミセ
    ス・セレビシエＡＨ２２ａｌｅｕ２ｈｉｓ４Ｃａｎ１（
    Ｃｉｒ＾＋）である前記第（８）項の形質転換酵母。
12. （１２）第（９）項の形質転換酵母を培養して単純ヘル
    ペスウィルスのキメラ蛋白質を産生させ、それを収集す
    ることを特徴とする単純ヘルペスウィルス蛋白質の製法
    。
13. （１３）該形質転換酵母の培養を、酸性ホスファターゼ
    プロモーターが抑制されない条件下に行なう前記第（１
    ２）項の製法。