JPS58995A - ウイルス蛋白の合成 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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-
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- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
組み換えＤＮＡ技術の操作には特定の所望蛋白質に対し
てコードしているＤＮＡの単離および精製、所望ＤＡの
異なった宿主菌への運搬、所望蛋白質の合成を生じる宿
主菌による運搬されたＤＮＡの表現および所望蛋白質の
宿主菌からの分離および精製を包含する。運搬は所望Ｄ
ＮＡを選択された宿主内で自律的複製が可能なりＮＡ
、プラスミドかウィルス原かである運搬媒介体に挿入す
ることによって達成される。現在まで原核、例えば細菌
、宿主およびそのための運搬媒介体の使用に重きがおか
れでいた。細菌宿主は大規模な安い培地で迅速発育速度
の利点を有するが、多くの真核遺伝子の正確な表現に要
求される転写後および翻訳後の過程のある種の態様を実
施するための固有力に欠ける欠点がある。
てコードしているＤＮＡの単離および精製、所望ＤＡの
異なった宿主菌への運搬、所望蛋白質の合成を生じる宿
主菌による運搬されたＤＮＡの表現および所望蛋白質の
宿主菌からの分離および精製を包含する。運搬は所望Ｄ
ＮＡを選択された宿主内で自律的複製が可能なりＮＡ
、プラスミドかウィルス原かである運搬媒介体に挿入す
ることによって達成される。現在まで原核、例えば細菌
、宿主およびそのための運搬媒介体の使用に重きがおか
れでいた。細菌宿主は大規模な安い培地で迅速発育速度
の利点を有するが、多くの真核遺伝子の正確な表現に要
求される転写後および翻訳後の過程のある種の態様を実
施するための固有力に欠ける欠点がある。
真核遺伝子はしばしば原核生物に見られないイントロン
と呼ばれる内部未翻訳部を含有する。真核遺伝子から転
写された几ＮＡの転写後の過程は隣接コードづけ部分を
有する伝令比ＮＡを生じる一連の切断および接合段階に
おいて真核細胞の核内で行なわれる。原核細胞は必要な
接合反応実施力に欠ける。結果として多くの真核遺伝子
は原核宿主内で直接運搬および表現することができない
。先行技術は伝令ＲＮＡの逆転写が真核供与体細胞から
分離されるクローニングｃＤＮＡの手段にたよっていた
。ｃＤＮＡ法は所望蛋白質に対してコードしているｍＲ
ＮＡが供与体細胞から単離された優勢なｍＲＮＡである
かまたは専門技術によって特異的に単離することができ
る状況に限定される。しかしながら多くの場合、相当す
る真核遺伝子の直接単離は実際に採りうる唯一の方法で
ある。かかるゲノムクローンは真核宿主細胞内で表現さ
れなければならない。
と呼ばれる内部未翻訳部を含有する。真核遺伝子から転
写された几ＮＡの転写後の過程は隣接コードづけ部分を
有する伝令比ＮＡを生じる一連の切断および接合段階に
おいて真核細胞の核内で行なわれる。原核細胞は必要な
接合反応実施力に欠ける。結果として多くの真核遺伝子
は原核宿主内で直接運搬および表現することができない
。先行技術は伝令ＲＮＡの逆転写が真核供与体細胞から
分離されるクローニングｃＤＮＡの手段にたよっていた
。ｃＤＮＡ法は所望蛋白質に対してコードしているｍＲ
ＮＡが供与体細胞から単離された優勢なｍＲＮＡである
かまたは専門技術によって特異的に単離することができ
る状況に限定される。しかしながら多くの場合、相当す
る真核遺伝子の直接単離は実際に採りうる唯一の方法で
ある。かかるゲノムクローンは真核宿主細胞内で表現さ
れなければならない。
さらに原核宿主の欠点はある転写後の過程段階を実施す
ることができないことにある。
ることができないことにある。
かかる段階は特異糖付加および付リン酸反応段階、例え
ば特異二値酸塩架橋の生成およびある種のペプチドの除
去を包含することができる。真核宿主細胞は標準的には
かかる段階を実施することができるが、一方原核宿主を
たよシの先行技術は制御することがむずかしい試験管内
の化学反応または酵素反応にたよらなければならない。
ば特異二値酸塩架橋の生成およびある種のペプチドの除
去を包含することができる。真核宿主細胞は標準的には
かかる段階を実施することができるが、一方原核宿主を
たよシの先行技術は制御することがむずかしい試験管内
の化学反応または酵素反応にたよらなければならない。
これらの困難にもかかわらず、真核宿主細胞の使用は翻
訳後の過程段階がさらに望ましい生成物を生じる場合に
好適である。例えばＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ ）の場
合に主な抗原、表面（Ｓ）抗原はウィルスに対して防御
免疫を惹起する主要因子である。Ｓ−抗原はウィルスの
外部エンベロープの一成分である。持続的に感染した個
体からの細胞質はまたＳ−抗原モノマー１脂質および他
の蛋白質の集合体である特徴のある２ ２ ｎｍ球形粒
子を含有する。２２ｎｍ粒子のＳ−抗原分子の約半分が
糖付加される。ＨＢＶが培養細胞または実験動物内で増
殖できないために、唯一の今の源泉は感染した供与個体
からである。精製した２２ｎｌｎ粒子は非免疫志願者に
投与した際に防御免疫の惹起を示した。抗原粒子の便利
な源泉の欠如は大規模な免疫化のためのワクチンとして
有用性を制限する。
訳後の過程段階がさらに望ましい生成物を生じる場合に
好適である。例えばＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ ）の場
合に主な抗原、表面（Ｓ）抗原はウィルスに対して防御
免疫を惹起する主要因子である。Ｓ−抗原はウィルスの
外部エンベロープの一成分である。持続的に感染した個
体からの細胞質はまたＳ−抗原モノマー１脂質および他
の蛋白質の集合体である特徴のある２ ２ ｎｍ球形粒
子を含有する。２２ｎｍ粒子のＳ−抗原分子の約半分が
糖付加される。ＨＢＶが培養細胞または実験動物内で増
殖できないために、唯一の今の源泉は感染した供与個体
からである。精製した２２ｎｌｎ粒子は非免疫志願者に
投与した際に防御免疫の惹起を示した。抗原粒子の便利
な源泉の欠如は大規模な免疫化のためのワクチンとして
有用性を制限する。
ＨＢＶの完全なゲノムは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ）内で
クローン化し、そのヌクレオチド配列が決定された。
表面および核抗原のアミノ酸配列はＨＢＶ ＤＮＡのヌ
クレオチド配列から推断された。しかしながらヌクレオ
チド配列データは未翻訳部の機能またはシグナルペプチ
ドのような翻訳されるが次に処理される部位の存在の予
測を可能にしない。一定の真核遺伝子に対するプロモー
ター配列の位置は予知できない。しかしながらプロモー
ターはしばしばコードづけ部のスタートからさかのぼっ
て“ホグネスボックス（Ｈｏｇｎｅｓｓ ｂｏｘ）”、
ＴＡＴＡＡ 。
クローン化し、そのヌクレオチド配列が決定された。
表面および核抗原のアミノ酸配列はＨＢＶ ＤＮＡのヌ
クレオチド配列から推断された。しかしながらヌクレオ
チド配列データは未翻訳部の機能またはシグナルペプチ
ドのような翻訳されるが次に処理される部位の存在の予
測を可能にしない。一定の真核遺伝子に対するプロモー
ター配列の位置は予知できない。しかしながらプロモー
ターはしばしばコードづけ部のスタートからさかのぼっ
て“ホグネスボックス（Ｈｏｇｎｅｓｓ ｂｏｘ）”、
ＴＡＴＡＡ 。
２１〜６２塩基対に似ている配列を包含するであろう。
（コーデン、Ｊ６等、サイエンス、牙２０９巻、矛１４
０６頁（１９８０年〕参照。）※ 本明細書中に引用される同時係属中の出願番号矛１０７
，２６７号参照。ＨＢＶ Ｓ−抗原の場合、かかる部位
は成熟Ｓ−抗原に対してコードしている部位のスタート
近くに固定されなかった。
０６頁（１９８０年〕参照。）※ 本明細書中に引用される同時係属中の出願番号矛１０７
，２６７号参照。ＨＢＶ Ｓ−抗原の場合、かかる部位
は成熟Ｓ−抗原に対してコードしている部位のスタート
近くに固定されなかった。
ＨＢＶの量体Ｓ−抗原および核抗原の両方が適当な運搬
媒介上ＨＢＶ ＤＮＡの各々のコードづけ部を含有する
細菌によって合成されている。原核宿主細胞による表現
が直接にあるいは原核ＮＨ２−末端部分を有する融合蛋
白質として非付加、単量体Ｓ−抗原の生産を生じる。（
出願番号矛１０７ 、２６７号参照。）原核表現生成物
は２２ｎ粒子よシ小さいこと以外は抗原である。望まし
い目的は２２ｎｍ粒子を生産する翻訳後の過程または他
の８−抗原集合体が生じることができる真核宿主内で８
−抗原の表現を得るだめの組み換えＤＮＡ技術の応用で
あった。かかる表現は伝えられるところによれば５Ｖ−
４０後期プロモーターの制御下で表現された５Ｖ−４０
に挿入されたＳ−抗原コードづけ部を用いるサルの細胞
で達成されている。 これらの条件下で表現されたＳ−
抗原の少なくともあるものは必要な翻訳過程がサルの細
胞における表現の中に生じることができることを示す電
子顕微鏡で見えるＳ−抗原集合体の形態にあった。。ハ
マーＩ Ｄ ｌリコンビナントＤＮＡリサーチのファー
ストインターナショナルコンブレス（１９８１年）。８
Ｖ−４０はヒトの細胞に感染させることができ、腫瘍転
換を起こすことが可能である。それ酸５Ｖ−４０系はＳ
Ｖ−４０感染細胞の抽出物のウィルス汚染の危険のため
にワクチクの生成目的に対して不利である。
媒介上ＨＢＶ ＤＮＡの各々のコードづけ部を含有する
細菌によって合成されている。原核宿主細胞による表現
が直接にあるいは原核ＮＨ２−末端部分を有する融合蛋
白質として非付加、単量体Ｓ−抗原の生産を生じる。（
出願番号矛１０７ 、２６７号参照。）原核表現生成物
は２２ｎ粒子よシ小さいこと以外は抗原である。望まし
い目的は２２ｎｍ粒子を生産する翻訳後の過程または他
の８−抗原集合体が生じることができる真核宿主内で８
−抗原の表現を得るだめの組み換えＤＮＡ技術の応用で
あった。かかる表現は伝えられるところによれば５Ｖ−
４０後期プロモーターの制御下で表現された５Ｖ−４０
に挿入されたＳ−抗原コードづけ部を用いるサルの細胞
で達成されている。 これらの条件下で表現されたＳ−
抗原の少なくともあるものは必要な翻訳過程がサルの細
胞における表現の中に生じることができることを示す電
子顕微鏡で見えるＳ−抗原集合体の形態にあった。。ハ
マーＩ Ｄ ｌリコンビナントＤＮＡリサーチのファー
ストインターナショナルコンブレス（１９８１年）。８
Ｖ−４０はヒトの細胞に感染させることができ、腫瘍転
換を起こすことが可能である。それ酸５Ｖ−４０系はＳ
Ｖ−４０感染細胞の抽出物のウィルス汚染の危険のため
にワクチクの生成目的に対して不利である。
本発明は真核宿主細胞特に哺乳動物細胞のＨＢＶのＳ−
抗原の表現を提供し、それによって８−抗原集合体の生
成に十分な翻訳後の過程が汚染の最小危険の条件下で生
じる。生成されたＳ−抗原集合体はＨＢＶ感染に対して
防御免疫を惹起でき、従ってワクチンへの合成に適当な
かなり抗原性である。本発明の重要な貢献はＨＢＶの正
常なＳ−抗原プロモーター単独またはオニプロモーター
と連絡し合っての使用である。それによってＳ−抗原の
表現が媒介体の他のプロモーターの存在または方向と無
関係に種々の媒介体で・得ることができる。Ｓ−抗原プ
ロモーターは非常に活性であｐ、真核宿主内の他の遺伝
子の表現を高めるためにそれ自体によって有用であるこ
とを示すべきである。さらに本発明の態様としてＳ−抗
原の合成がオニプロモーターと連絡し合いそして同じ方
向のＳ−抗原プロモーターの使用によって増大する。そ
れ数本発明は真核宿主細胞内のＳ−抗原の合成およびＳ
−抗原集合体の生産のための新規な見えない表現媒介体
を提供する。Ｓ−抗原集合体は細菌宿主によって生産さ
れるものよシさらに抗原性形態のＳ−抗原を提供する。
抗原の表現を提供し、それによって８−抗原集合体の生
成に十分な翻訳後の過程が汚染の最小危険の条件下で生
じる。生成されたＳ−抗原集合体はＨＢＶ感染に対して
防御免疫を惹起でき、従ってワクチンへの合成に適当な
かなり抗原性である。本発明の重要な貢献はＨＢＶの正
常なＳ−抗原プロモーター単独またはオニプロモーター
と連絡し合っての使用である。それによってＳ−抗原の
表現が媒介体の他のプロモーターの存在または方向と無
関係に種々の媒介体で・得ることができる。Ｓ−抗原プ
ロモーターは非常に活性であｐ、真核宿主内の他の遺伝
子の表現を高めるためにそれ自体によって有用であるこ
とを示すべきである。さらに本発明の態様としてＳ−抗
原の合成がオニプロモーターと連絡し合いそして同じ方
向のＳ−抗原プロモーターの使用によって増大する。そ
れ数本発明は真核宿主細胞内のＳ−抗原の合成およびＳ
−抗原集合体の生産のための新規な見えない表現媒介体
を提供する。Ｓ−抗原集合体は細菌宿主によって生産さ
れるものよシさらに抗原性形態のＳ−抗原を提供する。
本発明は本発明に従ってまたは本発明の表現媒介体を用
いて生産したＳ−抗原集合体からなるワクチンを提供す
る。
いて生産したＳ−抗原集合体からなるワクチンを提供す
る。
本発明はさらにＨＢＶ核抗原プロモーターを用いるＨＢ
Ｖ核抗原表現のだめの媒介体を提供する。ＨＢＶ核抗原
プロモーターの使用は媒介体のあらゆる既存のプロモー
ターと無関係に表現媒介体を構成させる。核抗原プロモ
ーターはまた非常に活性であり、他の蛋白質の表現のだ
めの媒介体の構成に有用となる。
Ｖ核抗原表現のだめの媒介体を提供する。ＨＢＶ核抗原
プロモーターの使用は媒介体のあらゆる既存のプロモー
ターと無関係に表現媒介体を構成させる。核抗原プロモ
ーターはまた非常に活性であり、他の蛋白質の表現のだ
めの媒介体の構成に有用となる。
本発明の出発点は大腸菌株に維持され、複製されるｐＲ
Ｒ３２５のようなプラスミド運搬媒介体で運ばれるクロ
ーンＨＢＶ −ＤＮＡである。
Ｒ３２５のようなプラスミド運搬媒介体で運ばれるクロ
ーンＨＢＶ −ＤＮＡである。
３２２１塩基対をしめるクローンＨＢＶゲノムのヌクレ
オチド配列の認識は三つの主なウィルス蛋白質、表面抗
原、核蛋白質およびＤＮＡポリメラーゼの相゛対的な位
置を決定し、アミノ酸配列を予測しそして種々の限定エ
ンドヌクレアーゼの作用部位を確認することにある。奄
ＨＢＶ ＤＮＡヌクレオチド配列はまた転写の開始部位
で通常会合するＴＡＴＡＡ様配列の位置に関東 して情報を提供することができる。 （出願番号矛１
０７ 、２６７号で示された通り）シかしながらプロモ
ーター配列を明白に確認しそして同定するために試験管
内の実験を行なうことが必要である。本明細書で使用し
た一般的な方法は試験管内転写のだめの鋳型として限定
エンドヌクレアーゼによって種々の点で切断したＨＢＶ
ＤＮＡを用いることであった。開始点（プロモーター
）と限定エンドヌクレアーゼ切断部位の間の鋳型の長さ
が長くなるにつれて、ＲＮＡ生成物は長くなる。真核転
写の意味のある反映を提供するために真核細胞から抽出
した生体内の系が所用されるべきである。
オチド配列の認識は三つの主なウィルス蛋白質、表面抗
原、核蛋白質およびＤＮＡポリメラーゼの相゛対的な位
置を決定し、アミノ酸配列を予測しそして種々の限定エ
ンドヌクレアーゼの作用部位を確認することにある。奄
ＨＢＶ ＤＮＡヌクレオチド配列はまた転写の開始部位
で通常会合するＴＡＴＡＡ様配列の位置に関東 して情報を提供することができる。 （出願番号矛１
０７ 、２６７号で示された通り）シかしながらプロモ
ーター配列を明白に確認しそして同定するために試験管
内の実験を行なうことが必要である。本明細書で使用し
た一般的な方法は試験管内転写のだめの鋳型として限定
エンドヌクレアーゼによって種々の点で切断したＨＢＶ
ＤＮＡを用いることであった。開始点（プロモーター
）と限定エンドヌクレアーゼ切断部位の間の鋳型の長さ
が長くなるにつれて、ＲＮＡ生成物は長くなる。真核転
写の意味のある反映を提供するために真核細胞から抽出
した生体内の系が所用されるべきである。
ＲＮＡポリメラーゼ■は哺乳動物細胞内のｍＲＮＡ生産
に役割を果す酵素である。ＲＮＡ生成物の長さはゲル電
気泳動法によって測定することができ、その長さに基づ
いて核酸を分離する。
に役割を果す酵素である。ＲＮＡ生成物の長さはゲル電
気泳動法によって測定することができ、その長さに基づ
いて核酸を分離する。
合成される几ＮＡの量は公知の特異活性を有する′放射
線札付の先駆物質のＲＮＡ生成物への混入を測定するこ
とによって定量することができる。
線札付の先駆物質のＲＮＡ生成物への混入を測定するこ
とによって定量することができる。
プロモーターが同定されれば、次の段階はコードづけ部
の表現のために表現媒介体を構成することである。ＨＢ
Ｖ Ｓ−抗原および核蛋白質プロモーターの活性を明細
書中に示しているので、これらの同じプロモーターがさ
らに他のコードづけ部の表現を指示するのに有用である
ことは理解されるであろう。まさにＩ（ＢＶプロモータ
ーの高レベル活性は高レベルの活性が望まれるかなり様
々な表現系における用途を示唆する。
の表現のために表現媒介体を構成することである。ＨＢ
Ｖ Ｓ−抗原および核蛋白質プロモーターの活性を明細
書中に示しているので、これらの同じプロモーターがさ
らに他のコードづけ部の表現を指示するのに有用である
ことは理解されるであろう。まさにＩ（ＢＶプロモータ
ーの高レベル活性は高レベルの活性が望まれるかなり様
々な表現系における用途を示唆する。
真核細胞に適当な表現媒介体はプロモーターおよびコー
ドづけ部を挿入するだめの適当な位置の限定部位を提供
するほかに宿主細胞内で複製が可能でなければならない
。好適には例えばワクチンとしてヒトの投与に望ましい
表現生成物を使用することが望ましいことから、媒介自
体は毒性物質の生産に対して役割を持つべきではない。
ドづけ部を挿入するだめの適当な位置の限定部位を提供
するほかに宿主細胞内で複製が可能でなければならない
。好適には例えばワクチンとしてヒトの投与に望ましい
表現生成物を使用することが望ましいことから、媒介自
体は毒性物質の生産に対して役割を持つべきではない。
しかしながらＨＢＶ抗原のユーティリティは活性免疫を
産生ずるための直接投与に限定されない。抗原はまた動
換向に対応する抗体を産生ずるのに有用であり、かかる
抗体は診断試験にそして受身免１疫を供するのに有用で
ある。抗原はまた単クローン性抗体を産生ずるのに有用
である。
産生ずるための直接投与に限定されない。抗原はまた動
換向に対応する抗体を産生ずるのに有用であり、かかる
抗体は診断試験にそして受身免１疫を供するのに有用で
ある。抗原はまた単クローン性抗体を産生ずるのに有用
である。
真核細胞におけるＨＢＶ −’ Ｓ−抗原表現を示す目
的に対してウィルス８Ｖ−４０に基づく表現媒介体を使
用した。Ｓ’Ｖ−４０の利点の特徴は非常に特徴のある
ウィルスであり、それ自体の活性プロモーター、“後期
パプロモーターを有しギして宿主細胞内の複製が感染サ
イクルに遅れて１細胞当９１ｏｏ、ｏｏｏコピー以下の
巨大な遺伝子増幅を供するという事実を包含する。。本
発明の実用性を示すだめの系として、８Ｖ−４０は操作
の容易さ、高レベルの表現および連絡し合うプロモータ
ーの効果を探究するだめの手段を提供する。憂一般的に
ＤＮＡ ＠瘍つィルス（Ｊ、トープ、改訂）、コールド
スプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリング
ハーバ−Ｉ Ｎ、Ｙ、２ ” 部’ ”１７５〜２０
４頁のトープ、Ｊ、（１９８０年）を参照。ワクチンに
用いるためのＳ−抗原の生産に対して、５Ｖ−４０はヒ
トの細胞に感染および腫瘍転換が可能なウィルスである
欠点を有する。表現生成物がヒトに投与しなければなら
ない場合に他の真核媒介体系、例えばアデノウィルスが
好ましいことは理解されるであろう。他の適当な系は完
全な５Ｖ−４０ゲノムを生じ、Ｓｖ〜４０複製に要求さ
れるラージＴ抗原を産生ずるＣＯＳ細胞を使用する（グ
ルツマン、Ｙ、セル、矛２６巻、矛１７５頁（１９８１
年〕）。かかる宿主細胞は５Ｖ−４０複製原部位を運ぶ
あらゆる媒介体を複製することができる。かかる媒介体
は異種配列の欠失または挿入によって５Ｖ−４０後期作
用に欠損を生じることができる。かかる媒介体はＣＯ８
宿主細胞内で複製することができ、ウィルス粒子の汚染
産生または感染ウィルスＤＮＡがなく生じる遺伝子を表
現することができる。
的に対してウィルス８Ｖ−４０に基づく表現媒介体を使
用した。Ｓ’Ｖ−４０の利点の特徴は非常に特徴のある
ウィルスであり、それ自体の活性プロモーター、“後期
パプロモーターを有しギして宿主細胞内の複製が感染サ
イクルに遅れて１細胞当９１ｏｏ、ｏｏｏコピー以下の
巨大な遺伝子増幅を供するという事実を包含する。。本
発明の実用性を示すだめの系として、８Ｖ−４０は操作
の容易さ、高レベルの表現および連絡し合うプロモータ
ーの効果を探究するだめの手段を提供する。憂一般的に
ＤＮＡ ＠瘍つィルス（Ｊ、トープ、改訂）、コールド
スプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリング
ハーバ−Ｉ Ｎ、Ｙ、２ ” 部’ ”１７５〜２０
４頁のトープ、Ｊ、（１９８０年）を参照。ワクチンに
用いるためのＳ−抗原の生産に対して、５Ｖ−４０はヒ
トの細胞に感染および腫瘍転換が可能なウィルスである
欠点を有する。表現生成物がヒトに投与しなければなら
ない場合に他の真核媒介体系、例えばアデノウィルスが
好ましいことは理解されるであろう。他の適当な系は完
全な５Ｖ−４０ゲノムを生じ、Ｓｖ〜４０複製に要求さ
れるラージＴ抗原を産生ずるＣＯＳ細胞を使用する（グ
ルツマン、Ｙ、セル、矛２６巻、矛１７５頁（１９８１
年〕）。かかる宿主細胞は５Ｖ−４０複製原部位を運ぶ
あらゆる媒介体を複製することができる。かかる媒介体
は異種配列の欠失または挿入によって５Ｖ−４０後期作
用に欠損を生じることができる。かかる媒介体はＣＯ８
宿主細胞内で複製することができ、ウィルス粒子の汚染
産生または感染ウィルスＤＮＡがなく生じる遺伝子を表
現することができる。
本明細書中に開示される５Ｖ−４０媒介体は内因性８Ｖ
−４０後期プロモーターと連絡し合うようにおよび反対
にＨＢＶプロモーター声用いる効果を示す。ＨＢＶ Ｓ
−抗原および核蛋白質の表現はＨＢＶプロモーター（本
明細書ではｐＥｓＶ −ＨＶＳ−と示す）から離れて（
と反対に）方向づけられた後期プロモーターを持つ５ｖ
−４０を有する宿主細胞内で両方とも示された。
−４０後期プロモーターと連絡し合うようにおよび反対
にＨＢＶプロモーター声用いる効果を示す。ＨＢＶ Ｓ
−抗原および核蛋白質の表現はＨＢＶプロモーター（本
明細書ではｐＥｓＶ −ＨＶＳ−と示す）から離れて（
と反対に）方向づけられた後期プロモーターを持つ５ｖ
−４０を有する宿主細胞内で両方とも示された。
それ故実質的な表現はＨＢＶプロモーター単独から得ら
れた。媒介体が本明細書中でｐＥ８Ｖ−ＨＶＳ＋と呼ば
れる同じ方向に（連絡し合うように）方向づけられたＳ
Ｖ −４（：ＪおよびＨＢＶプロモーターで構成されて
いる場合にある表現の刺激が見られた。それ故媒介体プ
ロモーターと連絡し合うＨＢＶプロモーターの使用は表
現生成物の収率を増大することができる。
れた。媒介体が本明細書中でｐＥ８Ｖ−ＨＶＳ＋と呼ば
れる同じ方向に（連絡し合うように）方向づけられたＳ
Ｖ −４（：ＪおよびＨＢＶプロモーターで構成されて
いる場合にある表現の刺激が見られた。それ故媒介体プ
ロモーターと連絡し合うＨＢＶプロモーターの使用は表
現生成物の収率を増大することができる。
ＨＢｖＳ−抗原と成熟Ｓ−抗原のコードづけ部との関係
はほとんどまれである。実験的に同定したプロモーター
は成熟Ｓ−抗原のＩ’１（２−末端アミノ酸のコドンか
ら上に５９２塩基対あるが、ＴＡＴＡＡ様配列は通常上
に２１〜３２塩基対見出される（コルデン、Ｊ８等、サ
イエンス、矛２０９巻、矛１４０６頁（１９８０年））
。成熟Ｓ−抗原が実際に開始翻訳生成物であるならば、
プロモーターからスタートコドンまでの長い距離はＳ−
抗原表現の制御に特別の重要性があることができる。し
かしながら同位相でストップコドンのない長い部位は成
熟Ｓ−抗原に対してコードしている部位のスタートに先
立っている。さらにその上メチオニンスタートコドンは
Ｓ−抗原プロモーターから下に７０塩基対だけこの前の
部位にある。他方Ｓ−抗原プロモーターからの開始翻訳
生成物は２２ ｎｍ Ｓ−抗原粒子のよりなＳ−抗原集
合体の集合において重要な作用−を有することができる
成熟Ｓ−抗原および前配列からなるかなり大きな蛋白資
であるとほぼ思われる。いずれの場合でも、成熟Ｓ−抗
原コードづけ部と正常な関係の正常なＳ−抗原プロモー
ターの使用はＳ−抗原集合体の有効な表現に貢献すると
見なされ、本発明の予期されない利点を説明するだめの
役に立つことができる。
はほとんどまれである。実験的に同定したプロモーター
は成熟Ｓ−抗原のＩ’１（２−末端アミノ酸のコドンか
ら上に５９２塩基対あるが、ＴＡＴＡＡ様配列は通常上
に２１〜３２塩基対見出される（コルデン、Ｊ８等、サ
イエンス、矛２０９巻、矛１４０６頁（１９８０年））
。成熟Ｓ−抗原が実際に開始翻訳生成物であるならば、
プロモーターからスタートコドンまでの長い距離はＳ−
抗原表現の制御に特別の重要性があることができる。し
かしながら同位相でストップコドンのない長い部位は成
熟Ｓ−抗原に対してコードしている部位のスタートに先
立っている。さらにその上メチオニンスタートコドンは
Ｓ−抗原プロモーターから下に７０塩基対だけこの前の
部位にある。他方Ｓ−抗原プロモーターからの開始翻訳
生成物は２２ ｎｍ Ｓ−抗原粒子のよりなＳ−抗原集
合体の集合において重要な作用−を有することができる
成熟Ｓ−抗原および前配列からなるかなり大きな蛋白資
であるとほぼ思われる。いずれの場合でも、成熟Ｓ−抗
原コードづけ部と正常な関係の正常なＳ−抗原プロモー
ターの使用はＳ−抗原集合体の有効な表現に貢献すると
見なされ、本発明の予期されない利点を説明するだめの
役に立つことができる。
本発明のもう一方の実施態様として成熟Ｓ−抗原とその
プロモーターの間にあるＨＢＶ部は削除され、成熟Ｓ−
抗原コードづけ部のスタートコドンのさらに近くにプロ
モーターを有効に移動する。この点で、削除された部位
のイントロンの存在は除外することができない。従って
もう一方の実施態様は転写後の過程を実施しないある種
の媒介、例えば酵母に有利であることができる。
プロモーターの間にあるＨＢＶ部は削除され、成熟Ｓ−
抗原コードづけ部のスタートコドンのさらに近くにプロ
モーターを有効に移動する。この点で、削除された部位
のイントロンの存在は除外することができない。従って
もう一方の実施態様は転写後の過程を実施しないある種
の媒介、例えば酵母に有利であることができる。
高活性のために、ＨＢＶプロモーターは真核宿主の種々
の蛋白質の高速度の表現に有用である。本発明はＨＢＶ
プロモーターからなる真核表現媒介体を企図するもので
ある一０ＨＢＶプロモーターはそれから下にコードづけ
部の表現速度を変更するために単独でまたはさらに１種
またはそれ以上の真核プロモーターと連絡し合うように
位置することができる。ＨＢＶＳ−抗原およびＨＢＶ核
蛋白質のような蛋白質は記載した媒介を含有する宿主細
胞によって合成される。他の蛋白質、特に成熟形態の合
成が転写後の処理段階を伴う蛋白質は本発明の媒介体を
用いて同様に合成される。
の蛋白質の高速度の表現に有用である。本発明はＨＢＶ
プロモーターからなる真核表現媒介体を企図するもので
ある一０ＨＢＶプロモーターはそれから下にコードづけ
部の表現速度を変更するために単独でまたはさらに１種
またはそれ以上の真核プロモーターと連絡し合うように
位置することができる。ＨＢＶＳ−抗原およびＨＢＶ核
蛋白質のような蛋白質は記載した媒介を含有する宿主細
胞によって合成される。他の蛋白質、特に成熟形態の合
成が転写後の処理段階を伴う蛋白質は本発明の媒介体を
用いて同様に合成される。
次の実施例はＨＢＶプロモーターの同定、ＨＢＹプロモ
ーターからなる適当な媒介体の構成、ＨＢＶプロモータ
ー制御制御台白質の合成および真核宿主細胞内でＨＢＶ
プロモーター制御制御台成されたＳ−抗原からなる肝炎
ワクチンの生産を示すものである。
ーターからなる適当な媒介体の構成、ＨＢＶプロモータ
ー制御制御台白質の合成および真核宿主細胞内でＨＢＶ
プロモーター制御制御台成されたＳ−抗原からなる肝炎
ワクチンの生産を示すものである。
、実施例 １゜
ＨＢＶプロモーターの同定
マンレイ、ＪＬ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ。
ｃｉ。
ＵＳＡ、矛７７巻、矛３８５５頁（１９８０年）に記載
されるＨｅＬａ５３細胞の無細胞抽出物を用いて試験管
内系でＨＢＶ −ＤＮＡの転写を実施した。反応の鋳型
として用いたＤＮＡはプラスミドｐＢａｍ １．８５ま
たはｐＥｃｏ ６５から導入した。前者はＨＢＶ地図（
牙１図参照）に約１．４〜０２の部位に及ぶＢ ａｍＷ
Ｉ部に挿入されたＨＢＹの二つの可能なりａｍＨＩ部分
の大きい方を有するｐＢＲ３２２である。後者はプラス
ミドのＥｃｏＲＩ部に挿入されたＥｃｏ几工部で切断さ
れる完全なＨＢＶゲノムを有するｐｓｔｔ ！＋ ２５
である。両プラスミドの構成は本明細書に引用された同
時係属中の゛出願番号矛１０７，２７ｓ７号に詳細に記
載されている。プラスミドＤＮＡは例えばポリバー、Ｒ
１等、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ ） （Ｒ，Ｗｕ０発行）矛６８巻、矛２４
５頁、アカデミツクプレス、ニューヨーク、Ｎ、Ｙ、（
１９７９年）および力−ン９Ｍ。
されるＨｅＬａ５３細胞の無細胞抽出物を用いて試験管
内系でＨＢＶ −ＤＮＡの転写を実施した。反応の鋳型
として用いたＤＮＡはプラスミドｐＢａｍ １．８５ま
たはｐＥｃｏ ６５から導入した。前者はＨＢＶ地図（
牙１図参照）に約１．４〜０２の部位に及ぶＢ ａｍＷ
Ｉ部に挿入されたＨＢＹの二つの可能なりａｍＨＩ部分
の大きい方を有するｐＢＲ３２２である。後者はプラス
ミドのＥｃｏＲＩ部に挿入されたＥｃｏ几工部で切断さ
れる完全なＨＢＶゲノムを有するｐｓｔｔ ！＋ ２５
である。両プラスミドの構成は本明細書に引用された同
時係属中の゛出願番号矛１０７，２７ｓ７号に詳細に記
載されている。プラスミドＤＮＡは例えばポリバー、Ｒ
１等、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ ） （Ｒ，Ｗｕ０発行）矛６８巻、矛２４
５頁、アカデミツクプレス、ニューヨーク、Ｎ、Ｙ、（
１９７９年）および力−ン９Ｍ。
等、■ｂｉｄ、牙２６８頁に記載される標準的な方法に
よって転換細胞の抽出物から精製した。
よって転換細胞の抽出物から精製した。
ｐＢａｍ １．８５のＤＮＡをさらに下記のように限定
エンドヌクレアーゼで消化により処理し、さらに精製せ
ずに転写反応に用いた。ｐＥｃｏ ６５のＤＮＡ ｆ
Ｂ ｃ ｏＲＩ工、ンドヌクレアーゼで消隼し十分な大
きさのＨＢＶ −ＤＮＡ挿入物を放出した。
エンドヌクレアーゼで消化により処理し、さらに精製せ
ずに転写反応に用いた。ｐＥｃｏ ６５のＤＮＡ ｆ
Ｂ ｃ ｏＲＩ工、ンドヌクレアーゼで消隼し十分な大
きさのＨＢＶ −ＤＮＡ挿入物を放出した。
挿入物を例えばポリバー、 ｐ、、 ５ｕｐｒａ＋また
はサウザン、 Ｅ、、 Ｉｂ１ｄ、牙１５２頁に記載さ
れる標準技術を用いて分取用ゲル電気泳動によって分離
し、ゲルから電気溶離した。。
はサウザン、 Ｅ、、 Ｉｂ１ｄ、牙１５２頁に記載さ
れる標準技術を用いて分取用ゲル電気泳動によって分離
し、ゲルから電気溶離した。。
ＨＢＶ核蛋白質に対してコードしているｍＲＮＡのスタ
ート部位を決定するために次のＤＮＡ、鋳型を試験した
。Ｈｉｎｃｆｆによって切断されたｐＢａｎｌ、 ８５
（’ＥｃｏＲＩ部からＨＢＶ塩基を数える系による塩
基１６８５で）、ＢｓｔＥＩｌによって切断されたｐＢ
ａｍ １８５ （塩基２８２４）、Ｂａ１ｌによって切
断されたｐＢａｍ １．８５ （塩基６０１０で）およ
びＥｃｏＲＩによって切断されたＨＢＶ’−ＤＮＡ （
塩基１で）。（同時係属出願の出願番号子１０７，２ｉ
Ｓ７号に開示したものと配列数を比較して、塩基を数え
る開始点が同じでなかったことに注意。従ってこの場合
、塩基数１は出願番号オ１０７，２６７号出願の塩基数
１４０８に相当する。ン近似地図位置は牙１図を参照し
て見ることができる。
ート部位を決定するために次のＤＮＡ、鋳型を試験した
。Ｈｉｎｃｆｆによって切断されたｐＢａｎｌ、 ８５
（’ＥｃｏＲＩ部からＨＢＶ塩基を数える系による塩
基１６８５で）、ＢｓｔＥＩｌによって切断されたｐＢ
ａｍ １８５ （塩基２８２４）、Ｂａ１ｌによって切
断されたｐＢａｍ １．８５ （塩基６０１０で）およ
びＥｃｏＲＩによって切断されたＨＢＶ’−ＤＮＡ （
塩基１で）。（同時係属出願の出願番号子１０７，２ｉ
Ｓ７号に開示したものと配列数を比較して、塩基を数え
る開始点が同じでなかったことに注意。従ってこの場合
、塩基数１は出願番号オ１０７，２６７号出願の塩基数
１４０８に相当する。ン近似地図位置は牙１図を参照し
て見ることができる。
核蛋白質遺伝子の場合には、可能なホグネスーボックス
を、ｔ−１図において三角にほとんど位置している塩基
１６５４で同定した。前に記載した制限エンドヌクレア
ーゼカット鋳型ＤＮＡを用いて塩基１６５４近くで開始
した転写は次の予期した大きさのＲＮＡ生成物を生成し
た。
を、ｔ−１図において三角にほとんど位置している塩基
１６５４で同定した。前に記載した制限エンドヌクレア
ーゼカット鋳型ＤＮＡを用いて塩基１６５４近くで開始
した転写は次の予期した大きさのＲＮＡ生成物を生成し
た。
Ｈｉｎｃ Ｉｔ ３塩基ＢｓｔＥ［ｉ
１１４２塩基ＢａｊＮ １５２
８塩基 ＥｃｏＲｒ １５３９塩基 試験管内転写反応は上のマンレイ、Ｊ、Ｌ、等によって
記載されるように実施した。反応混合物にはＣ＠−Ｐ）
ＧＴＰ、（４０００ｉ／記モル）ＡＴＰ、 Ｃ！ＴＰ、
およびＴＴＰ、 ＲＮＡポリメラーゼ■を含有するＨｅ
Ｌａ Ｃｅ１ｌＳ ５抽出物およびＨＢＶ鋳型ＤＮＡを
含有した。６０Ｃで６ｏ分培養後、ＲＮＡ生成物をフェ
ノール／クロロホルムで反応混合物から抽出し、エタノ
ールを沈殿し、再溶解してマ牛サム、Ａｏ等、酵素学の
方法、２６５巻（Ｌ、グロスマンおよびにモルダン、発
行ン矛４９９頁によって記載される５％アトＮ−。
１１４２塩基ＢａｊＮ １５２
８塩基 ＥｃｏＲｒ １５３９塩基 試験管内転写反応は上のマンレイ、Ｊ、Ｌ、等によって
記載されるように実施した。反応混合物にはＣ＠−Ｐ）
ＧＴＰ、（４０００ｉ／記モル）ＡＴＰ、 Ｃ！ＴＰ、
およびＴＴＰ、 ＲＮＡポリメラーゼ■を含有するＨｅ
Ｌａ Ｃｅ１ｌＳ ５抽出物およびＨＢＶ鋳型ＤＮＡを
含有した。６０Ｃで６ｏ分培養後、ＲＮＡ生成物をフェ
ノール／クロロホルムで反応混合物から抽出し、エタノ
ールを沈殿し、再溶解してマ牛サム、Ａｏ等、酵素学の
方法、２６５巻（Ｌ、グロスマンおよびにモルダン、発
行ン矛４９９頁によって記載される５％アトＮ−。
クリルアミド−尿素ゲルの電気泳動法で分析した。ゲル
を約５０〜１５００塩基の長さの範囲の几ＮＡ分子に溶
解した。ＲＮＡ転写が指示された鋳型ＤＮＡを用いて次
の大きさを有することを見出した。
を約５０〜１５００塩基の長さの範囲の几ＮＡ分子に溶
解した。ＲＮＡ転写が指示された鋳型ＤＮＡを用いて次
の大きさを有することを見出した。
Ｈｉｎｃｌｌ （検出されない）ＢｓｔＥ
、Ｉｌ １１００塩基Ｂａ／ Ｉ
１ろ５０塩基 ＥｃｏＲＩ １６００塩基 結果は塩基１６５４で開始するホグネスボックス近くで
ｍＲＮＡ合成の開始を示す。塩基１６５２からＨＢＶ
−ＤＮＡのヌクレオチド配列はＴＡＱＡ’Ｉ駄Ｇである
。
、Ｉｌ １１００塩基Ｂａ／ Ｉ
１ろ５０塩基 ＥｃｏＲＩ １６００塩基 結果は塩基１６５４で開始するホグネスボックス近くで
ｍＲＮＡ合成の開始を示す。塩基１６５２からＨＢＶ
−ＤＮＡのヌクレオチド配列はＴＡＱＡ’Ｉ駄Ｇである
。
Ｓ−抗原プロモーターを同系列の試験管内の転写実験に
よって実験的に決定した。塩基２７８５で可能なホグネ
スボックスー配列が言及されたが、成熟Ｓ−抗原コード
づけ部のスタートからかなりさかのぼって位置している
。
よって実験的に決定した。塩基２７８５で可能なホグネ
スボックスー配列が言及されたが、成熟Ｓ−抗原コード
づけ部のスタートからかなりさかのぼって位置している
。
これらの実験に用いた鋳型ＤＮＡ ＦｉＢｓｔＥ １１
エンドヌクレアーゼで切断されたｐＢａｍ １．８
５ （塩基２８２４）、Ｂａｇ Ｉエンドヌクレアーゼ
で切断されたｐＢａｍ １．８５ （塩基３０１０ン、
Ｈｉｎｃｌｌエンドヌクレアーゼで切断されたｐＢａｍ
’１．８５（塩基３２１０）、ＥｃｏＲＩで切断され
たＨＢＶ−ＤＮＡ （塩基１）およびＢａｍ）［エンド
ヌクレアーゼで切断されたｐＢａｍ １．８５ （塩基
３１）であった。塩基２７８５近くで開始した転写は指
示した制限エンドヌクレアーゼによって切断された鋳型
ＤＮＡを用いて次の予期されたＲＮＡ生成物を生成した
。
エンドヌクレアーゼで切断されたｐＢａｍ １．８
５ （塩基２８２４）、Ｂａｇ Ｉエンドヌクレアーゼ
で切断されたｐＢａｍ １．８５ （塩基３０１０ン、
Ｈｉｎｃｌｌエンドヌクレアーゼで切断されたｐＢａｍ
’１．８５（塩基３２１０）、ＥｃｏＲＩで切断され
たＨＢＶ−ＤＮＡ （塩基１）およびＢａｍ）［エンド
ヌクレアーゼで切断されたｐＢａｍ １．８５ （塩基
３１）であった。塩基２７８５近くで開始した転写は指
示した制限エンドヌクレアーゼによって切断された鋳型
ＤＮＡを用いて次の予期されたＲＮＡ生成物を生成した
。
ＢｓｔＥＩｌ ８塩基
Ｂａ１ｌ １９４塩基
Ｈｉｎａｌｌ ３０４塩基ＥｃｏＲＪ
４０５塩基 ＢａｍＨＩ ４５６塩基 試験管内の反応を核蛋白質に対して記載したように実施
した。指示した制限エンドヌクレオアーゼによって切断
されたＤＮＡを用いて、生成ＲＮ’Ａ転写は次の実測サ
イズからなっていた。
４０５塩基 ＢａｍＨＩ ４５６塩基 試験管内の反応を核蛋白質に対して記載したように実施
した。指示した制限エンドヌクレオアーゼによって切断
されたＤＮＡを用いて、生成ＲＮ’Ａ転写は次の実測サ
イズからなっていた。
ＢｓｔＥＩｌ 検出されないＢａ１Ｊ
Ｉ’ ２［１［１塩基Ｈｉｎｃｆｆ
３ｔｏ塩基ＥｃｏＲＩ ４１０塩
基 ＢａｍＨＩ ４４０塩基 ＤＮＡを切断したＢｓｔＥＩ［に対するデータはｐＥｃ
ｏ ６３から精製したＩ−ＩＢＹ −ＤＮＡを切断した
１３ｓ ｔＥｌｌを用いて確認した。さらに４６０およ
び４９０塩基のＲＮＡバンドはＤＮＡを処理したＥ ｃ
ｏ ＲＩおよびＢａｍ１旧で各々実測された。結果は
塩基２７８５近くでＳ−抗原プロモーターの位置を確認
する。塩基２７８３からのＨＢＶ−ＤＮＡヌクレオチド
配列はＴＡＴＡＴＡＡである。
Ｉ’ ２［１［１塩基Ｈｉｎｃｆｆ
３ｔｏ塩基ＥｃｏＲＩ ４１０塩
基 ＢａｍＨＩ ４４０塩基 ＤＮＡを切断したＢｓｔＥＩ［に対するデータはｐＥｃ
ｏ ６３から精製したＩ−ＩＢＹ −ＤＮＡを切断した
１３ｓ ｔＥｌｌを用いて確認した。さらに４６０およ
び４９０塩基のＲＮＡバンドはＤＮＡを処理したＥ ｃ
ｏ ＲＩおよびＢａｍ１旧で各々実測された。結果は
塩基２７８５近くでＳ−抗原プロモーターの位置を確認
する。塩基２７８３からのＨＢＶ−ＤＮＡヌクレオチド
配列はＴＡＴＡＴＡＡである。
ｍ ＲＮ Ａ合成の実際の開始部位は最初に予測された
もの上に約６０塩基を置くことができるが、プロモータ
ーの位置はこれらの実験によって明瞭に同定する。
もの上に約６０塩基を置くことができるが、プロモータ
ーの位置はこれらの実験によって明瞭に同定する。
いずれかのＨＢＶプロモーターの制御下で生成したＲＮ
Ａ０量をアデノウィルス後期プロモーター、公知の高活
性プロモーターの制御下で同じ系で合成した量と比較し
た。ＲＮＡに組う２ み入れられた〔α−Ｐ ） −ＧＴＰ量はゲル電気泳動
プレートの自動レントゲン写真の密度によって評価した
。ＨＢＹプロモーターはアデノウィルスプロモーターと
放射能の比較できる混入を生じる。従ってＨＢＶプロモ
ーターはｍＲＮＡの合成を促進するにあたりそれ自体非
常に活性である。
Ａ０量をアデノウィルス後期プロモーター、公知の高活
性プロモーターの制御下で同じ系で合成した量と比較し
た。ＲＮＡに組う２ み入れられた〔α−Ｐ ） −ＧＴＰ量はゲル電気泳動
プレートの自動レントゲン写真の密度によって評価した
。ＨＢＹプロモーターはアデノウィルスプロモーターと
放射能の比較できる混入を生じる。従ってＨＢＶプロモ
ーターはｍＲＮＡの合成を促進するにあたりそれ自体非
常に活性である。
実施例 ２゜
ＨＢＶプロモーターからなる表現媒介体の構成
次の実験において全制限酵素消化をニューシーラントビ
オラプス、ベバーリー、マサチュセッッの製造業者によ
って推薦される条件下で実施した。制限エンドヌクレア
ーゼ活性の単位をここでは１時間３７ＣにおいてＤＮＡ
１ μｇ中の全感受部位を完全に加水分解するために必
要な酵素量として定義する。完全な消化に対して反応混
合物はＤＮＡ １ μｇ当り１単位酵素を含有する。Ｈ
ｐａｌでの部分消化に対して０．２５単位／μｇ ＤＮ
Ａを使用し、Ｂ ａｍＨ１での部分消化に対して０５単
位／μｇ ＤＮＡを使用した。酵素の全バッチをその活
性の目盛を定めるために個別に検定した。ＤＮＡリガー
ゼによって触媒作用を及ぼしだ結紮反応を例えば上記ポ
リバー、Ｆｏ等によって記載されるような標準方法で実
施した。媒介体構成段階の配列を矛２図で図示しだ。二
つの媒介をあるものは５Ｖ−４０後期プロモーターと連
絡し合うＨＢＶプロモーターを有し、他のものは反対の
方向に二つのプロモーターを有する）（ＢＶ Ｓ−抗原
プロモーターを用いて構成した。前者はＩ）ＨＢＶ −
ＨＶＳ”、後者はｐＥｓＶ −ＨＶＳ−を消化した。
オラプス、ベバーリー、マサチュセッッの製造業者によ
って推薦される条件下で実施した。制限エンドヌクレア
ーゼ活性の単位をここでは１時間３７ＣにおいてＤＮＡ
１ μｇ中の全感受部位を完全に加水分解するために必
要な酵素量として定義する。完全な消化に対して反応混
合物はＤＮＡ １ μｇ当り１単位酵素を含有する。Ｈ
ｐａｌでの部分消化に対して０．２５単位／μｇ ＤＮ
Ａを使用し、Ｂ ａｍＨ１での部分消化に対して０５単
位／μｇ ＤＮＡを使用した。酵素の全バッチをその活
性の目盛を定めるために個別に検定した。ＤＮＡリガー
ゼによって触媒作用を及ぼしだ結紮反応を例えば上記ポ
リバー、Ｆｏ等によって記載されるような標準方法で実
施した。媒介体構成段階の配列を矛２図で図示しだ。二
つの媒介をあるものは５Ｖ−４０後期プロモーターと連
絡し合うＨＢＶプロモーターを有し、他のものは反対の
方向に二つのプロモーターを有する）（ＢＶ Ｓ−抗原
プロモーターを用いて構成した。前者はＩ）ＨＢＶ −
ＨＶＳ”、後者はｐＥｓＶ −ＨＶＳ−を消化した。
両方の構成の目的に対してｐＥｃｏ ６３２０μｇがＢ
ｇｌ ＩＩおよびＨｐａ７ルミ７エンドヌクレアーゼし
た。Ｓ−抗原コード七は部を包含するｐｎ几３２５およ
びＨＢＶ配列を含有する大きなフラグメントを本質的に
上記で述べた分取用ゲル電気泳動によって精製した。
ｇｌ ＩＩおよびＨｐａ７ルミ７エンドヌクレアーゼし
た。Ｓ−抗原コード七は部を包含するｐｎ几３２５およ
びＨＢＶ配列を含有する大きなフラグメントを本質的に
上記で述べた分取用ゲル電気泳動によって精製した。
ｐＥｓｖ −ＨＶＳ−（Ｄ構成に対してＳＶ−４０ＤＮ
Ａ２０μｇをＨｐａｌ エンドヌクレアーゼで部分消化
し、次にＢａｍ）（Ｉエンドヌクレアーゼで消化した。
Ａ２０μｇをＨｐａｌ エンドヌクレアーゼで部分消化
し、次にＢａｍ）（Ｉエンドヌクレアーゼで消化した。
８Ｖ −４，０地図上０７６のＨｐａ １部位から０１
４でＢ ａｍＨ１部位までに及ぶ所望の生成物を分取用
ゲル電気泳動によって精製した。
４でＢ ａｍＨ１部位までに及ぶ所望の生成物を分取用
ゲル電気泳動によって精製した。
生成した５Ｖ−４０およびｐＥｃｏ ６３フラグメント
をＤＮＡリガーゼ接触作用反応で組み換えた。各プラス
ミドのＢ ａｍＨＩおよびＢｈｌ ＩＩｌ生成末端単線
雄性および自己相補性従って付着性であり、特異的に連
結する。制限エンドヌクレアーゼの記述としてロベルッ
、Ｒ２酵素学の方法、矛６８巻（ＲｏＷｕ、発行）牙２
７頁参照。Ｈｐａ ｌ生成末端は鈍である。必然的に二
つのフラグメントは自己結紮できず、互いに一方向に組
み換えるだけである。
をＤＮＡリガーゼ接触作用反応で組み換えた。各プラス
ミドのＢ ａｍＨＩおよびＢｈｌ ＩＩｌ生成末端単線
雄性および自己相補性従って付着性であり、特異的に連
結する。制限エンドヌクレアーゼの記述としてロベルッ
、Ｒ２酵素学の方法、矛６８巻（ＲｏＷｕ、発行）牙２
７頁参照。Ｈｐａ ｌ生成末端は鈍である。必然的に二
つのフラグメントは自己結紮できず、互いに一方向に組
み換えるだけである。
組み換えｐｉｃｏ ６３／ ＳＶ−４０プラスミドを例
えば上記でポリバー、等によって記載され。
えば上記でポリバー、等によって記載され。
た標準転換技術によってアムビシリンー感受性大腸菌株
を転換するために用いた。約１０゜アムピシリンー耐性
集落が組み換えｐＥｃｏ ６３／５Ｖ−４０ＤＮＡへ１
μｇから得られた。次に集落を試験としてＳＶ −４０
ＤＮＡを用いて実質的にグルンステイン１Ｍ０等酵素学
の方法、矛６８巻（Ｒ０Ｗｕ０発行）牙３７９頁によシ
記載されるハイブリッド形成によって試験した。約２５
集落がＳＶ −４０配列を含有し、プラスミドＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼ開裂およびゲル電気泳動によ
ってさらに試験するためにこれらのいくつかから分離し
て予測した大きさおよび数の７ラグメントの存在を決定
した。
を転換するために用いた。約１０゜アムピシリンー耐性
集落が組み換えｐＥｃｏ ６３／５Ｖ−４０ＤＮＡへ１
μｇから得られた。次に集落を試験としてＳＶ −４０
ＤＮＡを用いて実質的にグルンステイン１Ｍ０等酵素学
の方法、矛６８巻（Ｒ０Ｗｕ０発行）牙３７９頁によシ
記載されるハイブリッド形成によって試験した。約２５
集落がＳＶ −４０配列を含有し、プラスミドＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼ開裂およびゲル電気泳動によ
ってさらに試験するためにこれらのいくつかから分離し
て予測した大きさおよび数の７ラグメントの存在を決定
した。
これらの分離物の約５０％が子分であることがわかった
。
。
選択されたｐＥｃｏ６５−５Ｖ−４０組み換えプラスミ
ドを精製し、ＥｃｏＲｒエンドヌクレアーゼで消化して
ｐＢ几３２５ ＤＮＡを除去した。次に生成物を自己結
紮した。この段階が矛２図に示したように未中断Ｓ−抗
原コードづけ部の回復を生じた。ＨＢＶプロモーターお
よび５ｖ−４０プロモーターは反対方向にあった。生成
した媒介体をｐＥｓＶ−ＨＶＳ−と系した。
ドを精製し、ＥｃｏＲｒエンドヌクレアーゼで消化して
ｐＢ几３２５ ＤＮＡを除去した。次に生成物を自己結
紮した。この段階が矛２図に示したように未中断Ｓ−抗
原コードづけ部の回復を生じた。ＨＢＶプロモーターお
よび５ｖ−４０プロモーターは反対方向にあった。生成
した媒介体をｐＥｓＶ−ＨＶＳ−と系した。
ｐＥｓＶ −ＨＶＳ−媒介を複製−不完全な５Ｖ−４０
変異菌と共にサルのＣＶ −１細胞を同時トランスフェ
クトし、熱感応性変異菌ｔｌｌＡ５Ｂまたは欠損変異菌
ｔｓＡ を使用したが後者が好適である。増殖性感染
は両ＤＮＡ （同時トランスフェクトしたってトランス
フェクトしたｃｖ−１細胞にだけ生じることができた。
変異菌と共にサルのＣＶ −１細胞を同時トランスフェ
クトし、熱感応性変異菌ｔｌｌＡ５Ｂまたは欠損変異菌
ｔｓＡ を使用したが後者が好適である。増殖性感染
は両ＤＮＡ （同時トランスフェクトしたってトランス
フェクトしたｃｖ−１細胞にだけ生じることができた。
ウィルス株を同時トランスフェクトされた細胞のシング
ル斑分離物から調製した。株は５Ｖ−４０（ｐＥＳＶ
−ＨＶＳ ）およびＳＶ−４０ｔｓｋ” （または使用
したヘルパー細胞に依存するＳ’Ｖ−４０ｔｓＡｓ８の
混合物であった。
ル斑分離物から調製した。株は５Ｖ−４０（ｐＥＳＶ
−ＨＶＳ ）およびＳＶ−４０ｔｓｋ” （または使用
したヘルパー細胞に依存するＳ’Ｖ−４０ｔｓＡｓ８の
混合物であった。
ウィルス株の組成はサウザンハイブリッド形成技術によ
って確かめた（サウザン、Ｅ０Ｍ、。
って確かめた（サウザン、Ｅ０Ｍ、。
Ｊ、ＭＯｌ、 Ｂｉｏ４．矛９８巻、矛５０３頁（１９
７５年））。
７５年））。
０増殖およびトランスフェクションは例えばマイエルス
、 ＲＯＭ１等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、 Ａｃｏｄ。
、 ＲＯＭ１等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、 Ａｃｏｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ矛７７巻、矛６４９１頁（１９８０年〕
に記載され゛る。
に記載され゛る。
記載した通り調製したウィルス株で同時感染して６日後
、遊離ＤＮＡをハート、 Ｂ、、 Ｊ、 Ｍｏ／。
、遊離ＤＮＡをハート、 Ｂ、、 Ｊ、 Ｍｏ／。
ＢｉｏＡ！、矛９８巻、矛５０３頁（１９６７年〕の方
法によって感染した細胞から抽出した。
法によって感染した細胞から抽出した。
ＤＮＡを１．４％アガロースゲルの電気泳動にかけ、上
記サウザン、 Ｅ、 Ｍ、にょって記載されるようにニ
トロセルロースフィルターに移した。５２ｐ−標示すれ
りＨＢＶ −ＤＮＡまたは５ｖ−４０ＤＮＡへのハイブ
リッド形成は電気泳動後の５Ｖ−４０およびＨＢＶ Ｄ
ＮＡ配列の位置を表わした。５Ｖ−４０の試験でｔｓＡ
” （またはｔｓＡ５８）ヘルパーと組み換えＥｓｖ
−ＨＶＳ−の二つのＤＮＡバンドが見出された。ＨＢＶ
−ＤＮＡ試験は組み換えＤＮＡバンドにのみ交雑した
。試験は株、ヘルパーおよび組み換え体中二つの別個の
ウィルス型の存在を示した。
記サウザン、 Ｅ、 Ｍ、にょって記載されるようにニ
トロセルロースフィルターに移した。５２ｐ−標示すれ
りＨＢＶ −ＤＮＡまたは５ｖ−４０ＤＮＡへのハイブ
リッド形成は電気泳動後の５Ｖ−４０およびＨＢＶ Ｄ
ＮＡ配列の位置を表わした。５Ｖ−４０の試験でｔｓＡ
” （またはｔｓＡ５８）ヘルパーと組み換えＥｓｖ
−ＨＶＳ−の二つのＤＮＡバンドが見出された。ＨＢＶ
−ＤＮＡ試験は組み換えＤＮＡバンドにのみ交雑した
。試験は株、ヘルパーおよび組み換え体中二つの別個の
ウィルス型の存在を示した。
ｐＥｓＶ −ＨＶＳ＋の構成 この構成に対して上述し
たＢｇＡ ＩＩおよびＨｐａｌルミｌエンドヌクレアー
ゼしたｐＥｃｏ ６３ を使用した。８Ｖ −４０ＤＮ
Ａ、 ２０μｇをＨｐａ ｌ［エンドヌクレアーゼで消
化して５Ｖ−４０地図上０．７２でＤＮＡを切断した。
たＢｇＡ ＩＩおよびＨｐａｌルミｌエンドヌクレアー
ゼしたｐＥｃｏ ６３ を使用した。８Ｖ −４０ＤＮ
Ａ、 ２０μｇをＨｐａ ｌ［エンドヌクレアーゼで消
化して５Ｖ−４０地図上０．７２でＤＮＡを切断した。
線状ＤＮＡを次に８１ヌクレアーゼおよびＤＮＡポリメ
ラーゼで例えば上記のポリバー。
ラーゼで例えば上記のポリバー。
Ｆ等による記載の通り処理して鈍い末端を生成した。鈍
い末端を次にグツドマン、 Ｈ，Ｍ。
い末端を次にグツドマン、 Ｈ，Ｍ。
等、１ｂｉｄ、牙７５頁のように記載される通り、標準
技術によってコラボラティブリサーチ、゛Ｉｎｃ、ウオ
ルサム、マサチュセッッから市販で入手し得る合成りａ
ｍＨＩオリゴヌクレオチド連鎖（ロススティン、Ｒ，Ｊ
０等酵素学の方法、矛６８巻（Ｒ０Ｗｕ０発行）矛９８
頁参照）に付着させた。線状ＤＮＡを次にＨｐａｌ エ
ンドヌクレアーゼで部分消化し、次にＢ ａｍＨＩエン
ドヌクレアーゼで消化した。０．７２地図単位のＨｐａ
ｉ１部位から０．１７地図単位のＨｐａ１部位まで２．
８ｋｂの所望のフラグメントをゲル電気泳動によって精
製し、上記で記載した通りＢｇｌＩＩ／Ｈｐａｌ−切断
ｐＥｃｏ ６５で組み換えた。アムビシリン耐性被転換
体の選択および組み換えプラスミツドの特徴は上記で記
載した通り実施した工それによって得られたｐｉｃｏ
６５ ／５Ｖ−４０組み換えプラスミドをＥｃｏＲ１エ
ンドヌクレアーゼで処理してｐＢ几６２５配列を除去し
、ＨＢＶ Ｓ−抗原遺伝子を再構成した。
技術によってコラボラティブリサーチ、゛Ｉｎｃ、ウオ
ルサム、マサチュセッッから市販で入手し得る合成りａ
ｍＨＩオリゴヌクレオチド連鎖（ロススティン、Ｒ，Ｊ
０等酵素学の方法、矛６８巻（Ｒ０Ｗｕ０発行）矛９８
頁参照）に付着させた。線状ＤＮＡを次にＨｐａｌ エ
ンドヌクレアーゼで部分消化し、次にＢ ａｍＨＩエン
ドヌクレアーゼで消化した。０．７２地図単位のＨｐａ
ｉ１部位から０．１７地図単位のＨｐａ１部位まで２．
８ｋｂの所望のフラグメントをゲル電気泳動によって精
製し、上記で記載した通りＢｇｌＩＩ／Ｈｐａｌ−切断
ｐＥｃｏ ６５で組み換えた。アムビシリン耐性被転換
体の選択および組み換えプラスミツドの特徴は上記で記
載した通り実施した工それによって得られたｐｉｃｏ
６５ ／５Ｖ−４０組み換えプラスミドをＥｃｏＲ１エ
ンドヌクレアーゼで処理してｐＢ几６２５配列を除去し
、ＨＢＶ Ｓ−抗原遺伝子を再構成した。
ｐＥｓＶ −Ｊ（ＶＳ＋と示される生成媒介体は牙２図
に図示されるようにＩ（ＢＹ Ｓ−抗原と連絡；−７合
うように方向づけられたＳＶ −４０後期プロモーター
を有した。ＳＶ−４０（ｐＥＳＶ −ＨＶＳ ）から
なるウィルス株を上記の通りヘルパーＤＮＡで同時トラ
ンスフェクションによってまたはヘルパーウィルスで同
時感染によって増殖した。
に図示されるようにＩ（ＢＹ Ｓ−抗原と連絡；−７合
うように方向づけられたＳＶ −４０後期プロモーター
を有した。ＳＶ−４０（ｐＥＳＶ −ＨＶＳ ）から
なるウィルス株を上記の通りヘルパーＤＮＡで同時トラ
ンスフェクションによってまたはヘルパーウィルスで同
時感染によって増殖した。
体の構成 ５Ｖ−４０および核蛋白質プロモーターのタ
ンデムおよび反対方向を有する５ｖ−４０媒介の構成に
対する一般方法を牙ろ図に図示する。使用した技術およ
び操作は本質的に既に述べた方法であった。
ンデムおよび反対方向を有する５ｖ−４０媒介の構成に
対する一般方法を牙ろ図に図示する。使用した技術およ
び操作は本質的に既に述べた方法であった。
ＳＶ −４０Ｄ、ＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨａｅ
ｌで地図単位０．８２で切断した。線状ＤＮＡを８１ヌ
クレアーゼおよびＩ）ＮＡポリメラーゼ■で処理して合
成り ａｍＩ（Ｉオしりゴヌクレオチド連鎖が結紮によ
って付着される鈍い末端を生じた。次にＤＮＡをＢ ａ
ｍＷ Ｉエンドヌクレアーゼ（地図単位０１４で）で
切断し、ゲル電気泳動によって精製した大きなフラグメ
ント（０１４〜０．８２に及ぶ）を製造した。次にフラ
グメントをプラスミドｐＢＲ５２２のＢａｍ１旧部位で
挿入した。生成組み換え体をＥ−８Ｖと示し、５Ｖ−４
０複製および機能Ａ遺伝子（ＳＶ−４０複製に要求され
る〕の源泉を含有した。ｐＥｃ。
ｌで地図単位０．８２で切断した。線状ＤＮＡを８１ヌ
クレアーゼおよびＩ）ＮＡポリメラーゼ■で処理して合
成り ａｍＩ（Ｉオしりゴヌクレオチド連鎖が結紮によ
って付着される鈍い末端を生じた。次にＤＮＡをＢ ａ
ｍＷ Ｉエンドヌクレアーゼ（地図単位０１４で）で
切断し、ゲル電気泳動によって精製した大きなフラグメ
ント（０１４〜０．８２に及ぶ）を製造した。次にフラ
グメントをプラスミドｐＢＲ５２２のＢａｍ１旧部位で
挿入した。生成組み換え体をＥ−８Ｖと示し、５Ｖ−４
０複製および機能Ａ遺伝子（ＳＶ−４０複製に要求され
る〕の源泉を含有した。ｐＥｃ。
６３で精製したＢ ａｒｒＪ（ＩフラグメントをｐＢ几
６２２のＢ ａｒｒＪ（＋に挿入した。二つのＢ ａｍ
ＨＩフラグメントがｐＥｃｏ ６５の開裂によって生じ
た。核蛋白質遺伝子を含有する大きいフラグメントおよ
びｐＢＲ２２２の短いセグメントをｐＢＲ，５２２のＢ
ａ＋ｎＨ１部位に挿入する前に分取用ゲル電気泳動に
よって精製した。−生成組み換え体をＥ−ＨＶＣと表示
した。プラスミドＥ−８ＶおよびＥ −’ＨＶＯを犬」
模で（各２０μｇ）調製した。
６２２のＢ ａｒｒＪ（＋に挿入した。二つのＢ ａｍ
ＨＩフラグメントがｐＥｃｏ ６５の開裂によって生じ
た。核蛋白質遺伝子を含有する大きいフラグメントおよ
びｐＢＲ２２２の短いセグメントをｐＢＲ，５２２のＢ
ａ＋ｎＨ１部位に挿入する前に分取用ゲル電気泳動に
よって精製した。−生成組み換え体をＥ−ＨＶＣと表示
した。プラスミドＥ−８ＶおよびＥ −’ＨＶＯを犬」
模で（各２０μｇ）調製した。
プラスミドをＢ ａｒｒ＋ＨＩで各々処理して各々５ｖ
−４０およびＨＢＶ配列を放出した。次に各配列をＤＮ
Ａ−リガーゼ接触反応で互いに組み換えた。５Ｖ−４０
配列に相関するＨＢＶ配列に対して二つの可能な方向が
ＨＢＶ核蛋白質プロモーターと各々反対におよび連絡し
合うように方向づけられた５Ｖ−４０プロモーターを有
する二つの組み換え体、ＥＳＶ −ＨＶＣ！−およびＥ
ＳＶ−ＨＶＣ＋を生成した。ＥＳｖ−ＨＶＣ−およびＥ
ＳＶ−ＨＶＯ＋はゲル電気泳動で認められる各媒介から
制限フラグメントの独特の一組を生じるように５Ｖ−４
０およびＩ（ＢＹ配列に非対称的に位置した部位を有す
る制限エンドヌクレアーゼで切断することによって区別
した。
−４０およびＨＢＶ配列を放出した。次に各配列をＤＮ
Ａ−リガーゼ接触反応で互いに組み換えた。５Ｖ−４０
配列に相関するＨＢＶ配列に対して二つの可能な方向が
ＨＢＶ核蛋白質プロモーターと各々反対におよび連絡し
合うように方向づけられた５Ｖ−４０プロモーターを有
する二つの組み換え体、ＥＳＶ −ＨＶＣ！−およびＥ
ＳＶ−ＨＶＣ＋を生成した。ＥＳｖ−ＨＶＣ−およびＥ
ＳＶ−ＨＶＯ＋はゲル電気泳動で認められる各媒介から
制限フラグメントの独特の一組を生じるように５Ｖ−４
０およびＩ（ＢＹ配列に非対称的に位置した部位を有す
る制限エンドヌクレアーゼで切断することによって区別
した。
実施例 ６゜
ＨＢＶ ｍＲＮＡ ）合成を全部で４）（ＩＤｓｖ−４
０ＨＢＶ組み換えウィルス、ＳＶ−４０（ｐＥｓＶ −
１ｔｖｓ″′）、ＳＶ−４０（ｐＥｓｖ −１（ＶＳ
） 、ＳＶ−４０（ｐｇｓｖ −ＨＶＯ−） オよびＳ
Ｖ−４０（ｐｇｓｖ −ＨＶＯ）を用いて試験した。サ
ルのＣＶ −１細胞をヘルパーとしてＳＶ−４０ｔｓＡ
５８と混合した上のウィルスの一つで感染させた。４０
Ｃで６日後細胞質ＲＮＡを分離し、変性しそして１５％
アガロースメチル−水銀ゲルの電気泳動で分画しそして
アルウィン、Ｊ、Ｃ０等、酵素学の方法１．！６８巻（
Ｒ，Ｗｕ０発行）、ｌ’２２０頁に記載される通り放射
線標示試験ＤＮＡに対するハイブリッド形成用のジアゾ
化ベンジルオ牛ジメチル紙に移した。几ＮＡを刻み目−
翻訳５２ｐ−標示ＨＢＶ −ＤＮＡまたはＳＶ −４０
ＤＮＡでハイブリッドを形成しオートラジオグラフィー
でゲル中の８Ｖ−４０およびＨＩ３Ｖ ＲＮＡ ノ位置
を表わした。５Ｖ−４０試験で１９８およびｉ ６ Ｓ
ＳＶ−４０ｍＲＮＡに相当する二つの几ＮＡバンドが
見られた。ＨＢＶ試験は少なくとも二つのｍＲＮＡを発
見し、その一つは核遺伝子転写であり、一つはＳ−抗原
転写であった。Ｓ−抗原および核蛋白質の合成は５５ｓ
−システィンで６時間を標示した４つの組み換えウィル
スの各一つで感染したサルのｃｖ−ｉ細胞内に発見する
。ホルムアルデヒド処理黄色ブドウ球菌を用いてＳ−抗
原および核蛋白質の各々に特異抗体をもつＳ−抗原およ
び核蛋白質が細胞性蛋白質留分および培地から免疫沈降
し、マーシャル、Ｊ、Ａｏ等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
０ＨＢＶ組み換えウィルス、ＳＶ−４０（ｐＥｓＶ −
１ｔｖｓ″′）、ＳＶ−４０（ｐＥｓｖ −１（ＶＳ
） 、ＳＶ−４０（ｐｇｓｖ −ＨＶＯ−） オよびＳ
Ｖ−４０（ｐｇｓｖ −ＨＶＯ）を用いて試験した。サ
ルのＣＶ −１細胞をヘルパーとしてＳＶ−４０ｔｓＡ
５８と混合した上のウィルスの一つで感染させた。４０
Ｃで６日後細胞質ＲＮＡを分離し、変性しそして１５％
アガロースメチル−水銀ゲルの電気泳動で分画しそして
アルウィン、Ｊ、Ｃ０等、酵素学の方法１．！６８巻（
Ｒ，Ｗｕ０発行）、ｌ’２２０頁に記載される通り放射
線標示試験ＤＮＡに対するハイブリッド形成用のジアゾ
化ベンジルオ牛ジメチル紙に移した。几ＮＡを刻み目−
翻訳５２ｐ−標示ＨＢＶ −ＤＮＡまたはＳＶ −４０
ＤＮＡでハイブリッドを形成しオートラジオグラフィー
でゲル中の８Ｖ−４０およびＨＩ３Ｖ ＲＮＡ ノ位置
を表わした。５Ｖ−４０試験で１９８およびｉ ６ Ｓ
ＳＶ−４０ｍＲＮＡに相当する二つの几ＮＡバンドが
見られた。ＨＢＶ試験は少なくとも二つのｍＲＮＡを発
見し、その一つは核遺伝子転写であり、一つはＳ−抗原
転写であった。Ｓ−抗原および核蛋白質の合成は５５ｓ
−システィンで６時間を標示した４つの組み換えウィル
スの各一つで感染したサルのｃｖ−ｉ細胞内に発見する
。ホルムアルデヒド処理黄色ブドウ球菌を用いてＳ−抗
原および核蛋白質の各々に特異抗体をもつＳ−抗原およ
び核蛋白質が細胞性蛋白質留分および培地から免疫沈降
し、マーシャル、Ｊ、Ａｏ等、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、 牙７４巻、牙１８１６頁（１９７７年〕に
゛よって記載される通り抗原−抗体複合体を収集する。
゛よって記載される通り抗原−抗体複合体を収集する。
Ｓ−抗原は感染細胞および培地の両方に見える。Ｓ−抗
原が８Ｖ−４０（ＥＳＶ −）（ＶＳ”−）に感染した
細胞に見られ、５Ｖ−４０プロモーターがＨＢＶプロモ
ーターと反対の方向を有することは意味がある。それ故
Ｓ−抗原の表現はこの場合にＨＢＶ Ｓ−抗原プロモー
ターによって完全に制御される。核蛋白質は細胞性蛋白
質留分に主として見える。核蛋白質の表現はＳＶ −４
０（ＥＳＶ−ＨＶＯつに感染した細胞に見られ、５Ｖ−
４０プロモーターはＨＢＶ核蛋白質プロモーターと反対
の方向を有する。
原が８Ｖ−４０（ＥＳＶ −）（ＶＳ”−）に感染した
細胞に見られ、５Ｖ−４０プロモーターがＨＢＶプロモ
ーターと反対の方向を有することは意味がある。それ故
Ｓ−抗原の表現はこの場合にＨＢＶ Ｓ−抗原プロモー
ターによって完全に制御される。核蛋白質は細胞性蛋白
質留分に主として見える。核蛋白質の表現はＳＶ −４
０（ＥＳＶ−ＨＶＯつに感染した細胞に見られ、５Ｖ−
４０プロモーターはＨＢＶ核蛋白質プロモーターと反対
の方向を有する。
それ故核蛋白質の表現はこの場合にはＨＢＶ核蛋白質プ
ロモーターによって制御される。
ロモーターによって制御される。
ＳＶ−４０（ＥＳＶ −）（ＳＶ ）感染細胞から部
分精製したＳ−抗原の標本を濃縮し、電子顕微鏡用に調
製した（スケリー、Ｊ０等、Ｊ、Ｇｅｎ。
分精製したＳ−抗原の標本を濃縮し、電子顕微鏡用に調
製した（スケリー、Ｊ０等、Ｊ、Ｇｅｎ。
ＶｉｒｏＡ！、牙４４巻、牙６７９頁（１９７９年）参
照）。２ｊｎｍＳ−抗原粒子に似ている集合体および粒
子が電子顕微鏡視野に見られた。
照）。２ｊｎｍＳ−抗原粒子に似ている集合体および粒
子が電子顕微鏡視野に見られた。
ヘルパーウィルスだけに感染させた制御培養からのかか
る集合体は見えなかった。
る集合体は見えなかった。
実施例 ４゜
Ｓ−抗原からなるワクチンの調製 ワクチンの目的のだ
めのＳ−抗原の合成に対して好ましい媒介体は毒性また
は腫瘍形成物質を産生じないものである。かかる媒介体
はウィルス粒子を生成することができないアデノウィル
スおよび種々の５Ｖ−４０系を包含する。例えばメイヤ
ー、 Ｒ６Ｍ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
めのＳ−抗原の合成に対して好ましい媒介体は毒性また
は腫瘍形成物質を産生じないものである。かかる媒介体
はウィルス粒子を生成することができないアデノウィル
スおよび種々の５Ｖ−４０系を包含する。例えばメイヤ
ー、 Ｒ６Ｍ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、 牙７７巻、牙６４９１頁（１９８０年）に
より記載された組み換え媒介体ｐｓＶＯＩ はｐＢＲ
３２２に挿入されたＤＮＡ複製、早期プロモーターおよ
びＴ抗原結合部位の５Ｖ−４０源泉を包含する３１１ｂ
ｐフラグメントを含有する。媒介体は完全な５Ｖ−４０
を含有し、Ｔ−抗原を表現する（グルツマン、′Ｙ、セ
ル、牙２５巻、牙１７５頁“（１９８１年〕〕トランス
フェクトされたサルのｃｏｓ −を細胞に複製する。
より記載された組み換え媒介体ｐｓＶＯＩ はｐＢＲ
３２２に挿入されたＤＮＡ複製、早期プロモーターおよ
びＴ抗原結合部位の５Ｖ−４０源泉を包含する３１１ｂ
ｐフラグメントを含有する。媒介体は完全な５Ｖ−４０
を含有し、Ｔ−抗原を表現する（グルツマン、′Ｙ、セ
ル、牙２５巻、牙１７５頁“（１９８１年〕〕トランス
フェクトされたサルのｃｏｓ −を細胞に複製する。
Ｓ−抗原プロモーターおよびコードづけ部を含有するｐ
８ＶＯ１およびＩ（ＢＹ −ＤＮＡ ）組み換え体は０
０８−１細胞内Ｓ−抗原の合成に適当な媒介体を提供す
る。
８ＶＯ１およびＩ（ＢＹ −ＤＮＡ ）組み換え体は０
０８−１細胞内Ｓ−抗原の合成に適当な媒介体を提供す
る。
Ｓ−抗原粒子を例えば上記スケリー、Ｊ０等によって記
載されだ通−り標準方法で細胞抽出物から精製した。Ｎ
製したＳ−抗原集合体および２２日ｍ粒子を生理食塩水
またはリン酸塩緩衝食塩水に対して透析し、２００μｇ
蛋白質／ｍｅ最終濃度に調製する。モルモットにＳ−抗
原標本１ｍｌを９，１４および５６日間隔で皮下注射す
る。試験゛動物の血清を［） ２８．５６および８４日
にサンプルにし、感染血清から部分精製したディン粒子
またはＳ−抗原に対する抗体力価を検定する。ホリンゲ
ル、Ｆｏ等、Ｊ、Ｉｍｍｕｒ＋ｏ１．矛１０７巻、牙１
０９９頁 （１９７１年）のラジオイムノアッセイを使
用する。動物の大部分が蛋白質の投与後８４日にＳ〜抗
原と交差反応する抗体を示す。同様の結果がサルの注射
の際に得られる。従って蛋白質およびそのＨＢＶプロモ
ーターを暗号にしている表現媒介によって転換されてい
る真核細胞によって表現されるＨＢＶの免疫学的に活性
な蛋白質成分はＨＢＶの公知の免疫学的に反応成分と交
差反応する抗体を惹起することができる。
載されだ通−り標準方法で細胞抽出物から精製した。Ｎ
製したＳ−抗原集合体および２２日ｍ粒子を生理食塩水
またはリン酸塩緩衝食塩水に対して透析し、２００μｇ
蛋白質／ｍｅ最終濃度に調製する。モルモットにＳ−抗
原標本１ｍｌを９，１４および５６日間隔で皮下注射す
る。試験゛動物の血清を［） ２８．５６および８４日
にサンプルにし、感染血清から部分精製したディン粒子
またはＳ−抗原に対する抗体力価を検定する。ホリンゲ
ル、Ｆｏ等、Ｊ、Ｉｍｍｕｒ＋ｏ１．矛１０７巻、牙１
０９９頁 （１９７１年）のラジオイムノアッセイを使
用する。動物の大部分が蛋白質の投与後８４日にＳ〜抗
原と交差反応する抗体を示す。同様の結果がサルの注射
の際に得られる。従って蛋白質およびそのＨＢＶプロモ
ーターを暗号にしている表現媒介によって転換されてい
る真核細胞によって表現されるＨＢＶの免疫学的に活性
な蛋白質成分はＨＢＶの公知の免疫学的に反応成分と交
差反応する抗体を惹起することができる。
記載した蛋白質はディン粒子または担体血清から得られ
たＳ−抗原より重要なことに大量に入手し得る利点を有
する。さらにその上、Ｓ−抗原表現生成物に完全なウィ
ルスがないことから偶発的感染の危険がない。対照的に
血清から精製したウィルス蛋白質は常にウィルス汚染の
危険を様している。
たＳ−抗原より重要なことに大量に入手し得る利点を有
する。さらにその上、Ｓ−抗原表現生成物に完全なウィ
ルスがないことから偶発的感染の危険がない。対照的に
血清から精製したウィルス蛋白質は常にウィルス汚染の
危険を様している。
実施例 ５゜
実施例４に示した通り、ＨＢＶゲノムによってコードさ
れ、真核細胞によって合成された蛋白質はＨＢＶ Ｓ−
抗原および核蛋白質と交差反応する抗体を惹起すること
かで゛きる。それ故記載の通シ精製し、生理的に使用し
得る培地に投与した時、かかる抗原および抗原集合物は
ウィルスによる感染に対して防御用ワク”チンを構成す
る。
れ、真核細胞によって合成された蛋白質はＨＢＶ Ｓ−
抗原および核蛋白質と交差反応する抗体を惹起すること
かで゛きる。それ故記載の通シ精製し、生理的に使用し
得る培地に投与した時、かかる抗原および抗原集合物は
ウィルスによる感染に対して防御用ワク”チンを構成す
る。
１６匹のチンパンジーを６つのグループに分ける。Ａグ
ループ（６匹の動物〕にＢ、 Ｏ，Ｂ。
ループ（６匹の動物〕にＢ、 Ｏ，Ｂ。
１．０ｍｌを静脈内に接種する。Ｂグループ（４匹の動
物）に生理食塩水中実施例６または４に記載した通シに
合成および精製したＳ−抗原５００μｇを含有する１、
ｏｍｌを静脈内に接種する。Ｃグループ（６匹の動物）
はコントロールグループであシ、接種を受けない。Ａグ
ループのチンバージー全部が４０週以内で臨床Ｂ型肝炎
（抗原血症、酵素高位および／または抗体応答）が明白
である。ＢまたはＣグルー゛プの動物はいずれも同じ４
０週間にわたって臨床Ｂ型肝炎感染を明白に示さない。
物）に生理食塩水中実施例６または４に記載した通シに
合成および精製したＳ−抗原５００μｇを含有する１、
ｏｍｌを静脈内に接種する。Ｃグループ（６匹の動物）
はコントロールグループであシ、接種を受けない。Ａグ
ループのチンバージー全部が４０週以内で臨床Ｂ型肝炎
（抗原血症、酵素高位および／または抗体応答）が明白
である。ＢまたはＣグルー゛プの動物はいずれも同じ４
０週間にわたって臨床Ｂ型肝炎感染を明白に示さない。
ＢグループのチンパンジーはＢ、 Ｏ，Ｂ、Ｂ型肝炎ウ
ィルス１．０ｍｌを静脈内に接種した時免疫を次の抗原
投与にさせる。
ィルス１．０ｍｌを静脈内に接種した時免疫を次の抗原
投与にさせる。
本発明がその特定の実施態様に関連して記載している一
方、さらに変形できることは理解されるものであり、本
出願は一般に本発明の原理に従い、発明が関係する当該
技術内で公知のま、たは通例の実施内に入るようなぞし
て前文に、示した必須な特徴に適用することができるよ
うな本発明の開示からの逸脱を包含する本発明のあらゆ
る変更、用途または適応を包含しているのである。
方、さらに変形できることは理解されるものであり、本
出願は一般に本発明の原理に従い、発明が関係する当該
技術内で公知のま、たは通例の実施内に入るようなぞし
て前文に、示した必須な特徴に適用することができるよ
うな本発明の開示からの逸脱を包含する本発明のあらゆ
る変更、用途または適応を包含しているのである。
出願人：ザ リージエンツ オブ ザ
ユニヴアーシテイ オブ
カリフォルニア
第１頁の続き
０発 明 者 オルガド・ラウブ
アメリカ合衆国９４１３２カリフオ
ルニア・サンフランシスコ・モ
ーニングサイド・ドライヴ２０１
０発 明 者 レスジー・ビー・ロオルアメリカ合衆国
９４１３１カリフォ ルニア・サンフランシスコ・デ ルプルツク２２２ 手続補正舎 昭和５７年 ６月２９１ 特許庁長官若杉和夫 殿 】、事件の表示昭和５７年 特許 願第５３６３７
号２ 発明の名称 タンノミク
ゴウセイウイルス蛋白の合成 ３、補正をする者 ４、代理人 ５、補正の対象 「明細書」 別紙の通り、明細書１通を提出致します。
９４１３１カリフォ ルニア・サンフランシスコ・デ ルプルツク２２２ 手続補正舎 昭和５７年 ６月２９１ 特許庁長官若杉和夫 殿 】、事件の表示昭和５７年 特許 願第５３６３７
号２ 発明の名称 タンノミク
ゴウセイウイルス蛋白の合成 ３、補正をする者 ４、代理人 ５、補正の対象 「明細書」 別紙の通り、明細書１通を提出致します。
」−申：出願当初手書明細書を提出致しましたが、此度
タイプ印書せる明細書と差替えて頂きたく」二申致しま
す。
タイプ印書せる明細書と差替えて頂きたく」二申致しま
す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コードづけ部およびコードづけ部と同じ転写方向に
方向づけられたＨＢＶ Ｓ−抗原または核蛋白質のプロ
モータ一部からなることを特徴とするＤＮＡコードづけ
部によってコードづけされた蛋白質の細胞の表現のため
に真核細胞内に複製することができるＤＮＡ媒介体。 ２、 さらに該ＨＢＶプロモーターと連絡し合うように
方向づけられたオニプロモーターを有する特許請求の範
囲牙１項記載のＤＮＡ媒介体。 ３ さらに該ＨＢＶプロモーターと反対の方向にオニプ
ロモーターを有する特許請求の範囲才１項記載のＤＮＡ
媒介体。 ４ コードづけ部が成熟Ｓ−抗原に対してコードしてい
るＨＢＶゲノム部位からなり、 ＨＢＶプロモーターが
Ｓ−抗原プロモーターである特許請求の範囲牙１項記載
のＤＮＡ媒介体。 ５ コードづけ部がＨＢＶ Ｓ−抗原プロモーターを含
有するＨＢＶゲノム部位および完全なＳ−抗原コードづ
け部位からなる特許請求の範囲矛１項記載のＤＮＡ媒介
体。 ６、 ＳＶ−４０ＤＮＡの部分からなる特許請求の範
囲５Ａ１４または５項記載のＤＮＡ媒介体。 ７ アデノウィルスＤＮＡの部分からなる特許請求の範
囲牙４または５項記載のＤＮＡ媒介体。 ８、 ５Ｖ−４０後期プロモーターからなる特許請求の
範囲ｊ′２または３項記載のＤＮＡ媒介体。 ９ さらにＨＢＶプロモーターと連絡し合うように方向
づけられたＳＶ−’４０後期プロモーターからなる特許
請求の範囲牙５項記載のｒ）ＮＡ媒介体。 １０ さらにＨＢＶプロモーターと反対の方向の５Ｖ
−４０後期プジモーターからなる特許請求の範囲子５項
記載のＤ Ｎ、Ａ媒介体。 １１． ５Ｖ−４０（ＥＳｖ−ＨＶＳ ）からなる特許
請求の範囲子９項記載のＤＮＡ媒介体。 １２、 ＳＶ−４０（ＥＳＶ −ＨＶ８’−）からな
る特許請求の範囲子１０項記載のＤＮＡ媒介体。 １３、 コードづけ部が核蛋白質に対してコードして
いるＨＢＶゲノム部位からなり、ＨＢＶプロモーターが
核蛋白質プロモーターである特許請求の範囲子１項記載
のＤＮＡ媒介体。 １４、 ５Ｖ−４０の部分からなる特許請求の範囲子１
３項記載のＤＮＡ媒介体。 １５、 アデノウィルスの部分からなる特許請求の範
囲子１３項記載のＤＮＡ媒介体。 １６ さらに該核蛋白質プロモーターと連絡し合うよ
うに方向づけられた８Ｖ−４０後期プロモーターからな
る特許請求の範囲子１６項記載のＤＮＡ媒介体。 １７、 さらに核蛋白質プロモーターと反対の方向の
５Ｖ−４０後期プロモーターからなる特許請求の範囲子
１３項記載のＤＮＡ媒介体。 １Ｂ、 ５Ｖ−４０（ＥＳＶ−ＨＶＣ！ ）からな
る特許請求の範囲子１６項記載のＤＮＡ媒介体。 １９、 ５Ｖ−４０（ＥＳＶ−）ｒＶｃｉからなる特許
請求の範囲子１７項記載のＤＮＡ媒介体。 ２０、Ｓ−抗原に対してコードしている部およびコード
づけ部と同じ転写方向のＳ−抗原プロモータ一部からな
る細胞内に複製できるＤＮＡ媒介体を該細胞に感染また
はトランスフェクションさせ、ＤＮＡ媒介体の複製を可
能にする条件下で真核細胞を培養しそして培地および細
胞の細胞性蛋白質留分からＳ−抗原を単離することを特
徴とする真核細胞のＨＢＶＳ−抗原の生成方法。 ２１、 ＤＮＡ媒介体がＳＶ−４０（ＥＳＶ −ＨＶ
Ｓ” ）またはＳＶ−４０（ＥＳＶ −ＨＶｓ’−）で
ある特許請求の範囲子２０項記載の方法。 ２２、 ＤＮＡ媒介体が５Ｖ−４０の部分からなる特
許請求の範囲子２０項記載の方法。 ２３、 ＤＮＡ媒介体がアデノウィルスの部分からな
る特許請求の範囲ｈ２．ｎ項記載の方法。 ２４、 核蛋白質に対してコードしている部位および
コードづけ部と同じ転写方向の核蛋白質プロモータ一部
からなる細胞内に複製できるＤＮＡ媒介体を該細胞に感
染またはトランスフェクションさせ、ＤＮＡ媒介体の複
製を可能にする条件下で真核細胞を培養し、そして培地
および該細胞の細胞性蛋白質留分から核蛋白質を単離す
ることを特徴とする真核細胞のＩ−ＩＢＹ核蛋白質の生
成方法。 ２５、 ＤＮＡ媒介体がＳＶ −４０（ＥＳＶ −Ｈ
ＶＣ＋）またはＳＶ −４０（ＥＳＶ −ＨＶＣ−）で
ある特許請求の範囲子２４項記載の方法。 ２６、 ＤＮＡ媒介体が５Ｖ−４０の部分からなる特
許請求の範囲子２４項記載の方法。 ２７、 ＤＮＡ媒介体がアデノウィルスの部分からな
る特許請求の範囲子２４項記載の方法。 ２８、 生理的に使用し得る培地中特許請求の範囲子
２０または２１項に従って生成されたＨＢＶ Ｓ−抗原
からなるワクチン。 ２９ 生理的に使用し得る培地中特許請求の範囲子２
２または２３項に従って生成されたＨＢＶ ８−抗原か
らなるワクチン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24935281A | 1981-03-31 | 1981-03-31 | |
| US249352 | 1981-03-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58995A true JPS58995A (ja) | 1983-01-06 |
Family
ID=22943104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57053637A Pending JPS58995A (ja) | 1981-03-31 | 1982-03-31 | ウイルス蛋白の合成 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0062574A3 (ja) |
| JP (1) | JPS58995A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5856685A (ja) * | 1981-08-31 | 1983-04-04 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 脊椎動物細胞培養におけるポリペプチドの製造方法 |
| JPS61118326A (ja) * | 1984-11-01 | 1986-06-05 | アメリカン・ホーム・プロダクツ・コーポレイシヨン | 経口ワクチン |
Families Citing this family (10)
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| JPS6078999A (ja) * | 1983-10-05 | 1985-05-04 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原の精製方法 |
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| US4624918A (en) * | 1984-07-09 | 1986-11-25 | Genentech, Inc. | Purification process for hepatitis surface antigen and product thereof |
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| FR2581393B2 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-07-21 | Grp Genie Genetique | Cellules hybrides productrices d'un antigene caracteristique du virus de l'hepatite b obtenu a partir d'hepatocytes et de cellules etablies de singe, procede pour l'obtention de ces cellules hybrides et application de celles-ci a la production de l'antigene susdit |
| IL79740A0 (en) * | 1986-08-17 | 1986-11-30 | Yeda Res & Dev | Hepatitis vaccine |
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Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
| IE52036B1 (en) * | 1979-05-24 | 1987-05-27 | Univ California | Non-passageable viruses |
| EP0038765B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1987-09-02 | Institut Pasteur | Vaccin contre l'hépatite virale B, procédé et cellules eucaryotes transformées pour la production de ce vaccin |
-
1982
- 1982-03-29 EP EP82400564A patent/EP0062574A3/en not_active Withdrawn
- 1982-03-31 JP JP57053637A patent/JPS58995A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5856685A (ja) * | 1981-08-31 | 1983-04-04 | ジエネンテツク・インコ−ポレイテツド | 脊椎動物細胞培養におけるポリペプチドの製造方法 |
| JPH0587518B2 (ja) * | 1981-08-31 | 1993-12-16 | Genentech Inc | |
| JPS61118326A (ja) * | 1984-11-01 | 1986-06-05 | アメリカン・ホーム・プロダクツ・コーポレイシヨン | 経口ワクチン |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0062574A2 (en) | 1982-10-13 |
| EP0062574A3 (en) | 1982-12-29 |
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