JPS615786A - 単純ヘルペスウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａ、形質転換動物細胞および単純ヘルペスウイルス蛋白質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、単純ヘルペスウィルス感染症の予防用ワクチ
ンの製造に有用な単純ヘルペスウィルス蛋白質の生産に
際して遺伝子工学技術を応用することにより所望の蛋白
質を高純度に生産させることを目的とするものであって
、単純′・ルペスウィルス遺伝子を組込んだ組換えＤＮ
Ａ、それを用いて形質転換を行った動物細胞、およびそ
の形質転換動物細胞を用いた単純ヘルペスウィルス蛋白
質の生産方法に関する。

さらに詳しくは、大腸菌プラスミド、の誘導体、　゛す
なわち、大腸菌プラスミドにチミジンキナーゼ（以下、
ＴＫと略す）の遺伝子を挿入して得られるプラスミドを
ベクターとして用い、これに単純ヘルペスウィルス（以
下、ＨＳ　Ｖと略す）の遺伝子、ことにＩ（ＳＶｇＢ遺
伝子、を組込んだ新規な組換えＤＮＡ、この組換えＤＮ
Ａを動物細胞、ことにＴＫ欠損動物細胞（例えばマウス
ＬＴＫ−細胞）、に作用させて形質転換を行って得られ
る形質転換動物細胞、およびこの形質転換動物細胞を培
養してＨＳ　Ｖ蛋白質、とくにＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　１１ｆ
Ｊ’＋蛋白質ｇＢを高純度に大量生産させる方法に関す
る。

技術的背景と従来技術 最近、先進国においてはＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖに対する抗体保
有人口か減少してきており、そのような国では、性器ヘ
ルペス、新生児ヘルペス、ヘルペス脳炎などのＨ５Ｖ感
染症か大きな問題となりつつある。

このようなＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ感染症の防御にはワクチンが
有効であり、すてに弱毒化Ｈ８Ｖからなる弱毒化ワクチ
ンやＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａを含む不活化ワクチン
が提案されている。しかしなから、ＨＳ　Ｖには潜伏感
染や発癌性の危険があることが知られており、従来の弱
毒化ワクチンや不活化ワクチンではかかる副作用の危険
が残り実用上問題かある。

一方、ＨＳ　Ｖが細胞に感染すると数種の糖蛋白質（ｇ
Ｂ、ｇＣ，ｇＤ、ｇＥ　　など。なお、従来のｇＡ、ｇ
Ｂの称呼は１９８３年ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＨｅ
ｒｐｅｓ　　Ｖｉ　ｒｕｓ　Ｗｏｒｋｓｂｏｐ　（オッ
クスフォード、英国）にてｇｌｌ　と統一された）か産
生され、これらの糖蛋白質が■−Ｉ　Ｓ　Ｖの感染防御
抗原として重要なことが明らかにされるとともに、これ
ら糖蛋白質を成分とするいわゆるコンポーネントワクチ
ンについての研究が行なわれている。例えば、キャペル
らはＨＳ　Ｖ感染細胞またはウィルス粒子より抽出して
得られる糖蛋白質が感染防御抗原として有効であること
を報告している（Ｃａｐｐｅｌ　ｅｔａｌ、。

Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、、　７３．６１　（１９８２
）　）。しかしなから、かかるＨ　Ｓ　Ｖ感染細胞やウ
ィルス粒子から抽出した糖蛋白質からなるコンポーネン
トワクチンでは、宿主細胞の多くの蛋白質を含んでいる
ため、それら不要な蛋白質に起因する副作用が問題であ
る。したがって、副作用のないコンポーネントワクチン
を得るためには、高度に精製された糖蛋白質を用いる必
要がある。このような観点から、本発明者らはＨＳ　Ｖ
の糖蛋白質の１種であるｇＢに着目し、それを高度に精
製し、マウスでの実験でその有効性を確認している〔城
野、細胞工学、３．１２０　（１９８４）］。

ところでこのような糖蛋白質ｇＢを得るには培養細胞に
ウィルスを接種し、それを培養することによって産生さ
せる方法か採られるが、かかる方法では、感染性の因子
を扱うためその操作が困難であり工程もきわめて煩雑と
なるうえ、発癌遺伝子を担うＩ）　Ｎ　Ａを完全に除去
したことを証明することは不町嗅に近く、結局、かかる
天然の糖蛋白質ｇＢを用いて実用性のある安全なコンポ
ーネントワクチンを製造することはきわめて困難である
。

発明の目的 −Ｆ記のような事情のもとに、本発明者らは、該ｇＢの
遺伝子を単離し、それを動物細胞で発現することができ
れば、発癌遺伝子を含まない安全なワクチンを得ること
ができると考え、鋭意研究を重ねた結果、所望のｇＢ遺
伝子の単離、それの動物細胞での発現に成功し、本発明
を完成するに致った。

すなわち、本発明は動物細胞の形質転換に適したＨ　Ｓ
　Ｖ遺伝子を組込んだ新規な組換えＩ）　Ｎ　Ａ、それ
による形質転換動物細胞、ことに形質転換マウスＬ細胞
、および該形質転換動物細胞によるＩ］ＳＶ蛋白質の製
造方法を提供するものである。

本発明によれば、大腸菌プラスミドの誘導体、すなわち
大腸菌プラスミドにＴＫ遺伝子を挿入した組換えＩ）Ｎ
Ａをベクターとして用い、これにＨＳＶの遺伝子（すな
わちＩ（ＳＶｇＢ遺伝子）を組込むことにより所望の組
換えＤＮＡが得られる。

このようにして得られる新規な組換えＤＮＡを動物細胞
、好ましくはＴＫ欠損動物細胞（例えば゛マウスＬＴＫ
−細胞）、に作用させて形質転換動物細胞を得る。この
形質転換動物細胞を所定の培養条件下に培養することに
より所望のＩ（ＳＶｉ白質（すなわちＨ５Ｖｇ’Ｂ）が
量産される。

以下に、本発明の組換えＤＮＡ、形質転換動物細胞、お
よびそれによるＨ８Ｖ蛋白質の生産についてさらに詳細
に説明する。

（１）Ｈ５ＶｇＢ遺伝子 本発明で用いられるＨ５ＶｇＢ遺伝子は大腸菌によりク
ローニングされたＨ８ＶｇＢ　ＤＮＡ　である。

Ｈ５ＶＤＮＡ　は約１６０　Ｋ　タルｌ−７（７）ＤＮ
Ａ　で、ｇＢの遺伝子はこのＨ５ＶＤＮＡ　　を制限酵
素の一種であるＢａｍＨＩで処理して切り出される約８
Ｋｂ（０，３４５〜０．３９９マツプユニツト）のフラ
グメント（Ｂａｍ　Ｔ−１１Ｇ　　フラグメントという
）の中に存在する。このＢａｍＨＩＧ　　フラグメント
は第１図に示すような各種の制限酵素（Ｓａｌ　Ｉ　、
５ＳＴＩＳ　Ｋｐｎ　Ｉ、ＢｓｔＥ　、［、Ｘｈｏ　Ｉ
　、　ＰｓＬ　Ｉ　）による切断部位を有する。したが
って、Ｉ（ＳＶｇＢ遺伝子としては、ＢａｍＨＩＧフラ
グメントのほか、これをさらに他の制限酵素で処理した
もの、好ましくはＫｐｎ　Ｉで処理して得られる約４．
５Ｋｂ（０３４８〜０．３８１マツプユニツト）のフラ
グメント（ＧＫフラグメントという）が用いられる。

このようなフラグメントの調製には、まずＨ５ＶＤＮＡ
をＢａｍＨＩで処理して切断し、アガロースゲル電気泳
動でＢａｍＨＩＧフラクメントを単離し、これを大腸菌
によりクローニングして増幅したのち、好ましくはざら
にＫｐｎＩ　などの制限酵素で処理して所定のフラグメ
ントを得る。このようにして得られるフラグメントをそ
のまま後述　、の組換えＤＮＡの構築に供する。　　　
　　′（２）大腸菌プラスミド誘導体 ベクターとして用いられる大腸菌プラスミド誘導体は大
腸菌プラスミドにＨ５ＶＤＮＡ　からのＴＫ遺伝子を挿
入したものであって、例えば、大腸菌７’５７．　ミＦ
ｐＢＲ３２２とＨ５ＶＤＮＡかラノＴＫ遺伝子との組換
えＤＮＡであり、第２図のような構造を有する［　Ｆｌ
ｏｒｅｎｃｅ　ｃｏｌｂｅｒｅ　−Ｇａｒａｐｉｎ、　
３ｒｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆＥＳＡ
ＣＴ　、　０ｘｆｏｒｄ　　ｌ　９７９　、　Ｄｅｖｅ
ｌｏｐ、ｂｉｏｌ　。

５ｔａｎｄａｒｄ、　　４６　、　７５〜８２　（１９
８０）を参照〕。

すなわち、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ
　開裂部位にＴＫ遺伝子（３，５Ｋｂ）を挿入してなり
、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）を有している。な
お、このような抗生物質耐性遺伝子は後記形質転換細胞
の選択マーカーとなる遺伝子であって、このほかにテト
ラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ク
ロラムフェニコール耐性遺伝子なども組込むことかでき
る。

このようなベクターをＨ５Ｖ遺伝子と結合させて所望の
組換えＤＮＡを調製する場合には適当な制限酵素、例え
は、Ｋｐｎ　エ　　などで処理して開裂させてフラグメ
ントとして用いる。

（３）組換えＤＮＡ（Ｈ８Ｖ８Ｖ遺伝子プラスミド）の
構築 前記Ｔ　Ｋ遺伝子を含む大腸菌プラスミド誘導体からな
るベクターをＴＫ遺伝子の活性を損うことのない適当な
制限酵素（例えは、ＫｐｎＩ）にて処理して得られるフ
ラグメントと、前記Ｈｓｖ　ｇｐ。

遺伝子を含むフラグメントとを適当な割合にて結合反応
に付すことにより所望の組換えＤＮＡか得られる。この
際、用いられる各フラグメントの使用割合によりベクタ
ーのフラグメント１個に対してＨ３ＶｇＢＤＮＡ　のフ
ラグメントが１〜複数個の割合で挿入される。好ましい
組換えＩ）　Ｎ　Ａは、ＨＳ　Ｖ　ｇ　Ｂ　ＤＮＡ　　
フラグメントが１〜２個挿入されたものである。

このような組換えＩ）　Ｎ　Ａは第３図に示すような構
造であり、第３図ではベクター１）　Ｎ　ＡのＫｐｔｒ
１部位にＩ（ＳＶｇ１３ＤＮＡのＫｐｎ　１７ラグメン
ト（ＧＫフラグメント）が１個挿入されている。

前記のＨ５ＶｇＢ遺伝子へ組換えＤＮＡを動物細胞に作
用させて培養することにより動物細胞の形質転換が行な
われる。

用いられる動物細胞としてはＴＫ−動物細胞、例えばマ
ウスＬ　Ｔ　Ｋ−細胞が好ましい。

つぎに動物細胞としてマウスＬＴＫ−細胞を用いた場合
の形質転換操作をさらに具体的に述へる。

例えば、マウスＬＴＫ−細胞を１０％牛血清を含むダル
ベツコ改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ、以下Ｄ　
Ｍ　Ｅ　Ｍと略す）　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ、Ｂ、　＆　
　Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｇ、　；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　８　
、３９６　、１９５９　）にて培養し、これに組換えＤ
ＮＡをリン酸カルシウム溶液中に混合した溶液を加えて
室温で数十分間、通常約３０分間放置したのち、ＤＭＥ
Ｍを加えて４〜５時間培養し、培地を交換し、さらに１
２〜２４時間ＤＭ　、Ｅ　Ｍにて培養する。ついで、ヒ
ノキサンチン（１５μｇ／ｍｌ）、アミノプテリン（１
／ｊｇ／ｍ１．）およびチミジン（５１１ｇ／ｒｎＩ）
を含む培地（以下、ＨＡ　Ｔ培地という）　（Ｌ口ｔｌ
ｅｆｉｅｌｄ　：　Ｊ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　７２　
　、３９６１〜３９６５　（１９６３）　〕て培養して
所望の形質転換マウスＬ細胞を得る。なお、この場合、
出発マウスＬ丁に一細胞はＴＫ遺伝子を欠損しているた
めＩ−Ｔ　Ａ　Ｔ培地では成育できないが、−ｒＫ遺伝
子を導入した組換えＤＮＡで形質転換したマウスＬ細胞
はチミジンキナーゼ合成能を有しＴ−Ｉ　Ａ　Ｔ培地で
成育するため、上記ＨＡＴ培地での培養により所望の形
質転換細胞のみが選択的に得られる。

（５）形質転換細胞の培養およびＩ−ＩＳＶｇＢの生産
前記の方法で得られた形質転換動物細胞を常法に従って
培養することにより生育細胞内に大量の■］ＳｖｇＢか
産生される。コノｌ−ｌ５Ｖ　ｇＢ（７）分離は、生育
動物細胞を分離し、界面活性剤（例えばトリトンＸ−１
（１０、ノリプツトＰ−４０なと）や有機溶媒（例えは
、四塩化炭素、エチルエーテルなど）で処理して細胞膜
を破壊し、ｇＢを通常の蛋白質精製法により精製する。

例えば、抗ｇＢ抗体を結合したケルを充填したカラムに
該ｇＢ含有抽出液を通し、３Ｍ　Ｋ　Ｓ　ＣＮ　　で溶
出してｇＢを単離する。

上記の方法で得られるｇＢは免疫学的にＩ−Ｉ　Ｓ　Ｖ
感染細胞から得られる天然ｇＢと全く同一であり、ＨＳ
　Ｖワクチンまたは診断用試薬として利用し得る。

つぎに実施例を挙けて本発明の組換えＤＮＡ、形質転換
動物細胞、およびＨＳ　Ｖ　ｇ　Ｂの生産についてさら
に具体的に説明する。

実施例 （１）　Ｉ（ＳＶ　−Ｉ　ＤＮＡ　（７）、Ｊ製Ｖｅｒ
ｏ細胞（アフリカミドリザル腎細胞）（約５　Ｘ　１０
８ｃｅｌｌｓ　）に単純ヘルペスウィルス１型（Ｈ５Ｖ
−１）（Ｋ２Ｓ株）を０，５〜Ｉ　ＰＦＵ／ｃｅ１１　
の量で感染させ、３７℃で２０〜２４ｆ！４間培養して
、細胞変性が充分に起きた時点で３０，（１００ｒｐｍ
　　にて１時間遠心して感染細胞と］−清を分離して、
感染細胞のペレット（２〜３　ｍｌ　）を得る。

これをリン酸緩衝液（ＰＨ７，２）　（以下、Ｉ）−Ｂ
Ｓと略記する）６．０ｍＡ！に懸濁し、この懸濁液を超
音波処理（９ＫＨｚ、２（１０Ｗ、５分間処理）または
凍結融解（−５０℃（アセトン−ドライアイス）と３７
℃にて３回凍結融解を繰返す）を行って細胞を破壊し、
細胞残渣を低速遠心分離（３，（１００ｒｐｍ、２０分
間）により除去する。得られる溶液ヲクリセロールクッ
ション（５９６，４０％）ニ重層し、３５（１００ｒＰ
ｍ　　にて１時間遠心分離する。得られたペレット０５
〜１　ｍｌをＰＢＳ　］〜２ｄに懸濁し、これにＤＮａ
　ｓ　ｅ　１０　μｇ／　、ｎｌ　　およびＲＮａ　ｓ
　ｅ　０．３　ｍＹ／ｍｌを３７℃で１時間作用させ、
ついて１１５量の５　ｘ　５ＴＥＰ　（０，５％ＳＤＳ
。

５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣ／　、　ｐＨ７，
５，０，４Ｍ　ＥＤＴＡ、Ｑ、１％プロテイナーゼＫ）
を加え、５０℃で３０分間作用させる。この処理液を等
量のフェノール、フェノール−クロロホルム（１：１）
およびクロロホルムで順に抽出し、ＤＮＡを含む水層を
得る。

この水層を１゛Ｅ緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−
ＨＣｌ、ｌ　ｍ　ＭＥＤＴＡ　、　　ｐｉ−１７，５）
に透析したのち、冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿　
させる。このＤＮＡを脚数し、真空下で乾燥後、塩化セ
シウム水溶液（Ｒｆｌ、３８８５、エチジウムブロマイ
ド０．０４％、ラウロイルサルコシネート０．４％を添
加）５ｍｌに溶解し、４（１００　ｒｐｍ　　で７２時
間遠心分離し、Ｈ５Ｖ−ＩＤＮＡのバンドを形成させる
。このバンドを回収し、イソプロピルアルコールで洗浄
してエチジウムブロマイドを除去後、ＴＥＨ衝液に透析
する。これに冷タノールを加えて沈殿させてＨＳ　Ｖ　
−Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａを得る。

（２１１（Ｓ　Ｖ　−Ｉ　ＤＮＡ　のＢａｍＨＩ切断Ｇ
フラグメントのクローン化 上記の方法で調製したＨ３Ｖ　−ｌＤＮＡ約１（１０μ
ｇを、７３　ｍＭＴｒｉｓ　−４（ＣＡ’　（ＰＨ８，
０）　、７ｒｎ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２、ｌＱＱｍＭＮ
ａｃｌ！、　２ｍＭ−２−メルカプトエタノールの混液
ｏ、７ｓｒｎｌ中で、制限酵素ＢａｍＨＩにより３７℃
、６時間処理したのち、０．７９６アガロース電気泳動
によって各断片を分離し、Ｇフラグメント（０，３４５
〜０３９９マツプユニツト）に相当する部分のゲルを切
り取り、電気泳動的にＧフラグメントを回収する。

前記と同様にして制限酵素ＢａｍＨＩ　　により開裂さ
れたｐＢＲ３２２プラスミド１／１０モル量と上記Ｇフ
ラグメント約２μｇとを、５　Ｑ　ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５
−ＨＣＩ　、　　ｐＨ７，９，１０ｍＭＭｇ”’２、２
０ｍＭジチオスレイトール、ｌ　ｍＭ　ＡＴ　Ｐ混液中
にて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で約１６時間
反応させる。

高木康敬編著「遺伝子操作実験法」第１６１項に記載の
方法で大腸菌の培養液を調製し、その菌液０．１−に上
記反応液を加えてよく混合させ、０℃で４５分間放置し
たのち、アンピシリン１（１０μｇ／−を含む寒天プレ
ート上に塗沫し、３７℃で一夜培養する。出現したコロ
ニーについて、アンピシリン１（１０μｇ／ｍｌを含む
寒天プレートとテトラサイクリン１（１０μｇ　／　ｍ
ｌを含む寒天プレートにそれぞれ塗沫し、同様に培養し
てアンピシリンを含む寒天プレートでのみ増殖したコロ
ニーを選択する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン耐性遺伝
子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するがテトラサイ
クリン耐性遺伝子中にあるＢａｍＨＩ　部位にＨ５Ｖ−
ｌＤＮＡ断片が挿入されることによりテトラサイクリン
耐性が消失されるため、上記選択された一１０ニーはｐ
ＢＲ３２２−Ｈ５ＶＩ）ＮＡのＢａｍＨＩＧ　フラグメ
ントの組換えＤＮＡを保持していることになる。

上記の方法で得られたコロニーについて、「代謝」第１
７巻、第４１リパーゼ」第８１〜８９頁（１９８０）に
記載される方法にしたがってプラスミドを調製する。得
られたプラスミドを種々の制限酵素（ＢａｍＨＩ、Ｂｓ
ｔＥ■、Ｋｐｎｌ、Ｓａｌ■、Ｓｓｔ　１１Ｘｈｏ　ｉ
　）にてその切断パターンを分析すルコトニより、Ｈ３
Ｖ−ＩＤＮＡ　のＢａｍＨＩ　ＧフラグメントがｐＢＲ
３２２に組込まれたｐＢＲ３２２−ＢａｍＨＩＧフラグ
メントの組換えＤＮＡ　（以下、ＰＲ’Ｒ３２２−Ｇと
略す）を得る。

（３）組換えＴ）ＮＡ　（ｐＢＲ３２”２−ＴＫ遺伝子
−ＧＫフラグメント）の調製 上記の方法で得られたｐＢＲ３２２−Ｇを、６ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ　−ＨＣｌ　　（ＰＨ７，５）　、５ｍＭ　Ｎａ
Ｃｌ！、６ｍＭＭｇＣｌ！２．５　ｍ　Ｍ　２−メルカ
プトエタノールの混液中にて、制限酵素ＫｐｎＩで処理
して切断し、このＩ）　Ｎ　Ａ断片の中から、前記Ｇフ
ラグメントを得る方法と同様にして、ＧＫフラグメント
（０，３４８〜０．３８１マツプユニツト）を得る。

予めクローン化したｐＢＲ３２２−ＴＫ、ＤＮＡ（ＴＫ
遺伝子を含むＨ５ＶＤＮＡ　　のＢａｍＨＩ　切断Ｑ−
ｙラグメントとｐＢＲ３２２とをＢａｍＨＩ切断部位で
結合させた組換えＤＮＡ）（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆＡ
　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ　　Ｅｎｃ
ｏｒｄｉｎｇ　ＴｈｅＧｅｎｅ　　ｆｏｒ　　ｔｈｅ　
Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　Ｋｉｎａｓｅ　ｏｆＨｅｒｐｅｓ
　　Ｓｉｍｐｌｅｘ　ｔｙｐｅ　　ｌ　ｖｉｒｕｓ、　
Ｅｎｑｕｉｓｃｅｔ、、Ｇｅｎｅ、７，３３５〜３４２
．１９７９　）と上記ＧＫフラグメントとをＫｐｎ　Ｉ
　　切断部位で結合させてＰＢＲ３２２−ＴＫ　　遺伝
子−ＧＫフラグメントの組換えＤＮＡを得る。この組換
えＤＮＡの調製は、前記ＰＢＲ３２２−Ｇの調製法と同
様にして得られるアンピシリン耐性のコロニーについて
、「蛋白質・核酸・酵素」第シロ巻４号「遺伝子操作」
第５７５〜５７９頁（１９８３）に記載される方法にし
たがい、３２ｐ　　でラベルしたＧＫフラグメントをプ
ローブとしてコロニーハイブリダイゼーションを行って
選択することにより行なわれる。なお、この際、得られ
るプラスミドを種々ノ制限酵素（Ｂａｍ　ＨＩ、Ｘｈｏ
　Ｉ　、　ＳｓＬ　Ｉ　。

Ｋｐｎ　Ｉ　）にて切断し、その切断パターンを分析す
ることによってＧＫフラグメントの挿入およびその方向
を決定する。

（４）マウスＬＴＫ−細胞の形質転換 上記の方法で得られるＰＢＲ３２２−ＴＫ　　遺伝Ｅ’
−ＧＫフラグメントの組換えＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで切断して得られるフラグメント（ｐＢＲ３２２−Ｔ
Ｋ−ＧＫフラグメント）２μｇとＬＴ’Ｋ　　ＤＮＡ　
　（キャリアＤＮＡ）２μｇとを１３０ｍＭＣａＣ／２
　２（１０１ＩＩ！に溶解し、これに２×ヘペス溶液（
ＮａＣ１！　１６ｇ／／、ＫＣｌ０．７４　ｇ　／ｚ　
、Ｎａ１−ＩＰＯ４・２　Ｈ２Ｏ０，２５ｇ／ｌ、デキ
ストロース２ｇ／Ａ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピ
ペラジン−Ｎ−（２−エタンスルホン酸）１０　ｇ／ｌ
！、ｐｉ−１７，１１）２（１０１１１を混合し、室温
で３０分間放置する。生じた沈殿物を充分に懸濁したの
ち、その混合液をマウスＬＴＫ−細胞の約６０％単一層
（約１０５ｃｅｌｌｓ／フラスコ）に滴下する。３７℃
で１時間細胞に吸着させたのち、ＤＭＥＭ５．、Ｊを添
加し、５％Ｃ０２雰囲気下、３７℃で４時間培養する。

Ｉ）　Ｍ　Ｅ　Ｍを吸引にして除去後、１５％ジメチル
ホキシトを含むヘペス溶液を添加し、室温で４分間放置
する。この混合物をＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍで２回洗浄したのち
、新たにＤＭＥＭ５ｍｌを添加し、５％ＣＯ２，３７℃
で２４時間培養する。ついでＨＡ　Ｔ培地に交換し、２
〜３日毎にＩ（Ａ　Ｔ培地を交換して培養を続ける。

約２週間後にＨＡＴ耐性細胞（ＬＴＫ＋細胞）のコロニ
ーを分離して形質転換細胞を得る。

＋５）　ＨＳ　Ｖ　−１表面糖蛋白質ｇＢの産生上記の
方法で得られた形質転換マウスＬ細胞（Ｌ　ＴＫ　　細
胞）を四塩化炭素にて１０−分間脱脂し、これに−次抗
体としてＨＳ　Ｖ−１表面糖蛋白質ｇＢに対するモノク
ロナール抗体を作用させ、洗浄、乾燥後、二次抗体とし
て螢光色素て′ラベルされた抗マウスＩｇＧ抗体を作用
させ、洗浄、乾燥、封入後、螢光顕微鏡下に観察すると
形質転換細胞の細胞質内にｇＢに対する特異抗体が認め
られた。

また、ｇＢに対するモノクロナール抗体を固定した９６
穴プレートに形質転換細胞の１％トリトンＸ−１（１０
可溶化液を添加し、３７℃で１時間反応させ、洗浄後、
パーオキシダーゼを結合したｇＢに対するモノクロナー
ル抗体を添加し、３７℃で１時間反応させ、洗浄後、パ
ーオキシダーゼの基質であるオルソフェニルジアミンを
添加するとｇＢの存在を認める発色が見られた。

さらに、形質転換細胞の１％トリトンＸ−１（１０可溶
化液を５ＤＳ−電気泳動を行ったのち、ニトロセルロー
スにブロッティングし、これにｇＢに対するモノクロナ
ール抗体を反応させ、洗浄後、パーオキシダーゼが結合
した抗マウスＩｇＧ抗体を作用さぜ、゛−浄後、基質で
あるンアミノベンチジンを添加する。ｒ−＋　ｓ　ｖ　
−１感ｉＬＴ’に一細胞の１％トリトンＸ　−１，（１
０可溶化液と同様のｇＢのパターンが認めンれた。

つぎに、ｇＢを産生じている形質転換細胞をマウス（Ｂ
ＡＬＢ／ｃ　）の腹腔内に投与し、数週間後にそのマウ
スの血清を調べたところ、ｔｉ　ｓ　ｖ　−１に対する
中和抗体価の上昇が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨ３ＶＤＮＡのＢａｍｌ−Ｔ１．Ｇフラグメン
トのマツプとその各種制限酵素による切断部位を示し、
第２図は大腸菌プラスミドＰＢＲ３２２とＨＳ　Ｖ　Ｄ
　Ｎ　Ａ　からのＴＫ遺伝子トノ組換工Ｉ）　Ｎ　Ａの
構造を示し、第３図は、ＴＫ遺伝子を含む大腸菌プラス
ミドｐＢＲ３２２からなるベクターにｌｌ５Ｖ　ｇＢ遺
伝子を含むＧＫフラグメントが組込まれてなる本発明の
組換えＤＮＡの一具体例の構造を示す。 特許出願人　財団法人化学及血清療法研究所代理　人　
弁理士　青　山　　葆　ほか１名ｊｌ’ｆ１図 ５ａｌＩ ＳＴＩ ｐｎＩ Ｂｓｔ　ＥＩＪ ｈｏｒ Ｐｓ↑工 第２図 第３図 （７，５ＫＤ　　Ｌ７．５ＫＤ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）大腸菌プラスミドにチミジンキナーゼ遺伝子を挿
   入したベクターに単純ヘルペスウィルス遺伝子を組込ん
   だことを特徴とする組換えＤＮＡ。
2. （２）該ベクタ−が、単純ヘルペスウィルスＤＮＡから
   のチミジンキナーゼ遺伝子と大腸菌プラスミドｐＢＲ３
   ２２との組換えＤＮＡである第（１）項の組換えＤＮＡ
   。
3. （３）単純ヘルペスウィルス遺伝子が単純ヘルペスウィ
   ルスｇＢ遺伝子である第（１）項の組換えＤＮＡ。
4. （４）該ｇＢ遺伝子が単純ヘルペスウィルスＤＮＡを制
   限酵素ＢａｍＨ I で処理して得られる約８Ｋｂ（０．
   ３４５〜０．３９９）のＢａｍＨ I Ｇフラグメントで
   ある第（３）項の組換えＤＮＡ。
5. （５）該ｇＢ遺伝子が単純ヘルペスウィルスＤＮＡを制
   限酵素ＢａｍＨ I で処理して得られるＢａｍＨ I Ｇフ
   ラグメントをさらに制限酵素ＫｐｎＩで処理して得られ
   るＧＫフラグメント（０．３４８〜０．３８１）である
   第（３）項の組換えＤＮＡ。
6. （６）組込まれている単純ヘルペスウィルス遺伝子が１
   〜複数個である第（１）項〜第（５）項のいずれか１つ
   である組換えＤＮＡ。
7. （７）該組込まれている単純ヘルペスウィルス遺伝子が
   １〜２個である第（６）項の組換えＤＮＡ。
8. （８）動物細胞に第（１）項の組換えＤＮＡを作用させ
   て形質転換させてなる形質転換動物細胞。
9. （９）該動物細胞がチミジンキナーゼ欠損動物細胞であ
   る第（８）項の形質転換動物細胞。
10. （１０）該動物細胞がマウスＬＴＫ＾−細胞である第（
    ８）項の形質転換動物細胞。
11. （１１）第（８）項の形質転換動物細胞を培養して単純
    ヘルペスウィルス糖蛋白質を産生させ、それを収集する
    ことを特徴とする単純ヘルペスウィルス蛋白質の製法。
12. （１２）該単純ヘルペスウィルス蛋白質が単純へルペス
    ウィルスの膜蛋白質ｇＢである第（１１）項の製法。