JPS58500167A - 真核細胞の選択的遺伝的マ−カ−、このようなマ−カ−の使用方法及びこのようなマ−カ−を含む細胞の対応するｄｎａによる形質転換後の特定タンパクの製造への適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 真核細胞の選択的遺伝的マーカー、このようなマーカーの使用方法及びこのよう なマーカーを含む細胞の対応するＤＮＡによる形質転換後の特定タンパクの製造 への適用本発明は、多くの種類の真核細胞特に高等生物由来の真核細胞内に侵入 し得、且つ、特異的培地内に置かねた該細胞に対し、形質転換細胞を容易に検出 せしめる安定な特異的キャラクタを付与し得る新規な優性の遺伝的マーカー（ｍ ａｒｑｕｅｕｒｇｇｎ＋ｔｉｑＩＪｅ）に係る。

本発明は更に、前記の如く特別なキャラクタが与えられた真核細胞の検出方法に 係る。本発明はまた、原核性、真核性又はウィルス性の特定タンパクの製法即ち 、該タンパクをコードする遺伝子又はｃＤＮ人の如きＤＮＡ配列を含む外来ＤＮ 人断片によって予め形質転換した前記の如き細胞を使用するタンパクの製法に係 る。

適正条件下で行なわれたカルチャーの真核細胞を前記の如きＤＮＡで形質転換処 理する場合に生じる課題は、ＤＮＡに影響されなかったかなり多数の真核、！ｉ ｌ胞の中からＤＮＡが有効に移入した真核細胞を検出単離するのが難しいことで ある。

原核細胞の領域でよく知られた技術、即ち、原核細胞のうちの検出されるべき細 胞に抗生物質耐性因子を組込ませ対応する抗生物質を含む適当な培地中で細胞培 養を実施しくマーカーで）標識された細胞のみを生き残らせてコロニーを形成せ しめる技術を真核細胞の培養に利用することは、今日まで殆んど検討されること がなかった。これらの技術が今日まで真核細胞の培養にら用されなかった理由は 、殆んどの抗生物質が大部分の真核細胞内に侵入するか及び／又は毒性プロセス による該細胞の破壊を行なうことができないためである。

従って、今日までに行なわれた遺伝子の真核細胞内移植テストに於いては、真核 細胞に侵入し該細胞内で発現され得る能力を有することがわかっているタイプの ＤＮＡ断片更にあるときはＤＮＡ完全体から成る遺伝的マーカーが使用されてき た。このタイプのＤＮＡとして特に、°単純ヘルペスウィルス（単純、ｊｃｔｔ 　珍ウィルス１（ｅｒｐｄｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　Ｖｉｒｕｓ　）　”タイプｌ　 （Ｈ８ＶＩ）と槓杵されるウィルスのＤＮＡ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）の遺伝 子、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）ノ遺伝子、ジヒド ロホレートレダクターゼ（ジヒドロ葉酸還元酵素、ＤＨＰＲ）の遺伝子等、又は キサンチンーグアニンホスホリホスホリボシルトランスフエラーゼの酵素活性は 容易に検出され得る。

しかし乍ら、前記の如き遺伝的マーカーを使用した技術の実用化は依然として困 難である。何故なら、特有の突然変異を有する細胞のカルチャー、特に対応する 遺伝子に影響を与える突然変異が誘発又は生起された細胞のカルチャーを使用す る必要があるからである。例えば、ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子 を用いる検出技術は、内因性チミジンキナーゼ遺伝子に影響を与える突然変異を 先ず誘発又は生起せしめて修飾したＬタイプのマウス細胞に於いて行なわれる。

このことは、ＩＭ。

ＷＩＧＬＢＲ及び共著者により既に発表されている（　’Ｃｅ１ｌ’。

１巻、２２３−２３２．１９７７）。更に、これらの細胞は、特異的培地例えば チミジンキナーゼの遺伝子のレベルに欠失を有する細胞（いわゆるＴＫ−細胞） に対して特異的な培地、例えば’ＨＡＴ培地１（ヒボキサンチンとアミノプテリ ンとチミジンとを含む）たる槓杵で知られる培地に於いて培養される必要がある 。この場合には、ヘルペスウィルスのＴＫ遺伝子を組込んで遺伝形質（ｐａｔｒ ｉｍｏｉｎｅ　ｇｃ＜ｎｅｔｉｑｕｅ　）が修ｓされたＴＫ−細胞のみが前記の 如き培地中で増殖し得る。同様の技術に別の遺伝子を用いた例もある。しかし乍 ら一般には、標識（ｍａｒｑｕａｇｅ　）テストで使用された突然変異細胞は、 マウスのＬＴＫ−細胞の安定キャラクタを有していない。突然変異の発生によっ て得られたキャラクタは、当該細胞の連続的細胞分裂の進行に伴なって急速に失 なわれる。

従って、適当な突然変異体の単離が難しい上に、一般には、所望の表現型の急速 な消失という欠点が生じ、特異的培地を毎回使用することが必要になる。

近年、Ａ、ＪＩＭＥＮＢＺ及びＪ、ＤＡＶＩＥＳは別途の研究に着手し、′抗生 物質耐性の転置可能エレメントのサツカロミセス内での発現Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ　ｏｆ　ａ　ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ　ａｎｔｉｈｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔ ａｎｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　’　（’　Ｎ ａｔｕｒｅ　”。

２８７巻、１９８０．１０．３０．．８６９−８７１ページ）と題する論文に於 いて発表した。

これらの著者の知見によれば、０４１８なる槓杵で知られるゲンタマイシンに似 た構造のアミノグリコシド類に属する抗生物質は、ある種の酵母菌例えばＳａｃ ｃｈａｒｏｍ　ＣｅＳ　ｃｅｒｅｖｉｓｒａｅの増殖を阻止する性質を有してい る。従って、アミノグリコシドタイプのいくつかの抗生物質のリン酸化及び不活 化を生じさせる酵素たるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（３′）− １（ＡＰｉＪ（３’）−１）をコードしており１転置可能エレメント１即ち１ト ランスポゾン１に担持されて（する遺伝子を予め細胞に組込んでから該抗生物質 を含む培地中で該細胞を培養すると該抗生物質に耐性のコロニーを産生ずること ができる。

１トランスポゾン１なる用語は、１トランスボザーゼに組込まれることができ、 また、前記の如き第１ＤＮＡ力）ら離脱して例えばバタテリオファージの如き別 のＤＮＡに転置又は組込まれることができるＤＮ人工レメントを意味しており、 これらの例は多数矧られている。しかし乍ら、著者等が同時に指摘しているよう に、抗生物−１ｌＧ４１８により形質転換された酵母細胞は抗生物質非含有培地 中で培養されると耐性を失ない易有効に形質転換された細胞の割合が少なく安定 性に欠けるので、この技術を真核ｌ１８１Ｉ＠の標識特に高等生物由来の真核細 胞の標識のために応用することは難しい。著者等が記載した条件に於いて使用酵 母のＤＮＡに原核細胞遺伝子がランダムに組込まれ内因性プロモータのコントロ ール下で発現するという現象は、酵母と原核細胞とが互いに近似しているにもか かわらず極めて希にしか発生しない（１０’未満）。より複雑な真核細胞特に高 等生物由来の真核細胞の場合には、このような現象の生じる度合は更に少なくな る。

本発明の目的は、抗生物質耐性遺伝子又はその同族体を用いる標識技術を真核細 胞特に高等生物由来の真核細胞に適用せしめることである。抗生物質としてはＧ ４１８の如く真核細胞の増殖阻止が証明されたか又はいずれ証明されるであろう 抗生物質が使用される。

更に本発明の目的は、高等生物由来の真核細胞をも含む多様な真核細胞に対して 使用することができ、前記細胞の高い形質転換効率を可能にし、連続的細胞分裂 中にも形質転換細胞の子孫に於いて維持される安定なキャラクタを該細胞に付与 することができ、このような抗生物質の存在中での培養を常に行なう必要のない 選択的遺伝的マーカーを製造することである。

勿論本発明は、前記の如きマーカーの使用方法をも含んでおり、更に特定タンパ クを産生ずるために前記の如く標識された細胞（ｃｅｌ　１ｕｔｅｓ　ｍａｒｑ ｕｅｅｓ　）を特定タンハク（７）　：）　−）’配列ヲ含むＤＮＡにより予め 形質転換してから培養を行なうタンパクの製法に係る。

本発明のマーカーは、真核性プロモータ即ち該プロモータに正常に結合した遺伝 子を真核細胞中で発現せしめる能力が認識されたプロモータと、該プロモータに 結合し咳プロモータの直接コントロール下で抗生物質例えば抗生物質０４１８を 不活化し得る酵素をコードするＤＮＡ配列とを含む環状又は非環状ＤＮＡから構 成されている。不活化酵素をコードするＤＮＡ配列がアミノグリコシド３′−ホ スホトランスフェラーゼ（ＡＰＩ（３’））をコードする配列から選択されるの が有利である。

本発明による真核細胞標識方法の特徴は、細胞の少くとも一部の形質転換を生じ させ得る条件で細胞と本発明のマーカーとを接触させ、抗生物質を含む細胞増殖 に適した培地中で培養する段階を含んでおり、前記抗生物質例えば０４１８が前 記細胞に対して通常は毒性であるが、不活化酵素特に前記ＤＮＡ配列によって合 成されるアミノグリコシド３′−ホスホトランスフェラーゼによって不活化され 得ることである。

有利な構成によれば、本発明のマーカーは、一方では、細菌カルチャーでクロー ニングするための複製オリジンを含む原核細胞ＤＮＡ由来の部分例えばファージ 好ましくはプラスミドを含んでおり、他方では、真核細胞内で結合した遺伝子を 発現せしめる前記真核性プロモータと、該プロモータの直接コントロール下で不 活化酵素特に人ＰＨ（３’）をコードする前記ＤＮＡ配列とが前記の原核細胞Ｄ ＮＡ１ｌ１分に組込まれている。

本発明の好ましいマーカーに於いては、プロモータは、チミジンキナーゼの遺伝 子のオリジン細胞中での転写をコントロールするプロモータであり、ＡＰＲ（３ ’）−１をコードする遺伝子は”　Ｔｎ　５　”なる槓杵でよく知られたトラン スポゾンにより担持された遺伝子の如きカナマイシン及び／又はネオマイシンに 耐性の遺伝子であるのが有利である。

別のプロモータの使用も勿論可能である。例えば前出の如き従来から使用されて いた遺伝的マーカーのプロモータ、又は使用真核細胞に感染し得ることがわかっ ているウィルスに属するプロモータがあり、例えば使用真核細胞がチンパンジー 由来の細胞から成るときはＢ型つィルス性肝炎のウィルスのＤＮＡ由来のプロモ ータを使用し得る。

不活化酵素をコードするＤＮＡ配列としては、遺伝的マーカーを組込んだ細胞を 選択するために使用培地中で使用される抗生物質を不活化し得る酵素を合成する ことが可能ないかなる配列を使用してもよい。培地に添合された抗生物質が抗生 物質０４１８から成る場合、前出のＡＰＩ（３’）タイプのリン酸化酵素の使用 が有利である。同様にして抗生物質を不活化する能力例えば抗生物質の対応する ヒドロキシル官能基をアセチル化して不活化する能力を有する酵素を合成する全 ての別のタイプのＤＮＡ配列の使用が勿論可能である。このようなりＮＡ配列は 任意の適当なソースから得ることができる。例えば前出のトランスポゾン’ｒｎ ｓに代えてＪＩＭＥＮＢＺ及びＤＡＶＩＥ８が挙げたトランスポゾンＴｎ６０１ （９０３）を使用してもよく、又は、培地中で使用選択抗生物質との相互作用を 生じ得るいかなる抗生物質耐性遺伝子を使用してもよい。場合によっては、特に 不活化酵素を特異的にコードするＤＮＡ配列を遺伝子から単離するために、この 耐性遺伝子の制限マツプを予め確定しておく。本発明の好ましい遺伝的マーカー に関して、酵素をコードする配列をより特異的に配置することの利点は、以下の 記載より明らかであろう。

勿論、前記遺伝子の同種配列（５Ｊｑｕｅｎｃｅｓ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ　） 特に対応するメツセンジャーＲＮＡの化学的又は酵素的転写により得られるＣＤ ＮＡを使用することも可能である。

本発明の好ましい付加的特徴によれば、人ＰＨ（３’）をコードするＤＮＡ配列 又はその同族配列（５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｏｇｕｅ　）の最初の複数のヌ クレオチド対は転写の方向でプロモータの最後の複数のヌクレオチド対に可能な 限り接近しており、特にヌクレオチ対の個数で示すと１ｏｏｏ未満、好ましくは ５００未満、更に好ましくは１００未満のヌクレオチド対に相当する間隔を隔て ている。特に適当な欠失を利用して得られるこのような間隔短縮の結果として形 質転換効率がかなり高くなることが確認された。このことに関しては、本発明の 好ましいマーカーに関する以後の記載に於いて明らかにされるであろう。

更に好ましくは、本発明のマーカーＤＮＡはＡＰＨ（３／）の遺伝子の下流側に ポリアデニル化部位をも含んでおり、該部位もまたＡＰＨ（３’））コードする 遺伝子の最終ヌクレオチド対正こできるだけ接近しているのが好ましい。この間 隔を塩基対の個数で示すと、ＡＰＩ（３／）をコードする遺伝子の末端とポリア デニル化部位又はこの遺伝子の翻訳１停止コドン１との間に含まれる塩基対が１ 　（ｌ　Ｏ０未満、好ましくは５００未満、更に好ましくは１００未満の個数で あるのが有利である。

マーカーＤＮＡに真核細胞複製オリジンを与えると標識効率をいっそう向上させ 得る。複製オリジンは該オリジンを含む新組込むことによって与えられる。対応 する欠失ゲノム中にこのウィルスのエピソーム形とマルチマー形の１．４キロ塩 基のＤＮＡサブユニットとが存在しているので、該サブユニットが複製オリジン を含んでいると考えることができる。

本発明の好ましいマーカーは、いずれもｐＢＲ３２２から誘導されたプラスミド ｐＡＧｏ又はｐＦＧ５の修飾により得られる。

ＴＫ遺伝子に加えて２種の付加的耐性因子即ちアンピシリン耐性因子とテトラサ イクリン耐性因子とを含むのでプラスミドｐＡＧＯが好ましい。ｐＡＧｏの構成 を第１図に概略的に示す。第１図では特に、ＴＫ遺伝子が点線円弧で概略的に示 されており、後述する如く本発明の好ましいマーカーの組立に特に使用される種 々の制限部位が示されている。ＴＫ遺伝子の矢印ｔｒ　は転写の方向を示す。点 ０はこのプラスミドのＢＣＯＲＩ部位に対応する。ＢＰＲ部位及びＰＡ８部位は ＴＫ遺伝子のプロモータの領域の位置及びＴＫ遺伝子のポリアデニル化部位の位 置に夫々対応する。

本発明の好ましい遺伝的マーカーはｐＡＧＯとトランスポゾンＴｎ５　との組換 により得られたマーカーである（Ｒ，Ａ。

ＪＯＲＧＢＮＳＥＮ、８．Ｊ、ＲＯＴＨ８ＴＥＩＮ及びＷ、Ｓ、几Ｅ　Ｚ　Ｎ　 Ｉ　ＫＯＦＦ’（１９７９）　’Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、’　、ｌ’ ７’ｙ　、６５−７２）。

この１例が第２図に概略的に示されている。第２図のマーカーは、Ｂ、ｃｏｌｉ 菌Ｇｌｌ／１ｐＨＮ５に含まれた細胞プラスミドＣｏ１ＥＩＴｎｓから得られた 。この１株は１９８１年３月２日、Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ 　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ　−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓｌｃｎｏ 　ｌ　−１４９として寄託されている。

前記の検出方法に於いて使用される好ましい抗生物質は、殆んどの真核細胞に侵 入して該細胞を毒性プロセスで破壊する能力がｇＩＩ＆されている抗生物質０４ １８から成る。しかし乍ら、本発明の条件で行なわれる検出方法で使用される真 核細胞のタイプに対して同様の毒性を示す別の抗生物質をも使用し得ることは言 う迄もなく当然である。勿論、対応するマーカーは選択された抗生物質を特に阻 止し得る不活化酵素を合成し得るＤＮＡ配列を含む必要がある。

本発明の別の特徴は、第２乃至第１３図に於いてその構成及び組立を概略的に示 した好ましいマーカーに関する以下の記載より明らかにされるであろう。

プラスミドの特定部位の開裂及びこれらの部位の結合を行なうために、ＢＩＯＬ ＡＢＳ製の制限エンドヌクレアーゼ及びＢＥＴＨＩ−；５ＤＡ）ＬＥＳＥＡＲＣ ＨＬＡＢＯＩ２Ａ’ｌ”０ＲＩＥＳ　（Ｍ、Ｄ。

１（、ｏｃｋｖｉｌｌｅ）製（７）Ｔ４　ＤＮＡ−リガーゼを夫々使用した。メ ーカーの勧める反応条件を用いた。

形質転換に使用された細菌株はＬ立姐貝１１０６　（８０３ｒｌ、−ｍｋ−）及 び１１０７　（８０３ｒｋ−ｍｋ”）であった（Ｎ、Ｅ。

ｎＹ、Ｗ、Ｊ　、ＢＲＡＭＭ、へＦＬ、Ｋ、ＭＵＲＲＡＹ（１９７６）、’Ｍｏ １ｅｃ、　Ｇｅｎ、Ｑｅｎｅｔ、＠、１５０　、５３−６１　）ｏ使用した真核 生物法は、マウスＬＴＫ−のクローンＩＤ１チンパンジーＶｅｒｏ細胞、ＯＭＫ 細胞及びヒト）ｌｅＬａ細胞であった。コウシ血清５乃至１０Ｌｓを添加り、　 タＤＵＬＢＥＣＣＯｔｃ　ヨる変性Ｅ人ＯＬＥ培地で細胞培養を実施した。プラ スミドのＤＮＡによる細胞の形質転換技術としては、Ｃ０ＬＢＥＲＥ−ＧＡＲＡ ＰＩＮ他（Ｆ。

Ｃ０ＬＢＥＲＥ−ＧＡＲ，ＡＰＩＮ、８．ＣＨＯＵＳＴＥＭＡＮ、Ｆ。

ＨＯＲＯＤＮＩＣＥＡＮＵ、Ｐ、ＫＯＵ几ＩＬＳＫＹ及びＡ、　Ｃ，ＧＡＲＡＰ ＩＮ（１９７９）、’　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　、、 　Ｕ、　８．　Ａ、”　。

Ｌ互、３７５５−３７５９）を使用し、ＧＲＡＨＡＭ及びＶＡＮＤＢＲＥＢ　の カルシウム沈殿技術を使用した（Ｐ、Ｌ。

ＧＲＡＨＡＭ及びＶＡＮ　ＤＥＲＥＢ（１９７３）、”　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ’　 。

５２．４５６−４６７）。ミリリットル当り１０乃至４００？イクログラムの抗 生物質０４１８を含む培地中で酵素Ｃ０ＬＢＥＲＥ−ＧＡＲＡＰＩＮ及び共著者 により記載された条件で、ＨＡＴ培地中でＴＫ　細胞を選択した。細胞のクロー ニングを行なうために個々のコロニーをランダムに単離し、融合カルチャーが産 生ずるまで培養した。

使用プロモータハ、Ｈ８Ｖ１　ＴＫ　ＥＰＲ遺伝子（［ｅＥＰＲと指称する）由 来の１真核性プロモータの領域１から得られる。

このプロモータはプラスミドｐＡＧＱに於いてＴＫ遺伝子の発端のＰｖｕ　１部 位とＨｉｎｃ　１部位との間に位置する（第１図）。このＥＰＲは遺伝子の５′ 末端に２つのＴＡＴＭ頁域（ＴＡＴＡボックス）を含んでおり、このうちの１つ の領域はＴＫ遺伝子の転写に重要な役割を果すことが現在わかっている（Ｓ、Ｌ 、ＭＣＫＮＩＧＨＴ　（１９８０）　、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　８ 　、５９４９−５９６４）。第２図に概略的に示す如くトランスポゾンＴｎ　５ が通常含んでいるカナマイシン耐性遺伝子（図中、矢印’　ｋａｎａ”で示され る）を組込／ｖり２４８０　塩Ｊｉｂ’ｔ（７）Ｈｉｎｃ　１−Ｈｉｎｃｌ　Ｄ ＮＡ断片と、Ｈｉｎｃｌ　制限酵素の存在下での部分消化によりＨｉｎｃ　１部 位のレベルで開環したプラスミドｐＡＧ。

と、の結合によって組換体を生成する。得られた組換体を用いで、ｇｓｃｈｅｒ ｉｃｈｉａ　ｃｏ、リ−１１０６（８０３ｒｋ−ｍｋ−）株ノトランスフエクシ ョンを行なった。カナマイシンとテトラサイクリンとアンピシリンとから成る３ 種の抗生物質に耐性のコロニーを選択する。このようにして、２種の組換プラス ミドｐＡＧ４０とｐＡＧ４５とが得られた。制限解析（ａｎａｌｙｓｅ　ｐａｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）によると、Ｔｎ５から得られた２４８ｏ塩基対の断片 は、ＴＫ配列内でｐ　ＡＧＱの２３０１位に存在するＨｉｎｃ　ｉ［部位（第１ 図）に組込まれていた。この断片の配向は、Ｘｈｏ　１及びＥＣ０ＲＩ　による 制限を用いた該プラスミドの解析によって決定された。Ｔｎ５のＸｈｏ　１部位 は、人ＰＨ（３’）−１遺伝子の５′末端の近傍に存在する。ｐＡＧ４０に於い てはＸｈｏ１部位がＴＫＥＰＲ領域に隣接の１（ｉｎｃ　１１　部位に極めて近 接していることが判明した（第３図）。逆に、プラスミドｐＡＧ４５に於いては 断片が逆向きになっている。従って、ｐＡＧ４０が真核細胞中での発現に適当で あると認識された。更にＡ　Ｐ　Ｒ（３’）−１の細菌性プロモータをも含むこ とが明らかにされたこのプラスミドは６０μＥｌ／ｌ　Ｚでのカナマイシンに耐 性であり得る。

ｐＡＧ４０に於いてＥＰＲと人ＰＨ（３’）−１をコードする遺伝子の第１トリ プレツ）ＡＵＧとの間の間隔は、約１ｓｏｏ塩基対である。後に改良された発現 を得るために、ｐＡＧ４０内の制限マツプの座標３６７０と４７９５との間に存 在するＢｇ１ｍ断片と、ＴＫＤＮＡ断片のＢｇ１１部位のレベルで開環させてお いたｐＡＧＯと、の間で新しい組換体を形成させた。得られたプラスミドｐＡＧ 　５０　（第４図）及びＩ）ＡＧ５５のｐＡＧＯｉこ対する違いは、Ｂｇｌ　Ｂ 末端によって限定された１１２５塩基対のインサート（挿入ＤＮＡ）が存在する ことであり、近い方の８ｇｌｌ末端はＥＰＲ領域から約１３０塩基対を隔てた位 置にある。酵素Ｓｍａ　ｌを用いた制限及びゲル上での解析により、ＡＰＲ（３ ’）−１遺伝子の５Ｉ末端がＴＫのＢＰＲに結合されたことが判明した。

逆にプラスミドｐＡＧ５５に於いてはインサートが逆向きに組込まれていた。こ のため、ＴＫの調整領域のコントロール下で酵素を発現させるためにプラスミド ｐＡＧ　５０が選択された。

ｐＡＧ５０の分子量ハ（ｐＡＧ５５　（Ｄ分子量と同じ＜）７４９０ｉ５０塩基 対である。

ｐＡＧ５０内でＴＫポリアデニル化部位（図中ＰＡＳ）は、ＴＫ遺伝子の転写方 向でＳｍａ　１部位の直ぐ下流側（第４図の座標領域４６０８）に存在する。ｐ ＡＧ　５０の２つのＳｍａ　１部位（マツプ中の座標３２４３と４６０８）間の １．２キロ塩基対のＤＮＡ断片を切除すると、ＡＰＨ（３’）−１遺伝子の３′ 末端とＴＫポリアデニル化部位（ＭｃＫＮＩＧＨＴ　）との間の間隔は、１３６ ５塩基対だけ短縮された。ＴＫの停止コドンＴＧＡはＳｍａ　１部位の下流側に ２１塩基対に対応する間隔を隔てて存在する。ＡＰ）（（３’）　−Ｈの停止コ ドンの位置は正確にはわからないが極めて近接している筈である。得られた新し いプラスミドは発現ｐＡＧ６０と指称された（第５図）。このプラスミドの長さ は約６１５０塩基対に対応するっ ｐＡＧ６０の形質転換効率を更に改良するために、このプラスミドに真核細胞複 製オリジンを組込むことを試みた。このために前記の如くサイミリヘルペスウィ ルスのＤＮＡの欠失ゲノムを用いた。この欠失ゲノムは１．４キロ塩基対のマル チマー形サブユニットを含んでおり、このサブユニットが複製オリジンを含むと 考えられる。（Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ及び共著者（１９７９）：Ｂｉｏｃｈ ｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　５旦旦３０１−３４２により記載されて いるサイミリヘルペスウィルスの菌株１１由来の）欠失遺伝子を、酵素Ｔａｑ　 Ｉによって開裂し、酵素Ｃ１ａｌによって同じく予め開裂したベクターｐＡＧｏ に結合した。得られた組換プラスミドは、１つのユニット（ｐＦＧ２２）又は縦 列（ｔａｎｄｅｍ）の２つの繰返しユニッ）　（ｐＰＧ２４）を含んでいた。酵 素ＴａｑＩを用いた切除によってｐＰＧ２４の繰返し配列を単離し、（’ｌａ■ によって予め直線形にしたｐＡＧ６０にリガーゼ結合し、組換プラスミドｐＡＧ ７０（第６図）を形成した。

真核細胞に対するＧ−４１８の作用 ＪＩＭＢＮＺ及びＤＡＹ　Ｉ　Ｅ　Ｓが既に指摘した如く、抗生物質Ｇ−４１８ は種々の阻止タンパク（ｐｒｏｔｃ’１ｎｅｓ　１ｎｈｉｂｉｔｒｉｃｅｓ　） の合成活性を有する。従って、マウスＬＴＫ−細胞、クローンＩＤ、チンパンジ ー細胞（非クローニング又はクローンＶＣＩ　Ｏ）。

ＯＭＫ細胞及びヒ）ＨｅＬａ細胞に対する抗生物質（）−４１８の毒性をテスト した。Ｇ−４１８添加後の最初の４８時間でカルチャー内の細胞の数は倍加した 。抗生物質２５μｇ／−の濃度ではＩＤ、ｌｆｆ１胞は１力月以内では離脱しな い。しかし乍ら抗生物質、シ の常用濃１ｉ（１５０μ９／ｙｅｔ＞ではＩＤ細胞は１０日内に死滅してプレー トから離脱する。ＩＤ細胞と対照的に、非りローンＶｅｒｏ細胞は、同じ濃度の Ｇ−４１８に対し、１カ月遅く死滅する投与量５０乃至４００μｇ／−の場合に は自発耐性を有するコロニーは得られなかった（ＩＤ細胞の場合自発耐性をもつ コロニーの発生率は＜４，１０”である）。

組をプラスミドを用いたマウス細胞の形質転換ＷＩＧＬＥＲ及び共著者（１９７ Ｂ　）　Ｃｅ１ｌ　、　１４　、７２５−７３１に示される如（、ＬＴＫ−マウ ス細胞のＩＤクローンはトランスフェクションに対して極めて敏感である。従っ て、本発明の選択的マーカーの移入発現能力を研究するためにこの細胞を選択し た。各々が約３．１０’　の細胞を収容した容器に於いて前記の如きトランスフ ェクションを実施した。トランスフェクションの４８時間後に選択物質Ｇ−４１ ８を濃度１５０μｇ／−で添加した。トランスフェクションの３週間後にコロニ ーを計数した。得られた結果を次表■に示す。

この表によればＡＰＲ（３’）−Ｉ遺伝子を含む組換プラスミドによるトランス フェクションの後に抗生物質Ｇ−４１８に耐性の形質転換コロニーが得られたこ とが明らかである。ａＩＩトランスポゾンＴｎ５及びプラスミドｐＡＧ４５．ｐ ＡＧ４ｏ及びｐＡＧ５５を用いて得られた形質転換効率は比較的小さくＤＮＡ１ μＳ当りのコロニーの数は約１乃至３であった。しかし乍らＴＫのプロモータ領 域がＡＰ）Ｉ（３’）−Ｈ遺伝子の５′末端に遥かに近いｐＡＧ５０を用いると 更に高い形質転換効率が得られる（２０乃至３０コロニ一／μｇ）ことが判明し た。ＴＫポリアデニル化部位がＡＰＩ（３’）−１１遺伝子のゴ末端に近いプラ スミドｐＡＧ６０を使用すると形質転換効率はくに増加した（７０−８０コロニ 一／μｇ）。サイミリヘルペスウィルスの繰返しサブユニットを含むプラスミド ｐＡＧ７０を用いると更に５０％増の効率が得られた。形質転換効率は、投与量 １５０乃至３００μに−の範囲ではＧ−４１８の濃度に余り左右されず、トラン スフェクションからＧ−４１８添加までに経過した時間の長さにも左右されない ことが判明した。しかし乍ら、０４１８の投与量が４００μｇ／−より多い値に なると形質転換効率が低下する。

環化された真線状ＤＮＡ（％にＣ１ａｌを用いてｐＡＧ６０を開環して得られた もの）に於いて前記の結果が得られた。後者の場合には２乃至３倍の形質転換効 率が得られる（１７５コロニー／１μｓのＤＮＡ）。

抗生物質Ｇ−４１８に耐性の表現型は１選択のために使用した培養条件に於いて 安定である。同じ培地に於し）て抗生物質を存在させずに培養した細胞も同じく 安定である。細胞は数回の世代交代（ｐａｓｓａｇｅｓ　）後に於いても抗生物 質Ｇ−４１８感受性にはならない。

組換プラスミドによるサル細胞及びヒＨａｔ胞の形質転換前記の場合と同様にし て、プラスミドｐＡＧ５０及びｐＡＧ６０を用いてサル細胞（ＶＣｌｏ、ＯＭＫ ）及びヒト細胞（ＨｅＬａ系統）のトランスフェクション後に抗生物質Ｇ−４１ ８耐性系統を得た。しかし乍ら、サケ精液由来のＤＮＡ担体のみを使用したとき は耐性コロニーは全く得られなかった。これらの細胞について得られた形質転換 効率は、マウスＬＴＫ−細胞の場合よりも劣っていた。ｐＡＧ５０によるＨｅＬ ａ細胞の形質転換効率は１μＪのＤＮＡ当り約１つのコロニーであり、ｐＡＧ６ ０によるサルＶＣ１０及びＯＭＫ細胞の形質転換効率は１μｓのＤＮＡ当り０１ 乃至１つのコロニーであった。

Ｈ８Ｖｉ　ＴＫ遺伝子とＡＰＲ（３’）−１選択マーカーとの同時移植所定遺伝 子とＡＰＨ（３’）−Ｉ選択マーカーとのコトランスボーメーション（ｃｏ−ｔ ｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　）即ち同時的形質転換の可能性を検討するために 、検出し易いＨ８ＶＩ　ＴＫ遺伝子を用いてテストした。ＡＰＨ（３／）−１及 びＴＫの遺伝子を夫々担持する環状プラスミドｐＡＧ６０及びｐＦＧ２４を用い てＴＫＩＤ細胞のコトランスホーメーション即ち同時的形質転換処理を実施した 。２つのプラスミドをＡＰＨ（３’）−Ｂ対ＴＫの重量比５：８の割合で使用し た。

抗生物質Ｇ−４１８のみを含む培地に於いて選択処理後に、２０のクローンを単 離した。これらの２０のクローンのうちの９つのクローン（即ち４５チ）が選択 的培地ＨＡＴに於いても増殖され得ることが判明した。従って、これらの９つの クローンはＡＰＲ（３’）−１！及び■の表現型を同時に有していた。

ＨＡＴ培地に耐性の５つのクローンとＨＡＴ培地に感受性の４つのクローンとか らコロニーを複製し、Ｇ−４１８のみを存在させて培養後、得られた９つのカル チャーのＴＫ活性のインビトロテストを実施した。■表現型を有していた５つの クローンが重要な酵素活性を有することが判明した。ｐＡＧ５０及びｐＦＧ２４ を用いて同時形質転換した細胞に関しても同様の結果が得られた。

させたい別のＤＮＡによって形質転換された真核細胞の認知に役立つことが明ら かである。発現させたい別のＤＮＡとは、例えば、インシュリン、ヒトインター フェロン等の如きタンパク製造用ウィルスタンパク等をコードするＤＮＡ又はＣ ＤＮＡである０ 上記テストの例で説明した方法即ち本発明のマーカープラスミドと発現させたい ＤＮＡ配列を担持した別のプラスミドとを用いて細胞の同時形質転換を行なう方 法に代えて、本発明のマーカープラスミド自体に発現させたいＤＮＡ配列を予め 挿入し次にこのプラスミドを用いて形質転換させる方法を用いると、形質転換及 び検出の効率をはるかに増加させ得ることが明らかである。前記の好ましいプラ スミドを用いる場合、これらのプラスミドがｐＡＧＯと共通に有しており本発明 プラスミドを得るための修飾によって影響されなかった部位たるテトラサイクリ ン及びアンピシリンに耐性の因子を含む部位の１つに前記の如きＤＮＡ配列の挿 入を行なうのが有利である。

上記に関する説明として、本発明のマーカーの好ましい使用方法を以下に説明す る。特に、本発明のマーカーを、Ｂ型つィ該ウィルスの遺伝子Ｓと該ウィルスを 真核細胞中で発現せしめる適当な遺伝情報とを含むベクターとして使用する場合 を説明する。これは好ましい場合の例であり、本発明がこの例に限定されないこ とは勿論である。

前記の如きインサートを含む前記の如きマーカープラスミドの組立を第７図乃至 第１３図に示す。

第７図は、プラスミドｐＡＧ６０の実例の略図である。この図は第５図に極めて 類似しているが更に付加的制限酵素部位が示されており、これらの部位が最終的 マーカープラスミドの組立に使用されるであろう。これらの部位とは即ち、（図 中文字１　（）　ｌで示される）ＢｃｏＲＩ部位から約５６５及び２８２７ヌク レオチドを夫々隔てて位置する２つの８ｐｈ　１部位である。更に、特にカナマ イシン耐性遺伝子”　１（ａｎａｒ”中の付加的Ｐｖｕ　Ｅ１部位のおおよその 位置をも示した。この部位も同じく後述の如き修飾マーカープラスミドの組立に 使用されるであろう。

第８図は、ｊ（ｓａ　ｌ末端と山ｎｃ　ｌ末端とにより限定された断片（以後、 ＦＬＳａＩ　−Ｈｌｎｃ　Ｉｌ断片と槓杵する）を概略的に示す。

この断片は例えば、欧州特許出願第８１　４００６３４号に記載のプラスミドｐ ｅｐ　１０から抽出され得る。抽出は、従来条件に於いて前記プラスミドを対応 する２種の制限酵素で処理し、対でいる断片を回収する段階を含む。これらの末 端は、Ｆ。

ＧＡＬＩＢＥＲＴ他による論文「大腸菌中でクローニングしたＢ型肝炎ウィルス ゲノム（サブタイプＡＹＷ）のヌクレオチド配列Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑ ｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓｇｅｎｏｍｅ 　（５ｕｂ−ｔｙｐｅ　ＡＹＷ）　ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎ　ｇ−ｃｏｌｉＪ　（Ｎ ａｔｕｒｅ１９７９．２８１巻、６４６−６５０ページ）に示されたナンバリン グ方式によれば、Ｂ型肝炎ウィルスゲノムに対応するＤＮＡ−ＨＢＶ　なる槓杵 で知られるＤＮＡ配列の制限マツプに於いてＥｃｏＲＩ　部位の両側の夫々、は ぼ６８０位及び１５００位のＲｓａ　１部位及び）（ｉｎｃ　１部位に対応する 。

図中星印の付いたいくつかの数字はＧＡＬＩＢＥＲＴ他のナンバリング方式によ るＤＮＡ−ＨＢＶ内での対応するヌクレオチドの位置を示す数字である。

遺伝子組換によって第８図）Ｒｓａ　ｌ　−Ｈｉｎｃ　ｉ断片をｐＡＧ６０の’ 　ｋａｎａｒ　’遺伝子中に位置するＰｖｕ　１部位に挿入する。この遺伝子組 換は、組換えるべき断片の自由端（ｅｘｔｒｄｍｉｔｄｓｆｒａｎｃｈｅｓ　） を介して行なわれるので特に容易であり、従来の条件でリガーゼを存在させて行 なわれる。得られたプラスミドＸＡＰＩ　を第９図に概略的に示す。

制限酵素Ｓｐｈ　ＩでＸＡＰＩを調節的に加水分解し、第１０図に示す断片を再 度抽出した。この断片の一方は、第８図のＲｓａｌ、４（ｉｎｃｌ断片中でＨｉ ｎｃｌ末端から少しだけ離れていたｓｐｈ１部位によって限定されており、他方 は、ＸＡＰＩ中の（図中に符号１０”で示したＥＣｏＲＩ部位に対して）約３０ １７の位置のｓｐｈ　１部位によって限定されていた。得られた断片は、Ｓ遺伝 子と真核細胞中での該遺伝子の発現に必要な遺伝情報とをかなりの割合で含む。

次にこの断片をプラスミドｐＡＧ６０、より詳細には該プラスミドの５６５位の ｓｐｈ１部位に再度挿入し、第１１図のプラスミドｐＡＧ６１を得る。

このプラスミドがＳ遺伝子の発現に必要な遺伝情報全部を含んでいないときは、 第１２図に示した付加的なりＮＡ−ＨＢＶ抽出配列を用いて、該プラスミドの付 加的な遺伝的組換を行なうのが好ましい。第１２図の断片は、ＧＡＬＩＢＥＲＴ 他のナンバリング方式によれば夫々２９３８位及び１２７６位のＸｂａｌ末端及 びＴａｑｌ末端によって限定されている。

ＰＡＧ６１に含まれたＤＮＡ−ＨＢＶ抽出インサートと第１１図の略図で示した 断片に含まれた対応する部位とが共に有しているＸｂａ１部位を利用した新規な 遺伝子組換を行なうことにより、一方がＸｂａｌ末端及び他方がＴａｑ　ｌ末端 によって限定されている第１２図のＤＮＡ　−ＨＢＶ断片部分を、プラスミドｐ ＡＧ６１内の一方がＸｂａＩ末端及び他方がＣ１ａ　ｌ末端によって限定された 断片と置換し、プラスミドｐＡＧ６６を得る。このプラスミドはＧＡＬＩＢＥＲ ，Ｔ他のナンバリング方式によれば（２９３８部位を通って）６８０位から１２ ７６位まで伸びるかなり大きいＤＮＡＨＢＶ断片を含む。

Ｂ型肝炎ウィルスの８遺伝子全体と真核細胞中での該遺伝子の発現に必要な遺伝 情報とをそれ自体が含むインサートを含むマーカープラスミドは、真核細胞のう ちで該プラスミドによる形質転換が可能な真核細胞を認識し得る多数のマーカー ベクターの一例に過ぎない。例えば、欧州特許出願第８１４００６３４号、第０ ０１３８２８号、第００２０２５１号及び第８１００５７７号に記載の如きＤＮ Ａ　ＨＢＶ抽出インサートのいずれをも使用し得ることは勿論である。特に、ウ ィルスゲノムの感染性に対応すると見なされるＤＮＡ　ＨＢＶの部分を除いて、 Ｓ遺伝子の発現に必要な全ての遺伝情報を含むいかなるＤＮＡＨＢＶ抽出配列の 挿入を行なってもよい。

本発明は勿論、他の全ての所定タンパクをコードするＤＮＡ又はｃＤＮＡによっ て形質転換された高等真核細胞の形質転換及び検出のためにも同様の手法及び同 様の条件で適用され得る。

本発明のマーカーは、高等生物の真核細胞、特に動物細胞又はヒト細胞、更には また植物ｍ胞の形質転換のために特に有用である。既に常識化したいかなる形質 転換技術を用いてもよく、又は本文中で取上げた形質転換技術を用いてもよい。

本発明は更に、真核細胞中での複製及び発現に必要な遺伝情報全部を含む核嵯断 片が挿入された前記の如きマーカーを使用して行なう対応する発現産物の製造に 係る。この製造には、前記の如く形質転換された細胞の培養と細胞又は培地から の発現産物の回収とを含むプロセスが使用される。発現産物特にタンれる。この ことに関連して説明すると、本発明は特に、Ｂ型肝炎ウィルスを中和し得る抗体 の産生を誘発し得る免疫原性を有するタンパクの製造に適しているが、このよう な場合、産生タンパクの大部分が培地内に分泌されるので培地から回収されるプ ロセスが採用される。タンパクは、物理化学的分離プロセス又は免疫学的プロセ スを用いた従来の精製技術によって培地から回収される。例えば、対応する抗体 を予め固定した基質上でのアフイニテイクロマトグラフイーを用いる。

前記の結果は、本発明が、サル（Ｖｅｒｏ及びＯＭＫ）細胞系統及びヒトＨｅＬ ａ細胞系統の形質転換及び検出に使用され得ることを示すが、これらの細胞はい くつかの例に過ぎない。特に前記の結果より、ある種の抗生物質に耐性の因子を 含む配列、例えば、イントロンが欠失したＡＰＩ　（３’）　−ＩＩをコードす るトランスポゾンＴｎ５　の遺伝子は、哺乳類細胞内に移植された後に発現され 得る。

前記の如き選択系は、特に重要な多くの特徴及び利点を有する。先ず注目すべき は、ＴＫ、人ＰＲＴ、ＸＧＰＲＴ又はＤＨＰＲをマーカーとして使用する従来技 術と違って、特別な代謝経路又は特別なヌクレオチド合成経路を使用しないで選 択が行なわれることである。本発明方法はまた、種々のプロモータの相対的効率 の研究にも使用され得る。これらの効率は、所定の細胞系統タイプに対する形質 転換効率として示されるか、又は、試験プロモータの夫々を形質転換することが できるある程度多数の種に関しては、ＴＫ遺伝子の転写を正常に制御（コントロ ール）するプロモータの効率に特に注目することが重要である。従って本発明は 、哺乳類細胞の種々の系統枠−１１１瘍遺伝子キャラクタを全く持たない細胞系 統に於いて発現され得るマーカーを提供する。これらの細胞系統として例えば、 ヒト以外の霊長類のＭｒｏヘテロ倍数（異数）細胞系統、例えばＪ、　Ｃ。

ＰＥＴＲＩＣＣＩＡＮＩ、Ｒ，Ｌ、ＫＩＲ８ＣＨ８ＴＥＩＮ、Ｊ、Ｅ。

ＨＩＮＥ８．Ｒ，Ｅ、ＷＡＬＬＡＣＢ及びり、　Ｐ、ＭＡＲ’ｒＩＮ（１９７３ ）。

”ＪＪＪａｔｌ、（’ａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　”　５１　、１９１−１９６に 記載の系統がある。後者の細胞は、免疫抑制処理を与えたサルに於いて試験した ときにもｍ瘍形成性でないことが判明した。同様へＡＴＣＣＣＣＬ　８１　（Ｖ ｅｒｏ細胞）タイプの細胞バンクに於いて入手し得る非腫瘍形成性細胞、オナガ ザル（ｓｉｎｇｅ　ｖｅｒｖｅｔ　）腎細胞又はＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎで保持されている別の非腫瘍形成性真核 細胞を挙げることができる。このコレクションによって刊行されている菌株カタ ログの参照が役立つであろう。

従って、得られた標識細胞は、生物学的又は治療学的用途のための産物合成に特 に有用である。例えば、特に前記の如き８誌 型ウィルス肝炎のウィルスのＨＢｓ抗原に対応するポリペプチド配列、別の全て のワクチン活性成分、又は例えばインシュリンもしくはインターフェロンの如き 有用なタンパクがある。

全体として本発明は、前記に記載又は定義した種々のマーカーの全ての均等物を 包含する。このことに関しては更に、以下の如き考察を付加することが重要であ る。

１当該プロモータに正常に結合した遺伝子を真核細胞中で発現せしめる能力が知 見又は認識された真核性プロモータ１なる定義は、別のタイプの細胞又は微生物 中で同種の遺伝子（ｇｄｎｅｓ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）　ｌ（結合シタプ０モ ータｌＣモ及／ｖＴニオＦ）、このうちには、対応する真核性遺伝子によって特 定されたタンパクト同種のタンパクをコードするウィルス遺伝子を支配するプロ モータも含まれる。これは１相補的ＤＮＡ”に結合したプロモータのことである 。′相補的ＤＮＡ”なる用語の意味は、１９８０年６月９日出願の欧州特許出願 第８０４００８２８号に定義されている。該出願に於いては１テにこのようなプ ロモータが使用されていた。

特筆すべきは、プラスミドｐＡＧｏとｐＧＦ５とが前記欧州特許出願にも記載さ れていることである。

本発明は勿論真核細胞の少くとも一部を形質転換させ得る条件下で細胞を前記の 如きマーカーと接触させ前記マーカーのＤＮＡ配列によりコードされた酵素によ って不活化され得る抗生物質を含む該細胞の増殖に適した培地中で細胞を培養す ることを特徴とするほぼ全ての真核細胞標識方法に係る。

本発明は更に、選択的内部遺伝的マーカーとして本発明のマーカーを含んでおり ワクチンの製造に青に適した特にサル又はヒトをオリジンとする真核細胞に係る 。

本文中に引用したすべての先行文献は亀参照文献Ｉとして本発明中に包含される 。換言すれば、これらの文献中の記載のうちで本出願の明細書の理解に必要とな り得る記載は本出願の一部を構成する。

図面の浄書（内容に変更なレノ ＦＩＧ　Ｉ　ＦＩＧ、２゜ 手続ネ市１丁巴 ８１ノ和５）７４１１月１２１」 相訂庁長官名杉和大殿 １、事イ′［の表示　ＰＣＴ／ＦＲＥう２．０００３６２、発明の名称　真核細 胞の選択的遺伝的マーカー、このようなマーカーの使用方法及びこのようなマー カーを含む細胞の対応するＤへＡによる形質転換後の相定゛タンパクの製迄ｌ＼ の適用 ４、代　埋　人　東京都新宿区斬宿１］１１番１４号　ｕ＋ｒＪＩビル（郵便番 号１６０）電話＜０３）　３５４１６２３５、補圧命令の日付　昭和　針　月　 日自発 ６、補正により増加する発明の数 ７　補正の対象　特語法第１８４条の５）第１項の規定による創面中、出願人の 代表者の欄、図面の翻訳文及び委Ｈ状・法人格証明書 ８、補任の内容 （°１））ＴｈＳｉ法第１８４条σ）５第１耳通σ、）規定（二よる広面中、出 願人の代表者をΣ１１紙σ）通り補充する。

（２）鮮明な図面の翻訳文をｌＡｌ１紙の通り補充する。

（３，１悶４ｆ状・イノ、人格町明？！’、　＋ＩＪよひ財（八１（文をｚ１］ 紙の通り補充する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、真核性プロモータ即ち当該プロモータに正常に結合した遺伝子を真核細胞中 で発現せしめる能力が認識されたプロモータと、少くともいくつかの真核細胞中 への侵入又は毒性プロセスによる真核細胞の破壊又は前記の侵入及び破壊の双方 を行なうことができる抗生物質を不活化し得る酵素をコードするＤＮＡ配列と、 を含んでおシ前記配列が前記プロモータに結合されており前記ゾロモータの直接 コントロール下にあることを特徴とする環状又は非環状ＤＮＡから成る選択的遺 伝的マーカー。 ２、抗生物質を不活化し得る酵素をコードするＤＮＡ配列が抗生物質０４１８を 不活化し得る酵素をコードするＤＮＡ配列から選択されることを特徴とする請求 の範ｉ！！１に記載のマーカ３、不活化酵素をコードするＤＮＡ配列がアミノグ リコシド３′−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＲ（３’））をコードするＤＮ Ａ配列から選択されることを特徴とする請求の範囲１又扛２に記載のマーカー。 ４、不活化酵素をコードするＤＮＡ配列がカナマイシン耐性又はネオマイシン耐 性又は双方に同時に耐性の遺伝子であることを特徴とする請求の範囲１乃至３の いずｎかに記載のマーカ５、プロモータがチミジンキナーゼをコードする遺伝子 即ちＤＮＡ断片の転写をコントロールするプロモータであＣ１＊にヘルペスウィ ルスのＴＫ遺伝子のプロモータであることを特徴とする請求の範囲１乃至４のい ずれかに記載のマーカー。 ６、　プロモータが、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ジヒドロホ レートレダクターゼ、又はキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラ ーゼ酵素の遺伝子の転写を正常にフントロールするプロモータの１つに属するこ とを特徴とする請求の範ｉ！！５１乃至４のいずれかに記載のマーカー。 ７、細菌カルチャーに於いてクローニングできる複製オリジンを含む原核吐５Ｄ ＮＡ由来の部分例えばファージ又は好ましくはプラスミドを含んでおり、前記プ ロモータと不活化酵素をコードする前記ＤＮＡ配列とが、ＤＮＡの前記部分に組 込まれていることを特徴とする請求の範１！ＩＩ乃至６のいずれかに記載のマー カー。 ８、プラスミドｐＢＲ３２２、更に好ましくは特にプラスミドｐＡＧｏ又はｐＦ Ｇ５から誘導さｆることを特徴とする請求の範囲７に記載のマーカー。 ９、転写の方向でのプロモータの最後の複数対のヌクレオチドが、ヌクレオチド 対の個数で示すと１０００未満好ましくは５００未満更に好ましくは１００未満 のヌクレオチド対で示される間隔に存在することを特徴とする請求の範囲１乃至 ８のいずれかに記載のマーカー。 １０、不活化酵素をコードするＤＮＡ配列の末端と、ポリアデニル化部位又は前 記ＤＮＡ配列の還元１停止コドン“との間の間隔を塩基対の個数で示すと、１０ ００未満、好ましくは５００未満、更に好ましくは１００未満のヌクレオチド対 で示されることを特徴とする請求の範囲１乃至９のいずれかに記載のマーカー。 １１、真核吐奥複製オリジン、例えば１サイミリヘルペスウイルス！なる指体で 知られるウィルスのＤＮＡの繰返し断片に対応する断片を含む補足配列を含むこ とを特徴とする請求の範囲１乃至１０のいずれかに記載のマーカー。 １２、不活化酵素をコードする配列がトランスポゾンＴｎ　５又はＴｎ６０１　 に含まれるリン酸化酵素をコードする遺伝子に対応しておシ、プロモータがヘル ペスウィルスのＴＫ遺伝子のプロモータに対応することを特徴とする請求の範囲 ｌ乃至１１のいずれかに記載のマーカー。 １３、ゲノムの別の領域に、所定のタンｌ（りの転写及び発現に必要な全ての遺 伝情報を含むＤＮＡ配列から成るインサートを含むことを特徴とする請求の範囲 １乃至１２のいずれかに記載のマーカー。 １４、イア”ｊ−）カ、ＤＮＡ　ＨＢＶ断片、特にＤＮＡ　ＨＢＶのＳ遺伝子を 含む断片から成ることを特徴とする請求の範囲１３に記載のマーカー。 １５、選択的内部遺伝的マーカーとして請求の範囲１乃至１４のいずれかに記載 のマーカーを含むことを特徴とするワクチン製造に適した特にサル又はヒト由来 の真核細胞。 １６、真核細胞の少くとも一部を形質転換せしめ得る条件下で請求の範囲１乃至 １５のいずれかに記載のマーカーを前記細胞と接触させ、前記マーカーのＤＮＡ 配列にニジコードされる酵素によシネ活化され得る抗生物質を含む前記細胞の増 殖に適した培地中で前記細胞の培養を実施することを特徴とする真核細胞の標識 方法。 １７、マーカーが、抗生物質Ｇ４１８を不活化せしめるリン酸化酵素又はアセチ ル化酵素をコードするＤＮＡ配列を含むこと、及び抗生物質０４１８を含む培地 中で培養が実施されること、及び、培養後に選択的遺伝的マーカーが取込まれた コロニーを回収することを特徴とする請求の範囲１５に記載の方法。 １８、請求の範囲１乃至１５のいずれかに記載の選択的遺伝的マーカーと目的と する特定タンツクをコードするＤＮＡを含むベクターとを用いる真核細胞の形質 転換を含んでおシ、前記マーカーと特定タンノぐりをコーｒする前記ＤＮＡとが 、両者とも同一のベクターに含有されるか、又は、別々のベクターに含有されて いることを特徴とする特定タンパクの製法。