JP3386461B2 - 遺伝子移入法および遺伝子移入療法に用いるシトシンデアミナーゼの負の選択系 - Google Patents
遺伝子移入法および遺伝子移入療法に用いるシトシンデアミナーゼの負の選択系Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の技術分野
本発明は真核性発現ベクター中に遺伝子工学で組込ま
れたシトシンデアミナーゼの修飾された細菌遺伝子を含
有する系およびその遺伝子のマウス繊維芽細胞による発
現に関する。
れたシトシンデアミナーゼの修飾された細菌遺伝子を含
有する系およびその遺伝子のマウス繊維芽細胞による発
現に関する。
さらに本発明は、５−フルオロシトシンから毒性の代
謝拮抗剤の５−フルオロウラシルを産生する性能を有す
る負の選択を行える標識形質（marker）であるシトシン
デアミナーゼを利用する方法、遺伝子療法およびワクチ
ンに関する。
謝拮抗剤の５−フルオロウラシルを産生する性能を有す
る負の選択を行える標識形質（marker）であるシトシン
デアミナーゼを利用する方法、遺伝子療法およびワクチ
ンに関する。
背景の情報
選択可能な遺伝標識形質は遺伝子の調節と機能を試験
するのに重要な手段でありかつ遺伝子移入療法に潜在的
に重要である。細胞障害性試薬に対して独特の耐性また
は感受性を与えれば当業者は遺伝子を変えられた細胞を
混合細胞集団から選択または除くことができる。
するのに重要な手段でありかつ遺伝子移入療法に潜在的
に重要である。細胞障害性試薬に対して独特の耐性また
は感受性を与えれば当業者は遺伝子を変えられた細胞を
混合細胞集団から選択または除くことができる。
酵素シトシンデアミナーゼ（CD）は、シトシンのデア
ミノ化反応を触媒してウラシルを生成する性能をもって
いるので選択可能な遺伝標識形質として本発明において
有用である（M.Kilstrupら、J.Bacteriology,171巻、21
24〜2127頁、1989年;L.Andersonら、Arch.Microbiol.,1
52巻、115〜118頁、1989年）。この遺伝子を発現する細
菌と真菌は、５−フルオロシトシン（5FC）を５−フル
オロウラシル（5FU）に変換するがこの代謝生成物は微
生物に対して毒性である〔A.PolakおよびH.J.Scholer,C
hemotherapy（Basel）,21巻、113−130頁、1975年〕。
哺乳類の細胞は有意な量のシトシンデアミナーゼを発現
しないので5FCを脱アミノ化しない（A.Polakら、Chemot
herapy,22巻、137〜153頁、1976年;B.A.Koechlinら、Bi
ochemical Pharmacology,15巻、434−446頁、1966
年）。そして5FCは哺乳類細胞に対して比較的非毒性で
ある〔Goodman and Gilman:the Pharmacological Basis
of Therapeutics、第８版、A.G.Gilman,T.Rall,A.S.Ni
esおよびP.Taylo編集（米国、ニューヨーク、Pergamon
Press）中1165〜1181頁に記載のJ.E.Bennettの論文）。
しかし5FUは哺乳類細胞に対して強い細胞障害作用をも
っている。5FUは続いて代謝されたFUTPとFdUMPになり、
その結果、RNAとDNAの両者の合成を阻害して細胞を殺す
〔Goodman and Gilman:the Pharmacological Basis of
Therapeutics、第８版、A.G.Gilman,T.Rall,A.S.Niesお
よびP.Taylor編集（Pergamon Press、米国、ニューヨー
ク）の1209〜1263頁におけるP.CalabrisiおよびB.A.Cha
bnerの論文;L.E.Damonら、Pharmac.Ther.,43巻、155〜1
89頁、1989年〕。したがって、5FCの5FUへの細胞内代謝
変換は哺乳類細胞に対して致命的である。
ミノ化反応を触媒してウラシルを生成する性能をもって
いるので選択可能な遺伝標識形質として本発明において
有用である（M.Kilstrupら、J.Bacteriology,171巻、21
24〜2127頁、1989年;L.Andersonら、Arch.Microbiol.,1
52巻、115〜118頁、1989年）。この遺伝子を発現する細
菌と真菌は、５−フルオロシトシン（5FC）を５−フル
オロウラシル（5FU）に変換するがこの代謝生成物は微
生物に対して毒性である〔A.PolakおよびH.J.Scholer,C
hemotherapy（Basel）,21巻、113−130頁、1975年〕。
哺乳類の細胞は有意な量のシトシンデアミナーゼを発現
しないので5FCを脱アミノ化しない（A.Polakら、Chemot
herapy,22巻、137〜153頁、1976年;B.A.Koechlinら、Bi
ochemical Pharmacology,15巻、434−446頁、1966
年）。そして5FCは哺乳類細胞に対して比較的非毒性で
ある〔Goodman and Gilman:the Pharmacological Basis
of Therapeutics、第８版、A.G.Gilman,T.Rall,A.S.Ni
esおよびP.Taylo編集（米国、ニューヨーク、Pergamon
Press）中1165〜1181頁に記載のJ.E.Bennettの論文）。
しかし5FUは哺乳類細胞に対して強い細胞障害作用をも
っている。5FUは続いて代謝されたFUTPとFdUMPになり、
その結果、RNAとDNAの両者の合成を阻害して細胞を殺す
〔Goodman and Gilman:the Pharmacological Basis of
Therapeutics、第８版、A.G.Gilman,T.Rall,A.S.Niesお
よびP.Taylor編集（Pergamon Press、米国、ニューヨー
ク）の1209〜1263頁におけるP.CalabrisiおよびB.A.Cha
bnerの論文;L.E.Damonら、Pharmac.Ther.,43巻、155〜1
89頁、1989年〕。したがって、5FCの5FUへの細胞内代謝
変換は哺乳類細胞に対して致命的である。
シトシンデアミナーゼの細菌遺伝子は最近単離され、
クローン化された（L.Andersonら、1989年）。本発明は
新しい負の選択可能な標識形質を提供するものであり、
その標識形質において、微生物例えば細菌由来のシトシ
ンデアミナーゼの遺伝子が修飾されて真核性発現ベクタ
ーに組込まれ、哺乳類細胞中で発現されて、その移入さ
れた細胞に対して5FCの細胞障害作用に対して独特の感
受性を与える。また本発明は、シトシンデアミナーゼの
負の系を、細胞の分集団を選択して除去するために生体
外で用いおよび遺伝子移入療法とワクチン用に生体内で
用いる方法を提供するものである。
クローン化された（L.Andersonら、1989年）。本発明は
新しい負の選択可能な標識形質を提供するものであり、
その標識形質において、微生物例えば細菌由来のシトシ
ンデアミナーゼの遺伝子が修飾されて真核性発現ベクタ
ーに組込まれ、哺乳類細胞中で発現されて、その移入さ
れた細胞に対して5FCの細胞障害作用に対して独特の感
受性を与える。また本発明は、シトシンデアミナーゼの
負の系を、細胞の分集団を選択して除去するために生体
外で用いおよび遺伝子移入療法とワクチン用に生体内で
用いる方法を提供するものである。
発明の要約
本発明の目的は、哺乳類細胞中の修飾されたシトシン
デアミナーゼ（CD）遺伝子を含有する新規な発現遺伝子
構造体と、その結果、修飾されたCD遺伝子を遺伝子工学
的に組込まれた哺乳類細胞の５−フルオロシトシン（5F
C）に対する感受性を提供するものである。
デアミナーゼ（CD）遺伝子を含有する新規な発現遺伝子
構造体と、その結果、修飾されたCD遺伝子を遺伝子工学
的に組込まれた哺乳類細胞の５−フルオロシトシン（5F
C）に対する感受性を提供するものである。
本発明の他の目的は、免疫療法、遺伝子療法および骨
髄移植法を含む各種の治療法において、CD遺伝子構造体
またはその修飾体を利用する必要がある方法を提供され
たものである。
髄移植法を含む各種の治療法において、CD遺伝子構造体
またはその修飾体を利用する必要がある方法を提供され
たものである。
本発明の他の種々の目的と利点は図面と本発明の詳細
な説明から明らかになるであろう。
な説明から明らかになるであろう。
一実施態様において、本発明は微生物由来の修飾され
たシトシンデアミナーゼ遺伝子と真核性発現ベクターと
からなるDNA構造体に関する。微生物の例は細菌と真菌
である。
たシトシンデアミナーゼ遺伝子と真核性発現ベクターと
からなるDNA構造体に関する。微生物の例は細菌と真菌
である。
他の実施態様において、本発明は受託番号が＃40999
のpCD2と命名されたDNAプラスミド構造体に関する。
のpCD2と命名されたDNAプラスミド構造体に関する。
別の実施態様において、本発明は修飾されたシトシン
デアミナーゼ遺伝子と真核性発現ベクターからなるDNA
構造体を含有する哺乳類宿主細胞に関する。本発明のさ
らに別の態様において、修飾された細菌シトシンデアミ
ナーゼDNA構造体を含有する哺乳類宿主細胞はシトシン
デアミナーゼタンパク質を発現する。
デアミナーゼ遺伝子と真核性発現ベクターからなるDNA
構造体を含有する哺乳類宿主細胞に関する。本発明のさ
らに別の態様において、修飾された細菌シトシンデアミ
ナーゼDNA構造体を含有する哺乳類宿主細胞はシトシン
デアミナーゼタンパク質を発現する。
他の実施態様において、本発明は、修飾されたCD遺伝
子、真核性発現ベクターおよび外因性DNAからなるDNA構
造体を宿主または患者のゲノムに挿入し、次いで該DNA
構造体をそのゲノムに取込んだ細胞を選択的に殺す、薬
理学的に許容される投与量の5FCで宿主または患者を治
療するステップからなる遺伝子移入療法に安全系を提供
するCDの負の選択標識形質に関する。
子、真核性発現ベクターおよび外因性DNAからなるDNA構
造体を宿主または患者のゲノムに挿入し、次いで該DNA
構造体をそのゲノムに取込んだ細胞を選択的に殺す、薬
理学的に許容される投与量の5FCで宿主または患者を治
療するステップからなる遺伝子移入療法に安全系を提供
するCDの負の選択標識形質に関する。
他の実施態様において、本発明は、修飾されたCD遺伝
子、真核性発現ベクターおよび問題の治療遺伝子を含有
するDNA構造体を宿主細胞に挿入して宿主細胞を変化さ
せ、次いでその変化させた宿主細胞を、その数は減少さ
せるのが完全には破壊しないように医薬量の5FCを定期
的に投与して治療するステップからなる、宿主内での遺
伝子産物の発現を調節する遺伝子療法に関する。宿主内
での遺伝子産物の発現を調整する方法の一つの変形で
は、上記の方法が、5FCによる治療が一層高い投与量で
行われ、変化させた細胞がすべて破壊されるように修飾
される。
子、真核性発現ベクターおよび問題の治療遺伝子を含有
するDNA構造体を宿主細胞に挿入して宿主細胞を変化さ
せ、次いでその変化させた宿主細胞を、その数は減少さ
せるのが完全には破壊しないように医薬量の5FCを定期
的に投与して治療するステップからなる、宿主内での遺
伝子産物の発現を調節する遺伝子療法に関する。宿主内
での遺伝子産物の発現を調整する方法の一つの変形で
は、上記の方法が、5FCによる治療が一層高い投与量で
行われ、変化させた細胞がすべて破壊されるように修飾
される。
本発明はさらに、修飾されたCD遺伝子と、真核性発現
ベクターと腫瘍細胞を含有する、哺乳類用の生腫瘍ワク
チンに関する。
ベクターと腫瘍細胞を含有する、哺乳類用の生腫瘍ワク
チンに関する。
別の態様において、本発明は、上記の生ワクチンの許
容投与量を患者に投与し、続いて、ワクチンとして使用
された生きている細胞を破壊する高投与量の5FCを投与
することからなる患者の腫瘍を治療する方法を提供する
ものである。
容投与量を患者に投与し、続いて、ワクチンとして使用
された生きている細胞を破壊する高投与量の5FCを投与
することからなる患者の腫瘍を治療する方法を提供する
ものである。
別の実施態様において、本発明は、生の非弱毒化のウ
イルス、細菌もしくは原生動物、修飾されたCD遺伝子お
よび発現ベクターを、上記ウイルス、細菌もしくは原生
動物に対する免疫化を誘発するのに充分な量で含有する
微生物学的病原に対する哺乳類用ワクチンに関する。
イルス、細菌もしくは原生動物、修飾されたCD遺伝子お
よび発現ベクターを、上記ウイルス、細菌もしくは原生
動物に対する免疫化を誘発するのに充分な量で含有する
微生物学的病原に対する哺乳類用ワクチンに関する。
他の実施態様において、本発明は、上記ワクチンを宿
主に投与し、続いて生の免疫原を破壊するのに充分な高
投与量の5FCを投与することからなる、微生物学的病原
に対する予防接種法に関する。
主に投与し、続いて生の免疫原を破壊するのに充分な高
投与量の5FCを投与することからなる、微生物学的病原
に対する予防接種法に関する。
別の実施態様において、本発明は、修飾されたCD構造
体が優先的に腫瘍の細胞またはリンパ球に感染するが骨
髄幹細胞には感染しないような方式で、ベクターにパッ
ケージされた修飾されたCD構造体で骨髄移植体を処理
し、続いて腫瘍の細胞もしくはリンパ球が完全に除去さ
れるか破壊されるような投与量の5FCで骨髄細胞を処理
し、次いでその処理された骨髄細胞を患者に投与するス
テップからなる同種〔累系〕間または自己由来の骨髄移
植体を患者に投与する方法に関する。上記の方法の変形
では、5FCによる処理は、骨髄移植の患者への投与に続
いて行われる。
体が優先的に腫瘍の細胞またはリンパ球に感染するが骨
髄幹細胞には感染しないような方式で、ベクターにパッ
ケージされた修飾されたCD構造体で骨髄移植体を処理
し、続いて腫瘍の細胞もしくはリンパ球が完全に除去さ
れるか破壊されるような投与量の5FCで骨髄細胞を処理
し、次いでその処理された骨髄細胞を患者に投与するス
テップからなる同種〔累系〕間または自己由来の骨髄移
植体を患者に投与する方法に関する。上記の方法の変形
では、5FCによる処理は、骨髄移植の患者への投与に続
いて行われる。
さらに他の実施態様において、本発明は修飾CDされた
遺伝子、ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子および真核性
発現ベクターを含有する二重の負の選択ベクターに関す
る。
遺伝子、ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子および真核性
発現ベクターを含有する二重の負の選択ベクターに関す
る。
さらに他の実施態様において、本発明は、修飾された
CD DNA構造体を生体外で細胞系に挿入し、該CD DNA構造
体のDNA配列に有意な相同性を保持しているが該CD遺伝
子を生物学的に不活性にする欠失変異体を創製し、次い
で成功した相同的組換えを、5FCに対する感受性の損失
を測定することによって検出するステップからなる、成
功した相同的組換え事象を検出する診断方法に関する。
CD DNA構造体を生体外で細胞系に挿入し、該CD DNA構造
体のDNA配列に有意な相同性を保持しているが該CD遺伝
子を生物学的に不活性にする欠失変異体を創製し、次い
で成功した相同的組換えを、5FCに対する感受性の損失
を測定することによって検出するステップからなる、成
功した相同的組換え事象を検出する診断方法に関する。
他の実施態様において本発明は、修飾されたCD遺伝子
および組織特異的プロモータからなる修飾されたCD DNA
構造体を動物の細胞に挿入し、次にその動物を5FCで処
理して前記組織特異的プロモーターに対応する組織を除
くステップからなる動物の組織を選択的に除く方法に関
する。
および組織特異的プロモータからなる修飾されたCD DNA
構造体を動物の細胞に挿入し、次にその動物を5FCで処
理して前記組織特異的プロモーターに対応する組織を除
くステップからなる動物の組織を選択的に除く方法に関
する。
さらに他の実施態様において、本発明は、修飾された
CD遺伝子と、癌細胞を形質導入する偏好性を有するプロ
モーターとからなるDNA構造体の治療投与量を患者に投
与し、続いて癌細胞を破壊するが他の細胞を破壊しない
5FCの毒性投与量で患者の治療するステップからなる患
者の癌の治療法に関する。
CD遺伝子と、癌細胞を形質導入する偏好性を有するプロ
モーターとからなるDNA構造体の治療投与量を患者に投
与し、続いて癌細胞を破壊するが他の細胞を破壊しない
5FCの毒性投与量で患者の治療するステップからなる患
者の癌の治療法に関する。
本願に挙げたすべての刊行物の全内容は本願に援用す
るものとする。
るものとする。
図面の簡単な説明
図１はpCD2の構築を示す。シトシンデアミナーゼ遺伝
子の真核性発現ベクターpLXSNへのクローン化は次のよ
うにして実施した。Hinc IIとBamH Iで消化したpMK116
由来の1.7kbのシトシンデアミナーゼフラグメントを、H
pa IとBamH Iで消化したpLXSNのポリクローン化部位に
連結してpCD1を製造した。出発部位GTGの近くのEcoR I
部位における５′領域のpCD1の配列を示してある。次に
pCD1のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発と修飾さ
れたシトシンデアミナーゼ遺伝子のpLXSNへの再クロー
ン化とを行ってpCD2を製造した。PCRプライマー（１）
とpMK116（L.Andersonら、1989年）を、上流のATGを除
き、出発コドンにおいてGTGをATGに変えるのに用いた。
次に修飾されたシトシンデアミナーゼ遺伝子をpLXSNに
クローン化した。EcoR I部位の近くで始まる出発コドン
の５′領域におけるpCD2の配列を示している。
子の真核性発現ベクターpLXSNへのクローン化は次のよ
うにして実施した。Hinc IIとBamH Iで消化したpMK116
由来の1.7kbのシトシンデアミナーゼフラグメントを、H
pa IとBamH Iで消化したpLXSNのポリクローン化部位に
連結してpCD1を製造した。出発部位GTGの近くのEcoR I
部位における５′領域のpCD1の配列を示してある。次に
pCD1のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発と修飾さ
れたシトシンデアミナーゼ遺伝子のpLXSNへの再クロー
ン化とを行ってpCD2を製造した。PCRプライマー（１）
とpMK116（L.Andersonら、1989年）を、上流のATGを除
き、出発コドンにおいてGTGをATGに変えるのに用いた。
次に修飾されたシトシンデアミナーゼ遺伝子をpLXSNに
クローン化した。EcoR I部位の近くで始まる出発コドン
の５′領域におけるpCD2の配列を示している。
図２はpCD2でトランスフェクトされた細胞のゲノムDN
A中のシトシンデアミナーゼ遺伝子の存在を検出するサ
ザン分析の結果を示す。
A中のシトシンデアミナーゼ遺伝子の存在を検出するサ
ザン分析の結果を示す。
パネルＡは、シトシンデアミナーゼDNAを合成するの
に鋳型として細胞DNAを用いて得たPCR生成物のサザン分
析結果を示す。修飾されたシトシンデアミナーゼ遺伝子
の５′と３′の末端に対応するプライマーを用いて１μ
ｇの細胞DNAをPCRに付した。PCR生成物を電気泳動に付
し、毛細管転移（capillary transfer）によってブロッ
トし、32Pで標識を付けたシトシンデアミナーゼプロー
ブでプローブした。見出されたバンドは1.7kbのフラグ
メントであった。
に鋳型として細胞DNAを用いて得たPCR生成物のサザン分
析結果を示す。修飾されたシトシンデアミナーゼ遺伝子
の５′と３′の末端に対応するプライマーを用いて１μ
ｇの細胞DNAをPCRに付した。PCR生成物を電気泳動に付
し、毛細管転移（capillary transfer）によってブロッ
トし、32Pで標識を付けたシトシンデアミナーゼプロー
ブでプローブした。見出されたバンドは1.7kbのフラグ
メントであった。
パネルＢは細胞DNAのサザン分析結果を示す。10μｇ
の細胞DNAをSac Iで消化し、電気泳動を行い、転移させ
次いで同じプローブでプローブした。Sca Iは、pCD2の
両方のLTR要素を切断し、再配列されていないDNAからシ
トシンデアミナーゼの配列を含有する4.5kbのフラグメ
ントを生成するはずである。Sac Iで消化する前に正の
対照として１μｇの3T3 DNAに30pgのpCD2を補充した（3
T3＋pCD2）。
の細胞DNAをSac Iで消化し、電気泳動を行い、転移させ
次いで同じプローブでプローブした。Sca Iは、pCD2の
両方のLTR要素を切断し、再配列されていないDNAからシ
トシンデアミナーゼの配列を含有する4.5kbのフラグメ
ントを生成するはずである。Sac Iで消化する前に正の
対照として１μｇの3T3 DNAに30pgのpCD2を補充した（3
T3＋pCD2）。
発明の詳細な説明
本発明は、一部分が、微生物由来のシトシンデアミナ
ーゼ（CD）遺伝子の真核性発現ベクターへの挿入に関す
る。本発明のこの態様の基本的な実施態様は、CD遺伝子
の哺乳類細胞内での発現の成功と、これに続いて起こる
該遺伝子を発現する細胞の５−フルオロシトシン（未変
化の哺乳類細胞に対して非毒性の試薬）の毒作用に対す
る感受性に関する。また本発明は上記のCD遺伝子の選択
可能な標識形質を、遺伝子移入試験および遺伝子移入療
法に利用する方法に関する。
ーゼ（CD）遺伝子の真核性発現ベクターへの挿入に関す
る。本発明のこの態様の基本的な実施態様は、CD遺伝子
の哺乳類細胞内での発現の成功と、これに続いて起こる
該遺伝子を発現する細胞の５−フルオロシトシン（未変
化の哺乳類細胞に対して非毒性の試薬）の毒作用に対す
る感受性に関する。また本発明は上記のCD遺伝子の選択
可能な標識形質を、遺伝子移入試験および遺伝子移入療
法に利用する方法に関する。
シトシンデアミナーゼ（CD）遺伝子は、真核性発現の
ための出発部位内およびその周辺を修飾された。シトシ
ンデアミナーゼは、これらの修飾なしでは、pLXSNのよ
うな強力なベクター中にクローン化された場合でも、哺
乳類細胞中での発現は不充分であった。特に、本発明
は、真核性発現ベクター例えばpCD2中に構築されたCDに
対する細菌遺伝子、および哺乳類の細胞例えばマウスの
繊維芽細胞での該遺伝子の発現に関する。
ための出発部位内およびその周辺を修飾された。シトシ
ンデアミナーゼは、これらの修飾なしでは、pLXSNのよ
うな強力なベクター中にクローン化された場合でも、哺
乳類細胞中での発現は不充分であった。特に、本発明
は、真核性発現ベクター例えばpCD2中に構築されたCDに
対する細菌遺伝子、および哺乳類の細胞例えばマウスの
繊維芽細胞での該遺伝子の発現に関する。
シトシンデアミナーゼ遺伝子は、各種の微生物に見出
され発現されている。その例としては以下のものがあ
る。すなわち、真菌のクリプトコックス・ネオフォルマ
ンス（Cryptococcus neoformans）、カンジダ・アルビ
カンス（Candida albicans）、トルロプシス・グラグラ
ータ（Torulopsis glabrata）、スポロトリックス・シ
ェンキイ（Sporothrix schenckii）、アスペルギルス
（Aspergillus）、クラドスポリウム（Cladosporiu
m）、およびフィアロフォラ（Phialophora）〔Goodman
and Gilman's the pharmacological Basis of Therapeu
tics第８版、A.G.Gilman編集、Pergamon Press、米国、
ニューヨーク、1990年の第50章:Antifungal AgentsのJ.
E.Bennettの論文〕ならびに細菌のエシェリキア・コリ
（Escherichia coli）およびサルモネラ・ティフィムリ
ウム（Salmonella Typhimurium）（L.Andersonら、Arch
ives of Microbiology,152巻、115〜118頁、1989年）が
ある。これらの微生物では、遺伝子によってコードされ
た酵素が同じ目的に役立っている。すなわち核酸を含有
するためにシトシンからウラシルを提供するのに役立っ
ている。イー・コリの酵素と遺伝子はこのグループの代
表的なものである。
され発現されている。その例としては以下のものがあ
る。すなわち、真菌のクリプトコックス・ネオフォルマ
ンス（Cryptococcus neoformans）、カンジダ・アルビ
カンス（Candida albicans）、トルロプシス・グラグラ
ータ（Torulopsis glabrata）、スポロトリックス・シ
ェンキイ（Sporothrix schenckii）、アスペルギルス
（Aspergillus）、クラドスポリウム（Cladosporiu
m）、およびフィアロフォラ（Phialophora）〔Goodman
and Gilman's the pharmacological Basis of Therapeu
tics第８版、A.G.Gilman編集、Pergamon Press、米国、
ニューヨーク、1990年の第50章:Antifungal AgentsのJ.
E.Bennettの論文〕ならびに細菌のエシェリキア・コリ
（Escherichia coli）およびサルモネラ・ティフィムリ
ウム（Salmonella Typhimurium）（L.Andersonら、Arch
ives of Microbiology,152巻、115〜118頁、1989年）が
ある。これらの微生物では、遺伝子によってコードされ
た酵素が同じ目的に役立っている。すなわち核酸を含有
するためにシトシンからウラシルを提供するのに役立っ
ている。イー・コリの酵素と遺伝子はこのグループの代
表的なものである。
本発明の著しい特徴は、負の選択系を創製するのを目
的として高級な真核細胞内にCD遺伝子を発現することで
ある。分子生物学の技術分野の熟練者は、各種の他の真
核性発現ベクター内に修飾されたCD遺伝子を発現して本
願に開示したのと同じ目的を達成することができる。
的として高級な真核細胞内にCD遺伝子を発現することで
ある。分子生物学の技術分野の熟練者は、各種の他の真
核性発現ベクター内に修飾されたCD遺伝子を発現して本
願に開示したのと同じ目的を達成することができる。
哺乳類の細胞に該遺伝子を導入すると、トランスフェ
クトされた細胞にシトシンをウラシルに変換する性能が
もたらされる。そして通常哺乳類の細胞は酵素のシトシ
ンデアミナーゼを含有していない。放射能標識をつけた
シトシンのウラシルへの生体外での変換は、トランスフ
ェクトされた細胞に常に見られる。該遺伝子の存在と発
現は、その細胞が5FCに暴露されなければ、その細胞に
対して明確な有害作用をもっていない。しかしかような
細胞が5FCに暴露されると、クローン原性検定によって
コロニーを産生できないことおよび3H−チミジン捕集検
定によって増殖が損われていることから判断されるよう
に増殖を停止して死滅する（実施例３参照）。その毒性
は、その細胞による5FCから5FUへの脱アミノ化反応が原
因であった。通常の細胞は5FCによって阻害されず、生
体外で明白なシトシンデアミナーゼ活性を有するこれら
細胞系だけが5FCの毒性に対して感受性であった。
クトされた細胞にシトシンをウラシルに変換する性能が
もたらされる。そして通常哺乳類の細胞は酵素のシトシ
ンデアミナーゼを含有していない。放射能標識をつけた
シトシンのウラシルへの生体外での変換は、トランスフ
ェクトされた細胞に常に見られる。該遺伝子の存在と発
現は、その細胞が5FCに暴露されなければ、その細胞に
対して明確な有害作用をもっていない。しかしかような
細胞が5FCに暴露されると、クローン原性検定によって
コロニーを産生できないことおよび3H−チミジン捕集検
定によって増殖が損われていることから判断されるよう
に増殖を停止して死滅する（実施例３参照）。その毒性
は、その細胞による5FCから5FUへの脱アミノ化反応が原
因であった。通常の細胞は5FCによって阻害されず、生
体外で明白なシトシンデアミナーゼ活性を有するこれら
細胞系だけが5FCの毒性に対して感受性であった。
細胞を、5FCの毒作用を選択的に受けることができる
ようにする性能は、本発明のCDの負の選択系を、上記の
各種治療検定法とワクチンに実施するのに重要である。
ようにする性能は、本発明のCDの負の選択系を、上記の
各種治療検定法とワクチンに実施するのに重要である。
本発明は、修飾されたシトシンデアミナーゼ遺伝子の
哺乳類細胞内での新規な発現と、これに続いて起こる、
修飾されたCD遺伝子を遺伝子工学的に組込まれた細胞の
5FCへの感受性について述べる。下記の本発明には、プ
ラスミドpCD2の直接利用、ならびに、出願人がシトシン
デアミナーゼの負の選択系について提供した情報、およ
び公知になっている、他の真核性遺伝子の発現プロモー
ター／エンハンサーとレトロウイルスのパッケージング
細胞系に関する知識と資料を与えられたならば、分子生
物学の技術分野の個々の熟練者は容易に実施するであろ
うプラスミドpCD2の修飾が含まれている。
哺乳類細胞内での新規な発現と、これに続いて起こる、
修飾されたCD遺伝子を遺伝子工学的に組込まれた細胞の
5FCへの感受性について述べる。下記の本発明には、プ
ラスミドpCD2の直接利用、ならびに、出願人がシトシン
デアミナーゼの負の選択系について提供した情報、およ
び公知になっている、他の真核性遺伝子の発現プロモー
ター／エンハンサーとレトロウイルスのパッケージング
細胞系に関する知識と資料を与えられたならば、分子生
物学の技術分野の個々の熟練者は容易に実施するであろ
うプラスミドpCD2の修飾が含まれている。
本発明はまず第一に、シトシンデアミナーゼとしての
細菌酵素は、配列が適切に修飾され真核性プロモーター
の制御下にあれば、トランスフェクションまたはレトロ
ウイルスの形質導入によってゲノム中に挿入され細胞を
5FCに対し選択的に感受性にすることができることを例
証するものである。シトシンデアミナーゼ遺伝子を遺伝
子工学的に組込むことによって哺乳類細胞を5FCに対し
て感受性にする本発明を提供することによって、当該技
術分野の当業者は、分子生物学およびレトロウイルス学
の公知の技術を単に適用するだけで各種の組織にシトシ
ンデアミナーゼの負の選択系（CDNSS）を適用すること
ができる。多数の組織特異的プロモーター／エンハンサ
ーの配列が報告されている。これらのプロモーター／エ
ンハンサー要素の代表的な例として、下記の引用文献が
挙げられる。すなわち、筋肉と神経系の組織については
E.Barneaら、Neuron,5巻、881〜888頁、1990年；甲状腺
の組織についてはC.Ledentら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,87巻、6176〜6180頁、1990年；リンパ球系組織につい
てはG.P.CookおよびM.S.Neuberger,Nucleic Acids Re
s.,18巻、3665〜3671頁、1990年；肝臓組織については
P.Herbomelら、Mol.Biol.,9巻、4750〜4758頁、1989年
およびM.G.Izbanら、J.Biol.Chem.,264巻、9171〜9199
頁、1989年；骨髄組織についてはJ.Magramら、Mol.Cell
Biol.,9巻、4750〜4758頁、1989年がある。
細菌酵素は、配列が適切に修飾され真核性プロモーター
の制御下にあれば、トランスフェクションまたはレトロ
ウイルスの形質導入によってゲノム中に挿入され細胞を
5FCに対し選択的に感受性にすることができることを例
証するものである。シトシンデアミナーゼ遺伝子を遺伝
子工学的に組込むことによって哺乳類細胞を5FCに対し
て感受性にする本発明を提供することによって、当該技
術分野の当業者は、分子生物学およびレトロウイルス学
の公知の技術を単に適用するだけで各種の組織にシトシ
ンデアミナーゼの負の選択系（CDNSS）を適用すること
ができる。多数の組織特異的プロモーター／エンハンサ
ーの配列が報告されている。これらのプロモーター／エ
ンハンサー要素の代表的な例として、下記の引用文献が
挙げられる。すなわち、筋肉と神経系の組織については
E.Barneaら、Neuron,5巻、881〜888頁、1990年；甲状腺
の組織についてはC.Ledentら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,87巻、6176〜6180頁、1990年；リンパ球系組織につい
てはG.P.CookおよびM.S.Neuberger,Nucleic Acids Re
s.,18巻、3665〜3671頁、1990年；肝臓組織については
P.Herbomelら、Mol.Biol.,9巻、4750〜4758頁、1989年
およびM.G.Izbanら、J.Biol.Chem.,264巻、9171〜9199
頁、1989年；骨髄組織についてはJ.Magramら、Mol.Cell
Biol.,9巻、4750〜4758頁、1989年がある。
本願および他の文献に記載されているクローン化技術
を用いれば、組織特異的プロモーター／エンハンサーを
pCD2に挿入して、シトシンデアミナーゼ遺伝式を特定の
組織内で活性化させることができるであろう。これの一
例は、免疫グロブリンの重鎖のプロモーター／エンハン
サーをＢ−細胞中で該遺伝子を活性化するのに使用する
ことである（S.Ecclesら、New Biol.,2巻、801〜811
頁、1990年;J.Wandら、Mol.Cell Biol.,11巻、75〜83
頁、1991年;B.Portonら、Mol.Cell Biol.,10巻、1076〜
1083頁、1990年;C.QueenおよびD.Baltimore,Cell,32
巻、717〜728頁、1983年;W.E.Paul編集Fundamental Imm
unology（第２版）、Paven Press、米国、ニューヨー
ク、235〜290頁、1989年E.E.Maxの論文“Immunoglobuli
ns:Molecular Genetics"）。
を用いれば、組織特異的プロモーター／エンハンサーを
pCD2に挿入して、シトシンデアミナーゼ遺伝式を特定の
組織内で活性化させることができるであろう。これの一
例は、免疫グロブリンの重鎖のプロモーター／エンハン
サーをＢ−細胞中で該遺伝子を活性化するのに使用する
ことである（S.Ecclesら、New Biol.,2巻、801〜811
頁、1990年;J.Wandら、Mol.Cell Biol.,11巻、75〜83
頁、1991年;B.Portonら、Mol.Cell Biol.,10巻、1076〜
1083頁、1990年;C.QueenおよびD.Baltimore,Cell,32
巻、717〜728頁、1983年;W.E.Paul編集Fundamental Imm
unology（第２版）、Paven Press、米国、ニューヨー
ク、235〜290頁、1989年E.E.Maxの論文“Immunoglobuli
ns:Molecular Genetics"）。
組織特異性を与える他の方法は、異なるパッケージン
グ細胞系でpCD2プラスミドを用いてCDNSSを放出する方
法であり、このような細胞系の一例は、本発明の発明者
らが本願で述べる細胞系PA317である。異なる細胞形と
種向性を有する各種のレトロウイルスパッケージング系
が報告されている（A.D.Miller,Human Gene Therapy,1
巻、５〜14頁、1990年）。分子生物学の当業者であれ
ば、本発明を用いて、それを、リン酸カルシウム沈澱法
を雨いて、CDNSSの標的細胞特異性を変えるであろう異
なるパッケージング細胞系にトランスフェクトすること
は困難でないであろう。
グ細胞系でpCD2プラスミドを用いてCDNSSを放出する方
法であり、このような細胞系の一例は、本発明の発明者
らが本願で述べる細胞系PA317である。異なる細胞形と
種向性を有する各種のレトロウイルスパッケージング系
が報告されている（A.D.Miller,Human Gene Therapy,1
巻、５〜14頁、1990年）。分子生物学の当業者であれ
ば、本発明を用いて、それを、リン酸カルシウム沈澱法
を雨いて、CDNSSの標的細胞特異性を変えるであろう異
なるパッケージング細胞系にトランスフェクトすること
は困難でないであろう。
一つの実施態様において、本発明は、遺伝子移入療法
に安全系を提供できるCDの負の選択標識形質系に関す
る。遺伝子療法は宿主または患者のゲノムへの外因性DN
Aの挿入を伴うので、標的細胞の悪性形質転換が起こる
ことがある。上記CD系はこの悪性細胞を破壊するのに用
いることができる。
に安全系を提供できるCDの負の選択標識形質系に関す
る。遺伝子療法は宿主または患者のゲノムへの外因性DN
Aの挿入を伴うので、標的細胞の悪性形質転換が起こる
ことがある。上記CD系はこの悪性細胞を破壊するのに用
いることができる。
この用途は、シトシンデアミナーゼの負の選択系（CD
NSS）について本願に記載されている本発明が与えられ
れば、いくつかの方法で達成することができるであろ
う。第一に、遺伝子療法に対する標的細胞をまずCDNSS
で処理し、次にネオマイシン耐性によって判断して上記
配列を組込んだ細胞だけが、治療遺伝子を保持する第二
のベクターで遺伝子療法を受けることができる。この２
ステップ法は、治療遺伝子ベクターによって変えられた
細胞もCDNSSをもっていることを保証するであろう。
NSS）について本願に記載されている本発明が与えられ
れば、いくつかの方法で達成することができるであろ
う。第一に、遺伝子療法に対する標的細胞をまずCDNSS
で処理し、次にネオマイシン耐性によって判断して上記
配列を組込んだ細胞だけが、治療遺伝子を保持する第二
のベクターで遺伝子療法を受けることができる。この２
ステップ法は、治療遺伝子ベクターによって変えられた
細胞もCDNSSをもっていることを保証するであろう。
第二に、分子生物学の技術分野のいずれかの熟練者は
CDNSSを修飾して、そのCDNSSと治療遺伝子を同じベクタ
ーに組込むことができるであろう。このことを達成する
方法の数は非常に多い。一例はネオマイシン耐性遺伝子
を除くかまたはpCD2に第三の遺伝子を加えることによっ
て、治療遺伝子とプロモーター要素をpCD2にクローン化
する方法である。他の例は、CDNSSのユニーク要素であ
る修飾されたシトシンデアミナーゼ遺伝子を制限エンド
ヌクレアーゼによって切出し、その遺伝子を、治療遺伝
子を保持する他のプラスミドまたはレトロウイルス中に
クローン化する方法である。そのベクターによって変え
られたいずれの細胞もCD遺伝子をもっている。その細胞
またはその子孫が悪性になった場合、その患者または宿
主は5FC（５−フルオロシトシン）で治療することがで
き、その細胞は殺される。
CDNSSを修飾して、そのCDNSSと治療遺伝子を同じベクタ
ーに組込むことができるであろう。このことを達成する
方法の数は非常に多い。一例はネオマイシン耐性遺伝子
を除くかまたはpCD2に第三の遺伝子を加えることによっ
て、治療遺伝子とプロモーター要素をpCD2にクローン化
する方法である。他の例は、CDNSSのユニーク要素であ
る修飾されたシトシンデアミナーゼ遺伝子を制限エンド
ヌクレアーゼによって切出し、その遺伝子を、治療遺伝
子を保持する他のプラスミドまたはレトロウイルス中に
クローン化する方法である。そのベクターによって変え
られたいずれの細胞もCD遺伝子をもっている。その細胞
またはその子孫が悪性になった場合、その患者または宿
主は5FC（５−フルオロシトシン）で治療することがで
き、その細胞は殺される。
同様に、遺伝子療法によって変えられた細胞が患者に
対して毒性の物質を産生した場合は、CD遺伝子がこれら
の細胞を破壊するのに使用することができる。例えば腫
瘍壊死因子が遺伝子療法に用いられる場合は、修飾され
たシトシンデアミナーゼ遺伝子のCDNSSはベクター中に
含めることができる。したがって、移入された細胞が宿
主に対して毒性の量のTNFを産生した場合、患者は5FCを
受けることができる。移入された細胞は破壊されるので
TNFの産生は停止する。この方法は、予期しないかまた
は容認できない副作用を有する治療遺伝子とともに利用
できる。
対して毒性の物質を産生した場合は、CD遺伝子がこれら
の細胞を破壊するのに使用することができる。例えば腫
瘍壊死因子が遺伝子療法に用いられる場合は、修飾され
たシトシンデアミナーゼ遺伝子のCDNSSはベクター中に
含めることができる。したがって、移入された細胞が宿
主に対して毒性の量のTNFを産生した場合、患者は5FCを
受けることができる。移入された細胞は破壊されるので
TNFの産生は停止する。この方法は、予期しないかまた
は容認できない副作用を有する治療遺伝子とともに利用
できる。
本発明はさらに、CDの負の選択系を利用することによ
って遺伝子療法において遺伝子発現を制御する方法に関
する。本発明のCD系は、宿主または患者が受ける遺伝子
産物の量を調節するのに使用できる。
って遺伝子療法において遺伝子発現を制御する方法に関
する。本発明のCD系は、宿主または患者が受ける遺伝子
産物の量を調節するのに使用できる。
CDNSSは、悪性の細胞または容認できない副作用を起
こしている細胞の制御を考察して先に述べたのと同様の
方式で遺伝子の投与量を調節するのに使用できる。すな
わち標的細胞がまず未修飾のCDNSSによって遺伝子的に
組込まれ、次いで該CDNSSで最初に修飾された細胞だけ
が、治療遺伝子を含有するベクターで第二の操作を受け
ることができる。あるいは分子生物学の個々の熟練者
は、CDNSSの必須の要素である修飾されたCD遺伝子を、
治療遺伝子を保持する他のベクター中に移動させ、次に
単一のベクターを用いて、そのCDNSSと治療遺伝子を移
入させることができる。この用途の例は次のとおりであ
る。例えばエリトロポエチンとCDの遺伝子は、貧血を治
療するため遺伝子療法で用いられる同じベクターにクロ
ーン化することができる。多数のベクターを含有する細
胞を注入した後、高血清レベルのホルモンを達成するこ
とができる。低投与量の5FCを患者に定期的に与えて、
ホルモンを産生する細胞のプールの大きさを小さくしし
たがってホルモンの血清レベルを所望のレベルまで低下
させることができる。同様に、患者に、遺伝子を変えら
れた細胞を永久的に保持させる代わりに、ごく短時間だ
け、患者に遺伝子療法を受けさせたい場合は、高投与量
の5FCを、予め決められた期間の終りに患者に投与して
すべての産生細胞を破壊することができる。この方法
は、あらゆる治療遺伝子とともに、例えばインスリン、
成長ホルモン、凝固因子類または成長因子とともに用い
ることができる。
こしている細胞の制御を考察して先に述べたのと同様の
方式で遺伝子の投与量を調節するのに使用できる。すな
わち標的細胞がまず未修飾のCDNSSによって遺伝子的に
組込まれ、次いで該CDNSSで最初に修飾された細胞だけ
が、治療遺伝子を含有するベクターで第二の操作を受け
ることができる。あるいは分子生物学の個々の熟練者
は、CDNSSの必須の要素である修飾されたCD遺伝子を、
治療遺伝子を保持する他のベクター中に移動させ、次に
単一のベクターを用いて、そのCDNSSと治療遺伝子を移
入させることができる。この用途の例は次のとおりであ
る。例えばエリトロポエチンとCDの遺伝子は、貧血を治
療するため遺伝子療法で用いられる同じベクターにクロ
ーン化することができる。多数のベクターを含有する細
胞を注入した後、高血清レベルのホルモンを達成するこ
とができる。低投与量の5FCを患者に定期的に与えて、
ホルモンを産生する細胞のプールの大きさを小さくしし
たがってホルモンの血清レベルを所望のレベルまで低下
させることができる。同様に、患者に、遺伝子を変えら
れた細胞を永久的に保持させる代わりに、ごく短時間だ
け、患者に遺伝子療法を受けさせたい場合は、高投与量
の5FCを、予め決められた期間の終りに患者に投与して
すべての産生細胞を破壊することができる。この方法
は、あらゆる治療遺伝子とともに、例えばインスリン、
成長ホルモン、凝固因子類または成長因子とともに用い
ることができる。
本発明はさらに、CD遺伝子を含有する生腫瘍ワクチン
に関する。悪性疾患の免疫療法は、宿主の腫瘍抽出物ま
たは腫瘍細胞のワクチンを使用して腫瘍に対する宿主の
免疫応答を強化することによって行われる（B.Gansbach
erら、J.Exp.Med.,172巻、1217〜1224頁、1990年）。生
ワクチンは、ウイルス学および細菌学の領域におけるワ
クチンの開発によって示されてきた殺された細胞または
細胞抽出物より有効である。しかし、ワクチンとして生
の腫瘍を患者に投与することは危険である。というの
は、生の腫瘍に対する初期の免疫応答は生の腫瘍を完全
には破壊しないことがあり、その腫瘍は依然として局部
的に広がりかつ転移する可能性がある。しかしトランス
フェクション、レトロウイルスの形質導入、または3T3
もしくはPA317の細胞とともに用いられる同じ方法を用
いるその他の遺伝子移入法によってCDNSSを生の腫瘍細
胞に導入すると、その腫瘍は5FCに対して感受性にな
る。この方法によれば生の腫瘍ワクチンが安全に使用で
きる。例えば腫瘍を接種してから２週間後に患者また宿
主は5FCを受けることができる。この方法によって腫瘍
の接種物は破壊されるが、その宿主の免疫細胞は損傷さ
れずに残る。
に関する。悪性疾患の免疫療法は、宿主の腫瘍抽出物ま
たは腫瘍細胞のワクチンを使用して腫瘍に対する宿主の
免疫応答を強化することによって行われる（B.Gansbach
erら、J.Exp.Med.,172巻、1217〜1224頁、1990年）。生
ワクチンは、ウイルス学および細菌学の領域におけるワ
クチンの開発によって示されてきた殺された細胞または
細胞抽出物より有効である。しかし、ワクチンとして生
の腫瘍を患者に投与することは危険である。というの
は、生の腫瘍に対する初期の免疫応答は生の腫瘍を完全
には破壊しないことがあり、その腫瘍は依然として局部
的に広がりかつ転移する可能性がある。しかしトランス
フェクション、レトロウイルスの形質導入、または3T3
もしくはPA317の細胞とともに用いられる同じ方法を用
いるその他の遺伝子移入法によってCDNSSを生の腫瘍細
胞に導入すると、その腫瘍は5FCに対して感受性にな
る。この方法によれば生の腫瘍ワクチンが安全に使用で
きる。例えば腫瘍を接種してから２週間後に患者また宿
主は5FCを受けることができる。この方法によって腫瘍
の接種物は破壊されるが、その宿主の免疫細胞は損傷さ
れずに残る。
本発明はさらに新規な生ワクチンおよび免疫原として
“弱毒化された”かまたは制御可能な病原体の新規な製
造方法に関する。いくつかのウイルス、細菌および原生
動物は著しく有毒なので免疫化には使用できない。弱毒
化された菌株を発生させる伝統的な方法では最適に免疫
性ではない微生物が生成することがある。本発明のCD系
は免疫化に用いる制御可能な病原体を製造するのに利用
できる。この状況におけるCDNSSの特異な特徴は、細胞
内病原体を保持している細胞を5FCで破壊する性能であ
る。修飾されたシトシンデアミナーゼ配列の遺伝子をpL
XSN中にクローン化する本願に記載の方法を用いればCDN
SSを修飾して、シトシンデアミナーゼ遺伝子および他の
ウイルスの要素を含有させることができる。例えばHIV
ゲノムの要素（エイズの原因であり、これに対する生ワ
クチンによる免疫化の方法は現在安全ではない）をCDNS
S中にクローン化することができる。その修飾された遺
伝子発現系はシトシンデアミナーゼよびHIVを発現す
る。次いでその修飾されたCDNSSは患者に投与すること
ができ、その接種によってHIV要素に対して免疫応答が
始まってから5FCを投与してHIV要素のそれ以上の転写と
翻訳を阻止することができる。この方法はアシクロビル
またはガンシクロビルによる単純ヘルペス感染症の治療
法に類似している〔A.G.Gilman編集、Goodman and Gilm
an's the Pharmacological Basis of Therapeutics（第
８版）1184〜1887頁、1990年中のR.G.Douglasの論文“A
ntiviral Angents"〕。
“弱毒化された”かまたは制御可能な病原体の新規な製
造方法に関する。いくつかのウイルス、細菌および原生
動物は著しく有毒なので免疫化には使用できない。弱毒
化された菌株を発生させる伝統的な方法では最適に免疫
性ではない微生物が生成することがある。本発明のCD系
は免疫化に用いる制御可能な病原体を製造するのに利用
できる。この状況におけるCDNSSの特異な特徴は、細胞
内病原体を保持している細胞を5FCで破壊する性能であ
る。修飾されたシトシンデアミナーゼ配列の遺伝子をpL
XSN中にクローン化する本願に記載の方法を用いればCDN
SSを修飾して、シトシンデアミナーゼ遺伝子および他の
ウイルスの要素を含有させることができる。例えばHIV
ゲノムの要素（エイズの原因であり、これに対する生ワ
クチンによる免疫化の方法は現在安全ではない）をCDNS
S中にクローン化することができる。その修飾された遺
伝子発現系はシトシンデアミナーゼよびHIVを発現す
る。次いでその修飾されたCDNSSは患者に投与すること
ができ、その接種によってHIV要素に対して免疫応答が
始まってから5FCを投与してHIV要素のそれ以上の転写と
翻訳を阻止することができる。この方法はアシクロビル
またはガンシクロビルによる単純ヘルペス感染症の治療
法に類似している〔A.G.Gilman編集、Goodman and Gilm
an's the Pharmacological Basis of Therapeutics（第
８版）1184〜1887頁、1990年中のR.G.Douglasの論文“A
ntiviral Angents"〕。
さらに他の実施態様において、本発明は、CDの負選択
系を用いるヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症の治療
法に関する。本願の別の部分に伸べられているように、
CDNSSは分子生物学の技術分野の熟練者によって種々の
方法で変えることができるであろう。その一つの変更
は、シトシンデアミナーゼ遺伝子の発現を駆動するプロ
モーターの他のプロモーターによる代替である。HIV転
写促進作用（transactivation）に応答するHIVゲノム由
来のプロモーター／エンハンサーの要素はシトシンデア
ミナーゼ遺伝子の上流に挿入することができる（K.A.Jo
nes,New Biol,1巻、127〜135頁、1989年）。細胞内HIV
活性はシトシンデアミナーゼ遺伝子を活性化することに
なる。このことはHIV感染症に対する新規な治療法を提
供する。HIV陽性個体由来の白血球は標準の白血球搬出
法で取出し、生体外でCDNSSに感染させ、患者に戻し次
いで患者には5FCが投与される。HIVを含有した細胞はそ
のときCDNSSを転写促進作用によって活性化し、5FCによ
って除去される。このようにしてHIV感染の増大は患者
内で削減される。
系を用いるヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染症の治療
法に関する。本願の別の部分に伸べられているように、
CDNSSは分子生物学の技術分野の熟練者によって種々の
方法で変えることができるであろう。その一つの変更
は、シトシンデアミナーゼ遺伝子の発現を駆動するプロ
モーターの他のプロモーターによる代替である。HIV転
写促進作用（transactivation）に応答するHIVゲノム由
来のプロモーター／エンハンサーの要素はシトシンデア
ミナーゼ遺伝子の上流に挿入することができる（K.A.Jo
nes,New Biol,1巻、127〜135頁、1989年）。細胞内HIV
活性はシトシンデアミナーゼ遺伝子を活性化することに
なる。このことはHIV感染症に対する新規な治療法を提
供する。HIV陽性個体由来の白血球は標準の白血球搬出
法で取出し、生体外でCDNSSに感染させ、患者に戻し次
いで患者には5FCが投与される。HIVを含有した細胞はそ
のときCDNSSを転写促進作用によって活性化し、5FCによ
って除去される。このようにしてHIV感染の増大は患者
内で削減される。
他の実施態様において、本発明は、同種〔異系〕また
は自己由来の骨髄移植に使用する治療法に関する。骨髄
移植法では、骨髄を患者に注入する前に骨髄からある種
の細胞を除くことが望ましい場合が多い。例えば残留腫
瘍細胞を除きたい場合、また骨髄被移植者に対宿主性移
植片病を起こすことがあるある種の細胞を除きたい場合
である。本発明のCD系はこのような除去法に用いること
ができる。例えば腫瘍細胞に優先的に感染するが骨髄幹
細胞には感染しないベクターにパッケージすることがで
きる。腫瘍細胞は5FCに対して感受性であるが骨髄幹細
胞は5FCに対して感受性ではない。
は自己由来の骨髄移植に使用する治療法に関する。骨髄
移植法では、骨髄を患者に注入する前に骨髄からある種
の細胞を除くことが望ましい場合が多い。例えば残留腫
瘍細胞を除きたい場合、また骨髄被移植者に対宿主性移
植片病を起こすことがあるある種の細胞を除きたい場合
である。本発明のCD系はこのような除去法に用いること
ができる。例えば腫瘍細胞に優先的に感染するが骨髄幹
細胞には感染しないベクターにパッケージすることがで
きる。腫瘍細胞は5FCに対して感受性であるが骨髄幹細
胞は5FCに対して感受性ではない。
レトロウイルス遺伝子の挿入は、複製中ではない細胞
すなわち細胞周期のG0にとどまっている細胞には起こら
ないということが報告されている（D.G.Millerら、Mol.
Cell Biol.,9巻、1426〜1434頁、1990年）。この現象
は、腫瘍が浸潤している骨髄への腫瘍細胞の選択感染の
原理である。骨髄幹細胞は、生体外で特定のホルモン刺
激がなければ静止したまゝであるが腫瘍細胞は自然に循
環する。この浸潤された骨髄を、CDNSSを保持するレト
ロウイルスに暴露すると、そのCD遺伝子は腫瘍細胞に挿
入されるが静止している骨髄幹細胞には挿入されない。
骨髄を注入した後患者に5FCを注入もしくは投与する前
に、骨髄を前処理しておくと感染した腫瘍細胞が除去さ
れる。同様に、本発明のCD遺伝子は、白血球には優先的
に感染するが幹細胞には感染しないベクター中にパッケ
ージすることができ、5FCは患者に注入もしくは投与す
る前に上記の白血球の骨髄を除くのに用いられ、対宿主
性移植片病を予防または治療する。
すなわち細胞周期のG0にとどまっている細胞には起こら
ないということが報告されている（D.G.Millerら、Mol.
Cell Biol.,9巻、1426〜1434頁、1990年）。この現象
は、腫瘍が浸潤している骨髄への腫瘍細胞の選択感染の
原理である。骨髄幹細胞は、生体外で特定のホルモン刺
激がなければ静止したまゝであるが腫瘍細胞は自然に循
環する。この浸潤された骨髄を、CDNSSを保持するレト
ロウイルスに暴露すると、そのCD遺伝子は腫瘍細胞に挿
入されるが静止している骨髄幹細胞には挿入されない。
骨髄を注入した後患者に5FCを注入もしくは投与する前
に、骨髄を前処理しておくと感染した腫瘍細胞が除去さ
れる。同様に、本発明のCD遺伝子は、白血球には優先的
に感染するが幹細胞には感染しないベクター中にパッケ
ージすることができ、5FCは患者に注入もしくは投与す
る前に上記の白血球の骨髄を除くのに用いられ、対宿主
性移植片病を予防または治療する。
さらに別の実施態様において、診断検定法として、本
発明のCD系は、成功した相同的組換えに対するリポータ
ー認識形質として使用することができる。CDNSS系を3T3
またはPA317の細胞に挿入すると記載されている方法と
同じ方法を用いて、生体外でCDNSSを細胞系に安定して
組込むことができる。分子生物学の技術分野の熟練者
は、CDNSSの制限部位について本発明を用いて、CDNSSの
DNA配列に対してかなりの相同性を保持しているが生物
学的に活性なシトシンデアミナーゼを与えない欠失変異
体を創製することができる。この方法は分子生物学で通
常用いられる。したがってこの欠失変異体とCDNSSは、
成功した相同的組換えに対する標識形質として5FCに対
する感受性を失うことから、相同的組換えの試験に利用
することができる。かような相同的組換え試験は、標的
にされた遺伝子挿入の試験において、選択可能な標識形
質またはリポーター遺伝子で行われている（R.J.Bollaf
ら、Annu.Rev.Genet.,23巻、199〜225頁、1989年）。
発明のCD系は、成功した相同的組換えに対するリポータ
ー認識形質として使用することができる。CDNSS系を3T3
またはPA317の細胞に挿入すると記載されている方法と
同じ方法を用いて、生体外でCDNSSを細胞系に安定して
組込むことができる。分子生物学の技術分野の熟練者
は、CDNSSの制限部位について本発明を用いて、CDNSSの
DNA配列に対してかなりの相同性を保持しているが生物
学的に活性なシトシンデアミナーゼを与えない欠失変異
体を創製することができる。この方法は分子生物学で通
常用いられる。したがってこの欠失変異体とCDNSSは、
成功した相同的組換えに対する標識形質として5FCに対
する感受性を失うことから、相同的組換えの試験に利用
することができる。かような相同的組換え試験は、標的
にされた遺伝子挿入の試験において、選択可能な標識形
質またはリポーター遺伝子で行われている（R.J.Bollaf
ら、Annu.Rev.Genet.,23巻、199〜225頁、1989年）。
他の実施態様において、本発明のCD系はウイルスベク
ターによる共培養（co−cultivation）形質導入法に用
いることができる。
ターによる共培養（co−cultivation）形質導入法に用
いることができる。
分子生物学とレトロウイルス遺伝子移入の研究におけ
る公知の方法は、標的細胞とレトロウイルス産性細胞系
の生体外での共培養である。これによって標的細胞は、
そのレトロウイルス含量が連続的に更新されている上澄
み液と充分に接触する（M.A.Eglitisら、Science,230
巻、1395〜1398頁、1985年;M.A.EglitisおよびW.F.Ande
rson,BioTechniques,6巻、608〜614頁、1988年）。遺伝
子移入のウイルス形質導入法において、細胞を含有して
いないウイルス上澄み液はウイルスを産生するウイルス
産生細胞系から収穫される。次に標的細胞がこの上澄み
液に暴露される。しかしウイルスの上澄み液は形質導入
に用いられる温度では不安定なのでその活性はすべて数
時間で失ってしまう。別の方法は、培養で、生きている
ウイルス産生系と標的細胞を混合する方法である。これ
らは長期間にわたって共培養されて標的細胞の一層有効
な形質導入を行うことができる。これは上記ウイルス産
生系が連続的に生きたウイルスを作るからである。この
ことは遺伝子療法に対して現在実施することはできな
い。なぜならば、該産生系と標的細胞系を分離すること
と、患者に投与するために精製された標的細胞だけを得
ることが非常に難しいからである。しかし本発明のCD遺
伝子系が、CD遺伝子のパッケージングをもたらさない形
態でウイルス産生系にトランスフェクトされたならば、
ウイルス産生細胞は、所望の期間のウイルス暴露が完了
した後5FCを培地に添加することによって、共培養の培
養物から除去できるであろう。次いで所望の標的細胞だ
けが生き残って宿主に与えることができる。
る公知の方法は、標的細胞とレトロウイルス産性細胞系
の生体外での共培養である。これによって標的細胞は、
そのレトロウイルス含量が連続的に更新されている上澄
み液と充分に接触する（M.A.Eglitisら、Science,230
巻、1395〜1398頁、1985年;M.A.EglitisおよびW.F.Ande
rson,BioTechniques,6巻、608〜614頁、1988年）。遺伝
子移入のウイルス形質導入法において、細胞を含有して
いないウイルス上澄み液はウイルスを産生するウイルス
産生細胞系から収穫される。次に標的細胞がこの上澄み
液に暴露される。しかしウイルスの上澄み液は形質導入
に用いられる温度では不安定なのでその活性はすべて数
時間で失ってしまう。別の方法は、培養で、生きている
ウイルス産生系と標的細胞を混合する方法である。これ
らは長期間にわたって共培養されて標的細胞の一層有効
な形質導入を行うことができる。これは上記ウイルス産
生系が連続的に生きたウイルスを作るからである。この
ことは遺伝子療法に対して現在実施することはできな
い。なぜならば、該産生系と標的細胞系を分離すること
と、患者に投与するために精製された標的細胞だけを得
ることが非常に難しいからである。しかし本発明のCD遺
伝子系が、CD遺伝子のパッケージングをもたらさない形
態でウイルス産生系にトランスフェクトされたならば、
ウイルス産生細胞は、所望の期間のウイルス暴露が完了
した後5FCを培地に添加することによって、共培養の培
養物から除去できるであろう。次いで所望の標的細胞だ
けが生き残って宿主に与えることができる。
本発明はさらに二重の選択ベクターを作製する新規な
方法に関する。本発明のCD遺伝子系は、ヘルペスチミジ
ンキナーゼの遺伝子とともに、他の遺伝子を有する遺伝
子移入ベクター中に挿入することができる。したがっ
て、このベクターを受け入れる細胞は、5FCおよびガン
シクロビルもしくはアシクロビルの両者に対して感受性
であり、遺伝子で修飾された細胞を除く二重の負の選択
系を提供する。このことは、いくつかの細胞がCD/5FCま
たはTK/ガンシクロビルだけでは除去できない場合に有
利である（F.L.MooltenおよびJ.M.Wells,Journal of th
e Natl.Cancer Inst.,82巻、297〜300頁、1990年）。組
合わせによって、これらのものは付加的毒性または恐ら
く相乗効果的な毒性を提供することができる。
方法に関する。本発明のCD遺伝子系は、ヘルペスチミジ
ンキナーゼの遺伝子とともに、他の遺伝子を有する遺伝
子移入ベクター中に挿入することができる。したがっ
て、このベクターを受け入れる細胞は、5FCおよびガン
シクロビルもしくはアシクロビルの両者に対して感受性
であり、遺伝子で修飾された細胞を除く二重の負の選択
系を提供する。このことは、いくつかの細胞がCD/5FCま
たはTK/ガンシクロビルだけでは除去できない場合に有
利である（F.L.MooltenおよびJ.M.Wells,Journal of th
e Natl.Cancer Inst.,82巻、297〜300頁、1990年）。組
合わせによって、これらのものは付加的毒性または恐ら
く相乗効果的な毒性を提供することができる。
また本発明は、本発明のCD遺伝子を動物の生殖細胞系
に組込むことによって形質転換動物を製造する方法に関
する。本発明のCD遺伝系は、動物例えばマウスの生殖細
胞系に挿入することができる。CD遺伝子は各種の組織特
異的プロモーターと結合することができ、その結果、CD
はそのプロモーターが活性である組織内、例えば免疫グ
ロブリンのプロモーターが用いられる場合のＢ細胞内で
のみ発現される（E.Borrelliら、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,85巻、7572〜7576頁、1988年）。5FCがこれらの組織
を選択的に除くために使用することができる。これは器
官および組織の発生の研究に有用である。
に組込むことによって形質転換動物を製造する方法に関
する。本発明のCD遺伝系は、動物例えばマウスの生殖細
胞系に挿入することができる。CD遺伝子は各種の組織特
異的プロモーターと結合することができ、その結果、CD
はそのプロモーターが活性である組織内、例えば免疫グ
ロブリンのプロモーターが用いられる場合のＢ細胞内で
のみ発現される（E.Borrelliら、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,85巻、7572〜7576頁、1988年）。5FCがこれらの組織
を選択的に除くために使用することができる。これは器
官および組織の発生の研究に有用である。
さらに別の実施態様において、本発明は癌を治療する
治療法に関する。現在形成されているように、本発明の
CDNSSは、正常な非新生物性組織とは対照的に癌性組織
の形質導入に対して偏好性をもっている。先に考察した
ように、複製中の細胞はレトロウイルスを介して遺伝子
挿入を行うことができるが静止している細胞はかような
挿入を行えないことが報告されている（A.D.Miller,199
0年）。したがって患者はレトロウイルス形の本発明のC
DNSSを用いて生体内で治療することが可能であり、その
患者の癌性細胞は優先的に形質導入されて5FCに対して
感受性になる。分子生物学の技術分野での熟練者であれ
ば、細胞を5FCに対して選択的に感受性にする性能に関
するCDNSSの本発明によって提供される情報を利用し、
および分子生物学の標準方法を用いて公知の組織特異的
プロモーターをCDNSSに挿入することによって、CDNSSの
組織特異性を増大することができるであろう（引用文献
についての、組織特異的プロモーターの先の考察を参照
のこと）。例えば下記のようにしてCDNSSの要素を再配
列して、Ｂ細胞の白血病およびリンパ腫の治療に有用で
ある.Bリンパ球内で活性なCDNSSを作ることができるで
あろう。pCD2を構築する際に用いられるような標準のク
ローン化法を用いて、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼの遺伝子をLTRプローモーターのすぐ３′側に移
動させ、免疫グロブリンの重鎖の遺伝子のプロモーター
／エンハンサーを、ネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子の３′側でかつ修飾されたシトシンデアミナ
ーゼ遺伝子の５′側に挿入し、次いでSV40プロモーター
を除くことができる。上記の免疫グロブリンのプロモー
ターはＢリンッパ球系列の細胞内で優先的に活性である
から〔S.Ecclesら、New Biol.,2巻、801〜811頁、1990
年;J.Wangら、Mol.Cell Biol.,11巻、75〜83頁、1991
年;B.Portonら、Mol.Cell Biol.,10巻、1076〜1083頁、
1990年;C.QueenおよびD.Baltimore,Cell,33巻、717〜72
8頁、1983年;W.E.Paul編集Fundamental Immunology（第
２版）Raven Press、米国、ニューヨーク、235〜290
頁、1989年のE.E.Maxの論文“Immunoglobulins:Molecul
ar Genetics〕、再発列CDNSSはＢ細胞の白血病とリンパ
腫を治療するのに有用であろう。腫瘍細胞に対する特異
性には２つの部分がある。すなわち遺伝子を移入する細
胞を増殖させるレトロウイルスの選択と、Ｂリンパ球系
列の細胞内での遺伝子の活性化である。
治療法に関する。現在形成されているように、本発明の
CDNSSは、正常な非新生物性組織とは対照的に癌性組織
の形質導入に対して偏好性をもっている。先に考察した
ように、複製中の細胞はレトロウイルスを介して遺伝子
挿入を行うことができるが静止している細胞はかような
挿入を行えないことが報告されている（A.D.Miller,199
0年）。したがって患者はレトロウイルス形の本発明のC
DNSSを用いて生体内で治療することが可能であり、その
患者の癌性細胞は優先的に形質導入されて5FCに対して
感受性になる。分子生物学の技術分野での熟練者であれ
ば、細胞を5FCに対して選択的に感受性にする性能に関
するCDNSSの本発明によって提供される情報を利用し、
および分子生物学の標準方法を用いて公知の組織特異的
プロモーターをCDNSSに挿入することによって、CDNSSの
組織特異性を増大することができるであろう（引用文献
についての、組織特異的プロモーターの先の考察を参照
のこと）。例えば下記のようにしてCDNSSの要素を再配
列して、Ｂ細胞の白血病およびリンパ腫の治療に有用で
ある.Bリンパ球内で活性なCDNSSを作ることができるで
あろう。pCD2を構築する際に用いられるような標準のク
ローン化法を用いて、ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼの遺伝子をLTRプローモーターのすぐ３′側に移
動させ、免疫グロブリンの重鎖の遺伝子のプロモーター
／エンハンサーを、ネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子の３′側でかつ修飾されたシトシンデアミナ
ーゼ遺伝子の５′側に挿入し、次いでSV40プロモーター
を除くことができる。上記の免疫グロブリンのプロモー
ターはＢリンッパ球系列の細胞内で優先的に活性である
から〔S.Ecclesら、New Biol.,2巻、801〜811頁、1990
年;J.Wangら、Mol.Cell Biol.,11巻、75〜83頁、1991
年;B.Portonら、Mol.Cell Biol.,10巻、1076〜1083頁、
1990年;C.QueenおよびD.Baltimore,Cell,33巻、717〜72
8頁、1983年;W.E.Paul編集Fundamental Immunology（第
２版）Raven Press、米国、ニューヨーク、235〜290
頁、1989年のE.E.Maxの論文“Immunoglobulins:Molecul
ar Genetics〕、再発列CDNSSはＢ細胞の白血病とリンパ
腫を治療するのに有用であろう。腫瘍細胞に対する特異
性には２つの部分がある。すなわち遺伝子を移入する細
胞を増殖させるレトロウイルスの選択と、Ｂリンパ球系
列の細胞内での遺伝子の活性化である。
本発明は以下の実施例でさらに詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明を限定するものではない。
れらの実施例は本発明を限定するものではない。
実施例
下記の原料と方法は下記実施例を通して使用した。
分子処理法
プラスミドpMK116は、ベクターpT218Uのポリクローニ
ング部位内にシトシンデアミナーゼのコーディング領域
を含有する、イー・コリ由来の1.7kbのフラグメントを
含有している（D.A.Meadら、Protein Engineering,1
巻、67〜74頁、1986年）。プラスミドpLXSNは、真核性
発現要素類すなわち（５′）モロニーマウス肉腫ウイル
スのLTRプロモーター、ポリクローニング部位、SV40初
期プロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子、およびモロニーマウス白血病ウイルスプロモ
ーター（３′）を含有している（A.D.MillerおよびG.T.
Rosman,BioTechniques,7巻、980〜990頁、1989年）。ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、タンパ
ク質合成阻害剤のネオマイシンまたはその類似体のG418
の存在下で細胞を生き残らせることができる（F.Colber
e−Garapinら、J.Mol.Biol.,150巻、１〜14頁、1981
年）。これらのベクターのその次の構造体を図１に示
す。pMK116を制限酵素のHinc IIとBamH Iで消化した。p
LXSNをHpa IとBamH Iで消化した。pMK116由来の1.7kbの
フラグメントと、pLXSN由来の5.7kbのフラグメントを分
離し、低溶融点のアガロースでの電気泳動法で単離し
た。これらのフラグメントは次にT4リガーゼで連結し、
形質転換受容性のイー・コリを上記生成物で形質転換さ
せた（K.Struhl,Biotechniques,3巻、452〜453頁、1985
年）。形質転換体の個々のコロニーのミニプレップ（mi
niprep）を、シトシンデアミナーゼ遺伝子のpLXSNへの
挿入と正しい配向について制限消化分析によってスクリ
ーニングした。プラスミドの大規模な標品を標準法で製
造し、そのプラスミドを塩化セシウム勾配遠心分離法ま
たはクィアゲン（Quiagen）カラム〔J.Sambrookら、Mol
ecular Cloning:A laboratory manual、第２版、（Cold
Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbo
r、米国、ニューヨーク、1989年）〕によって精製し
た。pCD1は未修飾の細菌シトシンデアミナーゼ配列をpL
XSNへ挿入したものである。
ング部位内にシトシンデアミナーゼのコーディング領域
を含有する、イー・コリ由来の1.7kbのフラグメントを
含有している（D.A.Meadら、Protein Engineering,1
巻、67〜74頁、1986年）。プラスミドpLXSNは、真核性
発現要素類すなわち（５′）モロニーマウス肉腫ウイル
スのLTRプロモーター、ポリクローニング部位、SV40初
期プロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子、およびモロニーマウス白血病ウイルスプロモ
ーター（３′）を含有している（A.D.MillerおよびG.T.
Rosman,BioTechniques,7巻、980〜990頁、1989年）。ネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、タンパ
ク質合成阻害剤のネオマイシンまたはその類似体のG418
の存在下で細胞を生き残らせることができる（F.Colber
e−Garapinら、J.Mol.Biol.,150巻、１〜14頁、1981
年）。これらのベクターのその次の構造体を図１に示
す。pMK116を制限酵素のHinc IIとBamH Iで消化した。p
LXSNをHpa IとBamH Iで消化した。pMK116由来の1.7kbの
フラグメントと、pLXSN由来の5.7kbのフラグメントを分
離し、低溶融点のアガロースでの電気泳動法で単離し
た。これらのフラグメントは次にT4リガーゼで連結し、
形質転換受容性のイー・コリを上記生成物で形質転換さ
せた（K.Struhl,Biotechniques,3巻、452〜453頁、1985
年）。形質転換体の個々のコロニーのミニプレップ（mi
niprep）を、シトシンデアミナーゼ遺伝子のpLXSNへの
挿入と正しい配向について制限消化分析によってスクリ
ーニングした。プラスミドの大規模な標品を標準法で製
造し、そのプラスミドを塩化セシウム勾配遠心分離法ま
たはクィアゲン（Quiagen）カラム〔J.Sambrookら、Mol
ecular Cloning:A laboratory manual、第２版、（Cold
Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbo
r、米国、ニューヨーク、1989年）〕によって精製し
た。pCD1は未修飾の細菌シトシンデアミナーゼ配列をpL
XSNへ挿入したものである。
pCD1のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発
オリゴヌクレオチド類は、Apptied Biosystems 381A
DNA Synthesizerで合成し、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法で精製した（J.Sambrookら、1989年）。オリゴ
ヌクレオチドの５′TGA CGC GAA TTC AGG CTA GCA ATG
TCG 3′（シトシンデアミナーゼ配列の５′末端に相当
する）と、５′CAC ACA TTC CAC AGC CGATCC 3′（遺伝
子に隣接する３′領域に対するアンチセンス）とを、Pe
rkin Elmer Cetus DNA thermal cyclerを用いるポリメ
ラーゼ連鎖反応のプライマーとして用い、かつpCD1を上
記反応の鋳型として用いた。得られた1.7kbのフラグメ
ントとpLXSNをEcoR IとBamH Iで消化し、電気泳動で単
離し、次いでT4リガーゼで連結した。イー・コリを形質
転換し、プラスミドを上記のようにスクリーニングし
た。変化させたシトシンデアミナーゼ配列を有する、生
成したプラスミドをpCD2と称する。この遺伝子の５′領
域を、ジデオキシヌクレオチド連鎖終結法で配列を決定
して所望の配列を確認した（J.Sambrookら、1989年）。
さきに述べたのと同じPCRプライマーを使用して、トラ
ンスフェクトされた細胞由来の精製ゲノムDNA 1μｇ中
のシトシンデアミナーゼ配列を増幅した。そしてそのPC
R生成物は、標準の方法（J.Sambrookら、1989年）およ
びpCD2のEcoR I部位とBamH I部位との間に見出された1.
7kbのシトシンデアミナーゼ遺伝子に相当する32P標識プ
ローブ（J.Sambrookら、1989年）を用いて、サザン分析
に付した。また同じプローブを用いるサザンブロット法
を、細胞系由来の精製ゲノムDNAの10μｇ試料のSac Iに
よる消化物について行った。
DNA Synthesizerで合成し、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法で精製した（J.Sambrookら、1989年）。オリゴ
ヌクレオチドの５′TGA CGC GAA TTC AGG CTA GCA ATG
TCG 3′（シトシンデアミナーゼ配列の５′末端に相当
する）と、５′CAC ACA TTC CAC AGC CGATCC 3′（遺伝
子に隣接する３′領域に対するアンチセンス）とを、Pe
rkin Elmer Cetus DNA thermal cyclerを用いるポリメ
ラーゼ連鎖反応のプライマーとして用い、かつpCD1を上
記反応の鋳型として用いた。得られた1.7kbのフラグメ
ントとpLXSNをEcoR IとBamH Iで消化し、電気泳動で単
離し、次いでT4リガーゼで連結した。イー・コリを形質
転換し、プラスミドを上記のようにスクリーニングし
た。変化させたシトシンデアミナーゼ配列を有する、生
成したプラスミドをpCD2と称する。この遺伝子の５′領
域を、ジデオキシヌクレオチド連鎖終結法で配列を決定
して所望の配列を確認した（J.Sambrookら、1989年）。
さきに述べたのと同じPCRプライマーを使用して、トラ
ンスフェクトされた細胞由来の精製ゲノムDNA 1μｇ中
のシトシンデアミナーゼ配列を増幅した。そしてそのPC
R生成物は、標準の方法（J.Sambrookら、1989年）およ
びpCD2のEcoR I部位とBamH I部位との間に見出された1.
7kbのシトシンデアミナーゼ遺伝子に相当する32P標識プ
ローブ（J.Sambrookら、1989年）を用いて、サザン分析
に付した。また同じプローブを用いるサザンブロット法
を、細胞系由来の精製ゲノムDNAの10μｇ試料のSac Iに
よる消化物について行った。
細胞処理法
細胞は、D10すなわち10％容積の熱で不活性化したウ
シ胎児血清、2mMグルタミン、50U/mlペニシリンおよび5
0μg/mlストレプトマイシンを補充したDMEM中で増殖さ
せ、37℃にて５％CO2雰囲気下でインキュベートした。N
IH−3T3細胞とPA317細胞はすでに報告されているマウス
繊維芽細胞系である（A.D.MillerおよびC.Buttumore,Mo
l.Cell.Biol.,6巻、2895〜2902頁、1986年）。PA317はN
IH−3T3細胞から誘導され、安定して組込まれた複製不
全レトロウイルスゲノムを含有し、完全なパッケージン
グシグナルを有するレトロウイルスをコードする配列と
を有するプラスミドでトランスフェクトされたときにレ
トロウイルスのパッケージング系として機能する。プラ
スミドpLXSN,pCD1およびpCD2はレトロウイルスのLTRと
完全パッケージングシグナルを含有している。細胞は、
標準のリン酸カルシウム沈澱法（J.Sambrookら、1989
年）を用いて精製プラスミドDNAでトランスフェクトし
た。ウイルスの形質導入法はすでに報告されている（K.
CornettaおよびW.F.Anderson,J.Virol.Meth.,23巻、186
〜194頁、1988年）。3T3細胞はパッケージングライン由
来の上澄み液とプロタミン５μg/ml中で24時間増殖さ
せ、次にD10培地に変えた。トランスフェクトしてから7
2時間後または形質導入してから48時間後に、G418 1mg/
mlを培地に添加して細胞をこの培地中で７日間選択し
た。その後、その細胞をD10培地のみの中で維持した。
クローン原性検定を次のようにして行った。細胞を104/
mlまで希釈し、その0.1mlを、下記の実施例と表に記載
されている濃度で5FCおよび／またはG418を含有する培
地5mlとともに、６ウェルのコスター（costar）組織培
養皿の4cm平底ウェル中に入れた。これらを５日間イン
キュベートし、その時点でウェルをゲイムサ染料（Geim
sa Stain）で染色し、25個の細胞より大きいコロニーを
試験し40倍の顕微鏡を使って計数した。増殖検定は次の
ようにして行った。103個の細胞を、表と明細書に記載
されている添加物を含有する0.2mlの培地が入ってい
る、96ウェルプレートの平底ウェル中に入れた。そのウ
ェルが、RPMI中の25μ 3H−チミジンによって、0.5μ
Ci/25μの活性でパルスされたことを示したとき、４
時間後に自動細胞収穫器でこれらの細胞を収穫しシンチ
レーションカウンターで計数した。各条件について12回
試験した。標準のＴ検定統計的方法を採用した（G.W.Sn
edecorおよびW.G.Cochran,Statisticat Methods第７
版、Iowa State University press、米国、アイオワ
州、エームズ、89〜98頁、124〜128頁、1980年）。
シ胎児血清、2mMグルタミン、50U/mlペニシリンおよび5
0μg/mlストレプトマイシンを補充したDMEM中で増殖さ
せ、37℃にて５％CO2雰囲気下でインキュベートした。N
IH−3T3細胞とPA317細胞はすでに報告されているマウス
繊維芽細胞系である（A.D.MillerおよびC.Buttumore,Mo
l.Cell.Biol.,6巻、2895〜2902頁、1986年）。PA317はN
IH−3T3細胞から誘導され、安定して組込まれた複製不
全レトロウイルスゲノムを含有し、完全なパッケージン
グシグナルを有するレトロウイルスをコードする配列と
を有するプラスミドでトランスフェクトされたときにレ
トロウイルスのパッケージング系として機能する。プラ
スミドpLXSN,pCD1およびpCD2はレトロウイルスのLTRと
完全パッケージングシグナルを含有している。細胞は、
標準のリン酸カルシウム沈澱法（J.Sambrookら、1989
年）を用いて精製プラスミドDNAでトランスフェクトし
た。ウイルスの形質導入法はすでに報告されている（K.
CornettaおよびW.F.Anderson,J.Virol.Meth.,23巻、186
〜194頁、1988年）。3T3細胞はパッケージングライン由
来の上澄み液とプロタミン５μg/ml中で24時間増殖さ
せ、次にD10培地に変えた。トランスフェクトしてから7
2時間後または形質導入してから48時間後に、G418 1mg/
mlを培地に添加して細胞をこの培地中で７日間選択し
た。その後、その細胞をD10培地のみの中で維持した。
クローン原性検定を次のようにして行った。細胞を104/
mlまで希釈し、その0.1mlを、下記の実施例と表に記載
されている濃度で5FCおよび／またはG418を含有する培
地5mlとともに、６ウェルのコスター（costar）組織培
養皿の4cm平底ウェル中に入れた。これらを５日間イン
キュベートし、その時点でウェルをゲイムサ染料（Geim
sa Stain）で染色し、25個の細胞より大きいコロニーを
試験し40倍の顕微鏡を使って計数した。増殖検定は次の
ようにして行った。103個の細胞を、表と明細書に記載
されている添加物を含有する0.2mlの培地が入ってい
る、96ウェルプレートの平底ウェル中に入れた。そのウ
ェルが、RPMI中の25μ 3H−チミジンによって、0.5μ
Ci/25μの活性でパルスされたことを示したとき、４
時間後に自動細胞収穫器でこれらの細胞を収穫しシンチ
レーションカウンターで計数した。各条件について12回
試験した。標準のＴ検定統計的方法を採用した（G.W.Sn
edecorおよびW.G.Cochran,Statisticat Methods第７
版、Iowa State University press、米国、アイオワ
州、エームズ、89〜98頁、124〜128頁、1980年）。
酵素検定
シトシンデアミナーゼの生体外での検定はすでに報告
されている方法（L.Andersonら、1989年）の改変法を用
いて行った。１×106の細胞をマイクロ遠心分離器で遠
心分離し、等張塩化ナトリウム水溶液（normal salin
e）で一回洗浄し、再び遠心分離にかけ、次いで100mMト
リスpH7.8,1mM EDTAおよび1mMジチオトレイトールの10
μ中に再懸濁させた。次に上記懸濁液を、５サイクル
の迅速凍結−融解に付した。得られた物質を卓上マイク
ロ遠心分離器で５分間遠心分離した。10μの上澄み液
を10μの3H−シトシン（0.5μCi/10μの放射能を有
する100mMトリスpH7.8中の5mMシトシン）と混合し、４
時間インキュベートした。10μの試料、および未標識
シトシン0.4mg/mlと未標識ウラシル0.4mg/mlを含有する
標識形質水溶液10μを薄層クロマトグラフィーのシー
ト（Kodak Chromatogra Sheet 13254）上に置き、１−
ブタノール（86％）と水（14％）の混合物で展開した。
乾燥後、シトシンとウラシルに相当するスポットを短波
UVの照射下で切り取って、シンチレーションカウンター
で検定した。上記のシトシンとウラシルのバンドから回
収した放射能は、クロマトグラフィーによる分離を受け
なかった10μの標識の放射能を計数することによって
判断して、試料に導入したほゞすべての標識に一致して
いた。
されている方法（L.Andersonら、1989年）の改変法を用
いて行った。１×106の細胞をマイクロ遠心分離器で遠
心分離し、等張塩化ナトリウム水溶液（normal salin
e）で一回洗浄し、再び遠心分離にかけ、次いで100mMト
リスpH7.8,1mM EDTAおよび1mMジチオトレイトールの10
μ中に再懸濁させた。次に上記懸濁液を、５サイクル
の迅速凍結−融解に付した。得られた物質を卓上マイク
ロ遠心分離器で５分間遠心分離した。10μの上澄み液
を10μの3H−シトシン（0.5μCi/10μの放射能を有
する100mMトリスpH7.8中の5mMシトシン）と混合し、４
時間インキュベートした。10μの試料、および未標識
シトシン0.4mg/mlと未標識ウラシル0.4mg/mlを含有する
標識形質水溶液10μを薄層クロマトグラフィーのシー
ト（Kodak Chromatogra Sheet 13254）上に置き、１−
ブタノール（86％）と水（14％）の混合物で展開した。
乾燥後、シトシンとウラシルに相当するスポットを短波
UVの照射下で切り取って、シンチレーションカウンター
で検定した。上記のシトシンとウラシルのバンドから回
収した放射能は、クロマトグラフィーによる分離を受け
なかった10μの標識の放射能を計数することによって
判断して、試料に導入したほゞすべての標識に一致して
いた。
実施例1.遺伝子クローン化の原理
図１はクローン化のプロセスを要約して示す。最初
に、pMK116由来のシトシンデアミナーゼの未修飾コーデ
ィング領域全体をpLXSNのポリクローニング部位中にク
ローン化した。得られた構造体をpCD1と命名した。3T3
細胞中にトランスフェクトした場合には遺伝子の発現を
ほとんど示さなかった。シトシンデアミナーゼ遺伝子の
コーディング領域のすぐ５′側の非コーディング領域の
配列決定を行ったところ次の配列であることが明らかに
なった。
に、pMK116由来のシトシンデアミナーゼの未修飾コーデ
ィング領域全体をpLXSNのポリクローニング部位中にク
ローン化した。得られた構造体をpCD1と命名した。3T3
細胞中にトランスフェクトした場合には遺伝子の発現を
ほとんど示さなかった。シトシンデアミナーゼ遺伝子の
コーディング領域のすぐ５′側の非コーディング領域の
配列決定を行ったところ次の配列であることが明らかに
なった。
細菌中のタンパク質を分析した結果、翻訳はGTGコドン
で始まることが分かった。上記の原料と方法の項に記載
し図１に要約したように、その５′側上流の配列はオリ
ゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法を用いて変えら
れ、その遺伝子は、pLXSN中に、LTRプロモーター下でポ
リクローニング部位の上流にクローン化した。この遺伝
子工学的に組込まれた配列を有する、生成したプラスミ
ドをpCD2と呼称する。この構造体は、ブダペスト条約の
規定に基づいて1991年４月11日に、米国、メリーランド
州、ロックビルのthe American Type Culture Collecti
onに寄託された。このウイルスに与えられた受託番号は
40999であった。そのシトシンデアミナーゼ遺伝子の
５′領域の配列決定を行ったところ、所望の配列である
ことが確認され、細菌の遺伝子を含有する未修飾のプラ
スミドであるpCD1の出発部位の上流の88個の塩基対が欠
失していることが明らかになった。図１に、pCD1（未修
飾配列）とpCD2由来の特徴的な配列を要約した。pCD2は
次の真核性発現要素：ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼをコードする遺伝子をプロモートするSV40初期プ
ロモーターが続くシトシンデアミナーゼ遺伝子をプロモ
ートするLTRプロモーターを含有している。
で始まることが分かった。上記の原料と方法の項に記載
し図１に要約したように、その５′側上流の配列はオリ
ゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法を用いて変えら
れ、その遺伝子は、pLXSN中に、LTRプロモーター下でポ
リクローニング部位の上流にクローン化した。この遺伝
子工学的に組込まれた配列を有する、生成したプラスミ
ドをpCD2と呼称する。この構造体は、ブダペスト条約の
規定に基づいて1991年４月11日に、米国、メリーランド
州、ロックビルのthe American Type Culture Collecti
onに寄託された。このウイルスに与えられた受託番号は
40999であった。そのシトシンデアミナーゼ遺伝子の
５′領域の配列決定を行ったところ、所望の配列である
ことが確認され、細菌の遺伝子を含有する未修飾のプラ
スミドであるpCD1の出発部位の上流の88個の塩基対が欠
失していることが明らかになった。図１に、pCD1（未修
飾配列）とpCD2由来の特徴的な配列を要約した。pCD2は
次の真核性発現要素：ネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼをコードする遺伝子をプロモートするSV40初期プ
ロモーターが続くシトシンデアミナーゼ遺伝子をプロモ
ートするLTRプロモーターを含有している。
実施例2.哺乳類の細胞がpCD2でトランスフェクトされる
と、シトシンデアミナーゼの遺伝子が発現される。
と、シトシンデアミナーゼの遺伝子が発現される。
3T3とPA317の細胞をpCD2でトランスフェクトし、72時
間後に、G418を1mg/ml含有する培地の中に入れた。その
細胞をG418中で７日間インキュベートし次に通常の培地
中に保持した。ネオマイシン類似体G418に対する耐性
は、細胞の集団中に、プラスミドの配列を取上げて組込
んだ細胞が増大することを考慮したものである。3T3−C
Dの線は3T3のトランスフェクションを示し、PA−CD−Ａ
とPA−CD−ＢはPA317の別のトランスフェクションを示
す。シトシンデアミナーゼ遺伝子のゲノムへの取込みは
２つの方法で示した。第一に、シトシンデアミナーゼ遺
伝子の５′と３′の末端に対応するプライマーを用いる
PCR反応（図１参照）を、遺伝子を増幅するために使用
した。そして全長のシトシンデアミナーゼDNAプローブ
を使用するサザンブロットは、3T3−CD,PA−CD−Ａおよ
びPA−CD−ＢのDNAに1.7kbの遺伝子を示したが対照の3T
3またはPA317にはこの遺伝子を示さなかった（図２）。
第二に、同じプローブを用い、Sa Iで消化したゲノムDN
Aのサザン分析を行ったところ上記の遺伝子を示した
（図２）。
間後に、G418を1mg/ml含有する培地の中に入れた。その
細胞をG418中で７日間インキュベートし次に通常の培地
中に保持した。ネオマイシン類似体G418に対する耐性
は、細胞の集団中に、プラスミドの配列を取上げて組込
んだ細胞が増大することを考慮したものである。3T3−C
Dの線は3T3のトランスフェクションを示し、PA−CD−Ａ
とPA−CD−ＢはPA317の別のトランスフェクションを示
す。シトシンデアミナーゼ遺伝子のゲノムへの取込みは
２つの方法で示した。第一に、シトシンデアミナーゼ遺
伝子の５′と３′の末端に対応するプライマーを用いる
PCR反応（図１参照）を、遺伝子を増幅するために使用
した。そして全長のシトシンデアミナーゼDNAプローブ
を使用するサザンブロットは、3T3−CD,PA−CD−Ａおよ
びPA−CD−ＢのDNAに1.7kbの遺伝子を示したが対照の3T
3またはPA317にはこの遺伝子を示さなかった（図２）。
第二に、同じプローブを用い、Sa Iで消化したゲノムDN
Aのサザン分析を行ったところ上記の遺伝子を示した
（図２）。
これらの細胞集団はシトシンデアミナーゼ遺伝子の発
現について検定した。生体外酵素検定法によって、細胞
の溶解物による放射能標識シトシンのウラシルへの変換
を測定した。細胞系3T3−CD,PA−CD−ＡおよびPA−CD−
Ｂは、シトシンをウラシルに変換することによってシト
シンデアミナーゼの活性を示したが、一方トランスフェ
クトされていない対照の細胞系はこの活性を示さなかっ
た（表１）。
現について検定した。生体外酵素検定法によって、細胞
の溶解物による放射能標識シトシンのウラシルへの変換
を測定した。細胞系3T3−CD,PA−CD−ＡおよびPA−CD−
Ｂは、シトシンをウラシルに変換することによってシト
シンデアミナーゼの活性を示したが、一方トランスフェ
クトされていない対照の細胞系はこの活性を示さなかっ
た（表１）。
実施例3.シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現する細胞系
は5FCの毒性に対して感受性である。
は5FCの毒性に対して感受性である。
細胞の5FCに対する感受性を評価するためにクローン
原性検定を行った。103の細胞を4cmのウェルに接種し、
５日後に接種物によってもたらされたコロニーの数を計
数した。その環境内で生残って増殖することができる個
々の細胞は個々のコロニーを生成することができる。接
種物は、個々のコロニーを容易に同定して数えることが
できるよう充分に希釈した。シトシンデアミナーゼ遺伝
子発現する細胞は、5FCが毒性の5FUを産生するので、5F
Cの存在下ではコロニーを生成できないことが予想され
る。同様にネオマイシン耐性遺伝子を発現しない細胞は
G418の存在下では増殖しないはずである。
原性検定を行った。103の細胞を4cmのウェルに接種し、
５日後に接種物によってもたらされたコロニーの数を計
数した。その環境内で生残って増殖することができる個
々の細胞は個々のコロニーを生成することができる。接
種物は、個々のコロニーを容易に同定して数えることが
できるよう充分に希釈した。シトシンデアミナーゼ遺伝
子発現する細胞は、5FCが毒性の5FUを産生するので、5F
Cの存在下ではコロニーを生成できないことが予想され
る。同様にネオマイシン耐性遺伝子を発現しない細胞は
G418の存在下では増殖しないはずである。
シトシンデアミナーゼの遺伝子とネオマイシン耐性遺
伝子の両法を含有する配列がゲノムに組込まれて両方の
遺伝子が発現すると仮定すると、G418中に生残れる細胞
はいずれも5FC内では生残れないであろうし、クローン
化の相対的効率はゼロ近くまで低下するはずである。表
２に、上記のことがシトシンデアミナーゼ活性を生体外
で発現する細胞系に実際に当てはまることを示す。3T3
−CD,PA−CD−ＡおよびPA−CD−Ｂについて、G418中の
コロニーの数は、対照だけの培地の場合の2/3より多
く、このことは、プラスミドを組込まれてG418 1mg/ml
中で生残るのに充分なネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼを発現する細胞が細胞集団中にかなり増大したこ
とを示している。5FCだけの場合、相対コロニー数は対
照のコロニー数の３〜15％であったが、このことはトラ
ンスフェクトされた細胞の大部分が5FCに対して感受性
であることを示す。5FCは3T3細胞またはPA317細胞のク
ローン化効率を低下させなかったので、その作用は5FC
の哺乳類細胞に対する固有の毒性が原因ではなかった。
5FCとG418の両者を含有する培地では、シトシンデアミ
ナーゼと発現する細胞系のコロニーはほとんど見られな
かった。
伝子の両法を含有する配列がゲノムに組込まれて両方の
遺伝子が発現すると仮定すると、G418中に生残れる細胞
はいずれも5FC内では生残れないであろうし、クローン
化の相対的効率はゼロ近くまで低下するはずである。表
２に、上記のことがシトシンデアミナーゼ活性を生体外
で発現する細胞系に実際に当てはまることを示す。3T3
−CD,PA−CD−ＡおよびPA−CD−Ｂについて、G418中の
コロニーの数は、対照だけの培地の場合の2/3より多
く、このことは、プラスミドを組込まれてG418 1mg/ml
中で生残るのに充分なネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼを発現する細胞が細胞集団中にかなり増大したこ
とを示している。5FCだけの場合、相対コロニー数は対
照のコロニー数の３〜15％であったが、このことはトラ
ンスフェクトされた細胞の大部分が5FCに対して感受性
であることを示す。5FCは3T3細胞またはPA317細胞のク
ローン化効率を低下させなかったので、その作用は5FC
の哺乳類細胞に対する固有の毒性が原因ではなかった。
5FCとG418の両者を含有する培地では、シトシンデアミ
ナーゼと発現する細胞系のコロニーはほとんど見られな
かった。
また5FCは、3H−チミジン組込み検定法で測定したと
ころ、生体外での増殖を阻害していた。表３は、細胞系
3T3−CDとPA−CD−Ａにおいて、0.5mg/mlの濃度の5FCに
よって3H−チミジンの取込みがほゞ完全に阻害され、一
方対照の細胞系の3T3とPA317には対応する作用がないこ
とを示している。
ころ、生体外での増殖を阻害していた。表３は、細胞系
3T3−CDとPA−CD−Ａにおいて、0.5mg/mlの濃度の5FCに
よって3H−チミジンの取込みがほゞ完全に阻害され、一
方対照の細胞系の3T3とPA317には対応する作用がないこ
とを示している。
表４に、クローン原性検定と増殖検定の両方における
5FC濃度と細胞系PA−CD−Ａの阻害との間の投与応答の
関係を要約する。PA−CD−Ａ細胞系では5FCは、62〜500
μg/mlの濃度範囲にわたって3H−チミジンの取込みとコ
ロニーの形成を大きく阻害した。一方この範囲より低い
濃度ではその作用はいくぶん低下したが依然として有意
であった。対照のPA314細胞の対応する阻害は全くみと
められなかった。
5FC濃度と細胞系PA−CD−Ａの阻害との間の投与応答の
関係を要約する。PA−CD−Ａ細胞系では5FCは、62〜500
μg/mlの濃度範囲にわたって3H−チミジンの取込みとコ
ロニーの形成を大きく阻害した。一方この範囲より低い
濃度ではその作用はいくぶん低下したが依然として有意
であった。対照のPA314細胞の対応する阻害は全くみと
められなかった。
表５は混合細胞集団における5FC毒性の選択性を示
す。同数のPA−CD−Ａ細胞（シトシンデアミナーゼ遺伝
子を含有している）とPA317細胞（シトシンデアミナー
ゼ遺伝子を含有していない）を混合して、クローン原性
検定用のウェル中に接種し、5FC,G418または両者の中で
の選択に付した。5FCの毒性がシトシンデアミナーゼ遺
伝子を含有する細胞に限定されると、混合細胞集団から
は約1/2の細胞が除去され、一方、純粋のPA−CD−Ａの
細胞集団中のほゞすべての細胞は5FCによって影響さ
れ、純粋のPA317の細胞集団中の細胞は5FCに全く影響さ
れないと考えられる。しかしシトシンデアミナーゼおよ
び／または５−FUの培地への放出によって有意な“傍観
者の致死（bystander killing）”が起こったならば、
混合細胞集団中のPA−CD−Ａ細胞とPA317細胞の両者が
殺されると考えられる。5FCのコロニーの数は非選択培
地内の混合細胞集団のコロニー数の約1/2であった。一
方対照のPA317細胞は5FCによって影響されなかったがPA
−CD−Ａ細胞は死滅した。
す。同数のPA−CD−Ａ細胞（シトシンデアミナーゼ遺伝
子を含有している）とPA317細胞（シトシンデアミナー
ゼ遺伝子を含有していない）を混合して、クローン原性
検定用のウェル中に接種し、5FC,G418または両者の中で
の選択に付した。5FCの毒性がシトシンデアミナーゼ遺
伝子を含有する細胞に限定されると、混合細胞集団から
は約1/2の細胞が除去され、一方、純粋のPA−CD−Ａの
細胞集団中のほゞすべての細胞は5FCによって影響さ
れ、純粋のPA317の細胞集団中の細胞は5FCに全く影響さ
れないと考えられる。しかしシトシンデアミナーゼおよ
び／または５−FUの培地への放出によって有意な“傍観
者の致死（bystander killing）”が起こったならば、
混合細胞集団中のPA−CD−Ａ細胞とPA317細胞の両者が
殺されると考えられる。5FCのコロニーの数は非選択培
地内の混合細胞集団のコロニー数の約1/2であった。一
方対照のPA317細胞は5FCによって影響されなかったがPA
−CD−Ａ細胞は死滅した。
結局、シトシンデアミナーゼ遺伝子が存在し発現する
ことは、クローン化効率、生体外での増殖、培養時の増
殖速度または顕微鏡による形態によって判断して、5FC
が存在しない場合、細胞に対して有害な作用は全くなか
った。
ことは、クローン化効率、生体外での増殖、培養時の増
殖速度または顕微鏡による形態によって判断して、5FC
が存在しない場合、細胞に対して有害な作用は全くなか
った。
実施例4.レトロウイルス依存性遺伝子移入法によってシ
トシンデアミナーゼ遺伝子の発現に成功する。
トシンデアミナーゼ遺伝子の発現に成功する。
3T3細胞を、材料と方法の項で先に述べたのと同様に
して、PA−CD−ＡとPA−CD−Ｂの細胞系由来の上澄み液
に暴露して形質導入してG418中で選択した。得られた細
胞系は、3T3−CD−V1（PA−CD−Ｂからレトロウイルス
で形質導入した）および3T3−CD−V2（PA−CD−Ａから
レトロウイルスで形質導入した）と呼称した。表１に見
られるように、3T3−CD−V1と3T3−CD−V2の両者の溶解
物はシトシンを生体外でウラシルに変換した。またこれ
らはクローン原性検定の結果5FCに対して感受性であっ
た（表２）。
して、PA−CD−ＡとPA−CD−Ｂの細胞系由来の上澄み液
に暴露して形質導入してG418中で選択した。得られた細
胞系は、3T3−CD−V1（PA−CD−Ｂからレトロウイルス
で形質導入した）および3T3−CD−V2（PA−CD−Ａから
レトロウイルスで形質導入した）と呼称した。表１に見
られるように、3T3−CD−V1と3T3−CD−V2の両者の溶解
物はシトシンを生体外でウラシルに変換した。またこれ
らはクローン原性検定の結果5FCに対して感受性であっ
た（表２）。
上述の発明は、明確さと理解を得るためにいくらか詳
細に述べてきたが、当該技術分野の熟練者が前記の開示
を読めば、本発明の真の適用範囲から逸脱することな
く、形態と細目に種々の変更を行うことができることは
明らかであろう。
細に述べてきたが、当該技術分野の熟練者が前記の開示
を読めば、本発明の真の適用範囲から逸脱することな
く、形態と細目に種々の変更を行うことができることは
明らかであろう。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：ミューレン，クレーグ エイ．ブレー
ス，アール．マイケル （ii）発明の名称：遺伝子移入法と遺伝子移入療法に
用いるシトシンデアミナーゼの負の選択系 （iii）配列の数:4 （iv）通信宛先： （Ａ）発信人:CUSHMAN,DARBY ＆ CUSHMAN事務所 （Ｂ）ストリート:1615L.ストリート N.W.11階 （Ｃ）市：ワシントン （Ｄ）州:D.C. （Ｅ）国：米国 （Ｆ）ZIP:20036−5601 （ｖ）コンピューターの読取り可能な形態： （Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:Release ＃1.0,Version ＃1.2
5における特許 （vi）本願のデータ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）弁護士／弁理士の情報： （Ａ）姓名：スコット，ワトソン ティ． （Ｂ）登録番号:26,581 （Ｃ）参照／摘要番号:WTS/5683/83833/KIK （ix）電気通信の情報： （Ａ）電話：（202）861−3000 （Ｂ）テレファックス：（202）822−0944 （Ｃ）テレックス:6714627 CUSH （２）配列番号:1に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:109個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数（strandedness）：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の表示：配列番号:1: （２）配列番号:2に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の表示：配列番号:2: （２）配列番号:3に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の表示：配列番号:3: （２）配列番号:4に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の表示：配列番号:4:
ス，アール．マイケル （ii）発明の名称：遺伝子移入法と遺伝子移入療法に
用いるシトシンデアミナーゼの負の選択系 （iii）配列の数:4 （iv）通信宛先： （Ａ）発信人:CUSHMAN,DARBY ＆ CUSHMAN事務所 （Ｂ）ストリート:1615L.ストリート N.W.11階 （Ｃ）市：ワシントン （Ｄ）州:D.C. （Ｅ）国：米国 （Ｆ）ZIP:20036−5601 （ｖ）コンピューターの読取り可能な形態： （Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:Release ＃1.0,Version ＃1.2
5における特許 （vi）本願のデータ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （viii）弁護士／弁理士の情報： （Ａ）姓名：スコット，ワトソン ティ． （Ｂ）登録番号:26,581 （Ｃ）参照／摘要番号:WTS/5683/83833/KIK （ix）電気通信の情報： （Ａ）電話：（202）861−3000 （Ｂ）テレファックス：（202）822−0944 （Ｃ）テレックス:6714627 CUSH （２）配列番号:1に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:109個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数（strandedness）：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の表示：配列番号:1: （２）配列番号:2に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の表示：配列番号:2: （２）配列番号:3に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の表示：配列番号:3: （２）配列番号:4に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:21個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （xi）配列の表示：配列番号:4:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ブリーズ，アール．マイケル
アメリカ合衆国，メリーランド 20854,
ロックビル，ランカシャー ドライブ
1986
(56)参考文献 欧州特許出願公開402108（ＥＰ，Ａ
１)
Claims (6)
- 【請求項１】真核性発現ベクターに連結された大腸菌シ
トシンデアミナーゼ遺伝子を含んでなるDNA構造体にお
いて、哺乳類細胞での翻訳の開始を促進するために前記
大腸菌シトシンデアミナーゼ遺伝子のGTG翻訳開始コド
ンがATGに変えられていることを特徴とするDNA構造体。 - 【請求項２】前記シトシンデアミナーゼ遺伝子が大腸菌
から得られる請求項１記載のDNA構造体。 - 【請求項３】受託番号がATCC＃40999であるpCD2と呼称
されるDNA構造体。 - 【請求項４】請求項１、２または３に記載の前記DNA構
造体を含有する哺乳類宿主細胞。 - 【請求項５】シトシンデアミナーゼタンパク質を発現す
る請求項４記載の哺乳類宿主細胞。 - 【請求項６】真核性発現ベクターに連結されたヘルペス
チミジンキナーゼ遺伝子および大腸菌シトシンデアミナ
ーゼ遺伝子を含んでなる二重の負の選択ベクターにおい
て、哺乳類細胞での翻訳の開始を促進するために前記大
腸菌シトシンデアミナーゼ遺伝子のGTG翻訳開始コドン
がATGに変えられていることを特徴とする選択ベクタ
ー。
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