JPS62501049A - 所定のポリペプチドまたは等価なポリペプチドを本来発現し得る一次細胞から得られた当該ポリペプチドを産生するハイブリツド細胞、当該ハイブリツド細胞の取得方法、および当該細胞の当該ポリペプチドの製造への応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４、−次肝細胞の遺伝形質の一部を含有しており、かつＢ型つィルス性肝炎に 対するワクチン特性を示す免疫原性ボＩＪ　、、ｌプチドを２４時間で細胞１０ 　個あたり少なくとも１５０　ｎＨの産生率で分泌し得るかまたは分泌し得るよ うにすることができることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載のハイブリッ ド細胞。

明　細　書 所定のポリペプチドまたは等価なポリペプチドを本未発現し得る一次細胞から得 られた当該ポリペプチドを産生するノ・イブリッド細胞、当該ハイブリッド細胞 の取得方法、および当該細胞の当該ポリペプチドの製造への応用 本発明は、細胞ノーイブリッド内でクローン化されたかまたはりｌｌｌ−ン化す ることができるＤＮＡ配列がコードしている所定のポリペプチドの産生に有効な 前記細胞ノ・イブリッド、これら細胞ハイブリッドの製造方法、および前記ポリ ペプチドの製造へのこれら細胞ノ・イブリッドの応用に係る。

細胞ハイブリッドの製造は既に、特にこれらノ・イブリッドを得るための由来と なった細胞の構成および分化機能（ｆｏｎｃｔｉｏｎｓｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖ ｅａ　ｅｔ　＋Ｈｆｆ６ｒｅｎｃｉ６ｅｓ　）の発現に関する研究において試み られている。たとえばベルトロッテ（ＢＥＲＴＯＬＯＴＴＩ）らＣＣｔｑｑ３年 ）、ジー、セル、フィシオル、　（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｐｈ７ｓｉｏ１．　）　、第７９巻、第２　／　／　−２Ｊ　ｙ　Ｒ）ハ、最初 ノ１ｉｔｕ胞が発現していた特定の機能のうちのいくつかの虫能が発現されるρ ・されないｎ・を研究するため、ラットへパトーム（肝癌）細胞をマウス線維芽 細胞またはラット上皮細胞と融合して細胞ハイブリッドを製造した。この著者ら は形成されたＩ・イブリッドがラットへパトーム細胞のアルドラーゼ産生症を獲 得したことを確認しｔこはずである。

他の著者ら、たとえばクレープ（ＫＬＥＢＥ）ら（（７９７０年）、ブａり、ナ トル、アカド、シ、ユエスア−（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　）　、ｐ　Ａ　＆巻、第１ココ ０−／ユコ７貞）も、・・イブリッド細胞の、この・・イブリッドの形成に使用 した細胞成分の少なくとも１つに固有の特異的機能を発現するかまたは再度発現 する能力について研究した。この著者らは特にこの・・イブリッドの形成を會で た。特にこの著者らが観察したところによると、Ｅ８−コニステラーゼを産生ず るマウス腎細胞癌の細胞とヒト二倍体線維芽細胞とのノ・イブリッドでは。

ヒトの染色体が残っているとＥＳコは産生されないが、ヒトの染色体が消失する とＥＳコが再び発現された。またフジエール（ＦｏｖｏｚＲＥ）ら、（／９７コ 年）、ベー、エヌ、アー、ニス（Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、）、第６２巻、第３３ ０−３３１Ｉ貞の類似の研究があり、これにはシリアンＩ・ムスターメラノーマ （黒色ｍ）細胞とマウス線維芽細胞とのノ・イブリッドクローンのいくつかの、 高虞生率でメラニンを発現する能力が報告されている。このメラニンは、メラノ ーマ細胞の二組のゲノムとマウス線維芽細胞の７組のゲノムが／Ｓイブリッドの 中に存在している（この存在はハイブリッドの抜型に現われる）ことと相関関係 があるのであろ５゜ 本発明は細胞ハイブリッドを用いることは同様であるが全く異なる研究に基づく ものであって、その研究の手法は基本的に遺伝子工学の技術の利点を細胞ハイブ リッドの製造に結びつげたことにあった。微生物を、これらが外来のタンパク質 またはポリペプチドを合成するのに適合せしめる条件でクローン化ＤＮＡ配列に よって形質転換できることは今日では周知である。

しかし、これらの微生物に牒せられる産生は必ずしも好ましいとは限らない遺伝 環境中で行なわれるので、タンパク質もしくはポリペプチドの産生収率、または 単に使用する微生物の生存もしくは増殖の条件は大きく影響を受けることになり 得る。

本発明は遺伝子工学の技術を用いてクローン化されたＤＮＡ配列で形質転換され ているかまたは形質転換することができる改良された微生物を提供することを目 的とするが、これらの改良微生物は、前記クローン化ＤＮＡ配列が通常その発現 に特に好ましいことがわかっている天然の条件に近い（たとえば同じまたは等価 のＤＮＡ配列を含有するゲノムの分化またはプログラミングのレベルで関与する ）遺伝環境中に実際に戻されているようなものである。

また本発明の目的は、クローン化ＤＮＡ配列を、遺伝子工学の技術によって対応 するポリペプチドを産生ずるようにされた微生物ではめったにあるいは決して達 成されなかったポリペプチド産生収率で発現し得る細胞ハイブリッドを提供する ことである。

本発明による。所定のクローン化ＤＮＡ配列を発現するかまたは発現できるよう にし得ろ細胞ノ・イブリッドのプロセスの特徴は、 一一方が前記クローン化ＤＮＡ配列を発現することができるかまたは発現する樹 立された真核細胞（ｃｅｌｌｕｌｅｓ　ａｕｃａｒｙｏｔｅｓ５ｔａｂｌｉｅｓ 　）で、他方が、前記クローン化ＤＮＡ配列がコードしているポリペプチドから なるタンパク質またはタンパク質自身の構造中に前記ポリペプチドの配列と同一 もしくは類似のポリペプチド配列を含有しているタンパク質をコードしている天 然の遺伝子の発現に本来適している一次ａＩ胞（ｃｅｌＬｕｌａｓｐｒｉｍａｉ ｒｓｓ　）のハイブリダイゼーションを可能にするのに適した条件下、前記樹立 細胞が適当な遺伝子配列で補足されないと増殖し得ない培地中で、共培養（ｃｏ ｃｕｌｔｕｒｅ　）を実施すること、−細胞ハイブリダイゼーションに使用する 一次細胞が前記培地中で形成された細胞・・イブリッドの少なくとも一部に前記 適当な遺伝子配列を供与し得るかまたは供与し得るように予じめされていること ＠および形成した。１ｉｌＩ！胞ハイブリツドを回収すること である。

本発明の方法によって、樹立細胞か一次細胞かあるいは同時にこれら両者が上記 共培養に先立って前記クローン化ＤＮＡ配列で形質転換されていれば、望まれる 所定のポリペプチドを直接産生する細胞ハイブリッドの取得が可能になる。この ような場合本発明の方法には、前記共培養後に前記形成した細胞ノ・イブリッド のうち前記クローン化ＤＮＡがコードしているポリペプチドを産生ずることも明 らかなものを選択するという追加ステップが含まれ得るであろう。

変形として、樹立真核ａｌ胞と本来有利な一次細胞と（どちらも形質転換されて いない）の上記共培養の結果得られた細胞ハイブリッド自体か上記クローン化Ｄ ＮＡ配列で形質転換することができ、この場合本発明方法の好ましい実施態様で は前記共培養後細胞ハイブリッドのうち上述のようにして上記クローン化ＤＮＡ がコードしているポリペプチドを産生ずるようにされたものを選択することにな ろう。

上記の定義は、７例として８ｍウィルス性肝炎に対するワクチン用ポリペプチド を大量に産生できるかまたは産生できるようにし得る好ましい細胞・・イブリッ ドの取得条件を直接考察すると容易に理解されるであろう。

この好ましい適用の範囲において本発明の方法は、Ｂ２肝炎ウィルスのゲノムに 含まれる所定の遺伝子の全部または一部を含有するクローン化ＤＮＡ配列または 前記遺伝子がコードしているポリペプチドの免疫特性と等価な免疫特性を有する 免疫原性ペプチドをコードしているクローン化ＤＮＡ配列を発現するかまたは発 現し得るようにすることができる細胞ハイブリッドの製造方法と定義することが でき、この方法は、−一方が前記クローン化ＤＮＡ配列を発現できるかまたは発 現する樹立真核細胞で、他方が、好ましくはヒトの肝細胞のノ・イブリダイゼー ションを可能にするのに適した条件下、前記樹立細胞が適当な遺伝子配列で補足 されていないときは増殖できない培地中で共培養を実施すること、 −ａ　１ｌｉｌハイブリダイゼーシヨンに用いる肝ａ胞が前記培地中で形成され た細胞Ｉ−イブリッドの少なくとも一部に前記適当な遺伝子配列な供与し得るか または供与し得るように予じめされていること、および形成したｌｌｊＩＪｍノ ・イブリッドを回収することを特徴とする・ この好ましい方法の第７の別法によると、樹立細胞か肝細胞かまたは同時にこれ ら三者が上記共培養に先立って上記クローン化ＤＮＡ配列によって形質転換され 【いる。この場合本発明の方法には、上記共培養後、上記クローン化ＤＮＡ配列 がコードしている免疫原性ペプチドすなわち抗原をも産生ずるのが認められる前 記形成した細胞ハイブリッドを選択することが含まれる。変形として、前記ＤＮ Ａ配列で形質転換されるのが非分泌型ではあるにしても得られた細胞ハイブリッ ドである場合があり、このときもやはり、本発明の方法には上記共培養後形成し た細胞ハイブリッドの５ち所定のＤＮＡ配列がコードしている抗原または免疫原 性ポリペプチドを産生ずることも明らかなものを選択することが含まれる。上記 で非分泌型のハイブリッドもまた、自身は予じめ形質転換されなかった樹立細胞 と一次細胞とから得られたハイブリッドによって構成され得るであろう。しかし これらの細胞も同様であろう。この場合形質転換に利用するハイブリッドは、上 記した変形で試みられる細胞ノ・イブリッドの選択の範囲内に入らなかったもの のうちの１つであろう。・ 上記で使用した如き「−次細胞（ｃａｌｌｕｌａｓ　ｐｒｌｍａｉｒｅａ　）　 Ｊという表現は、哺乳動物から得られ、産生が望まれるタンパク質またはこのタ ンパク質に対応するポリペプチドの産生の根源（ｓｉｎｇθ）となりうろことが 知られているあらゆる細胞を意味する。これら−次細胞の特徴は、インビトロで はほとんど増殖（ｍｕ工ｔｉｐｌｉａｒ　）　Ｌ、ないこと、その増殖（ｐｒｏ ｌｉｆ≦ｒａｔｉｏｎ　）がせいぜい単層の生成までであること１次にその増殖 （ａｓｖｅｌｏｐｐｅ−ｍ＠ｎｔ　）が［接触阻害（１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｄ 、ｅ　ｃｏｎｔａｃｔ　）　Ｊまたは類似のことによって中断されることである 。それでもなお、これらのａ胞は適当な培地中である程度の時間全（同様に生存 し得る。これら−次細胞は特に上述した好ましい場合肝細胞、とりわけヒトの肝 細胞からなる。本発明の方法の実施釦用いる一次細胞は常に、目的とするタンパ ク質またはポリペプチドをコードしている遺伝子配列を天然に発現する能力に基 づいて選択される。。問題としている種類のタンパク質またはポリペプチドを自 発的に産生ずる一次細胞、あるいはたとえばウィルスによって天然にトランスホ ーメーションされて問題としている遺伝子を発現する能力が知られている一次Ｉ ＢＵ胞が挙げられる。この点く関して、かつ上述の好ましい例の場合にはいつで も、Ｂ型肝炎ウィルスのゲノムに由来するＤＮＡ配列（ＨＢＶ　−ＤＮＡ　）ま たは同じポリペプチドをコードしている配列の発現にとっては肝細胞、とりわけ ヒトの肝細胞が特に好ましい。実際、肝細胞。

特にヒトまたはある系統のチンパンジーの肝細胞はＢ型肝炎ウィルスの格好な攻 撃目標となっている。

同様に、合成を望むタンパク質が生長ホルモンであるときは下垂体細胞を、また タンパク質がリンパ球インターフェロンであるときはリンパ球の株（Ｌｉｇｎｅ θＳ）を−次細胞として使用することができる。

「樹立真核細胞（ｃｅｌｌｕｌｅｓ　ｅｕｃａｒｙｏｔｅｓ　ｅｔａｂＬｉｅｓ 　）Ｊという表現は、インビトロで培養することができ、かつ数世代に亘って増 殖できる真核細胞、さらに特定的には涌乳動物の細胞を意味する。

あらゆる種類の樹立細胞、同様に哺乳動物細胞由来のものが使用できる。たとえ は、腫瘍細胞もしくは腫傷以外の細胞、天の突然変異は天然でも肪発しにもので もよい。さらに培養維持できるあらゆるカテゴリーの細胞があり、たとえば腫傷 形成特性をもたない細胞株（１１ｇｎ１θｓ　ｃｅｌｌｕｌａｉｒｅｓ　）　、 たとえばペトリシアニ（ＰＥＴＲＩＣＣＩＡＮＩ　、Ｊ、Ｃ，）、キルシエスタ イン（ＫＩＲ８ＣＨ８’ｒＥＩＮ、Ｒ，Ｌ、）、ハイネスＣＨＸＮＥＢ、Ｊ、Ｅ 、）。

ワレイス（ＷＡＬＬＡＣＥ　、　Ｒ，Ｅ、　）およびマーチン（ＭＡＲ’に’Ｉ Ｎ、Ｄ。

Ｐ、）が「ジャーナル　オブ　ナショナル　キャンサー　インスティテユート（ Ｊ　、Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　）　Ｊ　、第Ｓ１巻、第１デ／ −／９４負（／２り３年）に記載しているＭｉ胞のようなヒト以外の霊長目の異 数体細胞株ＶｅｒＯのようなものがある。

この最後の細胞は免疫抑制処置をしたサルでテストしたときでも腫瘍形成性でな いことが明らかにされている・さらにサルやヒトの細胞株Ｍｅｇａを挙げること もできる。

したがって本発明の方法の目的は、同じ生体内で、一方で所望のタンパク質また はポリペプチドの産生に最も適しかついβ）なる場合でも可能な限り天然の遺伝 環境に近い遺伝環境と、他方でインビトロ培養可能な細胞株の数世代に亘る増殖 能とを結び付けることである。

培地と使用する樹立細胞は上記に定義した条件を満たすように選択する。培地が なんであっても、樹立細胞はこれらと共に培養する一次細胞がもたらし得る適当 な遺伝子配列で補足されない限り選択された培地中では自己増殖し得ないような ものである。

樹立細胞としてはたとえば、その遺伝子の１つσ）レベルに天然のまたは誘発さ れた欠失を有する細胞がある。この欠失は、細胞が所定の培地中で増殖できない ようにするが、対応する遺伝子によってもしこの遺伝子が欠失していなければ特 定されるタンパク質と同族のタンパク質の形態で発現され得る類似の遺伝子の導 入で償うことができる。このように類似の遺伝子が導入された細胞は当該培地中 で増殖できるようになる。この補償の可能性が、本発明による方法について既に 最も一般的に述べた定義中で使用した「補足（ｃｏｍｐｌｓｍｅｎｔａｔＪｏｎ 　）　Ｊとい５表現の意味するものである。補足し得る遺伝子またはＤＮ人配列 の種々の例は１ことえは／テサ／年３月コ日付で出願された仏国特杆出願第ｔ／ 　０７７３７号に挙げられている。この種のＤＮＡに属するものとして特に、い わゆる「単純ヘルペスウィルス（Ｈａｒｐ’ｓ　ａｉｍｐｌｅｓ　Ｖｉｒｕｓ　 ）　Ｊ　Ｉ　ｍ　（Ｈ８Ｖ／　）のウィルスＤＮＡ、チミジン−キナーゼ（ＴＫ ）の遺伝子、アデニンホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）および ジヒドロ７オレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）等、キサンチン−グアニンホスホ リボシル−トランスフェラーゼ酵素（ＸＧＰＲＴ）もしくはヒボキサンチングア ニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（！（Ｃ）ＰＲＴ　）の遺伝子がある。

これら［補足ＤＮＡＪの各々に対応して上記条件に応じる培地がある。たとえは 樹立細胞として内因性のチミジン−キナーゼをコードしている遺伝子が誘導もし くは誘発された突然変異の影響を受けているマウスＬ型細胞（ＬＴＫ−細胞）か またはＥ（ＧＰＲＴ−細胞を用いる場合、「ＨＡＴ培地」　（チミジンに加えて ヒボキサンチンおよびアミノ−プテリンを含有する）という名称で知られている 培地を使用すると有利である。この培地では、「サルベージ経路（ｖｏｉｅ　ｄ ｏ　ｓａｕｖｅｔａｇｅ　）　Ｊといわれる代謝経路による以外にはチミジンホ スフェートの合成ができなくなることが知られている。しかしこの経路はこの培 地中で増殖し得る細胞のＴＫ遺伝子が完全に保持されていることを意味している 。補足の遺伝子または核酸配列が一次細胞（たとえばＴＫ＋またはＨＧＰＲＴ＋ の一次細胞）によってもたらされる場合には、細胞融合の過穆で前記類似遺伝子 が伝達されたノルイブリッドのみが選択した培地中で増殖できることがわかる。

ハイブリッド形成に関与せず補足されなかった樹立細胞は、天然では一定の期間 しか生育できない一次細胞自身と全く同様にこの培地中では増殖できない。

補足ＤＮＡは一次細胞のゲノムに属する天然の配列からなっていてもよい、−次 細胞が最初これを欠損している場合には、特に予じめ適当なり、ＮＡ配列で形質 転換することによって予じ種の細胞を速やかに殺すことができる物質を培地中に 導入することもできよう。ただしこの場合、この物質に相応するものは第７のも のを不活化し得る第一の物質、特に酵素であり、この第二のものは予じめ一次細 胞中に導入し得る所定のＤＮＡ配列によってコードされている。たとえばこの第 ７の物質はＧｔｌｌｔとい５名称で知られているような抗生物質であり、その場 合第一の物質はアミノグリコシド３′−ホスホトランフェラーゼである＠この原 理の例としては既に挙−げた特許出願第ｘｉ　ｏ４ＩＪ’ｙ号を参照することが できよう。前記の場合と同様、前記アミノグリコシド３′−ホスホトランスフェ ラーゼをコードしているＤＮＡ配列を一次細胞から［遺産として受け取った（ｒ ｅ５ｕｅｎｈｌｉｌｒｉｔａｇｅ　）　Ｊハイブリッドのみが生存することにな ろう。

発現させようとするクローン化ＤＮＡ配列は、天然遺伝子のあらゆる断片または 一本鎖の核酸、πとえはｍＲＮＡから酵素的に逆転写して得られるあらゆる酌乙 列、さらには化学合成で得られたあらゆるＤＮＡから成ることができる。たとえ は、この配列は対応する天然の遺伝子が発現するポリペプチドと同じ〆ｊポリペ プチドまたは等価なポリペプチドをコードしているｃＤＮＡから成る。この等価 というのは特に、天然のポリペプチドおよび等価なポリペプチドに対して予じめ 形成された抗体との対応する交叉反応においてこれら一種のポリペプチド間で認 識され得る免疫学的類似性に基因している。使用するＤＮＡ配列がどんなもので あっても一次細胞の株の選択は・対応する天然の遺伝子に基づいてなされるであ ろう。

ハイブリダイゼーション前の樹立Ｍｉ胞もしくは一次細胞あるいは予じめ形成さ れたハイブリッドの形質転換もしくはトランスフェクションを実施するには、あ らゆるベクター、特に適当なプラスミドを用いることができる。このベクターが 満足すべき条件は単に、有効な形質転換と使用した細胞内でのクローン化Ｄ　Ｎ 　Ａ配列の発現とを可能にするようなものである。当業者は、・・イブリダイゼ ーションに使用する細胞の性質と場合によってクローン化すべきＤＮＡ配列とを 考慮に入れた上で使用するプラスミドの穆類を完全に選択することができよう。

クロー化すべき配列が形質転換された細胞中でこの配列を発現し得るプロモータ ーの制御下に配置されていない場合には、発現のみプロモーターから選択したプ ロモーターの直接制御下にこの配列を配置すると有利である。有利なプロモータ ーとしてはたとえば、ＨＢＶ−ＤＮＡのＳ遺伝子とプレーＳ配列（５ｅｑｕｅｎ ｃｅｓｐｒｅ　−８）がその制御下にあるプロモーター、または５ＶＩＩθウイ ルスもしくはＭＭＴＶウィルスから得たプロそ一ターのような強いプロモーター がある。

もちろん、問題とするベクターはやはり、真核細胞、特に哺乳動物細胞内でのク ローン化ＤＮＡ配列の転写と翻訳を確実にし得る遺伝子要素全て、たとえばポリ アデニル化部位および好ましくは目的とするＴ）ＮＡＡ配列転写終結部位を含有 すべきである。とはいっても使用し得るプラスミドの構築に固執する必要はない 。これらプラスミドの数多くが技術文献に記載されている。これらは全て、ｒ＠ 乳動物の細胞を形質転換でき、これらの細胞にこれらの中で転写、発現し得る遺 伝子またはクローン化ＤＮＡ配列を授与できることが認められれば使用すること ができる。

遺後に、−次細胞と樹立細胞のいわゆるハイブリダイゼーションは従来の条件で 実施することができる。融合を可能にするという点で細胞壁を脆弱化し得るあら ゆる薬剤をそれ自体公知の方法で使゛用する。従来と同様に、センダイウィルス またはより有利にはポリアルキレングリコール（ｐｗａ　１ｏｏｏ）、特にポリ エチレングリコールをたとえば！；００ｍＱ／Ｋｌの割合でまたは無血清培地の 容量あたりｙｏＮ量％の培地液を１分間の割合で使用できる。

以下の実施例における本発明による方法の好ましい実施態様の説明から本発明め 他の好ましい特徴がさらに明らかになるでＨＢＶウィルスのＨＢｓ遺伝子でトラ ンスフェクションした後にＨＢｓ抗原を産生するマウス線維芽細胞株（Ｌ’Ｉ’ に一細＠）を初代培養ラット肝細胞と融合させた。出発法の１つを用いて。

ＨＢｓ抗原の産生率が２０倍以上に増幅された・・イブリッドクローンを得るこ とができた。

分泌型ハイブリッドクローンを得る技術と得られた結果について以下の実施例に 記載する。

ブースミド　ＡＣＦ／１１）は、ブールセル（ＰＯＵＲＣＥＬ　）らかジャーナ ル　オブ　パイクロジー（Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　）　。

第弘」巻、第１００員（ｉｔｔｇコ年）に記載した。ＨＢＶウィルスのプレー８ およびＳ領域をコードしている遺伝子をもつプラスミドｐＡｃｕから誘導されＦ ものである。プラスミドｐＡＣＦ１０７！ｆ−ｐｋｃコと異なる点は、プラスミ ドｐＡＣコのＨｌｎｄ　ｌ［部ｐｒｓｃｏｃｅｓ　）の一部ヲコードＬ、　”Ｃ イルＢａｍＨＩ　−Ｅ　Ｃ，ＯＲ、Ｉ（３デ／ｒ−／ｌｔ＆）ＤＮＡ断片が導入 されていることとチミジンキナーゼをコードしている遺伝子が欠失されているこ とである。ｐＡＣＦ　／　０で形質転換した大腸菌（旦、ミ旦）Ｋ／コ株は／９ ｔケ年３月Ｓ日　番号１−２ｔ’ｌでＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、に寄託し１こＯ プラスミド　ＮＹＩのＤＮＡにのプラスミドは、ポリオーマウィルスのＨａθ断 片（ポリオーマウィルスの複製起点と初期プロモーターを有−ｆろ断片）の後罠 配置されたプレーＳおよびＳ領域をコードしているＤＮＡ配列を含有するＨＢＶ −ＤＮＡのＢｇｌＩ［断片をもっている。このＨＢ　Ｖ−Ｄ　ＮＡの断片は遺伝 子工学によって初期プロモーターのＨａ８■部位に挿入されていたＯ プラスミド　ＷのＤＮＡ、このプラスミドはアミノグリコシド−３′−ホスホト ランスフェラーゼをコードしている遺伝子をもっており、これを発現する細胞は アミノグリコシドＧａ１ｇに対する耐性を示す（フルベール−ガラパン（Ｇｏｌ ｂｅｒｅ−Ｃ）ａｒａｐｉｎ　）およびガラパン（Ｇａｒａｐｉｎ　）、／’Ｉ ｔ／年、ならびに特許第ｔ／　０弘７３７号）。

−″）トランスフェクション、次に産生クローンを選択した後のＨＢｓタンパク 質を産生ずるマウス細胞株の取得ＬＭＴＫ−細胞（クローン／Ｄ）（クローンＬ ９２９由来チミジンキナーゼ欠損マウス細胞。７０％仔ウシ血清を添加したダル ベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　）変性イーグル（Ｅａｇｌｅ　）培地中で増殖する 。／９ｇμ年３月５日パリ、ランスティテユ　パスツール（１’Ｉ　ＮＳ　Ｔ　 Ｉ　ＴＵＴ　ＰＡＳ　Ｔ　ＥＵＲ）のラ　コレクシオン　ナシオナル　デ　キュ ルチュール　ド　ミクローオルガエスム（ｌａ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔ ｉｏｎａｌｅ　ｄｅｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｏ　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓ ｍｅａ　）に番号エースｔ３で寄託された）を、グラハム（ＧＲＡＨＡＭ、Ｆ、 Ｌ、）、！１７７　ン　デルニブ（ＶＡ、Ｎ　ＤＥＲＥＢ、Ａ、、７．）がバイ ｏｏジー（ＶｉｒｏｌｏｇＹ　）　、第５２巻、第ｔＩｊＡ頁（／９り３年）に 記載した技術に従ってコ糧のベクターのＤＮＡによってコトランスフエクトした 。２種のベクターのＤＮＡのうち１方はＨＢｓタンパク質をフードしている領域 を有しており（プラスミドｐＡＣＦ　／　０またはプラスミドｐＮＹ＋サブタイ プａｙｖ）％他方（プラスミドｐＷ）はアミ／グリコシド−３′−ホスホトラン スフェラーゼ（ＡＰＲ，７’）の遺伝子を有していた。トランスフェクトされＡ 　Ｐ　Ｈ、？’酵素を発現する細胞を、上記の論文に記載されているコルペール −ガラパン（Ｃｏ１ｂａｒｅ　−（）ａｒａｐｉｎ　）の方法に従って７ミノグ リコシドＣ）ＩＩ／ｌを弘Ｑ　（７ｔｔＧ／Ｉｌｌ存在させて選別する。次に、 この選別で得られたクローンなＨＢｓタンパク質の産生についてテストする。Ｌ ＴＫ−細胞ｊ　Ｘ　／　０”個をプラスミドｐＡＣＦ／　０またはｐＮＹ４’　 ／　ＯｕｇとプラスミドｐＷのＤＮＡ２ムｇとでフトランスフエクトしに０　ト ランスフェクションのｌ白抜選択培地を添加した。

ＬＭ　Ｔ　Ｋ−細胞のコトランスフエクション後に得られ、Ｂｆｆｉ肝炎ウィル スのエンベロープ抗原ＨＢｓＡｇに相当する抗原を産生する能力が認められた３ 個の細胞株（Ｌ／、Ｌコ、　Ｌ３）ｆｔランダムに採取し、ラット肝細胞（ＨＡ ）との融合試験に用いた。

ＡｇＨＢｓの存在は放射免疫試験ＡＵＳ−ＲＩＡＩＩ　（アボット。

Ａｂｂｏｔｔ　）を用いて検出した。培地中和分泌されたＡｇＨＢｓの量はラン ステイテユ　パスツール　プロデュクシオン（１’ｌＮ５ＴＩＴＵＴ　ＰＡ８Ｔ ＥＵＲＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ）のＡｇＨＢｓｍ品の希釈によって確立し１こ基準 曲線に関して決定した。

Ｌ／とＬ３はプラスミドＰＡＣＦ　／　０のＤＮＡでトランスフェクトしたＬＴ Ｋ−細胞由来であり、Ｌユはプラスミドｐ　ＮＹＩＩのＤＮＡでトランスフェク トしりＭ５胞由来であった。

Ｌ／株はｌ弘年３月３日番号ｌ−２１／としてＣ，Ｎ、Ｃ、Ｍ、に寄託した。

これら３種の株でのＨＢｓ抗原の産生レベルは次のとおりであった（−参時間、 細胞ｉｏ’個あたり）。

Ｌ／　ｇｏ−ｔｚｒｓｇ Ｌコ　６θｎｇ Ｌ　ｊ　Ａ　Ｉ　ｎ、！７ （以下余日） ３°）　初代培養ラット肝細胞の培養 シーグレン（Ｓｅｇｌｅｎ、１９７３年）の方法をいくらか修正した方法〔ギュ ガンーギルーゾ（ＧＵＧＵＥＮ−ＧＵＩＬＬＯＵＺＯ）ら、１９８０年、イン　 ビトロ（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）　１６　、　Ｊ、Ｆ、ウーセ（ＨＯＵＳＳＡＩＳ 　）ら、１９８３年、モー。エール、アカド、シ。

、６す（Ｃ１Ｒ，Ａｃａｄ、５ｃｉ−ｐａｒｉｓ　）、ｉ２９７焉第ｍ号、第４ ９７−５００頁〕に従って、ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットの肝臓にコラゲ ナーゼを注入した後肝細胞を単離した。

培養開始後６時間または２０時間で、ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ　）フラスコに 付着した後の肝細胞ζこハイブリダイゼーションを実施した。培養肝細胞（細胞 ２．５Ｘ１０　〜３×１０　個）中にＬ細胞をｌＯ個加えた。融合過程は、Ｒ， Ｌ、ダビツドソン（ＤＡＶＩＤＳＯＮ　）ら（１９７６年）１体細胞遺伝学（Ｓ ｏｍａｔｉｃＣｅｌｌ　にｅｎｅｔｉｃｓ　）、第２巻、第２号、第１６５−１ ７６頁に記載の方法に従って、短時間ポリエチレングリコールと接触させて誘発 する。２４〜２８時間後培養物をＨＡＴ選択培地（リトルフィールｆ（Ｌｉｔｔ ｌｌｌｅｆ＋’１ｉｅｌｄ）、１９６４年）に移る。培磐しポリエチレングリコ ールと接触して脆弱化した肝細胞も同様に自然に除かれる。培地に現われる生き たハイブリッドクローンを単離し、培養し、ＨＢｓ抗原の産生能についてテスト する。

ハイブリット°クローンのうちで（上記に示したように検出定量した）ＨＢＳ抗 原産生しＲルの高いものは荷にハイブリッドＬ１χＨＡでみられる。

ａ）単離した２９個のクローンのうち、−２個は陰性、すなわちＨＢｓＡｇを検 出し得る程度に産生ずることがなく、 一２７個はＬ１細胞より産生しばルが高く、その内訳は、−１１個は２〜５倍、 一５個は６〜１０倍、 一８個は１０〜２０倍、 一２個は２０〜４０倍、 一１個は５０倍以上産生量が増大していた。

ｂ）単離しなかったクローン全体を含めて４禎の培養物では、−１種は２倍の産 生、 ｍ個の３種の培養物は１０〜３０のファクターで産生が増大していた。

Ｌ２とＬ３から得られたハイプリツＰ、すなわちＬ；２χＨＡ（８ｆｌＡＩのク ローンを単離）およびＬ３χＩ（Ａ（１２個のクローンを単離）では検出し得る ＨＢｓは産生されなかった。

実施例■： 実施例Ｉに示したのと同じ肝細胞とへ・ぞドーム細胞株ＢＷＴＧ３（ＨＧＰＲＴ −）とをＩ（Ａ　Ｔ培地中で予じめハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダ イゼーションは実施例■に記載したのと同じ条件で実施する。この培地中で増殖 する細胞ハイブリッドを回収する。形成し、次の補足形質転換に用いた）１イブ リッド株は１９８４年３月５日番号ｌ−２８２としてＣ，Ｎ、　Ｃ，ＩＩＩＬに 寄託した。

第２段階では前記のハイブリッド細胞株を抗生物質Ｇ４１８を含有する培地中で 既に述べたガラパン（ＧＡＲＡＰＩＮ　）らの記載した条件でプラスミド０ｐＮ Ｙ４とプラスミ）’ｐＷとで同時形質転換する。

この培地中で生育し、さらに前実施例で行なった免疫学的テストによって確認で きるＨＢＳの産生を示す細胞を回収する。

こうして、ＨＢｓの産生が実施例Ｉに示したのと同じ程度の大きさである株を回 収する。

特に、第１回目の実験では（細胞１０６個、２４時間で）ＨＢｓＡｇをそれぞれ ８００，１１７．２０および６２５　ｎｇ分泌するクローン４個、第２回目の実 験では（常に細胞１０６個。

２４時間あたり）ＨＢｓＡｇをそれぞれ１７８１，３６５，５４８゜２８１０． ７７３．８６３ｎｇ分泌するクローンを単離した。

ハイブリッドではなく最初のヘメトーム細胞株に類似の条件で同時形質転換（ｃ ｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のテストを行なったところ無視し得る以上の 量でＨＢｓを分泌する株は得られなかったということは重要である。

プラスミ）−ｐＮＹ４は（大腸菌（≧、ｃｏ目）Ｋ１２に入れて）１９８４年３ 月５日番号ｌ−２８５としてＣ，Ｎ、Ｃ、Ｍ、に寄託した。

実施例Ｉに鑑みて、ハイブリッドのある徨のクローンは明らかにＨＢｓ抗原をコ ート°シているＤＮＡ配列を発現しないことが確かにわかるであろう。しかし同 時に、ランダムに採取した３個のクローンのうち１個がＨＢｓを大債に分泌する ことが明らかであることがわかろう。試験がランダムなため活性のないハイブリ ット°クローンが一定の数で単離されるのはこの技術では全く当然である。しか し、実施例Ｉに示されるように、活性のあるものを選択するために実施する培養 物のテストの回数がかなり少なくても統計的再現性は充分である。・　パ上記の 実施例では所定のＤＮＡ配列は基本的にＨＢ　Ｖ　−ＤＮＡのＳ遺伝子であった 。もちろん、この配列を他の配列、たとえばＨＢ　Ｃ抗原をコードシている遺伝 子や同じ抗原をコードシているあらゆる他の遺伝子または核酸配列で置き換える ことができよう。また同じ方法を、形實転換に使用する所定のＤＮＡ配列を一時 的に発現し得るあらゆる一次細胞を使用する場合、任意の遺伝子を含有する捕乳 動物細胞と対応の分化した正常−次細胞型とのハイブリダイゼーション後のクロ ーン化した前記遺伝子の発現の研究、Ｉこ拡張するこ七かできることに注意され たい。一般に本発明の方法は、医学的または産業上使用し得るタンノぐり質を高 度に産生ずるあらゆるハイブリッドクローンの取得、あるいは、、ｌＪ胞内で遺 伝子をコントロールするメカニズムの研究に応用できる。

いうまでもなく、また上述のことから既にわかるように、本発明は特に考慮した 使用および実施の態様に限定されるものではなく、逆にあらゆる変形を包含する 。

図面の簡単な説明 ３際調査報告 １＋＋＋ｍＡ＋＋Ｉｌ＋＋１＋＋、、、に丁、’ＦＲ４１５１０００４６

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．クローン化されたＤＮＡ配列を発現するかまたは発現できるようにし得る細 胞ハイブリツドの製造方法であつて、一方が前記クローン化ＤＮＡ配列を発現し 得るかまたは発現する樹立真核細胞で、他方が、前記クローン化ＤＮＡ配列がコ ードしているポリペプチドからなるタンパク質または前記ポリペプチドの配列と 同じもしくは類似のポリペプチド配列を自身の固有の構造中に含有しているタン パク質をコードしている天然の遺伝子を本来発現し得る一次細胞のハイプリダイ ゼーシヨンを可能にするのに適した条件下、前記樹立細胞が適当な遺伝子配列で 補足されていないときはこれらの細胞の生育を不可能にする培地中で、共培養を 実施すること、細胞のハイプリダイゼーシヨンに使用する一次細胞が前記培地中 で形成された細胞ハイブリツドの少なくとも一部に前記適当な遺伝子配列を供与 し得るかまたは供与し得るように予じめされていること、および形成された細胞 ハイブリツドを回収すること を特徴とする方法。
2. ２．樹立細胞または一次細胞または同時にこれら両者が前記共培養に先立つて前 記クローン化ＤＮＡ配列で形質転換されていること、および前記共培養の後形成 した細胞ハイブリツドの、かくの如く前記クローン化ＤＮＡがコードしているポ リペプチドを産生していることが明らかなものを選択することを特徴とする請求 の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記共培養終了時に得られた細胞ハイブリツド自体を前記クローン化ＤＮＡ 配列で形質転換すること、および前記共培養後形成した細胞ハイブリツドの、同 様に前記クローン化ＤＮＡがコードしているポリペプチドを産生することが明ら かなものを選択することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．Ｂ型肝炎ウイルスのゲノム内に含まれる所定の遺伝子の全部もしくは一部を 含有するクローン化ＤＮＡ配列または前記遺伝子がコードしているポリペプチド の免疫学的特性と等価な免疫学的特性を有する免疫原性ペプチドをコードしてい るクローン化ＤＮＡ配列を発現するかまたは発現できるようにし得る細胞ハイブ リツドの製造方法であつて、一方が前記クローン化ＤＮＡ自己列を発現し得るか または発現する樹立真核細胞で、他方が好ましくはヒトの肝細胞のハイプリダイ ゼーシヨンを可能にするのに適した条件下、前記樹立細胞が適当な遺伝子配列で 補足されていないときはこれらの細胞を生育させない培地中で、共培養を実施す ること、細胞ハイプリダイゼーシヨンに使用する肝細胞が、前記培地中で形成さ れた細胞ハイブリツドの少なくとも一部に前記適当な遺伝子配列を供与し得るか または供与し得るように予じめされていること、および形成した細胞ハイブリツ ドを回収すること を特徴とする方法。
5. ５．樹立細胞または肝細胞または同時にこれら二者が前記共培養に先立つて前記 クローン化ＤＮＡ配列で形質転換されていること、および前記共培養後、形成さ れた細胞ハイブリツドの、同様に前記クローン化ＤＮＡ配列がコードしている抗 原を産生することが明らかなものを選択することを特徴とする請求の範囲第４項 に記載の方法。
6. ６．共培養後に得られた細胞ハイブリツド自体を前記クローン化ＤＮＡ配列で形 質転換すること、および前記共培養後、形成した細胞ハイブリツドの、同様に前 記クローン化ＤＮＡ配列がコードしている抗原を産生することが明らかなものを 選択することを特徴とする請求の範囲第４項に記載の方法。
7. ７．樹立真核細胞がその遺伝子の１つのレベルに欠失を有すること、および培地 が、前記樹立細胞が前記欠失のために生育できない選択培地であることを特徴と する請求の範囲第１〜６項のいずれかに記載の方法。
8. ８．真核細胞がマウスＬＹＫまたはＨＧＰＴ細胞であり、培地がＨＡＴ選択培地 であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．樹立真核細胞がヘパトームＨＧＰＲＴ−株からなり、培地がＨＡＴ選択培地 からなることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の方法。
10. １０．培地が真核細胞内に浸透し得る抗生物質、特にアミノグリコシド型抗生物 質を含有しており、一次細胞、特に肝細胞が抗生物質を不活化し得る酵素をコー ドしているＤＮＡ配列で予じめ形質転換されていることを特徴とする請求の範囲 第１〜６項のいずれかに記載の方法。
11. １１．抗生物質がＧ４１８からなり、ＤＮＡ配列がアミノグリコシド３′−ホス ホトランスフエラーゼをコードしていることを特徴とする請求の範囲第１０項に 記載の方法。
12. １２．前記クローン化ＤＮＡ配列がウイルス性Ｂ型肝炎のウイルスのＳ遺伝子の 少なくとも一部および好ましくは同時にウイルス性Ｂ型肝炎のウイルスゲノムの プレーＳ傾城に相当する遺伝子を含有することを特徴とする請求の範囲第４項単 独または請求の範囲第４項と第５〜１１項のいずれかとの組み合せに記載の方法 。
13. １３．クローン化ＤＮＡ配列で形質転換されているかまたは形質転換し得るハイ ブリツド細胞であつて、一方で、前記クローン化ＤＮＡ配列がコードしているポ リペプチドからなるタンパク質または前記ポリペプチドの配列と同じかもしくは 類似のポリペプチド配列をその構造中に含有するタンパク質をコードしている天 然の遺伝子を本来発現し得る一次細胞株の遺伝形質（ｐａｔｒｉｍｏｉｎｅｇｅ ｎｅｔｉｑｕｅ）の少なくとも一部と、他方で、選択培地またはハイブリツドの 由来となる細胞にとつて通常致死性であるが遺伝子マーカーによつて発現される ポリペプチドによつて不活化し得る活性成分を含有する培地中で前記ハイブリツ ドを生育せしめ得る前記遺伝子マーカーとを含有することを特徴とするハイブリ ツド細胞。
14. １４．一次肝細胞の遺伝形質の一部を含有しており、かつＢ型ウイルス性肝炎に 対するワクチン特性を示す免疫原性ポリペプチドを２４時間で細胞１０６個あた り少なくとも１５０ｎｇの産生率で分泌し得るかまたは分泌し得るようにするこ とができることを特徴とする請求の範囲第１３項に記載のハイブリツド細胞。