DE60031260T2

DE60031260T2 - Vorübergehend-immortalisierte zellen zur verwendung in gentherapie

Info

Publication number: DE60031260T2
Application number: DE60031260T
Authority: DE
Inventors: Edward E. Baetge; Shou Wong; Philippe Dupraz; Bernard Thorens
Original assignee: Heart Biosystems GmbH
Current assignee: Heart Biosystems GmbH
Priority date: 1999-04-12
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2020-04-13
Also published as: CA2369884A1; CA2369884C; EP1175436B1; DE60031260D1; EP1175436A2; JP2002541786A; WO2000061617A3; DK1702979T3; AU4342900A; ATE342275T1; WO2000061617A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung steht in allgemeiner Beziehung zur Gewebetransplantation. Speziell bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Steigerung der Replikationskapazität von normalen ruhenden Zellen, wie etwa normale Körperzellen, durch transiente Immortalisation oder transiente Telomerisation, um Zellen herzustellen, die für die Zelltherapie geeignet sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Zelltherapie ist ein sich entwickelndes Gebiet zur Behandlung von medizinischen Erkrankungen. Zellen aus verschiedenen Gewebequellen werden zur Transplantation in Säugetierrezipienten, einschließlich Menschen, bei der Behandlung von Erkrankungen, Gewebe oder Organersatz, in Betracht gezogen. Die Verwendung primärer Zellen zur Transplantation erfordert eine kontinuierliche, fortwährende Verfügbarkeit von frischen Gewebequellen. Dies ist jedoch problematisch, insbesondere dann, wenn humane Zellen erwünscht sind. Normale humane Körperzellen zeigen eine begrenzte Replikationskapazität von 50–100 Populationsverdopplungen, die trotz der Anwesenheit adäquater Wachstumsfaktoren durch eine Beendigung der Proliferation charakterisiert ist. Die Replikationskapazität kann bedeutend niedriger sein (10–50 Populationsverdopplungen), wenn die Zellen in Kultur in vitro gehalten werden. Diese Beendigung der Replikation in vitro wird häufig als zelluläres Altern oder zelluläre Seneszenz bezeichnet.
Um Zellen für die therapeutische Verwendung in ausreichender Menge zu generieren, werden gewöhnlich Zellen immortalisiert, um eine unbegrenzte Replikationskapazität zu erzielen und zelluläre Seneszenz zu verhindern. Die Identifizierung von immortalisierenden Genen und die Entwicklung von Gentransfer-Verfahren erlaubt die Generierung von Zelllinien aus Zelltypen, die schwer in ausreichender Menge erhalten werden oder in Kultur über eine kurze Lebensdauer verfügen. Diese immortalisierenden Gene werden typischerweise durch den Transfer eines Virus oder eines Plasmids, das ein immortalisierndes Gen enthält, generiert. Die Immortalisation einer Zelle steigert die Lebensspanne einer Zelle (insbesondere in Kultur mit replikativen Wachstumsfaktoren), so dass die resultierende Zelllinie weitaus öfter in der Lage ist, als die ursprünglichen Primärzellen passagiert zu werden.
Die Publikationen ((1) KATAKURA Y ET AL.,: „Immortalization by gene transfection. „METHODS CELL BIOL, vol. 57, 1998, Seiten 69–91; (2) JIANG XU-RONG ET AL: „Telomerase expression in human somatic cells does not induce change associated with transformed phenotype" NATURE GENETICS, NATURE AMERICA, NEW YORK, US, vol. 21, no 1, January 1999 (1999-01), Seiten 111–114; (3) J WANG ET AL: "MYC ACTIVATES TELOMERASE" GENES AND DEVELOPMENT, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, NEW YORK, US, vol. 12, 1998, Seiten 1769–1774) beschreiben Polypeptide mit immortalisierender Aktivität (1), ein Polypeptid mit der katalytischen Komponente der Telomerase (hTERT, 2), ein Polypeptid, das Telomerase aktivierende Aktivität besitzt (myc, 3) und Verfahren, wobei die Gene der besagten Polypeptide in Zellen transfiziert werden. Jedoch bezieht sich keine dieser Veröffentlichungen auf Fusionsproteine umfassend die Transportfunktion der Transportproteine VP22 oder HIV TAT.
Die Anwendung von immortalisierten Zellen in der Zelltherapie kann jedoch ernsthafte Risiken für Patienten darstellen, weil immortalisierte Zellen auf mehreren Ebenen tumorgen sind. Darüber hinaus wird die exogene DNA, die für die Zelltransformation geeignete Nukleinsäuren enthält, im allgemeinen in Zellen durch Insertion, durch die Verwendung von infektiösen Vektoren wie etwa retrovirale Vektoren, eingefügt. Virusinfizierte Zellen stellen ebenfalls ernsthafte Risiken für Patienten dar, wie etwa die Generierung von replikationskompetenten Viren während der Virus-Produktion; die mögliche Rekombination zwischen dem therapeutischen und den endogenen retroviralen Genomen, eventuell die Generierung von infektiösen Agenzien mit neuen Zellspezifitäten, Wirtsbereichen oder einer gesteigerten Virulenz und Zytotoxizität; und die mögliche unabhängige Integration in eine große Anzahl an Zellen steigern das Risiko für tumorgene insertionale Ereignisse.
Annäherungen zur Vermeidung dieser Risiken konzentrieren sich auf die Entfernung des genetischen Elements, wenn die Differenzierung der Zielzellen erwünscht ist. Eine solche Annäherung ist mit der Anwendung des Cre/IoxP Rekombinationssystems des Bakteriophagen P1 verbunden. Im Cre/IoxP-Verfahren wird für die Insertion das immortalisierende Gen oder das Onkogen mit Rekombinase Erkennungssequenzen (IoxP) flankiert und anschließend via Cre-vermittelter Deletion das flankierende Gensegment entfernt. Die Abwesenheit von verbleibendem immortalisierendem Gen lässt sich jedoch sehr schwer überprüfen. Jedes verbleibende immortalisierende Gen stellt ein ernsthaftes Risiko für den Empfänger der Zelltherapie dar, da es möglicherweise diesen Zellen ermöglicht, im Wirt nach der Transplantation ihre Proliferation fortzusetzen und einen Tumor zu bilden. Dementsprechend ist Gewebe, welches auf diese Art aus Zellen für die Zelltherapie generiert wird, weniger erwünscht.
Daher besteht in diesem Fachgebiet der Bedarf für ein Verfahren zur Zellproliferation, welches Risiken vermeidet, die mit der Inkorporation von exogenen immortalisierenden Genen in Zellen, die für die Zelltherapie verwendet werden, assoziiert sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen für die Generierung von Zellen zur Verfügung, die nicht in ausreichender Menge vorhanden sind, die schwer in reiner Form in Primärkultur erhalten werden können, die wenig verfügbar sind (z.B. humane Zellen) oder eine kurze Lebensdauer in Kultur haben. Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur bedingten transienten Zellproliferation, wobei die Immortalisation oder Telomerisation durch die Wirkung von exogen bereitgestellten Molekülen initiiert wird und durch das Entfernen der exogen bereitgestellten Molekülen terminiert wird. Zellen werden in vitro zur Herstellung einer Zellbank vermehrt und durch die Entfernung des exogenen immortalisierenden oder telomerisierenden Fusionsproteins in ihren nicht-proliferativen Zustand zurückversetzt. Die Zellen, die durch die Verfahren der Erfindung hergestellt werden, sind für die Transplantation und die Zelltherapie geeignet. Die Verfahren der Erfindung können zur Proliferation von jeglichen normalen ruhenden Zellen, die zur Proliferation induziert werden können, wie etwa normale Körperzellen, angewendet werden.
In der Erfindung werden Fusionsproteine bereitgestellt, aufweisend ein Transport-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz des herpesviralen VP22 Proteins, des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) TAT Proteins oder von Homologen oder von Fragmenten davon, die an Aminosäuresequenzen von Zellimmortalisationsproteinen gekoppelt sind. Beispiele für Proteine oder Polypeptide für Zellimmortalisationsaktivität umfassen das 12S und 13S Produkt des Adenovirus E1A-Gens, die SV40 klein und groß T-Antigene (Subfragmente und verkürzte Versionen), Papilloma Viren E6 und E7, das Epstein-Barr Virus (EBV), Epstein-Barr nuklear Antigen-2 (EBNA2), humanes T-Zell Leukämievirus-1 (HTLV-1), HTLV-1 tax, Herpesvirus Saimiri (HVS), mutantes p53 und Proteine der Onkogene wie etwa myc, c-jun-, c-ras. C-Ha-ras, h-ras, vsrc, c-fgr, myb, c-myc, n-myc und Mdm2. Ebenfalls werden in der Erfindung Fusionsproteine bereitgestellt, aufweisend ein Transport-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz des herpesviralen VP22, des HIV TAT oder von Homologen oder Fragmenten davon, zusammen mit Aminosäuresequenzen von Proteinen oder Fragmenten davon mit Telomerase spezifischer Aktivität. Beispiele von Proteinen oder Fragmenten mit Telomerase spezifischer Aktivität hiervon, umfassen Telomerase, p140, p105, p48 und p43.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden normale ruhende Zellen transient immortalisiert, um diese Zellen zu vermehren. Zellen von Interesse werden in Anwesenheit eines Fusionsproteins, enthaltend ein erstes Polypeptid mit der Transportfunktion des herpesviralen VP22 Proteins oder HIV TAT Proteins und einem zweiten Polypeptid mit Zellimmortalisationssaktivität, kultiviert. Das Fusionsprotein wird in den Kern der Zellen transportiert und immortalisiert die Zellen. Die immortalisierten Zellen expandieren in Anwesenheit des Fusionsproteins. Sobald ausreichend Zellen erhalten werden, wird das Fusionsprotein aus dem Wachstumsmedium entfernt und die Zellen werden kultiviert bis sie in ihren ursprünglich differenzierten nicht-immortalisierten Zustand zurückkehren.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden normale ruhende Zellen durch transiente Telomerisierung dieser Zellen proliferiert. Zellen von Interesse werden in Anwesenheit eines Fusionsproteins, enthaltend ein erstes Polypeptid mit der Transportfunktion des herpesviralen VP22-Proteins, des HIV TAT-Proteins und einem zweiten Polypeptid mit Telomerase spezifischer Aktivität, kultiviert. Das Fusionsprotein wird zum Kern dieser Zellen transportiert, wo es telomerische DNA an chromosomale Enden synthetisiert und dabei die replikative Seneszenz verhindert. Die telomerisierten Zellen expandieren in Anwesenheit des Fusionsproteins. Sobald ausreichend Zellen erhalten werden, wird das Fusionsprotein aus dem Wachstumsmedium entfernt und die Zellen in einer standardisierten Art und Weise in der Abwesenheit von exogenen immortalisierenden oder telomerisierenden Fusionsproteinen kultiviert.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung werden das Transportprotein (wie etwa VP22 oder TAT) und das immortalisierende Gen (wie etwa hTERT, SV40, etc.) miteinander gemischt und auf die Zellen appliziert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden normale ruhende Zellen proliferiert, indem diese Zellen transient telomerisiert werden. Zellen von Interesse werden in Anwesenheit von zwei Fusionsproteinen kultiviert: (1) ein Fusionsprotein, enthaltend ein erstes Polypeptid mit einer Transportfunktion des herpesviralen VP22-Proteins oder HIV TAT-Proteins und einem zweiten Polypeptid mit Zellimmortalisationsaktivität; (2) ein Fusionsprotein, enthaltend ein erstes Polypeptid mit einer Transportfunktion des herpesviralen VP22 Proteins oder des HIV TAT Proteins und einem zweiten Polypeptid mit Telomerase spezifischer Aktivität. Die Zellen können in Anwesenheit von mehr als einem Fusions-Typ der VP22-Immortalisation oder TAT-Immortalisation kultiviert werden. Die Zellen expandieren in Anwesenheit der Fusionsproteine bis ausreichend Zellen mit erhöhter Lebensdauer erhalten werden. Die Fusionsproteine werden daraufhin aus dem Wachstumsmedium entfernt und die Zellen kultiviert bis sie in ihren ursprünglich differenzierten nicht-immortalisierten Zustand zurückkehren.
Die Zellen, die durch die Verfahren der Erfindung hergestellt werden, sind nicht permanent immortalisiert (und demzufolge nicht tumorgen oder transformiert) und nicht viral infiziert. Dementsprechend sind diese Zellen nach der Entfernung der exogen immortalisierenden oder telomerisierenden Fusionsproteine für die Transplantation oder für die Anwendung in der Zelltherapie geeignet.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die zelluläre Immortalisation durch direkte transkriptionale Aktivierung der Telomerase reversen Transkriptase erreicht, die durch die Zugabe des VP22-myc Fusionsproteins vermittelt wird. Wang, et al., 12 Genes & Dev. 1769–1774 (1998).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird in einer Zelle ein spezifisches Gen transient aktiviert, um spezifisch die Expression von einem endogenen Gen von Interesse zu aktivieren und das korrespondierende Protein von Interesse zu exprimieren. Die Proteine von Interesse schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf human growth hormone (hGH), Erythropoetin (EPO), Insulinotropin, Insulin, Leptin, hGCSF, Faktor VIII, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X und tissue-type Plasminogen Aktivator (tPA).
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist eine Plasmidkarte von pVP22-hTERT-1901.
2 ist eine Reihe von Photographien, welche die Detektion von VP22-hTERT und VP22-cMyc chimären Proteinen durch Immunozytochemie (ICC) zeigen. Cos Zellen wurden transient mit plasmidfreier DNA transfiziert (Panel A und B), pVP22-(cMyc-HIS-TAG)-1090 Kontrollvektor (Panel C und D), pVP22-hTERT-(cMy-HIS-TAG)-1095 Vektor (Panel E und F) und pVP22-cMyc-(HIS-TAG9-1101 Vektor (Panel G und H). Der anti-cMyC Erst-Antikörper (c-Myc Ab) wurde hinzugefügt in Panel A, C, E und G wobei kein anti-cMyc Erst-Antikörper hinzugefügt wurde in Panel B, D, F und H.
3 ist eine Western-Blot-Analyse von VP22-basierten chimären Proteinen, die in Cos Zellen exprimiert wurden. Das VP22-hTERT-(cMyc-HIS-TAG)Fusionsprotein und die Kontrolle VP22-(cMyc-HIS-TAG)Protein wurden jeweils in p1101 und p1090 in transient tranfizierten COS Zellen exprimiert (Als Antikörper wurde der anti-cMyc Antikörper von Invitrogen verwendet). Die Molekuralgewichte von VP22-hTERT-(cMyc-HIS-TAG), VP22-eMyc-(HIS-TAG) und TAG sind mit Pfeilen markiert.
4 ist eine Reihe von Abbildungen. 4A zeigt die Populationsverdopplungskurve für 1091-MDX01 (Kurve mit Rauten), wie bestimmt durch wiederholte serielle Passage der VP22-hTERT Zelllinie. Ebenso dargestellt sind die linearisierten Ergebnisse (durchgezogene Linie). 4B zeigt die Populationsverdopplungskurve für mMLV-hTERT immortalisierte MDX12(Kurve mit X)-Vs die parentale primäre MDX1 Zelle (Kurve mit Dreiecken), bestimmt durch wiederholte Passage der VP22-hTERT Zelllinie.
5 ist eine Reihe von Gelen, welche die katalytische Telomeraseaktivität von VP22-hTERT chimären Proteinen zeigt, wie durch den TRAP-Assay dargestellt. In 5A wurde der TRAP-Assay mit Zelllysaten von COS Zellen, die mit VP22,VP22-hTERT und VP22-HTERT-(mMyc.HIS-TAG)Fusionsprodukten, transient in die jeweiligen Expressionvektoren p1090, p1091 und p1095 transinfiziert wurden durchgeführt. 293T wurde als Positivkontrolle für die katalytische Aktivität von hTERT im TRAP-Assay einbezogen. In 5B, wurde der TRAP-Assay mit stabilen polyklonalen p1091/MDX1 Zellen, MDX1 als Negativkontrolle und MDX12 als Positivkontrolle durchgeführt.
6 ist eine Reihe von Photographien, welche die Detektion der Anwesenheit der Telomerase in p1091/MDX1 durch ICC zeigen. ICC wurde mit p1091/MDX12 stabilen Zellen mit anti-hTERT Antikörpern und α-hTERT (C-20) Antikörper durchgeführt, während MDX1 (6A und 6B) und MDX12 (6C und 6D) Zellen jeweils als H-TERT-Negativ- und Positivkontrolle verwendet wurden. Der anti-hTERT Erst-Antikörper wurde in 6A, 6C und 6E hinzugefügt, während der anti-hTERT Erst-Antikörper nicht in 6B, 6D und 6F hinzugefügt wurde.
7 ist eine Reihe von Gelen (mit zusätzlicher Darstellung), welche die endogene hTERT und VP22-hTERT mRNA Expression, gemessen durch RT-PCR in MDX12 und 1091-MDX01 immortalisierten Zelllinien zeigen. RT-PCR wurde mit aus MDX12 (hTERT immortalisiert) und 1091-MDX01 (VP22-hTERT immortalisierte) Zelllinien isolierter mRNA, unter Verwendung von Oligonukleotiden, die spezifisch für die endogene hTERT mRNA Expression sind, durchgeführt (7A). RT-PCR wurde mit aus MDX12 (h-TERT immortalisierte) und 1091-MDX01 (VP22-hTERT immortalisierte) Zelllinien isolierter mRNA, unter Verwendung von Oligonukleotiden, die spezifisch für VP22-hTERT mRNA Expression sind, durchgeführt (7B). +RT verweist auf die Zugabe von reverse Transkriptase und –RT verweist auf eine PCR ohne die Zugabe von reverse Transkriptase; +RT* verweist auf die Verwendung einer reversen Transkriptase eines anderen Herstellers.
8 ist eine Reihe von Gelen (mit zusätzlichen Darstellungen), welche die endogene hTERT und VP22-hTERT mRNA Expression zeigt, gemessen durch RT-PCR in MDX12 und 1091-MDX01 immortalisierten Zelllinien. RT-PCR wurde mit aus MDX12 (hTERT immortalisierte) und 1091-MDX01 (VP22-hTERT immortalisierte) Zelllinien isolierter mRNA, unter Verwendung von Oligonukleotiden, die spezifisch für mMLV-hTERT mRNA Expression sind, durchgeführt (7A). RT-PCR wurde mit aus MDX12 (hTERT immortalisierte) und 1091-MDX01 (VP22-hTERT immortalisierte) Zelllinien isolierter mRNA, unter Verwendung von Oligonukleotiden, die spezifisch für VP22-hTERT mRNA Expression sind, durchgeführt (7B). +RT verweist auf die Zugabe von reverse Transkriptase und –RT verweist auf eine PCR ohne die Zugabe von reverse Transkriptase. +RT* verweist auf die Verwendung einer reversen Transkriptase eines anderen Herstellers.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Einführung: Die Erfindung beschreibt Verfahren und Zusammensetzungen zur bedingten Immortalisation von primären Säugerzellen. Die Erfindung stellt Verfahren für die Kopplung von VP22 oder TAT an ein Onkogen oder ein immortalisierendes Gen bereit, so dass eukaryotische oder prokaryotische Zellen effizient das Fusionsprotein produzieren können. Das humane Telomerasegen (hTERT) ist in der Lage primäre humane Fibroplasten zu immortalisieren, ohne zu bewirken, dass die Zellen „transformiert" werden (Morales, C. P. et al. Nature Genetics 21, pp. 115–118, 1999; Jiang, X. R. et al. Nature Genetics 21, pp. 111–114, 1999). Wir nehmen an, dass das VP22 Protein möglicherweise dem gleichen Zwecke dienen könnte, indem es das humane Telomerase (hTERT) Protein durch die Zellmembran von geeignet exponierten Zellen hindurch transportiert. In Analogie könnte man jedes immortalisierende Protein, wie etwa das SV40, cMyc, E1A, E6, E7, ras, etc. an das C-terminale Ende des VP22 Proteins anheften und diese Fusionsproteine würden mit hoher Effizienz in die Zellkerne von exponierten primären Zellen transportiert werden.
In einer Ausführungsform ermöglicht die Erfindung die bedingte Immortalisation von humanen Betazellen (z.B. mit SV40 TAG, myc, ras, etc.) in einer transienten Art und Weise (für kurze Zeitabschnitte oder nur während der Wachstumsphase und Expansion der Zellen), so lang wie das VP22-Fusions- oder TAT-Fusionsprotein den Zellen bereit gestellt wird. Daher macht die Erfindung die bedingte Immortalisation, ohne die direkte Verwendung von DNA Transfektion oder viraler Transduktion möglich.
Kulturüberstände, Extrakte oder Kokulturen aus oder mit produzierenden Zellen können verwendet werden, um der Zelle der Wahl das Onkogen, das immortalisierende Protein oder ein anderes Protein von Interesse zu liefern. Alternativ können die Fusionsproteine gereinigt werden und dem Kulturmedium als Mediumzusatz hinzugefügt werden. Um differenzierte Endzellen zu erhalten werden die Fusionsproteinzusätze einfach aus dem Medium entfernt.
Die Vorteile dieser Ausführungsform könnten vielfältig sein. Die Vorteile schließen die Eliminierung der viralen Transduktion oder Plasmidtransfektion humaner Zelllinien von Interesse ein. Man könnte einfach das VP22-Fusionsprotein als Zusatz in das Wachtumsmedium der Kultur hinzufügen. Auf diesem Weg würden die Zellen in Kultur direkt den immortalisierenden Signalen ausgesetzt werden, ohne Notwendigkeit einer permanenten genetischen Modifikation der Zellen mit dem Onkogen oder immortalisierenden Gensequenzen.
Ein anderer Vorteil ist die Eliminierung von Gen-Switch- und Cre/Iox Inaktivierung-basierten Systemen, beziehungsweise zur Deaktivierung und Eliminierung der eingeführten immortalisierenden Gensequenzen aus dem Genom von demgemäß immortalisierten Säugerzellen. Da keine immortalisierende Gensequenzen jemals in primäre humane Zellen eingeführt werden, ist es nicht notwendig einen komplexen Gen-Switch (tet, Ecdyson etc.) hinzuzufügen, um die Expression der immortalisierenden/transformierenden Onkogene abzuschalten oder das immortalisierende Gen mit IoxP Seiten, für die spätere Excision des Onkogens durch das Hinzufügen von CRE Rekombinase zu flankieren. Mit dem VP22 oder TAT Fusionsproteinsystemen kann man auf einfache Weise, die für die Zellexpansion verantwortlichen Proteine aus dem Gewebekulturmedium entfernen und den zellulären Transport des immortalisierenden Signals anhalten. In einer Sicherheitsbetrachtung besteht aufgrund der Übertragung von potentiell transformierten humanen Zellen in die Patientenpopulation erheblich weniger Bedenken. Im Gegensatz dazu ist es mit klassischen Transfektions-/Tranduktionsverfahren sehr schwierig zu überprüfen, ob die transformierte Gensequenz „komplett" eliminiert wurde oder abgeschaltet wurde. Mit anderen Worten kann man niemals sicher sein, dass bei den Ausführungsformen, die aktuell die herkömmliche Gentransformation anwendet, jedes immortalisierende Gen inaktiviert wird, das ursprünglich in die transplantierten Zellen eingefügt wurde.
Ein anderer Vorteil dieser Erfindung ist die erhöhte Wahrscheinlichkeit, dass man nach der Entfernung des VP22 oder des TAT Fusionsproteins aus dem expandierenden Zellkulturmedium, sich die Möglichkeit zur effizienteren und schnelleren Umkehrung von expandierenden Zellen in einen völlig differenzierten Phänotyp entwickeln kann.
Ein anderer Vorteil der Erfindung ist, dass Proteine ohne die Notwendigkeit den Zellen Gene bereitzustellen, direkt zum Zellkern transportiert werden können. Die Erfindung ist besonders vorteilhaft für die bedingte Immortalisation von primären humanen Zellen, wie etwa Pankreas Betazellen, Hepatozyten, Knochenzellen, Knorpelzellen, Fibroblasten, Muskelzellen, Gehirnzellen oder Fettzellen. Als Ergebnis eines effizienten nukleären Transports kann die Erfindung darüber hinaus zur transienten Genaktivierung von bestimmten endogenen Genen in jeder Zelllinie verwendet werden. Wenn das Fusionsprotein Polypeptidsequenzen enthält, welche transkriptional die spezifische Genexpression von endogenen Proteinen aktiviert, dann kann die Erfindung zusätzlich zur Produktion eines jeden Proteins von Interesse ohne die Verwendung von kodierenden Sequenzen dieses Gens oder Proteins verwendet werden. Beispiele für Gene, die endogen durch die Verwendung von VP22 oder TAT Fusionsproteinen aktiviert werden können, sind EPO, Faktor VIII, Leptin, hGH, Insulin usw. Folglich kann die Erfindung verwendet werden, um transient in jeder primären oder immortalisierten Zelle Gene zur Produktion von besagtem Protein für jeden Gebrauch zu aktivieren.
Die Verwendung der Erfindung kann transient sein; kann ausgeführt werden mit jeder Zelle und erfordert keine DNA-Insertion in die Promoterregion stromaufwärts des Gens. Wir brauchen keine Sequenzinformation, eben nur spezifische Gen-Aktivierungsproteine. Dies vermeidet den Gebrauch der Genaktivierung von spezifischen Promotersequenzen. Vielmehr könnte es möglich sein ein Screening-Verfahren für transkriptionelle Aktivatoren zu entwickeln, die mit VP22 oder TAT verwendet werden, um Aktivatoren eines jeden Proteins von Interesse zu screenen.
In einer weiteren Ausführungsform wird VP22 oder TAT an Telomerase gekoppelt. Das VP22-Telomerase- oder TAT-Telomerase-Fusionsprotein wird transient Zellen von Interesse zugeführt. Nach Entfernung des Fusionsproteins aus dem Medium wird der Zuführungsprozeß unterbrochen – aber nur nach der transienten „Telomerisierung" der Chromosomenenden und der Erweiterung des replikativen Zelllebens für mehr als 50 Populationsverdopplungen oder mehr. Der Verabreichungsprozeß erfordert nicht das Verbleiben der verabreichten Gensequenzen in irgendeines unserer Endprodukte. Folglich verhindert die Erfindung das Verbleiben von Viren, Cre/Iox, SV40 oder Telomerase in der endgültigen Zelle oder Produktvorrichtung.
In einer weiteren Ausführungsform wird VP22 oder TAT an c-myc gekoppelt, welches spezifisch Telomeraseaktivität via transkriptionaler Aktivierung induziert, so dass keine Notwendigkeit für das Telomerase Fusionsprotein besteht (Wang, J. et al. Genes & Devel. 12, pp 1769–1774, 1998).
Polypeptide mit der Transportfunktion von VP22. VP22 ist ein Strukturprotein, welches in Herpes simplex Typ 1 Virus (HSV) vorkommt. Das herpesvirale HSV-1 Virion Protein VP22 verfügt über einen außergewöhnlichen interzellulären Traffic/Transportmechanismus (Siehe PCT Internationale Patentanmeldung WO 97/05265; Elliott & O'Hare, 88 Cell 223–233 (1997)). Das Protein kann sich selbst effizient durch die Membran von Zellen über einen nichtklassischen Golgi-unabhängigen Mechanismus hindurch transportieren. Das VP22 Protein kann sich selbst in umgebenden Zellen als ein Ergebnis einer endogenen Synthese und Sekretion oder nach exogener Applikation gegenüber naiven Zellen hinein transportieren. VP22 kann sich durch eine Monoschicht einer nicht exprimierenden Zelle hinweg ausbreiten, wobei VP22 aus dem Zytoplasma einer exprimierenden Zelle in Nachbarzellen transportiert wird. Interessanterweise zielt das VP22 naturgemäß auf den Zellkern, wo es direkt an Chromatin bindet und nach der Zellteilung auf die Tochterzellen verteilt wird. Darüber hinaus, falls an eine Vielfalt von anderen Proteinen fusioniert, kann das VP22 Protein die fusionierten Proteine durch Zellmembranen transportieren und so die gebundenen Proteine in den Zellkern befördern. Wichtiger ist, dass gezeigt werden konnte, dass VP22 fusionierte Proteine ihre biologische Aktivität im chimären Zustand beibehalten und diese Aktivität direkt in exponierten Zellen in einer hocheffektiven Art und Weise ausüben können. Diese Transportfähigkeit des VP22-Fusionsproteins wurde kürzlich für eine Vielzahl von verschiedenen Proteinen gezeigt, einschließlich Grünes Fluoreszenzprotein, ein 27 kDa Fluoreszenz Markerprotein, (Elliott & O'Hare, 6 Gene Therapy 149–151, 1999); P-53, ein 53 kDa Zellzyklus Regulatorprotein, (Phelean et al., 16 Nature Biotechnologie 440–443, 1998); Thymidinkinase, ein 52 kDa Enzym dienend als das konvertierende Enzym in der pro-drug suicide protein Kombination routinemäßig angewendet in Studien zur Gentherapie; (Dilber et al., 6 Gene Therapy 12–21 (1999)) und β-Galaktosidase, das 116 kDa bakterielle Enzym breit eingesetzt als ein Reporterprotein bei Gen Expressionsstudien (Invitrogen). In all diesen Studien wurden die chimären VP22-Fusionsproteine mit hoher Effizienz in Zellen, die dem Fusionsprotein ausgesetzt sind, transportiert und wichtiger, zeigten die biologischen Wirkungen mit jedem gekoppelten Protein, sowohl in vitro als auch in vivo für das VP22oTK System.
Eine Vielzahl von anderen Proteinen haben die Fähigkeit die zelluläre Membran durch die Addition von membrane-translocating (membrantranslozierende) Sequenzen (MTS) (Rojas et al., 16 Nature Biotechnology 370–375 (1998)) zu durchdringen. Die MTS, eine hydrophobe Region (h-Region) wird verwendet, um eine Vielzahl von Peptiden und Proteinen (Ladung) auf nicht zerstörerische Art durch die Zellmembran zu befördern. HIV-1TAT (Ensolo et al., 67 J. Virol 277–287 (1993); Fawell et al., 91 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 664.669 (1994); Schwarze et al., 285 Science 1569–1572 (1999)) und eine geringe Anzahl von anderen nicht viralen Proteinen (Jackson et al., 89 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 10691–10695 (1995)) wurden außerdem Eigenschaften zum interzellulären Trafficing zugesprochen, aber keines scheint dieses Phänomen so treffend wie etwa VP22, mit Ausnahme von denaturiertem/renaturiertem TAT Protein zu demonstrieren. Eine weitere bedeutende Eigenschaft von VP22 ist, dass wenn dem Medium eine Zellmonoschicht exogen hinzugefügt wird, es durch eben jene transfizierten Zellen aufgenommen werden kann, wo es im Zellkern angereichert wird.
Die Bezeichnung „VP22" bezieht sich auf das Protein VP22 des HSV (Bsp. HSV1) und Transportaktive Fragmente und Homologe davon, einschließlich Transport-aktive Homologe von anderen Herpesviren, einschließlich Varizella Zoster Virus, equines Herpesvirus EHV und bovines Herpesvirus BHV; modifizierte mutierte Proteine, Fusionspolypeptide und Kopplungsprodukte, die damit homolog sind und eine Transportfunktion haben, korrespondierend mit der Transportfunktion von VP22 aus HSV4; und in diesem Zusammenhang, sich ebenso bezieht auf Nukleinsäuresequenzen, die für irgendein der erwähnten, sei es in der Form nackter DNA, RNA oder eines Vektors oder langer Nukleinsäuresequenzen, einschließlich solcher Sequenzen als Subsequenzen, kodieren.
Subsequenzen von herpesviralen VP22 Proteinen mit einer Transportaktivität und Verfahren zum Testen dieser, sind anderswo beschrieben worden. Siehe zum Beispiel PCT Internationale Patentanmeldungen WO 97/05265, WO 98/04708 und WO 98/32866, einzeln hiermit mittels Referenz eingeschlossen. Subsequenzen des herpesviralen VP22 Proteins mit einer Transportaktivität umfassen Polypeptide, die zu den Aminosäuren 60–301 und 159–301 der vollständigen HSV1 VP22 Sequenz (1–301) korrespondieren. Ein Polypeptid, das sich aus den Aminosäureresten („aa") 175–301 der VP22 Sequenz zusammensetzt hat ausgesprochen geringe Transportaktivität und wird in diesem Zusammenhang für die Erfindung wenig bevorzugt. Demgemäß bezieht sich Erfindung in einem Aspekt auf gekoppelte Proteine oder Fusionsproteine bestehend aus einer Subsequenz von VP22, enthaltend eine Sequenz bevorzugt startend bei etwa aa 159 (oder früher in Richtung N-terminal der ursprünglichen VP22 Sequenz) bis etwa aa 301 und aufweisend (relativ zu der vollen VP22 Sequenz) wenigstens eine Deletion von wenigstens einem Teil der VP22 Sequenz, welche sich erstrecken kann z.B. vom N-terminalen bis zum bezeichneten Startpunkt, z.B. eine Deletion von der gesamten oder Teilen der Sequenz von etwa aa 1–158. Weniger bevorzugt breitet sich solch eine Deletion weiter in C-terminale Richtung aus, z.B. bis etwa aa 175. Zum Beispiel sind Sequenzen im Rahmen von etwa aa 60–301 bis hin zu etwa aa 159–301 bevorzugt.
VP22 Sequenzen, die wie hierbei betrachtet, erstrecken sich auch auf homologe Proteine und Fragmente, basierend auf Sequenzen von VP22 Protein-Homologen aus anderen Herpesviren. Zum Beispiel korrespondierende Derivative und homologe VP22 Sequenzen wurden aus VZV (z.B. alle oder homologe Teile aus der Sequenz der aa 1–301), aus MDV (z.B. alle oder homologe Teile aus der Sequenz der aa 1–149) und aus BHV (z.B alle oder homologe Teile aus der Sequenz der aa 1–258) (Siehe PCT Internationale Patentanmeldungen WO 97/05265, WO 98/04708 und WO 98/32866) erhalten. Die Sequenzen der korrespondierenden Proteine aus HSV2, VZV, BHV und MDV sind aus öffentlichen Protein/Nukleinsäuresequenz Datenbanken verfügbar. Demgemäß ist z.B innerhalb der EMBL/Genbank (Datenbank) eine VP22 Sequenz aus HSV2 verfügbar, als Gen-item UL49 unter der Zugangsnummer Z86099, enthaltend das komplette Genom des HSV2 Strang HG52; das komplette Genom des VZV, welches das homologe Gen/Protein umfasst, ist verfügbar unter den Zugangsnummern X04370, M14891, M16612; die korrespondierende Proteinsequenz des BHV ist verfügbar als „bovines Herpesvirus 1 Virion Tegument Protein" unter der Zugangsnummer U21237; und die korrespondierende Sequenz des MDV ist verfügbar als Gen-Gegenstand UL49 unter Zugangsnummer LI0283 stehend für "gallid Herpesvirus Typ 1 homologe Sequenzen". In diesen Proteinen, speziell diesen von HSV2 und VZV, können korrespondierende Deletionen, z.B. von Sequenzen, die homolog zu den aa 1–159 des VP22 des HSV1 gesetzt werden. Diese zitierten Sequenzen sind hiermit mittels Referenz eingeschlossen. Homologien zwischen diesen, sind leicht durch die Verwendung von standardisierten Algorithmen und Software, z.B. solchen, die in PCT Internationale Patentanmeldung WO 95/12673, Seite 9 erwähnt werden zugänglich.
VP22 Sequenzen, wie hierbei betrachtet, erstrecken sich auf Sequenzen von Proteinen mit ähnlichen Eigenschaften zu VP22, solche etwa wie die MTS 12 Aminosäuren (membrantranslozierende Sequenz) aus Karbosi Fibroblast Growth Factor und ähnlich wie die 11 Aminosäureregionen des HIV TAT Proteins (Schwarze et al., 285 Science 1569–1572 (1999)).
Darüber hinaus sind chimäre VP22 Proteine und Proteinsequenzen geeignet im Kontext dieser Erfindung, z.B. eine Proteinsequenz aus VP22 des HSV1, in welche teilweise eine homologe Sequenz aus dem korrespondierendem homologen VP22 eines anderen Herpevirus substituiert wurde. Zum Beispiel könnte in die Sequenz des Polypeptids 159–301 vom VP22 des HSV1 C-terminale Sequenzen vom VP22 des HSV2 oder vom VP22 Homologen des BHV substituiert werden.
Es wurde berichtet, dass die Deletion der C-terminalen 34-Aminosäuresequenz vom VP22 des HSV1, die Transportfähigkeit aufhebt (Siehe PCT Internationale Patentanmeldung WO 97/05265, WO 98/04708 und WO 98/32866). Folglich beinhaltet diese Sequenzregion wesentliche Elemente für die Transportaktivität. Dementsprechend wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gekoppelte und Fusionsproteine bereitgestellt, umfassend die C-terminale 34-Aminosäure Sequenz vom VP22 oder eine Variante davon zusammen mit einer Sequenz aus: (a) ein Protein oder Polypeptid zur Zellimmortalisation; (b) ein Protein oder Polypeptid, welches Telomerase spezifische Aktivität hat; oder (c) ein Protein oder Polypeptid zur Aktivierung eines spezifischen endogenen Gens. Diese werden bereitgestellt z.B. für den Gebrauch zur Verabreichung in Form von Proteinen für Zellen, die sie aufnehmen werden. Gekoppelte Produkte von modifizierten terminalen Fragmenten mit zumindest einer Mutation, Insertion oder Deletion relativ zur C-terminalen 34 Aminosäuresequenz des HSV1VP22 werden ebenfalls bereitgestellt. Entsprechend zu einer alternativen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Fusionspolypeptide enthaltend C-terminale 34 Aminosäuresequenz des HSV1VP22 oder eine Variante davon, zusammen mit einer Nukleinsäuresequenz (DNA oder RNA) kodierend für: (a) ein Protein oder Polypeptid zur Zellimmortalisation; (b) ein Protein oder Polypeptid das spezifische Telomeraseaktivität hat; oder (c) ein Protein oder Polypeptid zur Aktivierung eines spezifischen Gen.
Es wurde berichtet, dass notwendige Sequenzen für die Transportaktivität, eine oder eine Vielzahl von Aminosäuresequenz-Motiven oder deren Homologen aus der C-terminalen Sequenz von VP22 des HSV1 oder anderen Herpesviren enthalten und ausgewählt werden können aus RSASR, RTASR, RSRAR, ATATR und wobei der dritte oder vierte Rest A dupliziert werden kann, wie z.B. in RSAASR.
Fusionsproteine. In der Anwendung können viele der hier beschriebenen Zusammensetzungen als Fusionsproteine im ersten Teil der Zielpopulation von Zellen exprimiert werden, aus diesen exportiert werden und geerntet werden. Das Fusionsprotein wird dann in ein Wachstumsmedium überführt, wo es vom zweiten Teil der Zielpopulation von Zellen, die das Protein nicht direkt herstellen, aufgenommen wird.
Ein Fusionspolypeptid kann, wie hier beschrieben in eine Zielpopulation von Zellen durch die Einführung eines Polynukleotids oder anderen Vektor, das für das Fusionspolypeptid kodiert in eine erste Population von Zellen (z.B. durch Transfektion oder Mikroinjektion) transportiert werden, welche die kodierenden Polynukleotide exprimiert um das Fusionsprotein zu produzieren, dabei den Export aus der ersten Population von Zellen bewirkt, geerntet wird und in eine zweite Population von Zellen über das Wachstumsmedium eingeführt wird.
VP22 oder TAT oder funktionelle Subsequenzen davon, wahlweise mit einer zusätzlichen Polypeptidflanke zur Kopplung, können an andere Proteine oder Nukleinsäuren durch chemische Kopplung auf jede bekannte standardisierte Art und Weise gebunden werden. Die Kopplung oder die Fusion einer Aminosäuresequenz mit der Transportfunktion des VP22 Protein oder des TAT Proteins kann ein nützliches Konstrukt zur Lieferung von Proteinen der erwähnten Typen in die Zelle bereitstellen.
Die Bezeichnung „Fusionsprotein" schließt Ausdrücke ein wie etwa „gekoppelte Proteine", „Kopplungsprodukte" und „Fusionsprodukte". Vorzugsweise sind die gekoppelten Proteine Fusionsproteine, die konventionell aus annähernd im Leseraster fusionierten Gen-kodierenden Sequenzen in bekannten, geeigneten Wirtszellen exprimiert werden. Entsprechende Polynukleotidsequenzen können durch den Gebrauch von Elementen bekannter und standardisierter rekombinanter DNA-Methoden und leicht verfügbarer Adaptierungen davon präpariert und manipuliert werden. Jedoch können, falls erwünscht, chemisch gekoppelte Produkte für bestimmte Anwendungen verwendet werden und aus einzelnen Proteinkomponenten entsprechend aus einer Vielfalt von in der Technik bekannten chemischen Kopplungstechniken präpariert werden.
Fusionsproteine können im Wege entsprechend oder ohne weiteres adaptiert zu den herkömmlichen rekombinanten DNA Techniken gebildet und verwendet werden. Die Polynukleotide können in einem offenen Leseraster enthalten sein, wirksam verbunden mit einer geeigneten Promotersequenz und einen Teil eines Expressionsvektor bilden, z.B. umfassend das Polynukleotid in einem tragenden Plasmid. Der Expressionsvektor kann zum Beispiel ein rekombinanter Virusvektor oder ein nicht-viraler Tranfektionsvektor sein. Die Vektoren können zum Beispiel Analoga oder Beispiele jener Vektoren sein, die in der PCT Internationalen Patentanmeldung WO 97/05265 genannt oder beschrieben sind oder jene die in den PCT Internationalen Patentanmeldungen WO 92/05263, WO 94/21807 oder WO 96/26267 genannt oder beschrieben sind. Für Nukleotidsequenzen, die fähig sind transkribiert und translatiert zu werden um ein funktionelles Polypeptid zu bilden, ergibt sich aus der Degeneration des genetischen Codes eine Anzahl von Nukleotidsequenzen, die für das gleiche Polypeptid kodieren. Diese Erfindung schließt alle diese Sequenzen ein.
Die hierbei beschriebenen Produkte können, entsprechend der Erfindung als transportierbare Proteine verwendet werden, die zur Aufnahme durch eine Zielpopulation von Zellen geeignet sind, z.B derart, dass korrespondierend zur VP22 gekoppelten Polypeptidsequenz, gleichartig wie oben beschrieben eine Effektorfunktion innerhalb der Zielzellen, die das Produkt aufgenommen haben stattfinden kann. Somit können zum Beispiel die Zielzellen auf eine Weise immortalisiert werden, wobei das Polypeptid oder die Nukleotidsequenz aus einem immortalisierenden Agenz stammt oder eine verlängerte replikative Lebensdauer erhält, wobei das Polypeptid oder die Nukleotidsequenz aus einer Telomerase oder aus einem Telomeraseaktivator stammt. In der Anwendung können viele der hierbei beschriebenen Produkte als Fusionsproteine in einem ersten Teil der Zielpopulation von Zellen exprimiert werden, aus diesen herausexportiert und geerntet werden. Das Fusionsprotein wird daraufhin in ein Wachstumsmedium überführt, wo es durch einen zweiten Teil der Zielpopulation von Zellen, die das Protein nicht direkt herstellt, aufgenommen wird.
Ein Fusionsprotein, wie hier beschrieben, kann zu einer ersten Zellpopulation transportiert werden; durch die Einführung eines Polynukleotids oder anderen Vektors kodierend für das Fusionspolypeptid in einem ersten Teil der Zielpopulation von Zellen (z.B. durch Transfektion oder Mikroinjektion), exprimierend das zur Produktion des Fusionsproteins kodierende Polynukleotid und dabei bewirken, dass es aus dem besagten ersten Teil der besagten Zielpopulation exportiert wird, geerntet wird und via Wachstumsmedium in einem zweiten Teil der Zielpopulation von Zellen eingeführt wird. Ein Fusionsprotein (einschließlich chemisch gekoppelte Produkte) kann ebenso in eine Zielpopulation von Zellen transportiert werden, indem die Zellen direkt einer Präparation des Fusionsproteins ausgesetzt werden, um dabei deren Aufnahme in den Zielzellen zu bewirken.
Unter den Derivaten des VP22, die entsprechend im Hinsicht der Erfindung als transportaktive Substanzen verwendet werden können und zur Kopplung mit zu transportierenden Materialien, zu Zwecken, wie an anderer Stelle dargelegt, sind Peptide umfassend eine transportaktive funktionelle Sequenz aus dem C-terminalen Bereich des VP22.
Die auf VP22 basierten Kopplungsprodukte oder Fusionsproteine können eine Reihe von Molekuralgewichten haben. Die Produkte können in der Praxis zum Beispiel etwa 70 kDa oder mehr haben, z.B. 90 kDa oder 100 kDa oder mehr unter Berücksichtigung der Größe des Proteins, welches an VP22 gekoppelt oder fusioniert wird. Die Ausführungsformen der Erfindung umfassen Beispiele, wobei das Fusionspeptid zumindest 13 Aminosäurereste lang oder mehr als 12 Aminosäurereste lang ist. Die zu fusionierenden Proteine können manchmal auch mehr als etwa 27 oder 32 kDa sein. Die gekoppelten Polypeptide oder Fusionsproteine, umfassend die VP22 Komponente, können Größen größer als 120 kDa haben, z.B. bis hin zu etwa 180 kDa oder 200 kDa.
Es ist gelegentlich bevorzugt, dass die VP22 Sequenz an ihrem N-Terminus an die Sequenz des ausgewählten anderen Proteins, eines von der Art wie hierbei erwähnt, fusioniert wird. C-terminale Fusionen können gelegentlich entsprechend bevorzugt sein.
In den Polypeptiden der Erfindung können Mutationen in den zusammengesetzten Aminosäuresequenzen der Fusionspolypeptide und anderen gekoppelten Proteinen eingebaut sein. Hier eingeschlossen sind Proteine, die mutierte Sequenzen haben in der Art, dass sie homolog bleiben, z.B. in Sequenz, Funktion; und antigenem Charakter oder in einer anderen Funktion des Proteins, das die entsprechende parentale Sequenz beinhaltet. Solche Mutationen können vorzugsweise z.B. Mutationen sein, umfassend einen konservativen Aminosäureaustausch, z.B. Austausche zwischen Aminosäuren von weitgehend ähnlichen molekularen Eigenschaften. Zum Beispiel, Austausche untereinander innerhalb der aliphatischen Gruppe Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin können als konservativ betrachtet werden. Manchmal kann die Substitution von Glycin für eine von diesen ebenfalls als konservativ betrachtet werden. Austausche innerhalb der aliphatischen Gruppe Aspartat und Glutamat können auch als konservativ betrachtet werden. Austausche innerhalb der Amid-Gruppe Asparagin und Glutamin können auch als konservativ betrachtet werden. Austausche innerhalb der Hydroxy-Gruppe Serin und Threonin können auch als konservativ betrachtet werden Austausche innerhalb der aromatischen Gruppe Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan können auch als konservativ betrachtet werden. Austausche innerhalb der basischen Gruppe Lysin, Arginin und Histidin können auch als konservativ betrachtet werden Austausche innerhalb der Schwefel enthaltenden Gruppe Methionin und Cystein können ebenfalls als konservativ betrachtet werden. Manchmal kann die Substitution innerhalb der Gruppe Methionin und Leucin auch als konservativ betrachtet werden. Bevorzugte konservative Substituitionsgruppen sind Aspartat-Glutamat; Asparagin-Glutamin; Valin-Leucin-Isoleucin; Alanin-Valin; Phenylalanin-Tyrosin; und Lysin-Arginin. In anderer Hinsicht können mutierte Sequenzen Insertionen beinhalten, solche dass die gesamte Aminosäuresequenz verlängert wird, während das Protein Transporteigenschaften beibehält. Zusätzlich können mutierte Sequenzen zufällige oder beabsichtigte interne Deletionen umfassen, welche die gesamte Aminosäuresequenz verkürzen, während das Protein die Transporteigenschaften beibehält.
Die mutierte Proteinsequenz kann zusätzlich oder alternativ durch Polynukleotide kodiert sein, die unter stringenten Bedingungen mit dem geeigneten Strang des natürlich vorkommenden Polynukleotids, kodierend für das parentale Protein hybridisieren und können auf positive Ergebnisse hin mittels für das parentale Protein relevanten herkömmlichen funktionellen Tests, getestet werden. „Stringente Bedingungen" sind Sequenz-abhängig und werden unter unterschiedlichen Umständen unterschiedlich sein. Im Allgemeinen können stringente Bedingungen ausgewählt werden, die um etwa 5°C niedriger, als der thermale Schmelzpunkt (TM) der spezifischen Sequenz bei definierter Ionenstärke und pH, sind. Die TM ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH) bei der 50% der Zielsequenz zu einer genau passenden Probe hybridisiert. Typischerweise sind stringente Bedingungen solche, bei welchen die Salzkonzentration zumindest 0,02 Molar bei pH 7 liegt und die Temperatur zumindest bei 60°C liegt. Wie auch andere Faktoren die Stringenz der Hybridisierung beeinflussen können (umfassend unter anderem Basenzusammensetzung und Größe der komplementären Stränge), die Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln und das Ausmass unpassender Basen, ist die Kombination von Parametern weitaus wichtiger, als die exakte Messung eines jeden einzelnen.
VP22-Fusions- oder TAT-Fusionsproteine können unter Verwendung eine Poly-His-Tag (poly-Histidin) einfach gereinigt werden. Systeme zur Herstellung von Fusionsproteinen, umfassend die Poly-His-Tags, sind kommerziell erhältlich (Xpress, Invitrogen, San Diego CA; His Trap Kit, Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ).
Kopplung mit immortalisierenden Proteinen. Eine gemeinsame Annäherung, um die Lebensdauer von einer Zelle zu verlängern, ist der Transfer eines Virus oder Plasmids, das ein oder mehrere immortalisierende Gene enthält. Die Zellimortalisation steigert die Lebensdauer einer Zelle und die resultierende Zelllinie ist in der Lage weitaus häufiger als die Ursprungszellen passagiert zu werden. Jedoch bilden irreversibel transformierte, tumorgene humane Zellen in weichem Agar Kolonien und bilden darüber hinaus Tumore in Nacktmäusen. Diese Zellen sind für die direkte Zelltherapie oder beliebigen Test mit vollständig differenzierten Zellfunktionen unbrauchbar.
In einer nützlichen Klasse von Ausführungsformen der Erfindung, kann VP22 an bekannte Proteine oder Polypeptide, die eine Zellimmortalisation bewirken gekoppelt werden. Immortalisierende Gene sind in der Technik gut bekannt. Siehe Katakura et al., Methods Cell Biol. 57: 69–91 (1998). Immortalisierende Proteine oder Polypeptide umfassen, sind aber nicht begrenzt auf die 12S und 13S Produkte der Adenovirus E1A Gene, SV40 kurze und lange T-Antigene, Papilloma Virus E6 und E7, das Epstein Barr Virus (EBV), Epstein-Barr nukleäre Antigen-2 (EBNA2), humanes T-Zell Leukämie Virus-1 (HTLV-1), HTLV-1 tax, Herpesvirus Saimiri (HVS), Mutant p53 und die Proteine der Onkogene wie etwa myc, c-jun, c-ras, c-Ha-ras, h-ras, v-src, cfgr, myb, c-myc, n-myc und Mdm2.
In einem Beispiel der Erfindung, betreffend die Zellimmortalisation, ist VP22 mit dem Onkoprotein myc (v-myc oder c-myc) gekoppelt. Somit wird, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung ein Fusionsprotein bereitgestellt, aufweisend ein Transport-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz des herpesviralen Proteins und eine Sequenz mit der Immortalisationsfunktion von myc. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das Fusionsprotein im Wesentlichen die vollständige Länge der myc Sequenz und im Wesentlichen die vollständige Länge der VP22 Sequenz.
Die Fusion mit VP22 wird zur Bereitstellung eines Agenz, wie etwa myc für die Immortalisation verwendet. Wo die hierbei gegebene Beschreibung sich auf myc und verwandte Peptide bezieht, ist es zu verstehen, dass wo der Zusammenhang es erlaubt, alternative immortalisierende Agenzien, solche wie z.B. die myc Analoga und andere immortalisierende Agenzien hierbei genannt und hierin bezeichnet ebenfalls zu betrachten sind, wie mehr allgemein die alternativen Fusion- oder Kopplungspartner für VP22 von jedem der anderen genannten Typen hierin genannt. Sobald Exprimiert in einer Subpopulation von exprimierenden Zellen, geerntet und dem Wachstumsmedium zugefügt, kann ein solches Fusionsprotein durch die VP22 Transportmechanismen in einen Teil von signifikanten normalen somatischen Zielzellen transportiert werden und das fremde angeheftete Polypeptid dann diese normale Zellen immortalisieren.
Durch diesen Aspekt der Erfindung werden ebenfalls korrespondierende Polynukleotide bereitgestellt, kodierend für ein Fusionspolypeptid enthaltend eine Sequenz mit der Transportfunktion des herpesviralen VP22 Proteins und eine Sequenz mit der humanen oder anderen Säugern Zellproliferationsfunktion von myc. Das Polypeptid kann in einem offenen Rahmen enthalten sein, wirksam mit einer geeigneten Promotersequenz verbunden.
Das Polynukleotid kann, entsprechend zu Beispielen der Erfindung, einen Teil eines Expressionsvektors bilden, z.B. umfassend das Polynukleotid getragen in einem Plasmid. Der Expressionsvektor kann z.B. ein Virus oder ein nicht-viraler Transfektionsvektor sein.
Kopplung mit Telomerase. Telomere sind spezielle Strukturen am Ende von eukaryotischen Chromosomen und scheinen eine Funktion bei der Chromosomenstabilisierung, Positionierung und Replikation zu haben (Blackburn & Szostak, 53 Ann. Rev. Biochem. 163–194 (1984); Zakian, 23 Ann. Rev. Genetics 579–604 (1989); Blackburn, 350 Nature 569–573 (1991)). In allen Vertebraten verfügen Telomere über hunderte bis tausende Tandem Wiederholungen der 5'-TTAGGG-3' Sequenz und assoziierter Proteine (350 Nature 569–573 (1991); Moyzis et al., 85 Proc. Acad. Sci. 6622–6626 (1988)). Southern-Blot Analysen von terminalen chromosomalen Restriktionsfragmenten (chromosome terminal restriction fragments (TRF)) stellen die vielfältigen Längen von allen Telomerasen in einer Zellpopulation bereit (Harley et al., 3445 Nature 458–460 (1990); Allsop et al., 89 Proc. Natl. Acad. Sci USA 10114–10118 (1992); Vaziri et al., 52 Am. J. Human Genetics 661–667 (1993)). In allen normalen somatischen Zellen, die bislang untersucht wurden, hat die TRF Analyse gezeigt, dass die Chromosomen etwa 50–200 Nukleotide der telomerischen Sequenz pro Zellteilung verlieren, was einhergeht mit der Unfähigkeit der DNA Polymerase zur Replikation von linearer DNA zu den Enden hin (Watson, 239 Nature New Biology 197–201 (1972)).
Es wurde vorgeschlagen, dass die Verkürzung der Telomere, die mitotische Uhr ist, durch welche die Zellen ihre Teilungen zählen (Harley, 256 Mut. Res. 271–282 (1991) und dass ausreichend kurze Telomere das Signal für die replikative Seneszenz in normalen Zellen sein könnten (Hastie et al., 346 Nature 866–868 (1990); Lindsey et al., 256 Mut. Res. 45–48 (1991); Wright & Shay, 8 Trends Genetics 193–197 (1992)). Im Gegensatz hierzu, zeigen die weitgehende Mehrzahl von unsterblichen Zellen, die bis heute untersucht wurden, keinen Nettoverlust der Telomerlänge oder der Sequenz mit Zellteilungen, so dass angenommen wird, dass die Erhaltung der Telomerasen für die Zellen erforderlich ist, um sie vor replikativer Seneszenz und undefinierter Proliferation zu schützen (Counter et al., 11 EMBO 1921–1929 (1992); Counter et. al., 91 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2900–2940 (1994)).
Telomerase, eine einzigartige Ribonukleoprotein DNA Polymerase, ist das einzige bekannte Enzym, das telomerische DNA an chromosomalen Enden synthetisiert, indem als ein Template eine Sequenz genutzt wird, die innerhalb der RNA Komponente des Enzyms enthalten ist (Greider & Blackburn, 43 Cell 405–413 (1985); Greider & Blackburn, 337 Nature 331–337 (1989); Yu et al., 344 Nature 126–132 (1990); Blackburn, 61 Ann. Rev. Biochem. 113–129 (1992)). Im Hinsicht auf humane Zellen und Gewebe wurde Telomeraseaktivität in immortalisierten Zelllinien und Zellen des Ovarkarzinoms identifiziert, wurde aber nicht detektiert in sterblichen Zelllinien oder in normalem Nicht-Keimbahn-Gewebe (Morin, 59 Cell 521–529, 1989). Zusammen mit der TRF Analyse, lassen diese Ergebnisse die Annahme zu, dass Telomeraseaktivität in der Erhaltung der Telomere involviert ist und dieses Enzym mit der Zellimmortalität verbunden ist.
Die Expression der humanen katalytischen Komponente der Telomerase (human telomerace catalytic component hTERT) wurde kürzlich in humanen Körperzellen untersucht (Jiang, et al., 21 Nature Genetics 111–114 (1999)). Die Telomerase Expression in normalen somatischen Zellen scheint nicht Veränderungen zu induzieren, die mit einem malignen Phänotyp, wie etwa die abnormale Wachtumskontrolle oder onkogene Transformation, assoziiert sind. Die Abwesenheit von Krebs-assoziierten Veränderungen wurde auch in humanen Fibroblasten beschrieben, die mit Telomerase immortalisiert wurden (Morales, et al., 21 Nature Genetics 115–118 (1999)). Es wurde gezeigt, dass die Einführung der Telomerase in normalen humanen somatischen Zellen nicht zur Transformation des Wachstums führt, nicht Zellzyklus-induzierte Kontrollpunkte umgeht und nicht zur genomischen Instabilität dieser Zellen führt. Verfahren zur Detektion der Telomeraseaktivität, sowie zur Identifizierung von Komponenten oder Polypeptiden, die Telomeraseaktivität regulieren oder beeinflussen, zusammen mit Verfahren zur Therapie oder Diagnose zellulärer Alterung und Immortalisation durch Kontrolle oder Messung der Telomerlänge und Telomeraseaktivität wurden auch beschrieben (Siehe PCT Internationale Patentanmeldung WO 93/23572). Die Identifizierung von Komponenten, die Telomeraseaktivität beinflußen, stellen bedeutende Vorteile bei den Bemühungen zur Behandlung von humanen Erkrankungen dar. Komponenten, die die Telomeraseaktivität stimulieren oder aktivieren (solche wie myc), können mit VP22 oder TAT fusioniert werden, um die Zellseneszenz zu hemmen und die Lebensdauer der Zellen zu steigern.
In einer weiteren Klasse von Ausführungsformen der Erfindung, können VP22, TAT oder funktionelle Subsequenzen davon, zweckmäßig an Telomerase oder andere Enzyme oder funktionelle Fragmente davon, von denen bekannt ist, dass sie für einen ähnlichen Zweck geeignet sind, gekoppelt oder fusioniert werden. Das Kopplungsprodukt kann in die Zellen, die behandelt werden sollen eindringen. Diese VP22-Telomerase Kopplungsprodukte werden zur Verlängerung der replikativen Lebensspanne der Zielzelle verwendet. Die Telomerase fungiert zur Stabilisierung von Telomeren der Zelle und hält zelluläres Altern an (Siehe z.B. United States Patent 5,837,857).
Transiente Immortalisation oder Telomerisierung von Zellen. Entsprechend einem Aspekt der Erfindung werden normale ruhende Zellen transient immortalisiert, um die Zellen zu proliferieren. Die Zellen von Interesse werden in Anwesenheit eines Fusionsproteins, enthaltend ein erstes Polypeptid mit Transportfunktion des herpesviralen VP22- oder HIV TAT Proteins und ein zweites Polypeptid mit Zellimmortalisationsaktivität, kultiviert. Das Fusionsprotein wird zum Nukleus der Zelle transportiert und immortalisiert die Zellen. Die immortalisierten Zellen werden in Anwesenheit des Fusionsproteins expandieren. Sobald ausreichend Zellen erhalten werden, wird das Fusionsprotein aus dem Wachstumsmedium entfernt und die Zellen werden, bis sie in ihren ursprünglichen nicht immortalisierten Zustand zurückkehren, kultiviert. Mehr als ein Onkogen oder immortalisierendes Fragment können benötigt werden.
Entsprechend einem anderen Aspekt der Erfindung, proliferieren normale ruhende Zellen durch transiente Telomerisierung dieser Zellen. Zellen von Interesse werden in Anwesenheit eines Fusionsproteins, enthaltend ein erstes Polypeptid mit der Transportfunktion des herpesviralen VP22 Proteins und ein zweites Polypeptid mit Telomerase-spezifischer Aktivität, kultiviert. Das Fusionsprotein wird zum Nukleus der Zellen transportiert, wo es an chromosomalen Enden telomerische DNA synthetisiert und dabei replikative Seneszenz verhindert. Sobald ausreichend Zellen erhalten werden, wird das Fusionsprotein aus dem Wachstumsmedium entfernt und die Zellen werden entsprechend Standardmethoden in Abwesenheit des Fusionsproteins kultiviert.
Entsprechend noch einer Ausführungsform der Erfindung, proliferieren normale ruhende Zellen durch transiente Immortalisation und Telomerisierung dieser Zellen. Zellen von Interesse werden in Anwesenheit von zwei Fusionsproteinen kultiviert: (1) ein Fusionsprotein, enthaltend ein erstes Polypeptid mit Transportfunktion des herpesviralen VP22 Proteins und ein zweites Polypeptid mit Zellimortalisierungsaktivität; und (2) ein Fusionsprotein enthaltend ein erstes Polypeptid mit der Transportfunktion des herpesviralen VP22 Proteins und ein zweites Polypeptid mit Telomerase-spezifischer Aktivität oder Telomerase Genaktivierungsaktivität. Die Zellen expandieren in Anwesenheit der Fusionsproteine bis ausreichend Zellen erhalten werden. Die Zellen werden anschließend entsprechend Standardmethoden in Abwesenheit der Fusionsproteine kultiviert.
Transiente Genaktivierung. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, wird ein spezifisches Gen in einer Zelle transient aktiviert, um spezifisch die Expression eines endogenen Gens von Interesse zu aktivieren. Die Gene von Interesse schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf hGH, Faktor VIII (FAC III), Faktor VII (FAC II), Faktor IX (FAC IX), Faktor X (FAC X), EPO, Insulin und TPA.
Äquivalente. Aus der vorstehenden detaillierten Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen dieser Erfindung, sollte es offensichtlich sein, dass einzigartige Verfahren zur Steigerung der replikativen Kapazität normaler ruhender Zellen beschrieben wurden. Obwohl besondere Ausführungsformen hier in Detail offenbart wurden, wurde dies als Beispiele nur zu Zwecken der Veranschaulichung getan und es ist nicht beabsichtigt, dass dies beschränkend ist in Hinsicht auf die Tragweite der gestellten Patentsansprüche, die folgen. Im Besonderen hat der Erfinder hierbei betrachtet, dass verschiedene Ersetzungen, Veränderungen und Modifikationen der Erfindung gemacht werden können, ohne den Geist und den Umfang der Erfindung, wie durch die Patentansprüche definiert, zu verlassen. Zum Beispiel die Auswahl des bestimmten Polypeptids aufweisend die Transportfunktion des herpesviralen VP22 Proteins oder des bestimmten Polypeptids aufweisend die Zellimmortalisationsaktivität oder des bestimmten Polypeptids aufweisend die Telomerase-spezifische Aktivität, ist für einen Durchschnittsfachmann mit Kenntnissen zu den hier beschriebenen Ausführungsformen eine Routinetätigkeit.
Die Details einer oder mehreren Ausführungsformen der Erfindung wurden in der begleitenden Beschreibung oben dargelegt. Obwohl irgendwelche Verfahren und Materialien gleich oder gleichwertig zu den hier beschrieben in der Praxis oder Testung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben. Andere Merkmale, Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung und aus den Patentansprüchen ersichtlich. In der Beschreibung und den angefügten Patentansprüchen, beinhalten die einzelnen Formen eine Vielzahl von Referenzen, es sei denn, dass der Zusammenhang ausdrücklich anderweitig ist. Falls nicht anderweitig definiert, haben alle hierbei verwendeten Techniken und wissenschaftlichen Ausdrucksweisen, die gleiche Bedeutung wie gewöhnlich durch einen Durchschnittsfachmann verstanden werden. Alle in dieser Patentbeschreibung zitierten Patente und Veröffentlichungen sind mittels Referenzen eingeschlossen.
Die folgenden Beispiele werden dargestellt in der Absicht, um möglichst vollständig die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zu illustrieren. Diese Beispiele dürfen in keiner Weise als Beschränkung der Reichweite der Erfindung, wie durch die angefügten Patentansprüche definiert, aufgefasst werden.
BEISPIEL 1
KONSTRUKTION DER VP22-hTERT FUSION
Materialien. Taq-Polymerase und alle Restriktions- und Modifikationsenzyme wurden bei Life-Technologies (Basel, Schweiz) erworben. Der Expressionsvektor pCEP4, TA- und Klonierungs Kits wurden von Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA., U.S.A.) erworben. Die Quick-Klon cDNA aus humaner Testis, Lymphoma und HeLa Zellen, GC-Melt Genomic und cDNA PCR Kits wurde bei ClonTech (Basel, Schweiz) erworben. Der TRAPeze Assay Kit wurde von Oncor (Basel, Schweiz) erworben.
Oligonukleotide. Die folgenden Oligonukleotide haben wir als Kunden zur Verwendung als PCR Primer bei der Klonierung der hTERT DNA (Life-Technologies or Microsynth) synthetisieren lassen:
Durch die RT-PCR Amplifikation der 293T cDNA mit der Taq-Polymerase wurde unter Verwendung dieser Primer ein Produkt aus 3417 Basenpaaren hergestellt. Die Muster im diagnostischen Restriktionsverdau bestätigten, daß dieses 3417-bp RT-PCR-Produkt tatsächlich aus der hTERT cDNA stammt. Das Produkt wurde anschließend in pCR2.1 unter Verwendung des TOPO-TA Kits (Invitrogen) subkloniert. Die Ermittlung der Nukleotidsequenz des resultierenden Klons pCR2.1-hTERT-1007 zeigte, daß die klonierte hTERT, beim Vergleich mit der publizierten hTERT Nukleotidsequenz, eine fehlerfreie Nukleotidsequenz hat. Nakamura et al., 1997; GenBank Accession Number AF015950.
Konstruktion des VP22-hTERT chimären Fusionsgens. Bei einem A 3416-bp EcoRI Fragment mit unversehrter hTERT cDNA wurde pCR2.1-hTERT herausgeschnitten und im Leseraster an der EcoRI Schnittstelle in den Expressionsvektor pVP22-1090 subkloniert. Der resultierende Klon wurde pVP22-hTERT-1091 genannt. 1
Generierung einer p1091/BHK stabilen Zelllinie. Der pVP22-hTERT-1091 Expressionsvektor wurde stabil in BHK Zellen durch Verwendung von Lipofectamin Plus (Gibco Life-Technology) transfiziert. Kurz beschrieben, wurde das Selektionsmittel G418 24 Stunden nach der Transfektion zu den BHK Zellen hinzugefügt. Stabil transfizierte p1091/BHK Zellen wurden in Fibroblastenmedium (DMEM plus 10% FBS) und 1 mg/ml des G418 über zwei Wochen kultiviert. Eine Million p1091/BHK Zellen wurden in eine T-75 Kulturflasche ausgesät und zweimal mit 12 ml DMEM plus 10% FBS über 24 Stunden gepulst. Die gesammelten, konditionierten Medien wurden durch einen Nunc 0,22 μm-Filter sterilfiltriert und auf primäre humane Fibroblasten, MDX1 (Modex therapeutiques SA), mit 50.000 Zellen pro well in einer 6-well-Platte aufgebracht. Die Endkonzentration der Fibroblasten Wachstumsmedien lag entweder bei 25%, 50%, 75% oder 100%. Nach der ersten 24-stündigen Exposition in einem p1091/BHK konditionierten Medium, wurde die Medien entfernt und mit einem zweiten Batch eines für 24 Stunden gepulsten p1091/BHN konditionierten Mediums ersetzt. Nach der zweiten 24-stündigen Exposition wurden die MDX1 Zellen durch Trypsinisierung und Zentrifugation geerntet.
Telomerase Assay. Das Protokol zur telomerischen Wiederholungsamplifikation (Telomeric Repeat Amplification Protocol (TRAP)) wurde entsprechend der Herstelleranweisung (TRAPeze Telomerase Detection Kit, Oncor) durchgeführt. Kurz beschrieben, wurde ein Pellet von 50.000 Zellen in 50 μl des 1 × CHAP Lyse-Puffer mit RnaseOut bei 200 U/ml (Gibco Life-Technology), resuspendiert. Die Zellsuspension wurde für 30 Min auf Eis inkubiert und unmittelbar danach bei 15.000 U/Min bei 4°C für 10 Min zentrifugiert. Überstand wurde unmittelbar danach in ein RNase-freies Eppendorf Tube transferiert. Entsprechend dem Hersteller-Protokoll wurde der Zellextrakt 1:10 verdünnt, so dass für den TRAP Test ein Zellextrakt von 200 Zellen verwendet wurde. Zehn Mikroliter des Reaktionsgemisches wurden mittels 12,5% nicht-denaturierendem PAGE in 0,5 × TBE Puffer bei 150 Volt für 2 Stunden aufgetrennt. Die DNA Leitern wurden durch Färbung in SYBR Green Stain (Molekular Probe) sichtbar gemacht.
Ergebnisse. Wie durch den TRAP Test überprüft wurde, besitzen MDX1 primäre humane Fibroblasten keine detektierbare Telomerase Enzymaktivität. Somit kann jede detektierte Telomerase Enzymaktivität aus MDX1 Zellen, die den konditionierten Medien von pVP22-hTERT-1091/BHK ausgesetzt wurden, auf die chimären VP22-hTERT Proteine, die durch stabile pVP22-hTERT-1091/BHK Zellen durch Sekretion ausgeschieden wurden und daraufhin durch die primären humanen Fibroblasten MDX1 Zellen aufgenommen wurden, zurückgeführt werden. PAGE Ergebnisse zeigten die Telomeraseaktivitäten von MDX1 Zellen, die konditionierten Medien von pVP22-hTERT-1091/BHK Zellen ausgesetzt wurden. Die Formung von positiven Leitern im 50%igen Mediumgemisch, weist daraufhin, dass von pVP22-hTERT-1091/BHK Zellen ausgeschiedene chimäre VP22-hTERT, von den primären humanen MDX1 Fibroblasten aufgenommen wurden.
BEISPIEL 2
TECHNOLOGIE ZUR TRANSIENTEN IMMORTALISATION
Ziel dieses Beispiels ist es, die Durchführung von Translokationssystemen chimärer Proteine zur transienten Immortalisation von primären humanen Zellen zu validieren.
Konstruktion von pVP22-hTERT Fusionskasetten und Expressionsvektoren: Der grundlegende VP22 Expressionsvektor wurde von Invitrogen gekauft und in pVP22-(cMyc-HIS-TAG)-1090 umbenannt. c-Myc und HIS bezeichnen c-Myc-tags und HIS-tags, die am C-terminalen Ende des VP22 fusioniert wurden. Es wurde beschlossen, dass als erstes Gen zur Fusion an VP22 das hTERT, welches erfolgreich zur Steigerung des proliferativen Potentials primärer humaner Fibroblasten verwendet wurde, herangezogen wird. Aufgrund der Bedenken, dass die C-terminalen Tags in die katalytische Aktivität von hTERT eingreifen können, wurde enschieden, dass zwei VP22 Fusionskassetten gemacht werden: (1) VP22-hTERT beinhaltet im Leseraster eine Fusion zwischen VP22 und hTERT ohne cMyc und HIS Tags am C-terminalen Ende des Fusionsproteins und (2) VP22-hTERT(cMyc.HIS-Tag) beinhaltet im Leseraster eine Fusion zwischen VP22 und hTERT mit cMyc und HIS Tags am C-terminalen Ende des Fusionsproteins. Die c-Myc und HIS Tags wurden am C-Terminus eingeführt, wegen der Notwendigkeit die Fusionsproteine innerhalb von Säugerzellen identifizieren zu können und die Fusionsproteine in großen Mengen zu reinigen.
Die 3,4-kb EcoRI Insertion, welche das hTERT beinhaltet, wurde aus p1007 herausgeschnitten und in pVP22-c-Myc-HIS-1090 an der EcoRI site subkloniert, resultierend in einer im Leseraster gesetzten Fusion zwischen dem N-terminalen Ende von VP22 und dem C-terminalen Ende von hTERT. Dieses neue Konstrukt wurde pVP22-hTERT-1091 genannt (Siehe Tabelle 1).
Zur Bildung des VP22-hTERT (cMyc-HIS-TAG) Fusionsproteins, haben wir das Terminationscodon TGA an den Enden der hTERT-kodierenden Sequenz entfernt. Kurz gesagt, wurde das 3'900 bp MluI/NotI Fragment in hTERT durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden um ein 3'900 bp MluI/NotI Fragment zu generieren, das kein TAG Terminationscodon enthält. Das durch PCR hergestellte, kein TGA Terminationscodon enthaltende 3'900 bp MluI/NotI hTERT, wurde direkt in den pCR2.1-TOPO Klonierungsvektor kloniert und das resultierende Plasmid wurde pCR2.1-TOPO-hTERT(–)TGA-1093 genannt. Die 100%ige Genauigkeit der Insertion im p1093 wurde durch Nukleotidsequenzierungsreaktionen bestätigt. Das 3'900 bp MluI/NotI Fragment in pVp22-hTERT-1091 wurde durch das aus p1093 substituiert, wodurch eine im Leseraster gesetzte Fusion des VP22, hTERT, cMyc Epitop Tag und HIS Epitop Tag resultierte. Der resultierende Expressionsvektor wurde pV22-hTERT-(cMyc-HIS-Tag)-1095 genannt.
Konstruktion der VP22-cMyc Fusionskassetten und Expressionsvektoren. Die VP22-cMyc Fusionskassette enthält nur HIS-Tag am C-terminalen Ende des Fusionsproteins. Um VP22 und cMyc kodierende Sequenzen leicht im Leseraster zu fusionieren, wurde die vollständige cMyc kodierende Sequenz in einem 5'790-bp und 3'549-bp Fragment erneut hergestellt, resultierend in pCR2.1-cMyc-PCR1-1097 und beziehungsweise -1099. Die 100%ige Genauigkeit der Insertion in p1097 und p1099 wurde durch Nukleotidsequenzierungsreaktionen bestätigt. Die 5'790-bp und 3'549-bp cMyc Fragmente wurden durch die Subklonierung der 3'549 bp ClaI/BamHI aus p1099 in die ClaI/BamHI Stelle in p1097 subkloniert, ein cMyc mit vollständiger Länge, ohne TGA Terminationscodon generierend. Das Plasmid wurde pCR2.1-TOPO-c-Myc-(–)TGA-1100 genannt. Anschließend wurde cMyc in vollständiger Länge und ohne Terminationscodon aus p1100 durch EcoRI und NotI Restriktionsverdau in p1090 subkloniert, pV22-cMyc-HIS-1101 generierend.
Detektion von VP22-hTERT und VP22-cMyc Fusionsproteine durch ICC Analyse. Um zu zeigen, dass die VP22-hTERT und Vp22Myc Fusionsgene richtig konstruiert wurden, wurde eine immunzytochemische Analyse (immuncytochemistry (ICC) in COS Zellen, die entweder mit p1095 oder p1101 transient tranfiziert waren, durchgeführt. Der VP22-Kontrollvektor pVP22-(cMyc-HIS-TAG)-1090 war einbezogen (Siehe 3A und 3B). Da VP22, hTERT und cMyc nukleäre Proteine sind, konnte durch ICC mit anti-myc-Antikörpern eindeutig die nukleäre Färbung von transient transfizierten p1090, p1095 und p1101 gezeigt werden. Diese Daten zeigten ebenfalls, dass die Fusion VP22-hTERT (Siehe 3E und 3F) und VP22-cMyc (Siehe 3G und 3H) Fusionsgene korrekt konstruiert und die entsprechenden Fusionsproteine, wie erwartet richtig synthetisiert und zum Kern transportiert wurden.
Detektion von VP22-hTERT und VP22-cMyc Fusionsproteinen durch Western Blot Analyse: Um zu zeigen, dass die VP22-hTERT und Vp22-cMyc Fusionsproteine das korrekte Molekulargewicht haben, haben wir eine Western Blot Analyse mit Gesamtzellysaten von COS Zellen, die entweder mit p1095 oder mit p1101 transient transfiziert wurden, durchgeführt. Die Fusionsproteine mit den erwarteten Molekulargewichten wurden deutlich durch anti-Myc Antikörpern detektiert, somit weiterhin validierend, dass die VP22-hTERT (Siehe 3A) und VP22-cMyc (Siehe 3B) Fusionsgene korrekt konstruiert wurden.
Darstellung der gesteigerten Proliferationskapazität: Die VP22-hTERT stabil transfizierte Zelllinie zeigt einen vollständig immortalisierten Phänotyp, wie dargestellt durch die gesteigerte Populations Verdopplungskurve in 4. Normale nicht immortalisierte primäre MDX01 Zellen zeigen 13–20 Populationsverdopplungen unter den gleichen Kulturbedingungen.
Darstellung der katalytischen Enzymaktivität durch VP22-hTERT Fusionsproteine. Um zu zeigen, dass die N-terminalen VP22 Fusionsproteine nicht die katalytische Aktivität der C-terminal fusionierten hTERT Enzyme beeinflussen, wurden TRAP Enzym Tests mit Gesamtzellextrakten von Telomerase-negativen MDX1 Zellen, die transient mit p1091 oder p1095 transfiziert waren, durchgeführt. Beide, p1091 und p1095, zeigten deutliche leiterartige Bandenformierung, was die Erhaltung der katalytischen Aktivität von Telomerase im VP22-hTERT Fusionsprotein anzeigte (Siehe 4A).
Um festzustellen, ob VP22-hTERT Fusionsprotein kodiert durch das Expressionsplasmid P1091 in der Lage war Telomerase-negative primäre humane Fibroblasten Zelllinien zu immortalisieren, wurden diese Konstrukte stabil in hTERT-negative MDX1 Zellen transfiziert. Nach fünf Wochen G480 Selektion bei 50 ng/ml wurde eine kleine Kolonie von G418-resistenten p1091/MDX1 selektiert und für weitere Populations Verdopplungsstudien expandiert. Der Trap Test mit p1091/MDX1 zeigte die Enzymaktivität deutlich (Siehe 5B). Darüberhinaus zeigte eine ICC unter Verwendung von anti-hTERT Antikörpern positive nukleäre Färbung in p1091/MDX1 Zellen (Siehe 5B). Solch ein Ergebnis zeigte die Anwesenheit von „Telomerase" Proteinen in p1091/MDX1 Zellen an und stimmte mit der Detektion von Telomerase Aktivitäten in p1091/MDX1 durch TRAP Tests, überein. Es wurde gezeigt, dass stabile P1091/MDX1 Zellen G418 resistent aber Hygromycin sensitiv waren, was zeigt, dass es sich hierbei nicht um „kontaminierende" Zellen handelt, die von der MDX1 Linie, einer Hygromycin resistenten mMMLV hTERT immortalisierte Fibroblasten Positivkontroll-Zelllinie, abstammte.
Dennoch, es besteht immer noch die Möglichkeit, dass die p1091/MDX1 Zellen von spontan transformierten MDX1 Zellen abstammen, anstatt wirklich durch die verstärkte Expression von VP22-hTERT Fusionsproteinen immortalisiert zu werden. Um das Problem zu lösen, wurde eine RT-PCR Analyse mit der isolierten Gesamt-mRNA aus MDX01, p1091-MDX01 (VP22-hTERT immortalisierten) und MDX12 (mMLV-hTERT immortalisiert) Zelllinien durchgeführt. Wie in 7A gezeigt, wird kein PCR-Signal aus den mMLV-hTERT oder den VP22-hTERT immortalisierten Zelllinien erhalten, wenn eine RT-PCR unter Verwendung eines Ologonukleotidpaares, das spezifisch für den 5' untranslatierten Bereich und die kodierenden Regionen der endogenen hTERT Gene ist, durchgeführt wird. Wenn eine RT-PCR, mit einem Paar eines für die VP22 und hTERT kodierenden Regionen spezifischen Oligonukleotids durchgeführt wird, ist nur die VP22-hTERT immortalisierte 1091-MDX01 Zelllinie positiv (7B). Darüberhinaus wurde weiter sichergestellt, dass wenn eine RT-PCR mit Oligonukleotidpaaren, die spezifisch sind für mMLV und h-TERT kodierende Regionen durchgeführt wurde, nur die mMLV-hTERT immortalisierte mDX12 Zelllinie ein positives Signal aufwies.
Somit kann die Identität der enzymatischen Telomeraseaktivität, wie durch TRAP mit p1091/MDX01 Zellextrakten detektiert, auf die VP22-hTERT fusionierte mRNA und nicht auf die endogen aktivierten hTERT Proteine zurückgeführt werden. Dies zeigt, dass ähnlich wie bei MDX01 Zellen, die mit konstitutiv exprimiertem mMLV-hTERT immortalisiert wurden, die VP22-hTERT immortalisierten 1091-MDX01 ebenso vollständig durch die Expression der VP22-hTERT Fusions-mRNA und des resultierenden Proteins immortalisiert wurden.
Zusammenfassung:

1. Die VP22-hTERT, VP22-hTERT-(cMyc-HIS-TAG) und VP22-hTERT-cMyc-(HIS-TAG)Fusionsgene wurden durch Sequenzierungsreaktionen verifiziert, um frei von Sequenzfehlern zu sein und korrekt im Leseraster zwischen VP22 und hTERT kodierenden Regionen oder VP22, hTER, cMyc-TAG cdierenden Domänen oder VP22, cMyc beziehungweise HIS-TAG kodierenden Domänen, fusioniert zu sein.
2. Die VP22-hTERT, VP22-hTERT-(cMyc-HIS-TAG) und VP22-hTERT-(HIS-TAG)Fusionsgene sind alle fähig ein intaktes Fusionsprotein zu exprimieren, wie durch ICC und Western Blot Analyse von transient transfizierten COS Zellen gezeigt wurde.
3. Die katalytischen Telomeraseaktivitäten von VP22-hTERT und VP22-hTERT-(cMyc-HIS-TAG)Fusionsproteinen wurden überzeugend durch TRAP Tests in vitro gezeigt.
4. Die Expression von VP22-hTERT mRNA durch RT-PCR und der immortalisierte Phänotyp durch Analyse von Populationsstudien zeigt erfolgreich, dass VP22-hTERT Proteine mit Hinsicht auf die Immortalisation von primären Fibroblasten Zellen funktionell sind.

Die voranstehende Beschreibung wurde nur zum Zwecke der Veranschaulichung gezeigt und beabsichtigt nicht die Erfindung auf die hier genau offenbarte Form, außer durch die angefügten Patentansprüche zu beschränken.
SEQUENZ-PROTOKOLL

Claims

Fusionspolypeptid umfassend: (i) ein erstes Polypeptid mit einer Transportfunktion des herpesviralen VP22 Protein oder humanes Immundefizienz-Virus (HIV) TAT Protein, und (ii) ein zweites Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) ein Polypeptid aufweisend eine Zell-Immortalisationsaktivität, (b) ein Polypeptid, dass telomerische DNA an chromosomalen Enden synthetisiert, und (c) ein Polypeptid, welches resultierend aus der Synthese von telomerischer DNA an chromosomalen Enden ein transkriptionaler Aktivator der Telomeraseaktivität ist.
Fusionspolypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid aufweisend eine Zell-Immortalisationsaktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SV40 klein und groß T-Antigen, Adenovirus E1A-Polypeptiden, Papilloma Virus E6-Polypeptiden, Papilloma Virus E7-Polypeptiden, Epstein-Barr Virus-Polypeptiden, Epstein-Barr nuklear antigen-2, humanes T-Zell Leukämievirus Tax Polypeptiden, Herpesvirus Saimiri-Polypeptiden, mutantes p53, myc, c-jun, c-ras, c-Ha-ras, h-ras, v-src, c-fgr, myb, c-myc, n-myc, v-myc und Mdm2.
Fusionspolypeptid nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid, dass telomerische DNA an chromosomalen Enden synthetisiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Telomerase, Telomerase reverse Transkriptase (TERT), p140, p105, p48 und p43.
Verfahren zur transienten Immortalisation einer Zelle umfassend die Schritte: Expansion der Zelle in einem Wachstumsmedium enthaltend ein Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 bestehend aus einem ersten Polypeptid mit einer Transportfunktion des herpesviralen VP22 Protein oder humanen Immundefizienz-Virus (HIV) TAT Protein und einem zweiten Polypeptid aufweisend eine Zell-Immortalisationsaktivität, wobei das besagte Fusionsprotein von der Zelle aufgenommen wird und eine Proliferation der Zelle erfolgt, und wobei Wachstum der immortalisierten Zelle in einem Wachstumsmedium, dass nicht nur das Fusionsprotein enthält, den proliferativen Effekt des Fusionsproteins beendet.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das zweite Polypeptid aufweisend eine Zell-Immortalisierungsaktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SV40 klein und groß T-Antigen, Adenovirus E1A-Polypeptiden, Papilloma Virus E6-Polypeptiden, Papilloma Virus E7-Polypeptiden, Eppstein-Barr Virus-Polypeptiden, humanes T-Zell Leukämievirus Tax Polypeptiden, Herpesvirus Saimiri-Polypeptiden, mutantes p53, myc, jun, ras, myb und Mdm2.
Verfahren zur transienten Steigerung der Replikationskapazität einer Zelle umfassend die Schritte: Ausstreichen der Zelle in einem Wachstumsmedium enthaltend ein Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 bestehend aus einem ersten Polypeptid mit einer Transportfunktion der herpesviralen VP22 Protein oder humanes Immundefizienz-Virus (HIV) TAT Protein und einem zweiten Polypeptid, dass telomerische DNA an chromosomalen Enden synthetisiert, wobei Wachstum der Zelle in einem Wachstumsmedium, dass nicht das Fusionsprotein enthält, die Replikationskapazität-steigernden Effekte des Fusionsproteins beendet.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das zweite Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Telomerase, Telomerase reverse Transkriptase (TERT), p140, p105, p48 und p43.
Verfahren zur Steigerung der Replikationskapazität einer Zelle umfassend die Schritte: Expansion der Zelle in einem Wachstumsmedium enthaltend: (i) ein erstes Fusionsprotein nach Anspruch 1 bestehend aus einem ersten Polypeptid mit einer Transportfunktion des herpesviralen VP22 Protein oder humanes Immundefizienz-Virus (HIV) TAT Protein, und einem zweiten Polypeptid aufweisend eine Zell-Immortalisationsaktivität, und (ii) ein zweites Fusionsprotein nach Anspruch 1 bestehend aus einem ersten Polypeptid mit einer Transportfunktion des herpesviralen VP22 Protein oder humanes Immundefizienz-Virus (HIV) TAT Protein, und einem zweiten Polypeptid, dass telomerische DNA an chromosomalen Enden synthetisiert, wobei Wachstum der immortalisierten Zelle in einem Wachstumsmedium, dass nicht das erste und zweite Fusionsprotein enthält, die Immortalisation und den telomerisierenden Effekt des Fusionsproteins beendet.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Polypeptid aufweisend eine Zell-Immortalisierungsaktivität ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SV40 klein und groß T-Antigen, Adenovirus E1A-Polypeptiden, Papilloma Virus E6-Polypeptiden, Papilloma E7-Polypeptiden, Epstein-Barr Virus-Polypeptiden, Epstein-Barr nuklear antigen-2, humanes T-Zell Leukämievirus Tax Polypeptiden, Herpesvirus Saimiri-Polypeptiden, mutant p53, myc, jun, ras, src, myb und Mdm2.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das zweite Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Telomerase, Telomerase reverse Transkriptase (TERT), p140, p105, p48 und p43.
Zellkulturmedium enthaltend ein oder mehrere Fusionsproteine nach Anspruch 1.
Produktionszelle zur Expression eines Fusionsproteins nach Anspruch 1.