DE60010654T2 - Replikativer virus gesteuert von dem promotor der reversen telomerase transkriptase zur behandlung von krebs - Google Patents

Replikativer virus gesteuert von dem promotor der reversen telomerase transkriptase zur behandlung von krebs Download PDF

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Description

  • PRIORITÄTSANSPRUCH
  • Diese Anmeldung beansprucht die Prioritätsbasis der US-Patentanmeldung 09/244,438.
  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft im Allgemeinen die Gebiete genetischer Regulationselemente, welche die Proteintranskription in eukaryotischen Zellen steuert, und rekombinanter, viraler Strukturelemente, welche für die Behandlung von Krankheiten, einschließlich Krebs, von Nutzen sind. Insbesondere beschreibt die Erfindung auf Regulationselementen für die Telomerase-Reverse-Transkriptase basierende Promotoren, Transkriptionssteuersequenzen und die Verwendung dieser Merkmale bei der Schaffung onkolytischer Viren.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • Es ist seit langem bekannt, dass eine vollständige Replikation der Enden eukaryotischer Chromosomen besondere Zellkomponenten erfordert (Watson (1972) Nature New Biol. 239:197; Olovnikov (1973) J. Theor. Biol. 41:181). Die Replikation eines linearen DNA-Stranges durch konventionelle DNA-Polymerasen erfordert einen RNA-Primer und funktioniert nur von 5' bis 3'. Wenn der an den äußersten 5'-Enden eukaryotischer, chromosomaler DNA-Stränge gebundene RNA-Primer entfernt wird, wird dort ein Zwischenraum eingeführt, welcher zu einer progressiven Verkürzung der Tochterstränge bei jedem Replikationszyklus führt. Diese Verkürzung der Telomere, der Protein-DNA-Strukturen, die sich physisch an den Enden der Chromosomen befinden, gilt als Erklärung für das Phänomen der Zellseneszenz oder dem Altern normaler humaner Körperzellen in vitro und in vivo (Goldstein (1990) Science 249:1129; Martin (1979) Lab. Invest. 23:86; Goldstein (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64:155; Schneider (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73:3584; Harley (1990) Nature 345:458–460; Hastie (1990) Nature 346:866–868; Counter (1992) EMBO J. 11:1921–1929; Bodnar (1998) Science 279:349–52).
  • Die Länge und Integrität der Telomere stehen demnach in Zusammenhang mit dem Eintritt einer Zelle in ein Seneszenzstadium. Darüber hinaus kann es die Fähigkeit einer Zelle, die Telomerlänge beizubehalten (oder zu erhöhen), einer Zelle ermöglichen, der Seneszenz zu entgehen.
  • Die Aufrechterhaltung von Telomeren ist eine Funktion einer spezifischen DNA-Polymerase, bekannt als Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT). Telomerase ist ein Ribonukleoprotein (RNP), welches einen Teil seiner RNA-Komponente als Schablone für die Telomer-Repeat-DNA-Synthese verwendet (Morin (1997) Eur. J. Cancer 33:750). Im Einklang mit der Beziehung von Telomeren und TERT zur proliferativen Kapazität einer Zelle, kann die Telomeraseaktivität bei hochreplikativen Zelltypen wie Stammzellen erkannt werden. Sie ist außerdem in einer außerordentlich verschiedenartigen Gruppe von Tumorgeweben aktiv, wie auch in normalen Körperzellkulturen oder normalen, an einen Tumor angrenzenden Geweben (US-Patentschrift Nr. 5,629,154; 5,489,508; 5,648,215 und 5,639,613; Morin (1989) Cell 59:521; Shay (1997) Eur. J. Cancer 33:787; Kim (1994) Science 266:2011). Darüber hinaus wurde eine Korrelation zwischen dem Niveau der Telomeraseaktivität in einem Tumor und dem wahrscheinlichen klinischen Werdegang des Patienten beschrieben (US-Patentschrift Nr. 5,639,613; Langford (1997) Hum. Pathol. 28:416).
  • Telomeraseaktivität wurde auch in humanen Keimzellen, proliferierenden Stamm- oder Vorläuferzellen und aktivierten Lymphozyten entdeckt. In somatischen Stamm- oder Vorläuferzellen und in aktivierten Lymphozyten ist die Telomeraseaktivität normalerweise entweder sehr langsam oder nur vorübergehend exprimiert (Chiu (1996) Stem Cells 14:239, Bodnar (1996) Exp. Cell. Res. 228:58; Taylor (1996) J. Invest. Dermatol. 106:759).
  • Die Britische Patentschrift GB 2317891 B und GB 2321642 B und die Internationale Patentveröffentlichung WO 98/14593 (Geron Corporation) offenbaren die Gensequenz für die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT). Takakura et al. (Cancer Res. 59:551, 1991) beschreibt das Klonen des hTERT-Genpromotors und die Identifizierung proximaler Kernpromotorsequenzer, die für die Transkriptionsaktivierung in immortalisierten Zellen und Krebszellen erforderlich sind. Die Internationale Patentveröffentlichung WO 99/33998 (Bayer AG), eingereicht nach dem Prioritätsdatum dieser Anmeldung, beschreibt regulatorische DNA-Sequenzen des humanen Genes der katalytischen Untereinheit der Telomerase und seine Verwendung für Diagnose und Therapie. Cong et al. (Hu. Molec. Genetics 8:137, 1999), auch nach dem Prioritätsdatum dieser Anmeldung eingereicht, beschreibt die Organisation des hTERT-Gens und die Charakterisierung des Promotors. US-Patentschrift 5,728,379 (Georgetown University) beschreibt die Tumor- oder Zell-spezifische Replikation des Herpes-Simplex-Virus.
  • Die vorhergehende Zusammenfassung dient der Einführung in das Gebiet der vorliegenden Erfindung. Die zitierten Referenzen in dieser Anmeldung sind nicht als zugegebener Stand der Technik auszulegen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Offenbarung erklärt, dass die Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT) ein ideales Ziel für die Behandlung humaner Erkrankungen mit Bezug auf zelluläre Proliferation und Seneszenz, wie Krebs, ist. Die cis-aktiven Transkriptionssteuerelemente dieser Erfindung ermöglichen die Identifikation von trans-aktiven Transkriptionssteuerfaktoren. Die Entdeckung und Charakterisierung eines für TERT-exprimierende Zellen spezifischen Promotors bietet die Möglichkeit, wichtige neue Krankheitstherapien zu entwickeln.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein onkolytisches Virus mit einem Genom, in dem ein Promotor der Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT) wirkungsmäßig mit einem genetischen Element verbunden ist, das für die Replikation oder das Zusammensetzen des Virus erforderlich ist. Der Promotor stimuliert die Transkription des genetischen Elementes in Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT)-exprimierenden Zellen, wodurch die Replikation des Virus verursacht wird. Die Replikation des Virus in einer Zelle führt wiederum zur Lysis der Zelle.
  • Eine weitere Ausführungsform ist eine Polynukleotidkomponente, die zum Zusammensetzen eines onkolytischen Virus dieser Erfindung geeignet ist, wobei ein Promotor für (TERT) wirkungsmäßig mit einem genetischen Element verbunden ist, das für die Replikation oder das Zusammensetzen eines Virus erforderlich ist.
  • Beispielsweise gehören zu replikationskompetenten Viren dieser Erfindung das replikationsbedingte Adenovirus und Herpesvirus. Mit dem Promotor verbundene genetische Elemente sind beispielsweise Adenovirus-E4-, E1a-, E1b- oder E2-Gene und Herpes-Simplex-Virus-ICP6- oder ICP4-Gene. TERT-Promotorsequenzen sind beispielsweise im Phagen λGφ5, hinterlegt bei der ATCC unter der Zugangsnummer 98505, enthalten. Die Sequenz kann etwa 100 oder 500 aufeinanderfolgende Nukleotide von SEQ. ID. NR: 1 oder 2 enthalten, oder eine Sequenz, die zu einem Komplement davon hybridisiert und die Eigenschaft der bevorzugten Förderung der Transkription in TERT-exprimierenden Zellen aufweist. Beispielhafte Teile der TERT-Gensequenz sind später in dieser Offenbarung beschrieben. Gegebenenfalls kann das onkolytische Virus auch eine Codierregion aufweisen, deren Expression für die Zelle toxisch ist, oder welche die Zelle für toxische Wirkungen eines Medikaments empfänglicher macht; zum Beispiel kann das Gen Thymidinkinase codieren, was die Zelle empfänglich für das Medikament Ganciclovir macht.
  • Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Auswahl eines Virus mit den Eigenschaften eines onkolytischen Virus der Erfindung. Ein Virusstrukturelement wird bereitgestellt, in welchem ein TERT-Promotor wirkungsmäßig mit einem genetischen Element verbunden ist, das für die Replikation oder das Zusammensetzen des Virus erforderlich ist, welches zum Infizieren einer TERT-exprimierenden Zelle und einer nicht-TERT-exprimierenden Zelle verwendet wird. Anschließend wird ein Virus ausgewählt, wenn es vorzugsweise die TERT- exprimierende Zelle tötet. Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zum Herstellen eines onkolytischen Virus der Erfindung, welches die wirkungsmäßige Verbindung einer TERT-Promotorsequenz mit einem genetischen Element zur Bildung eines verbundenen Gens aufweist, das Transfizieren des verbundenen Gens in eine Telomerase-exprimierende Zelle, und anschließend das Vermehren des aus der Zelle erhaltenen Virus.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Töten einer Telomerase-Reverse-Transkriptase-exprimierenden Zelle, welches das Kontaktieren der Zelle mit dem onkolytischen Virus der Erfindung beinhaltet. Die Zelle kann eine Krebszelle sein. Eine weitere Ausführungsform ist ein Medikament, welches das onkolytische Virus der Erfindung aufweist, zur Verwendung in der Medizin oder zur Behandlung von Krebs. Zu illustrativen bösartigen Tumoren gehören Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Medulloblastom, Gebärmutterhalskrebs und Fibrosarkom.
  • Ein weiteres Verständnis der Art und der Vorteile der Erfindung werden aus der nachfolgenden Offenbarung ersichtlich.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine Restriktionskarte des Lambda-Phagen-Klons λGφ5, der zum Erhalt der Sequenz etwa 15 kBasen stromaufwärts der Translationsstartstelle verwendet wird. Diese Region beinhaltet den hTERT-Promotor.
  • 2 ist eine Karte mit den Merkmalen eines hTERT-Promotor-Reporterplasmids. Reporterplasmide wurden verwendet, um zu veranschaulichen, dass der Promotor besonders die Transkription in TERT-exprimierenden Zellen, einschließlich Krebszellen, fördert.
  • 3 ist ein Sequenz-Alignment, welches Regionen des hTERT-Promotors (SEQ. ID. NR: 1) mit dem des mTERT (SEQ. ID. NR: 2) vergleicht. Es wurden Homologieregionen verwendet, um Regulationselemente zu identifizieren. 3(A) zeigt die Position beibehaltener cis-aktiver Transkriptionsregulationsmotive, einschließlich der E-Box (die Myc/Max-Bindungsstelle, gekennzeichnet durch Schattierung) und der SP1-Stellen (unterstrichen). Die untere Tafel veranschaulicht die proximalen Sequenzen der 2,5 kb hTERT- und E-Box-Reporterstrukturelemente, einschließlich der im E-Box-Reporterstrukturelement entfernten Region, wie in Beispiel 8 beschrieben. 3(B) zeigt die Identifizierung weiterer Regulationselemente. Die angegebene Nummerierung ist von der Translationsstartstelle aus berechnet.
  • 4 ist eine Halbtonreproduktion von Zelllinien, fotografiert 7 Tage nach der Infizierung mit einem onkolytischen Virus. Obere Reihe: nicht infizierte Zellen (Negativkontrolle). Mittlere Reihe: Zellen infiziert mit onkolytischem Adenovirus, in dem das Replikationsgen E1a wirkungsmäßig mit dem hTERT-Promotor verbunden ist. Untere Reihe: Zellen infiziert mit Adenovirus, in dem E1a wirkungsmäßig mit dem CMV-Promotor verbunden ist (Positivkontrolle).
  • Die getesteten Zellen waren folgende: 4(A): BJ (Vorhautfibroblast); IMR-90 (Lungenfibroblast); WI-38 (Lungenfibroblast); Zellen nichtmalignen Ursprungs. 4(B): A549 (Lungenkarzinom), AsPC-1 und BxPC-3 (Adenokarzinom, Pankreas). 4(C): DAOY (Medulloblastom); HeLa (Gebärmutterhalskarzinom); HT1080 (Fibrosarkom). Die Ergebnisse zeigen, dass das hTERT-regulierte onkolytische Virus besonders Krebszellen auflöst, bevorzugt vor Zelllinien, welche die Telomerase-Reverse-Transkriptase nicht auf einem wesentlichen Niveau exprimieren. Dies wird im Gegensatz zum onkolytischen Virus durch einen konstitutiven Promotor wie den CMV-Promotor geregelt, welcher Zellen nicht-spezifisch auflöst.
  • 5 ist eine Reihe von Karten, welche den Aufbau des onkolytischen Adenovirus zeigen, das dadurch, dass die E1a-Replikation unter die Kontrolle eines hTERT-Promotors gestellt wurde, bedingt replikativ gemacht wurde. Das erste Strukturelement enthält das Inverted-Terminal-Repeat (ITR) aus dem Adenovirus (Ad2), gefolgt vom mittellangen hTERT-Promotor (pGRN176), welcher wirkungsmäßig mit der E1a-Region des Adenovirus verbunden ist, gefolgt vom Rest des Adenovirus, der für die E3-Region (ΔE3) entfernt wurde. Dieses Strukturelement wurde bei den in 4 gezeigten Virusinfektionsexperimenten verwendet. Das zweite in der Figur gezeigte bedingt replikative Adenovirus-Strukturelement enthält eine zusätzliche Sequenz zwischen dem hTERT-Promotor und der E1a-Region. Die HI-Sequenz ist ein künstliches Intron konstruiert aus Adenovirus- und Immunglobulin-Intron-Spleißsequenzen. Das dritte Adenovirus-Strukturelement ist ähnlich, außer dass die verwendete E1a-Region am 5'-Ende um 51 Nukleotide länger ist.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Die Erfindung bietet neuartige isolierte Polynukleotide, welche cis-aktive Transkriptionssteuersequenzen des Telomerase-Reverse-Transkriptase-Genes aufweisen. Zu den Polynukleotiden der Erfindung gehören diejenigen, die auf Genomsequenzen von nichttranskribierten, transkribierten und Intron-Regionen von TERT-Genen basieren oder davon abgeleitet sind, einschließlich dem humanen und dem Maus-Homolog. Zu den cis-aktiven TERT-Transkriptionssteuersequenzen gehören diejenigen, die das Timing und die Geschwindigkeit der Transkription des TERT-Genes regulieren und modulieren. Zu den TERT-Promotor-Sequenzen der Erfindung gehören cis-aktive Elemente wie Promotoren, Enhancer, Repressoren und Polynukleotidsequenzen, die Faktoren binden können, welche die Transkription beeinflussen.
  • Isolierung und Charakterisierung humaner TERT-Promotorsequenzen
  • Wie in Beispiel 1 beschrieben wurde der hTERT-Promotor (SEQ. ID. NR: 1) durch Sequenzierung eines Einschubs aus einem Lambda-Phagen, isoliert aus einer humanen Genombibliothek, erhalten. Dieser Lambda-Klon wird λGφ5 genannt und wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer 98505 hinterlegt. Lambda Gφ5 enthält einen 15,3 Kilobasen-Paar (kbp)-Einschub, einschließlich etwa 13.500 Basen von der hTERT-Codiersequenz aufwärts. Diese hTERT-Promotorsequenzen wurden weiter in Plasmide subkloniert. Ein Notl-Fragment (SEQ. ID. NR: 1) von λGφ5, welches die hTERT-Promotorsequenzen enthält, wurde in entgegengesetzten Richtungen in die Notl-Stelle von pUC-abgeleiteten Plasmiden (bezeichnet mit pGRN142 bzw. pGRN143) subkloniert, und pGRN142 wurde sequenziert.
  • In SEQ. ID. NR: 1 beginnt der hTERT-Genomeinschub bei Rest 44 und endet bei Rest 15375. Der Beginn der cDNA, von der er abgeleitet wurde, ist bei Rest 13490. Das hTERT-ATG-Translationsstartkodon beginnt bei Rest 13545. Nichttranskribierte hTERT-Promotorsequenzen liegen stromabwärts von Rest 44 und stromaufwärts der Codierregion, und können sich auch im ersten Intron befinden. Bei immortalen Zellen stimulierte ein von einer Sequenz stromaufwärts der TERT-Codiersequenz stimuliertes Reportergen die Expression so effizient wie die Positivkontrolle (die einen frühen SV40-Promotor und Enhancer enthält). Bestimmte TERT-Promotorsequenzen der Erfindung beinhalten auch Intronsequenzen.
  • Identifizieren von cis-aktiven Transkriptionsregulationssequenzen im humanen und im Maus-TERT-Promotor
  • Zum Identifizieren von cis-aktiven Transkriptionsregulationssequenzen in humanen TERT- und Maus-TERT-Sequenzen 5' zu ihrer entsprechenden TERT-Codiersequenz wurden humane und Maus-Promotor-Sequenzen auf Sequenzidentität analysiert. Das Alignment der ersten 300 Basen stromaufwärts der humanen und Maus-Codiersequenzen zeigte eine Reihe konservierter Regionen, und es wurden putative cis-aktive Transkriptionsregulationssequenzen identifiziert (3(A)).
  • Insbesondere Positionen an den Resten –34 bis –29 stromaufwärts der humanen TERT-Translationsstartstelle (ATG, A bei 13545 von SEQ. ID. NR: 1) und an den Resten –32 bis –27 stromaufwärts der Maus-TERT-Translationsstartstelle (ATG) sind genau konservierte Motive. Sie entsprechen einem cis-aktiven Motiv, von dem bekannt ist, dass es mit c-Myc, der sogenannten „E-Box" oder „Myc/Max-Bindungsstelle", interagiert. Sie sind besonders im Hinblick auf die Kernnukleotide, welche die E-Box beinhalten, Nukleotide, welche die E-Box flankieren, und die Position der E-Box relativ zur Translationsstartstelle genau konserviert. Eine zweite E-Box wurde an den Resten –242 bis –237 stromaufwärts der humanen TERT-Translationsstartstelle identifiziert. Diese zweite E-Box wurde im Maus-Promotor nicht konserviert. Diese Beobachtungen unterstützen das Untersuchungsergebnis, dass die konservierte Myc-Bindungsstelle durch Interaktion mit c-Myc als ein trans-aktiver Transkriptionsregulationsfaktor eine größere Rolle bei der TERT-Promotorregulation und der Telomeraseexpression spielt.
  • Das Sequenzalignment identifizierte zusätzliche konservierte cis-aktive Transkriptionsregulationselemente im TERT-Genpromotor. Zum Beispiel wurde zwei SP1-Bindungsstellen, die sich an Rest –168 bis –159 und Rest –133 und –121 relativ zur TERT-Translationsstartstelle befinden, identifiziert, welche zwischen dem Maus- und dem humanen TERT-Promotor genau konserviert wurden. Es wurden auch Bindungsstellen (cis-aktive Sequenzen) für eine Reihe weiterer Transkriptionsfaktoren, einschließlich des Genproduktes der geschlechtsbestimmenden Region Y (SRY), den hepatischen Kernfaktoren 3-β und 5, TFIID-MBP, E2F und c-Myb, innerhalb dieser Region der Maus- wie auch der humanen Promotoren gefunden.
  • Eine weitere Analyse der humanen und Maus-TERT-Promotorsequenzen zeigte weitere Regionen der Sequenzkonservierung. Insbesondere wurde eine Region mit einem hohen Maß an Sequenzidentität zwischen humanem und Maus-Promotor zwischen Rest –1106 und Rest –1602 stromaufwärts der humanen TERT-Translationsstartstelle und Rest –916 und Rest –1340 stromaufwärts der Maus-TERT-Translationsstartstelle gefunden (3(B)). So bietet die Erfindung cis-aktive Sequenzen, die spezifisch für die Modulation der TERT-Transkription sind. In einer bevorzugten Ausführungsform verwenden die Verfahren der Erfindung diese human- und Maus-TERT-spezifischen Transkriptionsregulationsmotive zum Identifizieren und Isolieren TERT-spezifischer und weiterer trans-aktiver Transkriptionsregulationsfaktoren.
  • Die Erfindung bietet außerdem die Reagenzien und Verfahren für das Screening und das Isolieren von trans-aktiven TERT-Transkriptionsregulationsfaktoren. Zu alternativen Ausführungsformen gehören neuartige in vitro und zellbasierte in vivo Versuchssysteme für die Untersuchung auf TERT-Promotorbindemitteln (trans-aktive TERT-Transkriptionsregulationsfaktoren) mit Hilfe der Nukleinsäuren der Erfindung.
  • c-Myc ist ein wirksamer Aktivator der TERT-Gentranskription
  • Die Verwendung rekombinierter Strukturelemente, welche TERT-Promotorsequenzen der Erfindung beinhalten, hat, und zwar zum ersten Mal, gezeigt, dass c-Myc durch direkte Interaktion mit cis-aktiven Regulationssequenzen im TERT-Promotor als ein wirksamer Aktivator der Telomerseaktivität agiert. c-Myc wirkt durch die schnelle Up-Regulation der hTERT-Genexpression (Beispiel 8). Maßgeblich veranschaulichen die Studien, dass die Transkriptionsaktivierung des hTERT-Promotors durch c-Myc durch Entfernung oder Mutation einer einzigen cis-aktiven Regulationssequenz, der „Myc/Max-Bindungsstelle", innerhalb des hTERT-Promotors aufgehoben werden kann. Weiters ist die Fähigkeit eines induzierbaren c-Myc zur Verbesserung der Expression von hTERT resistent gegen die Hemmung der Proteinsynthese.
  • TERT-Promotor verwendet zur Stimulation heterologer Gensequenzen
  • Die Erfindung bietet außerdem Konstrukte, in denen die TERT-Promotorsequenzen der Erfindung wirkungsmäßig mit einem heterologen Gen (in einer bevorzugten Ausführungsform mit einem Strukturgen) verbunden sind. Auf diese Weise wird das heterologe Gen in den gleichen Zellen transkribiert und zwar zur gleichen Zeit in der das natürliche TERT-Transkript exprimiert werden würde. So wird, wenn das Konstrukt in einer transformierten Zelle oder einem (nicht-humanen) Tier exprimiert wird, das heterologe Gen (und Protein, wenn es sich bei dem Gen um eine Codiersequenz handelt) im gleichen zeitlichen Rahmen über den gleichen Zellbereich exprimiert wie beim Wildtyp, das TERT-Promotor-stimulierte TERT-Gen.
  • Diese Konstrukte sind von Nutzen für TERT-Promotor-basierte Assays, zum Beispiel zum Identifizieren biologischer Modulatoren von TERT- und Telomeraseaktivität. In alternativen Ausführungsformen ist die heterologe Codiersequenz, die wirkungsmäßig mit einem TERT-Promotor der Erfindung verbunden ist, ein Marker-Gen (z.B. alkalische Phosphatase, SEAP, β-Galaktosidase), ein modifiziertes TERT-Strukturgen oder ein TERT-Antisense, ein therapeutisches Gen (z.B. ein zytotoxisches Gen wie Thymidinkinase).
  • In einer weiteren Ausführungsform werden zytopathische Viren bereitgestellt, insbesondere humane zytopathische Viren wie modifiziertes Adenovirus oder Herpes-Virus. Viren wie Adenovirus oder Herpes-Virus erfordern essentielle, viral codierte Gene zum Proliferieren und Auflösen spezifischer Zellen. Würde ein beliebiges dieser essentiellen viralen Gene so modifiziert, dass die Expression des essentiellen Elementes vom TERT-Promotor stimuliert werden würde, wäre die Proliferation des Virus und seiner zytopathischen Wirkungen auf Telomerase-exprimierende Zellen, insbesondere Tumorzellen, beschränkt.
  • Definitionen
  • Die folgenden Begriffe sind unten definiert, um einem Fachmann zusätzliche Anleitung im Umgang mit der Erfindung zu geben.
  • Der Begriff „verstärkend" wie hierin verwendet beinhaltet seine übliche Verwendung und bezieht sich auf die Verwendung jeder geeigneten Verstärkungsmethodik zur Erzeugung oder Erkennung von rekombinierten oder natürlich exprimierten Nukleinsäuren. Zum Beispiel bietet die Erfindung Verfahren und Reagenzien (einschließlich spezifischer Oligonukleotid-PCR-Primerpaare) zum Verstärken natürlich exprimierter oder rekombinierter Nukleinsäuren der Erfindung in vivo oder in vitro. Eine Indikation, dass zwei Polynukleotide „im Wesentlichen identisch" sind, erhält man durch das Verstärken eines der Polynukleotide mit einem Paar von Oligonukleotidprimeren oder einem Pool degenerierter Primere (z.B. Fragmente einer TERT-Promotorsequenz) und die anschließende Verwendung des Produktes als eine Probe unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zum Isolieren der zweiten Sequenz (z.B. der TERT-Promotorsequenz) aus einer Genombibliothek oder zum Identifizieren der zweiten Sequenz in einem Northern oder Southern Blot.
  • Wie hierin verwendet beinhaltet der Begriff „TERT-Promotor" sämtliche TERT-Genomsequenzen, die in der Lage sind, die Transkription in Zellen, in denen Telomeraseaktivität stattfindet, anzutreiben. Daher beinhalten die TERT-Promotoren der Erfindung ohne Einschränkung cis-aktive Transkriptionssteuerelemente und Regulationssequenzen, welche an der Regulierung oder Modulation des Timings bzw. der Geschwindigkeit der Transkription eines TERT-Genes beteiligt sind. Zum Beispiel enthält der TERT-Promotor der Erfindung cis-aktive Transkriptionssteuerelemente, einschließlich Enhancer, Promotoren, Transkriptionsterminatoren, Replikationsursprünge, Chromosomenintegrationssequenzen, untranslatierte 5'- und 3'-Regionen, Exone und Introne, welche an der Transkriptionsregulation beteiligt sind. Diese cis-aktiven Sequenzen interagieren normalerweise mit Proteinen oder anderen Biomolekülen, um die Transkription durchzuführen (starten, beenden, regulieren, modulieren, etc.).
  • Der Fachmann wird erkennen, dass die hierin bereitgestellten hTERT- und mTERT-Promotorsequenzen lediglich beispielhaft sind und dass sie als Grundlage zur Herstellung zahlreicher Versionen von TERT-Promotoren verwendet werden können, d.h. Promotoren, die in der Lage sind, die Transkription in Zellen, in denen Telomeraseaktivität stattfindet zu stimulieren. Während hierin zum Beispiel gezeigt wird, dass eine Sequenz, die 2447 Nukleotide des offenbarten hTERT-Promotors aufweist, die Expression auf diese Weise stimulieren kann (pGRN350), wird der Fachmann verstehen, dass eine solche Aktivität auch durch die Verwendung längerer oder kürzerer Promotorsequenzen erreicht werden kann. Weiters wird der Fachmann erkennen, dass auch Promotorsequenzen, die sich von den hierin bereitgestellten Sequenzen zum Beispiel durch das Zufügen, Entfernen oder Ersetzen von Nukleotiden unterscheiden, verwendet werden können, um eine Expression in Zellen, die Telomeraseaktivität positiv sind, zu erreichen. Solche Varianten teilen ein spezifiziertes Mindestniveau an Struktur(-Sequenz)-Ähnlichkeit zu den offenbarten TERT-Promotorsequenzen, wobei die Ähnlichkeit entweder bezüglich der Sequenzidentität zu den offenbarten TERT-Promotorsequenzen oder der Fähigkeit, auf spezifizierten Niveaus der Hybridisierungsstrenge zu den offenbarten Sequenzen zu hybridisieren, definiert werden kann. Zum Beispiel gehören zu den Varianten der TERT-Promotoren Promotoren, die zu den hierin offenbarten TERT-Promotoren hybridisieren (bei 37°C in einem Puffer aus 40% Formamid, 1 M NaCl und 1% SDS, gefolgt von einer Waschung in 1× SSC bei 45°C) und welche in der Lage sind, die Transkription in Zellen, in denen Telomeraseaktivität stattfindet anzutreiben. Zu anderen Varianten von TERT-Promotoren gehören Promotoren, die mindestens etwa 80%, 90%, 95%, 98% oder 100% Sequenzidentität mit den offenbarten TERT-Promotoren aufweisen. Die Sequenzidentität wird berechnet indem zuerst ein Alignment des untersuchten Polynukleotids mit dem Referenzgegenstück durchgeführt wird und anschließend die Anzahl der Reste, die bei den verglichenen Sequenzen gleich sind, als ein Prozentsatz der untersuchten Region gezählt wird. Es gibt keine Abzüge für die Gegenwart von Einschüben oder Deletionen, allerdings sind Einschübe oder Deletionen nur zulässig, wo sie zur Wiederanpassung des Alignments wirklich erforderlich sind. Der Prozentsatz wird in Bezug auf Reste in der untersuchten Sequenz angegeben, die identisch mit den Resten in der Vergleichs- oder Referenzsequenz sind.
  • Die Bestimmung, dass ein Promotor in der Lage ist, die Transkription in Zellen, in denen Telomeraseaktivität stattfindet anzutreiben, kann routinemäßig wie in Beispiel 2 und 5 beschrieben durchgeführt werden. Kurz, der zu testende Promotor wird wirkungsmäßig mit einer Codierregion verbunden, die ein erkennbares Protein wie alkalische Phosphatase oder grünes fluoreszentes Protein codiert. Dieses Konstrukt wird dann in Zellen, in denen Telomeraseaktivität stattfindet (TAP) und in Zellen in denen keine Telomerase stattfindet (TAN), eingefügt. Die Erkennung des erkennbaren Proteins in den TAP-Zellen, jedoch nicht in den TAN-Zellen, oder eines erhöhten Levels des erkennbaren Proteins in den TAP- verglichen mit den TAN-Zellen (vorzugsweise zumindest ein dreifacher Unterschied) zeigt an, dass der Promotor ein TERT-Promotor ist.
  • Man spricht dann davon, dass ein Promotor „bevorzugt die Transkription" in einer Zelle, welche einen bestimmten Phänotyp aufweist, „fördert", wenn das Niveau der Transkription in Zellen diesen Phänotyps mindestens etwa 3-fach höher ist als in Zellen, denen dieser Phänotyp fehlt. Promotoren gemäß dieser Erfindung fördern vorzugsweise die Transkription in TERT- exprimierenden Zellen, einschließlich erkrankten Zellen, bei denen die Erkrankung mit der Überexpression von TERT wie bei Krebs in Zusammenhang stehen. Bevorzugte Transkription findet statt, wenn der relative Anstieg bei Zellen, welche den angegebenen Phänotyp exprimieren, im Vergleich zu Zellen, die den Phänotyp nicht besitzen, mindestens etwa 3-fach, 10-fach, 30-fach oder 100-fach höher ist, in der Reihenfolge der steigenden Bevorzugung. Promotoren, die in einem Assays, in denen nur zwei Zellarten verglichen werden, geringere Spezifitätslevel zeigen, können in einem größeren Umfang getestet werden. Der Fachmann weiß, dass zu TERT-positiven Zellen verschiedene Arten von Krebszellen, verschiedene Arten von Vorläuferzellen und Stammzellen, und unter bestimmten Bedingungen B- und T-Lymphozyten gehören. Zu geeigneten Negativkontrollen gehören Primärkulturen und etablierte Zelllinien reifer differenzierter Zellen der meisten Gewebsarten.
  • In alternativen Ausführungsformen enthalten die TERT-Promotorsequenzen TERT-Sequenzen stromaufwärts der Translationsstartstelle (ATG), zum Beispiel enthält der hTERT-Promotor in einer Ausführungsform die Reste 44 bis 13545 von SEQ. ID. NR: 1. Zu weiteren Ausführungsformen gehören Sequenzen, welche mit etwa ein bis 5 Nukleotiden eines Translationsstartkodons (zum Beispiel in SEQ. ID. NR: 1 oder SEQ. ID. NR: 2) beginnen und bei etwa 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000, 2500 oder 13500 Nukleotiden stromaufwärts des Translationsstartkodons enden. Zu solchen Ausführungsformen können gegebenenfalls weitere Regulationssequenzen wie Exon- und/oder Intronsequenzen gehören. Zu einer weiteren Ausführungsform gehören TERT-Intronsequenzen mit Regulationsaktivität, wie in Beispiel 2 beschrieben. Zu hTERT-Promotoren der Erfindung gehören auch Sequenzen, die im Wesentlichen (wie hierin definiert) mit einer beispielhaften hTERT-Promotorsequenz der Erfindung identisch sind, welche die in SEQ. ID. NR: 1 dargestellte Sequenz aufweist. Ähnlich gehören zu den mTERT-Promotoren der Erfindung auch Sequenzen, die im Wesentlichen mit einer beispielhaften mTERT-Promotorsequenz der Erfindung identisch sind, welche die in SEQ. ID. NR: 2 dargestellte Sequenz aufweist.
  • Der Begriff „heterolog" bedeutet bei Verwendung mit Bezug auf Teile einer Nukleinsäure, dass die Nukleinsäure zwei oder mehr Untersequenzen aufweist, welche in der Natur nicht in der gleichen Beziehung zueinander auftreten. Zum Beispiel wird die Nukleinsäure normalerweise rekombinant hergestellt, wobei zwei oder mehr Sequenzen von nicht zueinander in Beziehung stehenden Genen auf eine Art und Weise angeordnet werden, die man so in der Natur nicht findet, wie zum Beispiel eine Promotorsequenz der Erfindung, die wirkungsmäßig mit einer Polypeptidcodiersequenz verbunden ist, die, wenn sie wirkungsmäßig verbunden ist, das natürlich vorkommende TERT-Gen nicht neu bildet. Die Erfindung stellt zum Beispiel rekombinante Strukturelemente (Expressionskassetten, Vektoren, Viren und ähnliche), welche unterschiedliche Kombinationen von Promotoren der Erfindung oder Untersequenzen davon aufweisen, und heterologe Codiersequenzen zur Verfügung.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet „isoliert" mit Bezug auf ein Molekül oder eine Zusammensetzung, wie eine hTERT-Promotorsequenz, dass das Molekül oder die Zusammensetzung zumindest von einer anderen Verbindung, wie einem Protein, DNA, RNA oder anderen Kontaminanten mit denen sie in vivo oder in ihrem natürlich Zustand in Verbindung gebracht wird, getrennt ist. So gilt eine Nukleinsäuresequenz als isoliert, wenn sie von einer anderen Komponente getrennt wurde, mit der sie natürlicherweise in Verbindung steht. Eine isolierte Zusammensetzung kann jedoch auch im Wesentlichen rein sein. Eine isolierte Zusammensetzung kann sich in einem homogenen Zustand befinden. Sie kann in einem trockenen Zustand oder in wässriger Lösung sein. Reinheit und Homogenität können durch analytische chemische Verfahren wie Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE), Agarosegelelektrophorese oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt werden.
  • Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „Nukleinsäure" und „Polynukleotid" austauschbar verwendet und beinhalten Oligonukleotide. Sie beziehen sich außerdem auf synthetische und/oder nicht natürlich vorkommende Nukleinsäuren (einschließlich Nukleinsäureanaloga oder modifizierte Hauptkettenreste oder -verknüpfungen). Die Begriffe beziehen sich auch auf Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotid-Oligonukleotide entweder in der Einzel- oder in der Doppelstrangform. Die Begriffe schließen Nukleinsäuren ein, welche bekannte Analoga natürlicher Nukleotide enthalten. Der Begriff schließt außerdem Nukleinsäure-ähnliche Strukturen mit synthetischer Hauptkette ein. Zu durch die Erfindung bereitgestellten DNA-Hauptketten-Analoga gehören Phosphodiester, Phosphorothioat, Phosphorodithivat, Methyl-Phosphonat, Phosphoramidat, Alkylphosphotriester, Sulfamat, 3'-Thioacetal, Methylen(methylimino), 3'-N-Carbamat, Morpholino-Carbamat und Peptid-Nukleinsäuren (PNAs); siehe Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, herausgegeben von F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, Eds. Baserga and Denhardt (NYAS 1992); Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923–1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press). PNAs enthalten nichtionische Hauptketten, wie N-(2-Aminoethyl)-Glycin-Einheiten. Phosphorothioat-Verknüpfungen sind beschrieben in WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189–197. Zu weiteren von dem Begriff eingeschlossenen synthetischen Hauptketten gehören Methyl-Phosphonat-Verknüpfungen oder alternierendes Methylphosphonat und Phosphodiester-Verknüpfungen (Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692–8698) und Benzyl-Phosphonat-Verknüpfungen (Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6:153–156).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „wirkungsmäßig verbunden" auf eine funktionale Beziehung zwischen zwei oder mehr Nukleinsäuresegmenten. Normalerweise bezieht er sich auf die funktionale Beziehung einer Transkriptionsregulationssequenz zu einer transkribierten Sequenz. Zum Beispiel ist eine TERT-Promotorsequenz der Erfindung, einschließlich jeder Kombination von cis-aktiven Transkriptionssteuerelementen, wirkungsmäßig mit einer Codiersequenz verbunden, wenn sie die Transkription der Codiersequenz in einer geeigneten Wirtszelle oder einem anderen Expressionssystem stimuliert oder moduliert. Im Allgemeinen grenzen Promotor-Transkriptionsregulationssequenzen, welche wirkungsmäßig mit einer transkribierten Sequenz verbunden sind, physisch an die transkribierte Sequenz, d.h. sie sind cis-aktiv. Einige Transkriptionsregulationssequenzen, wie z.B. Enhancer, müssen jedoch nicht physisch an die Codiersequenzen, deren Transkription sie verbessern, angrenzen oder sich in unmittelbarer Nähe befinden.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich „rekombinant" auf ein Polynukleotid, welches synthetisiert oder auf eine andere Weise in vitro manipuliert wurde, auf Verfahren der Verwendung rekombinanter Polynukleotide zur Herstellung von Genprodukten in Zellen oder anderen biologischen Systemen oder auf ein Polypeptid („rekombinantes Protein"), das durch ein rekombinantes Polynukleotid codiert wird. „Rekombinante Mittel" schließen außerdem die Ligation von Nukleinsäuren, welche Codier- oder Promotorsequenzen aus unterschiedlichen Quellen aufweisen, in eine Expressionskassette oder einen Vektor zur Expression eines Fusionsproteins; oder die induzierbare konstitutive Expression eines Proteins (zum Beispiel ein TERT-Promotor der Erfindung, der wirkungsmäßig mit einem heterologen Nukleotid, wie einer Polypeptidcodiersequenz, verbunden ist) ein.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich die „Sequenz" eines Genes (es sei denn es wird spezifisch anders angegeben) oder einer Nukleinsäure auf die Anordnung von Nukleotiden im Polynukleotid, einschließlich jedes einzelnen oder beider Stränge eines Doppelstrang-DNA-Moleküls – die Sequenz sowohl vom Codierstrang als auch seines Komplements, oder eines Einzelstrang-Nukleinsäure-Moleküls. Zum Beispiel umfasst der Promotor der Erfindung in alternativen Ausführungsformen untranskribierte, untranslatierte und Intron-TERT-Sequenzen, wie in der beispielhaften SEQ. ID. NR: 1 und SEQ. ID. NR: 2 dargestellt.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „transkribierbare Sequenz" auf jede Sequenz, welche, wenn sie wirkungsmäßig mit einem cis-aktiven Transkriptionssteuerelement verbunden ist, wie die TERT-Promotoren der Erfindung, und wenn sie sich in geeigneten Bedingungen befindet, in der Lage ist, transkribiert zu werden, um RNA zu erzeugen.
  • Die Begriffe „identisch" oder Prozent-„Identität" beziehen sich im Kontext von zwei oder mehr Nukleinsäuren oder Polypeptidsequenzen auf zwei oder mehr Sequenzen oder Untersequenzen, welche die gleichen sind oder einen spezifizierten Prozentsatz von Nukleotiden (oder Aminosäureresten) aufweisen, welche die gleichen sind, wenn sie für maximale Übereinstimmung über einem Vergleichsfenster verglichen werden und ein Alignment durchgeführt wird, wie mittels eines der folgenden Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch manuelles Alignment und visuelle Überprüfung gemessen. Diese Definition bezieht sich auch auf das Komplement einer Sequenz. Zum Beispiel gehören in alternativen Ausführungsformen zu Nukleinsäuren innerhalb des Umfangs der Erfindung auch diejenigen mit einer Nukleotidsequenzidentität, welche bei mindestens etwa 60%, mindestens etwa 75–80%, etwa 90% und etwa 95% der in SEQ. ID. NR: 1 (einschließlich der Reste 44 bis 13544 von SEQ. ID. NR: 1) oder SEQ. ID. NR: 2 dargestellten exemplarischen TERT-Promotorsequenz liegt, sowie die Intron-TERT-Sequenzen die in der Lage sind, ein Reportergen in Zellen, in denen Telomerase stattfindet zu stimulieren. Zwei Sequenzen mit diesen Identitätsniveaus sind „im Wesentlichen identisch". Wenn also eine Sequenz die erforderliche Sequenzidentität zu einer TERT-Promotorsequenz oder -untersequenz der Erfindung aufweist, ist sie ebenfalls eine TERT-Promotorsequenz innerhalb des Erfindungsumfangs. Vorzugsweise besteht die Prozentidentität über eine Region der Sequenz, welche eine Länge von mindestens 25 Nukleotiden hat, insbesondere über eine Region, welche eine Länge von mindestens etwa 50–100 Nukleotiden hat.
  • Beim Sequenzvergleich dient normalerweise eine Sequenz als Referenzsequenz, mit der Testsequenzen verglichen werden. Bei Verwendung eines Sequenzvergleichsalgorithmus werden Test- und Referenzsequenzen in einen Computer eingegeben, falls nötig werden Untersequenz-Koordinaten bestimmt und die Sequenzalgorithmus-Programmparameter werden bestimmt. Es können Standardprogrammparameter verwendet oder alternative Parameter bestimmt werden. Der Sequenzvergleichalgorithmus berechnet dann, basierend auf den bestimmten oder Standard-Programmparametern, die Prozentsequenzidentität für die Testsequenzen) relativ zur Referenzsequenz. Ein „Vergleichsfenster", wie hierin verwendet, beinhaltet den Bezug auf ein Segment einer beliebigen aus der Reihe benachbarter Positionen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 25 bis 600, normalerweise etwa 50 bis etwa 200, meist etwa 100 bis etwa 150, in der eine Sequenz mit einer Referenzsequenz mit der gleichen Anzahl benachbarter Positionen verglichen werden kann, nachdem die beiden Sequenzen optimal abgeglichen wurden. Das Alignment der Sequenzen kann mit dem lokalen Homologie-Algorithmus von Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mit dem Homologie-Alignment-Algorithmus von Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mit dem Verfahren zur Ähnlichkeitssuche von Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mittels computergesteuerter Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software-Paket, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch manuelles Alignment und visuelle Überprüfung durchgeführt werden.
  • Ein Beispiel eines nützlichen Algorithmus ist PILEUP. PILEUP erstellt ein multiples Sequenzalignment aus einer Gruppe zusammengehöriger Sequenzen mit Hilfe progressiver, paarweiser Alignments, um die Beziehung und Prozentsequenzidentität zu demonstrieren. Er entwirft außerdem einen Baum oder Dendrogramm, welche die Clustering-Beziehungen zeigt, die zur Erstellung des Alignments verwendet werden. PILEUP verwendet eine Vereinfachung des progressiven Alignment-Verfahrens von Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351–360 (1987). Das verwendete Verfahren ist ähnlich dem Verfahren, welches von Higgins & Sharp, CABIOS 5:151–153 (1989) beschrieben wurde. Das Programm kann ein Alignment von bis zu 300 Sequenzen durchführen, jede mit einer Maximallänge von 5.000 Nukleotiden oder Aminosäuren. Das multiple Alignment-Verfahren beginnt mit dem paarweisen Alignment der beiden ähnlichsten Sequenzen, wobei ein Cluster von zwei abgeglichenen Sequenzen erstellt wird. Dieses Cluster wird dann mit der/dem am nächsten verwandten Sequenz oder Cluster abgeglichener Sequenzen abgeglichen. Zwei Cluster von Sequenzen werden durch eine einfache Erweiterung des paarweisen Alignments von zwei individuellen Sequenzen abgeglichen. Das abschließende Alignment wird durch eine Reihe progressiver, paarweiser Alignments erreicht. Das Programm funktioniert über die Bestimmung spezifischer Sequenzen und ihrer Aminosäuren oder Nukleotid-Koordinaten für Gebiete des Sequenzvergleichs und durch Bestimmung der Programmparameter. Mit Hilfe von PILEUP wird eine Referenzsequenz mit einer anderen Sequenz verglichen, um die Prozentsequenzidentitätsbeziehung (ob die zweite Sequenz im Wesentlichen identisch ist und innerhalb des Erfindungsumfangs liegt) mit Hilfe der folgenden Parameter zu bestimmen: Standard-Spaltgewicht (3,00), Standard-Spaltlängengewicht (0,10) und gewichtete Endspalten. PILEUP ist erhältlich aus dem GCG-Sequenzanalyse-Softwarepaket (Devereaux (1984) Nuc. Acids Res. 12:387–395).
  • Ein weiteres Beispiel eines Algorithmus, der für die Bestimmung der Prozentsequenzidentität geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, welcher in Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403–410 beschrieben ist. Die Software für die Durchführung der BLAST-Analysen ist über das National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) öffentlich erhältlich. Als erstes beinhaltet dieser Algorithmus die Identifizierung von Sequenzpaaren mit hoher Übereinstimmung (HSPs) durch die Identifizierung von kurzen Wörtern der Länge W in der Anfragesequenz, welche entweder mit einem positiv bewerteten Schwellenwert T übereinstimmen oder diesen erfüllen, wenn sie mit einem Wort der gleichen Länge in einer Datenbanksequenz abgeglichen werden. T wird als der Neighborhood Word Score Threshold [Nachbarschaftsworttrefferschwellenwert] bezeichnet (Altschul (1990) oben). Diese Initial-Neighborhood-Word-Treffer dienen als Ausgangspunkte für das Initiieren von Suchvorgängen, um längere HSPs zu finden, in denen sie enthalten sind. Die Worttreffer werden dann in beide Richtungen entlang jeder Sequenz so weit erweitert, wie der kumulative Alignment-Wert erhöht werden kann. Kumulative Werte werden bei Nukleotidsequenzen mit Hilfe der Parameter M (Belohnungswert für ein Paar übereinstimmender Reste, immer > 0) und N (Strafwert für nicht übereinstimmende Reste, immer < 0) berechnet. Für Aminosäuresequenzen wird eine Bewertungsmatrix verwendet, um den kumulativen Wert zu berechnen. Die Erweiterung der Worttreffer in jede Richtung wird gestoppt, wenn: der kumulative Alignment-Wert um die Quantität X von seinem maximal erreichten Wert abfällt; der kumulative Wert aufgrund der Akkumulation eines oder mehrerer negativ bewerteter Reste-Alignments auf Null oder darunter sinkt oder das Ende der Sequenz ist erreicht. Die BLAST-Algorithmus-Parameter W, T und X bestimmen die Empfindlichkeit und die Geschwindigkeit des Alignments. In einer Ausführungsform wird zur Bestimmung, ob eine Nukleinsäuresequenz innerhalb des Erfindungsumfangs liegt, das BLAST-Programm (für Nukleotidsequenzen) verwendet, wobei als Standardwerte eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10 M=5, N=4 und ein Vergleich beider Stränge eingesetzt wird. Bei Aminosäuresequenzen verwendet das BLAST-Programm als Standardparameter eine Wortlänge (W) von 3, eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62-Bewertungsmatrix (Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).
  • Der BLAST-Algorithmus führt außerdem eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch (Karlin (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873–5787). Ein durch den BLAST-Algorithmus bereitgestelltes Maß der Ähnlichkeit ist die kleinste Summenwahrscheinlichkeit (P(N)), welche eine Angabe der Wahrscheinlichkeit bereitstellt, mit der eine Übereinstimmung zwischen zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zufällig auftreten würde. Zum Beispiel gilt eine Nukleinsäure als ähnlich zu einer Referenzsequenz, wenn die kleinste Summenwahrscheinlichkeit in einem Vergleich der Test-Nukleinsäure mit der Referenznukleinsäure geringer als etwa 0,1 ist, insbesondere geringer als etwa 0,01 und am bevorzugtesten geringer als 0,001.
  • Die Phrase „hybridisiert selektiv (oder spezifisch) zu" bezieht sich auf die Bindung, Duplizierung oder Hybridisierung eines Moleküls zu einer bestimmten Nukleotidsequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, wenn diese Sequenz in einer komplexen Mischung (wie komplette zelluläre oder Bibliotheks-DNA oder -RNA) vorhanden ist, wobei die bestimmte Nukleotidsequenz mit mindestens doppeltem Hintergrund, vorzugsweise 10-fachem Hintergrund, erkannt wird. In einer Ausführungsform kann eine Nukleinsäure entsprechend ihrer Fähigkeit, unter stringenten Bedingungen zu einer anderen Nukleinsäure zu hybridisieren (wie die hierin beschriebenen exemplarischen Sequenzen), als innerhalb des Erfindungsumfangs bestimmt werden.
  • Die Phrase „stringente Hybridisierungsbedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter denen eine Probe primär zu ihrer Ziel-Untersequenz hybridisiert, normalerweise in einer komplexen Nukleinsäure-Mischung, allerdings zu keinen anderen Sequenzen. Stringente Bedingungen sind Sequenz-abhängig und unterscheiden sich in unterschiedlichen Situationen, abhängig von der Länge der Sonde. Längere Sequenzen hybridisieren besonders bei höheren Temperaturen. Eine umfassende Anleitung zur Hybridisierung von Nukleinsäuren findet sich in Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Probes. „Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie etwa 5–10°C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (Tm) für die spezifische Sequenz bei definierter Ionenstärke und pH-Wert. Tm ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke, pH-Wert und Nukleinkonzentration) bei der 50% der zum Ziel komplementären Sonden im Gleichgewicht zur Zielsequenz hybridisieren (wenn die Zielsequenzen im Übermaß vorhanden sind werden bei Tm 50% der Sonden im Gleichgewicht belegt). Stringente Bedingungen sind diejenigen, bei denen die Salzkonzentration geringer als etwa 1,0 M Natriumionen ist, normalerweise etwa eine 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder andere Salze), bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,3, und die Temperatur beträgt mindestens etwa 30°C für kurze Sonden (–10 bis etwa 50 Nukleotide) und mindestens etwa 60°C für lange Sonden (länger als etwa 50 Nukleotide). Stringente Bedingungen können auch durch das Hinzufügen destabilisierender Agenzien wie Formamid erreicht werden. Für die selektive oder spezifische Hybridisierung ist ein positives Signal (Identifizierung einer Nukleinsäure der Erfindung) die etwa 5- bis 10-fache Background-Hybridisierung. Zu „stringenten" Hybridisierungsbedingungen, die zum Identifizieren im Wesentlichen identischer Nukleinsäuren innerhalb des Erfindungsumfangs verwendet werden, gehören die Hybridisierung in einem Puffer mit 50% Formamid, 5× SSC und 1% SDS bei 42°C oder die Hybridisierung in einem Puffer mit 5× SSC und 1% SDS bei 65°C, beide mit einer Waschung von 0,2× SSC und 0,1% SDS bei 65°C, für lange Sonden. Für kurze Sonden gehören zu stringenten Hybridisierungsbedingungen die Hybridisierung in einem Puffer mit 50% Formamid, 5× SSC und 1% SDS bei Raumtemperatur oder die Hybridisierung in einem Puffer mit 5× SSC und 1% SDS bei 37°C–42°C, beide mit einer Waschung von 0,2× SSC und 0,1% SDS bei 37°C–42°C. Für den Durchschnittsfachmann ist es jedoch offensichtlich, dass die Hybridisierungsbedingungen abhängig von der Sequenzzusammensetzung modifiziert werden können. Zu moderat stringenten Hybridisierungsbedingungen gehören eine Hybridisierung in einem Puffer von 40% Formamid, 1 M NaCl und 1% SDS bei 37°C und einer Waschung in 1× SSC bei 45°C. Eine positive Hybridisierung ist mindestens der zweifache Hintergrund. Der Durchschnittsfachmann wird leicht erkennen, dass alternative Hybridisierungs- und Waschungsbedingungen eingesetzt werden können, um Bedingungen ähnlicher Strenge bereitzustellen.
  • Allgemeine Methoden
  • Die TERT-Promotorsequenzen der Erfindung und die zur Ausführung dieser Erfindung verwendeten Nukleinsäuren, ob nun RNA, cDNA, Genom-DNA oder Hybride davon, können aus verschiedenen Quellen isoliert, genetisch bearbeitet, verstärkt bzw. rekombinant exprimiert werden. Es kann jedes rekombinante Expressionssystem verwendet werden, einschließlich Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugetiersysteme. Alternativ dazu können diese Nukleinsäuren in vitro chemisch synthetisiert werden. Methoden für die Manipulation von Nukleinsäuren, wie das Subklonieren in Expressionsvektoren, das Markieren von Proben, das Sequenzierung und Hybridisierung, sind in der wissenschaftlichen und Patentliteratur ausführlich beschrieben. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) („Sambrook"): Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, Ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997) („Ausubel"); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I, Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993). Nukleinsäuren können mit einer beliebigen Anzahl von Methoden analysiert und quantifiziert werden, einschließlich NMR, Spektrophotometrie, Radiographie, Elektrophorese, Kapillarelektrophorese, Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), Dünnschichtchromatographie (TLC) und Hyperdiffusionschromatographie, Fluid- oder Gel-Precipitin-Reaktionen, Immundiffusion (einfach oder doppelt), Immunelektrophorese, Radioimmunassays (RIAs), Enzym-Linked-Immuno-Sorbent-Assays (ELISAs), Immunfluoreszenzassays, Southern-Analyse, Northern-Analyse, Dot-Blot-Analyse, Gel-Elektrophorese, RT-PCR, quantitative PCR, weitere Nukleinsäure- oder Ziel- oder Signalverstärkungsverfahren, radioaktive Markierung, Szintillationszählung und Affinitätschromatographie.
  • Herstellung von hTERT-Promotorsequenzen
  • Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung sind TERT-Promotoren, welche Genomsequenzen-5' (stromaufwärts) einer hTERT- oder mTERT-Transkriptionsstartstelle sowie Intronsequenzen aufweisen. TERT-Promotoren enthalten cis-aktive Transkriptionsregulationselemente, die an der Expression der TERT-Nachricht beteiligt sind. Es ist offensichtlich, dass zusätzlich zu den Nukleinsäuresequenzen, die in hTERT SEQ. ID. NR: 1 oder mTERT SEQ. ID. NR: 2 bereitgestellt sind, zusätzliche TERT-Promotorsequenzen mit Hilfe von routinemäßigen molekularbiologischen Methoden leicht hergestellt werden können. Zum Beispiel erhält man eine zusätzliche hTERT-Genom- (und Promotor-) Sequenz durch das Screening einer humanen Genombibliothek mittels einer hTERT-Nukleinsäuresonde, die eine Sequenz oder Untersequenz wie in SEQ. ID. Nr: 1 dargestellt aufweist (eine Nukleinsäuresequenz liegt innerhalb des Erfindungsumfangs, wenn sie unter stringenten Bedingungen zu einer hTERT-Promotorsequenz der Erfindung hybridisiert). Die zusätzliche hTERT- oder mTERT-Genomsequenz kann durch die „Chromosome Walking"-Methoden, wie von Hauser (1998) Plant J. 18:117–125; Min (1998) Biotechniques 24:298–400 beschrieben, einfach identifiziert werden. Zu weiteren nützlichen Verfahren zur weiteren Charakterisierung von TERT-Promotorsequenzen gehören die allgemeinen Verfahren, die von Pang (1997) Biotechniques 22:1046–1048; Gobinda (1993) PCR Meth. Applic. 2:318; Triglia (1988) Nucleic Acids Res. 16:186; Lagerstrom (1991) PCR Methods Applic. 1:111; Parker (1991) Nucleic Acid Res. 19:3055 beschrieben wurden.
  • In einigen Ausführungsformen enthält die Promotor-Sequenz mindestens etwa 15, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000, 2500 oder 13.000 Basen in SEQ. ID. NR: 1 oder SEQ. ID. NR: 2. Mitenthalten ist ein Nukleinsäuremolekül, welches gegebenenfalls verbunden mit einer heterologen Sequenz einen TERT-Promotor aufweist, einschließlich, jedoch nicht darauf begrenzt hTERT oder mTERT. Der Promotor kann etwa 100 bis etwa 200, 200 bis etwa 400, 400 bis etwa 900 oder 900 bis etwa 2500 oder 2500 bis etwa 5000 Nukleotide stromaufwärts einer Translationsstartstelle aufweisen. In weiteren Ausführungsformen umfasst der Promotor eine Sequenz, die mit SEQ. ID. NR: 1 oder 2 hybridisiert. Beispielhaft sind Promotorsequenzen, welche bevorzugt die Transkription in Zellen, welche die Telomerase-Reverse-Transkriptase exprimieren, fördern. Solche Sequenzen lassen sich mit Hilfe der Assays leicht identifizieren, die an anderer Stelle in dieser Darlegung und in den Beispielen bereitgestellt werden, und bei denen in Frage kommende [Kandidator-] Promotorsequenzen wirkungsmäßig mit Codierregionen für ein Reporterprotein verbunden werden und dann zur Bestimmung der Spezifität in Zellen mit bekannter TERT-Aktivität transfiziert werden.
  • Die Erfindung bietet Oligonukleotidprimer, die alle oder jede einzelne spezifische Regionen innerhalb der TERT-Promotorsequenz der Erfindung verstärken können, einschließlich spezifischer Promotor- und Enhancer-Untersequenzen. Die Nukleinsäuren der Erfindung können auch mit Hilfe von Verstärkungsmethoden erzeugt oder quantitativ gemessen werden. Mit Hilfe der TERT-Promotorsequenzen der Erfindung (wie in der beispielhaften hTERT SEQ. ID. NR: 1 oder mTERT SEQ. ID. NR: 2) kann der Fachmann geeignete Oligonukleotid-Verstärkungsprimere auswählen und erzeugen. Zu den Verstärkungsverfahren gehören die Polymerase-Kettenreaktion (PCR-Protokolle, A Guide To Methods And Applications, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) und PCR Strategies (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.), Ligase-Kettenreaktion (LCR) (Wu (1989) Genomics 4:580; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117; Transkriptionsverstärkung (Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:1173) und selbständige Sequenzreplikation (Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874); Q-β-Replikase-Verstärkung (Smith (1997) T. Clin. Microbiol. 35:1477–1491), automatisiertes Q-β-Replikase-Verstärkungsassay (Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:267–271) und weitere RNA-Polymerase-mediierte Methoden (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307–316, Sambrook, Ausubel, Mullis (1987) US-Patentschrift Nr. 4,683,195 und 4,683,202; Arnheim (1990) C&EN 36–47; Lomell J. Clin. Chem., 35:1826 (1989); Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291–294; Wu (1989) Gene 4:560; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563–564. Nach der Verstärkung können TERT-Genom-DNA, TERT-Promotorsequenzen und ähnliches, falls gewünscht, mit Hilfe von routinemäßigen biologischen Verfahren in einen beliebigen von verschiedenen Vektoren geklont werden; Verfahren zum in vitro Klonen von verstärkten Nukleinsäuren sind in Wallace, US-Patentschrift Nr. 5,426,039 beschrieben.
  • Die Erfindung beinhaltet TERT-Promotorsequenzen, die auf eine regionspezifische Art und Weise modifiziert wurden, um die Funktionen des Promotors zu verändern, neue hinzuzufügen oder einige bzw. alle zu löschen. Zum Beispiel können spezifische Basendpaare modifiziert werden, um die Bindungsaffinität zu trans-aktiven Transkriptionsregulationsfaktoren zu verändern, zu steigern oder zu verringern, wodurch das relative Niveau der Transkriptionsaktivierung oder -unterdrückung modifiziert wird. Modifikationen können auch sekundäre Strukturen spezifischer Untersequenzen, wie die mit vielen cis-aktiven Transkriptionselementen in Verbindung stehenden, verändern. Regionspezifische Mutationen können durch verschiedene konventionelle Methoden, welche in der wissenschaftlichen und Patentliteratur gut beschrieben sind, in Nukleinsäuren platziert werden. Zu illustrativen Beispielen gehören regionengerichtete Mutagenese durch Overlap-Extension-Polymerase-Kettenreaktion (OE-PCR), wie in Urban (1997) Nucleic Acids Res. 25:2227–2228; Ke (1997) Nucleic Acids Res. 25:3371–3372 und Chattopadhyay (1997) Biotechniques 22:1054–1056, worin das PCR-basierte regionengerichtet Mutagenese-„Megaprimer"-Verfahren beschrieben wird; Bohnsack (1997) Mol. Biotechnol. 7:181–188; Ailenberg (1997) Biotechniques 22:624–626, worin die regionengerichtete Mutagenese mit Hilfe eines PCR-basierten abgestuften Neuverschmelzungsverfahrens ohne Restriktionsenzyme beschrieben wird; Nicolas (1997) Biotechniques 22:430–434, regionengerichtete Mutagenese mit Hilfe Langprimer-spezifischer Positionseliminierung und Exonuklease III beschrieben. Modifizierte TERT-Promotorsequenzen der Erfindung können des Weiteren durch chemische Modifikationsverfahren hergestellt werden. Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440–3444; Frankel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373–380; Blommers (1994) Biochemistry 33: 7886–7896.
  • Die Erfindung bietet außerdem Antisense-Oligonukleotide, die in der Lage sind, TERT-Promotorregionen zu binden, welche, zumindest zum Teil, die TERT-Transkriptions- und Telomeraseaktivität modulieren. Zum Beispiel verhindern Antisense-Oligonukleotide, die Triplexe mit Promotorregionen bilden, die Aktivität dieses Promotors. Joseph (1997) Nucleic Acids Res. 25:2182–2188; Alunni-Fabbroni (1998) Biochemistry 35:16361–16369; Olivas (1996) Nucleic Acids Res. 24:1758–1764. Alternativ dazu können Antisense-Oligonukleotide, die zu der Promotorsequenz hybridisieren, zur Verhinderung der Promotoraktivität verwendet werden.
  • Zum Beispiel können Antisense-Polynukleotide der Erfindung eine Antisense-Sequenz von mindestens 7 bis 10 bis etwa 20 oder mehr Nukleotide umfassen, die spezifisch zu einer Sequenz hybridisieren, die komplementär zu den TERT-Promotorsequenzen der Erfindung ist. Alternativ kann das Antisense-Polynukleotid der Erfindung eine Länge von etwa 10 bis etwa 50 Nukleotiden oder von etwa 14 bis etwa 35 Nukleotiden haben. In weiteren Ausführungsformen sind es weniger als etwa 100 Nukleotide oder weniger als etwa 200 Nukleotide. Im Allgemeinen sollte das Antisense-Polynukleotid lang genug sein, um ein stabiles Duplex (oder Triplex) zu bilden, aber (wenn gewünscht), je nach Art der Verabreichung, auch kurz genug, um in vivo verabreicht werden zu können. Die für eine spezifische Hybridisierung zu einer Zielsequenz erforderliche Mindestlänge eines Polynukleotids hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie G/C-Gehalt, Positionierung der nicht übereinstimmenden Basen (falls vorhanden), Grad der Einzigartigkeit der Sequenz im Vergleich zur Population von Ziel-Polynukleotiden und chemische Beschaffenheit der im Antisense-Reagens verwendeten Nukleotide (Methylphosphonat-Hauptkette, Peptid-Nukleinsäure, Phosphorothioat), u. a. Verfahren in Bezug auf Antisense-Polynukleotide sind auch in Antisense RNA And DNA, (1988), D.A. Melton, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.); Dagle (1991) Nucleic Acids Research 19:1805; Kim (1998) J. Controlled Release 53:175–182; zur Antisense-Therapie, Uhlmann (1990) Chem. Review 90:543–584; Poston (1998) J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 116:386–396 (ex vivo Gentherapie); Haller (1998) Kidney Int. 53:1550–1558; Nguyen (1998) Cancer Res. 58:5673–7 beschrieben.
  • Identifizierung von durch Transkriptionsregulationsfaktoren gebundenen TERT-Promotorsequenzen
  • Die Erfindung bietet Mittel zur Identifizierung und Isolierung von trans-aktiven Transkriptionsregulationsfaktoren, die an der Modulation der Aktivität des TERT-Promotors beteiligt sind. Die Identifizierung von cis-aktiven Motiven über den Sequenzidentitätsvergleich kann ein nützliches Startmittel zum Identifizieren von Promotorsequenzen sein, die durch trans-aktive Faktoren gebunden sind. Der hTERT-Promotor enthält das Motiv, von dem bekannt ist, dass es an c-Myc (die „E-Box" oder „Myc/Max-Bindungsstelle") bindet. Zwei SP1-Bindungsstellen befinden sich beginnend an Rest –168 und beginnend an Rest –134. Zu weiteren identifizierten Motiven gehören das Genprodukt der geschlechtsbestimmenden Region Y (SRY), der hepatische Kernfaktor 3-beta (HNF-3β) und der hepatische Kernfaktor 5 (HNF-5), TFIID-MBP-E2F und c-Myb cis-aktive Transkriptionsregulationselemente. Zum Identifizieren dieser Motive können verschiedene Vergleichsalgorithmen verwendet werden. Karas (1996) Comput. Appl. Biosci. 12:441–6; Frech (1997) Pac Symp Biocomput. 7:151–62; Brzma (1998) Genome Res. 8:1202–1215; Tsunoda (1998) Pac Symp. Biocomput 1998:252–63.
  • Zusätzlich zur Sequenzidentitätsanalyse können cis-aktive TERT-Transkriptionsregulationselemente durch funktionale Assays identifiziert werden, einschließlich Promotoraktivitätsassays, DNase-Assays, Bindungs-Assays (Mobilitätsverschiebungs-Assays) und Oligonukleotid-Affinitätssäulenchromatographie. Nach der positiven oder vorläufigen Identifikation einer cis-aktiven Bindungsstelle in einem TERT-Promotor werden diese Sequenzen verwendet, um den/die Transkriptionsregulationsfaktor(en) zu isolieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die trans-aktiven Faktoren mit Hilfe der sequenzspezifischen Oligonukleotid-Affinitätschromatographie isoliert, wobei die Oligonukleotide TERT-Sequenzen der Erfindung aufweisen.
  • Eine weitere Ausführungsform zur Identifizierung von Transkriptionsregulationsmotiven beinhaltet die Modifizierung putativer cis-aktiver Regulationsuntersequenzen und die Bewertung der Veränderung, wenn vorhanden, des entstehenden TERT-Promotors, um die Transkription zu modulieren. Die Modifikation kann das Löschen eines oder mehrerer Reste, die Substitution von Resten und die chemische Veränderung von Nukleotiden sein. Der (modifizierte) Promotor kann wirkungsmäßig mit TERT, einem Reportergen oder einer beliebigen anderen transkribierbaren Sequenz verbunden sein. Der relative Anstieg oder die Verringerung, welche/n die Modifikation bei den Transkriptionsraten verursacht, kann durch die Messung der Fähigkeit des nicht veränderten TERT-Promotors, die Reporter-Codiersequenz unter den gleichen Bedingungen, wie sie zum Testen des modifizierten Promotors verwendet wurden, transkriptional zu aktivieren, bestimmt werden. Ein Anstieg oder eine Verringerung in der Fähigkeit des modifizierten TERT-Promotors, die Transkription zu induzieren im Vergleich zum nicht modifizierten Promotorstrukturelement identifiziert eine cis-aktive Transkriptionsregulationssequenz, die an der Modulation der TERT-Promotoraktivität beteiligt ist.
  • Das Reportergen kann ein Fluoreszenz- oder Phosphoreszenz-Protein codieren, oder ein Protein, welches enzymatische Aktivität besitzt. In alternativen Ausführungsformen ist das erkennbare Protein Firefly-Luciferase, α-Glukuronidase, α-Galaktosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, grünes fluoreszentes Protein und die human-sekretierte alkalische Phosphatase. Eine weitere Ausführungsform testet die Fähigkeit dieser cis-aktiven Elemente, lösliche Polypeptid trans-aktiver Faktoren zu binden, die aus unterschiedlichen Zellkompartimenten isoliert wurden, insbesondere trans-aktive Faktoren, die in Kernen exprimiert sind. Zur Identifizierung und Isolierung von Faktoren, welche die Transkription stimulieren werden Kernextrakte aus Zellen verwendet, die TERT exprimieren.
  • Wurde des Weiteren ein cis-aktives Motiv oder Element identifiziert, kann es verwendet werden, um trans-aktive Faktoren in verschiedenen Zellen und unter unterschiedlichen Bedingungen zu identifizieren und zu isolieren (wie z.B. Zellproliferation gegen Zellseneszenz). Entsprechend bietet die Erfindung ein Verfahren zum Screening nach trans-aktiven Faktoren, welche die TERT-Promotoraktivität unter verschiedenen Bedingungen, in unterschiedlichen Entwicklungsstadien und Zelltypen (einschließlich normale gegen immortale gegen maligne Phänotypen) modulieren. Die cis-aktiven Transkriptionsregulationssequenzen der Erfindung, welche die TERT-Promotoraktivität modulieren, können auch als Oligonukleotide verwendet werden, welche bei Einbringung in eine Zelle trans-aktive Regulationsfaktoren binden können, um die TERT-Transkription in vivo zu modulieren. Dies führt zu einer erhöhten oder verringerten Zellproliferationskapazität bei der Behandlung verschiedener Krankheiten und Leiden.
  • Hoch-Durchsatz-Screening kleiner Molekülmodulatoren der TERT-Transkription
  • Die Erfindung bietet Strukturelemente und Verfahren zum Screening von Modulatoren, in einer bevorzugten Ausführungsform kleine Molekülmodulatoren der TERT-Promotoraktivität in vitro und in vivo. Die Erfindung schließt alle Assays mitein, die zum Screening kleiner Molekülmodulatoren der TERT-Transkription zur Verfügung stehen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Hoch-Durchsatz-Assays angepasst und mit den neuartigen TERT-Promotorsequenzen und -strukturelementen verwendet, welche von der Erfindung bereitgestellt werden. Schultz (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:2409–2414; Weller (1997) Mol. Divers. 3:61–70; Femandes (1998) Curr. Opin. Chem. Biol. 2:597–603; Sittampalam (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:384–91.
  • In alternativen Ausführungsformen enthalten rekombinierte Strukturelemente hTERT-Promotorsequenzen, welche einen Marker, wie ein alkalisches Phosphatase-Markergen (SEAP) oder ein §-Galaktosidase-Gen steuern. Mittels eines SEAP-exprimierenden Strukturelementes der Erfindung wurde veranschaulicht, dass ein TERT-Promotorfragment von etwa 2,5 kb ausreichend ist, um die TERT-Transkription als Reaktion auf Proliferations- bzw. Wachstumsstillstandsstimulanzien in einer Modellzelllinie, IDH4 zu aktivieren und zu unterdrücken. Zwei Zellklone, ID245-1 und ID245-16, deren SEAP-Profile nach der TERT-Aufwärts-Regulation durch Dexamethason nahezu mit der Telomerseaktivität übereinstimmte, wurden ausgewählt und für das Hoch-Durchsatz-Screening von kleinen Molekülaktivatoren der Telomerase expandiert.
  • Behandlung von Krankheiten in Verbindung mit veränderter Telomerase-Expression
  • Die vorliegende Erfindung bietet TERT-Promotorsequenzen, die für die Behandlung von Krankheiten und krankhaften Zuständen von Nutzen sind. Die rekombinanten und synthetischen Nukleinsäuren, welche TERT-Promotor- oder komplementäre TERT-Antisense-Sequenzen enthalten, können zur Erzeugung oder Erhöhung der Telomeraseaktivität in einer Zelle sowie zur Verhinderung der Telomeraseaktivität in Zellen, in denen diese nicht erwünscht ist, eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden humane TERT-Promotorsequenzen oder Antisense-Sequenzen für die Behandlung von Humankrankheiten und humanen krankhaften Zuständen verwendet.
  • Mit der Identifizierung von cis-aktiven Transkriptionsregulationssequenzen durch die Erfindung stehen ferner Zielsequenzen zur Verfügung, die, wie Oligonukleotide, die TERT-Promotoraktivität modifizieren können. In einer Ausführungsform wird die Telomeraseaktivität durch bindungssignifikante Mengen eines trans-aktiven Transkriptionsrepressors oder -Abwärts-Regulators mit einer Nukleinsäure, die sich spezifisch an den Repressor bindet, erzeugt oder erhöht. In einer weiteren Ausführungsform wird die Telomeraseaktivität durch Antisense-Oligonukleotide nach unten reguliert, die an die Promotorsequenzen binden. Ähnlich kann die Telomeraseaktivität durch die Bindung signifikanter Mengen eines trans-aktiven Transkriptionsaktivators oder Aufwärts-Regulators mit einer Nukleinsäure, die spezifisch an den Aktivator bindet, verhindert werden; oder die Telomeraseaktivität wird durch Antisense-Oligonukleotide nach oben reguliert, die sich an die Promotorsequenzen binden, die an der Telomeraserepression beteiligt sind. So kann das Verhindern, Aktivieren oder anderweitige Verändern einer Telomeraseaktivität (katalytische Telomeraseaktivität, Genauigkeit, Transkriptionsrate, Telomerbindung, usw.) in einer Zelle verwendet werden, um die proliferative Kapazität der Zelle zu verändern.
  • Zum Beispiel kann die Reduzierung der Telomeraseaktivität in einer unsterblichen Zelle, wie einer malignen Tumorzelle, die Zelle sterblich machen. Im Gegensatz dazu kann die Erhöhung der Telomeraseaktivität in einer Zelllinie oder einer sterblichen Zelle (die meisten humanen Körperzellen) die proliferative Kapazität der Zelle erhöhen. Zum Beispiel führt die Expression des hTERT-Proteins in Hautfibroblasten, wodurch die Telomerlänge erhöht wird, zu einer erhöhten proliferativen Kapazität der Fibroblasten. Eine solche Expression kann altersbedingte degenerative Prozesse, wie die altersbedingte Verlangsamung des Wundverschlusses, verlangsamen oder umkehren (West (1994) Arch. Derm. 130:87). So bietet die vorliegende Erfindung in einem Aspekt Reagenzien und Verfahren, die für die Behandlung von Krankheiten und Leiden von Nutzen sind, die durch die Gegenwart, Abwesenheit oder veränderte Menge humaner Telomeraseaktivität in einer Zelle gekennzeichnet sind (wobei die Krankheiten und Leiden empfänglich für die Behandlung mit Hilfe der hierin offenbarten Zusammensetzungen und Verfahren sind). Zu diesen Krankheiten gehören z.B. Krebsarten, weitere Krankheiten der Zellproliferation (insbesondere degenerative und Alterungsprozesse und Alterskrankheiten), Immunstörungen, Unfruchtbarkeit (oder Fruchtbarkeit).
  • TERT-Promotor wirkungsmäßig an Zellgiften gebunden
  • In einer Ausführungsform ist der TERT-Promotor der Erfindung wirkungsmäßig an eine transkribierbare Sequenz gebunden, die ein Zellgift codiert. Zu Polypeptid-Toxinen, die rekombinant erzeugt werden können, gehören Ricin, Abrin (Hughes (1996) Hum. Exp. Toxicol. 15:443–451), Diphtherie-Toxin, Gelonin (Rosenblum (1996) Cancer Immunol. Immunother. 42:115–121), Pseudomonas Exotoxin A, Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α), Crotalus durissus terrificus Toxin, Crotalus adamenteus Toxin, Naja naja Toxin und Naja mocambique Toxin, Rodriguez (1998) Prostate 34:259–269; Mauceri (1996) Cancer res. 56:4311–4314. Das Zellgift kann auch in der Lage sein, Apoptose zu induzieren, wie die ICE-Familie der Cysteinprotease, die Bcl-2-Familie von Proteinen, bax, bclXs und Caspasen. Favrot (1998) Gene Ther. 5:728–739; McGill (1997) Front. Biosci. 2:D353–D379; McDonnell (1995) Semin. Cancer Biol. 6:53–60.
  • Alternativ dazu kann die Sequenz unter der Kontrolle des TERT-Promotors für Polypeptide codieren, welche Aktivität aufweisen, die an sich nicht toxisch für eine Zelle ist, welche die Zelle aber empfindlich für ein ansonsten nicht toxisches Medikament wie die Herpes-Virus-Thymidinkinase (HSV-TK) macht. HSV-TK ist harmlos, verwandelt aber das Antiherpes-Agens Ganciclovir (GCV) in ein toxisches Produkt, das die DNA-Replikation in proliferierenden Zellen beeinträchtigt. Delaney (1996) J. Neorosci. 16:6908–6918; Heyman (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2698–2702. Das Fachgebiet beschreibt zahlreiche weitere geeignete toxische oder potentiell toxische Proteine und Systeme, die in dieser Ausführungsform angewandt werden können.
  • Die Verfahren der Erfindung können zusätzlich zur Ermöglichung des spezifischen Abtötens von Telomerase-positiven Zellen auch verwendet werden, um die Transformation von Telomerase-negativen Zellen in einen Telomerase-positiven Zustand zu verhindern. Wie in den Beispielen unten gezeigt kann eine hTERT-Promotorsequenz wirkungsmäßig an ein Reportergen gebunden sein, und zwar so, dass die Aktivierung des Promotors zur Expression des Proteins führt, das durch das Reportergen codiert ist. Sollte anstelle eines Reporterproteins das codierte Protein toxisch für die Zelle sein, führt die Aktivierung des Promotors zur Zellmorbidität oder zum Zelltod.
  • Onkolytische Viren und Toxine zur Behandlung von Krebs
  • Die vorliegende Erfindung bietet Verfahren und Zusammensetzungen zur Reduzierung der TERT-Promotoraktivität (und folglich der Telomeraseaktivität) in insterblichen Zellen und Tumorzellen zur Behandlung von Krebs. Krebszellen (maligne Tumorzellen), die Telomeraseaktivität exprimieren (Telomerase-positive Zellen) können durch die Verringerung oder Verhinderung der TERT-Promotor-Aktivität sterblich gemacht werden. Weil messbare Telomeraseaktivitätslevels mit Krankheitseigenschaften wie dem metastatischen Potential korrelieren (US-Patentschrift Nr. 5,639,613; 5,648,215; 5,489,508 und Pandita (1996) Proc. Am. Ass. Cancer Res. 37:559) könnte außerdem jede Reduzierung der TERT-Promotoraktivität die aggressive Natur einer Krebsart in ein handhabbareres Krankheitsstadium verringern.
  • In Ausnutzung dieser Eigenschaft wird in einer Ausführungsform dieser Erfindung eine TERT-Promotorsequenz wirkungsmäßig an ein Gen gebunden, das ein Toxin codiert (wie Ricin, Diphtherie, Gelonin, Pseudomonas-Toxin, Abrin), und in eine Zelle eingebracht, um die Zelle zu töten. Falls oder wenn TERT-Transkriptionsaktivatoren in der Zelle exprimiert oder aktiviert werden, wird das Toxin exprimiert, was zu einer spezifischen Zelltötung führt.
  • Alternativ kann das TERT-Promotor-verbundene Gen ein aktives Protein codieren, welches an sich nicht toxisch für eine Zelle ist, welches die Zelle aber empfindlich für ein ansonsten nicht toxisches Medikament macht (wie Herpes-Virus-Thymidinkinase).
  • In einer weiteren Ausführungsform nutzt die Erfindung die Tatsache, dass normale zytopathische Viren, insbesondere humane zytopathische Viren wie das Adenovirus oder Herpes-Virus, essentielle, viral-codierte Gene erfordern, um zu proliferieren und so spezifische Zellen aufzulösen. Basierend auf der folgenden Beschreibung wird der Fachmann erkennen, dass eine Reihe verschiedener zytopathischer Viren entsprechend dieser Erfindung angepasst werden kann. Zytopathische Viren sind im Fachgebiet gut bekannt und sind unter anderem in Veröffentlichungen von Coffey, Toda, Chase und Kramm (siehe unten) beschrieben. Für die Replikation essentielle Gene wurden in vielen solcher Viren charakterisiert. Wird ein essentielles Replikationsgen eines dieser Viren durch den TERT-Promotor stimuliert, so wäre die Proliferation des Virus und seine zytopathische Wirkung auf Tumorzellen und andere Telomerase-exprimierende Zellen beschränkt. Zum Beispiel sind einige essentielle genetische Elemente für die Replikation des Adenovirus die E4-, E1a-, E1b- und E2-Regionen oder eines der späteren Genprodukte. Zu essentiellen genetischen Elementen für die Replikation von HSV-1 gehören ICP6 and ICP4.
  • Entsprechend bietet die Erfindung Konstrukte und Verfahren zum Abtöten Telomerase-positiver Zellen (wie Krebszellen), wobei die TERT-Promotorsequenzen der Erfindung wirkungsmäßig an solche essentielle genetische Replikationselemente gebunden sind. Zur Verwendung in humanen Zellen werden humane zytopathische Viren modifiziert mit hTERT-Promotorsequenzen bevorzugt. Ein beliebiges oder mehrere der Gene, die für die Replikation und Verpackung des Virus erforderlich sind, können so modifiziert sein, dass sie vom TERT-Promotor stimuliert werden. Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform die Expression des E1a-Genes des Adenovirus, welches für die Aktivierung der Expression einer Kaskade von Adenovirusgenen erforderlich ist, unter die Kontrolle des hTERT-Promotors gestellt.
  • So tritt die Expression von E1a und somit auch die stromabwärtige Replikation des Virus nur in den Zellen auf, die Telomerase exprimieren (wie Tumorzellen). Gleichermaßen wird ein rekombinantes Adenovirus der Erfindung geschaffen, damit die Adenovirus-Capsidgene unter der Kontrolle eines TERT-Promotors sind. Während dieses Strukturelement seine DNA in den meisten Zelltypen repliziert, verpackt es sich selbst nur in den Zellen in ein aktives, infektiöses (und zytotoxisches) Virus, welche Telomerase exprimieren. Wenn also diese Strukturelemente als Krebstherapeutika verwendet werden, infiziert das bedingt replikative Virus nur Tumorzellen und erreicht nur dort eine produktive Infektion (ohne Wirkung in „normalen" Zellen, die keine Telomerase exprimieren). Bei der Infektion normaler Zellen, die keine Telomerase exprimieren, wird erwartet, dass entweder kein Virus produziert wird oder das Virus abortiv produziert wird, je nachdem welches Gen vom TERT-Promotor stimuliert wird. So erlauben diese rekombinierten Viren der Erfindung die natürliche, jedoch tumorspezifische Amplifikation eines onkolytischen Virus.
  • In alternativen Ausführungsformen sind viele andere Elemente in ein durch einen TERT-Promotor beschränktes onkolytisches Virus oder ein durch einen TERT-Promotor beschränktes replikatives Virus, welches nicht lytisch ist, eingefügt. Gene, welche Suizidgene, Markergene, apoptotische Gene oder Zellzyklusregulatoren codieren, sind in das vom TERT-Promotor beschränkte, bedingt replikative, rekombinante Virus eingefügt. Die Expression dieser Elemente in einem solchen Virus würde den Stopp des Tumorwachstums unterstützen. In einer Ausführungsform sind Elemente, die innerhalb dieser bedingt replikativen Viren der Erfindung eingefügt werden sollen, Strukturen, welche die Telomeraseaktivität verhindern. Diese Telomerasehemmer können inhibitorische Oligonukleotide, dominant-negative Inhibitoren von TERT oder das Gen für ein beliebiges Agens umfassen, das die TR/TERT-Zusammensetzung, -Interaktionen oder -Aktivität stört oder verhindert.
  • Außerdem können weitere Elemente in die vom TERT-Promotor beschränkten Vektoren der Erfindung eingebracht werden. Zum Beispiel können mit Hilfe eines rekombinanten Adenovirus-Vektors kleine inhibitorische RNA-Moleküle, die bevorzugt gegen Krebszellen gerichtet sind, wie RNA, die auf Telomeraseaktivität gerichtet ist, in vivo synthetisiert werden. Beispielhafte Sequenzen werden in US-Patentschrift Nr. 5,858,777 und GB 20890.4 bereitgestellt. Die RNA-Produktion aus dem Adenovirus kann mit verschiedenen Expressionskassetten erreicht werden. Zum Zweck der Hemmung des Zellwachstums werden RNA-Polymerase-III-Expressionskassetten basierend auf der Struktur von tRNA-Genen und anderen RNA-Polymerase-III-Transkripten, einschließlich des U6 snRNA-Genes, sowie RNA-Polymerase-II snRNP (U1, U2)-Transkripte bevorzugt, und zwar aufgrund ihrer Fähigkeit, hohe Niveaus an Transkripten zu produzieren.
  • Die vom hTERT-Promotor beschränkten Viren der Erfindung können so gestaltet sein, dass sie inhibitorische RNAs wie Antisense-Moleküle, die komplementär zu mehreren Regionen des hTR-Moleküls sind, einschließlich der Template-Region, exprimieren. Die inhibitorischen RNAs können auch Sequenzen bzw. Strukturen nachahmen, die in der RNA-Komponente der Telomerase (z.B. hTR) vorliegen, einschließlich (eine) potentielle Bindungsstelle(n) für TERT oder andere Telomerase-bezogene Proteine, die mit der RNA-Komponente interagieren könnten. Weitere Elemente können auch so gestaltet sein, dass sie inhibitorische RNAs so erzeugen, dass diese auf TERT-mRNA abzielen, indem deren normale Verarbeitung, Faltung, Modifikation, Transport bzw. Translation verhindert werden.
  • Weitere zytopathische virale Vektoren der Erfindung können so gestaltet sein, dass sie RNA-Moleküle mit Sequenzen erzeugen, die für den Zytoplasmaexport und die Translation in Peptide notwendig sind. Die so entstehenden Polypeptide oder Peptide können so gestaltet werden, dass sie auf Telomerasekomponenten oder andere Moleküle, die mit der Telomerase in Verbindung gebracht werden, gerichtet sind und damit die katalytische Telomeraseaktivität beeinflussen. Die Peptide, welche die Telomerase verhindern, werden auf einem hohen Niveau hergestellt, das parallel zur Menge an RNA ist. Peptide können zum Beispiel so gestaltet werden, dass sie die Dehnung der Aminosäuren in hTERT nachahmen, die an deren Bindung an hTR beteiligt sind, wodurch sie als Gegner in der Zusammensetzung einer funktionalen Telomerase agieren.
  • Die vom TERT-Promotor beschränkten viralen Vektoren der Erfindung können auch so gestaltet sein, dass sie Peptide oder Polypeptide für eine beliebige TERT-Domäne erzeugen, die an Interaktionen mit anderen Proteinen beteiligt ist, und Kontakte unterbrechen, die für die Telomerasefunktion essentiell sind. Weitere vom TERT-Promotor beschränkte Viren der Erfindung können so gestaltet sein, dass sie Polypeptide erzeugen, die an Telomerkomplexe binden und den Zugang bzw. das Andocken der Telomerase verhindern oder immunogene Peptide, teilweise TERT-Peptide, erzeugen.
  • Weitere vom TERT-Promotor beschränkte virale Vektoren der Erfindung können so gestaltet sein, dass sie Polypeptide so erzeugen, dass diese verschiedene Apoptose-induzierende Agenzien, beobachtet während des programmierten Zelltodes, nachahmen und dies könnte zum Einsetzen der Apoptose führen. Vom TERT-Promotor beschränkte Viren müssen nicht notwendigerweise zytopathisch sein. Das vom TERT-Promotor bedingt beschränkte Virus könnte verwendet werden, um beliebige Sequenzen oder ein beliebiges Element in einer beliebigen TERT-exprimierenden Zelle, wie einer Tumorzelle, zu verstärken.
  • Jede dieser Ausführungsformen kann mit den bedingt replikativen Viren der Erfindung bereitgestellt werden. Die TERT-Promotorstrukturelemente der Erfindung können auch in Gentherapievektoren verwendet werden, um die Telomeraseaktivierung zu verhindern, und führen zu spezifischer Mortalisierung oder dem Tod von Telomerase-positiven Zellen. Ähnlich können diese Gentherapieverfahren für die Behandlung einer genetischen Voreingenommenheit für Krebsarten verwendet werden.
  • Behandlung weiterer Leiden
  • Die vorliegende Erfindung bietet außerdem Zusammensetzungen und Verfahren, die für die Behandlung von Krankheiten und Krankheitsleiden (zusätzlich zu Krebs) von Nutzen sind, die durch Unter- oder Überexpression von Telomerase- oder TERT-Genprodukten gekennzeichnet sind. Beispiele sind Krankheiten der Zellproliferation, Krankheiten, die aus Zellseneszenz resultieren (insbesondere Alterungsprozesse und -kankheiten), immunologische Störungen, Unfruchtbarkeit und Immunfunktionsstörungen. Bestimmte Alterungskrankheiten sind durch Veränderungen gekennzeichnet, die mit Zellseneszenz aufgrund verkürzter Telomerlänge (verglichen mit jüngeren Zellen) in Verbindung stehen, welche sich aus der Abwesenheit (oder viel niedrigeren Niveaus) der Telomeraseaktivität in der Zelle ergibt. Die verkürzte Telomerlänge und verringerte replikative Kapazität tragen zu dieser Krankheit bei. Die Telomeraseaktivität (die zu erhöhter Telomerlänge führt) kann nach oben reguliert werden, indem die TERT-Promotoraktivität in der Zelle erhöht wird.
  • Die vorliegende Erfindung bietet durch die Bereitstellung von Verfahren und Zusammensetzungen zur Modulation der TERT-Promotoraktivität auch Verfahren zur Behandlung von Unfruchtbarkeit. Humane Keimlinienzellen (Spermatogonia-Zellen, ihre Vorläufer oder Abkömmlinge) sind in der Lage zu indefiniter Proliferation und durch hohe Telomeraseaktivität gekennzeichnet. Abnormale oder verminderte Niveaus von TERT-Genprodukten kann zu einer inadäquaten oder abnormalen Produktion von Spermatozoen führen, was wiederum in Unfruchtbarkeit oder Reproduktionsstörungen resultiert. Entsprechend kann die mit veränderter Telomeraseaktivität in Verbindung stehende Unfruchtbarkeit mit den hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen zur Erhöhung der TERT-Promotoraktivitätsniveaus behandelt werden. Da sich die Verhinderung der Telomerase negativ auf die Spermatogenese, Oogenese und die Lebensfähigkeit von Spermien und Eiern auswirken kann, können die Zusammensetzungen der Erfindung, die in der Lage sind, die hTERT- Promotoraktivität zu verhindern, entsprechend empfängnisverhütende Wirkungen haben, wenn sie zur Verringerung der hTERT-Niveaus in Keimlinienzellen eingesetzt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung Verfahren und nützliche Zusammensetzungen zur Verringerung des proliferativen Potentials von Telomerase-positiven Zellen wie aktivierten Lymphozyten und hämatopoietischen Stammzellen durch die Verringerung der TERT-Promotoraktivität. So stellt die Erfindung Mittel zur Verfügung, um eine Immunsuppression zu bewirken. Im Gegensatz dazu sind die Verfahren und Reagenzien der Erfindung von Nutzen bei der Immunstimulation durch die Erhöhung der TERT-Promotoraktivität (was zu einem gesteigerten proliferativen Potential führt) in Immunzellen, einschließlich hämatopoietischen Stammzellen (die vor dem therapeutischen Eingriff ein geringes Level an Telomerase oder keine Telomerase exprimieren).
  • Modulieren der TERT-Promotoraktivität
  • Wie aus der vorangegangenen Diskussion klar hervorgeht, kann die Modulation des Niveaus der TERT-Promotomanskriptionsaktivität (und somit das Niveau der Telomerase oder der Telomeraseaktivität einer Zelle) eine tiefgreifende Wirkung auf das proliferative Potential der Zelle haben und besitzt so großen Nutzen bei der Behandlung von Krankheiten. Diese Modulation kann entweder eine Verringerung oder eine Erhöhung der TERT-Promotoraktivität sein. Die die Promotoraktivität modulierenden Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können über eine Reihe von Mechanismen agieren. Die Erfindung ist jedoch nicht auf einen bestimmten Aktionsmechanismus beschränkt.
  • Zum Beispiel kann die TERT-Promotoraktivität durch Einzelstrang-Antisense-Sequenzen verringert oder erhöht werden, die direkt an die TERT-Promotorsequenzen binden. Dies führt zu einer Verringerung der Affinität oder Hemmung der trans-aktiven Transkriptionsregulationsfaktoren, die an kritische TERT-Promotorsequenzen (TATA-Boxen, CAAT-Boxen, u. ä.) binden. Wenn das durch einen trans-aktiven Faktor gebundene cis-aktive Element inhibitorische Aktivität aufweist, würde die Bindung des Oligonukleotides in einer Aufwärts-Regulierung der TERT-Transkription resultieren. Weist die Promotorsequenz, wenn sie durch einen trans-aktiven Faktor gebunden ist, im Gegensatz dazu nach oben regulierende Aktivität auf, würde die Bindung des Oligonukleotides zu einer Abwärts-Regulierung der TERT-Transkription führen. In einer weiteren Ausführungsform binden Doppelstrang-Oligonukleotide, welche die TERT-Promotorsequenzen darstellen, direkt an trans-aktive Transkriptionsmodulationselemente und hindern sie so daran, ihre entsprechenden cis-aktiven Elemente zu binden. Zusammenfassend kann die TERT-Promotoraktivität durch einen beliebigen mehrerer Mechanismen oder eine Kombination von Mechanismen gesteigert oder verringert werden. Dazu gehören alle dem Fachmann beim Lesen dieser Darlegung offensichtlichen Mittel.
  • Die cis-aktiven Transkriptionsregulationssequenzen der Erfindung können auch als Oligonukleotide verwendet werden, welche bei Einführung in eine Zelle trans-aktive Regulationsfaktoren binden können, um die TERT-Transkription in vivo zu modulieren. Diese Oligonukleotide können über ein geeignetes Verabreichungsschema in Zielzellen eingebracht werden oder sie können durch rekombinierte Expressionssysteme (Vektoren, Viren, u. ä.) in vivo synthetisiert werden.
  • Oligonukleotide und weitere pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Antisense-Oligonukleotide, welche zu TERT-Promotorsequenzen hybridisieren, verhindern die Bindung von trans-aktiven Transkriptionsregulationsagenzien an kritische TERT-Promotorsequenzen. Weiters erfolgt eine Aktivierung oder Repression der TERT-Transkriptionsaktivität, je nachdem ob die Promotorsequenz nach unten bzw. nach oben regulierend ist. So bietet die Erfindung Antisense-Oligonukleotide, die auf (cis-aktive) TERT-Promotorbindungsstellen für c-Myc (die „E-Box" oder „Myc/Max-Bindungsstellen"), SP1, das Y-Genprodukt (SRY) HNF-3β, HNF-5, TFIID-MBP, E2F, c-Myb, TATA-Boxen, CAAT-Boxen und weitere Regulationselemente gerichtet sind.
  • TERT-Polynukleotide können durch direkte chemische Synthese hergestellt werden. Die chemische Synthese wird normalerweise zur Herstellung von Oligonukleotiden und Polynukleotiden verwendet, welche nicht standardisierte Nukleotide enthalten (Sonden, Primer und Antisense-Oligonukleotide), obwohl auch Nukleinsäuren, welche nur Standard-Nukleotide enthalten, hergestellt werden können. Die direkte chemische Synthese von Nukleinsäuren kann zum Beispiel durch das Phosphotriester-Verfahren von Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; das Phosphodiester-Verfahren von Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; das Diethyl-Phosphoramidit-Verfahren von Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859 und das Solid-Support-Verfahren aus US-Patentschrift Nr. 4,458,066 erreicht werden. Die chemische Synthese erzeugt normalerweise ein Einzelstrang-Oligonukleotid, welches durch Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz oder durch Polymerisation mit einer DNA-Polymerase und einem Oligonukleotid-Primer unter Verwendung des Einzelstranges als Schablone in Doppelstrang-DNA umgewandelt werden kann. Ein Fachmann wird erkennen, dass während die chemische Synthese von DNA oft auf Sequenzen beschränkt ist, die kürzer sind als etwa 100 oder 150 Basen, durch die Ligation von kürzeren Sequenzen oder durch aufwändigere synthetische Verfahren längere Sequenzen erhalten werden können. Man wird verstehen, dass die Polynukleotide und Oligonukleotide der Erfindung mit Hilfe von nicht standardisierten Basen (andere als Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin) oder nicht standardisierten Hauptketten-Strukturen hergestellt werden können, um gewünschte Eigenschaften (erhöhte Nuklease-Resistenz, engere Bindung, Stabilität oder eine gewünschte Tm) bereitzustellen. Zu Methoden, um Oligonukleotide nukleaseresistent zu machen, gehören die in der PCT-Veröffentlichung WO 94/12633 beschriebenen. Eine Vielzahl nützlicher modifizierter Oligonukleotide kann hergestellt werden, einschließlich Oligonukleotide, welche eine Peptid-Nukleinsäure- (PNA) Hauptkette (Nielsen (1991) Science 254:1497) aufweisen, oder 2-O-Methyl-Ribonukleotide, Phosphorothioat-Nukleotide, Methyl-Phosphonat-Nukleotide, Phosphotriester-Nukleotide, Phosphorothioat-Nukleotide und Phosphoramidate beinhalten. Noch andere nützliche Oligonukleotide können Alkyl- und Halogen-substituierte Zuckerkomponenten enthalten, welche eines der folgenden an der 2'-Position aufweisen: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH3O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 oder O(CH2)nCH3, wobei n von 1 bis etwa 10 ist; C1 bis C10 ist Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, Alkaryl oder Aralkyl; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- oder N-Alkyl; O-, S- oder N-Alkenyl; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl; Amino-Alkylamino; Polyalkylamino; substituiertes Silyl; eine RNA-Spaltgruppe; eine Cholesteryl-Gruppe; eine Folat-Gruppe; eine Reporter-Gruppe; einen Interkalator; eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonukleotides oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonukleotides und anderer Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Folat, Cholesterol oder andere Gruppen, welche die Oligonukleotid-Aufnahme vereinfachen, wie Lipid-Analoga, können direkt oder über einen Linker an der 2'-Position eines jeden Nukleosides bzw. an der 3'- oder 5'-Position des 3'-Terminal- oder 5'-Terminal-Nukleosides konjugiert werden. Es können ein oder mehrere solcher Konjugate verwendet werden. Oligonukleotide können auch Zucker-Nachahmer wie Cyclobutyle anstelle der Pentofuranosyl-Gruppe besitzen. Zu weiteren Ausführungsformen kann mindestens eine modifizierte Basenform oder „Universalbase", wie Inosin, gehören, oder der Einschluss von anderen, nicht standardisierten Basen wie Queosin und Wybutosin sowie Acetyl-, Methyl- Thio- und ähnlich modifizierten Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin, welche von endogenen Endonukleasen nicht so leicht erkannt werden. Die Erfindung bietet weiters Oligonukleotide mit Hauptketten-Analoga wie Phosphodiester, Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Methylphosphonat, Phosphoramidat, Alkyl-Phosphotriester, Sulfamat, 3'-Thioacetal, Methylen(methylimino), 3'-N-Carbamat, Morpholino-Carbamat, Chiral-Methyl-Phosphonate, Nukleotide mit Kurzketten-Alkyl- oder Cycloalkyl- Intersugar-Verknüpfungen, Kurzketten-Heteroatom- oder heterozyklische Intersugar-(„Hauptketten"-) Verknüpfungen oder CH2-NH-O-CH2, CH2-N(CH3)-O CH2, CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 und O-N(CH3)-CH2-CH2 Hauptketten (wobei der Phosphodiester O-P-O-CH2 ist) oder Mischungen daraus. Weiters von Nutzen sind Oligonukleotide mit Morpholino-Hauptkettenstrukturen (US-Patentschrift Nr. 5,034,506).
  • Während die Erfindung nicht auf einen bestimmten Mechanismus beschränkt ist, können die Oligonukleotide der Erfindung auch an Doppelstrang- oder Duplex-TERT-Promotorsequenzen binden. Die Bindung kann in einer gefalteten Region erfolgen, wodurch eine Triple-Helix oder „Triplex"-Nukleinsäure gebildet wird. Die Triple-Helix-Bildung führt zur Verhinderung der TERT-Promotoraktivität durch Unterbrechung der sekundären Struktur der Promotorsequenz, was zu einer neuen Konformation führt, welche der trans-aktive Faktor nicht mit ausreichender Affinität binden kann, um eine transkriptionsmodifizierende Wirkung zu erreichen. Alternativ beeinträchtigt die Triple-Helix-Bildung (induziert durch die Bindung des Antisense-Oligonukleotides der Erfindung) die Fähigkeit der Doppelhelix, sich ausreichend zu öffnen, damit die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen trans-aktiven Molekülen stattfinden kann. Die Triplex-Oligonukleotid- und Polynukleotid-Konstruktion ist in Cheng (1988) J. Biol. Chem. 263:15110; Ferrin (1991) Science 354:1494; Ramdas (1989) J. Biol. Chem. 264:17395; Strobel (1991) Science 254:1639; Rigas (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9591; Carr (1994) Molecular and Immunological Approaches, Futura Publishing Co. Mt. Kisco NY; Rininsland (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5854; Perkins (1998) Biochemistry 37:11315–11322 beschrieben.
  • Die therapeutischen Nukleinsäuren und Verfahren der Erfindung beinhalten die Verabreichung von Oligonukleotiden oder Polynukleotiden, die so funktionieren, dass sie die TERT-Promotoraktivität unter in vivo physiologischen Bedingungen verhindern oder stimulieren. In einer Ausführungsform sind diese Nukleinsäuren Einzelstrang-Antisense-Sequenzen, die in der Lage sind, an Promotorsequenzen zu binden. In einer alternativen Ausführungsform sind es Doppelstrang-Nukleinsäuren, die in der Lage sind, trans-aktive Transkriptionsregulationsfaktoren zu binden. Sie sollten unter physiologischen Bedingungen für einen bestimmten Zeitraum ausreichend stabil sein, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Modifizierte Nukleinsäuren können von Nutzen sein, um eine solche Stabilität zu erzeugen sowie um die Bereitstellung des Oligonukleotides auf das/die gewünschte Gewebe, Organ oder Zelle zu richten. Oligo- und Polynukleotide können direkt als ein Medikament in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung bereitgestellt werden oder indirekt mit Hilfe der Einführung eines Nukleinsäureexpressionssystems, welches die hTERT-Promotor-modulierenden Oligonukleotide in einer Zelle rekombinant erzeugen kann. In einer Ausführungsform binden Oligonukleotide direkt an cis-aktive Sequenzen oder alternativ an trans-aktive Regulationsfaktoren. Eine Ausführungsform nutzt die Tatsache, dass der TERT-Promotor nur in einem sehr begrenzten Bereich von Zelltypen, insbesondere einschließlich Krebszellen, relativ aktiv ist.
  • Oligonukleotide oder Expressionsvektoren können über Liposome, Immunoliposome, Ballistik, direkte Aufnahme in Zellen und ähnliches verabreicht werden. Zur Behandlung von Krankheiten werden die Oligonukleotide der Erfindung einem Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht, welches eine Menge ist, die ausreicht, um die Symptome der Krankheit zu verbessern oder die hTERT-Promotoraktivität in der Zielzelle zu modulieren (wobei die Telomeraseaktivität beeinträchtigt wird). Nützliche Verfahren für die Bereitstellung von Oligonukleotiden zu therapeutischen Zwecken sind in US-Patentschrift Nr. 5,272,065 beschrieben. Die Telomeraseaktivität kann durch ein TRAP-Assay oder ein anderes geeignetes Assay der biologischen Telomerasefunktion, wie in anderen Veröffentlichungen ausführlich behandelt, gemessen werden.
  • Die Erfindung bietet pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Nukleinsäuren aufweisen, die TERT-Promotoren enthalten (Polynukleotide, Expressionsvektoren, Gentherapiestrukturelemente), wobei die Nukleinsäuren allein oder in Kombination mit zumindest einem anderen Agens, wie z.B. einer Stabilisierungsverbindung, einem Verdünnungsmittel, einem Träger, einem Zell-Targeting-Agens oder einem anderen aktiven Inhaltsstoff oder Agens auftreten. Das therapeutische Agens der Erfindung kann in jedem sterilen, bio-kompatiblen Träger verabreicht werden, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose und Wasser. Jedes dieser Moleküle kann einem Patienten allein verabreicht werden oder in Kombination mit anderen Agenzien, Medikamenten oder Hormonen, in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen es mit geeigneten Bindemitteln, Adjuvanzien bzw. pharmazeutisch akzeptablen Trägern gemischt ist.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann mit jedem möglichen Mittel verabreicht werden. Zu Verfahren der parenteralen Bereitstellung gehören die topische, intraarteriale, intramuskuläre (IM), subkutane (SC), intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse (IV) intraperitoneale (IP) oder intranasale Verabreichung. Weitere Einzelheiten zu Methoden der Formulierung und Verabreichung finden sich in der letzten Ausgabe von Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton PA); PCT-Veröffentlichung WO 93/23572.
  • Zu pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung gehören TERT-enthaltende Nukleinsäuren in einer wirksamen Menge, um den beabsichtigten Zweck zu erreichen. „Therapeutisch wirksame Menge" oder „pharmakologisch wirksame Menge" sind anerkannte Phrasen und beziehen sich auf die Menge eines Agens, die ausreichend ist, um das beabsichtigte pharmakologische Ergebnis zu erzielen. Zum Beispiel ist eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die ausreichend ist, um eine Krankheit oder ein Leiden zu behandeln oder die Symptome der behandelten Krankheit zu lindern. Zu nützlichen Assays zur Sicherstellung einer wirksamen Menge für eine gegebene Applikation gehören die Messung der Wirkung auf die endogene TERT-Promotoraktivität und Telomeraseaktivität in einer Zielzelle. Die tatsächlich verabreichte Menge ist abhängig von dem Individuum, das die Behandlung erhält und ist vorzugsweise eine optimierte Menge, so dass die gewünschte Wirkung ohne signifikante Nebenwirkungen erreicht wird. Die therapeutische wirksame Dosis kann anfänglich in Zellkultur-Assays oder in einem geeigneten Tiermodell geschätzt werden. Das Tiermodell wird auch verwendet, um geeignete Dosierungsbereiche und Verabreichungswege bei Menschen abzuschätzen. So liegt die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis gut innerhalb der Fähigkeiten eines Fachmanns.
  • Zelllinien und Tiere mit modifizierten Promotorsequenzen
  • Die meisten Wirbeltierzellen altern nach einer begrenzten Anzahl an Teilungen in der Kultur (~50 bis 100 Teilungen). Die Zellen bestimmter Varianten sind jedoch in der Lage, sich unbegrenzt in der Kultur zu teilen (z.B. HeLa-Zellen, 293-Zellen) und sind aus diesem Grund nützlich für die Forschung und gewerbliche Anwendungen. Normalerweise sind diese unsterblichen Zelllinien aus spontan entstehenden Tumoren abgeleitet oder entstehen durch Transformation, wenn sie einem Onkogen, Strahlung oder einem/r Tumor-induzierenden Virus oder Chemikalie ausgesetzt werden. Leider steht nur eine begrenzte Auswahl an Zelllinien, insbesondere an humanen Zelllinien, die eine differenzierte Zellfunktion zeigen, zur Verfügung. Außerdem sind viele derzeit verfügbare unsterbliche Zelllinien durch chromosomale Abnormalitäten gekennzeichnet (Aneuploidie, Gen-Neuordnungen oder Mutationen). Weiters sind viele langetablierte Zelllinien relativ undifferenziert. Also besteht Bedarf an den TERT-Promotor-aktivierenden Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung zur Erzeugung neuer unsterblicher Zelllinien, insbesondere unter Verwendung von Zellen humanen Ursprungs, wobei hTERT-Promotor-aktivierende Zusammensetzungen und Verfahren bevorzugt werden.
  • Die „unsterblich gemachten Zellen" der Erfindung sind nicht auf diejenigen beschränkt, die unbegrenzt proliferieren, sondern beinhalten auch Zellen, die verglichen mit ähnlichen Zellen, deren TERT-Promotor nicht nach oben reguliert wurde, eine erhöhte proliferative Kapazität aufweisen. Je nach Zelltyp kann die gesteigerte proliferative Kapazität Proliferation für mindestens etwa 50, etwa 100, etwa 150, etwa 200 oder etwa 400 oder mehr Generationen oder für mindestens etwa 3, etwa 6, etwa 12, etwa 18, etwa 24 oder etwa 36 oder mehr Monate in Kultur bedeuten.
  • Zu den Verwendungsmöglichkeiten für Zellen mit erhöhter proliferativer Kapazität gehören die Produktion natürlicher Proteine und rekombinanter Proteine (therapeutische Polypeptide wie Erythropoietin, humanes Wachstumshormon, Insulin und ähnliche) oder Antikörper, für die eine stabile, genetisch normale Zelllinie bevorzugt wird. Eine weitere Verwendung ist der Austausch von kranken/m oder geschädigten/m Zellen oder Gewebe. Zum Beispiel können autologe Immunzellen, die mit einer TERT-Promotorsequenz der Erfindung unsterblich gemacht wurden nach aggressiver Krebstherapie wie der Gesamtkörperbestrahlung für den Zellaustausch bei einem Patienten verwendet werden. Eine weitere Verwendung für unsterblich gemachte Zellen ist die ex vivo Produktion von „künstlichen" Geweben oder Organen zur therapeutischen Verwendung. Eine weitere Verwendung für solche Zellen ist das Screening oder die Validierung von Medikamenten wie Telomerase-verhindernden Medikamenten, oder zur Verwendung bei der Herstellung von Impfstoffen oder biologischen Reagenzien. Weitere Verwendungsmöglichkeiten der Zellen der Erfindung sind für den Fachmann offensichtlich.
  • Die Erfindung bietet außerdem nicht-humane transgene Tiere, welche heterologe TERT oder rekombinierte Strukturelemente aufweisen, welche einen endogenen TERT-Promotor enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die transgenen Tiere der Erfindung einen TERT-Promotor, der ein heterologes Gen wie eine Reportergen-Codiersequenz stimuliert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein hTERT-Promotor der Erfindung wirkungsmäßig mit einem Reportergen in einer transgenen Maus verbunden. Alternativ ist ein mTERT-Promotor wirkungsmäßig mit einem Reportergen in einer transgenen Maus verbunden. Diese transgenen Tiere sind sehr nützlich als in vivo Tiermodelle zum Screening nach Modulatoren der TERT-Transkriptionsaktivität. Das Einbringen von hTERT-, mTERT- oder anderen TERT-Promotoren in Tiere, um transgene Modelle zu erzeugen, wird auch verwendet, um die Konsequenzen von Mutationen oder Deletionen auf die Transkriptionsregulationsregionen zu bewerten.
  • In einer Ausführungsform funktioniert das endogene TERT-Gen in diesen Mäusen noch und die Wildtyp- (native) Telomeraseaktivität kann noch immer vorhanden sein. Ein TERT-Promotor der Erfindung wird verwendet, um eine Expression eines exogenen TERT-Strukturelements auf einem hohen Niveau zu stimulieren; das endogen hergestellte mTERT-Protein kann konkurrierend mit dem eingeführten exogenen TERT-Protein ersetzt werden. Dieses transgene Tier (welches eine funktionale endogene Telomeraseaktivität aufrechterhält) wird in Situationen bevorzugt, in denen es wünschenswert ist, die „normale" endogene Telomerasefunktion und Telomerstruktur aufrechtzuerhalten; in anderen Situationen, in denen es wünschenswert ist, dass die gesamte Telomeraseaktivität durch das eingeführte exogene TERT-Protein erfolgt, kann eine mTERT-Knockout-Linie verwendet werden.
  • Die Promotor-Funktion, und in einer bevorzugten Ausführungsform, die hTERT-Promotor-Funktion kann mit diesen transgenen Tieren bewertet werden. Veränderungen der TERT-Promotoren lassen sich konstruieren, die TERT oder ein Reportergen stimulieren, um ihr/e Funktions- und Expressionsmuster und -eigenschaften zu bewerten (die Erfindung bietet auch Strukturelemente und Tiere bzw. Verfahren zur Genexpression stimuliert von einem TERT-Promotor durch transiente Transfektion).
  • In einer Ausführungsform werden die TERT-Promotoren und -Reagenzien der Erfindung verwendet, um Mauszellen und transgene Tiere zu erzeugen, in denen der endogene TERT-Promotor entfernt, modifiziert, ersetzt oder gehemmt ist. Zum Beispiel können TERT-Promotorsequenzen entweder auf einem oder beiden Allelen entfernt, modifiziert oder gehemmt sein. Die Zellen oder Tiere können mit einem Wildtyp- oder modifizierten TERT-Promotor oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, einer exogenen TERT in Form von hTERT rekonstituiert sein.
  • Die Herstellung einer/s „Knockout"-Zelle oder -Tieres basiert auf der Voraussetzung, dass das Niveau der Expression eines bestimmten Genes in einer Säugetierzelle durch das Einbringen einer neuen DNA-Sequenz, welche einen Teil der DNA-Sequenz des zu unterdrückenden Gens/Promotors unterbrechen soll, in das Genom verringert oder komplett außer Kraft gesetzt werden kann. Um die Expression eines endogenen Promotors zu verhindern, können einfache Mutationen, welche den Promotor verändern oder stören, geeignet sein. Um die Expression nach oben zu regulieren kann ein nativer TERT-Promotor mit einem heterologen oder mutierten TERT-Promotor ersetzt werden, welcher höhere Transkriptionslevels induziert, oder mit mehreren Kopien transgener TERT-Promotoren. Auch die „Gen-Trap-Insertion" kann eingesetzt werden, um ein Wirtsgen zu stören und Maus-Embryonenstammzellen (ES) können verwendet werden, um wie hierin und in Holzschu (1997) Transgenic Res. 6:97–106 beschrieben, transgene Knockout-Tiere zu erzeugen.
  • Auch spezifisch für die Integration durch homologe Rekombination geschaffene Vektoren, welche TERT-Promotorsequenzen aufweisen, werden von der Erfindung bereitgestellt. Zu wichtigen Faktoren zur Optimierung der homologen Rekombination gehören der Grad der Sequenzidentität und die Länge der Homologie zu chromosomalen Sequenzen. Die spezifische Sequenz, welche die homologe Rekombination mediiert, ist auch wichtig, weil die Integration in Transkriptions-aktiver DNA viel einfacher abläuft. Verfahren und Materialien zum Aufau homologer Targeting-Strukturelemente werden von Mansour (1988) Nature 336:348; Bradley (1992) Bio/Technology 10:534; US-Patentschrift Nr. 5,627,059; 5,487,992; 5,631,153 und 5,464,764 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform exprimieren Zell- und transgene Tiermodelle den TERT-Promotor (insbesondere den hTERT-Promotor) wirkungsmäßig mit einem Reportergen verbunden. Die Zelle oder das Tier kann ein TERT-Promotor-„Knockout" sein oder sie/es kann die endogene TERT-Promotoraktivität beibehalten. Das Einfügen der TERT-Promotor-enthaltenden exogenen Sequenz erfolgt normalerweise durch homologe Rekombination zwischen komplementären Nukleinsäuresequenzen. So ist die exogene Sequenz, welche normalerweise ein hTERT- oder mTERT-Promotor dieser Erfindung ist, ein Teil des Zielgenes, das modifiziert werden soll, wie z.B. Exon-, Intron- oder Transkriptionsregulationssequenzen oder eine beliebige Genomsequenz, welche in der Lage ist, das Level der Expression des Zielgenes zu beeinträchtigen, oder eine Kombination davon. Das Strukturelement kann auch an anderen Stellen in das Genom eingefügt werden. Gen-Targeting über homologe Rekombination in pluripotenten embryonalen Stammzellen ermöglicht es, exakt die Genomsequenz von Interesse zu modifizieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann die eingefügte TERT-Promotorsequenz (modifiziert oder Wildtyp) eine endogene TERT-Promotorsequenz ersetzen oder stören. Eine neu eingefügte TERT-Promotorsequenz kann so bearbeitet werden, dass sie eine höhere oder geringere Transkriptionsaktivität hat, auf neue trans-aktive Transkriptionsmodulationsagenzien reagiert und ähnliches.
  • Die Störung einer endogenen TERT-Promotorsequenz verringert normalerweise die Transkription der TERT oder setzt sie außer Kraft („Knockout"). In einer Ausführungsform wird das TERT-Promotor-„Knockout" durch Deletion oder Störung durch homologe Rekombination des endogenen hTERT-Promotors vorbereitet. Homologe Rekombination und andere Mittel zur Veränderung (und zum „Knockout") der Expression endogener Sequenzen sind in Moynahan (1996) Hum. Mol. Genet. 5:875; Moynahan (1996) Hum. Mol. Genet. 5:875; Baudin (1993) Nucl. Acids Res. 21:3329; Wach (1994) Yeast 10:1793; Rothstein (1991) Methods Enzymol. 194:281; Anderson (1995) Methods Cell Biol. 48:31; Pettitt (1996) Development 122:4149–4157; Ramirez-Solis (1993) Methods Enzymol. 225:855; Thomas (1987) Cell 51:503; Couldrey (1998) Dev. Dyn. 212:284–292; Holzschu (1997) Transgenic Res. 6:97–106; US-Patentschrift Nr. 5,464,764; 5,631,153; 5,487,992; 5,627,059 und 5,272,071; WO 91/09955; WO 93/09222; WO 96/29411; WO 95/31560; WO 91/12650 beschrieben. Bei der TERT-Gentherapie nützliche Vektoren können viral oder nicht-viral sein. Sie können weitere Regulations- oder Verarbeitungssequenzen aufweisen. Lyddiatt (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:177–85.
  • Die Erfindung bietet die Abgabe der Expressionssysteme in Zellen oder Geweben in vivo oder ex vivo. Für die ex vivo Therapie können Vektoren in Zellen eingefügt werden, die dem Patienten entnommen und klonal für autologe Rücktransplantation in den gleichen Patienten fortgepflanzt wurden (US-Patentschrift Nr. 5,399,493 und 5,437,994). Zu Zellen, die für die TERT-Promotor-Gentherapie ausgerichtet werden können, die auf eine Erhöhung der Telomeraseaktivität einer Zielzelle abzielt, gehören, jedoch nicht darauf beschränkt, embryonale Stamm- oder Keimzellen, insbesondere Primaten- oder humane Zellen, hämatopoietische Stammzellen (AIDS und nach Chemotherapie), vaskuläre Endothelzellen (kardiale und zerebrale vaskuläre Erkrankungen), Hautfibroblasten und basale Haut-Keratinozyten (Wundheilung und Verbrennungen), Chondrozyten (Arthritis), Gehirn-Astrozyten und Mikroglialzellen (Alzheimer), Osteoblasten (Osteoporose), Netzhautzellen (Augenkrankheiten) und Pankreasinselzellen (Diabetes Typ I).
  • Die exogene Sequenz ist normalerweise in ein Konstrukt eingefügt, meist auch mit einem Marker-Gen zur Unterstützung der Erkennung des Knockout-Konstrukt bzw. eines Auswahlgenes. Das Knockout-Konstrukt ist in eine Zelle eingefügt, normalerweise eine embryonale Stammzelle (ES), meist durch homologe Rekombination. Die so entstehende transformierte Zelle kann ein Einzelgen-Knockout (ein Haplotyp) oder ein Doppelgen-Knockout (homozygot) sein. Das Knockout-Konstrukt kann aufgrund der zufälligen Natur homologer Rekombinationsereignisse an einer oder mehreren Stellen im Genom der Zelle integriert werden, jedoch findet die Rekombination zwischen Regionen mit Sequenzkomplementarität statt. Normalerweise integrieren weniger als ein bis fünf Prozent der ES-Zellen, die das Knockout-Konstrukt aufnehmen, tatsächlich exogene DNA in diesen Komplementaritätsregionen; so ist normalerweise eine Identifikation und Auswahl von Zellen mit dem gewünschten Phänotyp notwendig und normalerweise wird zu diesem Zweck meist ein Auswahl- oder Marker-Gen in das Konstrukt eingefügt. Zellen, die das Konstrukt aufgenommen haben, werden vor der Einbringung der genetisch manipulierten Zelle in einen sich entwickelnden Embryo ausgewählt: zum Beispiel unterliegen die Zellen der Positivauswahl (zum Beispiel mittels G418, zur Auswahl nach Neomycin-Resistenz) und Negativauswahl (zum Beispiel mittels FIAU zum Ausschluss von Zellen, denen die Thymidinkinase fehlt). Zu Auswahl- und Marker-Methoden gehören die Antibiotikaresistenz-Auswahl oder die β-Galaktosidase-Markerexpression, wie an anderer Stelle in dieser Darlegung beschrieben.
  • Nach der Auswahl manipulierter Zellen mit dem gewünschten Phänotyp, wie der vollständigen oder teilweisen Unfähigkeit einen endogenen TERT-Promotor zu exprimieren, oder der Expression des exogenen TERT-Promotors (wie hTERT-Promotoraktivität), werden die Zellen in einen Maus-Embryo eingebracht. Das Einbringen kann durch eine Vielzahl von Methoden erfolgen, wie. z.B. Mikroinjektion, bei der etwa 10 bis 30 Zellen in eine Mikropipette aufgenommen und in Embryos injiziert werden, die sich im richtigen Entwicklungsstadium befinden, um die ES-Zelle in die sich entwickelnde embryonale Blastozyste zu integrieren, und zwar etwa im achten Zellstadium, welches bei Mäusen bei etwa 3,5 Tagen nach der Befruchtung liegt. Die Embryonen werden durch Perfusion des Uterus schwangerer Weibchen entnommen. Nachdem die ES-Zelle in den Embryo eingebracht wurde, wird sie in den Uterus einer pseudo-schwangeren Pflegemutter implantiert, welche normalerweise durch Paarung mit vasektomierten Männchen der gleichen Spezies vorbereitet wird. Bei Mäusen ist die optimale Zeit zum Implantieren etwa zwei bis drei Tage nach Eintreten der Pseudo-Schwangerschaft. Nachkommen werden auf die Integration der TERT-Nukleinsäure-Sequenzen und den modifizierten Promotoraktivitäts-Phänotyp untersucht. Nachkommen, welche den gewünschten Phänotyp aufweisen werden miteinander gekreuzt, um einen homozygoten Knockout zu erzeugen. Sollte unklar sein, ob Keimlinienzellen der Nachkommen modifizierte Promotoren haben, können sie mit einem parentalen oder einem anderen Stamm und den Nachkommen gekreuzt werden, die auf Heterozygotie der gewünschten Merkmale untersucht wurden. Die Heterozygoten können miteinander gekreuzt werden, um Mäuse zu erzeugen, die homozygot für die modifizierte TERT-Genomsequenz sind. Bijvoet (1998) Hum. Mol. Genet. 7:53–62; Moreadith (1997) J. Mol. Med. 75:208–216; Tojo (1995) Cytotechnology 19:161–165; Mudgett (1995) Methods Mol. Biol. 48:167–184; Longo (1997) Transgenic Res. 6:321–328; US-Patentschrift Nr. 5,616,491 (Mak, et al.); 5,464,764; 5,631,153; 5,487,992; 5,627,059; 5,272,071 und WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411, WO 95/31560 und WO 91/12650. So sorgt die Erfindung für die Verwendung der TERT-Promotorsequenz-enthaltenden Reagenzien der Erfindung zur Herstellung von „Knockout"-Mauszellen und -Tieren, transgenen Tieren und deren Nachkommenschaft. Diese Zellen und Tiere können mit Wildtyp- oder modifizierten endogenen mTERT-Promotoren oder exogenen TERT-Promotoren wie hTERT weiter rekonstituiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung bietet weiters Verfahren und Reagenzien zur Karyotypanalyse, Genamplifikationsdetektion oder anderen Chromosomen-Analysen mit Hilfe von Sonden, welche die TERT-Promotorsequenzen der Erfindung aufweisen. In verschiedenen Ausführungsformen werden Amplifikationen (Veränderung in der Anzahl der Kopien), Deletionen, Einschübe, Substitutionen oder Veränderungen in der Chromosomenposition (Translokation) der Gene, welche den TERT-Promotor enthalten, erkannt. Diese können mit der Gegenwart einer pathologischen Kondition oder einer Prädisposition für die Entwicklung einer pathologischen Kondition (wie Krebs) korreliert werden. So können diese Informationen in einer diagnostischen oder prognostischen Art und Weise verwendet werden. Zum Beispiel könnte ein Translokationsereignis anzeigen, dass die Aktivierung der TERT-Expression in einigen Fällen durch das Ersetzen des gesamten oder eines Teiles des TERT-Promotors mit einem anderen Promotorelement auftritt, welches in einer ungeeigneten Art und Weise auf die TERT-Transkription gerichtet ist. Ferner können die Verfahren und Reagenzien der Erfindung verwendet werden, um diese ungeeignete TERT-Aktivierung zu verhindern.
  • Die Bestimmung der Chromosomenposition der TERT-Promotorsequenz kann auch für die Analyse der TERT-Genrepression in normalen Körperzellen von Nutzen sein, zum Beispiel, ob die Position Teil der Nichtexpression von Heterochromatin ist. Nuklease-Hypersensibilitätsassays zur Unterscheidung von Heterochromatin und Euchromatin sind in Wu (1979) Cell 16:797; Groudine (1982) Cell 30:131; Gross (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:159 beschrieben. Verfahren zum Analysieren von Karyotypen werden in Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 35:9138; EPO Pub. Nr. 430,402; Choo, ed., Methods in Molecular Biology Vol. 33: In Situ Hybridization Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1994; Kallioniemi (1992) Science 258:818) behandelt.
  • TERT-Promotor-Bindungsproteine und Transkriptionsregulationsfaktoren
  • Zusätzlich zu den hierin enthaltenen neuartigen TERT-Promotorsequenzen und der Identifikation der cis-aktiven Transkriptionsregulationssequenzen stellt die Erfindung neuartige in vitro und zellbasierte in vivo Assay-Systeme für das Screening nach TERT-Promotor-Bindungsproteinen (trans-aktive Transkriptionsregulationsfaktoren) mit Hilfe der Nukleinsäuren der Erfindung zur Verfügung. Es sind viele Assays verfügbar, die auf Nukleinsäure-Bindungsproteine untersuchen, und alle können angepasst und mit den von der Erfindung bereitgestellten neuartigen Sequenzen verwendet werden.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung bietet ein Verfahren zum Screening und zur Isolierung einer TERT-Promotor-Bindungsstruktur durch Kontaktieren einer TERT-Promotorsequenz der Erfindung (insbesondere einer identifizierten cis-aktiven Regulationssequenz) mit einer Testverbindung und Messen der Fähigkeit der Testverbindung, die ausgewählte Nukleinsäure zu binden. Die Testverbindung kann jedes Agens sein, welches in der Lage ist, spezifisch an eine TERT-Promotoraktivität zu binden, einschließlich Verbindungen die in kombinatorischen Bibliotheken, einem Zellextrakt, einem Kernextrakt, einem Protein oder Peptid verfügbar sind. Ist ein TERT-Transkriptionsaktivierungsprotein das Ziel der Suche, wird normalerweise eine Zelle mit Telomeraseaktivität ausgewählt.
  • Es können verschiedene Methoden verwendet werden, um Polypeptide zu identifizieren, welche sich spezifisch an den TERT-Promotor binden, zum Beispiel Mobilitätsverschiebungs-DNA-Bindungs-Assays, Methylierungs- und Uracil-Interferenz-Assays, DNase- und Hydroxylradikal-Footprinting-Analyse, Fluoreszenz-Polarisation und UV-Crosslinking oder chemische Cross-Linker. Für einen allgemeinen Überblick siehe Ausubel (Kapitel 12, DNA-Protein-Interaktionen). Eine Methode zur Isolierung mitverbundener Proteine, einschließlich Nukleinsäure und DNA/RNA-Bindungsproteine, beinhaltet die Verwendung von UV-Crosslinking oder chemischen Cross-Linkern, einschließlich spaltbare Cross-Linker-Dithiobis (Succinimidylpropionat) und 3,3'-Dithiobis (Sulfosuccinimidylpropionat); McLaughlin (1996) Am. J. Hum. Genet. 59:561–569; Tang (1996) Biochemistry 35:8216–8225; Linger (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10712; Chodosh (1986) Mol. Cell. Biol. 6:4723–4733. In vielen Fällen besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass ein spezifisches Protein (oder eine verwandtes Protein) an eine hTERT-Promotorsequenz wie eine Myc-, NF-Kappa B-, EF2-, Sp1-, AP-1- oder CAAT-Box-Bindungsstelle binden kann. Bei diesen Szenarien, bei denen ein Antikörper bereits verfügbar sein kann oder er leicht erzeugt werden kann, kann die Co-Immunpräzipitations-Analyse verwendet werden, um TERT-Promotor-bindende, trans-aktive Faktoren zu identifizieren und zu isolieren. Der trans-aktive Faktor kann durch Peptidsequenzanalyse charakterisiert werden. Nach der Identifizierung kann die Funktion des Proteins zum Beispiel durch Konkurrenzexperimente, Faktordepletionsexperimente mittels eines Antikörpers, der spezifisch für den Faktor ist, oder durch Konkurrenz mit einem Mutanten-Faktor bestätigt werden.
  • Alternativ können TERT-Promotor-Affinitätssäulen erzeugt werden, um auf potentielle TERT-Bindungsproteine zu untersuchen. In einer Abwandlung dieses Assays werden TERT-Promotoruntersequenzen biotinyliert, mit einer Lösung reagiert, von der angenommen wird, dass sie ein Bindungsprotein enthält, und dann mit einer Streptavidin-Affinitätssäule reagiert, um den Nukleinsäure- oder Bindungsproteinkomplex zu isolieren (Grabowski (1986) Science 233:1294–1299; Chodosh (1986) siehe oben). Das Promotor-Bindungsprotein kann dann konventionell eluiert und isoliert werden. Das Mobilitätsverschiebungs-DNA-Proteinbindungsassay mittels nichtdenaturierender Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) ist ein extrem schnelles und empfindliches Verfahren zur Erkennung spezifischer Polypeptidbindung an DNA (Chodosh (1986) siehe oben; Carthew (1985) Cell 43:439–448; Trejo (1997) J. Biol. Chem. 272:27411–27421; Bayliss (1997) Nucleic Acids Res. 25:3984–3990).
  • Interferenz-Assays und DNase- und Hydroxylradikal-Footprinting können verwendet werden, um spezifische Reste in der Nukleinsäure-Proteinbindungsstelle zu identifizieren; Bi (1997) J. Biol. Chem. 272:26562–26572; Karaoglu (1991) Nucleic Acids Res. 19:5293–5300. Fluoreszenzpolarisation ist eine leistungsfähige Methode zur Charakterisierung makromolekularer Assoziationen und kann Gleichgewichtsbestimmungen von Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen bereitstellen. Diese Methode ist besonders nützlich (und besser geeignet als elektrophoretische Verfahren) für die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen mit niedriger Affinität; Lundblad (1996) Mol. Endocrinol. 10:607–612.
  • Mit Hilfe dieser Methode identifizierte Proteine können aufgrund ihrer Größe, der Netto-Oberflächenladung, Hydrophobizität und Affinität zu Liganden weiter aufgeteilt werden. Außerdem können gegen solche Proteine gerichtete Antikörper an Säulenmatrizen konjugiert und die Proteine entsprechend gut bekannter Verfahren immun-gereinigt werden; Scopes, R. K., Protein Purification: Principles and Practice, 2nd ed. Springer Verlag (1987).
  • Zu Transkriptionsregulationssequenzen, welche durch Vergleich von hTERT- und mTERT-Sequenzen identifiziert werden, gehören die trans-aktiven Faktoren c-Myc, SP1, SRY, HNF-3β, HNF-5, TFIID-MBP, E2F und c-Myb. Tabelle 1 zeigt weitere Transkriptionsregulationssequenzen, welche durch Vergleich der hTERT-Sequenz mit bekannten Regulationsmotiven stromaufwärts der TERT-Codienegion identifiziert wurden. Diese Elemente sind von Interesse bei der Regulationstranskription bei den Zelltypen, bei denen die Faktoren vorhanden sind, die sich an diese Elemente binden.
  • TABELLE 1: Putative Erkennungselemente stromaufwärts der hTERT-Codierregion
    Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Die in dieser Offenbarung enthaltenen Beispiele und die detaillierte Darstellung dienen der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung der Erfindung. Durch den Fachmann können Modifikationen vorgenommen werden, welche im Sinne dieser Anmeldung und im Umfang der beigefügten Ansprüche eingeschlossen sind.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Klonen von λGφ5 und Charakterisierung von hTERT-Genomsequenzen
  • Das folgende Beispiel beschreibt detailliert das Klonen des humanen hTERT-Promotors.
  • Eine humane Genom-DNA-Bibliothek wurde mittels PCR und Hybridisierung durchsucht, um einen Genomklon zu identifizieren, welcher hTERT-RNA-Codiersequenzen enthält. Die Bibliothek war eine humane Fibroblasten-Genombibliothek, die mit Hilfe der DNA aus WI38-Lungenfibroblastenzellen (Stratagene, Kat. Nr. 946204) hergestellt wurde. In dieser Fibroblasten-Bibliothek waren partielle Sau3Al-Fragmente in die Xhol-Stelle eines gewerblichen Phage-Klon-Vektors, Lambda FIX®-Vektor (Stratagene, San Diego, CA) mit Einschuhgrößen im Bereich von etwa 9 Kilobasen (kb) bis 22 kb ligiert.
  • Die Genombibliothek wurde in Pools von je 150.000 Phagen geteilt. Jeder Pool wurde mittels verschachtelter PCR mit dem äußeren Primerpaar TCP 1.52 & TCP 1.57 und dem inneren Paar TCP 1.49 & TCP 1.50 untersucht. Diese Primerpaare umfassen ein putatives Intron in der Genom-DNA der hTERT und stellten sicher, dass das PCR-Produkt aus einer Genomquelle abgeleitet wurde und nicht aus der Kontamination durch den hTERT-cDNA-Klon. Positive Pools wurden weiter aufgeteilt bis man einen Pool von 2000 Phagen erhielt. Dieser Pool wurde bei niedriger Dichte plattiert und über Hybridisierung mit einem DNA-Fragment, welches eine Teilmenge der hTERT-cDNA, erzeugt durch Restriktionsschnitte mit Sphl und EcoRV enthält, untersucht.
  • Zwei positive Klone wurden isoliert und über verschachtelte PCR erneut untersucht. Bei der erneuten Untersuchung waren beide Klone positiv durch PCR. Einer der Lambda-Phagen-Klone (bezeichnet mit „Gphi5" oder „λGφ5") wurde mit Notl digeriert, was eine Einschubgröße von etwa 20 kb zeigte. Anschließende Kartierung ergab, dass die Einschubgröße 15 kb betrug und dass Phage-λGφ5 etwa 13 kb DNA stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle (stromaufwärts von der cDNA-Sequenz) enthält.
  • 1 zeigt die Struktur von Phage-λGφ5, abgebildet durch Restriktionsenzym-Digestion und DNA-Sequenzierung.
  • Isolierung, Subklonierung und Sequenzierung des Genom-hTERT-Einschubes
  • Die Phagen-DNA wurde mit Ncol digeriert. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pBBS167 geklont. Die so entstehenden Subklone wurden mittels PCR untersucht, um diejenigen zu identifizieren, die Sequenzen enthalten, welche der 5'-Region der hTERT-cDNA entsprechen. Ein Subklon (Plasmid „pGRN140"), welcher ein 9 kb Ncol-Fragment (mit hTERT-Gensequenz und etwa 4 bis 5 kb der Lambda-Vektor-Sequenz) enthält, wurde teilweise sequenziert, um die Orientierung des Einschubes zu bestimmen. pGRN140 wurde mit Hilfe von SalI digeriert, um Lambdavektor-Sequenzen zu entfernen und das entstehende Plasmid (mit entfernter Lambdasequenz) wurde mit pGRN144 bezeichnet. Der pGRN144-Einschub wurde dann sequenziert.
  • Ein Notl-Fragment aus λGφ5 (welches den kompletten etwa 15 kbp Genomeinschub einschließlich der hTERT-Genpromotorregion enthält) wurde in die Notl-Stelle des Plasmids pBBS 185 eingefügt. Zwei Plasmide wurden isoliert, deren entsprechende Einschübe in entgegengesetzte Richtungen orientiert waren. Bei einem zeigte der Einschub, der nach dem hTERT-Open-Reading-Frame (ORF) orientiert war, in die gleiche Richtung wie der Lac-Promotor des Plasmids; dieser wurde mit pGRN142 genannt, der zweite pGRN143.
  • SEQ. ID. NR: 1 ist eine Auflistung der Sequenzdaten aus Plasmid pGRN142. Die Nukleotide 1–43 und 15376–15418 sind Plasmidsequenzen. Somit beginnt der Genomeinschub an Rest 44 und endet an Rest 15375. Der Beginn des geklonten cDNA-Fragmentes entspricht Rest 13490. Alu-Sequenzelemente befinden sich 1700-Basenpaare stromaufwärts. Die Sequenz des hTERT-Einschubes von pGRN142 ist jetzt von GenBank (http://www.ncbi.nim.nih.gov/) unter der Zugangsnummer PGRN142.INS AF121948 erhältlich.
  • Die Nummerierung der hTERT-Reste für Plasmide in den folgenden Beispielen beginnt ab dem Translationsstartkodon, entsprechend der üblichen Praxis im Fachgebiet. Das hTERT-ATG-Kodon (die Translationsstartstelle) beginnt an Rest 13545 von SEQ. ID. NR: 1. So entspricht Position –1, der erste stromaufwärtige Rest, dem Nukleotid 13544 in SEQ. ID. NR: 1.
  • Beispiel 2: TERT-Promotor-stimulierte Reporterstrukturelemente
  • Dieses Beispiel beschreibt die Erzeugung von Plasmiden, in denen Reportergene wirkungsmäßig mit hTERT-Promotorsequenzen der Erfindung verbunden sind. Es wird außerdem veranschaulicht, wie die TERT-Promotorsequenz der Erfindung für die Expression in Zellen und Geweben in vitro und in vivo und analog in transgenen Tieren wirkungsmäßig mit heterologen Sequenzen wie Polypeptid-Codiersequenzen verbunden werden kann. Für den Fachmann wird es offensichtlich sein, dass Methoden wie die in diesen Beispielen veranschaulichten verwendet werden können, um andere in Frage kommende Sequenzen auf ihre Fähigkeit zu testen, spezifisch die Transkription in TERT-exprimierenden Zellen zu stimulieren.
  • hTERT-verbundene Reportervektoren der Erfindung besitzen zahlreiche Einsatzmöglichkeiten, einschließlich der Identifizierung spezifischer cis-aktiver Sequenzen und Trans-aktiver Transkriptionsregulationsfaktoren. Wichtig ist, dass diese hTERT-enthaltenden Reporterstrukturelemente für das Screening von Agenzien verwendet werden können, die in der Lage sind, die hTERT-Transkription zu modulieren (d.h. zu aktivieren oder zu hemmen). Diese Studien können in vitro und in vivo durchgeführt werden.
  • Eine Reihe von Reportergenen, wie Glühwürmchen-Luciferase, β-Glucuronidase, β-Galaktosidase, Chloramphenicolacetyltransferase und GFP, sind bekannt und können wirkungsmäßig mit dem hTERT-Promotor verbunden werden. In diesem Beispiel wurde die human sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP; ClonTech) verwendet. Das SEAP-Reportergen codiert eine verkürzte Form des Plazentaenzyms, der die Membran-verankernde Domäne fehlt, wodurch das Protein von transfizierten Zellen effektiv sekretiert werden kann. Die im Kulturmedium festgestellten Niveaus der SEAP-Aktivität zeigten sich als direkt proportional zu Veränderungen bei den intrazellulären Konzentrationen von SEAP-mRNA und Protein. Das Chemilumineszenz-basierte SEAP-Assay ist etwa 10-mal empfindlicher als ähnliche Assays mit Glühwürmchen-Luciferase als Reporterenzym. Die SEAP-Aktivität kann auch mit einem fluoreszierenden Substrat untersucht werden, welches eine zur Luciferase vergleichbare Empfindlichkeit aufweist. Berger (1988) Gene 66:1; Cullen (1992) Meth. Enzymol. 216:362; Yang (1997) Biotechniques 23:1110–1114.
  • hTERT-5'-stromaufwärtige und Intronsequenzen besitzen „Promotor"-Aktivität
  • Experimente mit Reporterkonstrukten, welche hTERT-Sequenzen der Erfindung aufweisen, identifizierten cis-aktive Regionen mit „Promotor"-Transkriptions-aktivierender Aktivität sowohl in 5'-stromaufwärtigen als auch in Intronsequenzen. Kurz, es wurden vier Konstrukte, pGRN148, pGRN150, „pSEAP2-Basis" (keine Promotorsequenzen = Negativkontrolle) und „pSEAP2-Kontrolle" (enthält den frühen SV40-Promotor und Enhancer) erzeugt und dreifach in sterbliche und unsterbliche Zellen transfiziert.
  • 2 zeigt den Plan für die Erzeugung von Plasmid pGRN148. Kurz, ein Bgl2-Eco47III-Fragment wurde aus pGRN144 (oben beschrieben) digeriert und an die BglII-NruI-Stelle von pSEAP2-Basis (ClonTech, San Diego, CA) geklont. Ein zweiter Reporterpromotor, Plasmid pGRN150 wurde durch Einfügen des BglII-Fspl-Fragmentes aus pGRN144 an die BglII-NruI-Stelle von pSEAP2 hergestellt. Das Plasmid pGRN173 wurde mit Hilfe des EcoRV-StuI-Fragmentes aus pGRN144 erzeugt. So entsteht ein Promotorreporterplasmid, welches die Promotorregion von hTERT ab etwa 2,5 kb stromaufwärts des Starts des hTERT-ORF bis genau nach dem ersten Intron innerhalb der Codierregion enthält. Das initiierende Met wurde zu Leu mutiert, so dass das zweite ATG, das auf die Promotorregion folgt, das initiierende ATG der SEAP-ORF wäre.
  • Die Verwendung der Intronsequenz ermöglicht die Identifizierung von Regulationssequenzen, die in dem Intron vorhanden sein können (die Erfindung bietet Transkriptionsregulationssequenzen aus jedem Teil der hTERT-Genomsequenz). Zusätzlich zu den hTERT-abgeleiteten pSEAP-Reporterkonstrukten wurden ein positiver Kontrollvektor und ein negativer Kontrollvektor verwendet. Die Negativkontrolle (pSEAP2-Basis) ist notwendig, um das mit der DNA-Hauptkette des Vektors in Verbindung stehende Hintergrundsignal zu bestimmen. Eine Positivkontrolle ist notwendig, um die Transfektion und Expression exogener DNA zu bestätigen und die Gegenwart aktiver SEAP im Kulturmedium nachzuweisen. Die Positivkontrolle ist der pSEAP2-Kontrollvektor (ClonTech), welcher unter Transkriptionskontrolle des SV40-Promotors und Enhancers das SEAP-Strukturgen enthält.
  • Drei Konstrukte, die Kontrolle, pGRN148 (welche hTERT-5'-Promotorsequenzen beinhalten) und pGRN150, wurden in eine sterbliche Zelllinie, BJ-Zellen, eine humane Vorhautfibroblasten-Linie, Feng (1995) Science 269:1236; und eine unsterbliche Zelllinie, die humane Embryonennieren-Linie 293 transfiziert, Graham (1977) J. Gen. Virol. 36:59. Alle Transfektionen erfolgten parallel mit den beiden Kontrollplasmiden.
  • Bei unsterblichen Zellen scheinen pGRN148- und pGRN150-Konstrukte die SEAP-Expression so wirksam zu stimulieren wie die pSEAP2-Positivkontrolle (welche den frühen SV40-Promotor und Enhancer enthält). Im Gegensatz dazu zeigte bei sterblichen Zellen nur die pSEAP2-Kontrolle erkennbare Aktivität. Ähnliche Ergebnisse erhielt man unter Verwendung einer anderen normalen Zelllinie (RPE- oder Netzhautpigmentepithelzellen; Aronson (1983) In vitro 19:642–650). Bei mit pGRN150 transfizierten RPE-Zellen war die hTERT-Promotorregion inaktiv, während das pSEAP-Kontrollplasmid aktiv war. Diese Ergebnisse zeigen, dass, wie erwartet, hTERT-Promotorsequenzen in Tumorzellen aktiv sind, in sterblichen Zellen jedoch nicht.
  • Identifizierung der Gewebespezifitätselemente des hTERT-Promotors
  • Die hTERT-DNA-Promotorsequenzen wurden in den pSEAP2-Basis-Transkriptionsreportervektor (ClonTech) geklont, um die Plasmide pGRN148, 150, 175, 176, 181, 184, 261, 262 und 319 zu erzeugen. Unten zusammengefasst sind Einzelheiten der Promotorplasmid-Herstellung (Nukleotidnummern beziehen sich auf die Anzahl der Nukleotide stromaufwärts der Translationsstartstelle bei 13545 von SEQ. ID. NR: 1):
    pEGFP-1. *Vektor von ClonTech, welcher das verbesserte grüne fluoreszente Protein (EGFP) beinhaltet.
    pGRN140. *NCO1-Fragment, welches hTERT-stromaufwärtige Sequenzen enthält sowie das erste Intron von hTERT von λGφ5 in die NCO1-Stelle eines pBBS167 (Variante des pUC19-Klonvektors mit MCS, z.B.
    ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGC AGGCATGCCCATGGCAGGCCTCGCGCGCGAGATCTCGGGCCCAATCGATGCCGCGGC GATATCGCTCGAGGAAGCTTGGCACTGGCC (SEQ. ID. NR:3) und einem Chloramphenicol-empfindlichen Gen zwischen Flori und dem Amp-Gen in der entgegengesetzten Orientierung vom Amp-Gen). Das Fragment ist so gerichtet, dass die hTERT-Sequenzen in die gleiche Richtung zeigen wie der Lac-Promotor.
    pGRN144. oben beschrieben; SalI-Deletion von pGRN140 zum Entfernen von Phage (Lambda)-Sequenzen.
    pGRN148: *BGL2-ECO47III-Fragment aus pGRN144, welches hTERT-stromaufwärtige Sequenzen (von Position –51 bis –2482) aufweist, in die BGL2-NRU1-Stellen von pSEAP2-Basis zur Erzeugung eines hTERT-Promotor-/Reporterplasmids.
    pGRN150: *BGL2-FSP1-Fragment aus pGRN144, welches 2447nt von hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen (von Position –36 bis –2482) aufweist, in die BGL2-NRU1-Stellen von pSEAP2 zur Erzeugung eines hTERT-Promotor-/Reporterplasmids.
    pGRN175: *APA1(Klenow-Abstumpfung)-SRF1-Religation von pGRN150 zum Entfernen der meisten hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen. So entsteht ein Promotor-/Reporterplasmid, welches 82 Nukleotide der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen (von Position –36 bis –117) verwendet.
    pGRN176: *PML1-SRF1-Religation von pGRN150 zum Entfernen der meisten hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen. So entsteht ein Promotor-/Reporterplasmid, welches 204 Nukleotide der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen (von Position –36 bis –239) verwendet.
    pGRN181: *APA1-Digestion und -Religation von pGRN150 zum Entfernen aller APA1-Stellen außer einer. So entsteht ein Promotor-/Reporterplasmid, welches von –36 bis –114 und –1076 bis –2482 der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen umfasst.
    pGRN184: *XBA1 (teilweise, Klenow-Füllung)-ECORI-Digestion und -Religation von pGRN150 zum Entfernen der hTERT-Promotorsequenzen. So entsteht ein Promotor-/Reporterplasmid, welches eine Region von –1391 bis –2484 der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen exprimiert.
    pGRN213: *FSP1-Fragment, welches das CatS-Gen und F1 ORI sowie einen Teil des AmpR-Genes, in die FSP1-Stellen von pSEAP2-Basis, aufweist so dass die Orientierung das AmpR-Gen rekonstruiert.
    pGRN244: *SAL1-NOT1-Fragment aus pSEAP2-Basis, welches die SEAP-Region in die SAL1-NOT1-Stellen von pEGFP-1 aufweist. Diese Modifizierung fügt dem Vektor einen wählbaren Marker hinzu.
    pGRN245: *SAL1-NOT1-Fragment aus pGRN176, welches die hTERT-Promotor-/SEAP-Region, in die SALT-NOT1-Stellen von pEGFP-1 aufweist. Diese Modifizierung fügt dem Vektor einen dominanten wählbaren Marker hinzu.
    pGRN246: *SAL1-NOT1-Fragment aus pGRN176, welches die hTERT-Promotor-/SEAP-Region, in die SAL1-NOT1-Stellen von pEGFP-1 aufweist. Diese Modifizierung fügt dem Vektor einen dominanten wählbaren Marker hinzu.
    pGRN248: *SAL1-NOT1-Fragment aus pGRN175, welches die hTERT-Promotor-/SEAP-Region, in die Sali-Notl-Stellen von pEGFP-1 aufweist. Diese Modifizierung fügt dem Vektor einen dominanten wählbaren Marker hinzu.
    pGRN259. *In vitro Mutagenese mittels RA94 (CCCGGCCACCCCCGCGAattCGCGCGCTCCCCGCTGC) (SEQ. ID. NR: 4) zum Einfügen einer EcoRI-Stelle am initiierenden met von hTERT in pGRN144. Dies bietet hTERT-Sequenzen von +1 bis –2482, die mittels EcoRl und BglII in einen Vektor geklont werden können.
  • pGRN260. *In vitro Mutagenese mittels RA91 (TTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGcatgcTACGTAAGAGGTTCCAACTTTCAC CATAAT) (SEQ. ID. NR: 5) zum Entfernen mehrerer Stellen aus der Chloramphenicol-Region von pGRN213 zur Erzeugung einer nützlicheren Variante, MCS. So wird eine Mutagenese-Version von pSEAP2-Basis mit einzigartigeren Klonstellen in ihrer MCS erzeugt.
    pGRN261: *BGL2-ECOR1-Fragment aus pGRN259, welches hTERT-stromaufwärtige Sequenzen, in die BGL2-ECOR1-Stellen von pSEAP2-Basis aufweist. So entsteht ein Promotor-/Reporterexpressionsplasmid, welches von +1 bis –2482 der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen enthält.
    pGRN262: *BGL2-ECOR1-Fragment aus pGRN259, welches hTERT-stromaufwärtige Sequenzen, in die BGL2-ECOR1-Stellen von pGRN260 aufweist. So entsteht ein Promotor-/Reporterexpressions- und -mutageneseplasmid, welches von +1 bis –2482 der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen enthält.
    pGRN294: *BbsI-XhoI-Fragment aus pGRN142, welches hTERT-stromaufwärtige Sequenzen von –1667 bis –3278 aufweist, in die BbsI-XhoI-Stellen von pGRN259. So entsteht ein Vektor, welcher die stromaufwärtige Genomregion für hTERT von +1 bis –3278 enthält, welche mit EcoRI und XhoI geklont werden kann.
    pGRN295: *ECOR1-XHO1-Fragment aus pGRN294, welches von +1 bis –3282 der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen, in die ECOR1-XHO1-Stellen von pGRN260 aufweist. So entsteht ein SEAP-Promotor-/Reporter-/Mutageneseplasmid.
    pGRN296: *ECOR1-XHOl-Fragment aus pGRN294, welches von +1 bis –3282 der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen, in die ECOR1-XHO1-Stellen von pSEAP2-Basis aufweist. So entsteht ein SEAP-Promotor-/Reporterplasmid.
    pGRN297: *RA96 (AATTGCGAAGCTTACG) (SEQ. ID. NR: 6) und RA97 (AATTCGTAAGCTTCGC) (SEQ. ID. NR: 7) aufgeschmolzen zu einem Oligo-Linker in die ECORl-Stellen von pGRN259, wodurch das ECORl-Fragment der Intron-Exonregion von pGRN259 ersetzt wird.
    pGRN299: *XHO1-HIND3-Fragment aus pGRN298, welches von +1 bis –3282 der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen, in die XHO1-HIND3-Stellen von pGL2-Basis aufweist. So entsteht ein Luciferase-Promotor-/Reporterplasmid mit etwa 3,3 kb der hTERT-Promotorsequenzen.
    pGRN300: *XHO1-SAC1-Fragment aus pGRN142, welches hTERT-stromaufwärtige Sequenzen, in die XHO1-SAC1-Stellen von pGRN299 aufweist, so dass das entstehende Strukturelement von +1 bis –5124 der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen enthält. So entsteht ein hTERT-Promotor-/Reporterstrukturelement, welches Luciferase als Reporter nutzt.
    pGRN310: *SAC1-Fragment aus pGRN142, welches hTERT-stromaufwärtige Sequenzen, in die SAC1-Stelle von pGRN300 aufweist, so dass das entstehende Strukturelement von +1 bis –7984 der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen enthält. So entsteht ein hTERT-Promotor-/Reporterstrukturelement, welches Luciferase als Reporter nutzt.
    pGRN311: *SPE1-Fragment aus pGRN142, welches von –4773 bis –13501 der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen, in die SPEl-Stelle von pGRN300 aufweist, so dass die Orientierung die Genomregion wiederherstellt. So entsteht ein Luciferase-Promotorreporterplasmid, welches die gesamte pGRN142-stromaufwärtige Genomregion von hTERT aufweist sowie eine 365 bp Region von Genom-DNA aus der Mitte der 13,5 kb Genomregion, die stromaufwärts des T7-Promotors wiederholt wird.
    pGRN312: *BGL2-FSP1-Fragment aus pGRN144 in die BGL2-HIND3- (Klenow-gefüllten) Stellen von pGL2-Basis. So entsteht eine Luciferase-Promotor-/Reporterversion von pGRN150.
    pGRN313: *KPN1-NOT1-digeriertes pGRN311 abgestumpft mit T4-Polymerase und neu ligiert. So entsteht ein Luciferase-Promotor-/Reporterplasmid mit Hilfe von +1 bis –13501 der hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen.
    pGRN316: *Oligo-RA101 (5'-TAGGTACCGAGCTCTTACGCGTGC TAGCCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCA-3') (SEQ. ID. NR: 8) verwendet für die in vitro Mutagenese zum Entfernen der Genomsequenz aus pGRN262 zwischen der SRFl- Stelle und der ersten PML1-Stelle. So entsteht ein Promotor-/Reporterplasmid, welches hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen von +1 bis –239 enthält.
    pGRN317: *Oligo-RA10 (5'-TAGGTACCGAGCTCTTACGCGTGC TAGCCCCTCGCTGGCGTCCCTGCACCCTGGGAGCGC-3') (SEQ. ID. NR: 9) verwendet für die in vitro Mutagenese zum Entfernen der Genomsequenz aus pGRN262 zwischen der SRF1-Stelle und neben der letzten APAl-Stelle. So entsteht ein Promotor-/Reporterplasmid, welches hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen von +1 bis –397 enthält.
    pGRN319: *RA107 (5'-CGTCCTGCTGCGCACtcaGGAAGCCCTGGCCCC-3') (SEQ. ID. NR: 10) verwendet für die in vitro Mutagenese zur Deaktivierung der ,B'-Klassen-E-Box in unmittelbarer Nähe der hTERT-initiierenden met in pGRN262. Dies verändert CACGTG (SEQ. ID. NR: 11) in CACTCA (SEQ. ID. NR: 12). Es wurde außerdem COD1941 (5'-GATGAATGCTCATGATTCCGTATGGCA-3') (SEQ. ID. NR: 3) um von CatR zu CatS unter Einführung einer BsPHI-Stelle zu wechseln, und COD2866 (5'-CAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGCGCAAAAACAGGAAGGCAAAATG CC-3') (SEQ. ID Nr.: 14) verwendet, um aus AmpS bis AmpR auszuwählen, wodurch eine FSP1-Stelle eingefügt wird. Zusammengefasst trägt pGRN319 eine Mutation in der E-Box.
    pGRN350: *RA 104 (5'-TAGGTACCGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCCCTCCCAGCCCCTC CCCTTCCTTTCCGCGGC-3') (SEQ. ID. NR: 15) verwendet für die in vitro Mutagenese zum Entfernen der Genomsequenz aus pGRN262 zwischen der SRFl-Stelle und der letzten APA1-Stelle vor dem ATG des hTERT-Open-Reading-Frame (ORF). So entsteht ein Promotor-/Reporterplasmid, welches hTERT-stromaufwärtigen Sequenzen von +1 bis –117 enthält.
    pGRN351: *SAC2-Fragment aus pGRN319 in die SAC2-Stellen von pGRN350, so dass der SEAP-ORF neu erzeugt wird. So entsteht eine „deaktivierte E-Box"-Version von pGRN350.
    pGRN352: *RA122 (5'-GACCGCGCTTCCCACtcaGCGGAG GGACTGGGG-3') (SEQ. ID. NR:16) verwendet für die in vitro Mutagenese zur „Deaktivierung" der vorletzten E-Box der Klasse „B" vor der Translationsstartstelle von hTERT.
  • Dem pSEAP2-Basis-Plasmid fehlen eukaryotische Promotor- und Enhancer-Sequenzen. Dieser Vektor enthält das späte SV40-Polyadenylationssignal, das stromabwärts der SEAP-Codiersequenzen eingefügt ist, um die korrekte und effiziente Verarbeitung des Transkriptes in eukaryotischen Zellen sicherzustellen. Er enthält außerdem einen synthetischen Transkriptionsblocker (TB), zusammengesetzt aus benachbarten Polyadenylations- und Transkriptionspausen-Stellen zur Verringerung der Background-Transkription. Wie oben festgestellt codiert das SEAP-Reportergen eine verkürzte Form des Plazentaenzyms, welchem die Membranverankerungsdomäne fehlt, wodurch das Protein effizient aus transfizierten Zellen sekretiert werden kann.
  • Die im Kulturmedium erkannten Niveaus der SEAP-Aktivität zeigten sich direkt proportional zur Veränderung bei intrazellulären Konzentrationen der SEAP-mRNA. Das Chemilumineszenz-SEAP-Substrat CSPDTM (ClonTech) wurde verwendet, um sekretiertes SEAP nachzuweisen. Die Verwendung dieses Substrates ermöglicht die Überwachung der Expression des SEAP-Reportergenes durch einfache, sensible, nicht-radioaktive Assays der sekretierten Phosphataseaktivität. Dieses Chemilumineszenz-Assay kann so geringe Mengen wie 10–13 g SEAP-Protein erkennen. Das Assay ist über einen 104-fachen Bereich der Enzymkonzentrationen linear. Dies macht das Assay (und diese Vektoren) besonders gut geeignet für vergleichende Analysen.
  • Zusätzlich zu den hTERT-abgeleiteten pSEAP-Reporterstrukturelementen wurden ein positiver Kontrollvektor (pSEAP2-Kontrollvektor) und ein negativer Kontrollvektor (pSEAP2-Basis) verwendet. Die Promotorstrukturelemente (pGRN 150, 175, 176) und die Kontrollvektoren wurden 48–72 Stunden nach der Transfektion in unsterblichen (HEK293) und sterblichen (BJ-Fibroblast, RPE, HUVEC) Zellen transfiziert. Das Kulturmedium wurde entnommen und auf SEAP-Aktivität untersucht. Die SEAP-Aktivität wurde mittels des Chemilumineszenz-Assays von CLONTECH, dem großen EscAPeTM-SEAP-Chemilumineszenz-Kit entsprechend der Anleitung des Herstellers erkannt. Die Transfektionen wurden dreifach durchgeführt. Das Kulturmedium jeder Transfektion wurde nach 48–72 Stunden entnommen und dreifach untersucht. Die durch die Transfektion des Negativkontroll- (pSEAP2-Basis-) Vektors erhaltenen Background-Werte wurden von den Werten abgezogen, die mit den Test-Konstrukte erhalten wurden. Der Durchschnitt von neun Messungen wurde verwendet und für jedes der Strukturkonstrukte eingetragen.
  • Versuchsergebnisse bei unsterblichen und sterblichen Zelllinien
  • Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass während die hTERT-Promotorkonstrukte in der Lage sind, die Expression des Reporter-SEAP-Genes in unsterbliche Zellen zu stimulieren, die gleichen Konstrukte in allen getesteten sterblichen Zellen keine Reaktion auslösten. Der pSEAP2-Kontrollvektor ist jedoch in allen Zelltypen aktiv, egal ob sie sterblich oder unsterblich sind, und der pSEAP2-Basisvektor verursacht in allen untersuchten Zellen keine Reaktion.
  • hTERT-Promotor-stimulierende Thymidinkinase-Expression in vitro
  • Die Erfindung bietet Strukturelemente, welche heterologe Codiersequenzen aufweisen, die wirkungsmäßig an hTERT-Promotorsequenzen gebunden sind. In einer Ausführungsform sind die hTERT-Codiersequenzen wirkungsmäßig an den Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase („HSV-TK")-Codiersequenzen gebunden. HSV-TK ist ein Enzym, welches in der Lage ist, harmlose Pro-Pharmaka, z.B. Ganciclovir, in toxische Metaboliten umzuwandeln, welche die zelluläre Replikation proliferierender Zellen (wie Krebszellen, welche aktive hTERT-Promotoraktivität aufweisen) beeinträchtigen. Die Kontrolle der Thymidinkinase (TK)-Expression durch Unterordnung unter den hTERT-Promotor beschränkt die TK-Expression auf Zellen, in denen der hTERT-Promotor normalerweise aktiv ist. Dies verhindert die TK-Expression in „normalen" Zellen, in denen der hTERT-Promotor normalerweise keine Reaktion auslöst.
  • Die Fähigkeit des hTERT-Promotors spezifisch die Expression des TK-Genes in Tumorzellen zu stimulieren, wurde mittels einer Vielzahl von Konstrukten getestet: ein Konstrukt, bezeichnet mit pGRN266, enthält ein EcoRI-FseI-PCR-Fragment mit dem TK-Gen in die EcoRI-FseI-Stellen von pGRN263 geklont, welches etwa 2,5 kb der hTERT-Promotorsequenz enthält, ist pGRN150 ähnlich, enthält aber ein Neomycin-Gen als Auswahlmarker. pGRN267 enthält ein EcoRI-FseI-PCR-Fragment mit dem TK-Gen in die EcoRI-FseI-Stellen von pGRN264 geklont, welches etwa 210 bp der hTERT-Promotorsequenz aufweist, ist pGRN176 ähnlich, enthält aber ein Neomycin-Gen als Auswahlmarker. pGRN268 enthält ein EcoRI-XbaI-PCR-Fragment mit dem TK-Gen in die EcoRI-XbaI (nicht-methyliert)-Stellen von pGRN265 geklont, welches etwa 90 bp der hTERT-PromotorsSequenz enthält, ist pGRN175 ähnlich, enthält aber ein Neomycin-Gen als Auswahlmarker.
  • Diese hTERT-Promotor-/TK-Konstrukte, pGRN266, pGRN267 und pGRN268, wurden wieder in Säugetierzellen eingeführt und es wurden TK/+-stabile Klone (bzw. Massenpopulationen) ausgewählt. Die in vitro Ganciclovir-Behandlung der TK/+-Zellen führte zu einer selektiven Zerstörung aller getesteten Zelllinien, einschließlich 143B, 293, HT1080, Bxpc-3, DAOY und NIH3T3. Bezeichnenderweise hatte die Ganciclovir-Behandlung keine Auswirkung auf normale BJ-Zellen. Dies zeigt deutlich die Tumorspezifität aller drei bei diesen Experimenten verwendeten hTERT-Promotorfragmente.
  • Beispiel 3: Direkte in vivo hTERT-Promotor-Suizidgentherapie
  • Die Erfindung bietet Reagenzien und Verfahren für die Behandlung von Krankheiten, welche durch ungewollte Zellproliferation gekennzeichnet sind, durch in vivo Gentherapie. Um die Wirksamkeit dieses Aspektes der Erfindung zu demonstrieren wurden die Reagenzien der Erfindung verwendet, um Krebs (humanen Ursprungs) in einem in der Technik bewährten Tiermodell zu behandeln. Eine humane Krebszelle, die Osteosarkom-Zelllinie 143B, welche normalerweise das Telomerase-Gen exprimiert, wurde mit einem Plasmid transfiziert, welches das TK-Gen stimuliert durch den hTERT-Promotor enthält.
  • Es wurden spezifisch die Sequenzen –36 bis –2482 stromaufwärts der Translationsstartstelle von SEQ. ID. NR: 1 verwendet, um das TK-Gen zu stimulieren. Das Plasmid enthielt das Neomycin-Phosphotransferase-Gen. Nach der Transfektion von Zellen mit dem Plasmid wurden TK-exprimierende, G418-resistente Klone ausgewählt. Zweihunderttausend der parentalen oder TK-exprimierenden 143B-Zellen wurden subkutan in die Flanke von Balb/c-Nackt- (nu/nu) Mäusen injiziert, um Tumore zu erzeugen. Vier bis 11 Tage nach der Tumorimplantation wurde den Mäusen zweimal täglich IP 75 mg/kg Gancilovir (GCV) oder Salzlösung injiziert. Das Tumorwachstum wurde alle 3–4 Tage überwacht. Wurde diesen Tumor-tragenden Tieren GCV entweder 4 oder 11 Tage nach der Tumorimplantation verabreicht, wurden TK-mediierte Zelllysis und verzögertes Tumorwachstum beobachtet. Eine solche Hemmung des Tumorzellenwachstums wurde nicht beobachtet, wenn Salzlösung verabreicht worden war oder wenn der parentale 143B-Tumor (143BP) entweder mit Salzlösung oder GCV behandelt wurde. Fünfundvierzig Tage nach der Tumorimplatation zeigten nur die Tiere, denen der TK+-143B-Klon implantiert worden war und die mit GCV behandelt wurden eine Überlebensrate von 100%. In den anderen Gruppen starben alle außer einem Tier an massiver Tumorbelastung.
  • Diese Daten zeigen, dass der hTERT-Promotor ausreicht, um die TK-Genexpression auch in vivo zu stimulieren. Es zeigt sich außerdem, dass die Reagenzien und Verfahren der Erfindung verwendet werden können, um die Tumorregression in vivo bei Subjekten (einschließlich Menschen), die vorerzeugte Tumore tragen zu stimulieren.
  • Beispiel 4: Onkolytische Viren unter der Kontrolle des hTERT-Promotors
  • Wie bereits zuvor diskutiert bietet die Erfindung „bedingt replizierende" onkolytische Virenkonstrukte, in denen hTERT-Promotorsequenzen der Erfindung wirkungsmäßig anessentielle, viral codierte Gene gebunden sind. Die Verwendung von hTERT-Promotorsequenzen der Erfindung stellt sicher, dass das Virus nur in Zellen mit Telomeraseaktivität produktiv exprimiert wird. So können die Konstrukte therapeutisch eingesetzt werden, um nur Zellen aufzulösen, welche Telomerase exprimieren, wie unsterbliche oder Krebszellen. Die Proliferation des Virus und seine zytopathische Wirkung wird somit auf Tumorzellen geschränkt. Einzelheiten zur Herstellung eines exemplarischen hTERT-Promotor-stimulierten, bedingt replizierenden onkolytischen Virus folgen. In dieser Ausführungsform ersetzt der hTERT-Promotor den normalen E1a-Promotor zur Erzeugung eines Virus, welches sich nur in Telomerase-exprimierenden Zellen repliziert.
  • Das Plasmid pBR/ITR/549-ClaI, welches die Nukleotide 1–356 (Ad2 ITR und Verpackungssignale) und 549–920 (ein Teil der E1a-Codiersequenz) des Adenovirus 2 (Ad2), gebunden mittels eines Polylinkers aufweist, wurde mit Hilfe von Standard-Molekularbiologieverfahren im Bakterienplasmid pBR322 erzeugt. In pBR/ITR/TB+phTERT176-E1A und pBR/ITR/TB+phTERT316-E1A wurde der normale E1a-Promotor (Ad2 357–548) durch den hTERT-Promotor ersetzt. Ad2-Sequenzen aus 916–10680 wurden diesen Plasmiden hinzugefügt, um die Expressionselemente des 5'-Endes des Virus neu zu erzeugen.
  • Diese Plasmide (pBR/ITR/TB+phTERT176–10680 und pBR/ITR/TB+phTERT316–10680) werden zusammen mit einem adenoviralen DNA-Fragment, welches die Ad2-Sequenzen 10681–35937 aufweist, in eine Telomerase-exprimierende humane Zelllinie transfiziert. Es werden rekombinante Plaques markiert und 7–21 Tage nach der Transduktion selektiert. Der hTERT-Promotor E1A, welcher Ad2 aufweist, wird fortgepflanzt und unter Anwendung der Standardschemata zur rekombinanten Ad2-Amplifikation und -Herstellung zur Verwendung hergestellt. (Graham and Prevec, 1991, in Methods in Molecular Biology, Kapitel 11, Ed. E.J. Murray, The Human Press Inc., Clifton, NJ.; Kanegae et al., Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1994, 47(3):157–66). Da das E1a-Gen durch den hTERT-Promotor stimuliert wird, welcher normalerweise von den meisten Körperzellen nicht exprimiert wird, repliziert sich das rekombinante Ad2-Genom nur in Zellen, und wird nur in Zellen in Virus-Partikel verpackt, die Telomerase exprimieren.
  • Beispiel 5: Stimulation eines alkalischen Phospatase-Reportergenes durch hTERT-Promotorsequenzen für das High-Throughput-Screening
  • Die Erfindung bietet Strukturelemente und Promotor-basierte Assays zur Identifizierung kleiner Molekülaktivatoren und/oder -repressoren der hTERT- und Telomeraseaktivität. Zu diesem Zweck wurden Fragmente des hTERT-Promotors in Plasmide geklont, welche eine sekretierte Form alkalischer Phosphatase und einen Selektionsmarker exprimieren. Die SEAP-Strukturelemente (pGRN244, pGRN245, pGRN246 und pGRN248) wurden wieder in normale humane Zellen und in immortale Zelllinien eingefügt. Nach der Auswahl stabiler Klone mit dem/n eingefügten hTERT-Promotor/SEAP-Konstrukten wurde RT-PCR verwendet, um die Niveaus an SEAP-mRNAs zu bestimmen. In 293 Zellen waren die SEAP-mRNA-Niveaus erhöht und mit den Niveaus endogener hTERT vergleichbar, wohingegen in BJ-Zellen die SEAP-mRNA-Levels praktisch nicht erkennbar waren und nahezu den Niveaus der endogenen hTERT in diesen Zellen entsprachen.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass hTERT-Promotor-/SEAP-Strukturelemente verwendet werden können, um Zellen herzustellen, die für Promotor-basierte Assays und für die Untersuchung auf chemische und/oder biologische Aktivatoren und/oder Repressoren von Telomerase in normalen und Tumorzellen geeignet sind. pGRN244, pGRN245, pGRN246 und pGRN248 wurden wieder in BJ- und 293-Zellen eingefügt. Die SEAP-Aktivität und die mRNA-Niveaus wurden in diesen Zellen als Kriterium für die Klonauswahl bestimmt. Mehrere 293- und BJ-Linien wurden ausgewählt und zwei BJ-/pGRN245-Klone wurden für das Hoch-Durchsatz-Screening expandiert. Diese Konstrukte wurden auch in IDH4-Zellen eingeführt, bei welchen es sich um unsterbliche Lungenfibroblasten handelt, die das große SV40-T-Antigen unter der Kontrolle des Dexamethason-induzierbaren MMTV-Promotors exprimieren. IDH4-Zellen sind Telomerase-positiv und proliferieren in Gegenwart von Dexamethason. Diese Zellen können jedoch nach der Entfernung des Dexamethason in eine seneszente, Telomerase-negative Stufe induziert werden. Beim erneuten Hinzufügen des Dexamethason kehren die Zellen zu einem unsterblichen Phänotyp zurück und reaktivieren die Telomerase.
  • pGRN244, pGRN245, pGRN246 und pGRN248 wurden in IDH4-Zellen transfiziert. Es wurde nachgewiesen, dass die SEAP-Aktivität in den verschiedenen Klonen parallel zur Telomeraseaktivität verlief, wohingegen beim Kontrollplasmid keine wesentliche Fluktuation der SEAP-Aktivität beobachtet wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Fragment von etwa 2,5 kb der hTERT-Promotorsequenz (pGRN245) ausreichend Sequenzelemente enthält, um sowohl die Aktivierung als auch die Repression als Reaktion auf Proliferations- und/oder Wachstumsstillstandsstimuli zu unterstützen, welche die Telomeraseaktivität in IDH4-Zellen kontrollieren. Zwei Klone, ID245-1 und ID245-16, deren SEAP-Profil nahezu mit dem der Telomeraseaktivität während der Medikamentenbehandlung übereinstimmte, wurden ausgewählt und für das Hoch-Durchsatz-Screening kleiner Molekülaktivatoren der Telomerase expandiert.
  • Beispiel 6: Stimulation eines β-Galaktosidase-Reportergenes durch hTERT-Promotorsequenzen zum Identifizieren biologischer Regulatoren von hTERT- und Telomeraseaktivität
  • Die Erfindung bietet außerdem Strukturelemente und Promotor-basierte Assays zum Identifizieren biologischer Modulatoren der hTERT- und Telomeraseaktivität. Ein beispielhaftes Konstrukt dieses Aspektes der Erfindung ist pGRN353, welches ein BglII-HindIII-Fragment aus pGRN297 mit etwa 2,5 kb der hTERT-Promotorsequenzen geklont in die BglII-HindIII-Stellen von β-gal-Basis (ClonTech) enthält. pGRN353 oder ähnliche Strukturelemente werden durch Co-Transfektion mit einem Plasmid, welches ein Hygromycin-Gen als Selektionsmarker aufweist, wieder in BJ-Zellen eingebracht. Klonzelllinien und/oder Massenpopulationen wurden bestimmt und für die Untersuchung retroviral-basierter cDNA-Bibliotheken auf Gene oder Fragmente von Genen verwendet, die den hTERT-Promotor aktivieren können. pGRN353 oder ähnliche Konstrukte wurden außerdem wieder in 143B- und 293-Zellen eingefügt, um retrovirale Bibliotheken für die Identifizierung von Sequenzen zu untersuchen, die den hTERT-Promotor unterdrücken können.
  • Beispiel 7: Identifizieren von trans-aktiven Transkriptionsregulationselementen
  • Die Promotorreporter- (und andere) Vektoren der Erfindung werden außerdem verwendet, um trans-aktive Transkriptionsregulationselemente zu identifizieren. Wie oben festgestellt, sind Plasmide, in denen Reportergene wirkungsmäßig an hTERT-Promotorsequenzen gebunden sind, außerordentlich nützlich für die Identifizierung von trans-aktiven Transkriptionsmodulationsagenzien und für das Screening potentieller hTERT-Promotor-modulierender Medikamente (einschließlich biologischer Agenzien und kleiner Moleküle).
  • Es können sowohl transiente als auch stabile Transfektionsverfahren verwendet werden. In einer Ausführungsform werden in Telomerase-negativen und Telomerase-positiven Zellen durch Co-Transfektion mit einem eukaryotischen, wählbaren Marker (wie neo) nach Ausubel, oben, stabile Transformanten von pGRN148 erzeugt.
  • Die so entstehenden Zelllinien werden zum Screening putativer trans-aktiver Telomerase-Transkriptionsmodulationsagenzien, zum Beispiel durch den Vergleich der hTERT-Promotor-stimulierten Expression in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung (des putativen trans-aktiven Transkriptionsmodulationsagens) verwendet. Zusätzliche Promotorreportervektoren (einschließlich der hierin beschriebenen Strukturelemente und Varianten davon) werden auf ähnliche Art und Weise verwendet, um trans-aktive Faktoren, die an cis-aktive Transkriptionsregulationselemente binden, wie Myc, Sp1, das TATA-Box-Bindungsprotein, API, CREB, der CAAT-Bindungsfaktor und Faktoren, die an Hormonresponseelemente binden (z.B. GRE) zu identifizieren und zu isolieren. Die Identifizierung und Isolierung solcher trans-aktiver Regulationssequenzen stellen weitere Verfahren und Reagenzien zur Modulation der Transkription und Translation der Telomerase bereit.
  • Beispiel 8: c-Myc agiert als ein wirksamer Aktivator des TERT-Promotors durch direkte Interaktion mit cis-aktiven Regulationssequenzen
  • Die Verwendung rekombinanter Konstrukte, welche TERT-Promotorsequenzen der Erfindung aufweisen, hat erstmalig gezeigt, dass c-Myc durch direkte Interaktion mit cis-aktiven Regulationssequenzen im TERT-Promotor als ein wirksamer Aktivator der Telomeraseaktivität agiert. In signifikanter Weise zeigen die Studien der Erfindung außerdem, dass die Transkriptionsaktivität des hTERT-Promotors durch c-Myc durch das Entfernen oder die Mutation einer einzigen cis-aktiven Regulationssequenz, der „Myc/Max-Bindungsstelle", außer Kraft gesetzt werden kann.
  • Um zu bestimmen, ob die experimentelle Induktion von c-Myc zur erneuten Aktivierung der Telomerase in primären Humanzellen führen kann, wurden prä-seneszente IMR90-Kulturen, hergestellt für die Expression des ecotropen Mausrezeptors (Serrano et al. (1997) Cell 88:593–602) entweder mit dem retroviralen pBABE-Vektor oder einem Vektor transduziert, der ein Hormon-induzierbares c-Myc-Östrogen-Rezeptor- (cMycER) Fusionsprotein codiert (Eilers et al., 1989 Nature 340:66–68; Littlewood (1995) Nuc. Acids Res. 23, 1686–1690). IMR90-Kulturen besitzen keine erkennbare Telomeraseaktivität oder TERT-Genexpression (Nakamura et al., 1997; Meyerson et al., 1997).
  • Retrovirale Infektion: Der ecotrope Mausrezeptor wurde in IMR90-Fibroblasten transduziert und alle nachfolgenden Transduktionen mit ecotropem Retrovirus wurden gemäß Serrano et al. (1997) durchgeführt. pBABE-MycER- und pBABE-Vektor-Kontrollviren wurden aus stabilen, exprimierenden _2-Zelllinien entnommen.
  • Zellkultur: IMR90-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco/BRL), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 0,29 mg/ml L-Glutamin, 0,03% Penicillin und Streptomycin sowie 25 μg/ml Gentamycinsulfat gezüchtet. Für die Myc-Induktionsstudien in IMR90-Zellen wurden MycER-transduzierte Zellen für 24, 48 und 72 Stunden 2 μM 4-OHT ausgesetzt. Für die Promotorstudien wurden NIH-3T3-Zellen für 24 und 72 Stunden 1 μM 4-OHT ausgesetzt. In allen Fällen wurden nicht induzierte Kontrollen mit einer äquivalenten Menge Ethanol, dem Lösemittel für 4-OHT, behandelt.
  • Telomerase-Assays: Die Telomeraseaktivität wurde durch ein modifiziertes Telomeric Repeat Amplification Protocol mit Hilfe der TRAPezeTM-Telomeraseerkennungsausrüstung (Oncor, Gaithersburg, MD) (Kim et al., 1994) gemessen. Die Genom-DNA wurde aus Vektorkontroll- oder MycER-transduzierten IMR90-Fibroblasten entnommen. TRAP-Assays wurden auf Lysaten äquivalent zu 1000 Zellen für alle Proben durchgeführt, wobei 293T-Zellen-Lysate als Positivkontrolle für die Telomeraseaktivität dienten. Die PCR-internen Kontrollen aus jedem Experiment wurden gleichmäßig amplifiziert. Die Inaktivierung der Lysate erfolgte für 5 Minuten bei 85°C vor dem TRAP-Assay.
  • Im MycER-System existiert der Myc-Teil in einer latenten Form, durch seine ER-Fusion gebunden in einem Komplex mit HSP-90 (Eilers et al., 1989; Littlewood et al., 1985). Bei Behandlung mit 4-Hydroxy-Tamoxifen (4-OHT) wird das MycER-Protein vom HSP-90 befreit, was in einem Myc-Überexpressions-Phänotyp (Eilers et al., 1989; Littlewood et al., 1995) resultiert. Bei Anwendung dieses Zellkultursystems führte die 4-OHT-Behandlung MycERtransduzierter IMR90-Kulturen zur beobachteten und aufrechterhaltenen Aktivierung der Telomerase auf einem Niveau, das dem entspricht oder darüber liegt, welches bei Lysaten erkannt wurde, die aus einer äquivalenten Zahl Telomerase-positiver 293T-Tumorzellen abgeleitet wurden, wie durch das sensible TRAP-Assay untersucht. Im Gegensatz dazu blieben unbehandelte MycER-transduzierte oder 4-OHT-behandelte, pBABE-transduzierte IMR90-Kulturen Telomerase-negativ. Die Western-Blot-Analyse bestätigte reichlich vorhandene MycER-Protein-Niveaus in den MycER-transduzierten Kulturen in Gegenwart oder Abwesenheit von 4-OHT.
  • Insbesondere fand man heraus, dass die verstärkte Expression von Onkogenen wie H-Ras und zellulären Modulatoren der Rb- und p53-Pathways (E7, Cyclin D1, Mdm2, dominantnegatives p53) nicht in der Lage ist, die Telomeraseaktivität in IMR90-Zellen zu beeinflussen (Wang et al., 1998).
  • Die c-Myc-Steigerung der hTERT-Transkription erfordert die Gegenwart eines cis-aktiven Promotorelementes: der proximalen Myc-Bindungs-E-Box
  • hTERT-Reporterherstellung: pGRN150 (E-Box entfernt), pGRN261 (2,5 kbp hTERT-Reporter) sind oben beschrieben. NIH-3T3-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco/BRL), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 0,29 mg/ml L-Glutamin, 0,03% Penicillin und Streptomycin und 25 μg/ml Gentamycinsulfat, gezüchtet. NIH-3T3-Zellen wurden mittels LipoFectamin-Reagens (Life Sciences) mit 100 ng eines Promotorreporters und 200 ng pCMX-β-Galaktosidase, welche als eine interne Kontrolle der Transfektionseffizienz diente, transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden für 6 Stunden in komplettem DMEM ruhen gelassen und dann vor der Analyse der sekretierten alkalischen Phosphataseaktivität mittels des Great EscAPeTM-Assay (ClonTech) für 36 Stunden mit 1 μM 4-OHT oder Ethanol behandelt. Die β-Galaktosidaseaktivität wurde durch Inkubation ganzer Zellextrakte mit 400 μg/ml ONPG in Pufferlösung, welche 60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4, 10 mMKCl und 1 mM MgSO4 enthielt, untersucht und relative Transfektionseffizienzen durch Ablesen des Absorptionsvermögens bei 415 nm bestimmt.
  • Die Expression endogener hTERT nach der 4-OHT-Aussetzung (oder Lösemittel allein) wurde zu verschiedenen Zeitpunkten in Gegenwart von 1 μM Cyclohexamid in IMR-Fibroblasten transduziert mit MycER gemessen. Die reverse Transkription von RNA abgeleitet aus jeder Probe gefolgt von PCR und Southern-Blotting der amplifizierten Produkte wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Glyceraldehyd-6-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH) wurde aus den gleichen Produkten der reversen Transkription amplifiziert wie eine interne semi-quantitative Kontrolle und durch Ethidiumbromid-Anfärbung sichtbar gemacht. Nach sehr langer Aussetzung wurde in uninduzierten Proben eine hTERT-mRNA-Expression auf geringem Niveau erkannt; das Niveau der hTERT-mRNA änderte sich jedoch in den uninduzierten Proben in dieser Zeit nicht.
  • Die Aktivität des hTERT-Promotors wurde durch c-Myc-ER in NIH-3T3-Zellen enorm gesteigert. Die Fähigkeit des c-Myc-ER, die hTERT-Promotoraktivität zu steigern, war abhängig von Sequenzen im hTERT-Promotor, zu denen eine evolutionär bewahrte Myc-Bindungsstelle (E-Box) gehört.
  • Um zu bestimmen, ob die erhöhte Telomeraseaktivität induziert durch Aktivierung von c-Myc-ER ein Ergebnis der gesteigerten Transkription des hTERT-Genes war, wurde anfänglich die Wirkung der 4-OHT-Induktion der c-Myc-ER-Aktivität auf hTERT-Promotorsequenzen untersucht, die sich stromaufwärts des sekretierten alkalischen Phosphatase-Reportergenes befinden. Der hTERT-Promotor enthält zwei putative Myc-Bindungsstellen, welche sich an –242 und –34 relativ zum ATG-Startkodon befinden.
  • NIH-3T3-Zellen, hergestellt um c-Myc-ER stabil zu exprimieren, wurden mit Konstrukten transfiziert, die einen sekretierten alkalischen Phosphatasereporter unter der Kontrolle eines 2,5 kb Fragmentes des hTERT-Promotors, einem 2,5 kb Fragment des hTERT-Promotors, dem die proximale E-Box fehlt oder einem promotorlosen Reporterkonstrukt enthält. Die grundlegende Aktivität des Wildtyp-hTERT-Promotors und die des hTERT-Promotors, dem die proximale E-Box fehlt, waren äquivalent und etwa 3-fach höher als die Aktivität des promotorlosen Reportes. Die Induzierung der c-Myc-ER-Aktivität mit 1 μM 4-OHT steigerte die Aktivität des 2,5 kb hTERT-Promotors um etwa das 10-fache. Im Gegensatz dazu wurde die Aktivität des Promotors, dem die proximale E-Box fehlt, nur unwesentlich durch die Induzierung des c-Myc-ER beeinflusst. Ähnliche wurde auch der promotorlose Reporter nicht durch die Induzierung des c-Myc-ER beeinflusst. Dies zeigt eindeutig, dass die Transkription einer heterologen Codierregion durch die Modulation eines Transkriptionsregulationselementes wie c-Myc innerhalb der Promotor-Region reguliert werden kann, welches wiederum durch einen Liganden für den Östrogenrezeptor moduliert ist.
  • Um die Rolle der proximalen E-Box bei der Regulierung des hTERT-Promotors weiter zu bestätigen wurde die Wirkung der Veränderung der E-Box von CACGTG zu CACTCA getestet. Die Mutation in der E-Box reduzierte die Promotoraktivität aufgrund der 4-OHT-Stimulation bis zum Äquivalent der E-Box-Entfernung und dem 10-fachen unter dem Wildtyp-Promotor. Dies zeigt, dass c-Myc-ER nicht in der Lage ist, einen hTERT-Promotor mit einer geschwächten E-Box bei –34 wesentlich zu aktivieren, und dass die E-Box bei –242 nicht in der Lage ist, die c-Myc-Aktivierung wesentlich zu mediieren. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Fähigkeit von c-Myc zur Stimulierung des hTERT-Promotors über die –34-E-Box mediiert wird.
  • hTERT ist ein direktes Ziel der c-Myc-regulierten Transkription
  • Zur Bestätigung der Fähigkeit von c-Myc, die Transkription des hTERT-Genes direkt zu stimulieren, wurde eine Untersuchung auf die hTERT-Genexpression in MycER-transduzierten Kulturen von IMR90-Zellen 0, 1, 3 und 9 Stunden nach dem Zufügen von 4-OHT durchgeführt. Die Kulturen wurden vor der Zugabe von 4-OHT für 30 Minuten mit Cyclohexamid behandelt, um eine erneute Proteinsynthese zu verhindern. Zum Null-Stunden-Zeitpunkt war bei den Myc-transduzierten Kulturen keine hTERT-Expression erkennbar. Die Vorbehandlung dieser Zellen mit Cyclohexamid allein hatte keine Auswirkung auf die Expression der hTERT-mRNA. Die Induzierung der c-Myc-ER-Aktivität durch die Behandlung mit 2 M 4-OHT in Gegenwart von 1 Cyclohexamid führte zu einem schnellen Anstieg in der Expression der hTERT-Nachricht.
  • Die hTERT-Expression wurde 1 Stunde nach der Induzierung festgestellt und erhöhte sich 3 und 9 Stunden nach der Induzierung. Im Gegensatz dazu wurden Zellen, die mit Lösemittel allein behandelt worden waren, nicht für die Expression von hTERT induziert. Ferner war das Expressionsniveau von GAPDH zu allen Zeitpunkten in den mit 4-OHT oder Lösemittel allein behandelten Zellen ähnlich. Diese Beobachtungen lassen stark annehmen, dass Myc direkt auf den hTERT-Promotor wirkt, um die Transkription des hTERT-Genes zu erhöhen.
  • Fehlende Äquivalenz von Myc und TERT bei der zellulären Transformation
  • Um die funktionalen Auswirkungen der Myc-Induzierung der Telomeraseaktivität in primären Zellen weiter zu erforschen, wurde untersucht, ob TERT im Rattenembryonenfibroblasten (REF) Kooperationsassay gegen c-Myc als ein unsterblich machendes Agens ausgetauscht werden könnte. Bei diesem Assay bewirkt die Co-Transfektion von Myc und aktiviertem RAS (H-RASG12V) die maligne Transformation von REFs im frühen Stadium. Diese kooperative Aktivität kann durch die Überwachung der Anzahl der transformierten Fokusse, die 7 bis 10 Tage nach der Transfektion in der Monoschicht erscheinen, quantifiziert werden. In zwei separaten Experimenten wurden verschiedene Kombinationen der Expressionsstrukturelemente, welche c-Myc, H-RASG12V, TERT oder eine Vektorkontrolle codieren, in REFs im frühen Stadium eingebracht. Starke kooperative Aktivität wurde bei den RAS- und Myc-Co-Transfektionen beobachtet, wie durch einen Durchschnitt von 34 Fokussen pro 10 cm Platte belegt, während Ras allein zwischen 0 und 3 Fokusse pro Platte erzeugte, und zwar übereinstimmend mit den vorhergehenden Ergebnissen, dass für eine effiziente Transformation von primären Nagerzellen ein unsterblich machendes Agens und aktiviertes RAS erforderlich sind (Land et al., 1983). Im Gegensatz dazu erzeugte die Co-Transfektion von TERT und RAS keine Anzahl transformierter Fokusse, die über denen der Kontrollen für RAS allein gemessen wurden liegen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Expression von hTERT ausreichend ist, um die immortalisierende Funktion von Myc in einem Rattenembryonenfibroblasten (REF) Kooperationsassay zu begründen.
  • Die Wirkung von c-Myc-ER auf die Aktivität des hTERT-Promotors in NIH3T3-Zellen wurde durch die Erkennung sekretierter alkalischer Phosphataseaktivität bestimmt. Die Zellen wurden für 36 Stunden mit 4-OHT behandelt. Uninduzierte Zellen wurden für 36 Stunden mit Lösemittel allein behandelt. Die erkannte sekretierte alkalische Phosphataseaktivität wurde für die Transfektionseffizienz in jedem Fall mittels β-Galaktosidase korrigiert.
  • Beispiel 9: Klonen des Maus-TERT-Promotors
  • Das folgende Beispiel beschreibt detailliert das Klonen des Maus-TERT-Promotors. mTERT-Erzeugung: Eine Hybridisierungsprobe (Nukleotide 1586–1970) der mTERT-cDNA (pGRN188) wurde verwendet, um einen rekombinanten Phagen (mTERT1) aus einer 129SV-Mausgenom-Phagen-Bibliothek (Stratagene) zu identifizieren. Ein 8 kb HindIII-Fragment von mTERT1, das an die 1586–1970-Sonde hybridisierte, wurde in pBluescriptTM II KS + (Stratagene) subkloniert, um Klon B2.18 zu erzeugen. Die den Initiator und Promotor einschließenden Regionen wurden sequenziert.
  • Die mTERT-stromaufwärtige Sequenz ist in SEQ. ID. NR: 2 aufgeführt. Die Sequenz ist erhältlich von GenBank unter der Zugangsnummer B2,18 AF121949.
  • 3 zeigt den Abgleich der homologen Teile der humanen und Maus-Promotorsequenzen. Die Sequenzen wurden mit Hilfe des GAP-Programmes aus dem Wisconsin GCG-Paket mittels eines Wertes von 48 für die Spalterzeugung und einem Wert von 3 für die Spalterweiterung abgeglichen. Die Verwendung einer kleinen Region der Codierregion (~450 Basen) verbesserte den anfängliche Abgleich.
  • Erhaltung von humanen und Maus-TERT-Promotoren
  • Um zu bestimmen, ob die Fähigkeit von c-Myc, die Telomeraseaktivität zu steigern, durch erhöhte Transkription des hTERT-Genes mediiert wurde, wurden die Sequenzen des humanen und des Maus-TERT-Promotors verglichen. Der Abgleich der ersten 300 Basen des humanen und des Maus-TERT-Promotors zeigte eine Reihe konservierter Regionen. Insbesondere die Myc/Max-Bindungsstelle (E-Box), welche sich bei –34 des humanen Promotors und bei –32 des Mauspromotors befindet, ist hoch konserviert. Eine zweite E-Box wurde bei –242 des humanen Promotors identifiziert; diese Stelle war beim Mauspromotor jedoch nicht konserviert. Diese Beobachtungen ließen auf die Möglichkeit schließen, dass die konservierte Myc-Bindungsstelle insbesondere eine Rolle bei der Regulierung der hTERT-Expression durch c-Myc spielen könnte.
  • Beispiel 10: Exemplarisches onkolytisches Virus
  • Basierend auf den in Beispiel 4 dargestellten Prinzipien wurde das folgende Experiment als ein Modell für ein onkolytisches Virus basierend auf dem Adenovirus vom Typ Ad2 durchgeführt. Es wurde ein Konstrukt hergestellt, in welchem das Adenovirus-E1a-Replikationsgen unter die Kontrolle des hTERT-Promotors gestellt wurde, welches die Transkription in Telomerase-exprimierenden Krebszellen aktivieren sollte. Als Positivkontrolle wurde ein ähnliches Konstrukt hergestellt, in dem E1a unter die Kontrolle des CMV-Promotors gestellt wurde, welches die Transkription in jeder beliebigen Zelle aktivieren sollte.
  • Reagenzien erhielt man wie folgt. pBR322, Restriktionsenzyme: NEB, Beverly, MA. Adenovirus vom Typ 2 (Ad2), Gewebskulturreagenzien: Gibco/BRL, Grand Island, NY. Profektions-Säugetiertransfektionssysteme: Promega, Madison, WI. Tumor- und normale Zelllinien: ATCC, Manassas, VA, außer BJ-Linie, welche man von J. Smith, U. von Texas Southwestern Medical Center erhielt.
  • Kurz gesagt, ein pBR322-basiertes Plasmid wurde hergestellt, welches das Genom des Adenovirus vom Typ 2 mit Deletionen von 356–548nt (E1a-Promotorregion) und 27971–30937nt (E3) enthält. Eine multiple Klonregion wurde an der Deletionsstelle des E1a-Promotors eingefügt, und der hTERT-Promotor (–239 bis –36nt) oder der CMV-Promotor (–524 bis –9nt) wurde anschließend geklont. Die Nummerierung der CMV-Sequenz stimmt überein mit Akrigg et al., Virus Res. 2:107, 1985. Die Nummerierung der Ad2-Sequenz stimmt überein mit „DNA Tumor Viruses: Molecular Biology of Tumor Viruses", J. Tooze ed., Cold Spring Harbor Laboratory, NY.
  • Diese Plasmid-DNAs wurden für die Freisetzung von ITRs mit SnaBl digeriert, dann wurde Phenol-Chloroform extrahiert, präzipitiert und für die Propagierung des Virus in 293A-Zellen transfiziert. Mehrere Zyklen von Plaque-Reinigungen wurden mittels A549-Zellen durchgeführt, und ein abschließendes Isolat wurde auf diesen gleichen Zellen expandiert. Die Viren wurden durch ein Plaque-Assay auf 293A-Zellen titriert und durch PCR auf die Gegenwart von 5'-WT-Ad-Sequenzen getestet. Durch HIRT-Extraktion wurde DNA von den Viren isoliert.
  • Das hTERT-Promotorkonstrukt wurde als AdphTERT-E1dlE3 bezeichnet. Das CMV-Promotorkonstrukt wurde mit AdCMV-E1dlE3 bezeichnet.
  • 4 zeigt die Wirkung dieser Viren auf normale und Krebs-abgeleitete Zelllinien. Jede Zelllinie wurde mit 5×10 in einem 48-Vertiefungen-Format plattiert und 24 h nach der Plattierung bei MOI = 20 infiziert. Die Zellen wurden dann über einen Zeitraum von 17–48 Tagen kultiviert und jeden vierten Tag mit Nährstoffen versorgt. Die in der Figur gezeigten Bilder entstanden 7 Tage nach der Infektion. Die oberste Reihe zeigt die Ergebnisse von Zellen, welche nicht viral infiziert wurden (Negativkontrolle). Die mittlere Reihe zeigt die Ergebnisse von Zellen, die mit onkolytischem Adenovirus infiziert wurden, in dem das Replikationsgen E1a wirkungsmäßig mit dem hTERT-Promotor verbunden ist. Die untere Reihe zeigt die Ergebnisse von Zellen, die mit Adenovirus infiziert wurden, bei dem E1a wirkungsmäßig mit dem CMV-Promotor verbunden ist (Positivkontrolle). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst: TABELLE 2 – Wirkung des onkolytischen Virus auf krebsartige und nicht krebsartige Zellen
    Figure 00680001
  • Alle getesteten Zelllinien waren durch AdCMV-E1dIE3 an Tag 17 nach der Infektion effektiv lysiert. Alle Tumorlinien waren durch AdphTERT-E1d1E3 in einem ähnlichen, aber leicht verzögerten Zeitrahmen lysiert worden, während normale Linien keine Anzeichen einer zytopathischen Wirkung zeigten und bis 6 Wochen nach der Infektion gesund blieben.
  • In einem parallelen Experiment wurde jede Zelllinie mit einem Adenovirus infiziert, welches das Gen, welches das grüne fluoreszente Protein als einen visuellen Marker (MO1=100) codiert, enthält, um die relative Transduktionseffizienz dieser Zellen durch Adenovirus-Vektoren zu bestimmen. Die Zelllinien zeigten eine große Spannbreite an Transduktionseffizienzen (~1–2% bis 100%). Selbst Zellen die schlecht transduziert sind, können mit dem hTERT-kontrollierten Adenovirus effizient ausgelöscht werden.
  • Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse, dass ein onkolytisches Virus hergestellt werden kann, indem ein genetisches Element, welches wesentlich für die Replikation des Virus unter der Kontrolle eines hTERT-Promotors ist, platziert wird. Replikation und Lysis findet in Krebszellen statt, jedoch nicht in differenzierten nicht-malignen Zellen.
  • 5 ist eine Abbildung des onkolytischen Adenovirus, das bei dem in 4 gezeigten Infektionsexperiment verwendet wurde. Es enthält den Inverted Terminal Repeat (ITR) des Adenovirus (Ad2), gefolgt vom mittellangen hTERT-Promotor (phTERT176), welcher wirkungsmäßig an der Adenovirus-E1a-Region gebunden ist, gefolgt vom Rest des Adenovirus, welcher für die E3-Region gelöscht wurde (ΔE3). Darunter werden einige modifizierte Konstrukte gezeigt. Das mittlere Konstrukt enthält eine zusätzliche Sequenz zwischen dem hTERT-Promotor und der E1a-Region. Die HI-Sequenz ist ein künstliches Intron hergestellt aus Adenovirus und Immunoglobulin-Intron-Splice-Donor- und -Acceptor-Sequenzen. Man nimmt an, dass das Einfügen eines Introns in die hTERT-Promotor-Adenovirusreplikationsgen-Kassette die Verarbeitung und den Transport heteronuklearer RNA stimulieren wird, was die Bildung der replizierten viralen Partikel vereinfacht. Das dritte Adenovirus-Konstrukt ist ähnlich, außer dass die verwendete E1a-Region am 5'-Ende um 51 Nukleotide länger ist. Man nimmt an, dass auch dies die effizientere. bedingte Replikation des onkolytischen Virus fördern könnte.
  • REFERENZEN
    • 1. Bello-Femandez (1993) Proc Natl Acad Sci USA. 90,7804–8.
    • 2. Bishop (1991) C.S.H. Symp. Quant. Biol. 56, 99–107.
    • 3. Bodnar (1996) Expl. Cell Res. 228, 58–64.
    • 4. Bodnar (1998) Science 279,349–52.
    • 5. Chase (1998) Nature Biotechnol. 16, 444–448.
    • 6. Coffey (1998) Science 282:1332–1334
    • 7. Counter (1992) EMBO J. 11, 1921–1929.
    • 8. Eilers (1989) Nature 340, 66–68.
    • 9. Eilers (1991) EMBO J. 10,133–41.
    • 10. Fujimoto.(1997) Biochem. & Biophys. Res. Comm. 241, 775–781.
    • 11. Galaktionov (1996) Nature 382, 511–7
    • 12. Grandori (1996) EMBO J. 15, 4344–57
    • 13. Grandori (1997) TIBS 22, 177–181.
    • 14. Greenberg (1998) Oncogene 16, 1723–30.
    • 15. Hartey (1990) Nature 345, 458–460.
    • 16. Harrington (1997) Genes Dev. 11, 3109–3115.
    • 17. Hastie (1990) Nature 346, 866–868.
    • 18. Hiyama (1995) Nature Med. 1, 249–255.
    • 19. Kilian (1997) Hum. Mol. Genet. 6, 2011–2019.
    • 20. Kim (1994) Science 266, 2011–2015.
    • 21. Kiyono (1998) Nature 396. 84–88.
    • 22. Klingelhutz (1996) Nature 380, 79–82.
    • 23. Kramm (1997) Hum. Gene Ther. 8, 2057–206B.
    • 24. Land (1983) Nature 304, 596–602.
    • 25. Lee (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94, 12886–91.
    • 26. Marhin (1997) Oncogene 14, 2825–34.
    • 27. Meyerson (1997) Cell 90, 785–795.
    • 28. Nakamura (1997) Science 277, 955–959.
    • 29. Nakayama (1998) Nature Genet. 18, 65–68.
    • 30. Reed (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83. 3982–3986.
    • 31. Schreiber-Agus (1995) Cell 80, 777–786.
    • 32. Smith (1998) Science 282, 1484–7.
    • 33. Toda (1998) Human Gene Therapy 9, 2177–2185.
    • 34. van Steensel (1997) Nature 385,740–3.
    • 35. Vaziri (1998) Curr. Biol. 8, 279–282.
    • 36. Wagner (1993) Cell Growth Differ. 4, 879–83.
    • 37. Wang (1998) Genes Dev. 12, 1769–74.
    • 38. Wright (1995) Trends Cell Biol. 5, 293–297.
    • 39. Xu (1997) Oncogene 15, 2589–2596.
  • BIOLOGISCHE MATERIALSAMMLUNG
  • Der Lambda-Klon mit der Bezeichnung λGφ5 (aus dem SEQ. ID. NR: 1 bestimmt wurde) wurde nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages mit der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110–2209 USA am 14. August 1997 unter der Zugangsnummer 98505 hinterlegt.
  • SEQUENZAUFLISTUNG SEQ. ID. NR: 1 (hTERT-Gensequenz bei GenBank Zugangsnr. AF121948)
    Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • SEQ. ID. NR: 2 (mTERT-Sequenz. GenBank Zugangsnr. AF121949)
    Figure 00760001
  • Figure 00770001
  • Figure 00780001

Claims (20)

  1. Onkolytisches Virus mit einem Genom, in dem ein Promotor der Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT) wirkungsmäßig mit einem genetischen Element verbunden ist, das für die Replikation oder das Zusammensetzen des Virus erforderlich ist, wobei der Promotor die Transkription des genetischen Elementes in die Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT) exprimierenden Zellen fördert, damit die Replikation des Virus fördert, und wobei die Replikation des Virus in einer Zelle zur Auflösung der Zelle führt.
  2. Onkolytisches Virus nach Anspruch 1, das ein replikationsbedingtes Adenovirus ist.
  3. Onkolytisches Virus nach Anspruch 1, das ein replikationsbedingtes Herpesvirus ist.
  4. Polynukleotid zum Zusammensetzen des onkolytischen Virus nach Anspruch 1, wobei ein Promotor der Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT) wirkungsmäßig mit einem genetischen Element verbunden ist, das für die Replikation oder das Zusammensetzen eines Virus erforderlich ist.
  5. Onkolytisches Virus oder Polynukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das genetische Element, das für die Replikation oder das Zusammensetzen eines Virus erforderlich ist, ein Adenovirus-E4-, E1a-, E1b- oder E2-Gen oder ein Herpes-Simplex-Virus-ICP6- oder ICP4-Gen ist.
  6. Onkolytisches Adenovirus nach Anspruch 2, wobei das genetische Element, das für die Replikation oder das Zusammensetzen erforderlich ist, eine Adenovirus-E1a-Region ist.
  7. Onkolytisches Virus oder Polynukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Promotor-Polynukleotid ein Promotor für humane Telomerase-Reverse-Transkriptase (hTERT) ist.
  8. Onkolytisches Virus oder Polynukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidsequenz des Promotors in Phage λGφ5 enthalten ist.
  9. Onkolytisches Virus oder Polynukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Promotor eines oder mehrere der folgenden Merkmale aufweist: a) er enthält eine Sequenz von mindestens ungefähr 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in SEQ ID NO: 1; b) er enthält eine Sequenz von mindestens ungefähr 500 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in SEQ ID NO: 1; c) er enthält eine Sequenz von mindestens ungefähr 100 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in SEQ ID NO: 2; d) er enthält eine Sequenz von mindestens ungefähr 500 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in SEQ ID NO: 2, oder e) er hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid, das zu einer Sequenz mit Merkmal a), b), c) oder d) komplementär ist, und weist die Eigenschaft auf, vorzugsweise Transkription in Zellen zu fördern, welche TERT exprimieren.
  10. Onkolytisches Virus oder Polynukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Promotor-Polynukleotid eines oder mehrere der folgenden Merkmale aufweist: a) es enthält die Sequenz von Position –117 bis zu Position –36 relativ zur Translationsstartstelle (Position 13545) von SEQ ID NO: 1; b) es enthält die Sequenz von Position –239 bis zu Position –36 relativ zur Translationsstartstelle (Position 13545) von SEQ ID NO: 1; c) es enthält die Sequenz von Position –117 bis zu Position +1 relativ zur Translationsstartstelle (Position 13545) von SEQ ID NO: 1; d) es enthält die Sequenz von Position –239 bis zu Position +1 relativ zur Translationsstartstelle (Position 13545) von SEQ ID NO: 1; e) es besteht aus nicht mehr als 82 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, oder f) es hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid, das zu einer Sequenz mit Merkmal a), b), c) oder d) komplementär ist, und weist die Eigenschaft auf, vorzugsweise Transkription in Zellen zu fördern, welche TERT exprimieren.
  11. Onkolytisches Virus oder Polynukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das ferner eine Codierregion aufweist, deren Expression für die Zelle toxisch ist, oder welche die Zelle für toxische Wirkungen eines Medikamentes empfänglicher macht.
  12. Onkolytisches Virus oder Polynukleotid nach dem vorhergehenden Anspruch, wobei die Codierregion Thymidinkinase codiert und das Medikament Ganciclovir ist.
  13. Verfahren zum Auswählen eines Virus mit Eigenschaften eines onkolytischen Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12, welches das Bereitstellen eines onkolytischen Virus, in dem der TERT-Promotor wirkungsmäßig mit einem genetischen Element verbunden ist, das für die Replikation oder das Zusammensetzen des Virus erforderlich ist, das Verwenden des Virus zum Infizieren einer TERT-exprimierenden Zelle und einer Zelle, die nicht TERT exprimiert, und Auswählen des Virus aufweist, falls es die Zelle tötet, welche TERT exprimiert.
  14. Verfahren zur Herstellung eines onkolytischen Virus nach Anspruch 1 bis 12, welches wirkungsmäßiges Verbinden der TERT-Promotorsequenz mit dem genetischen Element zum Bilden eines verbundenen Gens, Transfektieren des verbundenen Gens in eine Telomerase-exprimierende Zelle und anschließendes Propagieren des Virus, das aus der Zelle erhalten wurde, aufweist.
  15. In vitro-Verfahren zum Töten einer Telomerase-Reverse-Transkriptase exprimierenden Zelle, wobei das Verfahren in vitro Kontaktieren der Zelle mit dem onkolytischen Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 aufweist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Zelle eine Krebszelle ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Krebs aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Medulloblastoma, Gebärmutterhalskrebs und Fibrosarcoma besteht.
  18. Medikament, welches das onkolytische Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur medizinischen Verwendung enthält.
  19. Verwendung des onkolytischen Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 10 bei der Zubereitung eines Medikaments zur Krebsbehandlung.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei der Krebs aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Medulloblastoma, Gebärmutterhalskrebs und Fibrosarcoma besteht.
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19743497A1 (de) 1996-10-01 1998-08-20 Geron Corp Katalytische Untereinheit menschlicher Telomerase
US6610839B1 (en) 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
US6475789B1 (en) 1996-10-01 2002-11-05 University Technology Corporation Human telomerase catalytic subunit: diagnostic and therapeutic methods
US6777203B1 (en) 1997-11-19 2004-08-17 Geron Corporation Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences
US6093809A (en) 1996-10-01 2000-07-25 University Technology Corporation Telomerase
US7585622B1 (en) 1996-10-01 2009-09-08 Geron Corporation Increasing the proliferative capacity of cells using telomerase reverse transcriptase
US6808880B2 (en) 1996-10-01 2004-10-26 Geron Corporation Method for detecting polynucleotides encoding telomerase
US6261836B1 (en) 1996-10-01 2001-07-17 Geron Corporation Telomerase
US7622549B2 (en) 1997-04-18 2009-11-24 Geron Corporation Human telomerase reverse transcriptase polypeptides
US7413864B2 (en) 1997-04-18 2008-08-19 Geron Corporation Treating cancer using a telomerase vaccine
US7378244B2 (en) 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
US6900049B2 (en) 1998-09-10 2005-05-31 Cell Genesys, Inc. Adenovirus vectors containing cell status-specific response elements and methods of use thereof
DE19947668A1 (de) 1999-10-04 2001-04-19 Univ Eberhard Karls Tumorspezifischer Vektor für die Gentherapie
US6921665B2 (en) * 2000-11-27 2005-07-26 Roslin Institute (Edinburgh) Selective antibody targeting of undifferentiated stem cells
US6576464B2 (en) * 2000-11-27 2003-06-10 Geron Corporation Methods for providing differentiated stem cells
WO2002042468A2 (en) 2000-11-27 2002-05-30 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
AU2002230958A1 (en) * 2000-12-18 2002-07-16 Geron Corporation Chimeric cytolytic viruses for cancer treatment
EP1377672A2 (de) 2001-02-23 2004-01-07 Novartis AG Vektorkonstrukte
EP1373498A2 (de) * 2001-03-21 2004-01-02 Geron Corporation Tierisches gewebe mit kohlenhydratantigenen geeignet für die humantransplantation
US7211435B2 (en) 2001-06-21 2007-05-01 Sierra Sciences, Inc. Telomerase expression repressor proteins and methods of using the same
CN1195056C (zh) * 2001-07-12 2005-03-30 钱其军 一种在肿瘤细胞中特异性增殖及高效表达抗癌基因的重组病毒及其构建方法
WO2004002408A2 (en) * 2002-06-27 2004-01-08 Geron Corporation Cancer vaccine containing cross-species epitopes of telomerase reverse transcriptase
US8163892B2 (en) 2002-07-08 2012-04-24 Oncolys Biopharma, Inc. Oncolytic virus replicating selectively in tumor cells
JP3867968B2 (ja) 2002-07-08 2007-01-17 関西ティー・エル・オー株式会社 腫瘍細胞において選択的に増殖する腫瘍融解ウイルス
KR100523028B1 (ko) * 2003-02-27 2005-10-20 윤채옥 개선된 암세포 특이성과 활성을 가지는 사람 텔로미어역전사효소 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터
US7153650B2 (en) 2003-03-13 2006-12-26 Geron Corporation Marker system for preparing and characterizing high-quality human embryonic stem cells
US7598077B2 (en) 2003-06-05 2009-10-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Compositions and methods for enhancing differential expression
EP1925626A1 (de) 2003-07-21 2008-05-28 Transgene S.A. Neue multifunktionelle Cytokine
US7473418B2 (en) 2004-03-25 2009-01-06 Cell Genesys, Inc. Pan cancer oncolytic vectors and methods of use thereof
JP4635196B2 (ja) * 2005-03-04 2011-02-16 国立大学法人広島大学 遺伝子導入細胞、及びそれを用いたテロメラーゼ誘導物質の検出方法
AU2006220500A1 (en) 2005-03-09 2006-09-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Novel hTMC promoter and vectors for the tumor-selective and high-efficient expression of cancer therapeutic genes
RU2482189C2 (ru) 2007-01-30 2013-05-20 Трансген С.А. Полипептиды е2 папилломавируса, применяемые для вакцинации
AU2010206195B2 (en) 2009-01-20 2016-03-10 Transgene Sa Soluble ICAM-1 as biomarker for prediction of therapeutic response
NZ595290A (en) 2009-03-24 2012-09-28 Transgene Sa Biomarker for monitoring patients
US20120058493A1 (en) 2009-04-17 2012-03-08 Bruce Acres Biomarker for monitoring patients
MX337287B (es) 2009-07-10 2016-02-22 Transgene Sa Biomarcador para seleccionar pacientes y metodos relacionados.
CN109134640A (zh) 2012-10-23 2019-01-04 爱默蕾大学 Gm-csf和il-4轭合物、组合物以及与其相关的方法
US9846157B2 (en) 2012-10-26 2017-12-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions, methods and microfluidics device for telomerase based in vitro diagnostic assays for detecting circulating tumor cells (CTC)
WO2016057387A1 (en) 2014-10-06 2016-04-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for isolation of circulating tumor cells (ctc)
CN114703186B (zh) * 2022-03-31 2023-08-29 四川大学 肿瘤特异性启动子及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5728379A (en) * 1994-06-23 1998-03-17 Georgetown University Tumor- or cell-specific herpes simplex virus replication
DE19743497A1 (de) * 1996-10-01 1998-08-20 Geron Corp Katalytische Untereinheit menschlicher Telomerase
DE19757984A1 (de) * 1997-12-24 1999-07-01 Bayer Ag Regulatorische DNA-Sequenzen aus der 5'-Region vom Gen der humanen katalytischen Telomerase-Untereinheit udn deren diagnostische und therapeutische Verwendung

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