ES2220448T3 - Secuencias reguladoras de la transcripcion de la telomerasa transcriptasa inversa. - Google Patents
Secuencias reguladoras de la transcripcion de la telomerasa transcriptasa inversa.Info
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Abstract
Un virus oncolítico que tiene un genoma en el que un promotor de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) está unido operativamente a un elemento genético esencial para la replicación o montaje del virus, donde el promotor promueve la transcripción del elemento genético en células que expresan la telomerasa transcriptasa inversa (TERT), con lo que promueve la replicación del virus, y donde la replicación del virus en una célula conduce la lisis de la célula.
Description
Secuencias reguladoras de la transcripción de la
telomerasa transcriptasa inversa.
Esta solicitud reivindica la prioridad de la
Solicitud de Patente de Estados Unidos 09/244.438.
La invención se refiere, en general, a los campos
de los elementos reguladores genéticos que controlan la
transcripción de proteínas en células eucariotas, y de las
construcciones virales recombinantes útiles para el tratamiento de
enfermedades, incluyendo el cáncer. Más específicamente, la
invención describe promotores basados en elementos reguladores para
la telomerasa transcriptasa inversa, secuencias de control de la
transcripción y el uso de estas características en el diseño de
virus oncolíticos.
Desde hace mucho tiempo se ha reconocido que la
replicación completa de los extremos de los cromosomas eucarióticos
requiere componentes celulares especializados (Watson (1972) Nature
New Biol. 239:197; Olovnikov (1973) J. Theor. Biol. 41:181). La
replicación de una cadena de ADN lineal por ADN polimerasas
convencionales requiere un cebador de ARN, y puede avanzar sólo en
la dirección 5' a 3'. Cuando se retira el cebador de ARN unido a los
extremos 5' de las cadenas de ADN cromosómicas eucarióticas, se
introduce un hueco, lo cual conduce a un acortamiento progresivo de
las cadenas hijas con cada vuelta de replicación. Se cree que este
acortamiento de los telómeros, las estructuras de
proteína-ADN localizadas físicamente en los extremos
de los cromosomas, explica el fenómeno de senescencia celular o
envejecimiento de las células somáticas humanas normales in
vitro e in vivo (Goldstein (1990) Science 249:1129;
Martin (1979) Lab. Invest. 23.86; Goldstein (1969). Proc. Natl.
Acad. Sci. Estados Unidos 64:155; Schneider (1976) Proc Natl. Acad.
Sci. Estados Unidos, 73:3584; Harley (1990), Nature
345:458-460; Hastie (1990) Nature 346:
866-868: Counter (1992) EMBO J.
11:1921-1929; Bodnar (1998) Science
279:349-52).
De esta manera, la longitud e integridad de los
telómeros está relacionada con la entrada de una célula en un
estado senescente. Además, la capacidad de una célula de mantener
(o aumentar) la longitud de los telómeros puede permitir que una
célula escape a la senescencia.
El mantenimiento de los telómeros es una función
de una ADN polimerasa específica conocida como telomerasa
transcriptasa inversa (TERT). La telomerasa es una
ribonucleoproteína (RNP) que usa una porción de su resto de ARN como
plantilla para la síntesis repetida del ADN de los telómeros (Morin
(1997) Eur. J. Cancer 33:750). Consistente con la relación de los
telómeros y la TERT con la capacidad proliferativa de una célula,
puede detectarse actividad telomerasa en tipos celulares muy
replicativos tales como células madre. También es activa en una
serie extraordinariamente diversa de tejidos tumorales, pero no es
activa en cultivos de células somáticas normales o en tejidos
normales adyacentes a un tumor (Patentes de Estados Unidos Nº
5.629.154; 5.489.508; 5.648.215 y 5.639.613; Morin (1989) Cell
59:521; Shay (1997) Eur. J. Cancer 33:787; Kim (1994) Science
266:2011). Además, se ha informado sobre una correlación entre el
nivel de actividad telomerasa en un tumor y las consecuencias
clínicas probables del paciente (Patente de Estados Unidos Nº
5.639.613; Langford (1997) Hum. Pathol. 28:416).
También se ha detectado actividad telomerasa en
células germinales humanas, células madre o progenitoras en
proliferación, y linfocitos activados. En las células madre o
progenitoras somáticas y en los linfocitos activados, la actividad
telomerasa típicamente es muy baja o sólo se expresa
transitoriamente (Chiu (1996) Stem Cells 14:239; Bodnar (1996) Exp.
Cell Tes. 228:58; Taylor (1996) J. Invest. Dermatol. 106:759).
Las Patentes del Reino Unido GB 2317891 B y GB
2321642 B, y la Publicación de Patente Internacional WO 98/14593
(Geron Corporation) describen la secuencia génica de la subunidad
catalítica de la telomerasa humana (hTERT). Takakura et al.
(Cancer Res. 59:551, 1999) informan sobre la clonación del promotor
del gen hTERT y la identificación de secuencias promotoras de
núcleo proximales esenciales para la activación de la transcripción
en células inmortalizadas y cancerosas. La publicación de Patente
Internacional WO 99/33998 (Bayer AG), presentada después de la
fecha de prioridad de esta solicitud, informa sobre secuencias de
ADN reguladoras del gen de la subunidad catalítica de la telomerasa
humana, y su uso para realizar diagnósticos y para terapia. Cong
et al. (Hu Molec. Genetics 8.137, 1999) también presentaron,
después de la fecha de prioridad de esta solicitud, un informe
sobre la organización del gen hTERT y la caracterización del
promotor. La Patente de Estados Unidos 5.728.379 (Georgetown
University) informa sobre la replicación específica de tumor o de
célula del virus del herpes simple.
El resumen anterior pretende introducir el campo
de la presente invención al lector. Las referencias citadas en esta
solicitud no deben considerarse técnica anterior admitida.
Esta descripción explica que la telomerasa
transcriptasa inversa (TERT) es una diana ideal para tratar
enfermedades humanas relacionadas con la proliferación celular y la
senescencia, tales como el cáncer. Los elementos de control de la
transcripción de actuación cis de esta invención permiten la
identificación de factores de control de la transcripción de
actuación trans. El descubrimiento y caracterización de un promotor
específico para células que expresan TERT ha proporcionado una
oportunidad para desarrollar nuevas terapias para enfermedades
importantes.
Una realización de la invención es un virus
oncolítico que tiene un genoma en el que un promotor de la
telomerasa transcriptasa inversa (TERT) está unido operativamente a
un elemento genético esencial para la replicación o montaje del
virus. El promotor dirige la transcripción del elemento genético en
células que expresan la telomerasa transcriptasa inversa (TERT),
originando de esta manera la replicación del virus. La replicación
del virus en una célula a su vez conduce a la lisis de la
célula.
Otra realización es un componente
polinucleotídico adecuado para el montaje de un virus oncolítico de
esta invención, en el que un promotor para TERT está unido
operativamente a un elemento genético esencial para la replicación
o montaje de un virus.
Los ejemplos de virus competentes en cuanto a la
replicación de esta invención incluyen adenovirus y herpesvirus
condicionales con respecto a la replicación. Son ejemplos de
elementos genéticos asociados al promotor los genes de adenovirus
E4, E1a, E1b o E2 y los genes del virus del herpes simple ICP6 o
ICP4.Ciertas secuencias promotoras de TERT ilustrativas están
contenidas en el fago \lambdaG\varphi5, depositado en la ATCC
con el Nº de Acceso 98505. La secuencia puede contener
aproximadamente 100 ó 500 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº:
1 ó 2, o una secuencia que hibrida con el complemento de la misma y
que tiene la característica de promover preferentemente la
transcripción en células que expresan TERT. Más adelante, en la
descripción se describen porciones ilustrativas de la secuencia del
gen TERT. Opcionalmente, el virus oncolítico también puede contener
una región codificante cuya expresión sea tóxica para la célula, o
que hace que la célula sea más susceptible a los efectos tóxicos de
un fármaco, por ejemplo, el gen puede codificar timidina quinasa,
haciendo que la célula sea susceptible al fármaco ganciclovir.
Otra realización es un método para seleccionar un
virus que tiene características de un virus oncolítico de la
invención. Se proporciona una construcción de virus en la que un
promotor de TERT está unido operativamente a un elemento genético
requerido para la replicación o montaje del virus, que se usa para
infectar una célula que expresa TERT y una célula que no expresa
TERT. Después se selecciona un virus si destruye preferentemente la
célula que expresa TERT. Otra realización es un método para
producir un virus oncolítico de la invención, que comprende unir
operativamente una secuencia promotora de TERT a un elemento
genético para formar un gen unido; introducir el gen unido por
transfección en una célula que expresa telomerasa; y después
propagar el virus obtenido a partir de la célula.
Otra realización de la invención es un método
para destruir una célula que expresa la telomerasa transcriptasa
inversa, que comprende poner en contacto la célula con el virus
oncolítico de la invención. La célula puede ser una célula
cancerosa. Otra realización es un medicamento que comprende el virus
oncolítico de la invención para uso en medicina, o para el
tratamiento de un cáncer. Las malignidades ilustrativas incluyen
cáncer de pulmón, cáncer pancreático, meduloblastoma, carcinoma
cervical y fibrosarcoma.
Por medio de la siguiente descripción se
percibirá una comprensión adicional de la naturaleza y de las
ventajas de la invención.
La figura 1 es un mapa de restricción del clon
\lambdaG\varphi5 del fago lambda, usado para obtener la
secuencia situada aproximadamente 15 kbases cadena arriba del sitio
de inicio de la traducción. Esta región incluye el promotor de
hTERT.
La figura 2 es un mapa que muestra las
características de un promotor de hTERT-plásmido
indicador. Los plásmidos indicadores se han usado para demostrar
que el promotor promueve específicamente la transcripción en células
que expresan TERT, incluyendo células cancerosas.
La figura 3 es una alineación de secuencias, que
compara regiones del promotor de hTERT (SED IC Nº: 1) con la de
mTERT (SEC ID Nº: 2). Se usaron regiones de homología para
identificar elementos reguladores. La figura 3(A) muestra la
posición de motivos reguladores de la transcripción de actuación cis
conservados, incluyendo la caja E (el sitio de unión a Myc/Max,
indicado por un sombreado) y los sitios SP1 (subrayados). El panel
inferior ilustra las secuencias proximales de las construcciones
indicadoras hTERT de 2,5 kb y caja E, incluyendo la región
delecionada en la construcción indicadora de caja E, como se
describe en el ejemplo 8. La figura 3(B) muestra la
identificación de otros elementos reguladores. La numeración
mostrada se calcula a partir del sitio de inicio de la
traducción.
La figura 4 es un fotograbado a media tinta de
líneas celulares fotografiadas siete días después de la infección
con un virus oncolítico. Fila superior: células no infectadas
(control negativo). Fila central: células infectadas con adenovirus
oncolítico en el que el gen de replicación E1a está nido
operativamente al promotor de hTERT. Fila inferior: células
infectadas con adenovirus en el que E1a está unido operativamente
al promotor de CMV (control positivo).
Las células ensayadas fueron las siguientes:
figura 4(A): BJ (fibroblastos de prepucio);
IMR-90 (fibroblastos de pulmón);
WI-38 (fibroblastos de pulmón); células de origen
no maligno. Figura 4(B): A549 (carcinoma de pulmón)
AsPC-1 y BxPC-3 (adenocarcinoma,
páncreas). Figura 4(C): DAOY (meduloblastoma); HeLa
(carcinoma cervical); HT1080 (fibrosarcoma). Los resultados
demuestran que el virus oncolítico regulado por hTERT lisa
específicamente las células cancerosas, con preferencia a las
líneas celulares que no expresan la telomerasa transcriptasa
inversa a un nivel substancial. Esto contrasta con el virus
oncolítico regulado por un promotor constitutivo tal como el
promotor de CMV, que lisa las células de forma no específica.
La figura 5 es una serie de mapas que muestran la
construcción de adenovirus oncolíticos, que se han hecho
condicionalmente replicativos poniendo la replicación de E1a bajo
el control de un promotor de hTERT. La primera construcción
comprende la repetición terminal invertida (ITR) del adenovirus
(Ad2); seguido de promotor de longitud media de hTERT (pGRN176)
unido operativamente a la región E1a de adenovirus; seguido del
resto del adenovirus en el que se ha delecionado la región E3
(\Delta3). Esta construcción se usó en los experimentos de
infección de virus mostrados en la figura 4. La segunda
construcción de adenovirus condicionalmente replicativa mostrada en
la figura comprende una secuencia adicional entre el promotor de
hTERT y la región E1a. La secuencia HI es un intrón artificial
obtenido por ingeniería genética a partir de secuencias de ayuste
de intrones de adenovirus e inmunoglobulina. La tercera construcción
de adenovirus es similar, con la excepción de que la región E1a
usada es mayor en el extremo 5' en 51 nucleótidos.
La invención proporciona nuevos polinucleótidos
aislados que comprenden secuencias de control de la transcripción
de actuación cis de los genes de la telomerasa transcriptasa
inversa. Los polinucleótidos de la invención incluyen los basados o
derivados de secuencias genómicas de regiones no transcritas,
transcritas y de intrones de genes TERT, incluyendo el homólogo
humano y de ratón. Las secuencias de control de la transcripción de
TERT de actuación cis incluyen las que regulan y modulan la
temporización y las velocidades de transcripción del gen TERT. Las
secuencias promotoras de TERT de la invención incluyen elementos de
actuación cis tales como promotores, potenciadores, represores y
secuencias polinucleotídicas que pueden unirse a factores que
influyen sobre la transcripción.
Como se ha descrito en el ejemplo 1, el promotor
de hTERT (SEC ID Nº: 1) se obtuvo secuenciando un inserto de un
fago lambda aislado a partir de un biblioteca genómica humana. Este
clon lambda se denomina \lambdaG\varphi5 y se ha depositado en
la ATCC con el número de acceso 98505. Lambda G\theta5 contiene un
inserto de 15,3 kilopares de bases (kpb) que incluye
aproximadamente 13.500 bases cadena arriba de la secuencia
codificante de hTERT. Estas secuencias promotoras de hTERT se
subclonaron adicionalmente en plásmidos. Un fragmento Not1 (SEC ID
Nº: 1) de \lambdaG\varphi5 que contenía las secuencias
promotoras de hTERT se subclonó en orientaciones opuestas en el
sitio Not1 de plásmidos derivados de pUC (denominados pGRN142 y
pGRN143, respectivamente, y se secuenció pGRN142.
En la SEC ID Nº: 1, el inserto genómico de hTERT
empieza en el resto 44 y termina en el resto 15375. El inicio del
ADNc a partir del cual se obtuvo empieza en el resto 13490. El
codón de inicio de la traducción ATG de hTERT empieza en el resto
13545. Las secuencias promotoras de hTERT no transcritas están
cadena abajo del resto 44 y cadena arriba de la región codificante,
y también pueden residir en el primer intrón. En células
inmortales, un gen indicador dirigido por una secuencia cadena
arriba de la secuencia codificante de TERT dirigió la expresión tan
eficazmente como el control positivo (que contenía un promotor
temprano y potenciador de SV40). Ciertas secuencias promotoras de
TERT de la invención también incluyen secuencias de intrones.
Para identificar secuencias reguladoras de la
transcripción de actuación cis en secuencias de TERT humana y de
TERT de ratón en posición 5' con respecto a su secuencia
codificante de TERT respectiva, las secuencias promotoras de humano
y de ratón se analizaron para comprobar su identidad de secuencia.
La alineación de las primeras 300 bases cadena arriba de las
secuencias codificantes de humano y de ratón indicaron varias
regiones conservadas, y se identificaron supuestas secuencias
reguladoras de la transcripción de actuación cis (figura
3(A)).
En particular, hay motivos muy conservados
localizados en los restos -34 a -29 cadena arriba del sitio de
inicio de la traducción de TERT humana (ATG, A en 13545 de la SEC
ID Nº: 1) y en los restos -32 a -27 cadena arriba del sitio de
inicio de la traducción de TERT de ratón (ATG). Corresponden a un
motivo de actuación cis que se sabe que interacciona con
c-Myc, la denominada "caja E" o "sitio de
unión a Myc/Max". Específicamente, están muy conservados con
respecto a los nucleótidos de núcleo que constituyen la caja E, los
nucleótidos que flanquean la caja E y la posición de la caja E con
respecto al sitio de inicio de la traducción. Se identificó una
segunda caja E en los restos -242 a -237 cadena arriba del sitio de
inicio de la traducción de TERT humana. Esta segunda caja E no se
había conservado en el promotor de ratón. Estas observaciones
confirman el hallazgo de que el sitio de unión a Myc conservado, por
interacción con c-Myc como factor regulador de la
transcripción de actuación trans, participa de forma importante en
la regulación del promotor de TERT y en la expresión de la
telomerasa.
La alineación de secuencias identificó elementos
reguladores de la transcripción de actuación cis conservados
adicionales en el promotor del gen TERT. Por ejemplo, se
identificaron dos sitios de unión SP1 localizados en el resto -168
a -159 y en el resto -133 a -121 con respecto al sitio de inicio de
la traducción de TERT, que están muy conservados entre los
promotores de TERT de humano y de ratón. También se encontraron
dentro de esta región tanto del promotor humano como del promotor
de ratón sitios de unión (secuencias de actuación cis) para varios
factores de la transcripción distintos, incluyendo el producto
génico de la región determinante del sexo Y (SRY), factores
nucleares hepáticos 3-\beta y 5,
TFIID-MBP, E2F y c-Myb.
Otro análisis adicional de las secuencias
promotoras de TERT humana y de ratón indicaron otras regiones de
conservación de la secuencia. En particular, se encontró una región
con un alto grado de identidad de secuencia entre el promotor
humano y de ratón entre el resto -1106 y el resto -1602 cadena
arriba del sitio de inicio de la traducción de TERT humana y entre
el resto -916 y el resto -1340 cadena arriba del sitio de inicio de
la traducción de TERT de ratón (figura 3(B)). De esta
manera, la invención proporciona secuencias de actuación cis
específicas para la modulación de la transcripción de TERT. En una
realización preferida, los métodos de la invención usan estos
motivos reguladores de la transcripción específicos de TERT humana
y de ratón para identificar y aislar factores reguladores de la
transcripción de actuación trans específicos de TERT y otros
factores reguladores de la transcripción de actuación trans.
La invención también proporciona los reactivos y
métodos para seleccionar y aislar factores reguladores de la
transcripción de TERT de actuación trans. Otras realizaciones
alternativas incluyen nuevos sistemas de ensayo in vitro e
in vivo basados en células para seleccionar agentes de unión
al promotor de TERT (factores reguladores de la transcripción de
TERT de actuación trans) usando los ácidos nucleicos de la
invención.
El uso de construcciones recombinantes que
comprenden secuencias del promotor de TERT de la invención ha
demostrado, por primera vez, que c-Myc actúa como
un potente activador de la actividad telomerasa por interacción
directa con secuencias reguladoras de actuación cis en el promotor
de TERT. c-Myc actúa a través de la regulación
positiva rápida de la expresión del gen hTERT (ejemplo 8).
Significativamente, los estudios demuestran que la activación de la
transcripción del promotor de hTERT por c-Myc puede
anularse por medio de la deleción o mutación de una sola secuencia
reguladora de actuación cis, el "sitio de unión a Myc/Max",
dentro del promotor de hTERT. Además, la capacidad de un
c-Myc inducible de potenciar la expresión de hTERT
es resistente a la inhibición de la síntesis de proteínas.
La invención también proporciona construcciones
en las que las secuencias promotoras de TERT de la invención están
unidas operativamente a un gen heterólogo (en una realización
preferida, un gen estructural). De esta manera, el gen heterólogo
se transcribe en las mismas células al mismo tiempo que se
expresaría el transcrito de TERT natural. De esta manera, cuando la
construcción se expresa en una célula transformada o en un animal
transgénico (no humano), el gen heterólogo (y la proteína, si el
gen es una secuencia codificante) se expresa en el mismo modelo
temporal sobre la misma serie de células que el gen TERT dirigido
por el promotor de TERT de tipo silvestre.
Estas construcciones son útiles para ensayos
basados en el promotor de TERT, por ejemplo, para identificar
moduladores biológicos de TERT y de la actividad telomerasa. En
realizaciones alternativas, la secuencia codificante heteróloga
unida operativamente a un promotor de TERT de la invención es un gen
marcador (por ejemplo, fosfatasa alcalina, SEAP;
\beta-galactosidasa), un gen estructural de TERT
modificado o un TERT anti-sentido, o un gen
terapéutico (por ejemplo, un gen citotóxico tal como timidina
quinasa).
En otra realización se proporcionan virus
citopáticos, en particular virus citopáticos humanos, tales como
adenovirus modificados o herpesvirus. Los virus, tales como
adenovirus o herpesvirus, requieren genes codificados viralmente
esenciales para proliferar y lisar células específicas. Si uno
cualquiera de estos genes virales esenciales se modificara de tal
forma que la expresión del elemento esencial se dirigiera por el
promotor de TERT, la proliferación del virus y sus efectos
citopáticos se restringiría a células que expresan telomerasa, en
particular a células tumorales.
Los siguientes términos se definen más adelante
para proporcionar directrices adicionales a un especialista en la
práctica de la invención.
El término "amplificar", como se usa en este
documento, incorpora su uso común y se refiere al uso de cualquier
metodología de amplificación adecuada para generar o detectar
ácidos nucleicos recombinantes o expresados de forma natural. Por
ejemplo, la invención proporciona métodos y reactivos (incluyendo
pares de cebadores de PCR oligonucleotídicos específicos) para
amplificar ácidos nucleicos recombinantes o expresados de forma
natural de la invención in vivo e in vitro. Puede
obtenerse una indicación de que dos polinucleótidos son
"substancialmente idénticos" amplificando uno de los
polinucleótidos con un par de cebadores oligonucleotídicos o
conjunto de cebadores degenerados (por ejemplo, fragmentos de una
secuencia del promotor de TERT) y después usando el producto como
sonda en condiciones de hibridación rigurosas para aislar la
segunda secuencia (por ejemplo, la secuencia del promotor de TERT) a
partir de una biblioteca genómica o para identificar la segunda
secuencia en una transferencia de Northern o de Southern.
Como se usa en este documento, la expresión
"promotor de TERT" incluye cualquier secuencia genómica de
TERT capaz de dirigir la transcripción en células positivas con
respecto a la actividad telomerasa. De esta manera, los promotores
de TERT de la invención incluyen, sin limitación, elementos de
control de la transcripción de actuación cis y secuencias
reguladoras que están implicadas en la regulación o modulación de
la temporización y/o velocidad de transcripción de un gen TERT. Por
ejemplo, el promotor de TERT de la invención comprende elementos de
control de la transcripción de actuación cis, incluyendo
potenciadores, promotores, terminadores de la transcripción,
orígenes de replicación, secuencias de integración cromosómica,
regiones no traducidas 5' y 3', exones e intrones, que están
implicados en la regulación de la transcripción. Estas secuencias
de actuación cis típicamente interaccionan con proteínas u otras
biomoléculas para realizar (activar/desactivar, regular, modular,
etc.) la transcripción.
Un especialista en la técnica apreciará que las
secuencias promotoras de hTERT y mTERT proporcionadas en este
documento son sólo ilustrativas, y que pueden usarse como base para
producir numerosas versiones de los promotores de TERT, es decir,
promotores que son capaces de dirigir la transcripción en células
positivas con respecto a la actividad telomerasa. Por ejemplo,
aunque en este documento se demuestra que una secuencia que
comprende 2447 nucleótidos del promotor de hTERT descrito puede
dirigir la expresión de esta manera (pGRN350), un especialista en
la técnica apreciará que tal actividad puede obtenerse usando
secuencias promotoras más largas o más cortas. Además, un
especialista en la técnica apreciará que también pueden usarse
ciertas secuencias promotoras que harían de las secuencias
proporcionadas en este documento, por ejemplo, por adiciones,
deleciones o substituciones de nucleótidos, para obtener la
expresión en células positivas con respecto a la actividad
telomerasa. Tales variantes compartirán un nivel mínimo especificado
de similitud estructural (de secuencia) con las secuencias
promotoras de TERT descritas, similitud que puede definirse en
términos de identidad de secuencia con las secuencias promotoras de
TERT descritas, o la capacidad de hibridar con las secuencias
descritas a niveles específicos de rigurosidad de hibridación. Por
ejemplo, los promotores de TERT variantes incluyen promotores que
hibridan con los promotores de TERT descritos en este documento (a
37ºC en un tampón de formamida al 40%, NaCl 1 M y SDS al 1%,
seguido de un lavado en 1 X SSC a 45ºC) y que son capaces de dirigir
la transcripción en células positivas con respecto a la actividad
telomerasa. Otros promotores de TERT variantes incluyen promotores
que comparten una identidad de secuencia de al menos
aproximadamente un 80%, 90%, 95%, 98% o 100% con los promotores de
TERT descritos. La identidad de secuencia se calcula alineando
primero el polinucleótido a examinar con el homólogo de referencia,
y después contando el número de restos compartidos entre las
secuencias que se están comparando como un porcentaje de la región
bajo examen. No se impone ninguna penalidad por la presencia de
inserciones o deleciones, pero las inserciones o deleciones se
permiten sólo cuando se requieren claramente para reajustar la
alineación. El porcentaje se proporciona en términos de restos en
la secuencia a examinar que son idénticos a restos presentes en la
secuencia de comparación o de referencia.
La determinación de que un promotor es capaz de
dirigir la transcripción en células positivas con respecto a la
actividad telomerasa puede realizarse rutinariamente como se
describe en los ejemplos 2 y 5. En resumen, el promotor a ensayar
se une operativamente a una región codificante que codifica una
proteína detectable tal como la fosfatasa alcalina o la proteína
fluorescente verde. Esta construcción después se introduce en
células positivas con respecto a la actividad telomerasa (TAP) y
negativas con respecto a la actividad telomerasa (TAN). La
detección de la proteína detectable en las células TAP pero no en
las células TAN, o de un nivel elevado de la proteína detectable en
las células TAP en comparación con las células TAN (preferiblemente
una diferencia de al menos tres veces) indica que el promotor es un
promotor de TERT.
Se dice que un promotor "preferentemente
promueve la transcripción" en una célula que tiene un fenotipo
particular si el nivel de transcripción es al menos aproximadamente
3 veces mayor en las células de ese fenotipo que en células que
carecen del fenotipo. Los promotores de esta invención
preferentemente promueven la transcripción en células que expresan
TERT, incluyendo células enfermas en las que la enfermedad está
asociada con una sobreexpresión de TERT, tales como células
cancerosas. Existe una transcripción preferente si el aumento
relativo en las células que expresan el fenotipo indicado es al
menos 3 veces, 10 veces, 30 veces o 100 veces mayor en comparación
con las células que no tienen el fenotipo, en orden de preferencia
creciente. Los promotores que muestran menores niveles de
especificidad en un ensayo en el que se comparan sólo dos tipos de
células pueden ensayarse usando un panel mayor. Un especialista en
la técnica sabrá que las células TERT positivas incluyen diversos
tipos de células ancerosas, diversos tipos de células progenitoras
y células madre y, en ciertas condiciones, linfocitos B y T. Los
controles negativos adecuados incluyen cultivos primarios y líneas
celulares establecidas de células diferenciadas maduras de la
mayoría de los tipos de tejidos.
En realizaciones alternativas, la secuencia
promotora de TERT comprende secuencias de TERT cadena arriba del
sitio de inicio de la traducción (ATG), por ejemplo, en una
realización, el promotor de hTERT comprende los restos 44 a 13545
de la SEC ID Nº: 1. Otras realizaciones incluyen secuencias que
empiezan dentro de aproximadamente 1 a 5 nucleótidos de un codón de
inicio de la traducción (por ejemplo, en la SEC ID Nº: 1 o SEC ID
Nº: 2) y que terminan aproximadamente a 50, 100, 150, 200, 250,
500, 1000, 2500 ó 13500 nucleótidos cadena arriba del codón de
inicio de la traducción. Tales realizaciones pueden incluir
opcionalmente otras secuencias reguladoras tales como secuencias de
exones y/o intron es. Otra realización incluye secuencias de
intrones de TERT con actividad reguladora, como se describe en el
ejemplo 2. Los promotores de hTERT de la invención también incluyen
secuencias substancialmente idénticas (como se definen en este
documento) a la secuencia del promotor de hTERT ilustrativo de la
invención, que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 1. De
forma similar, los promotores de mTERT de la invención también
incluyen secuencias substancialmente idénticas a una secuencia del
promotor de mTERT ilustrativo de la invención, que tiene la
secuencia indicada por la SEC ID Nº: 2.
El término "heterólogo", cuando se usa
haciendo referencia a porciones de un ácido nucleico, indica que el
ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se
encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por
ejemplo, el ácido nucleico típicamente se produce de forma
recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados
dispuestas de una manera no encontrada en la naturaleza; tal como
una secuencia promotora de la invención unida operativamente a una
secuencia que codifica un polipéptido que, cuando está unida
operativamente, no reforma el gen TERT natural. Por ejemplo, la
invención proporciona construcciones recombinantes (cassettes de
expresión, vectores, virus y similares) que comprenden diversas
combinaciones de promotores de la invención, o subsecuencias de los
mismos y secuencias codificantes heterólogas.
Como se usa en este documento, "aislado",
cuando hace referencia a una molécula o composición tal como una
secuencia promotora de hTERT, significa que la molécula o
composición está separada de al menos otro compuesto, tal como una
proteína, ADN, ARN u otros contaminantes con los que está asociada
in vivo o en su estado natural. De esta manera, una
secuencia de ácido nucleico se considera aislada cuando se ha
aislado de cualquier otro componente con el que está asociada de
forma natural. Sin embargo, una composición aislada también puede
ser substancialmente pura. Una composición aislada puede estar en un
estado homogéneo. Puede estar en seco o en una solución acuosa. La
pureza y la homogeneidad pueden determinarse por técnicas de
química analítica tales como electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE), electroforesis en gel de agarosa o
cromatografía líquida de alta presión (HPLC).
Como se usan en este documento, las expresiones
"ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan
indistintamente e incluyen oligonucleótidos. También se refieren a
ácidos nucleicos sintéticos y/o no naturales (incluyendo análogos de
ácidos nucleicos o enlaces o restos de esqueleto modificados). Las
expresiones también se refieren a desoxirribonucleótidos u
oligonucleótidos de ribonuclótidos en forma monocatenaria o
bicatenaria. Las expresiones incluyen ácidos nucleicos que
contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. La expresión
también incluye estructuras similares a ácidos nucleicos con
esqueletos sintéticos. Los análogos de esqueleto de ADN
proporcionados por la invención incluyen fosfodiéster,
fosforotioato, fosforoditioato, metil-fosfonato,
fosforamidato, alquil fosfotriéster, sulfamato,
3'-tioacetal, metileno(metilimino),
3'-N-carbamato, morfolino carbamato
y ácidos péptido nucleicos (PNA); véase Oligonucleotides and
Analogues, a Practical Approach, editado por F. Eckstein, IRL Press
at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of
the New York Academy of Sciences, Volumen 600, Eds. Baserga and
Denhardt (NYAS 1992); Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923 -1937;
Antisense Research and Applications (1993, CRC Press). Los PNA
contienen esqueletos no iónicos, tales como unidades de
N-(2-aminoetil)glicina. Se describen enlaces
de fosforotioato en los documentos WO 97/03211; WO 96/39154, Mata
(1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197. Otros
esqueletos sintéticos incluidos por la expresión incluyen enlaces
de metil-fosfonato o enlaces de metilfosfonato y
fosfodiéster alternos (Strauss-Soukup (1997)
Biochemistry 36:8692-8698) y enlaces de
bencil-fosfonato (Samstag (1996) Antisense Nucleic
Acid Drug Dev 6:153-156).
Como se usa en este documento, la expresión
"unido operativamente" se refiere a una relación funcional
entre dos o más segmentos de ácido nucleico. Típicamente, se
refiere a la relación funcional entre una secuencia reguladora de
la transcripción y una secuencia transcrita. Por ejemplo, una
secuencia del promotor de TERT de la invención, incluyendo cualquier
combinación de elementos de control de la transcripción de
actuación cis, está unida operativamente a una secuencia
codificante si estimula o modula la transcripción de la secuencia
codificante en una célula hospedadora apropiada u otro sistema de
expresión. Generalmente, las secuencias reguladoras de la
transcripción de promotores que están unidas operativamente a una
secuencia transcrita están físicamente contiguas a la secuencia
transcrita, es decir, son de actuación cis. Sin embargo, algunas
secuencias reguladoras de la transcripción, tales como
potenciadores, no necesitan ser físicamente contiguas o estar
localizadas próximas a las secuencias codificantes cuya
transcripción potencian.
Como se usa en este documento,
"recombinante" se refiere a un polinucleótido sintetizado o
manipulado de otra manera in vitro, a métodos de uso de
polinucleótidos recombinantes para producir productos génicos en
células u otros sistemas biológicos, o a un polipéptido ("proteína
recombinante") codificado por un polinucleótido recombinante. La
expresión "medios recombinantes" también incluye la unión de
ácidos nucleicos que tienen secuencias codificantes o promotoras de
diferentes fuentes en un vector o cassette de expresión para la
expresión de una proteína de fusión; o la expresión inducible
constitutiva de una proteína (por ejemplo, un promotor de TERT de
la invención unido operativamente a un nucleótido heterólogo, tal
como una secuencia codificante de un polipéptido).
Como se usa en este documento, la
"secuencia" de un gen (a menos que se indique específicamente
otra cosa) o de un ácido nucleico se refiere al orden de los
nucleótidos en el polinucleótido, incluyendo una cualquiera o las
dos cadenas de una molécula de ADN bicatenaria - la secuencia de la
cadena codificante y su complemento, o de una molécula de ácido
nucleico monocatenaria. Por ejemplo, en realizaciones alternativas,
el promotor de la invención comprende secuencias de TERT no
transcritas, no traducidas y de intrones, como se indica en las
secuencias ilustrativas SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2.
Como se usa en este documento, la expresión
"secuencia transcribible" se refiere a cualquier secuencia
que, cuando se une operativamente a un elemento de control de la
transcripción de actuación cis, tal como los promotores de TERT de
la invención, y cuando se pone en las condiciones apropiadas, es
capaz de transcribirse para generar ARN.
Los términos "idéntico" o "identidad"
en porcentaje, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o
secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o
subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado
de nucleótidos (o restos aminoacídicos) que son iguales, cuando se
comparan y se alinean para una correspondencia máxima en una ventana
de comparación, medida usando uno de los siguientes algoritmos de
comparación de secuencias o por alineación manual e inspección
visual. Esta definición también se refiere al complemento de una
secuencia. Por ejemplo, en realizaciones alternativas, los ácidos
nucleicos dentro del alcance de la invención incluyen los que tienen
una identidad de secuencia de nucleótidos que es al menos
aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 75%-80%,
aproximadamente un 90% y aproximadamente un 95% con respecto a la
secuencia del promotor de TERT ilustrativa indicada en la SEC ID
Nº: 1 (incluyendo los restos 44 a 13544 de la SEC ID Nº: 1) o la
SEC ID Nº: 2, y las secuencias de intrones de TERT capaces de
dirigir un gen indicador a células
telomerasa-positivas. Dos secuencias con estos
niveles de identidad son "substancialmente idénticas." De esta
manera, si una secuencia tiene la identidad de secuencia requerida
con una secuencia o subsecuencia del promotor de TERT de la
invención, también es una secuencia del promotor de TERT dentro del
alcance de la invención. Preferiblemente, la identidad en porcentaje
existe en una región de la secuencia que tiene una longitud de al
menos aproximadamente 25 nucleótidos, más preferiblemente en una
región que tiene una longitud de al menos aproximadamente
50-100 nucleótidos.
Para la comparación de las secuencias,
típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con
la que se comparan secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo
de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de
ensayo y de referencia en un ordenador, se diseñan coordenadas de
subsecuencia, si es necesario, y se diseñan parámetros del programa
de algoritmo de secuencias. Pueden usarse parámetros del programa
por defecto, o pueden diseñarse parámetros alternativos. El
algoritmo de comparación de secuencias después calcula el
porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o
secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia,
basándose en los parámetros del programa diseñados o por defecto.
Una "ventana de comparación", como se usa en este documento,
incluye la referencia a un segmento de una cualquiera de las
diversas posiciones contiguas seleccionadas entre el grupo
compuesto por 25 a 600, normalmente de aproximadamente 50 a
aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a
aproximadamente 150, donde una secuencia puede compararse con una
secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas
después de que las dos secuencias se hayan alineado óptimamente. La
alineación de secuencias puede realizarse por el algoritmo de
homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:428
(1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman
& Wunsch, J. Mol. Biol. 48.443 (1970), por medio de la búsqueda
del método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad.
Sci. Estados Unidos 85:2444 (1988), por ejecuciones informatizadas
de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin
Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,
Madison, WI) o por alineación manual e inspección visual.
Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP
crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de
secuencias relacionadas usando alineaciones progresivas por parejas
para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencia.
También representa un árbol o dendograma, que muestra las relaciones
de agrupamiento usadas para crear la alineación. PILEUP usa una
simplificación del método de alineación progresiva de Feng
&
Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). El método usado es similar al método descrito por Higgins & Sharp,
CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple empieza con la alineación por parejas de las dos secuencias más similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Este grupo después se alinea con la siguiente secuencia o grupo de secuencias alineadas más relacionado. Dos grupos de secuencia se alinean por medio de una simple extensión de la alineación por parejas de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue por una serie de alineaciones progresivas por parejas. El programa se ejecuta diseñando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o de nucleótidos para regiones de comparación de secuencias y diseñando los parámetros del programa. Usando PILEUP, una secuencia de referencia se compara con otra secuencia para determinar el porcentaje de relación de identidad de secuencia (si la segunda secuencia es substancialmente idéntica y está dentro del alcance de la invención) usando los siguiente parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos terminales pesados. PILEUP puede obtenerse en el paquete de software de análisis de secuencias GCG (Devereaux (1984) Nuc. Acids Res. 12:387-395). Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El software para realizar los análisis BLAST está disponible para el público en el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia dudosa, que corresponden o satisfacen algunas puntuaciones umbral de valor positivo T cuando se alinean con un palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T recibe el nombre de umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul (1990) supra). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar la búsqueda de HSP mayores que las contengan. Los aciertos de palabras después se extienden en las dos direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos correspondientes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos que no corresponden, siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae por debajo de la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la acumulación acumulativa llega a cero o a un valor inferior a cero debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. En una realización, para determinar si una secuencia de ácido nucleico está dentro del alcance de la invención, se usa el programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) que incorpora como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectación (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de las dos cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89:10915).
Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). El método usado es similar al método descrito por Higgins & Sharp,
CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple empieza con la alineación por parejas de las dos secuencias más similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Este grupo después se alinea con la siguiente secuencia o grupo de secuencias alineadas más relacionado. Dos grupos de secuencia se alinean por medio de una simple extensión de la alineación por parejas de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue por una serie de alineaciones progresivas por parejas. El programa se ejecuta diseñando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o de nucleótidos para regiones de comparación de secuencias y diseñando los parámetros del programa. Usando PILEUP, una secuencia de referencia se compara con otra secuencia para determinar el porcentaje de relación de identidad de secuencia (si la segunda secuencia es substancialmente idéntica y está dentro del alcance de la invención) usando los siguiente parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos terminales pesados. PILEUP puede obtenerse en el paquete de software de análisis de secuencias GCG (Devereaux (1984) Nuc. Acids Res. 12:387-395). Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El software para realizar los análisis BLAST está disponible para el público en el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia dudosa, que corresponden o satisfacen algunas puntuaciones umbral de valor positivo T cuando se alinean con un palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T recibe el nombre de umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul (1990) supra). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar la búsqueda de HSP mayores que las contengan. Los aciertos de palabras después se extienden en las dos direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos correspondientes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos que no corresponden, siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae por debajo de la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la acumulación acumulativa llega a cero o a un valor inferior a cero debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. En una realización, para determinar si una secuencia de ácido nucleico está dentro del alcance de la invención, se usa el programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) que incorpora como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectación (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de las dos cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89:10915).
El algoritmo BLAST también realiza un análisis
estadístico de la similitud entre dos secuencias (Karlin (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
90:5873-5787). Una medida de la similitud
proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de
suma (P(N)), que proporciona una indicación de la
probabilidad con la que una correspondencia entre dos secuencias de
nucleótidos de aminoácidos se produciría por casualidad. Por
ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de
referencia si la menor probabilidad de suma en una comparación del
ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es
menor que aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor que
aproximadamente 0,01 y aún más preferiblemente menor que
aproximadamente 0,001.
La expresión "hibrida selectivamente (o
específicamente) con" se refiere a la unión, formación de dúplex
o hibridación de una molécula con una secuencia de nucleótidos
particular en condiciones de hibridación rigurosas cuando la
secuencia está presente en una mezcla compleja (tal como ADN o ARN
de biblioteca o celular total), donde la secuencia de nucleótidos
particular se detecta al menos dos veces con respecto al nivel de
fondo, preferiblemente 10 veces con respecto al nivel de fondo. En
una realización, se puede determinar que un ácido nucleico está
dentro del alcance de la invención de acuerdo con su capacidad de
hibridar en condiciones rigurosas con otro ácido nucleico (tal como
las secuencias ilustrativas descritas en este documento).
La expresión "condiciones de hibridación
rigurosas" se refiere a condiciones en las que una sonda
hibridará principalmente con su subsecuencia diana, típicamente en
una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no con otras
secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y
serán diferentes en las diferentes circunstancias, dependiendo de
la longitud de la sonda. Las secuencias más largas hibridan
específicamente a mayores temperaturas. Se puede encontrar una
pauta extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos en
Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology
Hibridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of
hibridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993).
En general, las condiciones rigurosas se seleccionan entre una
temperatura de aproximadamente 5-10ºC por debajo
del punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una
intensidad iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a unos
valores definidos de intensidad iónica, pH y concentración de ácido
nucleico) a la que el 50% de la sondas complementarias a la diana
hibridan con la secuencia diana en el equilibrio (como las
secuencias diana están presentes en exceso, a la Tm, el 50% de la
sondas están ocupadas en el equilibrio). Las condiciones rigurosas
serán aquellas en las que la concentración de sal es menor que
aproximadamente 1,0 M de ion de sodio, típicamente una concentración
de ion de sodio (u otras sales) de aproximadamente 0,01 a 1,0 M a
un pH de 7,0 a 8,3, y la temperatura es al menos de aproximadamente
30ºC para sondas cortas (\sim 10 a aproximadamente 50
nucleótidos) y al menos de aproximadamente 60ºC para sondas largas
(mayores de aproximadamente 50 nucleótidos). Las condiciones
rigurosas también pueden conseguirse con la adición de agentes de
desestabilización tales como formamida. Para una hibridación
selectiva o específica, una señal positiva (identificación de un
ácido nucleico de la invención) es aproximadamente
5-10 veces la hibridación de fondo. Las condiciones
de hibridación "rigurosas" que se usan para identificar ácidos
nucleicos substancialmente idénticos dentro del alcance de la
invención incluyen la hibridación en un tampón que comprende
formamida al 50%, 5 x SSC y SDS al 1% a 42ºC, o hibridación en un
tampón que comprende 5 x SSC y SDS al 1% a 65ºC, ambas con un
lavado de 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 65ºC para sondas largas. Para
sondas cortas, las condiciones de hibridación rigurosas incluyen
hibridación en un tampón que comprende formamida al 50%, 5 x SSC y
SDS al 1% a temperatura ambiente o hibridación en un tampón que
comprende 5 x SSC y SDS al 1% a 37ºC-42ºC, ambas
con un lavado de 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 37ºC- 42ºC. Sin embargo,
como es evidente para un especialista habitual en la técnica, las
condiciones de hibridación pueden modificarse dependiendo de la
composición de la secuencia. Las condiciones de hibridación
moderadamente rigurosas incluyen una hibridación en un tampón de
formamida al 40%, NaCl 1 M y SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 1 X
SSC a 45ºC. Una hibridación positiva es al menos dos veces el
efecto de fondo. Los especialistas habituales reconocerán fácilmente
que pueden utilizarse condiciones de hibridación y lavado
alternativas para proporcionar condiciones de rigurosidad
similar.
Las secuencias del promotor de TERT de la
invención y los ácidos nucleicos usados para poner en práctica esta
invención, ya sean ARN, ADNc, ADN genómico o híbridos de los
mismos, pueden aislarse a partir de una diversidad de fuentes,
obtenerse por ingeniería genética, amplificarse y/o expresarse de
forma recombinante. Puede usarse cualquier sistema de expresión
recombinante, incluyendo sistemas bacterianos, de levaduras, de
insectos o de mamíferos. Como alternativa, estos ácidos nucleicos
pueden sintetizarse químicamente in vitro. Las técnicas para
la manipulación de ácidos nucleicos, tales como subclonación en
vectores de expresión, sondas de marcaje, secuenciación e
hibridación, están bien descritas en la bibliografía científica y de
patentes. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Ed.) Vols.
1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)
("Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,
Ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997) ("Ausubel");
Laboratory Techniques in Biochemistry And Molecular Biology:
Hybridization With Nucleic Acid Probes. Part I. Theory and Nucleic
Acid Preparation. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993). Los ácidos
nucleicos pueden analizarse y cuantificarse por cualquiera de
varias técnicas, incluyendo RMN, espectrofotometría, radiografía,
electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de
alta presión (HPLC), cromatografía de capa fina (TLC) y
cromatografía de hiperdifusión, reacciones de precipitina en fluido
o gel, inmunodifusión (simple o doble), inmunoelectroforesis,
radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunoabsorbente ligado a
enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes, análisis de Southern,
análisis de Northern, análisis dot-blot,
electroforesis en gel, RT-PCR, PCR cuantitativa,
otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos o de dianas o de
señales, radiomarcaje, recuento de centelleo, y cromatografía de
afinidad.
Ciertas realizaciones de la invención son
promotores de TERT que comprenden secuencias genómicas 5' (cadena
arriba) de un sitio de inicio de la transcripción de hTERT o mTERT,
y secuencias de intrones. Los promotores de TERT contienen
elementos reguladores de la transcripción de actuación cis
implicados en la expresión del mensajero de TERT. Será evidente
que, además de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en
la SEC ID Nº: 1 de hTERT o en la SEC ID Nº: 2 de TERT, pueden
obtenerse fácilmente secuencias promotoras de TERT adicionales
usando técnicas de biología molecular rutinarias. Por ejemplo, puede
obtenerse una secuencia genómica de hTERT (y un promotor) adicional
investigando una biblioteca genómica humana usando la sonda de
ácido nucleico de hTERT que tiene una secuencia o subsecuencia como
la indicada en la SEC ID Nº: 1 (una secuencia de ácido nucleico
está dentro del alcance de la invención si hibrida en condiciones
rigurosas con una secuencia del promotor de hTERT de la invención).
Pueden identificarse fácilmente secuencias genómicas de hTERT o
mTERT adicionales por técnicas de "desplazamiento sobre el
cromosoma", como se describe por Hauser (1998) Plant J
16:117-125; Min (1998) Biotechniques 24:398- 400.
Otros métodos útiles para una caracterización adicional de las
secuencias del promotor de TERT incluyen los métodos generales
descritos por Pang (1997) Biotechniques
22:1046-1048; Gobinda (1993) PCR Meth. Applic.
2:318, Triglia (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186; Lagerstrom (1991)
PCR Methods Applic. 1:111; Parker (1991) Nucleic Acids Res.
19:3055.
En algunas realizaciones, la secuencia promotora
comprende al menos aproximadamente 15, 50, 100, 150, 200, 250, 500,
1000, 2500 ó 13.000 bases de la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2. Se
incluye una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de
TERT, incluyendo pero sin limitación hTERT o mTERT, unido
opcionalmente a una secuencia heteróloga. El promotor puede
comprender de aproximadamente 100 a aproximadamente 200, de 200 a
aproximadamente 400, de 400 a aproximadamente 900, de 900 a
aproximadamente 2500 o de 2500 a aproximadamente 5000 nucleótidos
cadena arriba de un sitio de inicio de la traducción. En otras
realizaciones, el promotor comprende una secuencia que hibrida con
la SEC ID Nº: 1 ó 2. Son ilustrativas secuencias promotoras que
preferiblemente promueven la transcripción en células que expresan
la telomerasa transcriptasa inversa. Tales secuencias pueden
identificarse fácilmente usando los ensayos proporcionados en
otras partes de esta descripción y en los ejemplos, en los que las
secuencias promotoras candidatas están unidas operativamente a la
región codificante de una proteína indicadora, y después se
introducen por transfección en células con una actividad TERT
conocida para determinar la especificidad.
La invención proporciona cebadores
oligonucleotídicos que pueden amplificar todas o cualquier región
específica dentro de la secuencia del promotor de TERT de la
invención, incluyendo subsecuencias potenciadoras y promotoras
específicas. Los ácidos nucleicos de la invención también pueden
generarse o medirse cuantitativamente usando técnicas de
amplificación. Usando las secuencias del promotor de TERT de la
invención (como en la SEC ID Nº: 1 de hTERT o SEC ID Nº: 1 de mTERT
ilustrativas), el especialista en la técnica puede seleccionar y
diseñar cebadores de amplificación oligonucleotídicos adecuados.
Los métodos de amplificación incluyen reacción en cadena de la
polimerasa (PCR Protocols, A Guide To Methods And Applications ed.
Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR Strategies (1995), ed.
Innis, Academic Press, Inc., N.Y.; reacción en cadena de la ligasa
(LCR) (Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077;
Barringer (1990) Gene 89:117), amplificación de la transcripción
(Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86:1173); y
replicación de secuencias autosostenida (Guatelli (1990) Proc.
Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 87:1874); amplificación por Q
\beta-replicasa (Smith (1997) J. Clin. Microbiol.
35:1477-1491, ensayo de amplificación por
Q-\beta replicasa automático; Burg (1996) Mol.
Cell. Probes 10.257-271) y otras técnicas mediadas
por la ARN polimerasa (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); Berger
(1987) Methods Enzymol. 152:307-316, Sambrook,
Ausebel Mullis (1987), Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195 y
4.683.202; Arnheim (1990) C&EN 36-47; Lomell J.
Clin. Chem., 35:1826 (1989); Van Brunt (1990) Biotechnology,
8:291-294; Wu (1989) Gene 4:560; Sooknanan (1995)
Biotechnology 13:563-564. Una vez amplificado, el
ADN genómico de TERT, las secuencias promotoras de TERT y similares
pueden clonarse, si se desea, en cualquiera de una diversidad de
vectores usando métodos de biología molecular rutinarios; se
describen métodos para la clonación de ácidos nucleicos
amplificados in vitro en Wallace, Patente de Estados Unidos
Nº 5.426.039.
La invención incluye secuencias promotoras de
TERT que se han modificado de una manera específica de sitio para
alterar, añadir o delecionar algunas o todas las funciones del
promotor. Por ejemplo, pueden modificarse pares de bases
específicos para alterar, aumentar o reducir la afinidad de unión a
factores de regulación de la transcripción de actuación trans,
modificando de esta manera el nivel relativo de activación o
represión de la transcripción. Las modificaciones también pueden
cambiar estructuras secundarias de subsecuencias específicas, tales
como las asociadas con muchos elementos de la transcripción de
actuación cis. Pueden introducirse mutaciones específicas de sitio
en ácidos nucleicos por una diversidad de técnicas convencionales,
bien descritas en la bibliografía científica y de patentes. Los
ejemplos ilustrativos incluyen mutagénesis de localización dirigida
por reacción en cadena de la polimerasa de extensión solapante
(OE-PCR), como en Urban (1997) Nucleic Acids Res.
25:2227-2228; Ke (1997) Nucleic Acids Res
25:3371-3372 y Chattopadhyay (1997) Biotechniques
22:1054-1056, que describen el método
"megaprimer" de mutagénesis de localización dirigida basada en
PCR; Bohnsack (1997) Mol. Biotechnol. 7:181-188;
Ailenberg (1997) Biotechniques 22:624-626, que
describe mutagénesis de localización dirigida usando un método de
re-templado escalonado basado en PCR sin enzimas de
restricción; Nicolas (1997) Biotechniques
22:430-434, mutagénesis de localización dirigida
usando eliminación de un sitio único para un cebador largo y
exonucleasa III. También pueden producirse secuencias del promotor
de TERT modificadas de la invención por métodos de modificación
química. Belousov (1997) Nucleic Acids. Res.
25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med.
19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry
33:7886-7896.
La invención también proporciona oligonucleótidos
antisentido capaces de unirse a regiones del promotor de TERT que,
al menos en parte, modulan la transcripción de TERT y la actividad
telomerasa. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido que
forman triples cadenas con regiones del promotor inhiben la
actividad de ese promotor. Joseph (1997) Nucleic Acids Res.
25:2182-2188; Alunni-Fabbroni (1996)
Biochemistry 35:16361-16369; Olivas (1996) Nucleic
Acids Res 24:1758-1764. Como alternativa, pueden
usarse oligonucleótidos antisentido que hibridan con la secuencia
del promotor para inhibir la actividad del promotor.
Por ejemplo, los polinucleótidos antisentido de
la invención pueden comprender una secuencia antisentido de al
menos 7 a 10 a aproximadamente 20 o más nucleótidos que hibrida
específicamente con una secuencia complementaria a las secuencias
del promotor de TERT de la invención. Como alternativa, el
polinucleótido antisentido de la invención puede tener una longitud
de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos o de
aproximadamente 14 a aproximadamente 35 nucleótidos. En otras
realizaciones, tienen una longitud menor que aproximadamente 100
nucleótidos o menor que aproximadamente 200 nucleótidos. En
general, el polinucleótido antisentido debe ser suficientemente
largo para formar un dúplex (o tríplex) estable pero, si se desea,
debe ser suficientemente corto, dependiendo del modo de liberación,
como para administrarse in vivo. La longitud mínima de un
polinucleótido requerido para una hibridación específica con una
secuencia diana depende de varios factores, tales como el contenido
de G/C, la colocación de bases desemparejadas (si existen), el
grado de singularidad de la secuencia en comparación con la
población de polinucleótidos diana, y la naturaleza química de los
nucleótidos usados en el reactivo anti-sentido
(esqueleto de metilfosfonato, ácido péptido nucleico,
fosforotioato), entre otros factores. También se describen métodos
relacionados con polinucleótidos anti-sentido en
Antisense RNA And DNA, (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY); Dagle (1991) Nucleic Acids
Research 19:1805; Kim (1998) J. Controlled Release
53:175-182; para terapia
anti-sentido. Uhiman (1990) Chem. Reviews
90:543-584; Poston (1998) J. Thorac. Cardiovasc.
Surg. 116:386-396 (terapia génica ex vivo);
Haller (1998) Kidney Int. 53:1550-1558; Nguyen
(1998) Cancer Res 58:5673-7.
La invención proporciona medios para identificar
y aislar factores reguladores de la transcripción de actuación
trans que están implicados en la modulación de la actividad del
promotor de TERT. La identificación de motivos de actuación cis por
comparación de identidad de secuencias puede ser un medio inicial
útil para identificar secuencias promotoras unidas por factores de
actuación trans. El promotor de hTERT contiene el motivo que se sabe
que se une a c-Myc (la "caja E" o el "sitio
de unión a Myc/Max"). Dos sitios de unión a SP1 están
localizados desde el resto -168 y desde el resto -134. Otros motivos
identificados incluyen el producto génico de la región determinante
del sexo Y (SRY), el factor nuclear hepático 3-beta
(HNF- 3\beta) y el factor nuclear hepático 5
(HNF-5), TFIID-MBP y los elementos
reguladores de la transcripción de actuación cis E2F y
c-Myb. Para identificar estos motivos, puede usarse
una diversidad de algoritmos de comparación. Karas (1996) Comput.
Appl. Biosci. 12:441-6; Frech (1997) Pac Symp
Biocomput. 7:151-62; Brzma (1998) Genome Res
8:1202-1215; Tsunoda (1998) Pac Symp Biocomput:
1998:252-63.
Además del análisis de identidad de secuencia,
los elementos reguladores de la transcripción de actuación cis de
TERT pueden identificarse por ensayos funcionales, incluyendo
ensayos de la actividad del promotor, ensayos de DNasa, ensayos de
unión (ensayos de cambio de movilidad), y cromatografía en columna
de afinidad de oligonucleótidos. Después de una identificación
positiva o tentativa de un sitio de unión de actuación cis en un
promotor de TERT, estas secuencias se usan para aislar el o los
factores reguladores de la transcripción de actuación trans. En una
realización preferida, los factores de actuación trans se aíslan
usando cromatografía de afinidad de oligonucleótidos específica de
secuencia, comprendiendo los oligonucleótidos las secuencias de TERT
de la invención.
Otra realización para identificar motivos
reguladores de la transcripción implica modificar supuestas
subsecuencias reguladoras de actuación cis y evaluar el cambio, si
existe, del promotor de TERT resultante para modular la
transcripción. La modificación puede ser una o más deleciones de
restos, substituciones de restos y alteraciones químicas de
nucleótidos. El promotor (modificado) puede unirse operativamente a
TERT, un gen indicador o cualquier otra secuencia transcribible. El
aumento o la reducción relativa que la modificación tiene sobre las
velocidades de transcripción puede determinarse midiendo la
capacidad del promotor de TERT inalterado para activar de forma
transcripcional la secuencia codificante del indicador en las mismas
condiciones usadas para ensayar el promotor modificado. Un aumento
o reducción en la capacidad del promotor de TERT modificado para
inducir la transcripción en comparación con la construcción del
promotor no modificado identifica una secuencia reguladora de la
transcripción de actuación cis que está implicada en la modulación
de la actividad del promotor de TERT.
El gen indicador puede codificar una proteína
fluorescente o fosforescente, o una proteína que posee actividad
enzimática. En realizaciones alternativas, la proteína detectable
es luciferasa de luciérnaga,
\alpha-glucuronidasa,
\alpha-galactosidasa, cloranfenicol acetil
transferasa, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente
verde potenciada y la fosfatasa alcalina secretada humana. Otra
realización ensaya la capacidad de estos elementos de actuación cis
de unirse a factores polipeptídicos solubles de actuación trans
aislados a partir de diferentes compartimentos celulares,
particularmente los factores de actuación trans expresados en los
núcleos. Para la identificación y aislamiento de factores que
estimulan la transcripción, se usan extractos nucleares de células
que expresan TERT.
Además, una vez identificado un motivo o elemento
de actuación cis, puede usarse para identificar y aislar factores
de actuación trans en una diversidad de células y en diferentes
condiciones (tales como proliferación celular frente a senescencia
celular). Por consiguiente, la invención proporciona un método para
seleccionar factores de actuación trans que modulan la actividad del
promotor de TERT en una diversidad de condiciones, estados de
desarrollo y tipos celulares (incluyendo fenotipos normales frente
a fenotipos inmortales y frente a fenotipos malignos). Las
secuencias reguladoras de la transcripción de actuación cis de la
invención que modulan la actividad del promotor de TERT también
pueden usarse como oligonucleótidos que, tras la introducción en una
célula, pueden unirse a factores reguladores de actuación trans
para modular la transcripción de TERT in vivo. Esto tiene
como resultado un aumento o reducción de la capacidad proliferativa
de las células para el tratamiento de diversas enfermedades y
afecciones.
La invención proporciona construcciones y métodos
para seleccionar moduladores, en una realización preferida,
moduladores de molécula pequeña, de la actividad del promotor de
TERT in vitro e in vivo. La invención incorpora todos
los ensayos disponibles para seleccionar moduladores de la
transcripción de TERT de molécula pequeña. En una realización
preferida, se adaptan ensayos de alto rendimiento y se usan con las
nuevas secuencias del promotor de TERT y construcciones
proporcionadas por la invención. Schultz (1998) Bioorg Med Chem
Lett 8:2409-2414; Weller (1997) Mol Divers.
3:61-70; Fernandes (1998) Curr Opin Chem Biol
2:597-603; Sittampalam (1997) Curr Opin Chem Biol
1:384-91.
En realizaciones alternativas, las construcciones
recombinantes contienen secuencias del promotor de hTERT que
dirigen un gen marcador, tal como un gen marcador de fosfatasa
alcalina (SEAP) o un gen de la \NAK-galactosidasa.
Usando una construcción de expresión de SEAP de la invención, se
demostró que un fragmento del promotor de TERT de aproximadamente
2,5 kg es suficiente para activar y reprimir la transcripción de
TERT en respuesta al estímulo de detención de la proliferación y/o
crecimiento en una línea de células modelo, IDH4. Se seleccionaron
dos clones celulares, ID245-1 e
ID245-16 cuyos perfiles de SEAP corresponden
estrechamente a la actividad telomerasa después de la regulación
positiva de TERT por dexametasona, y se expandieron para la
selección de alto rendimiento de activadores de telomerasa de
molécula pequeña.
La presente invención proporciona secuencias del
promotor de TERT útiles para el tratamiento de enfermedades y
estados de enfermedad. Los ácidos nucleicos recombinantes y
sintéticos que comprenden el promotor de TERT, o secuencias
complementarias antisentido de TERT, pueden usarse para crear o
elevar la actividad telomerasa en una célula, así como para inhibir
la actividad telomerasa en células en las que no se desea. En una
realización preferida, las secuencias del promotor de TERT humano o
las secuencias antisentido se usan para el tratamiento de
enfermedades y patologías humanas.
La identificación de secuencias reguladoras de la
transcripción de actuación cis por la invención también proporciona
medios para el diseño de secuencias diana que, como los
oligonucleótidos, pueden modificar la actividad del promotor de
TERT. En una realización, la actividad telomerasa se crea o se
eleva por medio de la unión de cantidades significativas de un
represor o regulador negativo de la transcripción de actuación
trans con un ácido nucleico que se une específicamente al represor.
En otra realización, la actividad telomerasa se regula
negativamente por oligonucleótidos antisentido que se unen a
secuencias promotoras. De forma similar, la actividad telomerasa
puede inhibirse por medio de la unión de cantidades significativas
de un activador o regulador positivo de la transcripción de
actuación trans con un ácido nucleico que se une específicamente al
activador; o la actividad telomerasa se regula positivamente por
oligonucleótidos antisentido que se unen a secuencias promotoras
implicadas en la represión de la telomerasa. De esta manera, la
inhibición, activación o alteración de otra manera de una actividad
telomerasa (actividad catalítica de telomerasa, fidelidad,
procesabilidad, unión al telómero, etc.) en una célula puede usarse
para cambiar la capacidad proliferativa de la célula.
Por ejemplo, la reducción de la actividad
telomerasa en una célula inmortal, tal como una célula tumoral
maligna, puede hacer que la célula sea mortal. A la inversa, al
aumentar la actividad telomerasa en una línea celular o una célula
mortal (la mayoría de las células somáticas humanas) puede aumentar
la capacidad proliferativa de la célula. Por ejemplo, la expresión
de la proteína hTERT en fibroblastos dérmicos, aumentando de esta
manera la longitud de los telómeros, dará como resultado una mayor
capacidad proliferativa de los fibroblastos. Tal expresión puede
ralentizar o invertir procesos degenerativos relacionados con la
edad, tales como una ralentización dependiente de la edad del
cierre de las heridas (West (1994) Arch. Derm. 130:87). De esta
manera, en una aspecto, la presente invención proporciona reactivos
y métodos útiles para tratar enfermedades y afecciones
caracterizadas por la presencia, ausencia o cantidad alterada de
actividad telomerasa humana en una célula (siendo las enfermedades
y afecciones susceptibles de tratamiento usando las composiciones y
métodos descritos en este documento). Estas enfermedades incluyen,
por ejemplo, cánceres, otras enfermedades de proliferación celular
(particularmente procesos degenerativos y de envejecimiento y
enfermedades de envejecimiento), trastornos inmunológicos, e
infertilidad (o fertilidad).
En una realización, el promotor de TERT de la
invención está unido operativamente a una secuencia transcribible
que codifica una toxina celular. Las toxinas polipeptídicas que
pueden generarse de manera recombinante incluyen ricina, abrina
(Hughes (1996) Hum. Exp. Toxicol. 15:443-451),
difteria, gelonina (Rosenblum (1996) Cancer Immunol. Immunother.
42:115-121), exotoxina A de seudomonas, factor de
necrosis tumoral alfa (TNF-a), toxina de Crotalus
durissus terrificus, toxina de Crotalus adamenteus,
toxina de Naja naja, y toxina de Naja mocambique. Rodriguez (1998)
Prostate 34:259-269; Mauceri (1996) Cancer Res.
56:4311-4314. La toxina celular también puede ser
capaz de inducir apoptosis, tal como la familia ICE de proteasas de
cisteína, la familia de proteínas Bcl-2, bax, bclXs
y caspasas. Favrot (1998) Gene Ther. 5:728-739;
McGill (1997) Front. Biosci. 2:D353-D379; McDonnell
(1995) Semin. Cancer Biol. 6:53-60.
Como alternativa, la secuencia bajo el control
del promotor de TERT puede codificar polipéptidos que tienen
actividad que no es tóxica por sí misma para una célula, pero que
hace que la célula sea sensible a otro fármaco no tóxico de otra
manera, tal como la timidina quinasa del virus del herpes
(HSV-TK). La HSV-TK es inocua, pero
convierte el agente anti-herpético ganciclovir (GCV)
en un producto tóxico que interfiere con la replicación del ADN en
células proliferativas. Delaney (1996) J. Neurosci.
16:6908-6918; Heyman (1989) Proc. Natl. Acad Sci.
Estados Unidos 86:2698-2702. La técnica describe
otras numerosas proteínas tóxicas o potencialmente tóxicas adecuadas
y sistemas que pueden aplicarse en esta realización.
Los métodos de la invención, además de permitir
la destrucción específica de células
telomerasa-positivas, también pueden usarse para
prevenir la transformación de células
telomerasa-negativas en células
telomerasa-positivas. Como se muestra en los
siguientes ejemplos, una secuencia del promotor de hTERT puede
unirse operativamente a un gen indicador de tal manera que la
activación del promotor tenga como resultado la expresión de la
proteína codificada por el gen indicador. Si en lugar de una
proteína indicadora la proteína codificada es tóxica para la
célula, la activación del promotor conduce a una morbididad o
muerte celular.
La presente invención proporciona métodos y
composiciones para reducir la actividad del promotor de TERT (y,
por lo tanto, la actividad telomerasa) en células inmortales y
células tumorales para tratar el cáncer. Las células cancerosas
(células tumorales malignas) que expresan la actividad telomerasa
(células telomerasa-positivas) pueden hacerse
mortales reduciendo o inhibiendo la actividad del promotor de TERT.
Además, como los niveles medibles de la actividad telomerasa se
correlacionan con características de la enfermedad tales como el
potencial metastásico (Patentes de Estados Unidos Nº 5.639.613;
5.648.21; 5.489.508; y Pandita (1996) Proc. Am. Ass. Cancer Res.
37:559), cualquier reducción en la actividad del promotor de TERT
podría reducir la naturaleza agresiva de un cáncer hasta un estado
de enfermedad más tratable.
Aprovechando esta característica, en una
realización de la invención, una secuencia promotora de TERT está
unida operativamente a un gen que codifica una toxina y se
introduce en una célula para destruir la célula (tal como ricina,
difteria, gelonina, toxina de Pseudomonas, o abrina). Si o cuando
los activadores de la transcripción de TERT se expresen o se
activen en la célula, la toxina se expresará, dando como resultado
una destrucción de células específicas.
Como alternativa, el gen unido al promotor de
TERT puede codificar una proteína que tiene una actividad que no es
tóxica por sí misma para la célula, sino que hace que la célula sea
sensible a un fármaco no tóxico de otra manera (tal como la
timidina quinasa del virus del herpes).
En otra realización, la invención aprovecha el
hecho de que virus citopáticos normales, en particular virus
citopáticos humanos, tales como adenovirus o herpesvirus, requieren
genes codificados viralmente esenciales para proliferar, lisando de
esta manera células específicas. Basándose en la siguiente
descripción, los especialistas en la técnica reconocerán que pueden
adaptarse varios virus citopáticos diferentes de acuerdo con esta
invención. Los virus citopáticos son bien conocidos en la técnica y
se describen, entre otros sitios, en las publicaciones de Coffey,
Toda, Chase y Kramm, presentadas más adelante. En muchos de tales
virus se han caracterizado genes esenciales para la replicación. Si
un gen de replicación esencial de cualquiera de estos virus se
dirige por el promotor de TERT, la proliferación del virus y sus
efectos citopáticos se restringirían a las células tumorales y otras
células que expresan telomerasa. Por ejemplo, algunos elementos
genéticos esenciales para la replicación de adenovirus son las
regiones E4, E1a, E1b y E2, o cualquiera de los productos génicos
tardíos. Los elementos genéticos esenciales para la replicación de
HSV-1 incluyen ICP6 e ICP4.
Por consiguiente, la invención proporciona
construcciones y métodos para destruir células
telomerasa-positivas (tales como células
cancerosas), donde secuencias promotoras de TERT de la invención
están unidas operativamente a tales elementos genéticos de
replicación esenciales. Para uso en células humanas, se prefieren
virus citopáticos humanos modificados con secuencias del promotor
de TERT. Uno cualquiera o más de los genes requeridos para la
replicación y empaquetamiento del virus podrían modificarse para
dirigirse por el promotor de TERT. Por ejemplo, en una realización,
la expresión del gen E1a de adenovirus, que se requiere para la
activación de la expresión de una cascada de genes adenovirales, se
pone bajo el control del promotor de hTERT.
De esta manera, la expresión de E1a, y por lo
tanto la replicación cadena abajo del virus, se produce sólo en las
células que expresan telomerasa (tales como células tumorales). De
forma similar, un adenovirus recombinante de la invención se diseña
de manera que los genes de la cápsida adenoviral estén bajo el
control de un promotor de TERT. Aunque esta construcción replica su
ADN en la mayoría de los tipos celulares, se empaqueta en un virus
infeccioso activo (y citotóxico) sólo en las células que expresan
la telomerasa. De esta manera, cuando estas construcciones se usan
como agentes terapéuticos contra el cáncer, el virus
condicionalmente replicativo sólo infecta y produce una infección
productiva en células tumorales (sin efecto en las células
"normales" que no expresan la telomerasa). Es de esperar que
la infección de las células normales que no expresan la telomerasa
no produzca ningún virus o presenten una producción abortiva del
virus, dependiendo del gen que se dirija por el promotor de TERT.
De esta manera, estos virus recombinantes de la invención permiten
la amplificación natural, aunque específica de tumor, de un virus
oncolítico.
En realizaciones alternativas, se incorporan
muchos otros elementos en un virus oncolítico restringido con el
promotor de TERT o un virus replicativo restringido con el promotor
de TERT que no es lítico. En el virus recombinante condicionalmente
replicativo restringido con el promotor de TERT se incorporan genes
codificantes, genes suicidas, genes marcadores, genes apoptóticos o
reguladores del ciclo celular. La expresión de estos elementos en
tal virus ayudaría a detener el crecimiento tumoral. En una
realización, los elementos a incluir dentro de estos virus
condicionalmente replicativos de la invención son estructuras que
inhiben la actividad telomerasa. Estos inhibidores de la telomerasa
podrían incorporar oligonucleótidos inhibidores, inhibidores
dominantes-negativos de TERT, o el gen de cualquier
agente que impidiera o previniera el montaje, las interacciones o
la actividad de TR/TERT.
En los vectores restringidos con el promotor de
TERT de la invención también se pueden incluir otros elementos. Por
ejemplo, pueden sintetizarse in vivo moléculas de ARN
inhibidoras pequeñas, preferiblemente que se dirigen a células
cancerosas, tales como ARN que se dirige a la actividad telomerasa,
usando un vector de adenovirus recombinante. Se proporcionan
secuencias ilustrativas en la Patente de Estados Unidos Nº
5.858.777 y en el documento GB 20890.4. La producción de ARN a
partir del adenovirus puede conseguirse por medio de una diversidad
de cassettes de expresión. Para la inhibición del crecimiento
celular, se prefieren cassettes de expresión de la ARN polimerasa
III basados en la estructura de genes de ARNt y otros transcritos de
la ARN polimerasa III, incluyendo el gen U6 snRNA, así como los
transcritos de la ARN polimerasa II snRNP (U1, U2), debido a su
capacidad de producir altos niveles de transcritos.
Los virus restringidos con el promotor de hTERT
de la invención pueden diseñarse para expresar ARN inhibidores,
como moléculas antisentido complementarias a varias regiones de la
molécula de hTR, incluyendo la región de plantilla. Los ARN
inhibidores también pueden imitar secuencias y/o estructuras
presentes en el componente de ARN de la telomerasa (por ejemplo,
hTR), incluyendo sitios de unión potenciales a TERT u otras
proteínas asociadas a telomerasa que podrían interaccionar con el
componente de ARN. También pueden diseñarse otros elementos para
generar ARN inhibidores del ARNm de TERT diana por medio de la
prevención de su procesamiento, plegamiento, modificación,
transporte y/o traducción normales.
Otros vectores virales citopáticos de la
invención pueden diseñarse para generar moléculas de ARN con
secuencias necesarias para la exportación al citoplasma y la
traducción en péptidos. Los polipéptidos o péptidos resultantes
pueden diseñarse para dirigirse a componentes de telomerasa u otras
moléculas que estén asociadas con la telomerasa, influyendo de esta
manera sobre la actividad catalítica de la telomerasa. Los péptidos
que inhiben la telomerasa se producirán a un alto nivel,
correspondiente con la cantidad de ARN. Por ejemplo, podrían
diseñarse péptidos para imitar el tramo de aminoácidos en hTERT
implicado en su unión a hTR, actuando de esta manera como
competidores en el montaje de una telomerasa funcional.
Los vectores virales restringidos con el promotor
de TERT de la invención también pueden diseñarse para generar
péptidos o polipéptidos para cualquier dominio de TERT implicado en
interacciones con otras proteínas y para romper contactos que son
esenciales para la función telomerasa. Otros virus restringidos
con el promotor de TERT de la invención pueden diseñarse para
generar polipéptidos que se unan a complejos de telómeros e impidan
el acceso y/o acoplamiento de la telomerasa o para generar péptidos
inmunogénicos, en parte péptidos TERT.
Otros vectores virales restringidos con el
promotor de TERT de la invención pueden diseñarse para generar
polipéptidos que imiten una diversidad de agentes inductores de
apoptosis observados durante la muerte celular programada, y
podrían ocasionar el inicio de la apoptosis. Los virus restringidos
con el promotor de TERT no necesitan ser citopáticos forzosamente.
Los virus condicionalmente restringidos con el promotor de TERT
podrían usarse para amplificar cualquier secuencia o cualquier
elemento en cualquier célula que expresa TERT, tal como una célula
tumoral.
Cualquiera de estas realizaciones puede
proporcionarse con los virus condicionalmente replicativos de la
invención. Las construcciones de promotor de TERT de la invención
también pueden usarse en vectores de terapia génica para prevenir
la activación de la telomerasa y ocasionar una destrucción o muerte
específica de células telomerasa-positivas. De forma
similar, estos métodos de terapia génica pueden usarse para tratar
una predilección genética por cánceres.
La presente invención también proporciona
composiciones y métodos útiles para el tratamiento de enfermedades
y patologías (además de los cánceres) caracterizadas por una infra-
o sobreexpresión de telomerasa o de productos génicos del gen TERT.
Los ejemplos incluyen enfermedades de proliferación celular,
enfermedades producidas por senescencia celular (particularmente,
procesos y enfermedades de envejecimiento), trastornos
inmunológicos, infertilidad, y enfermedades de disfunción inmune.
Ciertas enfermedades de envejecimiento se caracterizan por cambios
asociados con la senescencia celular debidos a una longitud
reducida de los telómeros (en comparación con células más jóvenes),
debida a la ausencia (o niveles mucho menores) de actividad
telomerasa en la célula. La reducción de la longitud de los
telómeros y la reducción de la capacidad de replicación contribuyen
a estas enfermedades. La actividad telomerasa (que aumenta la
longitud de los telómeros) puede regularse positivamente
aumentando la actividad promotora de TERT en la célula.
La presente invención, al proporcionar métodos y
composiciones para modular la actividad promotora de TERT, también
proporciona métodos para tratar la infertilidad. Las células de la
línea germinal humana (células de la espermatogonia, sus
progenitores o descendientes) pueden proliferar indefinidamente y
se caracterizan por una alta actividad telomerasa. Unos niveles
anormales o disminuidos de productos del gen TERT pueden tener como
resultado una producción inadecuada o anormal de espermatozoides,
conduciendo a una infertilidad o a trastornos de la reproducción.
Por consiguiente, la infertilidad asociada con una actividad
telomerasa alterada puede tratarse usando los métodos y
composiciones descritos en este documento para aumentar los niveles
de actividad del promotor de TERT. De forma similar, como la
inhibición de la telomerasa puede impactar negativamente sobre la
espermatogénesis, oogénesis y viabilidad del esperma y del huevo,
las composiciones de la invención capaces de inhibir la actividad
promotora de hTERT pueden tener efectos anticonceptivos cuando se
usan para reducir los niveles de hTERT en células de la línea
germinal.
En otra realización, la invención proporciona
métodos y composiciones útiles para reducir el potencial
proliferativo de células telomerasa-positivas tales
como linfocitos activados y células madre hematopoyéticas por medio
de la deducción de la actividad del promotor de TERT. De esta
manera, la invención proporciona medios para realizar
inmunosupresión. A la inversa, los métodos y reactivos de la
invención son útiles en inmunoestimulación al aumentar la actividad
del promotor de TERT (dando como resultado un mayor potencial
proliferativo) en células inmunes, incluyendo células madre
hematopoyéticas (que expresan un bajo nivel de telomerasa o no
expresan telomerasa antes de la intervención terapéutica).
Como es evidente por la discusión anterior, la
modulación del nivel de actividad transcripcional del promotor de
TERT (y, por lo tanto, los niveles de telomerasa o actividad
telomerasa en una célula) pueden tener un profundo efecto sobre el
potencial proliferativo de la célula, y de esta manera tiene gran
utilidad en el tratamiento de enfermedades. Esta modulación puede
ser una reducción o un aumento de la actividad del promotor de
TERT. Las moléculas de ácido nucleico moduladoras de la actividad
del promotor de la invención pueden actuar a través de varios
mecanismos. Sin embargo, la invención no se limita a ningún
mecanismo de acción particular.
Por ejemplo, la actividad del promotor de TERT
puede reducirse o aumentarse por medio de secuencias monocatenarias
antisentido que se unen directamente a secuencias del promotor de
TERT. Esto dará como resultado una reducción de la afinidad o
inhibición de factores reguladores de la transcripción de
actuación trans que se unen a secuencias promotoras de TERT
críticas (cajas ATA, cajas CAAT, y similares). Cuando el elemento de
actuación cis unido a un factor de actuación trans tiene actividad
inhibidora, la unión del oligonucleótido daría como resultado una
regulación positiva de la transcripción de TERT. A la inversa, si
la subsecuencia del promotor, cuando se une a un factor de
actuación trans, tiene actividad de regulación positiva, la unión
del oligonucleótido daría como resultado una regulación negativa de
la transcripción de TERT. En otra realización, oligonucleótidos
bicatenarios que representan subsecuencias del promotor de TERT se
unen directamente a elementos moduladores de la transcripción de
actuación trans, previniendo de esta manera su unión a los
elementos de actuación cis correspondientes. En resumen, la
actividad del promotor de TERT puede aumentarse o reducirse por
medio de cualquiera de varios mecanismos, o por medio de una
combinación de mecanismos. Éstos incluyen cualquier medio evidente
para los especialistas tras la revisión de esta descripción.
Las secuencias reguladoras de la transcripción de
actuación cis de la invención también pueden usarse como
oligonucleótidos que, tras la introducción en una célula, se pueden
unir a factores reguladores de actuación trans para modular la
transcripción de TERT in vivo. Estos oligonucleótidos pueden
suministrarse a células diana por medio de un esquema de liberación
apropiado o pueden sintetizarse in vivo por sistemas de
expresión recombinantes (vectores, virus y similares).
Los oligonucleótidos antisentido que hibridan con
secuencias promotoras de TERT inhibirán la unión de agentes
reguladores de la transcripción de actuación trans a secuencias
promotoras de TERT críticas. Además, el resultado será la
activación o represión de la actividad transcripcional de TERT,
dependiendo de si la subsecuencia promotora es reguladora negativa
o reguladora positiva, respectivamente. De esta manera, la
invención proporciona oligonucleótidos antisentido dirigidos a los
sitios de unión del promotor de TERT (actuación cis) para
c-Myc (la "caja E" o "sitios de unión a
Myc/Max"), SP1, el producto del gen Y (SRY),
HNF-3\beta, HNF-5,
TFIID-MBP, E2F, c-Myb, cajas TATA,
cajas CAAT y otros elementos reguladores.
Los polinucleótidos de TERT pueden producirse por
síntesis química directa. Típicamente se usará síntesis química
para producir oligonucleótidos y polinucleótidos que contienen
nucleótidos no estándar (sondas, cebadores y oligonucleótidos
antisentido), aunque también pueden prepararse ácidos nucleicos que
contienen sólo nucleótidos estándar. La síntesis química directa de
ácidos nucleicos puede realizarse, por ejemplo, por el método de
fosfotriéster de Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90, el métodos de
fosfotriéster de Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; el método de
dietil-fosforamidita de Beaucage (1981) Tetra.
Lett. 22:1859; y el método de soporte sólido de la Patente de
Estados Unidos Nº 4.458.066. La síntesis química típicamente
produce un oligonucleótido monocatenario, que puede convertirse en
ADN bicatenario por hibridación con una secuencia complementaria, o
por polimerización con una ADN polimerasa y un cebador
oligonucleotídico usando la cadena sencilla como plantilla. Un
especialista reconocerá que aunque la síntesis química de ADN a
menudo está limitada a secuencias menores de aproximadamente 100 ó
150 bases, pueden obtenerse secuencias mayores por medio de la
unión de secuencias más cortas o por métodos de síntesis más
elaborados. Se apreciará que los polinucleótidos y oligonucleótidos
de la invención pueden realizarse usando bases no estándar
(distintas de adenina, citidina, guanina, timidina y uridina) o
estructuras de esqueleto no estándar para proporcionar propiedades
deseables (mayor resistencia a nucleasas, unión más fuerte,
estabilidad o una Tm deseada). Las técnicas para hacer que los
oligonucleótidos sean resistentes a nucleasas incluyen las
descritas en la publicación PCT WO 94/12633. Puede producirse una
amplia diversidad de oligonucleótidos modificados útiles,
incluyendo oligonucleótidos que tienen un esqueleto de ácido
péptido nucleico (PNA) (Nielsen (1991) Sience 254:1497) o que
incorporan 2'-O-metil
ribonucleótidos, nucleótidos de fosforotioato, nucleótidos de metil
fosfonato, nucleótidos de fosfotriéster, nucleótidos de
fosforotioato, y fosforamidatos. Otros oligonucleótidos útiles
pueden contener restos de azúcar substituidos con alquilo y con
halógenos que comprenden uno de los siguientes en la posición 2':
OH, SH, SCH_{3}, F, OCN, OCH_{3}OCH_{3},
OCH_{3}O(CH_{2})nCH_{3},
O(CH_{2})nNH_{2} o
O(CH_{2})nCH_{3} donde n es de 1 a aproximadamente
10; alquilo inferior con 1 a 10 átomos de carbono, alquilo inferior
substituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF_{3}; OCF_{3};
O-, S- o N-alquilo; O-, S-, o
N-alquenilo; SOCH_{3}; SO_{2}CH_{3};
ONO_{2}; NO_{2}; N_{3}; NH_{2}; heterocicloalquilo;
heterocicloalcarilo; amino-alquilamino;
polialquilamino; sililo substituido; un grupo de escisión de ARN; un
grupo colesterilo; un grupo folato; un grupo indicador; un
intercalador; un grupo para mejorar las propiedades
farmacocinéticas de un oligonucleótido; o un grupo para mejorar las
propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros
substituyentes que tienen propiedades similares. El folato, el
colesterol u otros grupos que facilitan la captación de
oligonucleótidos, tales como análogos de lípidos, pueden conjugarse
directamente o a través de un enlazador en la posición 2' de
cualquier nucleósido o en la posición 3' o 5' del nucleósido
3'-terminal o 5'-terminal,
respectivamente. Pueden usarse uno o más de tales conjugados. Los
oligonucleótidos también pueden tener grupos miméticos de azúcar
tales como ciclobutilos en lugar de los grupos pentofuranosilo.
Otras realizaciones pueden incluir al menos una forma de base
modificada o "base universal" tal como inosina, o la inclusión
de otras bases no estándar tales como queosina y wybusina, así como
acetil-, metil-, tio- y formas modificadas de forma similar de
adenina, citidina, guanina, timidina y uridina que no se reconocen
fácilmente por endonucleasas endógenas. La invención también
proporciona oligonucleótidos que tienen análogos de esqueleto tales
como fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato,
fosforamidato, alquil fosfotriéster, sulfamato,
3'-tioacetal, metileno(metilimino),
3'-N-carbamato, morfolino carbamato,
metil fosfonatos quirales, nucleótidos con enlaces entre azúcares
cicloalquilo o alquilo de cadena corta, enlaces entre azúcares
("esqueleto") heterocíclicos o heteroatómicos de cadena corta,
o esqueletos
CH_{2}-NH-O-CH_{2},
CH_{2}-N(CH_{3})-OCH_{2},
CH_{2}-O-N(CH_{3})-CH_{2},
CH_{2}-N(CH_{3})-N(CH_{3})-CH_{2}
y
O-N(CH_{3})-CH_{2}-CH_{2}
(donde fosfodiéster es
O-P-O-CH_{2}), o
mezclas de los mismos. También son útiles oligonucleótidos que
tienen estructuras de esqueleto de morfolino (Patente de Estados
Unidos Nº 5.034.506).
Aunque la invención no se limita por ningún
mecanismo particular, los oligonucleótidos de la invención también
pueden unirse a secuencias promotoras de TERT bicatenarias o
dúplex. Pueden unirse a una región plegada, formando una triple
hélice o ácido nucleico "tríplex". La formación de una triple
hélice tiene como resultado la inhibición de la actividad del
promotor de TERT por medio de la alteración de la estructura
secundaria de la secuencia promotora, dando como resultado una
nueva conformación con la que el factor de actuación trans no se
puede unir con suficiente afinidad como para tener un efecto
modificador de la transcripción. Como alternativa, la formación de
una triple hélice (inducida por la unión del oligonucleótido
antisentido de la invención) compromete la capacidad de la doble
hélice de abrirse suficientemente para que tenga lugar la unión de
polimerasas, factores de transcripción o moléculas reguladoras de
actuación trans. En Cheng (1988) J. Biol. Chem. 263:15110; Ferrin
(1991) Science 354:1494; Ramdas (1989) J. Biol. Chem. 264:17395;
Strobel (1991) Science 254:1639; Rigas (1986) Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 83: 9591) Carr, 1994, Molecular and Immunological
Approaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco NY; Rininsland (1997)
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94:5854; Perkins (1998)
Biochemistry 37:11315-11322, se describe la
construcción de polinucleótidos y oligonucleótidos tríplex.
Los ácidos nucleicos terapéuticos y métodos de la
invención implican la administración de oligonucleótidos o
polinucleótidos que funcionan inhibiendo o estimulando la actividad
del promotor de TERT en condiciones fisiológicas in vivo. En
una realización, estos ácidos nucleicos son secuencias antisentido
monocatenarias capaces de unirse a secuencias promotoras. En una
realización alternativa, son ácidos nucleicos bicatenarios capaces
de unirse a factores reguladores de la transcripción de actuación
trans. Deben ser suficientemente estables en condiciones
fisiológicas durante un período de tiempo para obtener un efecto
terapéutico. Los ácidos nucleicos modificados pueden ser útiles para
impartir tal estabilidad, así como para dirigir la liberación del
oligonucleótido en el tejido, órgano o célula deseados. Los oligo- y
polinucleótidos pueden suministrarse directamente como un fármaco en
una formulación farmacéutica adecuada, o indirectamente por medio
de la introducción de un sistema de expresión de ácidos nucleicos
que puede generar de manera recombinante los oligonucleótidos
moduladores del promotor de hTERT en una célula. En una realización,
los oligonucleótidos se unen directamente a secuencias de actuación
cis o, como alternativa, se unen a factores reguladores de
actuación trans. Una realización explota el hecho de que el promotor
de TERT sólo es relativamente activo en una serie muy limitada de
tipos celulares, incluyendo, significativamente, células
cancerosas.
Los oligonucleótidos o vectores de expresión
pueden administrarse por liposomas, inmunoliposomas, balística,
captación directa en las células, y similares. Para el tratamiento
de enfermedades, los oligonucleótidos de la invención se
administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz,
que es una cantidad suficiente para mejorar los síntomas de la
enfermedad o modular la actividad de promotor de hTERT (afectando
de esta manera a la actividad telomerasa) en la célula diana. En la
Patente de Estados Unidos 5.272.065 se describen métodos útiles
para suministrar oligonucleótidos para fines terapéuticos. La
actividad telomerasa puede medirse por medio de un ensayo TRAP u
otro ensayo adecuado de la función biológica de la telomerasa, como
se describe con detalle en otras publicaciones.
La invención proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden ácidos nucleicos que contienen el
promotor de TERT (polinucleótidos, vectores de expresión,
construcciones de terapia génica) solos o en combinación con al
menos otro agente, tal como un compuesto de estabilización,
diluyente, vehículo, agente de dirección a las células u otro
ingrediente o agente activo. Los agentes terapéuticos de la
invención pueden administrarse en cualquier vehículo farmacéutico
biocompatible estéril incluyendo, pero sin limitación, solución
salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Cualquiera de
estas moléculas puede administrarse a un paciente sola, o en
combinación con otros agentes fármacos u hormonas, en composiciones
farmacéuticas, donde se mezcla con excipientes, adyuvantes y/o
vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
pueden administrarse por cualquier medio. Los métodos de
administración parenteral incluyen la administración tópica,
intra-arterial, intramuscular (IM), subcutánea (SC),
intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa (IV),
intraperitoneal (IP) o intranasal. Pueden encontrarse más detalles
sobre técnicas para formulación y administración en la última
edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing
Co, Easton PA); publicación PCT WO 93/23572.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
incluyen ácidos nucleicos que contienen TERT en una cantidad eficaz
para conseguir el fin deseado. "Cantidad terapéuticamente
eficaz" o "cantidad farmacológicamente eficaz" son frases
bien reconocidas y hacen referencia a la cantidad de un agente
eficaz para producir el resultado farmacológico deseado. Por
ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad
suficiente para tratar una enfermedad o afección o mejorar los
síntomas de la enfermedad que se está tratando. Los ensayos útiles
para determinar una cantidad eficaz para una aplicación dada
incluye la medición del efecto sobre la actividad del promotor de
TERT endógeno y la actividad telomerasa en una célula diana. La
cantidad administrada realmente dependerá del individuo al que se
le aplica el tratamiento, y preferiblemente será una cantidad
optimizada de tal forma que se consiga el efecto deseado sin
efectos secundarios significativos. La dosis terapéuticamente
eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo de células
o en cualquier modelo animal apropiado. El modelo animal también se
usa para estimar los intervalos de dosificación y las vías de
administración apropiadas en seres humanos. De esta manera, la
determinación de una dosis terapéuticamente eficaz está bien dentro
de la capacidad de los especialistas en la técnica.
La mayoría de las células de vertebrados
presentan senescencia después de un número finito de divisiones en
cultivo (\sim 50 a 100 divisiones). Sin embargo, ciertas células
variantes pueden dividirse indefinidamente en cultivo (por ejemplo,
células HeLa y células 293) y por esta razón son útiles para
investigación y aplicaciones industriales. Normalmente, estas líneas
de células inmortales proceden de tumores que se producen
espontáneamente, o por transformación por exposición a un oncogen,
radiación o un virus o agente químico inductor de tumores.
Desafortunadamente, se dispone de una selección limitada de líneas
celulares, especialmente de líneas celulares humanas que
representan una función celular diferenciada. Además, muchas líneas
de células inmortales disponibles actualmente se caracterizan por
anormalidades cromosómicas (aneuploidía, redisposiciones de genes o
mutaciones). Además, muchas líneas de células establecidas desde
hace mucho tiempo están relativamente indiferenciadas. De esta
manera, existe la necesidad de composiciones activadoras del
promotor de TERT y métodos de la invención para generar nuevas
líneas de células inmortales, especialmente usando células de
origen humano, donde se prefieren los métodos y composiciones de
activación del promotor de hTERT.
Las "células inmortalizadas" de la invención
no se limitan a las que proliferan indefinidamente, sino que
también incluyen células con una mayor capacidad de proliferación
en comparación con células similares cuyo promotor de TERT no se ha
regulado positivamente. Dependiendo del tipo celular, una mayor
capacidad proliferativa puede significar la proliferación durante al
menos aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150,
aproximadamente 200 o aproximadamente 400 o más generaciones, o
durante al menos aproximadamente 3, aproximadamente 6,
aproximadamente 12, aproximadamente 18, aproximadamente 24 o
aproximadamente 36 o más meses en cultivo.
Los usos de células con mayor capacidad de
proliferación incluyen la producción de proteínas naturales y
proteínas recombinantes (polipéptidos terapéuticos tales como
eritropoyetina, hormona de crecimiento humana, insulina y
similares) o anticuerpos, para lo que se prefiere una línea de
células genéticamente normales estable. Otro uso es para el
reemplazo de células o tejidos enfermos o lesionados. Por ejemplo,
pueden usarse células inmunes autólogas inmortalizadas usando una
secuencia del promotor de TERT de la invención para el reemplazo de
células en un paciente después de una terapia agresiva contra el
cáncer, tal como irradiación del cuerpo entero. Otro uso para las
células inmortalizadas es para la producción ex vivo de
tejidos u órganos "artificiales" para uso terapéutico. Otro
uso para tales células es para la selección o validación de
fármacos, tales como fármacos inhibidores de telomerasa, o para uso
en la producción de vacunas o reactivos biológicos. Otros usos de
las células de la invención serán evidentes para los
especialistas.
La invención también proporciona animales
transgénicos no humanos que comprenden TERT heterólogo o
construcciones recombinantes que comprenden el promotor de TERT
endógeno. En una realización preferida, los animales transgénicos
de la invención comprenden un promotor de TERT que dirige un gen
heterólogo, tal como una secuencia codificante de un gen indicador.
En una realización preferida, un promotor de hTERT de la invención
está unido operativamente a un gen indicador en un ratón
transgénico. Como alternativa, un promotor de mTERT está unido
operativamente a un gen indicador en un ratón transgénico. Estos
animales transgénicos son muy útiles como modelos animales in
vivo para seleccionar moduladores de la actividad
transcripcional de TERT. La introducción de hTERT y mTERT u otros
promotores de TERT en animales para generar modelos transgénicos
también se usa para evaluar las consecuencias de mutaciones o
deleciones en las regiones reguladoras de la transcripción.
En una realización, el gen de TERT endógeno en
estos ratones aún es funcional y aún puede existir actividad
telomerasa de tipo silvestre (nativa). Un promotor de TERT de la
invención se usa para dirigir un alto nivel de expresión de una
construcción de TERT exógena, y la proteína mTERT producida
endógenamente puede reemplazarse competitivamente por la proteína
TERT exógena introducida. Este animal transgénico (que retiene una
actividad telomerasa endógena funcional) se prefiere en situaciones
en las que es deseable retener la función de la telomerasa endógena
"normal" y la estructura de los telómeros. En otras
situaciones, cuando es deseable que toda la actividad telomerasa se
deba a la proteína TERT exógena introducida, puede usarse una
línea knockout de mTERT.
La función del promotor, y en una realización
preferida la función del promotor de hTERT, puede evaluarse con
estos animales transgénicos. Pueden construirse alteraciones de
promotores de TERT que dirijan TERT o un gen indicador para evaluar
su función, su modelo de expresión y sus características (la
invención también proporciona construcciones, animales y métodos
para la expresión génica dirigida por un promotor de TERT por
transfección transitoria).
En una realización, los promotores de TERT y
reactivos de la invención se usan para crear células de ratón y
animales transgénicos en los que el promotor de TERT endógeno está
delecionado, modificado, suplementado o inhibido. Por ejemplo, las
secuencias del promotor de TERT pueden estar delecionadas,
modificadas o inhibidas en uno o los dos alelos. Las células o
animales pueden reconstituirse con un promotor de TERT modificado o
de tipo silvestre, o en una realización preferida, un TERT exógeno
en forma de hTERT.
La construcción de una célula y un animal
"knockout" se basa en la premisa de que el nivel de expresión
de un gen particular en una célula de mamífero puede reducirse o
anularse completamente por medio de la introducción en el genoma de
una nueva secuencia de ADN que sirve para romper alguna parte de la
secuencia de ADN del gen/promotor a suprimir. Para prevenir la
expresión del promotor endógeno, pueden ser adecuadas mutaciones
simples que alteran o rompen el promotor. Para regular
positivamente la expresión, un promotor de TERT nativo puede
substituirse por un promotor de TERT heterólogo o mutado que
induce mayores niveles de transcripción, o por múltiples copias de
promotores de TERT transgénicos. Además, puede usarse una
"inserción de trampas génicas" para romper un gen del
hospedador, y pueden usarse células madre embrionarias (ES) de
ratón para producir animales transgénicos knockout, como se describe
en este documento y en Holzschu (1997) Transgenic Res 6:
97-106.
La invención también proporciona vectores
diseñados específicamente para la integración por recombinación
homóloga que comprenden secuencias del promotor de TERT. Los
factores importantes para optimizar la recombinación homóloga
incluyen el grado de identidad de secuencia y la longitud de
homología con secuencias cromosómicas. También es importante la
secuencia específica que media la recombinación homóloga, porque la
integración se produce mucho más fácilmente en ADN activo
transcripcionalmente. Mansour (1988) Nature 336; 348; Bradley
(1992) Bio/Technology 10:534; y las Patentes de Estados Unidos
5.627.059; 5.487.992; 5.631.153; y 5.464.764, describen métodos y
materiales para construir construcciones de dirección
homólogas.
En una realización preferida, los modelos de
células y animales transgénicos expresan el promotor de TERT
(particularmente, el promotor de hTERT) unido operativamente a un
gen indicador. La célula o animal puede ser un promotor de TERT
"knockout" o puede retener la actividad del promotor de TERT
endógeno. La inserción de la secuencia exógena que contiene el
promotor de TERT típicamente es por recombinación homóloga entre
secuencias de ácidos nucleicos complementarias. De esta manera, la
secuencia exógena, que típicamente es un promotor de hTERT o mTERT
de esta invención, es alguna parte del gen diana a modificar, tal
como un exón, intrón o secuencias reguladoras de la
transcripción, o cualquier secuencia genómica que pueda afectar al
nivel de expresión del gen diana; o una combinación de los mismos.
La construcción también puede introducirse en otras localizaciones
en el genoma. La dirección de genes a través de recombinación
homóloga en células madre embrionarias pluripotenciales permite
modificar de forma precisa la secuencia genómica de interés.
En otra realización, la secuencia del promotor de
TERT introducida (modificada o de tipo silvestre) puede reemplazar
o alterar una secuencia del promotor de TERT endógeno. Una
secuencia del promotor de TERT recién introducida puede modificarse
por ingeniería genética para tener una mayor o menor actividad de
transcripción, o para responder a nuevos agentes moduladores de la
transcripción de actuación trans, y similares.
La alteración de una secuencia del promotor de
TERT endógeno típicamente reducirá o anulará ("knockout") la
transcripción de TERT. En una realización, el promotor de TERT
"knockout" se prepara por deleción o alteración por
recombinación homóloga del promotor de hTER endógeno. En Moynahan
(1996) Hum. Mol. Genet. 5:875; Moynahan (1996) Hum. Mol. Genet.
5:875; Baudin (1993) Nucl. Acids. Res. 21:3329; Wach (1994) Yeast
10:1793; Rothstein (1991) Methods Enzymol. 194:281; Anderson (1995)
Methods Cell Biol. 48:31; Pettitt (1996) Development
122:4149-4157; Ramirez-Solis (1993)
Methods Enzymol. 225:855; Thomas (1987) Cell 51:503; Couldrey
(1998) Dev. Dyn. 212:284-292). Holzschu (1997)
Transgenic Res 6:97-106; en las Patentes de Estados
Unidos 5.464.764; 5.631.153; 5.487.992, 5.627.059 y 5.272.071; y en
los documentos WO 91/09955; WO 93/09222; WO 96/29411; WO 95/31560;
y WO 91/12650, se describe la recombinación homóloga y otros medios
para alterar (y "knockout") la expresión de secuencias
endógenas. Los vectores útiles en la terapia con el gen TERT pueden
ser virales o no virales. Pueden comprender otras secuencias
reguladoras o de procesamiento. Lyddiatt (1998) Curr Opin
Biotechnol 9: 177-85.
La invención proporciona medios para la
liberación de los sistemas de expresión en células o tejidos in
vitro o ex vivo. Para la terapia ex vivo, pueden
introducirse vectores en células recogidas del paciente y propagarse
clonalmente para el transplante autólogo de nuevo en el mismo
paciente (Patentes de Estados Unidos Nº. 5.399.493 y 5.437.994. Las
células que pueden ser la diana para la terapia génica con el
promotor de TERT destinadas a aumentar la actividad telomerasa de
una célula diana incluyen, pero sin limitación, células madre
embrionarias o células germinales, particularmente células de
primate o humanas, células madre hematopoyéticas (SIDA y después de
quimioterapia), células del endotelio vascular (enfermedades
cardíacas y cerebrovasculares), fibroblastos de la piel y
queratinocitos basales de la piel (curación de heridas y
quemaduras), condrocitos (artritis), astrocitos cerebrales y
células de microglia (enfermedad de Alzheimer), osteoblastos
(osteoporosis), células de la retina (enfermedades oftálmicas) y
células de los islotes pancreáticos (diabetes de tipo I).
La secuencia exógena típicamente se inserta en
una construcción, normalmente también con un gen marcador para
ayudar a la detección de la construcción knockout y/o un gen de
selección. La construcción knockout se inserta en una célula,
típicamente una célula madre embrionaria (ES), normalmente por
recombinación homóloga. La célula transformada resultante puede ser
un solo gen knockout (un haplotipo) o un gen doble (homocigoto)
knockout. La construcción knockout puede integrarse en una o varias
localizaciones del genoma celular debido a la naturaleza aleatoria
de los acontecimientos de recombinación homóloga; sin embargo, la
recombinación no se produce entre regiones de complementariedad de
secuencia. Típicamente, menos de un uno a un cinco por ciento de
las células ES que captan la construcción knockout integrarán
realmente el ADN exógeno en estas regiones de complementariedad; de
esta manera, normalmente es necesaria la identificación y selección
de las células con el fenotipo deseado y normalmente se incorpora
una secuencia de selección o marcadora en la construcción para este
fin. Las células que han incorporado la construcción se seleccionan
antes de insertar la célula manipulada genéticamente en un embrión
en desarrollo; por ejemplo, las células se someten a selección
positiva (usando, por ejemplo, G418, para seleccionar con respecto a
la resistencia a neomicina) y selección negativa (usando, por
ejemplo, FIAU para excluir las células que carecen de timidina
quinasa). Las técnicas de selección y de marcaje incluyen selección
por resistencia a antibióticos o expresión del marcador
\beta-galactosidasa como se describe en otras
partes de esta descripción.
Después de la selección de las células
manipuladas con el fenotipo deseado, tal como una incapacidad
completa o parcial de expresar el promotor de TERT endógeno, o la
expresión del promotor de TERT endógeno (como actividad del
promotor de hTERT), las células se insertan en un embrión de ratón.
La inserción puede realizarse por una diversidad de técnicas tales
como microinyección, en la que se recogen de aproximadamente 10 a
30 células en una micropipeta y se inyectan en embriones que están
en la fase apropiada de desarrollo para integrar la célula ES en el
blastocisto embrionario en desarrollo, aproximadamente en la fase
de ocho células, que para el ratón es aproximadamente 3,5 días
después de la fertilización. Los embriones se obtienen por
perfusión del útero de hembras preñadas. Después de haber
introducido la célula ES en el embrión, se implanta en el útero de
una madre de acogida seudopreñada, que típicamente se prepara por
apareamiento con machos vasectomizados de la misma especie. En
ratones, el tiempo óptimo para el implante es de aproximadamente
dos a tres días de seudoembarazo. La descendencia se selecciona con
respecto a la integración de las secuencias de ácido nucleico de
TERT y el fenotipo de actividad del promotor modificada. Las crías
que tienen el fenotipo deseado se cruzan entre sí para generar un
knockout homocigoto. Si no está claro si las células de la línea
germinal de la descendencia tienen el promotor modificado, pueden
cruzarse con un parenteral u otra cepa y la descendencia
seleccionarse con respecto a la heterocigosidad del rasgo deseado.
Los heterocigotos pueden cruzarse entre sí para producir ratones
homocigotos para la secuencia genómica de TERT modificada. Bijvoet
(1998) Hum. Mol. Genet. 7:53-62; Moreadith (1997) J.
Mol. Med. 5:208-216; Tojo (1995) Cytotechnology
19:161-165; Mudgett (1995) Methods Mol. Biol.
48:157-184; Longo (1997) Transgenic Res.
6:321-328; Patente de Estados Unidos Nº 5.616.491
(Mak, et al.); 5.464.764; 5.631.153; 5.487.992; 5.627.059;
5.272.071; y documentos WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411, WO
95/31560 y WO 91/12650. De esta manera, la invención proporciona
medios para el uso de los reactivos que contienen la secuencia del
promotor de TERT de la invención para producir animales y células
de ratón "knockout", animales transgénicos y su progenie.
Estas células y animales pueden reconstituirse adicionalmente con
el promotor de mTERT endógeno de tipo silvestre o modificado o un
promotor de TERT exógeno, tal como hTERT.
La presente invención también proporciona métodos
y reactivos para el análisis de cariotipos, detección de
amplificación de genes, u otros análisis cromosómicos usando sondas
que comprenden las secuencias del promotor de TERT de la invención.
En diversas realizaciones, se detectan amplificaciones (cambios en
el número de copias), deleciones, inserciones, substituciones o
cambios en la localización cromosómica (translocaciones) de genes
que contienen el promotor de TERT. Estos acontecimientos pueden
correlacionarse con la presencia de un estado patológico o una
predisposición a desarrollar un estado patológico (tal como un
cáncer). De esta manera, esta información puede usarse para un
diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, un acontecimiento de
translocación podría indicar que la activación de la expresión de
TERT se produce en algunos casos reemplazando todo o parte del
promotor de TERT por otro elemento promotor que dirige la
transcripción de TERT de una manera inapropiada. Además, los métodos
y reactivos de la invención pueden usarse para inhibir esta
activación de TERT inapropiada.
La determinación de la localización cromosómica
de la secuencia del promotor de TERT también puede ser útil para el
análisis de la represión del gen TERT en células somáticas
normales, por ejemplo, si la localización es parte de una
heterocromatina que no se expresa. En Wu (1979) Cell 16:797;
Groudine (1982) Cell 30:131; Gross (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:159
se describen ensayos de hipersensibilidad a nucleasas para
distinguir la heterocromatina y la eucromatina. En Pinkel (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:9138: Pub EPO Nº 430.402;
Choo, ed., Methods In Molecular Biology Vol. 33: In Situ
Hybridization Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1994;
Kallioniemi (1992) Science 258:818) se describen métodos para
analizar el cariotipo.
Además de las nuevas secuencias del promotor de
TERT y la identificación de las secuencias reguladoras de la
transcripción de actuación cis contenidas en dichas secuencias, la
invención proporciona nuevos sistemas de ensayo in vitro e
in vivo basados en células para seleccionar proteínas de
unión al promotor de TERT (factores reguladores de la transcripción
de actuación trans) usando los ácidos nucleicos de la invención.
Se dispone de muchos ensayos que seleccionan proteínas de unión a
ácidos nucleicos y todos pueden adaptarse y usarse con las nuevas
secuencias de TERT proporcionadas por la invención.
Una realización de la invención proporciona un
método para seleccionar y aislar un compuesto de unión al promotor
de TERT poniendo en contacto una secuencia del promotor de TERT de
la invención (particularmente, una secuencia reguladora de
actuación cis identificada) con un compuesto de ensayo y midiendo
la capacidad del compuesto de ensayo de unirse al ácido nucleico
seleccionado. El compuesto de ensayo puede ser cualquier agente
capaz de unirse específicamente a una actividad promotora de TERT,
incluyendo compuestos disponibles en bibliotecas combinatorias, un
extracto celular, un extracto nuclear, una proteína o un péptido.
Si el objetivo de la búsqueda es una proteína activadora de la
transcripción de TERT, típicamente se elige una célula con
actividad telomerasa.
Pueden usarse diversas técnicas para identificar
péptidos que se unen específicamente al promotor de TERT, por
ejemplo, ensayos de unión al ADN con cambio de movilidad, ensayos
de metilación e interferencia de uracilo, análisis de DNasa y de
huellas de radicales hidroxilo, polarización de fluorescencia y
reticulación UV o agentes de reticulación químicos. Como visión de
conjunto, véase Ausubel (capítulo 12, DNA-Protein
Interactions). Una técnica para aislar proteínas de coasociación,
incluyendo proteínas de unión a ácidos nucleicos y ADN/ARN,
incluye el uso de reticulación UV o de agentes de reticulación
química, incluyendo los agentes de reticulación escindibles
ditiobis(succinimidilpropionato) y
3,3'-ditiobis(sulfosuccinimidil-propionato).
McLaughlin (1996) Am. J. Hum. Genet. 59:561-569;
Tang (1996) Biochemistry 35:8216-8225; Lingner
(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 93:10712; Chodosh
(1986) Mol. Cell. Biol. 6:4723-4733. En muchos casos
hay una alta probabilidad de que una proteína específica (o una
proteína relacionada) pueda unirse a una secuencia del promotor de
hTERT, tal como Myc, NF-kappa B, EF2, Sp1,
AP-1 o el sitio de unión a la caja CAAT. En estos
escenarios, donde un anticuerpo ya puede estar disponible o puede
generarse fácilmente, puede usarse un análisis de
co-inmunoprecipitación para identificar y aislar
factores de actuación trans que se unen al promotor de TERT. El
factor de actuación trans puede caracterizarse por análisis de la
secuencia peptídica. Una vez identificada, la función de la
proteína puede confirmarse, por ejemplo, por experimentos de
competición, experimentos de reducción de factores usando un
anticuerpo específico para el factor o por competición con un factor
mutante.
Como alternativa, pueden generarse columnas de
afinidad del promotor de TERT para seleccionar proteínas de unión a
TERT potenciales. En una variación de este ensayo, se biotinilan
subsecuencias del promotor de TERT, se hacen reaccionar con una
solución que se sospecha que contiene una proteína de unión, y
después se hacen reaccionar con una columna de afinidad de
estreptavidina para aislar el ácido nucleico o el complejo de
proteína de unión (Grabowski (1986) Science
233:1294-1299; Chodosh (1986) supra). El
promotor -proteína de unión después puede eluirse convencionalmente
y aislarse. El ensayo de unión de proteínas al ADN con cambio de
movilidad usando electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) no
desnaturalizante es un método extremadamente rápido y sensible para
detectar la unión específica de un polipéptido a un ADN (Chodosh
(1986) supra, Carthew (1985) Cell 43:439-448;
Trejo (1997), J. Biol. Chem. 272:27411-27421;
Bayliss (1997) Nucleic Acids Res. 25:3984-3990).
Pueden usarse ensayos de interferencia y DNasa y
huellas de radicales hidroxilo para identificar restos específicos
en el sitio de unión entre la proteína y el ácido nucleico. Bi
(1997) J. Biol. Chem. 272:26562-26572; Karaoglu
(1991) Nucleic Acids Res. 19:5293-5300. La
polarización fluorescente es una técnica poderosa para caracterizar
asociaciones macromoleculares y puede proporcionar determinaciones
en equilibrio de interacciones de proteína-ADN y
proteína-proteína. Esta técnica es particularmente
útil (y está mejor adecuada que los métodos electroforéticos) para
estudiar interacciones de proteína-proteína de baja
afinidad. Lundblad (1996) Mol. Endocrinol
10:607-612.
Las proteínas identificadas por estas técnicas
pueden separarse adicionalmente basándose en su tamaño, carga
superficial neta, hidrofobia y afinidad por ligandos. Además,
pueden conjugarse anticuerpos inducidos contra tales proteínas con
matrices de columna y las proteínas pueden inmunopurificarse de
acuerdo con métodos bien conocidos. Scopes, R. K., Protein
Purification: Principles and Practice, 2ª ed. Springer Verlag,
(1987).
Las secuencia reguladora de la transcripción
identificada por comparación de las secuencias de hTERT y mTERT
incluyen los factores de actuación trans c-Myc, SP1,
SRY, HNF-3\beta, HNF-5,
TFIID-MBP, E2F y c-Myb. La tabla 1
muestra otras secuencias reguladoras de la transcripción que se han
identificado cadena arriba de la región codificante de TERT por
comparación de la secuencia de hTERT con motivos reguladores
conocidos. Estos elementos son de interés en la regulación de la
transcripción en los tipos celulares donde están presentes los
factores que se unen a estos elementos.
Los ejemplos y la elaboración detallada
proporcionada en esta descripción tienen fines ilustrativos y no
pretenden limitar la invención. Los especialistas en la técnica
podrán realizar modificaciones que se incluyen dentro del espíritu
de esta solicitud y del alcance las reivindicaciones adjuntas.
El siguiente ejemplo detalla la clonación de
promotor de hTERT humano. Se seleccionó una biblioteca de ADN
genómico humano por PCR e hibridación para identificar un clon
genómico que contuviera secuencias codificantes de ARN de hTERT. La
biblioteca era una biblioteca genómica de fibroblastos humanos
obtenida usando ADN de fibroblastos pulmonares W138 (Stratagene, Nº
de cat. 946204). En esta biblioteca de fibroblastos, se unieron
fragmentos Sau3AI parciales en el sitio XhoI de un vector de
clonación de fago comercial, el vector Lambda FSX® (Stratagene, San
Diego, CA) variando los tamaños de los insertos de aproximadamente
9 kilobases (kb) a 22 kb.
La biblioteca genómica se dividió en grupos de
150.000 fagos cada uno. Cada conjunto se seleccionó por PCR
anidada, con el par de cebadores externos TCP1.52 y TCP1.57; y el
par interno TCP1.49 y TCP1.50. Estos pares de cebadores abarcan un
supuesto intrón en el ADN genómico de hTERT y aseguraban que el
producto de PCR procedía de una fuente genómica y no de la
contaminación por el clon de ADNc de hTERT. Los grupos positivos se
subdividieron adicionalmente hasta que se obtuvo un conjunto de
2000 fagos. Este conjunto se cultivó en placas a una baja densidad
y se seleccionó por hibridación con un fragmento de ADN que
comprendía una subserie de ADNc de hTERT, generado por digestión de
restricción con SphI y EcoRV.
Se aislaron dos clones positivos y se
reseleccionaron mediante PCR anidada. En la reselección, los dos
clones fueron positivos por PCR. Uno de los clones del fago lambda
(denominado "Gphi5" o "\lambdaG\varphi5") se digirió
con NotI, revelando un tamaño de inserto de aproximadamente 20 kb.
El posterior mapeo indicó que el tamaño del inserto era de 15 kb y
que el fago \lambdaG\varphi5 contiene aproximadamente 13 kb de
ADN cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción (cadena
arriba de la secuencia de ADNc).
La figura 1 muestra la estructura del fago
\lambdaG\varphi5 mapeado por digestión con enzimas de
restricción y secuenciación del ADN.
El ADN del fago se digirió con NcoI. Este
fragmento se clonó en el plásmido pBBS167. Los subclones
resultantes se seleccionaron por PCR para identificar los que
contenían secuencias correspondientes a la región 5' de ADNc de
hTERT. Un subclon (plásmido "pGRN140") que contenía un
fragmento NcoI de 9 kb (con la secuencia del gen hTERT y de
aproximadamente 4 a 5 kb de la secuencia del vector lambda) se
secuenció parcialmente para determinar la orientación del inserto.
pGRN140 se digirió usando SalI para retirar las secuencias del
vector lambda, denominándose el plásmido resultante (con las
secuencias lambda retiradas) pGRN144. Después se secuenció el
inserto de
pGRN144.
pGRN144.
En el sitio NotI del plásmido pBBS185 se insertó
un fragmento NotI de \lambdaG\varphi5 (que contenía el inserto
genómico completo de aproximadamente 15 kpb incluyendo la región
del promotor del gen hTERT). Se aislaron dos plásmidos con sus
insertos respectivos orientados en direcciones opuestas. Uno tuvo el
inserto orientado con la fase de lectura abierta (ORF) de hTERT en
la misma orientación que el promotor Lac del plásmido, denominado
pGRN 142; el segundo se denominó pGRN 143.
La SEC ID Nº: 1 es una lista de los datos de
secuencia obtenidos a partir del plásmido pGRN 142. Los nucleótidos
1-43 y 15376-15418 son secuencias
plasmídicas. De esta manera, el inserto genómico empieza en el resto
44 y termina en el resto 15375. El principio del fragmento de ADNc
clonado corresponde al resto 13490. Hay elementos de secuencia Alu
localizados \sim 1700 pares de bases cadena arriba. La secuencia
del inserto de hTERT de pGRN 142 ahora puede obtenerse en el
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) con el acceso PGRN142.INS AF
121948.
La numeración de los restos de hTERT para los
plásmidos en los siguientes ejemplos empieza en el codón de inicio
de la traducción, de acuerdo con la práctica convencional en el
campo. El codón ATG de hTERT (el sitio de inicio de la traducción)
comienza en el resto 13545 de la SEC ID Nº: 1. De esta manera, la
posición -1, el primer resto cadena arriba, corresponde al
nucleótido 13544 en la SEC ID Nº: 1.
Este ejemplo describe la construcción de
plásmidos en los que genes indicadores están unidos operativamente
a secuencias del promotor de hTERT de la invención. Esto también
ilustra cómo la secuencia del promotor de TERT de la invención
puede unirse operativamente de forma análoga a secuencias
heterólogas, tales como secuencias que codifican polipéptidos, para
la expresión en células y tejidos in vitro e in vivo
y en animales transgénicos. Como será evidente para un especialista
en la técnica, pueden usarse técnicas tales como las ilustradas en
estos ejemplos para ensayar otras secuencias candidatas con
respecto a su capacidad de promover específicamente la transcripción
en células que expresan TERT.
Los vectores indicadores unidos a hTERT de la
invención tienen numerosos usos, incluyendo la identificación de
secuencias de actuación cis y de factores reguladores de la
transcripción de actuación trans específicos. De forma importante,
estas construcciones de indicadores que contienen hTERT pueden
usarse para la selección de agentes capaces de modular (es decir,
activar o inhibir) la transcripción de hTERT. Estos estudios pueden
realizarse in vitro e in vivo.
Se conocen varios genes indicadores, tales como
la luciferasa de luciérnaga, \beta-glucuronidasa,
\beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil
transferasa y GFP, y pueden unirse operativamente al promotor de
hTERT. En este ejemplo, se usó la fosfatasa alcalina secretada
humana (SEAP; GlonTech). El gen indicador de SEAP codifica una
forma truncada del enzima placentario que carece del dominio de
anclaje a la membrana, permitiendo de esta manera que la proteína
se secrete eficazmente desde las células transfectadas. Se ha
demostrado que los niveles de actividad SEAP detectados en el medio
de cultivo son directamente proporcionales a cambios en las
concentraciones intracelulares de ARNm y de la proteína SEAP. El
ensayo de SEAP basado en quimioluminiscencia es aproximadamente 10
veces más sensible que ensayos similares que usan luciferasa de
luciérnaga como enzima indicador. La actividad SEAP también puede
ensayarse con un substrato fluorescente, que proporciona una
sensibilidad comparable a la de la luciferasa. Berger (1988) Gene
66:1; Cullen (1992) Meth. Enzymol. 216:362; Yang (1997)
Biotechniques 23:1110-1114.
Ciertos experimentos realizados con
construcciones de indicadores que comprendían diversas secuencias
de hTERT de la invención identificaron regiones de actuación cis
con actividad activadora de la transcripción "promotora" tanto
en secuencias 5' cadena arriba como en secuencias de intrones. En
resumen, se construyeron cuatro construcciones, pGRN148, pGRN150,
"pSEAP 2 basic" (sin secuencias promotoras = control
negativo) y "pSEAP control" (que contiene el promotor temprano
y el potenciador de SV40) y se utilizaron para transfectar por
triplicado células mortales e inmortales.
La figura 2 muestra el plan para la construcción
del plásmido pGRN148. En resumen, se digirió un fragmento
Bgl2-Eco47III de pGRN144 (descrito anteriormente) y
se clonó en el sitio BglII-NruI de pSeap2Basic
(ClonTech, San Diego, CA). Se obtuvo un segundo
indicador-promotor, el plásmido pGRN150, insertando
el fragmento BglII-FspI de pGRN144 en los sitios
BglII-NruI de pSEAP2. El plásmido pGRN173 se
construyó usando el fragmento EcoRV-StuI de
pGRN144. De esta forma se obtiene un plásmido
promotor-indicador que contiene la región promotora
de hTERT desde aproximadamente 2,5 kb cadena arriba del inicio de
la ORF de hTERT hasta justo después del primer intrón dentro de la
región codificante. La Met de iniciación se mutó a Leu, de forma
que el segundo ATG después de la región promotora sería el ATG de
iniciación de la ORF de SEAP.
El uso de la secuencia del intrón permite la
identificación de secuencias reguladoras que pueden estar presentes
en el intrón (la invención proporciona secuencias reguladoras de la
transcripción de cualquier porción de la secuencia genómica de
hTERT). Además de las construcciones de indicador de pSEAP derivadas
de hTERT, se usaron un vector de control positivo y un vector de
control negativo. El control negativo
(pSEAP2-Basic) se necesita para determinar la señal
de fondo asociada con el esqueleto de ADN del vector. Se necesita un
control positivo para confirmar la transfección y expresión del ADN
exógeno y para verificar la presencia de SEAP activa en el medio de
cultivo. El control positivo es el vector de control
pSEAP-2 (ClonTech) que contiene el gen estructural
de SEAP bajo el control de la transcripción del promotor y
potenciador de SV40.
Tres construcciones, el control, pGRN148 (que
incluye secuencias del promotor 5' de hTERT) y pGRN150, se
introdujeron por transfección en una línea de células mortales,
células BJ, una línea de fibroblastos de prepucio humano, Feng
(1995) Science 269:1236; y una línea de células inmortales, la línea
de riñón embrionario humano 293; Graham (1977) J. Gen. Virol. 36:59.
Todas las transfecciones se realizaron en paralelo con los dos
plásmidos de control.
En las células inmortales, las construcciones
pGRN148 y pGRN150 parecen dirigir la expresión de SEAP tan
eficazmente como el control positivo pSEAP2 (que contenía el
promotor temprano y el potenciador de SV40). Por el contrario, en
las células mortales sólo el control pSEAP2 proporcionó una
actividad detectable. Se obtuvieron resultados similares usando
otra línea de células normales (RPE, o células epiteliales
pigmentarias de retina; Aronson (1983) In vitro
19:642-650). En las células RPE transfectadas con
pGRN150, la región del promotor de hTERT era inactiva, mientras que
el plásmido de control pSEAP2 era activo. Estos resultados indican
que, como era de esperar, las secuencias del promotor de hTERT son
activas en células tumorales pero no en células mortales.
Las secuencias de ADN del promotor de hTERT se
clonaron en el vector indicador de transcripción
pSEAP2-Basic (ClonTech) para generar los plásmidos
pGRN 148, 150, 175, 176, 181, 184, 261, 262 y 319. Más adelante se
resumen los detalles de la construcción de los plásmidos de
promotores (los números de nucleótidos se refieren al número de
nucleótidos cadena arriba del sitio de inicio de la traducción en
13545 de la SEC ID Nº: 1):
pEGFP-1. * Vector de ClonTech que
contiene la proteína fluorescente verde potenciada.
pGRN140. * Fragmento NCO1 que contiene secuencias
cadena arriba de hTERT y el primer intrón de hTERT
de \lambdaG\varphi5 en el sitio NCO1 de un pBBS167 (variante del vector de clonación pUC19 con MCS, por ejemplo
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCCCATGG CAGGCCTCG CGCGCGAGATCTCGGGCCCAATCGATGCCGCGGCGATATCGCTCGAGGAAGCTTGGCACT
GGCC (SEC ID Nº: 3) y un gen sensible al cloranfenicol entre el F1ori y el gen Amp en orientación opuesta a la del gen Amp). El fragmento está orientado de forma que las secuencias de hTERT están en la misma dirección que el promotor Lac.
de \lambdaG\varphi5 en el sitio NCO1 de un pBBS167 (variante del vector de clonación pUC19 con MCS, por ejemplo
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCCCATGG CAGGCCTCG CGCGCGAGATCTCGGGCCCAATCGATGCCGCGGCGATATCGCTCGAGGAAGCTTGGCACT
GGCC (SEC ID Nº: 3) y un gen sensible al cloranfenicol entre el F1ori y el gen Amp en orientación opuesta a la del gen Amp). El fragmento está orientado de forma que las secuencias de hTERT están en la misma dirección que el promotor Lac.
pGRN144; descrito anteriormente; deleción con
SalI de pGRN140 para retirar las secuencias del fago (lambda).
pGRN148: * fragmento
BGL2-ECO47III de pGRN144 que contiene secuencias
cadena arriba de hTERT (desde la posición -51 a -2482) en los sitios
BGL2-NRU1 de pSEAP2-Basic para
obtener un plásmido de promotor de hTERT/indicador.
pGRN150: * fragmento de BGL2-FSP1
de pGRN144 que contiene 2447 nucleótidos de secuencias cadena
arriba de hTERT (desde la posición -36 a -2482) en los sitios
BGL2-NRU1 de pSEAP2 para obtener un plásmido de
promotor de hTERT/indicador.
pGRN175: * religadura de APA1 (romo de
Klenow)-SRF1 de pGRN150 para delecionar la mayor
parte de las secuencias cadena arriba de hTERT. Esto hace que se
obtenga un plásmido de promotor/indicador que usa 82 nucleótidos de
las secuencias cadena arriba de hTERT (desde la posición -36 a
-117).
pGRN176: * religadura de
PML1-SRF1 de pGRN150 para delecionar la mayor parte
de las secuencias cadena arriba de hTERT. Esto hace que se obtenga
un plásmido de promotor/indicador que usa 204 nucleótidos de las
secuencias cadena arriba de hTERT (desde la posición -36 a
-239).
pGRN185: * digestión con APA1 y religadura de
pGRN150 para delecionar todos los sitios APA1 excepto uno. Esto
hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que comprende
desde la posición -36 a -114 y desde la posición -1076 a -2482 de
las secuencias cadena arriba de hTERT.
pGRN184: * digestión con XBA1 (parcial, relleno
de Klenow)-ECOR1 y religadura de pGRN150 para
obtener una deleción de las secuencias del promotor de hTERT. Esto
hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que expresa
una región de -1391 a -2484 de las secuencias cadena arriba de
hTERT.
pGRN213. * fragmento FSP1 que contiene gen CatS y
el F1 ORI más parte de gen AmpR en los sitios FSP1 de
pSEAP-Basic de tal forma que la orientación
reconstruye el gen AmpR.
pGRN244: * fragmento SAL1-NOT1 de
pSEAP-Basic que contiene la región SEAP en los
sitios SAL1-NOT1 de pEGFP-1. Esta
modificación añade un marcador selectivo al vector.
pGRN245: * fragmento SAL1-NOT1 de
pGRN176 que contiene el promotor de hTERT/región SEAP en los sitios
SAL1-NOT1 de pEGFP-1. Esta
modificación añade un marcador selectivo dominante al vector.
pGRN246: * fragmento SAL1-NOT1 de
pGRN176 que contiene el promotor de hTERT/región SEAP en los sitios
SAL1-NOT1 de pEGFP-1. Esta
modificación añade un marcador selectivo dominante al vector.
pGRN248: * fragmento SAL1-NOT1 de
pGRN175 que contiene el promotor de hTERT/región SEAP en los sitios
SAL1-NOT1 de pEGFP-1. Esta
modificación añade un marcador selectivo dominante al vector.
pGRN259: * mutagénesis in vitro usando
RA94 (CCCGGCCACCCCCGCGAattCGCGCGCTCCCCGCTGC) (SEC ID Nº: 4) para
introducir un sitio EcoRI en la Met de iniciación de hTERT en
pGRN144. Esto proporciona secuencias de hTERT desde +1 a -2482 que
pueden clonarse en un vector usando EcoRI y BglII.
pGRN260: * mutagénesis in vitro usando
RA91
(TTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGcatgcTACG
TAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAAT) (SEC ID Nº: 5) para delecionar varios sitios de la región de cloranfenicol de pGRN213 para crear una MCS variante más útil. Esto crea una versión de mutagénesis de pSEAP2-Basic con más sitios de clonación únicos en su MCS.
TAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAAT) (SEC ID Nº: 5) para delecionar varios sitios de la región de cloranfenicol de pGRN213 para crear una MCS variante más útil. Esto crea una versión de mutagénesis de pSEAP2-Basic con más sitios de clonación únicos en su MCS.
pGRN261: * fragmento BGL2-ECOR1
de pGRN259 que contiene secuencias cadena arriba de hTERT en los
sitios BGL2-ECOR1 de pSEAP2-Basic.
Eso hace que se obtenga un plásmido de expresión de
promotor/indicador que contiene de +1 a -2482 de las secuencias
cadena arriba de hTERT.
pGRN262: * fragmento BGL2-ECOR1
de pGRN259 que contiene secuencias cadena arriba de hTERT en los
sitios BGL2-ECOR1 de pGRN260. Esto hace que se
obtenga un plásmido de expresión y mutagénesis de
promotor/indicador que contiene desde +1 a -2482 de las secuencias
cadena arriba de hTERT.
pGRN294. * fragmento BbsI-Xhol de
pGRN142 que contiene secuencias cadena arriba de hTERT desde -1667
a -3278 en los sitios BbsI-XhoI de pGRN259. Esto
hace que se obtenga un vector que contiene la región genómica cadena
arriba para hTERT desde +1 a -3278 que puede clonarse con EcoRI y
XhoI.
pGRN295: * fragmento ECOR1-XHO1
de pGRN294 que contiene desde +1 a -3282 de secuencias cadena
arriba de hTERT en los sitios ECOR1-XHO1 de pGRN260.
Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor de
SEAP/indicador/mutagénesis.
pGRN296: * fragmento ECOR1-XHO1
de pGRN294 que contiene desde +1 a -3282 de las secuencias cadena
arriba de hTERT en los sitios ECOR1-XHO1 de pSEAP2-
Basic. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor de
SEAP/indicador.
pGRN297: * RA96 (AATTGCGAAGCTTACG) (SEC ID Nº: 6)
Y RA97 (AATTCGTAAGCTTCGC) (SEC ID Nº: 7) templados para obtener un
enlazador oligonucleotídico en los sitios ECOR1 de pGRN259 que
reemplaza el fragmento ECOR1 de la región de intrón/exón de
pGRN259.
pGRN299: * fragmento XHO1-HIND3
de pGRN298 que contiene de +1 a -3282 de las secuencias cadena
arriba de hTERT en los sitios XHO1-HIND3 de
pGL2-Basic. Esto hace que se obtenga un plásmido de
promotor de luciferasa/indicador con aproximadamente 3,3 kb de
secuencias del promotor de hTERT.
pGRN300: * fragmento XHO1-SAC1 de
pGRN142 que contiene secuencias cadena arriba de hTERT en los
sitios XHO1-SAC1 de pGRN299 de tal forma que la
construcción resultante contiene de +1 a -5124 de las secuencias
cadena arriba de hTERT. Esto crea una construcción de promotor de
hTERT/indicador usando luciferasa como indicador.
pGRN310: * fragmento SAC1 de pGRN142 que contiene
secuencias cadena arriba de hTERT en el sitio SAC1 de pGRN300 de
tal forma que la construcción resultante contiene desde la posición
+1 a –7984 de las secuencias cadena arriba de hTERT. Esto crea una
construcción de promotor de hTERT/indicador usando luciferasa como
indicador.
pGRN311: * fragmento SPE1 de pGRN142 que contiene
desde la posición -4773 a -13501 de las secuencias cadena arriba de
hTERT en el sitio SPE1 de pGRN300 de tal forma que la orientación
reconstruye la región genómica. Esto hace que se obtenga un
plásmido de promotor/indicador de luciferasa que contiene la región
genómica cadena arriba de pGRN142 entera de hTERT más una región de
365 pb de ADN genómico de la mitad de la región genómica de 13,5 kb
repetida cadena arriba del promotor de T7.
pGRN312: * fragmento BGL2-FSP1 de
pGRN144 en los sitios BGL2-HIND3 (rellenos con
Klenow) de pGL2-Basic. Esto hace que se obtenga una
versión de promotor/indicador de luciferasa de pGRN150.
pGRN313: * pGRN311 digerido con
KPN1-NOT1 cuyos extremos se han hecho romos con
polimerasa de T4 y se ha religado. Esto hace que se obtenga un
plásmido de promotor/indicador de luciferasa usando desde la
posición +1 a -13501 de las secuencias cadena arriba de hTERT.
pGRN316: * oligo RA101
(5'-TAGGTACCGAGCTCTTACGCGTCG
TAGCCCCACGTGGCGGAGGGACTGG
GGACCCGGGCA-3') (SEC ID Nº: 8) usado para mutagénesis in vitro para delecionar la secuencia genómica de pGRN262 entre el sitio SRF1 y el primer sitio PML1. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que contiene secuencias cadena arriba de hTERT desde la posición +1 a -239.
GGACCCGGGCA-3') (SEC ID Nº: 8) usado para mutagénesis in vitro para delecionar la secuencia genómica de pGRN262 entre el sitio SRF1 y el primer sitio PML1. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que contiene secuencias cadena arriba de hTERT desde la posición +1 a -239.
pGRN317: * oligo RA100
(5'-TAGGTACCGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCCCTCGCTGGCGTCCCTGCACC
CTGGGAGCGC-3') (SEC ID Nº: 9) usado para mutagénesis in vitro para delecionar la secuencia genómica de pGRN262 entre el sitio SRF1 y cerca del último sitio APA1. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que contiene secuencias cadena arriba de hTERT desde +1 a -397.
CTGGGAGCGC-3') (SEC ID Nº: 9) usado para mutagénesis in vitro para delecionar la secuencia genómica de pGRN262 entre el sitio SRF1 y cerca del último sitio APA1. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que contiene secuencias cadena arriba de hTERT desde +1 a -397.
pGRN319: * RA107
(5'-CGTCCTGCTGCGCACtcaGGAAGCCCTGGCCCC-3')
(SEC ID Nº: 10) usado para mutagénesis in vitro para
inactivar la caja E de clase "B" próxima a la Met de inicio de
hTERT en pGRN262. Esto cambia la secuencia CACGTG (SEC ID Nº: 11) a
CACTCA (SEC ID Nº: 12). También se usó CD1941
(5'GAT
GAATGCTCATGATTCCGTATGGCA-3') (SEC ID Nº: 13) para cambiar de CatR a CatS introduciendo un sitio BSPH1 y se usó COD2866 (5'-AGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGCGCAAAAACAGGAAGG
CAAAATGCC-3') (SEC ID Nº: 14) para seleccionar de AmpS a AmpR introduciendo un sitio FSP1. En resumen, pGRN319 lleva una mutación en la caja E.
GAATGCTCATGATTCCGTATGGCA-3') (SEC ID Nº: 13) para cambiar de CatR a CatS introduciendo un sitio BSPH1 y se usó COD2866 (5'-AGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGCGCAAAAACAGGAAGG
CAAAATGCC-3') (SEC ID Nº: 14) para seleccionar de AmpS a AmpR introduciendo un sitio FSP1. En resumen, pGRN319 lleva una mutación en la caja E.
pGRN350: * RA104
(5'-TAGGTACCGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCC CTCCCAGCCCCTC
CCCTTCCTTTC
CGCGGC-3') (SEC ID Nº: 15) usado para mutagénesis in vitro para delecionar la secuencia genómica de pGRN262 entre el sitio SRF1 y el último sitio APA1 antes del codón ATG de la fase de lectura abierta de hTERT (orf). Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que contiene secuencias cadena arriba de hTERT desde +1 a
-177.
CGCGGC-3') (SEC ID Nº: 15) usado para mutagénesis in vitro para delecionar la secuencia genómica de pGRN262 entre el sitio SRF1 y el último sitio APA1 antes del codón ATG de la fase de lectura abierta de hTERT (orf). Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que contiene secuencias cadena arriba de hTERT desde +1 a
-177.
pGRN351: * fragmento SAC2 de pGRN319 en los
sitios SAC2 de pGRN350 de tal forma que se recrea la orf de SEAP.
Esto hace que se obtenga una versión "caja E desactivada" de
pGRN350.
pGRN352: * RA122
(5'-GACCGCGCTTCCCACtcaGCGGAG
GGACTGGGG-3') (SEC ID Nº: 16) usado para mutagénesis
in vitro para "desactivar" la penúltima clase de caja E
"B" antes del sitio de inicio de la traducción de hTERT.
El plásmido pSEAP2-Basic carece
de secuencias promotoras y potenciadoras eucarióticas. Este vector
contiene la señal de poliadenilación tardía de SV40 insertada
cadena abajo de las secuencias codificantes de SEAP para asegurar un
procesamiento apropiado y eficaz del transcrito en células
eucariotas. También contiene un bloqueante de la transcripción (TB)
sintético, compuesto de sitios de pausa de la transcripción y
poliadenilación adyacentes para reducir la transcripción de fondo.
Como se ha indicado anteriormente, el gen indicador de SEAP
codifica una forma truncada del enzima placentario que carece del
dominio de anclaje a la membrana, permitiendo de esta manera que la
proteína se secrete eficazmente a partir de las células
transfectadas.
Se ha demostrado que los niveles de actividad
SEAP detectada en el medio de cultivo son directamente
proporcionales a cambios en las concentraciones intracelulares del
ARNm de SEAP. El substrato de SEAP quimioluminiscente CSPDTM
(ClonTech) se usó para detectar la SEAP secretada. El uso de este
substrato permite controlar la expresión del gen indicador de SEAP
por medio de ensayos sencillos, sensibles y no radiactivos de
actividad fosfatasa secretada. Este ensayo quimioluminiscente puede
detectar una cantidad tan pequeña como de 10-13 g
de proteína SEAP. El ensayo es lineal en un intervalo de
concentraciones de enzima de 104 veces. Esto hace que el ensayo (y
estos vectores) sea articularmente adecuado para análisis
comparativos.
Además de las construcciones de indicador pSEAP
derivadas de hTERT, se usaron un vector de control positivo (vector
pSEAP2-Control) y un vector de control negativo
(pSEAP2-Basic). Las construcciones del promotor
(pGRN 150, 175, 176) y los vectores de control se introdujeron por
transfección en células inmortales (HEK 293) y mortales
(fibroblastos BJ, RPE, HUVEC) 48-72 horas después
de la transfección. El medio de cultivo se recogió y se ensayó con
respecto a la actividad SEAP. La actividad SEAP se detectó usando el
ensayo quimioluminiscente de CLONTECH, Great EscAPeTM SEAP
Chemiluminescence Kit, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las transfecciones se realizaron por triplicado. Los medios de
cultivo de cada transfección se recogieron después de
48-72 horas y se ensayaron por triplicado. Los
valores de fondo obtenidos por transfección del vector del control
negativo (pSEAP2-Basic) se restaron de los valores
obtenidos con las construcciones de ensayo. Se usó la media de nueve
mediciones y se representó para cada una de las construcciones.
Los resultados de los ensayos demuestran que
aunque las construcciones del promotor de hTERT son capaces de
dirigir la expresión del gen de SEAP indicador en células
inmortales, las mismas construcciones son silenciosas en todas las
células mortales ensayadas. Sin embargo, el vector
pSEAP2-Control es activo en todos los tipos
celulares independientemente de su estado mortal o inmortal y el
vector pSEAP2-Basic es silencioso en todas las
células ensayadas.
La invención proporciona construcciones que
comprenden secuencias codificantes heterólogas unidas
operativamente a secuencias del promotor de hTERT. En una
realización, las secuencias codificantes de hTERT están unidas
operativamente a secuencias codificantes de la timidina quinasa del
virus del herpes simple ("HSV-TK").
HSV-TK es un enzima que es capaz de convertir
profármacos inocuos, por ejemplo ganciclovir, en metabolitos tóxicos
que interfieren con la replicación celular de células
proliferativas (tales como células cancerosas, que tienen la
actividad del promotor de hTERT activo). Al controlar la expresión
de la timidina quinasa (TK) por medio de su subordinación al
promotor de hTERT, se restringe la expresión de TK a células en las
que el promotor de hTERT es normalmente activo. Esto previene la
expresión de TK en células "normales", donde el promotor de
hTERT normalmente es silencioso.
La capacidad del promotor de hTERT de dirigir
específicamente la expresión del gen TK en células tumorales se
ensayó usando una diversidad de construcciones: una construcción,
denominada pGRN266, contiene un fragmento de PCR
EcoRI-FseI con el gen TK clonado en los sitios Eco
RI-FseI de pGRN263. pGRN263, que contiene
aproximadamente 2,5 kb de la secuencia del promotor de hTERT, es
similar a pGRN150, pero contiene un gen de neomicina como marcador
de selección. pGRN267 contiene un fragmento de PCR
EcoRI-FseI con el gen TK clonado en los sitios
EcoRI-FseI de pGRN264. pGRN264, que contiene
aproximadamente 210 pb de la secuencia del promotor de hTERT, es
similar a pGRN176, pero contiene un gen de neomicina como marcador
de selección. pGRN268 contiene un fragmento de PCR
EcoRI-XbaI con el gen de TK clonado en los sitios
EcoRI-XbaI (no metilados) de pGRN265. pGRN265, que
contiene aproximadamente 90 pb de la secuencia del promotor de
hTERT, es similar a pGRN175, pero contiene un gen de neomicina como
marcador de selección.
Estas construcciones de promotor de hTERT/TK,
pGRN266, pGRN267 y pGRN268 se reintrodujeron en células de mamífero
y se seleccionaron los clones estables TK/+ (y/o las poblaciones de
masa). El tratamiento con ganciclovir in vitro de las
células TK/+ tuvo como resultado una destrucción selectiva de todas
las líneas tumorales ensayadas, incluyendo 143B, 293, HT1080,
Bxpc-3, DAOY y NIH3T3. Significativamente, el
tratamiento con ganciclovir no tuvo ningún efecto sobre las células
BJ normales. Esto demuestra claramente la especificidad del tumor
de los tres fragmentos del promotor de hTERT usado en estos
experimentos.
La invención proporciona reactivos y métodos para
tratar enfermedades que implican la proliferación de células
indeseadas por medio de una terapia génica in vivo. Para
demostrar la eficacia de este aspecto de la invención, los
reactivos de la invención se usaron para tratar cáncer (de origen
humano) en un modelo animal aceptado en la técnica. Una célula
cancerosa humana, la línea de células de osteosarcoma 143B, que
normalmente expresa el gen de la telomerasa, se transfectó con un
plásmido que contenía el gen TK dirigido por el promotor de
hTERT.
Específicamente, se usaron secuencias de -36 a
-2482 cadena arriba del sitio de inicio de la traducción de la SEC
ID Nº: 1 para dirigir el gen TK. El plásmido también contenía el
gen de la neomicina fosfotransferasa. Después de la transfección de
las células con el plásmido, se seleccionaron clones resistentes a
G418 que expresaban TK. Se inyectaron doscientas mil de las células
143B parentales o que expresaban TK por vía subcutánea en el
flanco de ratones desnudos Balb/c (nu/nu) para establecer los
tumores. De 4 a 11 días después del implante de los tumores, a los
ratones se les inyectaron IP 75 mg/kg de ganciclovir (GCV) o
solución salina dos veces al día. El crecimiento de los tumores se
controló cada 3-4 días. Cuando el GCV se administró
a 4-11 días después de la implantación de los
tumores a estos animales portadores de tumores, se observó una
lisis de las células mediada por TK y un crecimiento del tumor
retrasado. Tal inhibición del crecimiento de las células tumorales
no se observa cuando se administra solución salina o si el tumor
143B parental (143BP) se trata con solución salina o GCV. Cuarenta
y cinco días después de la implantación del tumor, sólo los
animales a los que se les implantó el clon 143B TK+ y se trataron
con GCV mostraron una supervivencia del 100%. En los otros grupos,
todos excepto un animal murieron por una carga tumoral masiva.
Estos datos indican que el promotor de hTERT es
suficiente para dirigir la expresión del gen TK in vivo.
También demuestra que los reactivos y métodos de la invención
pueden usarse para promover la regresión de tumores in vivo
en sujetos (incluyendo seres humanos) portadores de tumores
pre-establecidos.
Como se ha descrito anteriormente, la invención
proporciona construcciones de virus oncolíticos "de replicación
condicional" en los que secuencias del promotor de hTERT de la
invención están unidas operativamente a genes codificados
viralmente esenciales. El uso de secuencias del promotor de hTERT de
la invención asegura que el virus sólo se expresará productivamente
en células con actividad telomerasa. De esta manera, pueden usarse
construcciones terapéuticamente para lisar sólo las células que
expresan telomerasa, tales como células inmortales o cancerosas. De
esta manera, la proliferación del virus y sus efectos citopáticos
se restringen a las células tumorales. A continuación se
proporcionan detalles de la construcción de un virus oncolítico de
replicación condicional dirigido por el promotor de hTERT
ilustrativo. En esta realización, el promotor de hTERT reemplaza al
promotor E1a normal para crear un virus que sólo se replicará en
células que expresan telomerasa.
Se construyó el plásmido
pBR/ITR/549-ClaI que contenía los nucleótidos
1-356 (ITR y señales de empaquetamiento de Ad2) y
549-920 (una porción de la secuencia codificante de
E1a) del adenovirus 2 (Ad2) unidos usando un polienlazador usando
procedimientos de biología molecular convencionales en el plásmido
bacteriano pBR322. En pBR/ITR/TB+phTERT176-E1A y
pBR/ITR/TB+phTERT316 -E1A, el promotor E1a normal
(357-548 de Ad2) se ha reemplazado por el promotor
de hTERT. A estos plásmidos se les añaden secuencias de Ad2 de
916-10680 para recrear los elementos de expresión
del extremo 5' del virus.
Estos plásmidos
(pBR/ITR/TB+phTERT176-10680 y
pBR/ITR/TB+phTERT316-10680) se introducen por
transfección en una línea de células humanas que expresan
telomerasa junto con un fragmento de ADN adenoviral que contiene
secuencias 10681-35937 de Ad2. Las placas
recombinantes se puntúan y se seleccionan de 7 a 21 días después de
la transducción. El Ad2 que contiene E1a y el promotor de hTERT se
propaga y se produce para uso empleando esquemas convencionales para
la amplificación y fabricación de Ad2 recombinante. (Graham y
Prevec, 1991, en Methods in Molecular Biology, Capítulo 11, Ed. E.
J. Murray, The Human Press Inc., Clifton, NJ.; Kanegae et
al., Jpn J Med Sci Biol. 1994, 47(3):
157-66). Como el gen E1a se dirige por el promotor
de hTERT, que normalmente no se expresa por la mayoría de las
células somáticas, el genoma de Ad2 recombinante sólo se replicará
y se empaquetará en partículas víricas en células que expresen
telomerasa.
La invención proporciona construcciones y ensayos
basados en promotores para identificar activadores y/o represores
de hTERT y de la actividad telomerasa de molécula pequeña. Para
este fin, se clonaron fragmentos del promotor de hTERT en plásmidos
que expresaban una forma secretada de la fosfatasa alcalina y un
marcador de selección. Las construcciones de SEAP (pGRN244,
pGRN245, pGRN246 y pGRN248) se re-introdujeron en
células humanas normales y en líneas de células inmortales. Después
de la selección de clones estables que tenían integradas las
construcciones de promotor de hTERT/SEAP, se usó
RT-PCR para determinar los niveles de ARNm de SEAP.
En células 293, los niveles de ARNm de SEAP se elevaron y fueron
comparables a los niveles de hTERT endógena, mientras que en
células BJ, los niveles de ARNm de SEAP fueron prácticamente
indetectables y correspondían estrechamente a los niveles de hTERT
endógena en estas células.
Estos resultados indican que pueden usarse
construcciones de promotor de hTERT/SEAP para modificar por
ingeniería genética células adecuadas para ensayos basados en
promotor y para seleccionar activadores y/o represores químicos y/o
biológicos de la telomerasa en células normales y tumorales. Se
re-introdujeron GRN244, pGRN245, pGRN246 y pGRN248
en células BJ y 293. En estas células se determinaron la actividad
SEAP y los niveles de ARNm como criterios para la elección de
clones. Se seleccionaron varias líneas 293 y BJ y se expandieron dos
clones BJ/pGRN245 para la selección de alto rendimiento. Estas
construcciones también se introdujeron en células IDH4, que son
fibroblastos de pulmón inmortales que expresan el antígeno T largo
de SV40 bajo el control del promotor de MMTV inducible por
dexametasona. Las células IDH4 son telomerasa positivas y
proliferan en presencia de dexametasona. Sin embargo, puede
inducirse un paso de estas células a una fase telomerasa negativa
senescente después de retirar la dexametasona. Tras la
re-adición de dexametasona, las células vuelven a un
fenotipo inmortal y re-activan la telomerasa.
pGRN244, pGRN245, pGRN246 y pGRN248 se
introdujeron en células IDH4 por transfección. Se demostró que la
actividad SEAP era paralela a la actividad telomerasa en diferentes
clones, mientras que no se observó ninguna fluctuación
significativa de la actividad SEAP con el plásmido de control. Estos
resultados indican que un fragmento de aproximadamente 2,5 kb de la
secuencia del promotor de hTERT (pGRN245) contiene suficientes
elementos de secuencia para soportar tanto la activación como la
represión en respuesta a estímulos que detienen la proliferación
y/o crecimiento que controlan la actividad telomerasa en células
IDH4. Se seleccionaron dos clones, ID245-1 e
ID245-16, cuyo perfil de SEAP correspondía
estrechamente a la actividad telomerasa durante el tratamiento con
fármaco, y se expandieron para la selección de alto rendimiento de
activadores de telomerasa de molécula pequeña.
La invención también proporciona construcciones y
ensayos basados en promotores para identificar moduladores
biológicos de hTERT y de la actividad telomerasa. Una construcción
ilustrativa de este aspecto de la invención es pGRN353 que contiene
un fragmento BglII-HindIII de pGRN297 con
aproximadamente 2,5 kb de secuencias del promotor de hTERT clonadas
en los sitios BglII-HindIII de
\beta-gal-Basic (ClonTech). Se
re-introduce pGRN353 o construcciones similares en
células BJ por co-transfección con un plásmido que
contiene un gen de higromicina como marcador de selección. Se
establecen líneas de células clonales y/o poblaciones de masas y se
usan para seleccionar bibliotecas de ADNc basadas en retrovirus
para genes o fragmentos de genes que pueden activar el promotor de
hTERT. También se re-introduce pGRN353 o
construcciones similares en células 143B y 293 para seleccionar
bibliotecas retrovirales e identificar secuencias que pueden
reprimir el promotor de hTERT.
Los vectores de
promotor-indicador (y otros) de la invención también
se usan para identificar elementos reguladores de la transcripción
de actuación trans. Como se ha indicado anteriormente, los
plásmidos en los que los genes indicadores están unidos
operativamente a secuencias de promotor de hTERT son extremadamente
útiles para la identificación de agentes moduladores de la
transcripción de actuación trans y para la selección de fármacos
moduladores del promotor de hTERT potenciales (incluyendo agentes
biológicos y moléculas pequeñas). Pueden usarse técnicas de
transfección tanto transitorias como estables. En una realización,
se obtienen transformantes estables de pGRN148 en células
telomerasa negativas y telomerasa positivas por cotransfección con
un marcador selectivo eucariota (tal como neo), de acuerdo con
Ausubel, supra.
Las líneas celulares resultantes se usan para
seleccionar supuestos agentes moduladores de la transcripción de
actuación trans de la telomerasa, por ejemplo, comparando la
expresión dirigida por el promotor de hTERT en presencia y ausencia
del compuesto de ensayo (el supuesto a gente modulador de la
transcripción de actuación trans). De forma similar, se usan otros
vectores de promotor-indicador (incluyendo las
construcciones descritas en este documento, así como variaciones de
las mismas) para identificar y aislar factores de actuación trans
que se unen a elementos reguladores de la transcripción de
actuación cis tales como Myc, Sp1, proteína de unión a la caja TATA,
AP-1, CREB, CAAT, factor de unión a CAAT y factores
que se unen a elementos de respuesta a hormonas (por ejemplo, GRE).
La identificación y aislamiento de tales secuencias reguladoras de
actuación trans proporciona métodos adicionales y reactivos para
modular transcripción y traducción de la telomerasa.
El uso de construcciones recombinantes que
comprenden secuencias del promotor de TERT de la invención ha
demostrado, por primera vez, que c-Myc actúa como
un potente activador de la actividad telomerasa por interacción
directa con secuencias reguladoras de actuación cis en el promotor
de TERT. Significativamente, los estudios de la invención también
demuestran que la activación de la transcripción del promotor de
hTERT por c-Myc puede anularse por deleción o
mutación de una sola secuencia reguladora de actuación cis, el
"sitio de unión a Myc/Max".
Para determinar si la inducción experimental de
c-Myc puede conducir a la activación de novo de la
telomerasa en células humanas primarias, se transdujeron cultivos
de IMR90 presenescentes modificados por ingeniería genética para
expresar el receptor ecotrópico de ratón (Serrano et al.,
(1997) Cell 88, 593-602) con el vector retroviral
pBABE o uno que codifica una proteína de fusión
c-Myc-receptor de estrógenos
(cMycER) inducible por hormonas (Eilers et al., 1989 Nature
340, 66-68; Littlewood (1995) Nuc. Acids. Res. 23,
1686-1690). Los cultivos de IMR90 no poseen
actividad telomerasa detectable ni expresión del gen TERT (Nakamura
et al., 1997; Meyerson et al., 1997).
Infección Retroviral. El receptor ecotrópico de
ratón se introdujo por transducción en fibroblastos IMR90 y todas
las transducciones posteriores con retrovirus ecotrópicos se
realizaron de acuerdo con Serrano et al., (1997). Se
recogieron los virus pBABE-MycER y los virus de
control con el vector pBABE a partir de 2 líneas celulares de
expresión estable.
Cultivo Celular: se cultivaron células IMR90 en
medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco/BRL)
suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 0,29 mg/ml de
L-glutamina, penicilina y estreptomicina al 0,03%, y
25 \mug/ml de sulfato de gentamicina. Para los estudios de
inducción de Myc en células IMR90, las células transducidas con
MycER se expusieron a 4-OHT 2 \muM durante 24, 48
y 72 horas. Para los estudios del promotor, se expusieron células
NIH 3T3 a 4-OHT 1 \muM durante 24 y 72 horas. En
todos los casos, los controles no inducidos se trataron con un
volumen equivalente de etanol, el disolvente para
4-OHT.
Ensayo de Telomerasa: La actividad telomerasa se
midió por un protocolo de amplificación repetido de telomerasa
modificado usando el kit de detección de telomerasa
TRAPeze^{TM}(Oncor, Gaithersburg, MD) (Kim et al.,
1994). Se obtuvo ADN genómico a partir de fibroblastos IMR90
transducidos con MycER o con el vector de control. Se realizaron
ensayos TRAP sobre los lisados equivalentes a 1000 células para
todas las muestras, sirviendo los lisados de células 293T como
control positivo para la actividad telomerasa. Igualmente se
amplificaron controles internos de PCR a partir de cada
experimento. La inactivación del lisado se realizó durante 5 minutos
a 85ºC antes del ensayo TRAP.
En el sistema MycER, el resto Myc existe en una
forma latente unida en un complejo con HSP-90, a
través de su fusión con ER (Eilers et al., 1989; Littlewood
et al., 1995). Tras el tratamiento con
4-hidroxi-tamoxifeno (4 -OHT), la
proteína MycER se libera de HSP-90, dando como
resultado un fenotipo con un exceso de expresión de Myc (Eilers
et al., 1989; Littlewood et al., 1995). Empleando
este sistema de cultivo celular, el tratamiento con 4- OHT de
cultivos IMR90 transducidos con MycER dio como resultado una
activación marcada y sostenida de telomerasa a un nivel igual o por
encima del detectado en lisados derivados de un número equivalente
de células tumorales 293T telomerasa positivas, como se evalúa por
el ensayo TRAP sensible. Por el contrario, los cultivos de IMR90
transducidos con pBABE tratados con 4-OHT o
transducidos con MycER y no tratados permanecieron negativos con
respecto a la telomerasa. El análisis de transferencia de Western
confirmó abundantes niveles de proteína MycER en los cultivos
transducidos con MycER en presencia o ausencia de
4-OHT.
Es importante indicar que no se ha descubierto
que la expresión forzada de oncogenes tales como
H-Ras y moduladores celulares de las rutas Rb y p53
(E7, ciclina D1, Mdm2, p53 dominante negativo) sea capaz de influir
sobre la actividad telomerasa en células IMR90 (Wang et al.,
1998).
Construcción del indicador de hTERT: Los
plásmidos pGRN150 (caja E delecionada), pGRN261 (indicador de hTERT
de 2,5 kpb) se han descrito anteriormente. Se cultivaron células
NIH 3T3 en medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)
(Gibco/BRL) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 0,29
mg/ml de L-glutamina, penicilina y estreptomicina al
0,03%, y 25 \mug/ml de sulfato de gentamicina. Las células NIH
3T3 se transfectaron usando el reactivo LipoFectamine (Life
Sciences) con 100 ng de un indicador de promotor, y 200 ng de
pCMX-\beta-Galactosidasa que
sirvió como control interno para la eficacia de transfección. Se
dejó que las células transfectadas se recuperaran durante 6 horas
en DMEM completo y después se trataron con 4-OHT 1
\muM o etanol durante 36 horas antes del análisis de la actividad
fosfatasa alcalina secretada usando el ensayo Great EscAPe^{TM}
(ClonTech). La actividad \beta-galactosidasa se
ensayó por incubación de extractos de células enteras con 400
\mug/ml de ONPG en tampón que contenía Na_{2}HPO_{4} 60 mM,
NaH_{2}PO_{4} 40 mM, KCl 10 mM y MgSO_{4} 1 mM, y las
eficacias de transfección relativas se determinaron leyendo la
absorbancia a 415 nm.
La expresión del hTERT endógeno después de la
exposición a 4-OHT (o disolvente solo) se midió a
diversos tiempos en presencia de ciclohexamida 1 \muM en
fibroblastos IMR90 transducidos con MycER. Se realizó una
transcripción inversa del ARN obtenido a partir de cada muestra
seguida de PCR y transferencia de Southern de los productos
amplificados como se ha descrito anteriormente. La
gliceraldehído-6-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) se amplificó a partir de los mismos
productos de transcripción inversa como un control
semi-cuantitativo interno y se visualizó por tinción
con bromuro de etidio. Se detectó un bajo nivel de expresión de
ARNm de hTERT en muestras no inducidas después de exposiciones muy
largas; sin embargo, el nivel de ARNm de hTERT no cambió a lo largo
del tiempo en muestras no inducidas.
La actividad del promotor de hTERT aumentó
dramáticamente por c-MycER en células NIH 3T3. La
capacidad de c-MycER de aumentar la actividad del
promotor de hTERT era dependiente de secuencias en el promotor de
hTERT que incluían un sitio de unión a Myc conservado
evolutivamente (caja E).
Para determinar si el aumento de la actividad
telomerasa inducido por la activación de c-MycER
era el resultado de una mayor transcripción del gen de hTERT,
examinamos inicialmente el efecto de la inducción por
4-OHT de la actividad
c-Myc-ER sobre secuencias del
promotor de hTERT colocadas cadena arriba del gen indicador de la
fosfatasa alcalina secretada. El promotor de hTERT contiene dos
supuestos sitios de unión a Myc colocados en -242 y -34 con
respecto al codón de iniciación ATG.
Se transfectaron células NIH 3T3 modificadas por
ingeniería genética para expresar c-MycER de forma
estable con construcciones que contenían un indicador de fosfatasa
alcalina secretada bajo el control de un fragmento de 2,5 kb del
promotor de hTERT, un fragmento de 2,5 kb del promotor de hTERT que
carecía de la caja E proximal, o una construcción de indicador sin
promotor. La actividad basal de promotor de hTERT de tipo silvestre
y la del promotor de hTERT que carecía de la caja E proximal fueron
equivalentes y aproximadamente 3 veces mayores que la actividad del
indicador sin promotor. La inducción de la actividad
c-MycER con 4-OHT 1 \muM aumentaba
la actividad del promotor de hTERT de 2,5 kb aproximadamente 10
veces. Por el contrario, la actividad del promotor que carecía de
la caja E proximal no se veía afectada significativamente por la
inducción de c-Myc-ER. De forma
similar, el indicador sin promotor no se vio afectado por la
inducción de c-Myc-ER. Claramente,
esto demuestra que la transcripción de una región codificante
heteróloga puede regularse por medio de la modulación de un
elemento regulador de la transcripción tal como
c-Myc dentro de la región promotora, que a su vez se
modula por un ligando para el receptor de estrógenos.
Para confirmar adicionalmente el papel de la caja
E proximal en la regulación del promotor de hTERT, ensayamos el
efecto de intercambiar la caja E de CACGTG a CACTCA. La mutación en
la caja E redujo la actividad del promotor debida a la estimulación
de 4-OHT al equivalente de la deleción de la caja E
y 10 veces por debajo del promotor de tipo silvestre. Esto demuestra
que c-Myc-R no es capaz de activar
significativamente un promotor de hTERT con una caja E atenuada en
la posición -34 y que la caja E en la posición -242 no puede mediar
significativamente la activación de c-Myc. Estos
resultados sugieren que la capacidad de c-Myc de
estimular el promotor de hTERT está mediada por la caja E en
posición -34.
Para confirmar la capacidad de
c-Myc de estimular la transcripción del gen hTERT
directamente, ensayamos la expresión del gen hTERT en cultivos
transducidos con MycER de células IMR90 0, 1, 3 y 9 horas después de
la adición de 4-OHT. Los cultivos se trataron con
ciclohexamida durante 30 minutos antes de la adición de
4-OHT para prevenir la síntesis de proteínas de
novo. La expresión de hTERT fue indetectable en el punto de tiempo
de 0 horas para los cultivos transducidos con Myc. El
pretratamiento de estas células con ciclohexamida sola no tuvo
ningún efecto sobre la expresión del ARNm de hTERT. La inducción de
la actividad de c-Myc-ER por
tratamiento con 4-OHT 2 M en presencia de 1
ciclohexamida condujo un aumento rápido en la expresión del
mensajero de hTERT.
La expresión de hTERT se detectó una hora después
de la inducción y aumentó de 3 a 9 horas después de la inducción.
Por el contrario, en las células tratadas con disolvente solo no se
indujo la expresión de hTERT. Además, el nivel de expresión de
GAPDH fue similar en todos los puntos de tiempo en las células
tratadas con 4-OHT o disolvente solo. Estas
observaciones sugieren firmemente que Myc actúa directamente sobre
el promotor de hTERT para aumentar la transcripción del gen
hTERT.
Para explorar adicionalmente las implicaciones
funcionales de la inducción por Myc de la actividad telomerasa en
células primarias, examinamos si TERT podría substituir a
c-Myc como agente de inmortalización en el ensayo de
cooperación de fibroblastos embrionarios de rata (REF). En este
ensayo, la cotransfección de Myc y RAS activado
(H-RASG12V) produce la transformación maligna de
REF de pocos pasos. Esta actividad cooperativa puede cuantificarse
controlando el número de focos transformados que aparecen en la
monocapa de 7 a 10 días después de la transfección. En dos
experimentos separados, se introdujeron diversas combinaciones de
las construcciones de expresión que codificaban
c-Myc, H-RASG12V, TERT o vector de
control en REF de pocos pasos. Se observó una actividad cooperativa
fuerte en las cotransfecciones de RAS y Myc como se muestra por un
promedio de 34 focos por placa de 10 cm; mientras que RAS solo
generó entre 0 y 3 focos por placa; lo cual es coherente con los
hallazgos previos de que se requieren un agente de inmortalización
y RAS activado para una transformación eficaz de células primarias
de roedor (Land et al., 1983). Por el contrario, la
cotransfección de TERT y ratas no generó números de focos
transformados por encima de los evaluados para los controles de RAS
solo. Estos resultados indican que la expresión de hTERT es
insuficiente para responder de la función de inmortalización de Myc
en un ensayo de cooperación de fibroblastos embrionarios de rata
(REF).
El efecto de
c-Myc-ER sobre la actividad del
promotor de hTERT en células NIH3T3 se determinó por medio de la
detección de la actividad fosfatasa alcalina secretada. Las células
se trataron con 4-OHT durante 36 horas. Las células
no inducidas se trataron con disolvente solo durante 36 horas. La
actividad fosfatasa alcalina secretada detectada se corrigió con
respecto a la eficacia de transfección en cada caso usando
\beta-galactosidasa.
El siguiente ejemplo detalla la clonación del
promotor de mTERT de ratón.
Construcción de mTERT: se usó una sonda de
hibridación (nucleótidos 1586-1970) del ADNc de
mTERT
(pGRN188) para identificar un fago recombinante (mTERT1) a partir de una biblioteca de fagos genómicos de ratón 129SV (Stratagene). Un fragmento HindIII de 8 kb de mTERT1 que hibridaba con la sonda 1586-1970 se subclonó en pBluescript^{TM} I KS + (Stratagene) para generar el clon B2.18. Se secuenciaron las regiones que incluían el iniciador y el promotor.
(pGRN188) para identificar un fago recombinante (mTERT1) a partir de una biblioteca de fagos genómicos de ratón 129SV (Stratagene). Un fragmento HindIII de 8 kb de mTERT1 que hibridaba con la sonda 1586-1970 se subclonó en pBluescript^{TM} I KS + (Stratagene) para generar el clon B2.18. Se secuenciaron las regiones que incluían el iniciador y el promotor.
La secuencia cadena arriba de mTERT se indica en
la SEC ID Nº: 2. La secuencia puede obtenerse en el GenBank con el
acceso B2.18 AF121949.
La figura 3 muestra la alineación de porciones
homólogas de las secuencias del promotor humano y de ratón. Las
secuencias se alinearon usando el programa GAP del paquete GCG de
Wisconsin, usando un valor de 48 para la creación de huecos y un
valor de 3 para la extensión de huecos. Usando una pequeña porción
de la región codificante (\sim 450 bases) se descubrió que
mejoraba la lineación inicial.
Para determinar si la capacidad de
c-Myc de aumentar la actividad telomerasa estaba
mediada por un aumento de la transcripción del gen hTERT,
comparamos las secuencias de los promotores de TERT humano y de
ratón. La alineación de las primeras 300 bases de los promotores de
humano y de ratón indica varias regiones conservadas. En
particular, el sitio de unión a Myc/Max (caja E) localizado en -34
del promotor humano y en -32 del promotor de ratón, está muy
conservado. Se identificó una segunda caja E en la posición -242 del
promotor humano; sin embargo, este sitio no estaba conservado en el
promotor de ratón. Estas observaciones suscitaron la posibilidad
de que el sitio de unión a Myc conservado en particular pudiera
jugar un papel en la regulación de la expresión de hTERT por
c-Myc.
c-Myc.
Basándose en los principios ilustrados en el
ejemplo 4, se realizó el siguiente experimento como modelo para un
virus oncolítico basado en el adenovirus de tipo Ad2. Se realizó
una construcción en la que el gen de replicación de adenovirus E1a
se colocó bajo el control del promotor de hTERT, que activaría la
construcción en células cancerosas que expresaban telomerasa. Como
control positivo, se realizó una construcción similar en la que E1a
se puso bajo el control de promotor de CMV, que activaría la
transcripción en cualquier célula.
Se obtuvieron los siguientes reactivos. pBR322,
enzimas de restricción: NEB, Bervely, MA. Adenovirus tipo 2 (Ad2),
reactivos de cultivo de tejidos: Gibco/BRL, Grand Island, NY.
Sistemas de transfección de mamífero Profection: Promega, Madison,
WI. Líneas celulares tumorales y normales. ATCC, Manassas, VA,
excepto la línea BJ, que se obtuvo en J. Smith, U. of Texas
Southwestern Medical Center.
En resumen, se construyó un plásmido basado en
pBR322 que contiene el genoma del adenovirus de tipo 2 con
deleciones de los nucleótidos 356-548 (región de
promotor de E1a) y los nucleótidos 27971-30937 (E3).
Se insertó una región de clonación múltiple en el punto de
deleción del promotor de E1a y posteriormente se clonó el promotor
de hTERT (nucleótidos -239 a -36) o el promotor de CMV (del
nucleótido -524 al -9). La numeración de la secuencia de CMV está
de acuerdo con Akrigg et al., Virus Res 2:107, 1985. La
numeración de la secuencia de Ad2 está de acuerdo con "DNA Tumor
Viruses: Molecular Biology of Tumor Viruses", J. Tooze ed., Cold
Spring Harbor Laboratory,
NY.
NY.
Estos ADN plasmídicos se digirieron con SnaBI
para liberar ITR, y después se extrajeron con
fenol-cloroformo, se precipitaron y se utilizaron
para transfectar células 293A para la propagación del virus. Se
realizaron varias vueltas de purificaciones en placa usando células
A549, y se expandió un aislado final en estas mismas células. Los
virus se titularon por ensayos en placas en células 293A y se
ensayaron con respecto a la presencia de secuencias Ad 5' WT por
PCR. El ADN se aisló a partir de los virus por extracción HIRT.
La construcción del promotor de hTERT se denominó
AdphTERT-E1dlE3. La construcción del
promotor de CMV se denominó AdCMV-E1dlE3.
La figura 4 muestra el efecto de estos virus
sobre líneas de células normales y cancerosas. Cada línea celular
se cultivo a 5 x 10 en formato de 48 pocillos y se infectó a una
MOI=20, \sim 24 horas después del cultivo. Las células después se
cultivaron durante un período de 17-48 días y se
alimentaron cada cuatro días. Las fotografías mostradas en la
figura se tomaron siete días después de la infección. La fila
superior muestra los resultados de las células que no se infectaron
viralmente (control negativo). La fila central muestra los
resultados de las células infectadas con adenovirus oncolítico, en
el que el gen de replicación E1a está unido operativamente al
promotor de hTERT. La fila inferior muestra los resultados de las
células infectadas con adenovirus en los que E1a está unido
operativamente al promotor de CMV (control positivo). Los
resultados se resumen en la tabla 2:
Todas las líneas celulares ensayadas se lisaron
eficazmente por AdCMV-E1dlE3 el día 17 después de
la infección. Todas las líneas tumorales se lisaron por
AdphTERT-E1dlE3 en un marco de tiempo similar, pero
ligeramente retrasado, mientras que las líneas normales no
mostraron ningún signo de efecto citopático permanecieron sanas
hasta las 6 semanas después de la infección.
En un experimento paralelo, cada línea celular se
infecto con un adenovirus que contenía el gen que codificaba la
proteína fluorescente verde como marcador visual (MOI = 100) para
determinar la eficacia de transducción relativa de estas células
por vectores de adenovirus. Las líneas celulares presentaron un
amplio intervalo de eficacia de transducción (\sim
1-2% hasta el 100%). Incluso las células que se
transducen de forma deficiente pueden erradicarse eficazmente con
el adenovirus controlado por hTERT.
Conjuntamente, los resultados confirman que un
virus oncolítico puede construirse poniendo un elemento genético
esencial para la replicación del virus bajo el control de un
promotor de hTERT. Se producen replicación y lisis en células
cancerosas, pero no en las células no malignas diferenciadas.
La figura 5 es un mapa del adenovirus oncológico
usado en el experimento de infección mostrado en la figura 4.
Comprende la repetición terminal invertida (ITR) del adenovirus
(Ad2); seguido del promotor de longitud media de hTERT (phTERT176)
unido operativamente a la región E1a de adenovirus; seguido del
resto del adenovirus en el que se ha delecionado la región E3
(\DeltaE3). Debajo se muestran algunas construcciones
modificadas. La construcción central comprende una secuencia
adicional entre el promotor de hTERT y la región E1a. La secuencia
HI es un intrón artificial obtenido por ingeniería genética a partir
de un adenovirus y secuencias donadoras y aceptoras de ayuste de
intrones de inmunoglobulina. Se cree que la colocación de un intrón
en el gen de replicación de adenovirus con el promotor de hTERT
promoverá el procesamiento y el transporte del ARN heteronuclear,
facilitando de esta manera la formación de partículas virales
replicadas. La tercera construcción de adenovirus es similar, con
la excepción de que la región E1a usada es mayor en el extremo 5'
por 51 nucleótidos. Se cree que esto puede promover también una
replicación condicional más eficaz del virus oncolítico.
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términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture
Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Virginia
20110-2209 Estados Unidos, el 14 de agosto de 1997,
con el número de acceso 98505.
SEC ID Nº: 1 (secuencia del gen hTERT, Acceso del
GenBank AF121948)
SEC ID Nº: 2 (secuencia de mTERT, Acceso del
GenBank AF121949)
Claims (20)
1. Un virus oncolítico que tiene un genoma en el
que un promotor de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) está
unido operativamente a un elemento genético esencial para la
replicación o montaje del virus, donde el promotor promueve la
transcripción del elemento genético en células que expresan la
telomerasa transcriptasa inversa (TERT), con lo que promueve la
replicación del virus, y donde la replicación del virus en una
célula conduce la lisis de la célula.
2. El virus oncolítico de la reivindicación 1,
que es un adenovirus de replicación condicional.
3. El virus oncolítico de la reivindicación 1,
que es un herpesvirus de replicación condicional.
4. Un polinucleótido para el montaje del virus
oncolítico de la reivindicación 1, en el que un promotor de la
telomerasa transcriptasa inversa (TERT) está unido operativamente a
un elemento genético esencial para la replicación o montaje de un
virus.
5. El virus oncolítico o polinucleótido de
cualquier reivindicación anterior, donde el elemento genético
esencial para la replicación o montaje de un virus es un gen E4,
E1a, E1b o E2 de adenovirus o un gen ICP6 o ICP4 del virus del
herpes simple.
6. El adenovirus oncolítico de la reivindicación
2, donde el elemento genético esencial para la replicación o
montaje es una región E1a de adenovirus.
7. El virus oncolítico o polinucleótido de
cualquier reivindicación anterior, donde el polinucleótido promotor
es un promotor para la telomerasa transcriptasa inversa humana
(hTERT).
8. El virus oncolítico o polinucleótido de
cualquier reivindicación anterior, donde la secuencia de
nucleótidos del promotor está contenida en el fago
\lambdaG\varphi5.
9. El virus oncolítico o polinucleótido de
cualquier reivindicación anterior, donde el promotor tiene una o
más de las siguientes características:
- a)
- comprende una secuencia de al menos aproximadamente 100 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 1;
- b)
- comprende una secuencia de al menos aproximadamente 500 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 1;
- c)
- comprende una secuencia de al menos aproximadamente 100 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 2;
- d)
- comprende una secuencia de al menos aproximadamente 500 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 2; o
- e)
- hibrida con un polinucleótido complementario a una secuencia que tiene las características a), b), c) o d) en condiciones rigurosas, y tiene la características de promover preferentemente la transcripción en células que expresan TERT.
10. El virus oncolítico o polinucleótido de
cualquier reivindicación anterior, donde el polinucleótido promotor
tiene una o más de las siguientes características:
a) comprende la secuencia desde la posición -117
a la posición -36 con respecto al sitio de inicio de la traducción
(posición 13545) de la SEC ID Nº: 1;
b) comprende la secuencia desde la posición -239
a la posición -36 con respecto al sitio de inicio de la traducción
(posición 13545) de la SEC ID Nº: 1;
c) comprende la secuencia desde la posición -117
a la posición +1 con respecto al sitio de inicio de la traducción
(posición 13545) de la SEC ID Nº: 1;
d) comprende la secuencia desde la posición -239
a la posición +1 con respecto al sitio de inicio de la traducción
(posición 13545) de la SEC ID Nº: 1;
e) consta de no más de 82 nucleótidos
consecutivos; o
f) hibrida con un polinucleótido complementario a
una secuencia que tiene las características a), b), c) o d) en
condiciones rigurosas, y tiene la característica de promover
preferentemente la transcripción en células que expresan TERT.
11. El virus oncolítico o polinucleótido de
cualquier reivindicación anterior, que comprende además una región
codificante cuya expresión es tóxica para la célula o que hace que
la célula sea más susceptible a los efectos tóxicos de un
fármaco.
12. El virus oncolítico o polinucleótido de la
reivindicación anterior, donde la región codificante codifica
timidina quinasa y el fármaco es ganciclovir.
13. Un método para seleccionar un virus que tiene
las características de un virus oncolítico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que
comprende proporcionar un virus oncolítico en el que dicho promotor
de TERT está unido operativamente a un elemento genético requerido
para la replicación o montaje del virus, usar el virus para
infectar una célula que expresa TERT y una célula que no expresa
TERT, y seleccionar el virus si destruye la célula que expresa
TERT.
14. Un método para producir un virus oncolítico
de acuerdo con las reivindicaciones 1-12, que
comprende unir operativamente dicha secuencia del promotor de TERT
a dicho elemento genético para formar un gen unido; introducir el
gen unido por transfección en una célula que expresa telomerasa; y
después propagar el virus obtenido a partir de la célula.
15. Un método in vitro para destruir una
célula que expresa la telomerasa transcriptasa inversa, que
comprende poner en contacto la célula in vitro con el virus
oncolítico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-12.
16. El método de la reivindicación 15, donde la
célula es una célula cancerosa.
17. El método de la reivindicación 16, donde el
cáncer se selecciona entre el grupo compuesto por cáncer de pulmón,
cáncer pancreático, meduloblastoma, carcinoma cervical y
fibrosarcoma.
18. Un medicamento que comprende el virus
oncolítico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-12 para uso en medicina.
19. Uso del virus oncolítico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en la
preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19,
donde el cáncer se selecciona entre el grupo compuesto por cáncer
de pulmón, cáncer pancreático, meduloblastoma, carcinoma cervical y
fibrosarcoma.
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