ES2220448T3 - Secuencias reguladoras de la transcripcion de la telomerasa transcriptasa inversa. - Google Patents

Secuencias reguladoras de la transcripcion de la telomerasa transcriptasa inversa.

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ES2220448T3 ES00917613T ES00917613T ES2220448T3 ES 2220448 T3 ES2220448 T3 ES 2220448T3 ES 00917613 T ES00917613 T ES 00917613T ES 00917613 T ES00917613 T ES 00917613T ES 2220448 T3 ES2220448 T3 ES 2220448T3
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Abstract

Un virus oncolítico que tiene un genoma en el que un promotor de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) está unido operativamente a un elemento genético esencial para la replicación o montaje del virus, donde el promotor promueve la transcripción del elemento genético en células que expresan la telomerasa transcriptasa inversa (TERT), con lo que promueve la replicación del virus, y donde la replicación del virus en una célula conduce la lisis de la célula.

Description

Secuencias reguladoras de la transcripción de la telomerasa transcriptasa inversa.
Reivindicación de prioridad
Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente de Estados Unidos 09/244.438.
Campo de la invención
La invención se refiere, en general, a los campos de los elementos reguladores genéticos que controlan la transcripción de proteínas en células eucariotas, y de las construcciones virales recombinantes útiles para el tratamiento de enfermedades, incluyendo el cáncer. Más específicamente, la invención describe promotores basados en elementos reguladores para la telomerasa transcriptasa inversa, secuencias de control de la transcripción y el uso de estas características en el diseño de virus oncolíticos.
Antecedentes de la invención
Desde hace mucho tiempo se ha reconocido que la replicación completa de los extremos de los cromosomas eucarióticos requiere componentes celulares especializados (Watson (1972) Nature New Biol. 239:197; Olovnikov (1973) J. Theor. Biol. 41:181). La replicación de una cadena de ADN lineal por ADN polimerasas convencionales requiere un cebador de ARN, y puede avanzar sólo en la dirección 5' a 3'. Cuando se retira el cebador de ARN unido a los extremos 5' de las cadenas de ADN cromosómicas eucarióticas, se introduce un hueco, lo cual conduce a un acortamiento progresivo de las cadenas hijas con cada vuelta de replicación. Se cree que este acortamiento de los telómeros, las estructuras de proteína-ADN localizadas físicamente en los extremos de los cromosomas, explica el fenómeno de senescencia celular o envejecimiento de las células somáticas humanas normales in vitro e in vivo (Goldstein (1990) Science 249:1129; Martin (1979) Lab. Invest. 23.86; Goldstein (1969). Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 64:155; Schneider (1976) Proc Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 73:3584; Harley (1990), Nature 345:458-460; Hastie (1990) Nature 346: 866-868: Counter (1992) EMBO J. 11:1921-1929; Bodnar (1998) Science 279:349-52).
De esta manera, la longitud e integridad de los telómeros está relacionada con la entrada de una célula en un estado senescente. Además, la capacidad de una célula de mantener (o aumentar) la longitud de los telómeros puede permitir que una célula escape a la senescencia.
El mantenimiento de los telómeros es una función de una ADN polimerasa específica conocida como telomerasa transcriptasa inversa (TERT). La telomerasa es una ribonucleoproteína (RNP) que usa una porción de su resto de ARN como plantilla para la síntesis repetida del ADN de los telómeros (Morin (1997) Eur. J. Cancer 33:750). Consistente con la relación de los telómeros y la TERT con la capacidad proliferativa de una célula, puede detectarse actividad telomerasa en tipos celulares muy replicativos tales como células madre. También es activa en una serie extraordinariamente diversa de tejidos tumorales, pero no es activa en cultivos de células somáticas normales o en tejidos normales adyacentes a un tumor (Patentes de Estados Unidos Nº 5.629.154; 5.489.508; 5.648.215 y 5.639.613; Morin (1989) Cell 59:521; Shay (1997) Eur. J. Cancer 33:787; Kim (1994) Science 266:2011). Además, se ha informado sobre una correlación entre el nivel de actividad telomerasa en un tumor y las consecuencias clínicas probables del paciente (Patente de Estados Unidos Nº 5.639.613; Langford (1997) Hum. Pathol. 28:416).
También se ha detectado actividad telomerasa en células germinales humanas, células madre o progenitoras en proliferación, y linfocitos activados. En las células madre o progenitoras somáticas y en los linfocitos activados, la actividad telomerasa típicamente es muy baja o sólo se expresa transitoriamente (Chiu (1996) Stem Cells 14:239; Bodnar (1996) Exp. Cell Tes. 228:58; Taylor (1996) J. Invest. Dermatol. 106:759).
Las Patentes del Reino Unido GB 2317891 B y GB 2321642 B, y la Publicación de Patente Internacional WO 98/14593 (Geron Corporation) describen la secuencia génica de la subunidad catalítica de la telomerasa humana (hTERT). Takakura et al. (Cancer Res. 59:551, 1999) informan sobre la clonación del promotor del gen hTERT y la identificación de secuencias promotoras de núcleo proximales esenciales para la activación de la transcripción en células inmortalizadas y cancerosas. La publicación de Patente Internacional WO 99/33998 (Bayer AG), presentada después de la fecha de prioridad de esta solicitud, informa sobre secuencias de ADN reguladoras del gen de la subunidad catalítica de la telomerasa humana, y su uso para realizar diagnósticos y para terapia. Cong et al. (Hu Molec. Genetics 8.137, 1999) también presentaron, después de la fecha de prioridad de esta solicitud, un informe sobre la organización del gen hTERT y la caracterización del promotor. La Patente de Estados Unidos 5.728.379 (Georgetown University) informa sobre la replicación específica de tumor o de célula del virus del herpes simple.
El resumen anterior pretende introducir el campo de la presente invención al lector. Las referencias citadas en esta solicitud no deben considerarse técnica anterior admitida.
Sumario de la invención
Esta descripción explica que la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) es una diana ideal para tratar enfermedades humanas relacionadas con la proliferación celular y la senescencia, tales como el cáncer. Los elementos de control de la transcripción de actuación cis de esta invención permiten la identificación de factores de control de la transcripción de actuación trans. El descubrimiento y caracterización de un promotor específico para células que expresan TERT ha proporcionado una oportunidad para desarrollar nuevas terapias para enfermedades importantes.
Una realización de la invención es un virus oncolítico que tiene un genoma en el que un promotor de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) está unido operativamente a un elemento genético esencial para la replicación o montaje del virus. El promotor dirige la transcripción del elemento genético en células que expresan la telomerasa transcriptasa inversa (TERT), originando de esta manera la replicación del virus. La replicación del virus en una célula a su vez conduce a la lisis de la célula.
Otra realización es un componente polinucleotídico adecuado para el montaje de un virus oncolítico de esta invención, en el que un promotor para TERT está unido operativamente a un elemento genético esencial para la replicación o montaje de un virus.
Los ejemplos de virus competentes en cuanto a la replicación de esta invención incluyen adenovirus y herpesvirus condicionales con respecto a la replicación. Son ejemplos de elementos genéticos asociados al promotor los genes de adenovirus E4, E1a, E1b o E2 y los genes del virus del herpes simple ICP6 o ICP4.Ciertas secuencias promotoras de TERT ilustrativas están contenidas en el fago \lambdaG\varphi5, depositado en la ATCC con el Nº de Acceso 98505. La secuencia puede contener aproximadamente 100 ó 500 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 1 ó 2, o una secuencia que hibrida con el complemento de la misma y que tiene la característica de promover preferentemente la transcripción en células que expresan TERT. Más adelante, en la descripción se describen porciones ilustrativas de la secuencia del gen TERT. Opcionalmente, el virus oncolítico también puede contener una región codificante cuya expresión sea tóxica para la célula, o que hace que la célula sea más susceptible a los efectos tóxicos de un fármaco, por ejemplo, el gen puede codificar timidina quinasa, haciendo que la célula sea susceptible al fármaco ganciclovir.
Otra realización es un método para seleccionar un virus que tiene características de un virus oncolítico de la invención. Se proporciona una construcción de virus en la que un promotor de TERT está unido operativamente a un elemento genético requerido para la replicación o montaje del virus, que se usa para infectar una célula que expresa TERT y una célula que no expresa TERT. Después se selecciona un virus si destruye preferentemente la célula que expresa TERT. Otra realización es un método para producir un virus oncolítico de la invención, que comprende unir operativamente una secuencia promotora de TERT a un elemento genético para formar un gen unido; introducir el gen unido por transfección en una célula que expresa telomerasa; y después propagar el virus obtenido a partir de la célula.
Otra realización de la invención es un método para destruir una célula que expresa la telomerasa transcriptasa inversa, que comprende poner en contacto la célula con el virus oncolítico de la invención. La célula puede ser una célula cancerosa. Otra realización es un medicamento que comprende el virus oncolítico de la invención para uso en medicina, o para el tratamiento de un cáncer. Las malignidades ilustrativas incluyen cáncer de pulmón, cáncer pancreático, meduloblastoma, carcinoma cervical y fibrosarcoma.
Por medio de la siguiente descripción se percibirá una comprensión adicional de la naturaleza y de las ventajas de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un mapa de restricción del clon \lambdaG\varphi5 del fago lambda, usado para obtener la secuencia situada aproximadamente 15 kbases cadena arriba del sitio de inicio de la traducción. Esta región incluye el promotor de hTERT.
La figura 2 es un mapa que muestra las características de un promotor de hTERT-plásmido indicador. Los plásmidos indicadores se han usado para demostrar que el promotor promueve específicamente la transcripción en células que expresan TERT, incluyendo células cancerosas.
La figura 3 es una alineación de secuencias, que compara regiones del promotor de hTERT (SED IC Nº: 1) con la de mTERT (SEC ID Nº: 2). Se usaron regiones de homología para identificar elementos reguladores. La figura 3(A) muestra la posición de motivos reguladores de la transcripción de actuación cis conservados, incluyendo la caja E (el sitio de unión a Myc/Max, indicado por un sombreado) y los sitios SP1 (subrayados). El panel inferior ilustra las secuencias proximales de las construcciones indicadoras hTERT de 2,5 kb y caja E, incluyendo la región delecionada en la construcción indicadora de caja E, como se describe en el ejemplo 8. La figura 3(B) muestra la identificación de otros elementos reguladores. La numeración mostrada se calcula a partir del sitio de inicio de la traducción.
La figura 4 es un fotograbado a media tinta de líneas celulares fotografiadas siete días después de la infección con un virus oncolítico. Fila superior: células no infectadas (control negativo). Fila central: células infectadas con adenovirus oncolítico en el que el gen de replicación E1a está nido operativamente al promotor de hTERT. Fila inferior: células infectadas con adenovirus en el que E1a está unido operativamente al promotor de CMV (control positivo).
Las células ensayadas fueron las siguientes: figura 4(A): BJ (fibroblastos de prepucio); IMR-90 (fibroblastos de pulmón); WI-38 (fibroblastos de pulmón); células de origen no maligno. Figura 4(B): A549 (carcinoma de pulmón) AsPC-1 y BxPC-3 (adenocarcinoma, páncreas). Figura 4(C): DAOY (meduloblastoma); HeLa (carcinoma cervical); HT1080 (fibrosarcoma). Los resultados demuestran que el virus oncolítico regulado por hTERT lisa específicamente las células cancerosas, con preferencia a las líneas celulares que no expresan la telomerasa transcriptasa inversa a un nivel substancial. Esto contrasta con el virus oncolítico regulado por un promotor constitutivo tal como el promotor de CMV, que lisa las células de forma no específica.
La figura 5 es una serie de mapas que muestran la construcción de adenovirus oncolíticos, que se han hecho condicionalmente replicativos poniendo la replicación de E1a bajo el control de un promotor de hTERT. La primera construcción comprende la repetición terminal invertida (ITR) del adenovirus (Ad2); seguido de promotor de longitud media de hTERT (pGRN176) unido operativamente a la región E1a de adenovirus; seguido del resto del adenovirus en el que se ha delecionado la región E3 (\Delta3). Esta construcción se usó en los experimentos de infección de virus mostrados en la figura 4. La segunda construcción de adenovirus condicionalmente replicativa mostrada en la figura comprende una secuencia adicional entre el promotor de hTERT y la región E1a. La secuencia HI es un intrón artificial obtenido por ingeniería genética a partir de secuencias de ayuste de intrones de adenovirus e inmunoglobulina. La tercera construcción de adenovirus es similar, con la excepción de que la región E1a usada es mayor en el extremo 5' en 51 nucleótidos.
Descripción detallada
La invención proporciona nuevos polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de control de la transcripción de actuación cis de los genes de la telomerasa transcriptasa inversa. Los polinucleótidos de la invención incluyen los basados o derivados de secuencias genómicas de regiones no transcritas, transcritas y de intrones de genes TERT, incluyendo el homólogo humano y de ratón. Las secuencias de control de la transcripción de TERT de actuación cis incluyen las que regulan y modulan la temporización y las velocidades de transcripción del gen TERT. Las secuencias promotoras de TERT de la invención incluyen elementos de actuación cis tales como promotores, potenciadores, represores y secuencias polinucleotídicas que pueden unirse a factores que influyen sobre la transcripción.
Aislamiento y caracterización de secuencias promotoras de TERT humana
Como se ha descrito en el ejemplo 1, el promotor de hTERT (SEC ID Nº: 1) se obtuvo secuenciando un inserto de un fago lambda aislado a partir de un biblioteca genómica humana. Este clon lambda se denomina \lambdaG\varphi5 y se ha depositado en la ATCC con el número de acceso 98505. Lambda G\theta5 contiene un inserto de 15,3 kilopares de bases (kpb) que incluye aproximadamente 13.500 bases cadena arriba de la secuencia codificante de hTERT. Estas secuencias promotoras de hTERT se subclonaron adicionalmente en plásmidos. Un fragmento Not1 (SEC ID Nº: 1) de \lambdaG\varphi5 que contenía las secuencias promotoras de hTERT se subclonó en orientaciones opuestas en el sitio Not1 de plásmidos derivados de pUC (denominados pGRN142 y pGRN143, respectivamente, y se secuenció pGRN142.
En la SEC ID Nº: 1, el inserto genómico de hTERT empieza en el resto 44 y termina en el resto 15375. El inicio del ADNc a partir del cual se obtuvo empieza en el resto 13490. El codón de inicio de la traducción ATG de hTERT empieza en el resto 13545. Las secuencias promotoras de hTERT no transcritas están cadena abajo del resto 44 y cadena arriba de la región codificante, y también pueden residir en el primer intrón. En células inmortales, un gen indicador dirigido por una secuencia cadena arriba de la secuencia codificante de TERT dirigió la expresión tan eficazmente como el control positivo (que contenía un promotor temprano y potenciador de SV40). Ciertas secuencias promotoras de TERT de la invención también incluyen secuencias de intrones.
Identificación de secuencias reguladoras de la transcripción de actuación cis en el promotor de TERT humana y de ratón
Para identificar secuencias reguladoras de la transcripción de actuación cis en secuencias de TERT humana y de TERT de ratón en posición 5' con respecto a su secuencia codificante de TERT respectiva, las secuencias promotoras de humano y de ratón se analizaron para comprobar su identidad de secuencia. La alineación de las primeras 300 bases cadena arriba de las secuencias codificantes de humano y de ratón indicaron varias regiones conservadas, y se identificaron supuestas secuencias reguladoras de la transcripción de actuación cis (figura 3(A)).
En particular, hay motivos muy conservados localizados en los restos -34 a -29 cadena arriba del sitio de inicio de la traducción de TERT humana (ATG, A en 13545 de la SEC ID Nº: 1) y en los restos -32 a -27 cadena arriba del sitio de inicio de la traducción de TERT de ratón (ATG). Corresponden a un motivo de actuación cis que se sabe que interacciona con c-Myc, la denominada "caja E" o "sitio de unión a Myc/Max". Específicamente, están muy conservados con respecto a los nucleótidos de núcleo que constituyen la caja E, los nucleótidos que flanquean la caja E y la posición de la caja E con respecto al sitio de inicio de la traducción. Se identificó una segunda caja E en los restos -242 a -237 cadena arriba del sitio de inicio de la traducción de TERT humana. Esta segunda caja E no se había conservado en el promotor de ratón. Estas observaciones confirman el hallazgo de que el sitio de unión a Myc conservado, por interacción con c-Myc como factor regulador de la transcripción de actuación trans, participa de forma importante en la regulación del promotor de TERT y en la expresión de la telomerasa.
La alineación de secuencias identificó elementos reguladores de la transcripción de actuación cis conservados adicionales en el promotor del gen TERT. Por ejemplo, se identificaron dos sitios de unión SP1 localizados en el resto -168 a -159 y en el resto -133 a -121 con respecto al sitio de inicio de la traducción de TERT, que están muy conservados entre los promotores de TERT de humano y de ratón. También se encontraron dentro de esta región tanto del promotor humano como del promotor de ratón sitios de unión (secuencias de actuación cis) para varios factores de la transcripción distintos, incluyendo el producto génico de la región determinante del sexo Y (SRY), factores nucleares hepáticos 3-\beta y 5, TFIID-MBP, E2F y c-Myb.
Otro análisis adicional de las secuencias promotoras de TERT humana y de ratón indicaron otras regiones de conservación de la secuencia. En particular, se encontró una región con un alto grado de identidad de secuencia entre el promotor humano y de ratón entre el resto -1106 y el resto -1602 cadena arriba del sitio de inicio de la traducción de TERT humana y entre el resto -916 y el resto -1340 cadena arriba del sitio de inicio de la traducción de TERT de ratón (figura 3(B)). De esta manera, la invención proporciona secuencias de actuación cis específicas para la modulación de la transcripción de TERT. En una realización preferida, los métodos de la invención usan estos motivos reguladores de la transcripción específicos de TERT humana y de ratón para identificar y aislar factores reguladores de la transcripción de actuación trans específicos de TERT y otros factores reguladores de la transcripción de actuación trans.
La invención también proporciona los reactivos y métodos para seleccionar y aislar factores reguladores de la transcripción de TERT de actuación trans. Otras realizaciones alternativas incluyen nuevos sistemas de ensayo in vitro e in vivo basados en células para seleccionar agentes de unión al promotor de TERT (factores reguladores de la transcripción de TERT de actuación trans) usando los ácidos nucleicos de la invención.
c-Myc es un potente activador de la transcripción del gen TERT
El uso de construcciones recombinantes que comprenden secuencias del promotor de TERT de la invención ha demostrado, por primera vez, que c-Myc actúa como un potente activador de la actividad telomerasa por interacción directa con secuencias reguladoras de actuación cis en el promotor de TERT. c-Myc actúa a través de la regulación positiva rápida de la expresión del gen hTERT (ejemplo 8). Significativamente, los estudios demuestran que la activación de la transcripción del promotor de hTERT por c-Myc puede anularse por medio de la deleción o mutación de una sola secuencia reguladora de actuación cis, el "sitio de unión a Myc/Max", dentro del promotor de hTERT. Además, la capacidad de un c-Myc inducible de potenciar la expresión de hTERT es resistente a la inhibición de la síntesis de proteínas.
Promotor de TERT usado para dirigir secuencias génicas heterólogas
La invención también proporciona construcciones en las que las secuencias promotoras de TERT de la invención están unidas operativamente a un gen heterólogo (en una realización preferida, un gen estructural). De esta manera, el gen heterólogo se transcribe en las mismas células al mismo tiempo que se expresaría el transcrito de TERT natural. De esta manera, cuando la construcción se expresa en una célula transformada o en un animal transgénico (no humano), el gen heterólogo (y la proteína, si el gen es una secuencia codificante) se expresa en el mismo modelo temporal sobre la misma serie de células que el gen TERT dirigido por el promotor de TERT de tipo silvestre.
Estas construcciones son útiles para ensayos basados en el promotor de TERT, por ejemplo, para identificar moduladores biológicos de TERT y de la actividad telomerasa. En realizaciones alternativas, la secuencia codificante heteróloga unida operativamente a un promotor de TERT de la invención es un gen marcador (por ejemplo, fosfatasa alcalina, SEAP; \beta-galactosidasa), un gen estructural de TERT modificado o un TERT anti-sentido, o un gen terapéutico (por ejemplo, un gen citotóxico tal como timidina quinasa).
En otra realización se proporcionan virus citopáticos, en particular virus citopáticos humanos, tales como adenovirus modificados o herpesvirus. Los virus, tales como adenovirus o herpesvirus, requieren genes codificados viralmente esenciales para proliferar y lisar células específicas. Si uno cualquiera de estos genes virales esenciales se modificara de tal forma que la expresión del elemento esencial se dirigiera por el promotor de TERT, la proliferación del virus y sus efectos citopáticos se restringiría a células que expresan telomerasa, en particular a células tumorales.
Definiciones
Los siguientes términos se definen más adelante para proporcionar directrices adicionales a un especialista en la práctica de la invención.
El término "amplificar", como se usa en este documento, incorpora su uso común y se refiere al uso de cualquier metodología de amplificación adecuada para generar o detectar ácidos nucleicos recombinantes o expresados de forma natural. Por ejemplo, la invención proporciona métodos y reactivos (incluyendo pares de cebadores de PCR oligonucleotídicos específicos) para amplificar ácidos nucleicos recombinantes o expresados de forma natural de la invención in vivo e in vitro. Puede obtenerse una indicación de que dos polinucleótidos son "substancialmente idénticos" amplificando uno de los polinucleótidos con un par de cebadores oligonucleotídicos o conjunto de cebadores degenerados (por ejemplo, fragmentos de una secuencia del promotor de TERT) y después usando el producto como sonda en condiciones de hibridación rigurosas para aislar la segunda secuencia (por ejemplo, la secuencia del promotor de TERT) a partir de una biblioteca genómica o para identificar la segunda secuencia en una transferencia de Northern o de Southern.
Como se usa en este documento, la expresión "promotor de TERT" incluye cualquier secuencia genómica de TERT capaz de dirigir la transcripción en células positivas con respecto a la actividad telomerasa. De esta manera, los promotores de TERT de la invención incluyen, sin limitación, elementos de control de la transcripción de actuación cis y secuencias reguladoras que están implicadas en la regulación o modulación de la temporización y/o velocidad de transcripción de un gen TERT. Por ejemplo, el promotor de TERT de la invención comprende elementos de control de la transcripción de actuación cis, incluyendo potenciadores, promotores, terminadores de la transcripción, orígenes de replicación, secuencias de integración cromosómica, regiones no traducidas 5' y 3', exones e intrones, que están implicados en la regulación de la transcripción. Estas secuencias de actuación cis típicamente interaccionan con proteínas u otras biomoléculas para realizar (activar/desactivar, regular, modular, etc.) la transcripción.
Un especialista en la técnica apreciará que las secuencias promotoras de hTERT y mTERT proporcionadas en este documento son sólo ilustrativas, y que pueden usarse como base para producir numerosas versiones de los promotores de TERT, es decir, promotores que son capaces de dirigir la transcripción en células positivas con respecto a la actividad telomerasa. Por ejemplo, aunque en este documento se demuestra que una secuencia que comprende 2447 nucleótidos del promotor de hTERT descrito puede dirigir la expresión de esta manera (pGRN350), un especialista en la técnica apreciará que tal actividad puede obtenerse usando secuencias promotoras más largas o más cortas. Además, un especialista en la técnica apreciará que también pueden usarse ciertas secuencias promotoras que harían de las secuencias proporcionadas en este documento, por ejemplo, por adiciones, deleciones o substituciones de nucleótidos, para obtener la expresión en células positivas con respecto a la actividad telomerasa. Tales variantes compartirán un nivel mínimo especificado de similitud estructural (de secuencia) con las secuencias promotoras de TERT descritas, similitud que puede definirse en términos de identidad de secuencia con las secuencias promotoras de TERT descritas, o la capacidad de hibridar con las secuencias descritas a niveles específicos de rigurosidad de hibridación. Por ejemplo, los promotores de TERT variantes incluyen promotores que hibridan con los promotores de TERT descritos en este documento (a 37ºC en un tampón de formamida al 40%, NaCl 1 M y SDS al 1%, seguido de un lavado en 1 X SSC a 45ºC) y que son capaces de dirigir la transcripción en células positivas con respecto a la actividad telomerasa. Otros promotores de TERT variantes incluyen promotores que comparten una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 80%, 90%, 95%, 98% o 100% con los promotores de TERT descritos. La identidad de secuencia se calcula alineando primero el polinucleótido a examinar con el homólogo de referencia, y después contando el número de restos compartidos entre las secuencias que se están comparando como un porcentaje de la región bajo examen. No se impone ninguna penalidad por la presencia de inserciones o deleciones, pero las inserciones o deleciones se permiten sólo cuando se requieren claramente para reajustar la alineación. El porcentaje se proporciona en términos de restos en la secuencia a examinar que son idénticos a restos presentes en la secuencia de comparación o de referencia.
La determinación de que un promotor es capaz de dirigir la transcripción en células positivas con respecto a la actividad telomerasa puede realizarse rutinariamente como se describe en los ejemplos 2 y 5. En resumen, el promotor a ensayar se une operativamente a una región codificante que codifica una proteína detectable tal como la fosfatasa alcalina o la proteína fluorescente verde. Esta construcción después se introduce en células positivas con respecto a la actividad telomerasa (TAP) y negativas con respecto a la actividad telomerasa (TAN). La detección de la proteína detectable en las células TAP pero no en las células TAN, o de un nivel elevado de la proteína detectable en las células TAP en comparación con las células TAN (preferiblemente una diferencia de al menos tres veces) indica que el promotor es un promotor de TERT.
Se dice que un promotor "preferentemente promueve la transcripción" en una célula que tiene un fenotipo particular si el nivel de transcripción es al menos aproximadamente 3 veces mayor en las células de ese fenotipo que en células que carecen del fenotipo. Los promotores de esta invención preferentemente promueven la transcripción en células que expresan TERT, incluyendo células enfermas en las que la enfermedad está asociada con una sobreexpresión de TERT, tales como células cancerosas. Existe una transcripción preferente si el aumento relativo en las células que expresan el fenotipo indicado es al menos 3 veces, 10 veces, 30 veces o 100 veces mayor en comparación con las células que no tienen el fenotipo, en orden de preferencia creciente. Los promotores que muestran menores niveles de especificidad en un ensayo en el que se comparan sólo dos tipos de células pueden ensayarse usando un panel mayor. Un especialista en la técnica sabrá que las células TERT positivas incluyen diversos tipos de células ancerosas, diversos tipos de células progenitoras y células madre y, en ciertas condiciones, linfocitos B y T. Los controles negativos adecuados incluyen cultivos primarios y líneas celulares establecidas de células diferenciadas maduras de la mayoría de los tipos de tejidos.
En realizaciones alternativas, la secuencia promotora de TERT comprende secuencias de TERT cadena arriba del sitio de inicio de la traducción (ATG), por ejemplo, en una realización, el promotor de hTERT comprende los restos 44 a 13545 de la SEC ID Nº: 1. Otras realizaciones incluyen secuencias que empiezan dentro de aproximadamente 1 a 5 nucleótidos de un codón de inicio de la traducción (por ejemplo, en la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2) y que terminan aproximadamente a 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000, 2500 ó 13500 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio de la traducción. Tales realizaciones pueden incluir opcionalmente otras secuencias reguladoras tales como secuencias de exones y/o intron es. Otra realización incluye secuencias de intrones de TERT con actividad reguladora, como se describe en el ejemplo 2. Los promotores de hTERT de la invención también incluyen secuencias substancialmente idénticas (como se definen en este documento) a la secuencia del promotor de hTERT ilustrativo de la invención, que tiene la secuencia indicada en la SEC ID Nº: 1. De forma similar, los promotores de mTERT de la invención también incluyen secuencias substancialmente idénticas a una secuencia del promotor de mTERT ilustrativo de la invención, que tiene la secuencia indicada por la SEC ID Nº: 2.
El término "heterólogo", cuando se usa haciendo referencia a porciones de un ácido nucleico, indica que el ácido nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico típicamente se produce de forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestas de una manera no encontrada en la naturaleza; tal como una secuencia promotora de la invención unida operativamente a una secuencia que codifica un polipéptido que, cuando está unida operativamente, no reforma el gen TERT natural. Por ejemplo, la invención proporciona construcciones recombinantes (cassettes de expresión, vectores, virus y similares) que comprenden diversas combinaciones de promotores de la invención, o subsecuencias de los mismos y secuencias codificantes heterólogas.
Como se usa en este documento, "aislado", cuando hace referencia a una molécula o composición tal como una secuencia promotora de hTERT, significa que la molécula o composición está separada de al menos otro compuesto, tal como una proteína, ADN, ARN u otros contaminantes con los que está asociada in vivo o en su estado natural. De esta manera, una secuencia de ácido nucleico se considera aislada cuando se ha aislado de cualquier otro componente con el que está asociada de forma natural. Sin embargo, una composición aislada también puede ser substancialmente pura. Una composición aislada puede estar en un estado homogéneo. Puede estar en seco o en una solución acuosa. La pureza y la homogeneidad pueden determinarse por técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), electroforesis en gel de agarosa o cromatografía líquida de alta presión (HPLC).
Como se usan en este documento, las expresiones "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente e incluyen oligonucleótidos. También se refieren a ácidos nucleicos sintéticos y/o no naturales (incluyendo análogos de ácidos nucleicos o enlaces o restos de esqueleto modificados). Las expresiones también se refieren a desoxirribonucleótidos u oligonucleótidos de ribonuclótidos en forma monocatenaria o bicatenaria. Las expresiones incluyen ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. La expresión también incluye estructuras similares a ácidos nucleicos con esqueletos sintéticos. Los análogos de esqueleto de ADN proporcionados por la invención incluyen fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, metil-fosfonato, fosforamidato, alquil fosfotriéster, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno(metilimino), 3'-N-carbamato, morfolino carbamato y ácidos péptido nucleicos (PNA); véase Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, editado por F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volumen 600, Eds. Baserga and Denhardt (NYAS 1992); Milligan (1993) J. Med. Chem. 36:1923 -1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press). Los PNA contienen esqueletos no iónicos, tales como unidades de N-(2-aminoetil)glicina. Se describen enlaces de fosforotioato en los documentos WO 97/03211; WO 96/39154, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197. Otros esqueletos sintéticos incluidos por la expresión incluyen enlaces de metil-fosfonato o enlaces de metilfosfonato y fosfodiéster alternos (Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698) y enlaces de bencil-fosfonato (Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156).
Como se usa en este documento, la expresión "unido operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácido nucleico. Típicamente, se refiere a la relación funcional entre una secuencia reguladora de la transcripción y una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia del promotor de TERT de la invención, incluyendo cualquier combinación de elementos de control de la transcripción de actuación cis, está unida operativamente a una secuencia codificante si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula hospedadora apropiada u otro sistema de expresión. Generalmente, las secuencias reguladoras de la transcripción de promotores que están unidas operativamente a una secuencia transcrita están físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, son de actuación cis. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripción, tales como potenciadores, no necesitan ser físicamente contiguas o estar localizadas próximas a las secuencias codificantes cuya transcripción potencian.
Como se usa en este documento, "recombinante" se refiere a un polinucleótido sintetizado o manipulado de otra manera in vitro, a métodos de uso de polinucleótidos recombinantes para producir productos génicos en células u otros sistemas biológicos, o a un polipéptido ("proteína recombinante") codificado por un polinucleótido recombinante. La expresión "medios recombinantes" también incluye la unión de ácidos nucleicos que tienen secuencias codificantes o promotoras de diferentes fuentes en un vector o cassette de expresión para la expresión de una proteína de fusión; o la expresión inducible constitutiva de una proteína (por ejemplo, un promotor de TERT de la invención unido operativamente a un nucleótido heterólogo, tal como una secuencia codificante de un polipéptido).
Como se usa en este documento, la "secuencia" de un gen (a menos que se indique específicamente otra cosa) o de un ácido nucleico se refiere al orden de los nucleótidos en el polinucleótido, incluyendo una cualquiera o las dos cadenas de una molécula de ADN bicatenaria - la secuencia de la cadena codificante y su complemento, o de una molécula de ácido nucleico monocatenaria. Por ejemplo, en realizaciones alternativas, el promotor de la invención comprende secuencias de TERT no transcritas, no traducidas y de intrones, como se indica en las secuencias ilustrativas SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2.
Como se usa en este documento, la expresión "secuencia transcribible" se refiere a cualquier secuencia que, cuando se une operativamente a un elemento de control de la transcripción de actuación cis, tal como los promotores de TERT de la invención, y cuando se pone en las condiciones apropiadas, es capaz de transcribirse para generar ARN.
Los términos "idéntico" o "identidad" en porcentaje, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleótidos (o restos aminoacídicos) que son iguales, cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por alineación manual e inspección visual. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia. Por ejemplo, en realizaciones alternativas, los ácidos nucleicos dentro del alcance de la invención incluyen los que tienen una identidad de secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 75%-80%, aproximadamente un 90% y aproximadamente un 95% con respecto a la secuencia del promotor de TERT ilustrativa indicada en la SEC ID Nº: 1 (incluyendo los restos 44 a 13544 de la SEC ID Nº: 1) o la SEC ID Nº: 2, y las secuencias de intrones de TERT capaces de dirigir un gen indicador a células telomerasa-positivas. Dos secuencias con estos niveles de identidad son "substancialmente idénticas." De esta manera, si una secuencia tiene la identidad de secuencia requerida con una secuencia o subsecuencia del promotor de TERT de la invención, también es una secuencia del promotor de TERT dentro del alcance de la invención. Preferiblemente, la identidad en porcentaje existe en una región de la secuencia que tiene una longitud de al menos aproximadamente 25 nucleótidos, más preferiblemente en una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50-100 nucleótidos.
Para la comparación de las secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se diseñan coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se diseñan parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Pueden usarse parámetros del programa por defecto, o pueden diseñarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias después calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa diseñados o por defecto. Una "ventana de comparación", como se usa en este documento, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera de las diversas posiciones contiguas seleccionadas entre el grupo compuesto por 25 a 600, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, donde una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se hayan alineado óptimamente. La alineación de secuencias puede realizarse por el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:428 (1981), por el algoritmo de alineación de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48.443 (1970), por medio de la búsqueda del método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:2444 (1988), por ejecuciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o por alineación manual e inspección visual.
Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones progresivas por parejas para mostrar la relación y el porcentaje de identidad de secuencia. También representa un árbol o dendograma, que muestra las relaciones de agrupamiento usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng &
Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987). El método usado es similar al método descrito por Higgins & Sharp,
CABIOS 5:151-153 (1989). El programa puede alinear hasta 300 secuencias, cada una de una longitud máxima de 5.000 nucleótidos o aminoácidos. El procedimiento de alineación múltiple empieza con la alineación por parejas de las dos secuencias más similares, produciendo un grupo de dos secuencias alineadas. Este grupo después se alinea con la siguiente secuencia o grupo de secuencias alineadas más relacionado. Dos grupos de secuencia se alinean por medio de una simple extensión de la alineación por parejas de dos secuencias individuales. La alineación final se consigue por una serie de alineaciones progresivas por parejas. El programa se ejecuta diseñando secuencias específicas y sus coordenadas de aminoácidos o de nucleótidos para regiones de comparación de secuencias y diseñando los parámetros del programa. Usando PILEUP, una secuencia de referencia se compara con otra secuencia para determinar el porcentaje de relación de identidad de secuencia (si la segunda secuencia es substancialmente idéntica y está dentro del alcance de la invención) usando los siguiente parámetros: peso de hueco por defecto (3,00), peso de longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos terminales pesados. PILEUP puede obtenerse en el paquete de software de análisis de secuencias GCG (Devereaux (1984) Nuc. Acids Res. 12:387-395). Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. El software para realizar los análisis BLAST está disponible para el público en el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia dudosa, que corresponden o satisfacen algunas puntuaciones umbral de valor positivo T cuando se alinean con un palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T recibe el nombre de umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul (1990) supra). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar la búsqueda de HSP mayores que las contengan. Los aciertos de palabras después se extienden en las dos direcciones a lo largo de cada secuencia hasta que pueda aumentarse la puntuación de alineación acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos correspondientes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos que no corresponden, siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa cae por debajo de la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la acumulación acumulativa llega a cero o a un valor inferior a cero debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos de puntuación negativa; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. En una realización, para determinar si una secuencia de ácido nucleico está dentro del alcance de la invención, se usa el programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) que incorpora como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectación (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de las dos cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89:10915).
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (Karlin (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:5873-5787). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la menor probabilidad de suma (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la que una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos de aminoácidos se produciría por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la menor probabilidad de suma en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor que aproximadamente 0,01 y aún más preferiblemente menor que aproximadamente 0,001.
La expresión "hibrida selectivamente (o específicamente) con" se refiere a la unión, formación de dúplex o hibridación de una molécula con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones de hibridación rigurosas cuando la secuencia está presente en una mezcla compleja (tal como ADN o ARN de biblioteca o celular total), donde la secuencia de nucleótidos particular se detecta al menos dos veces con respecto al nivel de fondo, preferiblemente 10 veces con respecto al nivel de fondo. En una realización, se puede determinar que un ácido nucleico está dentro del alcance de la invención de acuerdo con su capacidad de hibridar en condiciones rigurosas con otro ácido nucleico (tal como las secuencias ilustrativas descritas en este documento).
La expresión "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a condiciones en las que una sonda hibridará principalmente con su subsecuencia diana, típicamente en una mezcla compleja de ácido nucleico, pero no con otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en las diferentes circunstancias, dependiendo de la longitud de la sonda. Las secuencias más largas hibridan específicamente a mayores temperaturas. Se puede encontrar una pauta extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hibridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hibridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993). En general, las condiciones rigurosas se seleccionan entre una temperatura de aproximadamente 5-10ºC por debajo del punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una intensidad iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a unos valores definidos de intensidad iónica, pH y concentración de ácido nucleico) a la que el 50% de la sondas complementarias a la diana hibridan con la secuencia diana en el equilibrio (como las secuencias diana están presentes en exceso, a la Tm, el 50% de la sondas están ocupadas en el equilibrio). Las condiciones rigurosas serán aquellas en las que la concentración de sal es menor que aproximadamente 1,0 M de ion de sodio, típicamente una concentración de ion de sodio (u otras sales) de aproximadamente 0,01 a 1,0 M a un pH de 7,0 a 8,3, y la temperatura es al menos de aproximadamente 30ºC para sondas cortas (\sim 10 a aproximadamente 50 nucleótidos) y al menos de aproximadamente 60ºC para sondas largas (mayores de aproximadamente 50 nucleótidos). Las condiciones rigurosas también pueden conseguirse con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. Para una hibridación selectiva o específica, una señal positiva (identificación de un ácido nucleico de la invención) es aproximadamente 5-10 veces la hibridación de fondo. Las condiciones de hibridación "rigurosas" que se usan para identificar ácidos nucleicos substancialmente idénticos dentro del alcance de la invención incluyen la hibridación en un tampón que comprende formamida al 50%, 5 x SSC y SDS al 1% a 42ºC, o hibridación en un tampón que comprende 5 x SSC y SDS al 1% a 65ºC, ambas con un lavado de 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 65ºC para sondas largas. Para sondas cortas, las condiciones de hibridación rigurosas incluyen hibridación en un tampón que comprende formamida al 50%, 5 x SSC y SDS al 1% a temperatura ambiente o hibridación en un tampón que comprende 5 x SSC y SDS al 1% a 37ºC-42ºC, ambas con un lavado de 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 37ºC- 42ºC. Sin embargo, como es evidente para un especialista habitual en la técnica, las condiciones de hibridación pueden modificarse dependiendo de la composición de la secuencia. Las condiciones de hibridación moderadamente rigurosas incluyen una hibridación en un tampón de formamida al 40%, NaCl 1 M y SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 1 X SSC a 45ºC. Una hibridación positiva es al menos dos veces el efecto de fondo. Los especialistas habituales reconocerán fácilmente que pueden utilizarse condiciones de hibridación y lavado alternativas para proporcionar condiciones de rigurosidad similar.
Técnicas generales
Las secuencias del promotor de TERT de la invención y los ácidos nucleicos usados para poner en práctica esta invención, ya sean ARN, ADNc, ADN genómico o híbridos de los mismos, pueden aislarse a partir de una diversidad de fuentes, obtenerse por ingeniería genética, amplificarse y/o expresarse de forma recombinante. Puede usarse cualquier sistema de expresión recombinante, incluyendo sistemas bacterianos, de levaduras, de insectos o de mamíferos. Como alternativa, estos ácidos nucleicos pueden sintetizarse químicamente in vitro. Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, tales como subclonación en vectores de expresión, sondas de marcaje, secuenciación e hibridación, están bien descritas en la bibliografía científica y de patentes. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) ("Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, Ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997) ("Ausubel"); Laboratory Techniques in Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes. Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993). Los ácidos nucleicos pueden analizarse y cuantificarse por cualquiera de varias técnicas, incluyendo RMN, espectrofotometría, radiografía, electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), cromatografía de capa fina (TLC) y cromatografía de hiperdifusión, reacciones de precipitina en fluido o gel, inmunodifusión (simple o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), ensayos inmunofluorescentes, análisis de Southern, análisis de Northern, análisis dot-blot, electroforesis en gel, RT-PCR, PCR cuantitativa, otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos o de dianas o de señales, radiomarcaje, recuento de centelleo, y cromatografía de afinidad.
Preparación de secuencias promotoras de hTERT
Ciertas realizaciones de la invención son promotores de TERT que comprenden secuencias genómicas 5' (cadena arriba) de un sitio de inicio de la transcripción de hTERT o mTERT, y secuencias de intrones. Los promotores de TERT contienen elementos reguladores de la transcripción de actuación cis implicados en la expresión del mensajero de TERT. Será evidente que, además de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en la SEC ID Nº: 1 de hTERT o en la SEC ID Nº: 2 de TERT, pueden obtenerse fácilmente secuencias promotoras de TERT adicionales usando técnicas de biología molecular rutinarias. Por ejemplo, puede obtenerse una secuencia genómica de hTERT (y un promotor) adicional investigando una biblioteca genómica humana usando la sonda de ácido nucleico de hTERT que tiene una secuencia o subsecuencia como la indicada en la SEC ID Nº: 1 (una secuencia de ácido nucleico está dentro del alcance de la invención si hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia del promotor de hTERT de la invención). Pueden identificarse fácilmente secuencias genómicas de hTERT o mTERT adicionales por técnicas de "desplazamiento sobre el cromosoma", como se describe por Hauser (1998) Plant J 16:117-125; Min (1998) Biotechniques 24:398- 400. Otros métodos útiles para una caracterización adicional de las secuencias del promotor de TERT incluyen los métodos generales descritos por Pang (1997) Biotechniques 22:1046-1048; Gobinda (1993) PCR Meth. Applic. 2:318, Triglia (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186; Lagerstrom (1991) PCR Methods Applic. 1:111; Parker (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055.
En algunas realizaciones, la secuencia promotora comprende al menos aproximadamente 15, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000, 2500 ó 13.000 bases de la SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 2. Se incluye una molécula de ácido nucleico que comprende un promotor de TERT, incluyendo pero sin limitación hTERT o mTERT, unido opcionalmente a una secuencia heteróloga. El promotor puede comprender de aproximadamente 100 a aproximadamente 200, de 200 a aproximadamente 400, de 400 a aproximadamente 900, de 900 a aproximadamente 2500 o de 2500 a aproximadamente 5000 nucleótidos cadena arriba de un sitio de inicio de la traducción. En otras realizaciones, el promotor comprende una secuencia que hibrida con la SEC ID Nº: 1 ó 2. Son ilustrativas secuencias promotoras que preferiblemente promueven la transcripción en células que expresan la telomerasa transcriptasa inversa. Tales secuencias pueden identificarse fácilmente usando los ensayos proporcionados en otras partes de esta descripción y en los ejemplos, en los que las secuencias promotoras candidatas están unidas operativamente a la región codificante de una proteína indicadora, y después se introducen por transfección en células con una actividad TERT conocida para determinar la especificidad.
La invención proporciona cebadores oligonucleotídicos que pueden amplificar todas o cualquier región específica dentro de la secuencia del promotor de TERT de la invención, incluyendo subsecuencias potenciadoras y promotoras específicas. Los ácidos nucleicos de la invención también pueden generarse o medirse cuantitativamente usando técnicas de amplificación. Usando las secuencias del promotor de TERT de la invención (como en la SEC ID Nº: 1 de hTERT o SEC ID Nº: 1 de mTERT ilustrativas), el especialista en la técnica puede seleccionar y diseñar cebadores de amplificación oligonucleotídicos adecuados. Los métodos de amplificación incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR Protocols, A Guide To Methods And Applications ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR Strategies (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.; reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117), amplificación de la transcripción (Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86:1173); y replicación de secuencias autosostenida (Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 87:1874); amplificación por Q \beta-replicasa (Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491, ensayo de amplificación por Q-\beta replicasa automático; Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10.257-271) y otras técnicas mediadas por la ARN polimerasa (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316, Sambrook, Ausebel Mullis (1987), Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.195 y 4.683.202; Arnheim (1990) C&EN 36-47; Lomell J. Clin. Chem., 35:1826 (1989); Van Brunt (1990) Biotechnology, 8:291-294; Wu (1989) Gene 4:560; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564. Una vez amplificado, el ADN genómico de TERT, las secuencias promotoras de TERT y similares pueden clonarse, si se desea, en cualquiera de una diversidad de vectores usando métodos de biología molecular rutinarios; se describen métodos para la clonación de ácidos nucleicos amplificados in vitro en Wallace, Patente de Estados Unidos Nº 5.426.039.
La invención incluye secuencias promotoras de TERT que se han modificado de una manera específica de sitio para alterar, añadir o delecionar algunas o todas las funciones del promotor. Por ejemplo, pueden modificarse pares de bases específicos para alterar, aumentar o reducir la afinidad de unión a factores de regulación de la transcripción de actuación trans, modificando de esta manera el nivel relativo de activación o represión de la transcripción. Las modificaciones también pueden cambiar estructuras secundarias de subsecuencias específicas, tales como las asociadas con muchos elementos de la transcripción de actuación cis. Pueden introducirse mutaciones específicas de sitio en ácidos nucleicos por una diversidad de técnicas convencionales, bien descritas en la bibliografía científica y de patentes. Los ejemplos ilustrativos incluyen mutagénesis de localización dirigida por reacción en cadena de la polimerasa de extensión solapante (OE-PCR), como en Urban (1997) Nucleic Acids Res. 25:2227-2228; Ke (1997) Nucleic Acids Res 25:3371-3372 y Chattopadhyay (1997) Biotechniques 22:1054-1056, que describen el método "megaprimer" de mutagénesis de localización dirigida basada en PCR; Bohnsack (1997) Mol. Biotechnol. 7:181-188; Ailenberg (1997) Biotechniques 22:624-626, que describe mutagénesis de localización dirigida usando un método de re-templado escalonado basado en PCR sin enzimas de restricción; Nicolas (1997) Biotechniques 22:430-434, mutagénesis de localización dirigida usando eliminación de un sitio único para un cebador largo y exonucleasa III. También pueden producirse secuencias del promotor de TERT modificadas de la invención por métodos de modificación química. Belousov (1997) Nucleic Acids. Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896.
La invención también proporciona oligonucleótidos antisentido capaces de unirse a regiones del promotor de TERT que, al menos en parte, modulan la transcripción de TERT y la actividad telomerasa. Por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido que forman triples cadenas con regiones del promotor inhiben la actividad de ese promotor. Joseph (1997) Nucleic Acids Res. 25:2182-2188; Alunni-Fabbroni (1996) Biochemistry 35:16361-16369; Olivas (1996) Nucleic Acids Res 24:1758-1764. Como alternativa, pueden usarse oligonucleótidos antisentido que hibridan con la secuencia del promotor para inhibir la actividad del promotor.
Por ejemplo, los polinucleótidos antisentido de la invención pueden comprender una secuencia antisentido de al menos 7 a 10 a aproximadamente 20 o más nucleótidos que hibrida específicamente con una secuencia complementaria a las secuencias del promotor de TERT de la invención. Como alternativa, el polinucleótido antisentido de la invención puede tener una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos o de aproximadamente 14 a aproximadamente 35 nucleótidos. En otras realizaciones, tienen una longitud menor que aproximadamente 100 nucleótidos o menor que aproximadamente 200 nucleótidos. En general, el polinucleótido antisentido debe ser suficientemente largo para formar un dúplex (o tríplex) estable pero, si se desea, debe ser suficientemente corto, dependiendo del modo de liberación, como para administrarse in vivo. La longitud mínima de un polinucleótido requerido para una hibridación específica con una secuencia diana depende de varios factores, tales como el contenido de G/C, la colocación de bases desemparejadas (si existen), el grado de singularidad de la secuencia en comparación con la población de polinucleótidos diana, y la naturaleza química de los nucleótidos usados en el reactivo anti-sentido (esqueleto de metilfosfonato, ácido péptido nucleico, fosforotioato), entre otros factores. También se describen métodos relacionados con polinucleótidos anti-sentido en Antisense RNA And DNA, (1988), D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY); Dagle (1991) Nucleic Acids Research 19:1805; Kim (1998) J. Controlled Release 53:175-182; para terapia anti-sentido. Uhiman (1990) Chem. Reviews 90:543-584; Poston (1998) J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 116:386-396 (terapia génica ex vivo); Haller (1998) Kidney Int. 53:1550-1558; Nguyen (1998) Cancer Res 58:5673-7.
Identificación de secuencias del promotor de TERT unidas por factores reguladores de la transcripción
La invención proporciona medios para identificar y aislar factores reguladores de la transcripción de actuación trans que están implicados en la modulación de la actividad del promotor de TERT. La identificación de motivos de actuación cis por comparación de identidad de secuencias puede ser un medio inicial útil para identificar secuencias promotoras unidas por factores de actuación trans. El promotor de hTERT contiene el motivo que se sabe que se une a c-Myc (la "caja E" o el "sitio de unión a Myc/Max"). Dos sitios de unión a SP1 están localizados desde el resto -168 y desde el resto -134. Otros motivos identificados incluyen el producto génico de la región determinante del sexo Y (SRY), el factor nuclear hepático 3-beta (HNF- 3\beta) y el factor nuclear hepático 5 (HNF-5), TFIID-MBP y los elementos reguladores de la transcripción de actuación cis E2F y c-Myb. Para identificar estos motivos, puede usarse una diversidad de algoritmos de comparación. Karas (1996) Comput. Appl. Biosci. 12:441-6; Frech (1997) Pac Symp Biocomput. 7:151-62; Brzma (1998) Genome Res 8:1202-1215; Tsunoda (1998) Pac Symp Biocomput: 1998:252-63.
Además del análisis de identidad de secuencia, los elementos reguladores de la transcripción de actuación cis de TERT pueden identificarse por ensayos funcionales, incluyendo ensayos de la actividad del promotor, ensayos de DNasa, ensayos de unión (ensayos de cambio de movilidad), y cromatografía en columna de afinidad de oligonucleótidos. Después de una identificación positiva o tentativa de un sitio de unión de actuación cis en un promotor de TERT, estas secuencias se usan para aislar el o los factores reguladores de la transcripción de actuación trans. En una realización preferida, los factores de actuación trans se aíslan usando cromatografía de afinidad de oligonucleótidos específica de secuencia, comprendiendo los oligonucleótidos las secuencias de TERT de la invención.
Otra realización para identificar motivos reguladores de la transcripción implica modificar supuestas subsecuencias reguladoras de actuación cis y evaluar el cambio, si existe, del promotor de TERT resultante para modular la transcripción. La modificación puede ser una o más deleciones de restos, substituciones de restos y alteraciones químicas de nucleótidos. El promotor (modificado) puede unirse operativamente a TERT, un gen indicador o cualquier otra secuencia transcribible. El aumento o la reducción relativa que la modificación tiene sobre las velocidades de transcripción puede determinarse midiendo la capacidad del promotor de TERT inalterado para activar de forma transcripcional la secuencia codificante del indicador en las mismas condiciones usadas para ensayar el promotor modificado. Un aumento o reducción en la capacidad del promotor de TERT modificado para inducir la transcripción en comparación con la construcción del promotor no modificado identifica una secuencia reguladora de la transcripción de actuación cis que está implicada en la modulación de la actividad del promotor de TERT.
El gen indicador puede codificar una proteína fluorescente o fosforescente, o una proteína que posee actividad enzimática. En realizaciones alternativas, la proteína detectable es luciferasa de luciérnaga, \alpha-glucuronidasa, \alpha-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde potenciada y la fosfatasa alcalina secretada humana. Otra realización ensaya la capacidad de estos elementos de actuación cis de unirse a factores polipeptídicos solubles de actuación trans aislados a partir de diferentes compartimentos celulares, particularmente los factores de actuación trans expresados en los núcleos. Para la identificación y aislamiento de factores que estimulan la transcripción, se usan extractos nucleares de células que expresan TERT.
Además, una vez identificado un motivo o elemento de actuación cis, puede usarse para identificar y aislar factores de actuación trans en una diversidad de células y en diferentes condiciones (tales como proliferación celular frente a senescencia celular). Por consiguiente, la invención proporciona un método para seleccionar factores de actuación trans que modulan la actividad del promotor de TERT en una diversidad de condiciones, estados de desarrollo y tipos celulares (incluyendo fenotipos normales frente a fenotipos inmortales y frente a fenotipos malignos). Las secuencias reguladoras de la transcripción de actuación cis de la invención que modulan la actividad del promotor de TERT también pueden usarse como oligonucleótidos que, tras la introducción en una célula, pueden unirse a factores reguladores de actuación trans para modular la transcripción de TERT in vivo. Esto tiene como resultado un aumento o reducción de la capacidad proliferativa de las células para el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones.
Selección de alto rendimiento de moduladores de la transcripción de TERT de molécula pequeña
La invención proporciona construcciones y métodos para seleccionar moduladores, en una realización preferida, moduladores de molécula pequeña, de la actividad del promotor de TERT in vitro e in vivo. La invención incorpora todos los ensayos disponibles para seleccionar moduladores de la transcripción de TERT de molécula pequeña. En una realización preferida, se adaptan ensayos de alto rendimiento y se usan con las nuevas secuencias del promotor de TERT y construcciones proporcionadas por la invención. Schultz (1998) Bioorg Med Chem Lett 8:2409-2414; Weller (1997) Mol Divers. 3:61-70; Fernandes (1998) Curr Opin Chem Biol 2:597-603; Sittampalam (1997) Curr Opin Chem Biol 1:384-91.
En realizaciones alternativas, las construcciones recombinantes contienen secuencias del promotor de hTERT que dirigen un gen marcador, tal como un gen marcador de fosfatasa alcalina (SEAP) o un gen de la \NAK-galactosidasa. Usando una construcción de expresión de SEAP de la invención, se demostró que un fragmento del promotor de TERT de aproximadamente 2,5 kg es suficiente para activar y reprimir la transcripción de TERT en respuesta al estímulo de detención de la proliferación y/o crecimiento en una línea de células modelo, IDH4. Se seleccionaron dos clones celulares, ID245-1 e ID245-16 cuyos perfiles de SEAP corresponden estrechamente a la actividad telomerasa después de la regulación positiva de TERT por dexametasona, y se expandieron para la selección de alto rendimiento de activadores de telomerasa de molécula pequeña.
Tratamiento de enfermedades asociadas con una alteración de la expresión de la telomerasa
La presente invención proporciona secuencias del promotor de TERT útiles para el tratamiento de enfermedades y estados de enfermedad. Los ácidos nucleicos recombinantes y sintéticos que comprenden el promotor de TERT, o secuencias complementarias antisentido de TERT, pueden usarse para crear o elevar la actividad telomerasa en una célula, así como para inhibir la actividad telomerasa en células en las que no se desea. En una realización preferida, las secuencias del promotor de TERT humano o las secuencias antisentido se usan para el tratamiento de enfermedades y patologías humanas.
La identificación de secuencias reguladoras de la transcripción de actuación cis por la invención también proporciona medios para el diseño de secuencias diana que, como los oligonucleótidos, pueden modificar la actividad del promotor de TERT. En una realización, la actividad telomerasa se crea o se eleva por medio de la unión de cantidades significativas de un represor o regulador negativo de la transcripción de actuación trans con un ácido nucleico que se une específicamente al represor. En otra realización, la actividad telomerasa se regula negativamente por oligonucleótidos antisentido que se unen a secuencias promotoras. De forma similar, la actividad telomerasa puede inhibirse por medio de la unión de cantidades significativas de un activador o regulador positivo de la transcripción de actuación trans con un ácido nucleico que se une específicamente al activador; o la actividad telomerasa se regula positivamente por oligonucleótidos antisentido que se unen a secuencias promotoras implicadas en la represión de la telomerasa. De esta manera, la inhibición, activación o alteración de otra manera de una actividad telomerasa (actividad catalítica de telomerasa, fidelidad, procesabilidad, unión al telómero, etc.) en una célula puede usarse para cambiar la capacidad proliferativa de la célula.
Por ejemplo, la reducción de la actividad telomerasa en una célula inmortal, tal como una célula tumoral maligna, puede hacer que la célula sea mortal. A la inversa, al aumentar la actividad telomerasa en una línea celular o una célula mortal (la mayoría de las células somáticas humanas) puede aumentar la capacidad proliferativa de la célula. Por ejemplo, la expresión de la proteína hTERT en fibroblastos dérmicos, aumentando de esta manera la longitud de los telómeros, dará como resultado una mayor capacidad proliferativa de los fibroblastos. Tal expresión puede ralentizar o invertir procesos degenerativos relacionados con la edad, tales como una ralentización dependiente de la edad del cierre de las heridas (West (1994) Arch. Derm. 130:87). De esta manera, en una aspecto, la presente invención proporciona reactivos y métodos útiles para tratar enfermedades y afecciones caracterizadas por la presencia, ausencia o cantidad alterada de actividad telomerasa humana en una célula (siendo las enfermedades y afecciones susceptibles de tratamiento usando las composiciones y métodos descritos en este documento). Estas enfermedades incluyen, por ejemplo, cánceres, otras enfermedades de proliferación celular (particularmente procesos degenerativos y de envejecimiento y enfermedades de envejecimiento), trastornos inmunológicos, e infertilidad (o fertilidad).
Promotor de hTERT unido operativamente a toxinas celulares
En una realización, el promotor de TERT de la invención está unido operativamente a una secuencia transcribible que codifica una toxina celular. Las toxinas polipeptídicas que pueden generarse de manera recombinante incluyen ricina, abrina (Hughes (1996) Hum. Exp. Toxicol. 15:443-451), difteria, gelonina (Rosenblum (1996) Cancer Immunol. Immunother. 42:115-121), exotoxina A de seudomonas, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), toxina de Crotalus durissus terrificus, toxina de Crotalus adamenteus, toxina de Naja naja, y toxina de Naja mocambique. Rodriguez (1998) Prostate 34:259-269; Mauceri (1996) Cancer Res. 56:4311-4314. La toxina celular también puede ser capaz de inducir apoptosis, tal como la familia ICE de proteasas de cisteína, la familia de proteínas Bcl-2, bax, bclXs y caspasas. Favrot (1998) Gene Ther. 5:728-739; McGill (1997) Front. Biosci. 2:D353-D379; McDonnell (1995) Semin. Cancer Biol. 6:53-60.
Como alternativa, la secuencia bajo el control del promotor de TERT puede codificar polipéptidos que tienen actividad que no es tóxica por sí misma para una célula, pero que hace que la célula sea sensible a otro fármaco no tóxico de otra manera, tal como la timidina quinasa del virus del herpes (HSV-TK). La HSV-TK es inocua, pero convierte el agente anti-herpético ganciclovir (GCV) en un producto tóxico que interfiere con la replicación del ADN en células proliferativas. Delaney (1996) J. Neurosci. 16:6908-6918; Heyman (1989) Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos 86:2698-2702. La técnica describe otras numerosas proteínas tóxicas o potencialmente tóxicas adecuadas y sistemas que pueden aplicarse en esta realización.
Los métodos de la invención, además de permitir la destrucción específica de células telomerasa-positivas, también pueden usarse para prevenir la transformación de células telomerasa-negativas en células telomerasa-positivas. Como se muestra en los siguientes ejemplos, una secuencia del promotor de hTERT puede unirse operativamente a un gen indicador de tal manera que la activación del promotor tenga como resultado la expresión de la proteína codificada por el gen indicador. Si en lugar de una proteína indicadora la proteína codificada es tóxica para la célula, la activación del promotor conduce a una morbididad o muerte celular.
Virus oncolíticos y toxinas para tratar el cáncer
La presente invención proporciona métodos y composiciones para reducir la actividad del promotor de TERT (y, por lo tanto, la actividad telomerasa) en células inmortales y células tumorales para tratar el cáncer. Las células cancerosas (células tumorales malignas) que expresan la actividad telomerasa (células telomerasa-positivas) pueden hacerse mortales reduciendo o inhibiendo la actividad del promotor de TERT. Además, como los niveles medibles de la actividad telomerasa se correlacionan con características de la enfermedad tales como el potencial metastásico (Patentes de Estados Unidos Nº 5.639.613; 5.648.21; 5.489.508; y Pandita (1996) Proc. Am. Ass. Cancer Res. 37:559), cualquier reducción en la actividad del promotor de TERT podría reducir la naturaleza agresiva de un cáncer hasta un estado de enfermedad más tratable.
Aprovechando esta característica, en una realización de la invención, una secuencia promotora de TERT está unida operativamente a un gen que codifica una toxina y se introduce en una célula para destruir la célula (tal como ricina, difteria, gelonina, toxina de Pseudomonas, o abrina). Si o cuando los activadores de la transcripción de TERT se expresen o se activen en la célula, la toxina se expresará, dando como resultado una destrucción de células específicas.
Como alternativa, el gen unido al promotor de TERT puede codificar una proteína que tiene una actividad que no es tóxica por sí misma para la célula, sino que hace que la célula sea sensible a un fármaco no tóxico de otra manera (tal como la timidina quinasa del virus del herpes).
En otra realización, la invención aprovecha el hecho de que virus citopáticos normales, en particular virus citopáticos humanos, tales como adenovirus o herpesvirus, requieren genes codificados viralmente esenciales para proliferar, lisando de esta manera células específicas. Basándose en la siguiente descripción, los especialistas en la técnica reconocerán que pueden adaptarse varios virus citopáticos diferentes de acuerdo con esta invención. Los virus citopáticos son bien conocidos en la técnica y se describen, entre otros sitios, en las publicaciones de Coffey, Toda, Chase y Kramm, presentadas más adelante. En muchos de tales virus se han caracterizado genes esenciales para la replicación. Si un gen de replicación esencial de cualquiera de estos virus se dirige por el promotor de TERT, la proliferación del virus y sus efectos citopáticos se restringirían a las células tumorales y otras células que expresan telomerasa. Por ejemplo, algunos elementos genéticos esenciales para la replicación de adenovirus son las regiones E4, E1a, E1b y E2, o cualquiera de los productos génicos tardíos. Los elementos genéticos esenciales para la replicación de HSV-1 incluyen ICP6 e ICP4.
Por consiguiente, la invención proporciona construcciones y métodos para destruir células telomerasa-positivas (tales como células cancerosas), donde secuencias promotoras de TERT de la invención están unidas operativamente a tales elementos genéticos de replicación esenciales. Para uso en células humanas, se prefieren virus citopáticos humanos modificados con secuencias del promotor de TERT. Uno cualquiera o más de los genes requeridos para la replicación y empaquetamiento del virus podrían modificarse para dirigirse por el promotor de TERT. Por ejemplo, en una realización, la expresión del gen E1a de adenovirus, que se requiere para la activación de la expresión de una cascada de genes adenovirales, se pone bajo el control del promotor de hTERT.
De esta manera, la expresión de E1a, y por lo tanto la replicación cadena abajo del virus, se produce sólo en las células que expresan telomerasa (tales como células tumorales). De forma similar, un adenovirus recombinante de la invención se diseña de manera que los genes de la cápsida adenoviral estén bajo el control de un promotor de TERT. Aunque esta construcción replica su ADN en la mayoría de los tipos celulares, se empaqueta en un virus infeccioso activo (y citotóxico) sólo en las células que expresan la telomerasa. De esta manera, cuando estas construcciones se usan como agentes terapéuticos contra el cáncer, el virus condicionalmente replicativo sólo infecta y produce una infección productiva en células tumorales (sin efecto en las células "normales" que no expresan la telomerasa). Es de esperar que la infección de las células normales que no expresan la telomerasa no produzca ningún virus o presenten una producción abortiva del virus, dependiendo del gen que se dirija por el promotor de TERT. De esta manera, estos virus recombinantes de la invención permiten la amplificación natural, aunque específica de tumor, de un virus oncolítico.
En realizaciones alternativas, se incorporan muchos otros elementos en un virus oncolítico restringido con el promotor de TERT o un virus replicativo restringido con el promotor de TERT que no es lítico. En el virus recombinante condicionalmente replicativo restringido con el promotor de TERT se incorporan genes codificantes, genes suicidas, genes marcadores, genes apoptóticos o reguladores del ciclo celular. La expresión de estos elementos en tal virus ayudaría a detener el crecimiento tumoral. En una realización, los elementos a incluir dentro de estos virus condicionalmente replicativos de la invención son estructuras que inhiben la actividad telomerasa. Estos inhibidores de la telomerasa podrían incorporar oligonucleótidos inhibidores, inhibidores dominantes-negativos de TERT, o el gen de cualquier agente que impidiera o previniera el montaje, las interacciones o la actividad de TR/TERT.
En los vectores restringidos con el promotor de TERT de la invención también se pueden incluir otros elementos. Por ejemplo, pueden sintetizarse in vivo moléculas de ARN inhibidoras pequeñas, preferiblemente que se dirigen a células cancerosas, tales como ARN que se dirige a la actividad telomerasa, usando un vector de adenovirus recombinante. Se proporcionan secuencias ilustrativas en la Patente de Estados Unidos Nº 5.858.777 y en el documento GB 20890.4. La producción de ARN a partir del adenovirus puede conseguirse por medio de una diversidad de cassettes de expresión. Para la inhibición del crecimiento celular, se prefieren cassettes de expresión de la ARN polimerasa III basados en la estructura de genes de ARNt y otros transcritos de la ARN polimerasa III, incluyendo el gen U6 snRNA, así como los transcritos de la ARN polimerasa II snRNP (U1, U2), debido a su capacidad de producir altos niveles de transcritos.
Los virus restringidos con el promotor de hTERT de la invención pueden diseñarse para expresar ARN inhibidores, como moléculas antisentido complementarias a varias regiones de la molécula de hTR, incluyendo la región de plantilla. Los ARN inhibidores también pueden imitar secuencias y/o estructuras presentes en el componente de ARN de la telomerasa (por ejemplo, hTR), incluyendo sitios de unión potenciales a TERT u otras proteínas asociadas a telomerasa que podrían interaccionar con el componente de ARN. También pueden diseñarse otros elementos para generar ARN inhibidores del ARNm de TERT diana por medio de la prevención de su procesamiento, plegamiento, modificación, transporte y/o traducción normales.
Otros vectores virales citopáticos de la invención pueden diseñarse para generar moléculas de ARN con secuencias necesarias para la exportación al citoplasma y la traducción en péptidos. Los polipéptidos o péptidos resultantes pueden diseñarse para dirigirse a componentes de telomerasa u otras moléculas que estén asociadas con la telomerasa, influyendo de esta manera sobre la actividad catalítica de la telomerasa. Los péptidos que inhiben la telomerasa se producirán a un alto nivel, correspondiente con la cantidad de ARN. Por ejemplo, podrían diseñarse péptidos para imitar el tramo de aminoácidos en hTERT implicado en su unión a hTR, actuando de esta manera como competidores en el montaje de una telomerasa funcional.
Los vectores virales restringidos con el promotor de TERT de la invención también pueden diseñarse para generar péptidos o polipéptidos para cualquier dominio de TERT implicado en interacciones con otras proteínas y para romper contactos que son esenciales para la función telomerasa. Otros virus restringidos con el promotor de TERT de la invención pueden diseñarse para generar polipéptidos que se unan a complejos de telómeros e impidan el acceso y/o acoplamiento de la telomerasa o para generar péptidos inmunogénicos, en parte péptidos TERT.
Otros vectores virales restringidos con el promotor de TERT de la invención pueden diseñarse para generar polipéptidos que imiten una diversidad de agentes inductores de apoptosis observados durante la muerte celular programada, y podrían ocasionar el inicio de la apoptosis. Los virus restringidos con el promotor de TERT no necesitan ser citopáticos forzosamente. Los virus condicionalmente restringidos con el promotor de TERT podrían usarse para amplificar cualquier secuencia o cualquier elemento en cualquier célula que expresa TERT, tal como una célula tumoral.
Cualquiera de estas realizaciones puede proporcionarse con los virus condicionalmente replicativos de la invención. Las construcciones de promotor de TERT de la invención también pueden usarse en vectores de terapia génica para prevenir la activación de la telomerasa y ocasionar una destrucción o muerte específica de células telomerasa-positivas. De forma similar, estos métodos de terapia génica pueden usarse para tratar una predilección genética por cánceres.
Tratamiento de otras afecciones
La presente invención también proporciona composiciones y métodos útiles para el tratamiento de enfermedades y patologías (además de los cánceres) caracterizadas por una infra- o sobreexpresión de telomerasa o de productos génicos del gen TERT. Los ejemplos incluyen enfermedades de proliferación celular, enfermedades producidas por senescencia celular (particularmente, procesos y enfermedades de envejecimiento), trastornos inmunológicos, infertilidad, y enfermedades de disfunción inmune. Ciertas enfermedades de envejecimiento se caracterizan por cambios asociados con la senescencia celular debidos a una longitud reducida de los telómeros (en comparación con células más jóvenes), debida a la ausencia (o niveles mucho menores) de actividad telomerasa en la célula. La reducción de la longitud de los telómeros y la reducción de la capacidad de replicación contribuyen a estas enfermedades. La actividad telomerasa (que aumenta la longitud de los telómeros) puede regularse positivamente aumentando la actividad promotora de TERT en la célula.
La presente invención, al proporcionar métodos y composiciones para modular la actividad promotora de TERT, también proporciona métodos para tratar la infertilidad. Las células de la línea germinal humana (células de la espermatogonia, sus progenitores o descendientes) pueden proliferar indefinidamente y se caracterizan por una alta actividad telomerasa. Unos niveles anormales o disminuidos de productos del gen TERT pueden tener como resultado una producción inadecuada o anormal de espermatozoides, conduciendo a una infertilidad o a trastornos de la reproducción. Por consiguiente, la infertilidad asociada con una actividad telomerasa alterada puede tratarse usando los métodos y composiciones descritos en este documento para aumentar los niveles de actividad del promotor de TERT. De forma similar, como la inhibición de la telomerasa puede impactar negativamente sobre la espermatogénesis, oogénesis y viabilidad del esperma y del huevo, las composiciones de la invención capaces de inhibir la actividad promotora de hTERT pueden tener efectos anticonceptivos cuando se usan para reducir los niveles de hTERT en células de la línea germinal.
En otra realización, la invención proporciona métodos y composiciones útiles para reducir el potencial proliferativo de células telomerasa-positivas tales como linfocitos activados y células madre hematopoyéticas por medio de la deducción de la actividad del promotor de TERT. De esta manera, la invención proporciona medios para realizar inmunosupresión. A la inversa, los métodos y reactivos de la invención son útiles en inmunoestimulación al aumentar la actividad del promotor de TERT (dando como resultado un mayor potencial proliferativo) en células inmunes, incluyendo células madre hematopoyéticas (que expresan un bajo nivel de telomerasa o no expresan telomerasa antes de la intervención terapéutica).
Modulación de la actividad del promotor de TERT
Como es evidente por la discusión anterior, la modulación del nivel de actividad transcripcional del promotor de TERT (y, por lo tanto, los niveles de telomerasa o actividad telomerasa en una célula) pueden tener un profundo efecto sobre el potencial proliferativo de la célula, y de esta manera tiene gran utilidad en el tratamiento de enfermedades. Esta modulación puede ser una reducción o un aumento de la actividad del promotor de TERT. Las moléculas de ácido nucleico moduladoras de la actividad del promotor de la invención pueden actuar a través de varios mecanismos. Sin embargo, la invención no se limita a ningún mecanismo de acción particular.
Por ejemplo, la actividad del promotor de TERT puede reducirse o aumentarse por medio de secuencias monocatenarias antisentido que se unen directamente a secuencias del promotor de TERT. Esto dará como resultado una reducción de la afinidad o inhibición de factores reguladores de la transcripción de actuación trans que se unen a secuencias promotoras de TERT críticas (cajas ATA, cajas CAAT, y similares). Cuando el elemento de actuación cis unido a un factor de actuación trans tiene actividad inhibidora, la unión del oligonucleótido daría como resultado una regulación positiva de la transcripción de TERT. A la inversa, si la subsecuencia del promotor, cuando se une a un factor de actuación trans, tiene actividad de regulación positiva, la unión del oligonucleótido daría como resultado una regulación negativa de la transcripción de TERT. En otra realización, oligonucleótidos bicatenarios que representan subsecuencias del promotor de TERT se unen directamente a elementos moduladores de la transcripción de actuación trans, previniendo de esta manera su unión a los elementos de actuación cis correspondientes. En resumen, la actividad del promotor de TERT puede aumentarse o reducirse por medio de cualquiera de varios mecanismos, o por medio de una combinación de mecanismos. Éstos incluyen cualquier medio evidente para los especialistas tras la revisión de esta descripción.
Las secuencias reguladoras de la transcripción de actuación cis de la invención también pueden usarse como oligonucleótidos que, tras la introducción en una célula, se pueden unir a factores reguladores de actuación trans para modular la transcripción de TERT in vivo. Estos oligonucleótidos pueden suministrarse a células diana por medio de un esquema de liberación apropiado o pueden sintetizarse in vivo por sistemas de expresión recombinantes (vectores, virus y similares).
Oligonucleótidos y otras composiciones farmacéuticas
Los oligonucleótidos antisentido que hibridan con secuencias promotoras de TERT inhibirán la unión de agentes reguladores de la transcripción de actuación trans a secuencias promotoras de TERT críticas. Además, el resultado será la activación o represión de la actividad transcripcional de TERT, dependiendo de si la subsecuencia promotora es reguladora negativa o reguladora positiva, respectivamente. De esta manera, la invención proporciona oligonucleótidos antisentido dirigidos a los sitios de unión del promotor de TERT (actuación cis) para c-Myc (la "caja E" o "sitios de unión a Myc/Max"), SP1, el producto del gen Y (SRY), HNF-3\beta, HNF-5, TFIID-MBP, E2F, c-Myb, cajas TATA, cajas CAAT y otros elementos reguladores.
Los polinucleótidos de TERT pueden producirse por síntesis química directa. Típicamente se usará síntesis química para producir oligonucleótidos y polinucleótidos que contienen nucleótidos no estándar (sondas, cebadores y oligonucleótidos antisentido), aunque también pueden prepararse ácidos nucleicos que contienen sólo nucleótidos estándar. La síntesis química directa de ácidos nucleicos puede realizarse, por ejemplo, por el método de fosfotriéster de Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90, el métodos de fosfotriéster de Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; el método de dietil-fosforamidita de Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; y el método de soporte sólido de la Patente de Estados Unidos Nº 4.458.066. La síntesis química típicamente produce un oligonucleótido monocatenario, que puede convertirse en ADN bicatenario por hibridación con una secuencia complementaria, o por polimerización con una ADN polimerasa y un cebador oligonucleotídico usando la cadena sencilla como plantilla. Un especialista reconocerá que aunque la síntesis química de ADN a menudo está limitada a secuencias menores de aproximadamente 100 ó 150 bases, pueden obtenerse secuencias mayores por medio de la unión de secuencias más cortas o por métodos de síntesis más elaborados. Se apreciará que los polinucleótidos y oligonucleótidos de la invención pueden realizarse usando bases no estándar (distintas de adenina, citidina, guanina, timidina y uridina) o estructuras de esqueleto no estándar para proporcionar propiedades deseables (mayor resistencia a nucleasas, unión más fuerte, estabilidad o una Tm deseada). Las técnicas para hacer que los oligonucleótidos sean resistentes a nucleasas incluyen las descritas en la publicación PCT WO 94/12633. Puede producirse una amplia diversidad de oligonucleótidos modificados útiles, incluyendo oligonucleótidos que tienen un esqueleto de ácido péptido nucleico (PNA) (Nielsen (1991) Sience 254:1497) o que incorporan 2'-O-metil ribonucleótidos, nucleótidos de fosforotioato, nucleótidos de metil fosfonato, nucleótidos de fosfotriéster, nucleótidos de fosforotioato, y fosforamidatos. Otros oligonucleótidos útiles pueden contener restos de azúcar substituidos con alquilo y con halógenos que comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH, SH, SCH_{3}, F, OCN, OCH_{3}OCH_{3}, OCH_{3}O(CH_{2})nCH_{3}, O(CH_{2})nNH_{2} o O(CH_{2})nCH_{3} donde n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo inferior con 1 a 10 átomos de carbono, alquilo inferior substituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF_{3}; OCF_{3}; O-, S- o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; SOCH_{3}; SO_{2}CH_{3}; ONO_{2}; NO_{2}; N_{3}; NH_{2}; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; amino-alquilamino; polialquilamino; sililo substituido; un grupo de escisión de ARN; un grupo colesterilo; un grupo folato; un grupo indicador; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros substituyentes que tienen propiedades similares. El folato, el colesterol u otros grupos que facilitan la captación de oligonucleótidos, tales como análogos de lípidos, pueden conjugarse directamente o a través de un enlazador en la posición 2' de cualquier nucleósido o en la posición 3' o 5' del nucleósido 3'-terminal o 5'-terminal, respectivamente. Pueden usarse uno o más de tales conjugados. Los oligonucleótidos también pueden tener grupos miméticos de azúcar tales como ciclobutilos en lugar de los grupos pentofuranosilo. Otras realizaciones pueden incluir al menos una forma de base modificada o "base universal" tal como inosina, o la inclusión de otras bases no estándar tales como queosina y wybusina, así como acetil-, metil-, tio- y formas modificadas de forma similar de adenina, citidina, guanina, timidina y uridina que no se reconocen fácilmente por endonucleasas endógenas. La invención también proporciona oligonucleótidos que tienen análogos de esqueleto tales como fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alquil fosfotriéster, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno(metilimino), 3'-N-carbamato, morfolino carbamato, metil fosfonatos quirales, nucleótidos con enlaces entre azúcares cicloalquilo o alquilo de cadena corta, enlaces entre azúcares ("esqueleto") heterocíclicos o heteroatómicos de cadena corta, o esqueletos CH_{2}-NH-O-CH_{2}, CH_{2}-N(CH_{3})-OCH_{2}, CH_{2}-O-N(CH_{3})-CH_{2}, CH_{2}-N(CH_{3})-N(CH_{3})-CH_{2} y O-N(CH_{3})-CH_{2}-CH_{2} (donde fosfodiéster es O-P-O-CH_{2}), o mezclas de los mismos. También son útiles oligonucleótidos que tienen estructuras de esqueleto de morfolino (Patente de Estados Unidos Nº 5.034.506).
Aunque la invención no se limita por ningún mecanismo particular, los oligonucleótidos de la invención también pueden unirse a secuencias promotoras de TERT bicatenarias o dúplex. Pueden unirse a una región plegada, formando una triple hélice o ácido nucleico "tríplex". La formación de una triple hélice tiene como resultado la inhibición de la actividad del promotor de TERT por medio de la alteración de la estructura secundaria de la secuencia promotora, dando como resultado una nueva conformación con la que el factor de actuación trans no se puede unir con suficiente afinidad como para tener un efecto modificador de la transcripción. Como alternativa, la formación de una triple hélice (inducida por la unión del oligonucleótido antisentido de la invención) compromete la capacidad de la doble hélice de abrirse suficientemente para que tenga lugar la unión de polimerasas, factores de transcripción o moléculas reguladoras de actuación trans. En Cheng (1988) J. Biol. Chem. 263:15110; Ferrin (1991) Science 354:1494; Ramdas (1989) J. Biol. Chem. 264:17395; Strobel (1991) Science 254:1639; Rigas (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 9591) Carr, 1994, Molecular and Immunological Approaches, Futura Publishing Co, Mt Kisco NY; Rininsland (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94:5854; Perkins (1998) Biochemistry 37:11315-11322, se describe la construcción de polinucleótidos y oligonucleótidos tríplex.
Los ácidos nucleicos terapéuticos y métodos de la invención implican la administración de oligonucleótidos o polinucleótidos que funcionan inhibiendo o estimulando la actividad del promotor de TERT en condiciones fisiológicas in vivo. En una realización, estos ácidos nucleicos son secuencias antisentido monocatenarias capaces de unirse a secuencias promotoras. En una realización alternativa, son ácidos nucleicos bicatenarios capaces de unirse a factores reguladores de la transcripción de actuación trans. Deben ser suficientemente estables en condiciones fisiológicas durante un período de tiempo para obtener un efecto terapéutico. Los ácidos nucleicos modificados pueden ser útiles para impartir tal estabilidad, así como para dirigir la liberación del oligonucleótido en el tejido, órgano o célula deseados. Los oligo- y polinucleótidos pueden suministrarse directamente como un fármaco en una formulación farmacéutica adecuada, o indirectamente por medio de la introducción de un sistema de expresión de ácidos nucleicos que puede generar de manera recombinante los oligonucleótidos moduladores del promotor de hTERT en una célula. En una realización, los oligonucleótidos se unen directamente a secuencias de actuación cis o, como alternativa, se unen a factores reguladores de actuación trans. Una realización explota el hecho de que el promotor de TERT sólo es relativamente activo en una serie muy limitada de tipos celulares, incluyendo, significativamente, células cancerosas.
Los oligonucleótidos o vectores de expresión pueden administrarse por liposomas, inmunoliposomas, balística, captación directa en las células, y similares. Para el tratamiento de enfermedades, los oligonucleótidos de la invención se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz, que es una cantidad suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad o modular la actividad de promotor de hTERT (afectando de esta manera a la actividad telomerasa) en la célula diana. En la Patente de Estados Unidos 5.272.065 se describen métodos útiles para suministrar oligonucleótidos para fines terapéuticos. La actividad telomerasa puede medirse por medio de un ensayo TRAP u otro ensayo adecuado de la función biológica de la telomerasa, como se describe con detalle en otras publicaciones.
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden ácidos nucleicos que contienen el promotor de TERT (polinucleótidos, vectores de expresión, construcciones de terapia génica) solos o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto de estabilización, diluyente, vehículo, agente de dirección a las células u otro ingrediente o agente activo. Los agentes terapéuticos de la invención pueden administrarse en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible estéril incluyendo, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. Cualquiera de estas moléculas puede administrarse a un paciente sola, o en combinación con otros agentes fármacos u hormonas, en composiciones farmacéuticas, donde se mezcla con excipientes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por cualquier medio. Los métodos de administración parenteral incluyen la administración tópica, intra-arterial, intramuscular (IM), subcutánea (SC), intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa (IV), intraperitoneal (IP) o intranasal. Pueden encontrarse más detalles sobre técnicas para formulación y administración en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co, Easton PA); publicación PCT WO 93/23572.
Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen ácidos nucleicos que contienen TERT en una cantidad eficaz para conseguir el fin deseado. "Cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad farmacológicamente eficaz" son frases bien reconocidas y hacen referencia a la cantidad de un agente eficaz para producir el resultado farmacológico deseado. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para tratar una enfermedad o afección o mejorar los síntomas de la enfermedad que se está tratando. Los ensayos útiles para determinar una cantidad eficaz para una aplicación dada incluye la medición del efecto sobre la actividad del promotor de TERT endógeno y la actividad telomerasa en una célula diana. La cantidad administrada realmente dependerá del individuo al que se le aplica el tratamiento, y preferiblemente será una cantidad optimizada de tal forma que se consiga el efecto deseado sin efectos secundarios significativos. La dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo de células o en cualquier modelo animal apropiado. El modelo animal también se usa para estimar los intervalos de dosificación y las vías de administración apropiadas en seres humanos. De esta manera, la determinación de una dosis terapéuticamente eficaz está bien dentro de la capacidad de los especialistas en la técnica.
Líneas celulares y animales con secuencias promotoras modificadas
La mayoría de las células de vertebrados presentan senescencia después de un número finito de divisiones en cultivo (\sim 50 a 100 divisiones). Sin embargo, ciertas células variantes pueden dividirse indefinidamente en cultivo (por ejemplo, células HeLa y células 293) y por esta razón son útiles para investigación y aplicaciones industriales. Normalmente, estas líneas de células inmortales proceden de tumores que se producen espontáneamente, o por transformación por exposición a un oncogen, radiación o un virus o agente químico inductor de tumores. Desafortunadamente, se dispone de una selección limitada de líneas celulares, especialmente de líneas celulares humanas que representan una función celular diferenciada. Además, muchas líneas de células inmortales disponibles actualmente se caracterizan por anormalidades cromosómicas (aneuploidía, redisposiciones de genes o mutaciones). Además, muchas líneas de células establecidas desde hace mucho tiempo están relativamente indiferenciadas. De esta manera, existe la necesidad de composiciones activadoras del promotor de TERT y métodos de la invención para generar nuevas líneas de células inmortales, especialmente usando células de origen humano, donde se prefieren los métodos y composiciones de activación del promotor de hTERT.
Las "células inmortalizadas" de la invención no se limitan a las que proliferan indefinidamente, sino que también incluyen células con una mayor capacidad de proliferación en comparación con células similares cuyo promotor de TERT no se ha regulado positivamente. Dependiendo del tipo celular, una mayor capacidad proliferativa puede significar la proliferación durante al menos aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200 o aproximadamente 400 o más generaciones, o durante al menos aproximadamente 3, aproximadamente 6, aproximadamente 12, aproximadamente 18, aproximadamente 24 o aproximadamente 36 o más meses en cultivo.
Los usos de células con mayor capacidad de proliferación incluyen la producción de proteínas naturales y proteínas recombinantes (polipéptidos terapéuticos tales como eritropoyetina, hormona de crecimiento humana, insulina y similares) o anticuerpos, para lo que se prefiere una línea de células genéticamente normales estable. Otro uso es para el reemplazo de células o tejidos enfermos o lesionados. Por ejemplo, pueden usarse células inmunes autólogas inmortalizadas usando una secuencia del promotor de TERT de la invención para el reemplazo de células en un paciente después de una terapia agresiva contra el cáncer, tal como irradiación del cuerpo entero. Otro uso para las células inmortalizadas es para la producción ex vivo de tejidos u órganos "artificiales" para uso terapéutico. Otro uso para tales células es para la selección o validación de fármacos, tales como fármacos inhibidores de telomerasa, o para uso en la producción de vacunas o reactivos biológicos. Otros usos de las células de la invención serán evidentes para los especialistas.
La invención también proporciona animales transgénicos no humanos que comprenden TERT heterólogo o construcciones recombinantes que comprenden el promotor de TERT endógeno. En una realización preferida, los animales transgénicos de la invención comprenden un promotor de TERT que dirige un gen heterólogo, tal como una secuencia codificante de un gen indicador. En una realización preferida, un promotor de hTERT de la invención está unido operativamente a un gen indicador en un ratón transgénico. Como alternativa, un promotor de mTERT está unido operativamente a un gen indicador en un ratón transgénico. Estos animales transgénicos son muy útiles como modelos animales in vivo para seleccionar moduladores de la actividad transcripcional de TERT. La introducción de hTERT y mTERT u otros promotores de TERT en animales para generar modelos transgénicos también se usa para evaluar las consecuencias de mutaciones o deleciones en las regiones reguladoras de la transcripción.
En una realización, el gen de TERT endógeno en estos ratones aún es funcional y aún puede existir actividad telomerasa de tipo silvestre (nativa). Un promotor de TERT de la invención se usa para dirigir un alto nivel de expresión de una construcción de TERT exógena, y la proteína mTERT producida endógenamente puede reemplazarse competitivamente por la proteína TERT exógena introducida. Este animal transgénico (que retiene una actividad telomerasa endógena funcional) se prefiere en situaciones en las que es deseable retener la función de la telomerasa endógena "normal" y la estructura de los telómeros. En otras situaciones, cuando es deseable que toda la actividad telomerasa se deba a la proteína TERT exógena introducida, puede usarse una línea knockout de mTERT.
La función del promotor, y en una realización preferida la función del promotor de hTERT, puede evaluarse con estos animales transgénicos. Pueden construirse alteraciones de promotores de TERT que dirijan TERT o un gen indicador para evaluar su función, su modelo de expresión y sus características (la invención también proporciona construcciones, animales y métodos para la expresión génica dirigida por un promotor de TERT por transfección transitoria).
En una realización, los promotores de TERT y reactivos de la invención se usan para crear células de ratón y animales transgénicos en los que el promotor de TERT endógeno está delecionado, modificado, suplementado o inhibido. Por ejemplo, las secuencias del promotor de TERT pueden estar delecionadas, modificadas o inhibidas en uno o los dos alelos. Las células o animales pueden reconstituirse con un promotor de TERT modificado o de tipo silvestre, o en una realización preferida, un TERT exógeno en forma de hTERT.
La construcción de una célula y un animal "knockout" se basa en la premisa de que el nivel de expresión de un gen particular en una célula de mamífero puede reducirse o anularse completamente por medio de la introducción en el genoma de una nueva secuencia de ADN que sirve para romper alguna parte de la secuencia de ADN del gen/promotor a suprimir. Para prevenir la expresión del promotor endógeno, pueden ser adecuadas mutaciones simples que alteran o rompen el promotor. Para regular positivamente la expresión, un promotor de TERT nativo puede substituirse por un promotor de TERT heterólogo o mutado que induce mayores niveles de transcripción, o por múltiples copias de promotores de TERT transgénicos. Además, puede usarse una "inserción de trampas génicas" para romper un gen del hospedador, y pueden usarse células madre embrionarias (ES) de ratón para producir animales transgénicos knockout, como se describe en este documento y en Holzschu (1997) Transgenic Res 6: 97-106.
La invención también proporciona vectores diseñados específicamente para la integración por recombinación homóloga que comprenden secuencias del promotor de TERT. Los factores importantes para optimizar la recombinación homóloga incluyen el grado de identidad de secuencia y la longitud de homología con secuencias cromosómicas. También es importante la secuencia específica que media la recombinación homóloga, porque la integración se produce mucho más fácilmente en ADN activo transcripcionalmente. Mansour (1988) Nature 336; 348; Bradley (1992) Bio/Technology 10:534; y las Patentes de Estados Unidos 5.627.059; 5.487.992; 5.631.153; y 5.464.764, describen métodos y materiales para construir construcciones de dirección homólogas.
En una realización preferida, los modelos de células y animales transgénicos expresan el promotor de TERT (particularmente, el promotor de hTERT) unido operativamente a un gen indicador. La célula o animal puede ser un promotor de TERT "knockout" o puede retener la actividad del promotor de TERT endógeno. La inserción de la secuencia exógena que contiene el promotor de TERT típicamente es por recombinación homóloga entre secuencias de ácidos nucleicos complementarias. De esta manera, la secuencia exógena, que típicamente es un promotor de hTERT o mTERT de esta invención, es alguna parte del gen diana a modificar, tal como un exón, intrón o secuencias reguladoras de la transcripción, o cualquier secuencia genómica que pueda afectar al nivel de expresión del gen diana; o una combinación de los mismos. La construcción también puede introducirse en otras localizaciones en el genoma. La dirección de genes a través de recombinación homóloga en células madre embrionarias pluripotenciales permite modificar de forma precisa la secuencia genómica de interés.
En otra realización, la secuencia del promotor de TERT introducida (modificada o de tipo silvestre) puede reemplazar o alterar una secuencia del promotor de TERT endógeno. Una secuencia del promotor de TERT recién introducida puede modificarse por ingeniería genética para tener una mayor o menor actividad de transcripción, o para responder a nuevos agentes moduladores de la transcripción de actuación trans, y similares.
La alteración de una secuencia del promotor de TERT endógeno típicamente reducirá o anulará ("knockout") la transcripción de TERT. En una realización, el promotor de TERT "knockout" se prepara por deleción o alteración por recombinación homóloga del promotor de hTER endógeno. En Moynahan (1996) Hum. Mol. Genet. 5:875; Moynahan (1996) Hum. Mol. Genet. 5:875; Baudin (1993) Nucl. Acids. Res. 21:3329; Wach (1994) Yeast 10:1793; Rothstein (1991) Methods Enzymol. 194:281; Anderson (1995) Methods Cell Biol. 48:31; Pettitt (1996) Development 122:4149-4157; Ramirez-Solis (1993) Methods Enzymol. 225:855; Thomas (1987) Cell 51:503; Couldrey (1998) Dev. Dyn. 212:284-292). Holzschu (1997) Transgenic Res 6:97-106; en las Patentes de Estados Unidos 5.464.764; 5.631.153; 5.487.992, 5.627.059 y 5.272.071; y en los documentos WO 91/09955; WO 93/09222; WO 96/29411; WO 95/31560; y WO 91/12650, se describe la recombinación homóloga y otros medios para alterar (y "knockout") la expresión de secuencias endógenas. Los vectores útiles en la terapia con el gen TERT pueden ser virales o no virales. Pueden comprender otras secuencias reguladoras o de procesamiento. Lyddiatt (1998) Curr Opin Biotechnol 9: 177-85.
La invención proporciona medios para la liberación de los sistemas de expresión en células o tejidos in vitro o ex vivo. Para la terapia ex vivo, pueden introducirse vectores en células recogidas del paciente y propagarse clonalmente para el transplante autólogo de nuevo en el mismo paciente (Patentes de Estados Unidos Nº. 5.399.493 y 5.437.994. Las células que pueden ser la diana para la terapia génica con el promotor de TERT destinadas a aumentar la actividad telomerasa de una célula diana incluyen, pero sin limitación, células madre embrionarias o células germinales, particularmente células de primate o humanas, células madre hematopoyéticas (SIDA y después de quimioterapia), células del endotelio vascular (enfermedades cardíacas y cerebrovasculares), fibroblastos de la piel y queratinocitos basales de la piel (curación de heridas y quemaduras), condrocitos (artritis), astrocitos cerebrales y células de microglia (enfermedad de Alzheimer), osteoblastos (osteoporosis), células de la retina (enfermedades oftálmicas) y células de los islotes pancreáticos (diabetes de tipo I).
La secuencia exógena típicamente se inserta en una construcción, normalmente también con un gen marcador para ayudar a la detección de la construcción knockout y/o un gen de selección. La construcción knockout se inserta en una célula, típicamente una célula madre embrionaria (ES), normalmente por recombinación homóloga. La célula transformada resultante puede ser un solo gen knockout (un haplotipo) o un gen doble (homocigoto) knockout. La construcción knockout puede integrarse en una o varias localizaciones del genoma celular debido a la naturaleza aleatoria de los acontecimientos de recombinación homóloga; sin embargo, la recombinación no se produce entre regiones de complementariedad de secuencia. Típicamente, menos de un uno a un cinco por ciento de las células ES que captan la construcción knockout integrarán realmente el ADN exógeno en estas regiones de complementariedad; de esta manera, normalmente es necesaria la identificación y selección de las células con el fenotipo deseado y normalmente se incorpora una secuencia de selección o marcadora en la construcción para este fin. Las células que han incorporado la construcción se seleccionan antes de insertar la célula manipulada genéticamente en un embrión en desarrollo; por ejemplo, las células se someten a selección positiva (usando, por ejemplo, G418, para seleccionar con respecto a la resistencia a neomicina) y selección negativa (usando, por ejemplo, FIAU para excluir las células que carecen de timidina quinasa). Las técnicas de selección y de marcaje incluyen selección por resistencia a antibióticos o expresión del marcador \beta-galactosidasa como se describe en otras partes de esta descripción.
Después de la selección de las células manipuladas con el fenotipo deseado, tal como una incapacidad completa o parcial de expresar el promotor de TERT endógeno, o la expresión del promotor de TERT endógeno (como actividad del promotor de hTERT), las células se insertan en un embrión de ratón. La inserción puede realizarse por una diversidad de técnicas tales como microinyección, en la que se recogen de aproximadamente 10 a 30 células en una micropipeta y se inyectan en embriones que están en la fase apropiada de desarrollo para integrar la célula ES en el blastocisto embrionario en desarrollo, aproximadamente en la fase de ocho células, que para el ratón es aproximadamente 3,5 días después de la fertilización. Los embriones se obtienen por perfusión del útero de hembras preñadas. Después de haber introducido la célula ES en el embrión, se implanta en el útero de una madre de acogida seudopreñada, que típicamente se prepara por apareamiento con machos vasectomizados de la misma especie. En ratones, el tiempo óptimo para el implante es de aproximadamente dos a tres días de seudoembarazo. La descendencia se selecciona con respecto a la integración de las secuencias de ácido nucleico de TERT y el fenotipo de actividad del promotor modificada. Las crías que tienen el fenotipo deseado se cruzan entre sí para generar un knockout homocigoto. Si no está claro si las células de la línea germinal de la descendencia tienen el promotor modificado, pueden cruzarse con un parenteral u otra cepa y la descendencia seleccionarse con respecto a la heterocigosidad del rasgo deseado. Los heterocigotos pueden cruzarse entre sí para producir ratones homocigotos para la secuencia genómica de TERT modificada. Bijvoet (1998) Hum. Mol. Genet. 7:53-62; Moreadith (1997) J. Mol. Med. 5:208-216; Tojo (1995) Cytotechnology 19:161-165; Mudgett (1995) Methods Mol. Biol. 48:157-184; Longo (1997) Transgenic Res. 6:321-328; Patente de Estados Unidos Nº 5.616.491 (Mak, et al.); 5.464.764; 5.631.153; 5.487.992; 5.627.059; 5.272.071; y documentos WO 91/09955, WO 93/09222, WO 96/29411, WO 95/31560 y WO 91/12650. De esta manera, la invención proporciona medios para el uso de los reactivos que contienen la secuencia del promotor de TERT de la invención para producir animales y células de ratón "knockout", animales transgénicos y su progenie. Estas células y animales pueden reconstituirse adicionalmente con el promotor de mTERT endógeno de tipo silvestre o modificado o un promotor de TERT exógeno, tal como hTERT.
La presente invención también proporciona métodos y reactivos para el análisis de cariotipos, detección de amplificación de genes, u otros análisis cromosómicos usando sondas que comprenden las secuencias del promotor de TERT de la invención. En diversas realizaciones, se detectan amplificaciones (cambios en el número de copias), deleciones, inserciones, substituciones o cambios en la localización cromosómica (translocaciones) de genes que contienen el promotor de TERT. Estos acontecimientos pueden correlacionarse con la presencia de un estado patológico o una predisposición a desarrollar un estado patológico (tal como un cáncer). De esta manera, esta información puede usarse para un diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, un acontecimiento de translocación podría indicar que la activación de la expresión de TERT se produce en algunos casos reemplazando todo o parte del promotor de TERT por otro elemento promotor que dirige la transcripción de TERT de una manera inapropiada. Además, los métodos y reactivos de la invención pueden usarse para inhibir esta activación de TERT inapropiada.
La determinación de la localización cromosómica de la secuencia del promotor de TERT también puede ser útil para el análisis de la represión del gen TERT en células somáticas normales, por ejemplo, si la localización es parte de una heterocromatina que no se expresa. En Wu (1979) Cell 16:797; Groudine (1982) Cell 30:131; Gross (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:159 se describen ensayos de hipersensibilidad a nucleasas para distinguir la heterocromatina y la eucromatina. En Pinkel (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85:9138: Pub EPO Nº 430.402; Choo, ed., Methods In Molecular Biology Vol. 33: In Situ Hybridization Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1994; Kallioniemi (1992) Science 258:818) se describen métodos para analizar el cariotipo.
Proteínas de unión al promotor de TERT y factores de regulación de la transcripción
Además de las nuevas secuencias del promotor de TERT y la identificación de las secuencias reguladoras de la transcripción de actuación cis contenidas en dichas secuencias, la invención proporciona nuevos sistemas de ensayo in vitro e in vivo basados en células para seleccionar proteínas de unión al promotor de TERT (factores reguladores de la transcripción de actuación trans) usando los ácidos nucleicos de la invención. Se dispone de muchos ensayos que seleccionan proteínas de unión a ácidos nucleicos y todos pueden adaptarse y usarse con las nuevas secuencias de TERT proporcionadas por la invención.
Una realización de la invención proporciona un método para seleccionar y aislar un compuesto de unión al promotor de TERT poniendo en contacto una secuencia del promotor de TERT de la invención (particularmente, una secuencia reguladora de actuación cis identificada) con un compuesto de ensayo y midiendo la capacidad del compuesto de ensayo de unirse al ácido nucleico seleccionado. El compuesto de ensayo puede ser cualquier agente capaz de unirse específicamente a una actividad promotora de TERT, incluyendo compuestos disponibles en bibliotecas combinatorias, un extracto celular, un extracto nuclear, una proteína o un péptido. Si el objetivo de la búsqueda es una proteína activadora de la transcripción de TERT, típicamente se elige una célula con actividad telomerasa.
Pueden usarse diversas técnicas para identificar péptidos que se unen específicamente al promotor de TERT, por ejemplo, ensayos de unión al ADN con cambio de movilidad, ensayos de metilación e interferencia de uracilo, análisis de DNasa y de huellas de radicales hidroxilo, polarización de fluorescencia y reticulación UV o agentes de reticulación químicos. Como visión de conjunto, véase Ausubel (capítulo 12, DNA-Protein Interactions). Una técnica para aislar proteínas de coasociación, incluyendo proteínas de unión a ácidos nucleicos y ADN/ARN, incluye el uso de reticulación UV o de agentes de reticulación química, incluyendo los agentes de reticulación escindibles ditiobis(succinimidilpropionato) y 3,3'-ditiobis(sulfosuccinimidil-propionato). McLaughlin (1996) Am. J. Hum. Genet. 59:561-569; Tang (1996) Biochemistry 35:8216-8225; Lingner (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 93:10712; Chodosh (1986) Mol. Cell. Biol. 6:4723-4733. En muchos casos hay una alta probabilidad de que una proteína específica (o una proteína relacionada) pueda unirse a una secuencia del promotor de hTERT, tal como Myc, NF-kappa B, EF2, Sp1, AP-1 o el sitio de unión a la caja CAAT. En estos escenarios, donde un anticuerpo ya puede estar disponible o puede generarse fácilmente, puede usarse un análisis de co-inmunoprecipitación para identificar y aislar factores de actuación trans que se unen al promotor de TERT. El factor de actuación trans puede caracterizarse por análisis de la secuencia peptídica. Una vez identificada, la función de la proteína puede confirmarse, por ejemplo, por experimentos de competición, experimentos de reducción de factores usando un anticuerpo específico para el factor o por competición con un factor mutante.
Como alternativa, pueden generarse columnas de afinidad del promotor de TERT para seleccionar proteínas de unión a TERT potenciales. En una variación de este ensayo, se biotinilan subsecuencias del promotor de TERT, se hacen reaccionar con una solución que se sospecha que contiene una proteína de unión, y después se hacen reaccionar con una columna de afinidad de estreptavidina para aislar el ácido nucleico o el complejo de proteína de unión (Grabowski (1986) Science 233:1294-1299; Chodosh (1986) supra). El promotor -proteína de unión después puede eluirse convencionalmente y aislarse. El ensayo de unión de proteínas al ADN con cambio de movilidad usando electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) no desnaturalizante es un método extremadamente rápido y sensible para detectar la unión específica de un polipéptido a un ADN (Chodosh (1986) supra, Carthew (1985) Cell 43:439-448; Trejo (1997), J. Biol. Chem. 272:27411-27421; Bayliss (1997) Nucleic Acids Res. 25:3984-3990).
Pueden usarse ensayos de interferencia y DNasa y huellas de radicales hidroxilo para identificar restos específicos en el sitio de unión entre la proteína y el ácido nucleico. Bi (1997) J. Biol. Chem. 272:26562-26572; Karaoglu (1991) Nucleic Acids Res. 19:5293-5300. La polarización fluorescente es una técnica poderosa para caracterizar asociaciones macromoleculares y puede proporcionar determinaciones en equilibrio de interacciones de proteína-ADN y proteína-proteína. Esta técnica es particularmente útil (y está mejor adecuada que los métodos electroforéticos) para estudiar interacciones de proteína-proteína de baja afinidad. Lundblad (1996) Mol. Endocrinol 10:607-612.
Las proteínas identificadas por estas técnicas pueden separarse adicionalmente basándose en su tamaño, carga superficial neta, hidrofobia y afinidad por ligandos. Además, pueden conjugarse anticuerpos inducidos contra tales proteínas con matrices de columna y las proteínas pueden inmunopurificarse de acuerdo con métodos bien conocidos. Scopes, R. K., Protein Purification: Principles and Practice, 2ª ed. Springer Verlag, (1987).
Las secuencia reguladora de la transcripción identificada por comparación de las secuencias de hTERT y mTERT incluyen los factores de actuación trans c-Myc, SP1, SRY, HNF-3\beta, HNF-5, TFIID-MBP, E2F y c-Myb. La tabla 1 muestra otras secuencias reguladoras de la transcripción que se han identificado cadena arriba de la región codificante de TERT por comparación de la secuencia de hTERT con motivos reguladores conocidos. Estos elementos son de interés en la regulación de la transcripción en los tipos celulares donde están presentes los factores que se unen a estos elementos.
TABLA 1 Elementos de reconocimiento supuestos cadena arriba de la región codificante de hTERT
1
2
3
Los ejemplos y la elaboración detallada proporcionada en esta descripción tienen fines ilustrativos y no pretenden limitar la invención. Los especialistas en la técnica podrán realizar modificaciones que se incluyen dentro del espíritu de esta solicitud y del alcance las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos Ejemplo 1 Clonación de \lambdaG\varphi5 y caracterización se secuencias genómicas de hTERT
El siguiente ejemplo detalla la clonación de promotor de hTERT humano. Se seleccionó una biblioteca de ADN genómico humano por PCR e hibridación para identificar un clon genómico que contuviera secuencias codificantes de ARN de hTERT. La biblioteca era una biblioteca genómica de fibroblastos humanos obtenida usando ADN de fibroblastos pulmonares W138 (Stratagene, Nº de cat. 946204). En esta biblioteca de fibroblastos, se unieron fragmentos Sau3AI parciales en el sitio XhoI de un vector de clonación de fago comercial, el vector Lambda FSX® (Stratagene, San Diego, CA) variando los tamaños de los insertos de aproximadamente 9 kilobases (kb) a 22 kb.
La biblioteca genómica se dividió en grupos de 150.000 fagos cada uno. Cada conjunto se seleccionó por PCR anidada, con el par de cebadores externos TCP1.52 y TCP1.57; y el par interno TCP1.49 y TCP1.50. Estos pares de cebadores abarcan un supuesto intrón en el ADN genómico de hTERT y aseguraban que el producto de PCR procedía de una fuente genómica y no de la contaminación por el clon de ADNc de hTERT. Los grupos positivos se subdividieron adicionalmente hasta que se obtuvo un conjunto de 2000 fagos. Este conjunto se cultivó en placas a una baja densidad y se seleccionó por hibridación con un fragmento de ADN que comprendía una subserie de ADNc de hTERT, generado por digestión de restricción con SphI y EcoRV.
Se aislaron dos clones positivos y se reseleccionaron mediante PCR anidada. En la reselección, los dos clones fueron positivos por PCR. Uno de los clones del fago lambda (denominado "Gphi5" o "\lambdaG\varphi5") se digirió con NotI, revelando un tamaño de inserto de aproximadamente 20 kb. El posterior mapeo indicó que el tamaño del inserto era de 15 kb y que el fago \lambdaG\varphi5 contiene aproximadamente 13 kb de ADN cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción (cadena arriba de la secuencia de ADNc).
La figura 1 muestra la estructura del fago \lambdaG\varphi5 mapeado por digestión con enzimas de restricción y secuenciación del ADN.
Aislamiento, subclonación y secuenciación del inserto de hTERT genómico
El ADN del fago se digirió con NcoI. Este fragmento se clonó en el plásmido pBBS167. Los subclones resultantes se seleccionaron por PCR para identificar los que contenían secuencias correspondientes a la región 5' de ADNc de hTERT. Un subclon (plásmido "pGRN140") que contenía un fragmento NcoI de 9 kb (con la secuencia del gen hTERT y de aproximadamente 4 a 5 kb de la secuencia del vector lambda) se secuenció parcialmente para determinar la orientación del inserto. pGRN140 se digirió usando SalI para retirar las secuencias del vector lambda, denominándose el plásmido resultante (con las secuencias lambda retiradas) pGRN144. Después se secuenció el inserto de
pGRN144.
En el sitio NotI del plásmido pBBS185 se insertó un fragmento NotI de \lambdaG\varphi5 (que contenía el inserto genómico completo de aproximadamente 15 kpb incluyendo la región del promotor del gen hTERT). Se aislaron dos plásmidos con sus insertos respectivos orientados en direcciones opuestas. Uno tuvo el inserto orientado con la fase de lectura abierta (ORF) de hTERT en la misma orientación que el promotor Lac del plásmido, denominado pGRN 142; el segundo se denominó pGRN 143.
La SEC ID Nº: 1 es una lista de los datos de secuencia obtenidos a partir del plásmido pGRN 142. Los nucleótidos 1-43 y 15376-15418 son secuencias plasmídicas. De esta manera, el inserto genómico empieza en el resto 44 y termina en el resto 15375. El principio del fragmento de ADNc clonado corresponde al resto 13490. Hay elementos de secuencia Alu localizados \sim 1700 pares de bases cadena arriba. La secuencia del inserto de hTERT de pGRN 142 ahora puede obtenerse en el GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) con el acceso PGRN142.INS AF 121948.
La numeración de los restos de hTERT para los plásmidos en los siguientes ejemplos empieza en el codón de inicio de la traducción, de acuerdo con la práctica convencional en el campo. El codón ATG de hTERT (el sitio de inicio de la traducción) comienza en el resto 13545 de la SEC ID Nº: 1. De esta manera, la posición -1, el primer resto cadena arriba, corresponde al nucleótido 13544 en la SEC ID Nº: 1.
Ejemplo 2 Construcciones de indicador dirigido por el promotor de TERT
Este ejemplo describe la construcción de plásmidos en los que genes indicadores están unidos operativamente a secuencias del promotor de hTERT de la invención. Esto también ilustra cómo la secuencia del promotor de TERT de la invención puede unirse operativamente de forma análoga a secuencias heterólogas, tales como secuencias que codifican polipéptidos, para la expresión en células y tejidos in vitro e in vivo y en animales transgénicos. Como será evidente para un especialista en la técnica, pueden usarse técnicas tales como las ilustradas en estos ejemplos para ensayar otras secuencias candidatas con respecto a su capacidad de promover específicamente la transcripción en células que expresan TERT.
Los vectores indicadores unidos a hTERT de la invención tienen numerosos usos, incluyendo la identificación de secuencias de actuación cis y de factores reguladores de la transcripción de actuación trans específicos. De forma importante, estas construcciones de indicadores que contienen hTERT pueden usarse para la selección de agentes capaces de modular (es decir, activar o inhibir) la transcripción de hTERT. Estos estudios pueden realizarse in vitro e in vivo.
Se conocen varios genes indicadores, tales como la luciferasa de luciérnaga, \beta-glucuronidasa, \beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa y GFP, y pueden unirse operativamente al promotor de hTERT. En este ejemplo, se usó la fosfatasa alcalina secretada humana (SEAP; GlonTech). El gen indicador de SEAP codifica una forma truncada del enzima placentario que carece del dominio de anclaje a la membrana, permitiendo de esta manera que la proteína se secrete eficazmente desde las células transfectadas. Se ha demostrado que los niveles de actividad SEAP detectados en el medio de cultivo son directamente proporcionales a cambios en las concentraciones intracelulares de ARNm y de la proteína SEAP. El ensayo de SEAP basado en quimioluminiscencia es aproximadamente 10 veces más sensible que ensayos similares que usan luciferasa de luciérnaga como enzima indicador. La actividad SEAP también puede ensayarse con un substrato fluorescente, que proporciona una sensibilidad comparable a la de la luciferasa. Berger (1988) Gene 66:1; Cullen (1992) Meth. Enzymol. 216:362; Yang (1997) Biotechniques 23:1110-1114.
Las secuencias de intrones y 5' cadena arriba de hTERT tienen actividad "promotora"
Ciertos experimentos realizados con construcciones de indicadores que comprendían diversas secuencias de hTERT de la invención identificaron regiones de actuación cis con actividad activadora de la transcripción "promotora" tanto en secuencias 5' cadena arriba como en secuencias de intrones. En resumen, se construyeron cuatro construcciones, pGRN148, pGRN150, "pSEAP 2 basic" (sin secuencias promotoras = control negativo) y "pSEAP control" (que contiene el promotor temprano y el potenciador de SV40) y se utilizaron para transfectar por triplicado células mortales e inmortales.
La figura 2 muestra el plan para la construcción del plásmido pGRN148. En resumen, se digirió un fragmento Bgl2-Eco47III de pGRN144 (descrito anteriormente) y se clonó en el sitio BglII-NruI de pSeap2Basic (ClonTech, San Diego, CA). Se obtuvo un segundo indicador-promotor, el plásmido pGRN150, insertando el fragmento BglII-FspI de pGRN144 en los sitios BglII-NruI de pSEAP2. El plásmido pGRN173 se construyó usando el fragmento EcoRV-StuI de pGRN144. De esta forma se obtiene un plásmido promotor-indicador que contiene la región promotora de hTERT desde aproximadamente 2,5 kb cadena arriba del inicio de la ORF de hTERT hasta justo después del primer intrón dentro de la región codificante. La Met de iniciación se mutó a Leu, de forma que el segundo ATG después de la región promotora sería el ATG de iniciación de la ORF de SEAP.
El uso de la secuencia del intrón permite la identificación de secuencias reguladoras que pueden estar presentes en el intrón (la invención proporciona secuencias reguladoras de la transcripción de cualquier porción de la secuencia genómica de hTERT). Además de las construcciones de indicador de pSEAP derivadas de hTERT, se usaron un vector de control positivo y un vector de control negativo. El control negativo (pSEAP2-Basic) se necesita para determinar la señal de fondo asociada con el esqueleto de ADN del vector. Se necesita un control positivo para confirmar la transfección y expresión del ADN exógeno y para verificar la presencia de SEAP activa en el medio de cultivo. El control positivo es el vector de control pSEAP-2 (ClonTech) que contiene el gen estructural de SEAP bajo el control de la transcripción del promotor y potenciador de SV40.
Tres construcciones, el control, pGRN148 (que incluye secuencias del promotor 5' de hTERT) y pGRN150, se introdujeron por transfección en una línea de células mortales, células BJ, una línea de fibroblastos de prepucio humano, Feng (1995) Science 269:1236; y una línea de células inmortales, la línea de riñón embrionario humano 293; Graham (1977) J. Gen. Virol. 36:59. Todas las transfecciones se realizaron en paralelo con los dos plásmidos de control.
En las células inmortales, las construcciones pGRN148 y pGRN150 parecen dirigir la expresión de SEAP tan eficazmente como el control positivo pSEAP2 (que contenía el promotor temprano y el potenciador de SV40). Por el contrario, en las células mortales sólo el control pSEAP2 proporcionó una actividad detectable. Se obtuvieron resultados similares usando otra línea de células normales (RPE, o células epiteliales pigmentarias de retina; Aronson (1983) In vitro 19:642-650). En las células RPE transfectadas con pGRN150, la región del promotor de hTERT era inactiva, mientras que el plásmido de control pSEAP2 era activo. Estos resultados indican que, como era de esperar, las secuencias del promotor de hTERT son activas en células tumorales pero no en células mortales.
Identificación de los elementos de especificidad de tejidos del promotor de hTERT
Las secuencias de ADN del promotor de hTERT se clonaron en el vector indicador de transcripción pSEAP2-Basic (ClonTech) para generar los plásmidos pGRN 148, 150, 175, 176, 181, 184, 261, 262 y 319. Más adelante se resumen los detalles de la construcción de los plásmidos de promotores (los números de nucleótidos se refieren al número de nucleótidos cadena arriba del sitio de inicio de la traducción en 13545 de la SEC ID Nº: 1):
pEGFP-1. * Vector de ClonTech que contiene la proteína fluorescente verde potenciada.
pGRN140. * Fragmento NCO1 que contiene secuencias cadena arriba de hTERT y el primer intrón de hTERT
de \lambdaG\varphi5 en el sitio NCO1 de un pBBS167 (variante del vector de clonación pUC19 con MCS, por ejemplo
ATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCCCATGG CAGGCCTCG CGCGCGAGATCTCGGGCCCAATCGATGCCGCGGCGATATCGCTCGAGGAAGCTTGGCACT
GGCC (SEC ID Nº: 3) y un gen sensible al cloranfenicol entre el F1ori y el gen Amp en orientación opuesta a la del gen Amp). El fragmento está orientado de forma que las secuencias de hTERT están en la misma dirección que el promotor Lac.
pGRN144; descrito anteriormente; deleción con SalI de pGRN140 para retirar las secuencias del fago (lambda).
pGRN148: * fragmento BGL2-ECO47III de pGRN144 que contiene secuencias cadena arriba de hTERT (desde la posición -51 a -2482) en los sitios BGL2-NRU1 de pSEAP2-Basic para obtener un plásmido de promotor de hTERT/indicador.
pGRN150: * fragmento de BGL2-FSP1 de pGRN144 que contiene 2447 nucleótidos de secuencias cadena arriba de hTERT (desde la posición -36 a -2482) en los sitios BGL2-NRU1 de pSEAP2 para obtener un plásmido de promotor de hTERT/indicador.
pGRN175: * religadura de APA1 (romo de Klenow)-SRF1 de pGRN150 para delecionar la mayor parte de las secuencias cadena arriba de hTERT. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que usa 82 nucleótidos de las secuencias cadena arriba de hTERT (desde la posición -36 a -117).
pGRN176: * religadura de PML1-SRF1 de pGRN150 para delecionar la mayor parte de las secuencias cadena arriba de hTERT. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que usa 204 nucleótidos de las secuencias cadena arriba de hTERT (desde la posición -36 a -239).
pGRN185: * digestión con APA1 y religadura de pGRN150 para delecionar todos los sitios APA1 excepto uno. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que comprende desde la posición -36 a -114 y desde la posición -1076 a -2482 de las secuencias cadena arriba de hTERT.
pGRN184: * digestión con XBA1 (parcial, relleno de Klenow)-ECOR1 y religadura de pGRN150 para obtener una deleción de las secuencias del promotor de hTERT. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que expresa una región de -1391 a -2484 de las secuencias cadena arriba de hTERT.
pGRN213. * fragmento FSP1 que contiene gen CatS y el F1 ORI más parte de gen AmpR en los sitios FSP1 de pSEAP-Basic de tal forma que la orientación reconstruye el gen AmpR.
pGRN244: * fragmento SAL1-NOT1 de pSEAP-Basic que contiene la región SEAP en los sitios SAL1-NOT1 de pEGFP-1. Esta modificación añade un marcador selectivo al vector.
pGRN245: * fragmento SAL1-NOT1 de pGRN176 que contiene el promotor de hTERT/región SEAP en los sitios SAL1-NOT1 de pEGFP-1. Esta modificación añade un marcador selectivo dominante al vector.
pGRN246: * fragmento SAL1-NOT1 de pGRN176 que contiene el promotor de hTERT/región SEAP en los sitios SAL1-NOT1 de pEGFP-1. Esta modificación añade un marcador selectivo dominante al vector.
pGRN248: * fragmento SAL1-NOT1 de pGRN175 que contiene el promotor de hTERT/región SEAP en los sitios SAL1-NOT1 de pEGFP-1. Esta modificación añade un marcador selectivo dominante al vector.
pGRN259: * mutagénesis in vitro usando RA94 (CCCGGCCACCCCCGCGAattCGCGCGCTCCCCGCTGC) (SEC ID Nº: 4) para introducir un sitio EcoRI en la Met de iniciación de hTERT en pGRN144. Esto proporciona secuencias de hTERT desde +1 a -2482 que pueden clonarse en un vector usando EcoRI y BglII.
pGRN260: * mutagénesis in vitro usando RA91 (TTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGcatgcTACG
TAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAAT) (SEC ID Nº: 5) para delecionar varios sitios de la región de cloranfenicol de pGRN213 para crear una MCS variante más útil. Esto crea una versión de mutagénesis de pSEAP2-Basic con más sitios de clonación únicos en su MCS.
pGRN261: * fragmento BGL2-ECOR1 de pGRN259 que contiene secuencias cadena arriba de hTERT en los sitios BGL2-ECOR1 de pSEAP2-Basic. Eso hace que se obtenga un plásmido de expresión de promotor/indicador que contiene de +1 a -2482 de las secuencias cadena arriba de hTERT.
pGRN262: * fragmento BGL2-ECOR1 de pGRN259 que contiene secuencias cadena arriba de hTERT en los sitios BGL2-ECOR1 de pGRN260. Esto hace que se obtenga un plásmido de expresión y mutagénesis de promotor/indicador que contiene desde +1 a -2482 de las secuencias cadena arriba de hTERT.
pGRN294. * fragmento BbsI-Xhol de pGRN142 que contiene secuencias cadena arriba de hTERT desde -1667 a -3278 en los sitios BbsI-XhoI de pGRN259. Esto hace que se obtenga un vector que contiene la región genómica cadena arriba para hTERT desde +1 a -3278 que puede clonarse con EcoRI y XhoI.
pGRN295: * fragmento ECOR1-XHO1 de pGRN294 que contiene desde +1 a -3282 de secuencias cadena arriba de hTERT en los sitios ECOR1-XHO1 de pGRN260. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor de SEAP/indicador/mutagénesis.
pGRN296: * fragmento ECOR1-XHO1 de pGRN294 que contiene desde +1 a -3282 de las secuencias cadena arriba de hTERT en los sitios ECOR1-XHO1 de pSEAP2- Basic. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor de SEAP/indicador.
pGRN297: * RA96 (AATTGCGAAGCTTACG) (SEC ID Nº: 6) Y RA97 (AATTCGTAAGCTTCGC) (SEC ID Nº: 7) templados para obtener un enlazador oligonucleotídico en los sitios ECOR1 de pGRN259 que reemplaza el fragmento ECOR1 de la región de intrón/exón de pGRN259.
pGRN299: * fragmento XHO1-HIND3 de pGRN298 que contiene de +1 a -3282 de las secuencias cadena arriba de hTERT en los sitios XHO1-HIND3 de pGL2-Basic. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor de luciferasa/indicador con aproximadamente 3,3 kb de secuencias del promotor de hTERT.
pGRN300: * fragmento XHO1-SAC1 de pGRN142 que contiene secuencias cadena arriba de hTERT en los sitios XHO1-SAC1 de pGRN299 de tal forma que la construcción resultante contiene de +1 a -5124 de las secuencias cadena arriba de hTERT. Esto crea una construcción de promotor de hTERT/indicador usando luciferasa como indicador.
pGRN310: * fragmento SAC1 de pGRN142 que contiene secuencias cadena arriba de hTERT en el sitio SAC1 de pGRN300 de tal forma que la construcción resultante contiene desde la posición +1 a –7984 de las secuencias cadena arriba de hTERT. Esto crea una construcción de promotor de hTERT/indicador usando luciferasa como indicador.
pGRN311: * fragmento SPE1 de pGRN142 que contiene desde la posición -4773 a -13501 de las secuencias cadena arriba de hTERT en el sitio SPE1 de pGRN300 de tal forma que la orientación reconstruye la región genómica. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador de luciferasa que contiene la región genómica cadena arriba de pGRN142 entera de hTERT más una región de 365 pb de ADN genómico de la mitad de la región genómica de 13,5 kb repetida cadena arriba del promotor de T7.
pGRN312: * fragmento BGL2-FSP1 de pGRN144 en los sitios BGL2-HIND3 (rellenos con Klenow) de pGL2-Basic. Esto hace que se obtenga una versión de promotor/indicador de luciferasa de pGRN150.
pGRN313: * pGRN311 digerido con KPN1-NOT1 cuyos extremos se han hecho romos con polimerasa de T4 y se ha religado. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador de luciferasa usando desde la posición +1 a -13501 de las secuencias cadena arriba de hTERT.
pGRN316: * oligo RA101 (5'-TAGGTACCGAGCTCTTACGCGTCG TAGCCCCACGTGGCGGAGGGACTGG
GGACCCGGGCA-3') (SEC ID Nº: 8) usado para mutagénesis in vitro para delecionar la secuencia genómica de pGRN262 entre el sitio SRF1 y el primer sitio PML1. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que contiene secuencias cadena arriba de hTERT desde la posición +1 a -239.
pGRN317: * oligo RA100 (5'-TAGGTACCGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCCCTCGCTGGCGTCCCTGCACC
CTGGGAGCGC-3') (SEC ID Nº: 9) usado para mutagénesis in vitro para delecionar la secuencia genómica de pGRN262 entre el sitio SRF1 y cerca del último sitio APA1. Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que contiene secuencias cadena arriba de hTERT desde +1 a -397.
pGRN319: * RA107 (5'-CGTCCTGCTGCGCACtcaGGAAGCCCTGGCCCC-3') (SEC ID Nº: 10) usado para mutagénesis in vitro para inactivar la caja E de clase "B" próxima a la Met de inicio de hTERT en pGRN262. Esto cambia la secuencia CACGTG (SEC ID Nº: 11) a CACTCA (SEC ID Nº: 12). También se usó CD1941 (5'GAT
GAATGCTCATGATTCCGTATGGCA-3') (SEC ID Nº: 13) para cambiar de CatR a CatS introduciendo un sitio BSPH1 y se usó COD2866 (5'-AGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGCGCAAAAACAGGAAGG
CAAAATGCC-3') (SEC ID Nº: 14) para seleccionar de AmpS a AmpR introduciendo un sitio FSP1. En resumen, pGRN319 lleva una mutación en la caja E.
pGRN350: * RA104 (5'-TAGGTACCGAGCTCTTACGCGTGCTAGCCC CTCCCAGCCCCTC CCCTTCCTTTC
CGCGGC-3') (SEC ID Nº: 15) usado para mutagénesis in vitro para delecionar la secuencia genómica de pGRN262 entre el sitio SRF1 y el último sitio APA1 antes del codón ATG de la fase de lectura abierta de hTERT (orf). Esto hace que se obtenga un plásmido de promotor/indicador que contiene secuencias cadena arriba de hTERT desde +1 a
-177.
pGRN351: * fragmento SAC2 de pGRN319 en los sitios SAC2 de pGRN350 de tal forma que se recrea la orf de SEAP. Esto hace que se obtenga una versión "caja E desactivada" de pGRN350.
pGRN352: * RA122 (5'-GACCGCGCTTCCCACtcaGCGGAG GGACTGGGG-3') (SEC ID Nº: 16) usado para mutagénesis in vitro para "desactivar" la penúltima clase de caja E "B" antes del sitio de inicio de la traducción de hTERT.
El plásmido pSEAP2-Basic carece de secuencias promotoras y potenciadoras eucarióticas. Este vector contiene la señal de poliadenilación tardía de SV40 insertada cadena abajo de las secuencias codificantes de SEAP para asegurar un procesamiento apropiado y eficaz del transcrito en células eucariotas. También contiene un bloqueante de la transcripción (TB) sintético, compuesto de sitios de pausa de la transcripción y poliadenilación adyacentes para reducir la transcripción de fondo. Como se ha indicado anteriormente, el gen indicador de SEAP codifica una forma truncada del enzima placentario que carece del dominio de anclaje a la membrana, permitiendo de esta manera que la proteína se secrete eficazmente a partir de las células transfectadas.
Se ha demostrado que los niveles de actividad SEAP detectada en el medio de cultivo son directamente proporcionales a cambios en las concentraciones intracelulares del ARNm de SEAP. El substrato de SEAP quimioluminiscente CSPDTM (ClonTech) se usó para detectar la SEAP secretada. El uso de este substrato permite controlar la expresión del gen indicador de SEAP por medio de ensayos sencillos, sensibles y no radiactivos de actividad fosfatasa secretada. Este ensayo quimioluminiscente puede detectar una cantidad tan pequeña como de 10-13 g de proteína SEAP. El ensayo es lineal en un intervalo de concentraciones de enzima de 104 veces. Esto hace que el ensayo (y estos vectores) sea articularmente adecuado para análisis comparativos.
Además de las construcciones de indicador pSEAP derivadas de hTERT, se usaron un vector de control positivo (vector pSEAP2-Control) y un vector de control negativo (pSEAP2-Basic). Las construcciones del promotor (pGRN 150, 175, 176) y los vectores de control se introdujeron por transfección en células inmortales (HEK 293) y mortales (fibroblastos BJ, RPE, HUVEC) 48-72 horas después de la transfección. El medio de cultivo se recogió y se ensayó con respecto a la actividad SEAP. La actividad SEAP se detectó usando el ensayo quimioluminiscente de CLONTECH, Great EscAPeTM SEAP Chemiluminescence Kit, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las transfecciones se realizaron por triplicado. Los medios de cultivo de cada transfección se recogieron después de 48-72 horas y se ensayaron por triplicado. Los valores de fondo obtenidos por transfección del vector del control negativo (pSEAP2-Basic) se restaron de los valores obtenidos con las construcciones de ensayo. Se usó la media de nueve mediciones y se representó para cada una de las construcciones.
Resultados experimentales en líneas de células inmortales y mortales
Los resultados de los ensayos demuestran que aunque las construcciones del promotor de hTERT son capaces de dirigir la expresión del gen de SEAP indicador en células inmortales, las mismas construcciones son silenciosas en todas las células mortales ensayadas. Sin embargo, el vector pSEAP2-Control es activo en todos los tipos celulares independientemente de su estado mortal o inmortal y el vector pSEAP2-Basic es silencioso en todas las células ensayadas.
Promotor de hTERT que dirige la expresión de la timidina quinasa in vitro
La invención proporciona construcciones que comprenden secuencias codificantes heterólogas unidas operativamente a secuencias del promotor de hTERT. En una realización, las secuencias codificantes de hTERT están unidas operativamente a secuencias codificantes de la timidina quinasa del virus del herpes simple ("HSV-TK"). HSV-TK es un enzima que es capaz de convertir profármacos inocuos, por ejemplo ganciclovir, en metabolitos tóxicos que interfieren con la replicación celular de células proliferativas (tales como células cancerosas, que tienen la actividad del promotor de hTERT activo). Al controlar la expresión de la timidina quinasa (TK) por medio de su subordinación al promotor de hTERT, se restringe la expresión de TK a células en las que el promotor de hTERT es normalmente activo. Esto previene la expresión de TK en células "normales", donde el promotor de hTERT normalmente es silencioso.
La capacidad del promotor de hTERT de dirigir específicamente la expresión del gen TK en células tumorales se ensayó usando una diversidad de construcciones: una construcción, denominada pGRN266, contiene un fragmento de PCR EcoRI-FseI con el gen TK clonado en los sitios Eco RI-FseI de pGRN263. pGRN263, que contiene aproximadamente 2,5 kb de la secuencia del promotor de hTERT, es similar a pGRN150, pero contiene un gen de neomicina como marcador de selección. pGRN267 contiene un fragmento de PCR EcoRI-FseI con el gen TK clonado en los sitios EcoRI-FseI de pGRN264. pGRN264, que contiene aproximadamente 210 pb de la secuencia del promotor de hTERT, es similar a pGRN176, pero contiene un gen de neomicina como marcador de selección. pGRN268 contiene un fragmento de PCR EcoRI-XbaI con el gen de TK clonado en los sitios EcoRI-XbaI (no metilados) de pGRN265. pGRN265, que contiene aproximadamente 90 pb de la secuencia del promotor de hTERT, es similar a pGRN175, pero contiene un gen de neomicina como marcador de selección.
Estas construcciones de promotor de hTERT/TK, pGRN266, pGRN267 y pGRN268 se reintrodujeron en células de mamífero y se seleccionaron los clones estables TK/+ (y/o las poblaciones de masa). El tratamiento con ganciclovir in vitro de las células TK/+ tuvo como resultado una destrucción selectiva de todas las líneas tumorales ensayadas, incluyendo 143B, 293, HT1080, Bxpc-3, DAOY y NIH3T3. Significativamente, el tratamiento con ganciclovir no tuvo ningún efecto sobre las células BJ normales. Esto demuestra claramente la especificidad del tumor de los tres fragmentos del promotor de hTERT usado en estos experimentos.
Ejemplo 3 Terapia directa de genes suicidas con el promotor hTERT in vivo
La invención proporciona reactivos y métodos para tratar enfermedades que implican la proliferación de células indeseadas por medio de una terapia génica in vivo. Para demostrar la eficacia de este aspecto de la invención, los reactivos de la invención se usaron para tratar cáncer (de origen humano) en un modelo animal aceptado en la técnica. Una célula cancerosa humana, la línea de células de osteosarcoma 143B, que normalmente expresa el gen de la telomerasa, se transfectó con un plásmido que contenía el gen TK dirigido por el promotor de hTERT.
Específicamente, se usaron secuencias de -36 a -2482 cadena arriba del sitio de inicio de la traducción de la SEC ID Nº: 1 para dirigir el gen TK. El plásmido también contenía el gen de la neomicina fosfotransferasa. Después de la transfección de las células con el plásmido, se seleccionaron clones resistentes a G418 que expresaban TK. Se inyectaron doscientas mil de las células 143B parentales o que expresaban TK por vía subcutánea en el flanco de ratones desnudos Balb/c (nu/nu) para establecer los tumores. De 4 a 11 días después del implante de los tumores, a los ratones se les inyectaron IP 75 mg/kg de ganciclovir (GCV) o solución salina dos veces al día. El crecimiento de los tumores se controló cada 3-4 días. Cuando el GCV se administró a 4-11 días después de la implantación de los tumores a estos animales portadores de tumores, se observó una lisis de las células mediada por TK y un crecimiento del tumor retrasado. Tal inhibición del crecimiento de las células tumorales no se observa cuando se administra solución salina o si el tumor 143B parental (143BP) se trata con solución salina o GCV. Cuarenta y cinco días después de la implantación del tumor, sólo los animales a los que se les implantó el clon 143B TK+ y se trataron con GCV mostraron una supervivencia del 100%. En los otros grupos, todos excepto un animal murieron por una carga tumoral masiva.
Estos datos indican que el promotor de hTERT es suficiente para dirigir la expresión del gen TK in vivo. También demuestra que los reactivos y métodos de la invención pueden usarse para promover la regresión de tumores in vivo en sujetos (incluyendo seres humanos) portadores de tumores pre-establecidos.
Ejemplo 4 Virus oncolíticos bajo el control del promotor de hTERT
Como se ha descrito anteriormente, la invención proporciona construcciones de virus oncolíticos "de replicación condicional" en los que secuencias del promotor de hTERT de la invención están unidas operativamente a genes codificados viralmente esenciales. El uso de secuencias del promotor de hTERT de la invención asegura que el virus sólo se expresará productivamente en células con actividad telomerasa. De esta manera, pueden usarse construcciones terapéuticamente para lisar sólo las células que expresan telomerasa, tales como células inmortales o cancerosas. De esta manera, la proliferación del virus y sus efectos citopáticos se restringen a las células tumorales. A continuación se proporcionan detalles de la construcción de un virus oncolítico de replicación condicional dirigido por el promotor de hTERT ilustrativo. En esta realización, el promotor de hTERT reemplaza al promotor E1a normal para crear un virus que sólo se replicará en células que expresan telomerasa.
Se construyó el plásmido pBR/ITR/549-ClaI que contenía los nucleótidos 1-356 (ITR y señales de empaquetamiento de Ad2) y 549-920 (una porción de la secuencia codificante de E1a) del adenovirus 2 (Ad2) unidos usando un polienlazador usando procedimientos de biología molecular convencionales en el plásmido bacteriano pBR322. En pBR/ITR/TB+phTERT176-E1A y pBR/ITR/TB+phTERT316 -E1A, el promotor E1a normal (357-548 de Ad2) se ha reemplazado por el promotor de hTERT. A estos plásmidos se les añaden secuencias de Ad2 de 916-10680 para recrear los elementos de expresión del extremo 5' del virus.
Estos plásmidos (pBR/ITR/TB+phTERT176-10680 y pBR/ITR/TB+phTERT316-10680) se introducen por transfección en una línea de células humanas que expresan telomerasa junto con un fragmento de ADN adenoviral que contiene secuencias 10681-35937 de Ad2. Las placas recombinantes se puntúan y se seleccionan de 7 a 21 días después de la transducción. El Ad2 que contiene E1a y el promotor de hTERT se propaga y se produce para uso empleando esquemas convencionales para la amplificación y fabricación de Ad2 recombinante. (Graham y Prevec, 1991, en Methods in Molecular Biology, Capítulo 11, Ed. E. J. Murray, The Human Press Inc., Clifton, NJ.; Kanegae et al., Jpn J Med Sci Biol. 1994, 47(3): 157-66). Como el gen E1a se dirige por el promotor de hTERT, que normalmente no se expresa por la mayoría de las células somáticas, el genoma de Ad2 recombinante sólo se replicará y se empaquetará en partículas víricas en células que expresen telomerasa.
Ejemplo 5 Secuencias del promotor de hTERT que dirigen un gen indicador de fosfatasa alcalina para selección de alto rendimiento
La invención proporciona construcciones y ensayos basados en promotores para identificar activadores y/o represores de hTERT y de la actividad telomerasa de molécula pequeña. Para este fin, se clonaron fragmentos del promotor de hTERT en plásmidos que expresaban una forma secretada de la fosfatasa alcalina y un marcador de selección. Las construcciones de SEAP (pGRN244, pGRN245, pGRN246 y pGRN248) se re-introdujeron en células humanas normales y en líneas de células inmortales. Después de la selección de clones estables que tenían integradas las construcciones de promotor de hTERT/SEAP, se usó RT-PCR para determinar los niveles de ARNm de SEAP. En células 293, los niveles de ARNm de SEAP se elevaron y fueron comparables a los niveles de hTERT endógena, mientras que en células BJ, los niveles de ARNm de SEAP fueron prácticamente indetectables y correspondían estrechamente a los niveles de hTERT endógena en estas células.
Estos resultados indican que pueden usarse construcciones de promotor de hTERT/SEAP para modificar por ingeniería genética células adecuadas para ensayos basados en promotor y para seleccionar activadores y/o represores químicos y/o biológicos de la telomerasa en células normales y tumorales. Se re-introdujeron GRN244, pGRN245, pGRN246 y pGRN248 en células BJ y 293. En estas células se determinaron la actividad SEAP y los niveles de ARNm como criterios para la elección de clones. Se seleccionaron varias líneas 293 y BJ y se expandieron dos clones BJ/pGRN245 para la selección de alto rendimiento. Estas construcciones también se introdujeron en células IDH4, que son fibroblastos de pulmón inmortales que expresan el antígeno T largo de SV40 bajo el control del promotor de MMTV inducible por dexametasona. Las células IDH4 son telomerasa positivas y proliferan en presencia de dexametasona. Sin embargo, puede inducirse un paso de estas células a una fase telomerasa negativa senescente después de retirar la dexametasona. Tras la re-adición de dexametasona, las células vuelven a un fenotipo inmortal y re-activan la telomerasa.
pGRN244, pGRN245, pGRN246 y pGRN248 se introdujeron en células IDH4 por transfección. Se demostró que la actividad SEAP era paralela a la actividad telomerasa en diferentes clones, mientras que no se observó ninguna fluctuación significativa de la actividad SEAP con el plásmido de control. Estos resultados indican que un fragmento de aproximadamente 2,5 kb de la secuencia del promotor de hTERT (pGRN245) contiene suficientes elementos de secuencia para soportar tanto la activación como la represión en respuesta a estímulos que detienen la proliferación y/o crecimiento que controlan la actividad telomerasa en células IDH4. Se seleccionaron dos clones, ID245-1 e ID245-16, cuyo perfil de SEAP correspondía estrechamente a la actividad telomerasa durante el tratamiento con fármaco, y se expandieron para la selección de alto rendimiento de activadores de telomerasa de molécula pequeña.
Ejemplo 6 Secuencias del promotor de hTERT que dirigen un gen indicador de \beta-galactosidasa para identificar reguladores biológicos de hTERT y de la actividad telomerasa
La invención también proporciona construcciones y ensayos basados en promotores para identificar moduladores biológicos de hTERT y de la actividad telomerasa. Una construcción ilustrativa de este aspecto de la invención es pGRN353 que contiene un fragmento BglII-HindIII de pGRN297 con aproximadamente 2,5 kb de secuencias del promotor de hTERT clonadas en los sitios BglII-HindIII de \beta-gal-Basic (ClonTech). Se re-introduce pGRN353 o construcciones similares en células BJ por co-transfección con un plásmido que contiene un gen de higromicina como marcador de selección. Se establecen líneas de células clonales y/o poblaciones de masas y se usan para seleccionar bibliotecas de ADNc basadas en retrovirus para genes o fragmentos de genes que pueden activar el promotor de hTERT. También se re-introduce pGRN353 o construcciones similares en células 143B y 293 para seleccionar bibliotecas retrovirales e identificar secuencias que pueden reprimir el promotor de hTERT.
Ejemplo 7 Identificación de elementos reguladores de la transcripción de actuación trans
Los vectores de promotor-indicador (y otros) de la invención también se usan para identificar elementos reguladores de la transcripción de actuación trans. Como se ha indicado anteriormente, los plásmidos en los que los genes indicadores están unidos operativamente a secuencias de promotor de hTERT son extremadamente útiles para la identificación de agentes moduladores de la transcripción de actuación trans y para la selección de fármacos moduladores del promotor de hTERT potenciales (incluyendo agentes biológicos y moléculas pequeñas). Pueden usarse técnicas de transfección tanto transitorias como estables. En una realización, se obtienen transformantes estables de pGRN148 en células telomerasa negativas y telomerasa positivas por cotransfección con un marcador selectivo eucariota (tal como neo), de acuerdo con Ausubel, supra.
Las líneas celulares resultantes se usan para seleccionar supuestos agentes moduladores de la transcripción de actuación trans de la telomerasa, por ejemplo, comparando la expresión dirigida por el promotor de hTERT en presencia y ausencia del compuesto de ensayo (el supuesto a gente modulador de la transcripción de actuación trans). De forma similar, se usan otros vectores de promotor-indicador (incluyendo las construcciones descritas en este documento, así como variaciones de las mismas) para identificar y aislar factores de actuación trans que se unen a elementos reguladores de la transcripción de actuación cis tales como Myc, Sp1, proteína de unión a la caja TATA, AP-1, CREB, CAAT, factor de unión a CAAT y factores que se unen a elementos de respuesta a hormonas (por ejemplo, GRE). La identificación y aislamiento de tales secuencias reguladoras de actuación trans proporciona métodos adicionales y reactivos para modular transcripción y traducción de la telomerasa.
Ejemplo 8 c-Myc actúa como un potente activador del promotor de TERT por interacción directa con secuencias reguladoras de actuación cis
El uso de construcciones recombinantes que comprenden secuencias del promotor de TERT de la invención ha demostrado, por primera vez, que c-Myc actúa como un potente activador de la actividad telomerasa por interacción directa con secuencias reguladoras de actuación cis en el promotor de TERT. Significativamente, los estudios de la invención también demuestran que la activación de la transcripción del promotor de hTERT por c-Myc puede anularse por deleción o mutación de una sola secuencia reguladora de actuación cis, el "sitio de unión a Myc/Max".
Para determinar si la inducción experimental de c-Myc puede conducir a la activación de novo de la telomerasa en células humanas primarias, se transdujeron cultivos de IMR90 presenescentes modificados por ingeniería genética para expresar el receptor ecotrópico de ratón (Serrano et al., (1997) Cell 88, 593-602) con el vector retroviral pBABE o uno que codifica una proteína de fusión c-Myc-receptor de estrógenos (cMycER) inducible por hormonas (Eilers et al., 1989 Nature 340, 66-68; Littlewood (1995) Nuc. Acids. Res. 23, 1686-1690). Los cultivos de IMR90 no poseen actividad telomerasa detectable ni expresión del gen TERT (Nakamura et al., 1997; Meyerson et al., 1997).
Infección Retroviral. El receptor ecotrópico de ratón se introdujo por transducción en fibroblastos IMR90 y todas las transducciones posteriores con retrovirus ecotrópicos se realizaron de acuerdo con Serrano et al., (1997). Se recogieron los virus pBABE-MycER y los virus de control con el vector pBABE a partir de 2 líneas celulares de expresión estable.
Cultivo Celular: se cultivaron células IMR90 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco/BRL) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 0,29 mg/ml de L-glutamina, penicilina y estreptomicina al 0,03%, y 25 \mug/ml de sulfato de gentamicina. Para los estudios de inducción de Myc en células IMR90, las células transducidas con MycER se expusieron a 4-OHT 2 \muM durante 24, 48 y 72 horas. Para los estudios del promotor, se expusieron células NIH 3T3 a 4-OHT 1 \muM durante 24 y 72 horas. En todos los casos, los controles no inducidos se trataron con un volumen equivalente de etanol, el disolvente para 4-OHT.
Ensayo de Telomerasa: La actividad telomerasa se midió por un protocolo de amplificación repetido de telomerasa modificado usando el kit de detección de telomerasa TRAPeze^{TM}(Oncor, Gaithersburg, MD) (Kim et al., 1994). Se obtuvo ADN genómico a partir de fibroblastos IMR90 transducidos con MycER o con el vector de control. Se realizaron ensayos TRAP sobre los lisados equivalentes a 1000 células para todas las muestras, sirviendo los lisados de células 293T como control positivo para la actividad telomerasa. Igualmente se amplificaron controles internos de PCR a partir de cada experimento. La inactivación del lisado se realizó durante 5 minutos a 85ºC antes del ensayo TRAP.
En el sistema MycER, el resto Myc existe en una forma latente unida en un complejo con HSP-90, a través de su fusión con ER (Eilers et al., 1989; Littlewood et al., 1995). Tras el tratamiento con 4-hidroxi-tamoxifeno (4 -OHT), la proteína MycER se libera de HSP-90, dando como resultado un fenotipo con un exceso de expresión de Myc (Eilers et al., 1989; Littlewood et al., 1995). Empleando este sistema de cultivo celular, el tratamiento con 4- OHT de cultivos IMR90 transducidos con MycER dio como resultado una activación marcada y sostenida de telomerasa a un nivel igual o por encima del detectado en lisados derivados de un número equivalente de células tumorales 293T telomerasa positivas, como se evalúa por el ensayo TRAP sensible. Por el contrario, los cultivos de IMR90 transducidos con pBABE tratados con 4-OHT o transducidos con MycER y no tratados permanecieron negativos con respecto a la telomerasa. El análisis de transferencia de Western confirmó abundantes niveles de proteína MycER en los cultivos transducidos con MycER en presencia o ausencia de 4-OHT.
Es importante indicar que no se ha descubierto que la expresión forzada de oncogenes tales como H-Ras y moduladores celulares de las rutas Rb y p53 (E7, ciclina D1, Mdm2, p53 dominante negativo) sea capaz de influir sobre la actividad telomerasa en células IMR90 (Wang et al., 1998).
La potenciación por c-Myc de la transcripción de hTERT requiere la presencia de un elemento promotor de actuación cis: la caja E de unión a Myc proximal
Construcción del indicador de hTERT: Los plásmidos pGRN150 (caja E delecionada), pGRN261 (indicador de hTERT de 2,5 kpb) se han descrito anteriormente. Se cultivaron células NIH 3T3 en medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco/BRL) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 0,29 mg/ml de L-glutamina, penicilina y estreptomicina al 0,03%, y 25 \mug/ml de sulfato de gentamicina. Las células NIH 3T3 se transfectaron usando el reactivo LipoFectamine (Life Sciences) con 100 ng de un indicador de promotor, y 200 ng de pCMX-\beta-Galactosidasa que sirvió como control interno para la eficacia de transfección. Se dejó que las células transfectadas se recuperaran durante 6 horas en DMEM completo y después se trataron con 4-OHT 1 \muM o etanol durante 36 horas antes del análisis de la actividad fosfatasa alcalina secretada usando el ensayo Great EscAPe^{TM} (ClonTech). La actividad \beta-galactosidasa se ensayó por incubación de extractos de células enteras con 400 \mug/ml de ONPG en tampón que contenía Na_{2}HPO_{4} 60 mM, NaH_{2}PO_{4} 40 mM, KCl 10 mM y MgSO_{4} 1 mM, y las eficacias de transfección relativas se determinaron leyendo la absorbancia a 415 nm.
La expresión del hTERT endógeno después de la exposición a 4-OHT (o disolvente solo) se midió a diversos tiempos en presencia de ciclohexamida 1 \muM en fibroblastos IMR90 transducidos con MycER. Se realizó una transcripción inversa del ARN obtenido a partir de cada muestra seguida de PCR y transferencia de Southern de los productos amplificados como se ha descrito anteriormente. La gliceraldehído-6-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se amplificó a partir de los mismos productos de transcripción inversa como un control semi-cuantitativo interno y se visualizó por tinción con bromuro de etidio. Se detectó un bajo nivel de expresión de ARNm de hTERT en muestras no inducidas después de exposiciones muy largas; sin embargo, el nivel de ARNm de hTERT no cambió a lo largo del tiempo en muestras no inducidas.
La actividad del promotor de hTERT aumentó dramáticamente por c-MycER en células NIH 3T3. La capacidad de c-MycER de aumentar la actividad del promotor de hTERT era dependiente de secuencias en el promotor de hTERT que incluían un sitio de unión a Myc conservado evolutivamente (caja E).
Para determinar si el aumento de la actividad telomerasa inducido por la activación de c-MycER era el resultado de una mayor transcripción del gen de hTERT, examinamos inicialmente el efecto de la inducción por 4-OHT de la actividad c-Myc-ER sobre secuencias del promotor de hTERT colocadas cadena arriba del gen indicador de la fosfatasa alcalina secretada. El promotor de hTERT contiene dos supuestos sitios de unión a Myc colocados en -242 y -34 con respecto al codón de iniciación ATG.
Se transfectaron células NIH 3T3 modificadas por ingeniería genética para expresar c-MycER de forma estable con construcciones que contenían un indicador de fosfatasa alcalina secretada bajo el control de un fragmento de 2,5 kb del promotor de hTERT, un fragmento de 2,5 kb del promotor de hTERT que carecía de la caja E proximal, o una construcción de indicador sin promotor. La actividad basal de promotor de hTERT de tipo silvestre y la del promotor de hTERT que carecía de la caja E proximal fueron equivalentes y aproximadamente 3 veces mayores que la actividad del indicador sin promotor. La inducción de la actividad c-MycER con 4-OHT 1 \muM aumentaba la actividad del promotor de hTERT de 2,5 kb aproximadamente 10 veces. Por el contrario, la actividad del promotor que carecía de la caja E proximal no se veía afectada significativamente por la inducción de c-Myc-ER. De forma similar, el indicador sin promotor no se vio afectado por la inducción de c-Myc-ER. Claramente, esto demuestra que la transcripción de una región codificante heteróloga puede regularse por medio de la modulación de un elemento regulador de la transcripción tal como c-Myc dentro de la región promotora, que a su vez se modula por un ligando para el receptor de estrógenos.
Para confirmar adicionalmente el papel de la caja E proximal en la regulación del promotor de hTERT, ensayamos el efecto de intercambiar la caja E de CACGTG a CACTCA. La mutación en la caja E redujo la actividad del promotor debida a la estimulación de 4-OHT al equivalente de la deleción de la caja E y 10 veces por debajo del promotor de tipo silvestre. Esto demuestra que c-Myc-R no es capaz de activar significativamente un promotor de hTERT con una caja E atenuada en la posición -34 y que la caja E en la posición -242 no puede mediar significativamente la activación de c-Myc. Estos resultados sugieren que la capacidad de c-Myc de estimular el promotor de hTERT está mediada por la caja E en posición -34.
hTERT es una diana directa de la transcripción regulada por c-Myc
Para confirmar la capacidad de c-Myc de estimular la transcripción del gen hTERT directamente, ensayamos la expresión del gen hTERT en cultivos transducidos con MycER de células IMR90 0, 1, 3 y 9 horas después de la adición de 4-OHT. Los cultivos se trataron con ciclohexamida durante 30 minutos antes de la adición de 4-OHT para prevenir la síntesis de proteínas de novo. La expresión de hTERT fue indetectable en el punto de tiempo de 0 horas para los cultivos transducidos con Myc. El pretratamiento de estas células con ciclohexamida sola no tuvo ningún efecto sobre la expresión del ARNm de hTERT. La inducción de la actividad de c-Myc-ER por tratamiento con 4-OHT 2 M en presencia de 1 ciclohexamida condujo un aumento rápido en la expresión del mensajero de hTERT.
La expresión de hTERT se detectó una hora después de la inducción y aumentó de 3 a 9 horas después de la inducción. Por el contrario, en las células tratadas con disolvente solo no se indujo la expresión de hTERT. Además, el nivel de expresión de GAPDH fue similar en todos los puntos de tiempo en las células tratadas con 4-OHT o disolvente solo. Estas observaciones sugieren firmemente que Myc actúa directamente sobre el promotor de hTERT para aumentar la transcripción del gen hTERT.
Falta de equivalencia de Myc y TERT en la transformación celular
Para explorar adicionalmente las implicaciones funcionales de la inducción por Myc de la actividad telomerasa en células primarias, examinamos si TERT podría substituir a c-Myc como agente de inmortalización en el ensayo de cooperación de fibroblastos embrionarios de rata (REF). En este ensayo, la cotransfección de Myc y RAS activado (H-RASG12V) produce la transformación maligna de REF de pocos pasos. Esta actividad cooperativa puede cuantificarse controlando el número de focos transformados que aparecen en la monocapa de 7 a 10 días después de la transfección. En dos experimentos separados, se introdujeron diversas combinaciones de las construcciones de expresión que codificaban c-Myc, H-RASG12V, TERT o vector de control en REF de pocos pasos. Se observó una actividad cooperativa fuerte en las cotransfecciones de RAS y Myc como se muestra por un promedio de 34 focos por placa de 10 cm; mientras que RAS solo generó entre 0 y 3 focos por placa; lo cual es coherente con los hallazgos previos de que se requieren un agente de inmortalización y RAS activado para una transformación eficaz de células primarias de roedor (Land et al., 1983). Por el contrario, la cotransfección de TERT y ratas no generó números de focos transformados por encima de los evaluados para los controles de RAS solo. Estos resultados indican que la expresión de hTERT es insuficiente para responder de la función de inmortalización de Myc en un ensayo de cooperación de fibroblastos embrionarios de rata (REF).
El efecto de c-Myc-ER sobre la actividad del promotor de hTERT en células NIH3T3 se determinó por medio de la detección de la actividad fosfatasa alcalina secretada. Las células se trataron con 4-OHT durante 36 horas. Las células no inducidas se trataron con disolvente solo durante 36 horas. La actividad fosfatasa alcalina secretada detectada se corrigió con respecto a la eficacia de transfección en cada caso usando \beta-galactosidasa.
Ejemplo 9 Clonación del promotor de TERT de ratón
El siguiente ejemplo detalla la clonación del promotor de mTERT de ratón.
Construcción de mTERT: se usó una sonda de hibridación (nucleótidos 1586-1970) del ADNc de mTERT
(pGRN188) para identificar un fago recombinante (mTERT1) a partir de una biblioteca de fagos genómicos de ratón 129SV (Stratagene). Un fragmento HindIII de 8 kb de mTERT1 que hibridaba con la sonda 1586-1970 se subclonó en pBluescript^{TM} I KS + (Stratagene) para generar el clon B2.18. Se secuenciaron las regiones que incluían el iniciador y el promotor.
La secuencia cadena arriba de mTERT se indica en la SEC ID Nº: 2. La secuencia puede obtenerse en el GenBank con el acceso B2.18 AF121949.
La figura 3 muestra la alineación de porciones homólogas de las secuencias del promotor humano y de ratón. Las secuencias se alinearon usando el programa GAP del paquete GCG de Wisconsin, usando un valor de 48 para la creación de huecos y un valor de 3 para la extensión de huecos. Usando una pequeña porción de la región codificante (\sim 450 bases) se descubrió que mejoraba la lineación inicial.
Conservación de promotores de TERT humano y de ratón
Para determinar si la capacidad de c-Myc de aumentar la actividad telomerasa estaba mediada por un aumento de la transcripción del gen hTERT, comparamos las secuencias de los promotores de TERT humano y de ratón. La alineación de las primeras 300 bases de los promotores de humano y de ratón indica varias regiones conservadas. En particular, el sitio de unión a Myc/Max (caja E) localizado en -34 del promotor humano y en -32 del promotor de ratón, está muy conservado. Se identificó una segunda caja E en la posición -242 del promotor humano; sin embargo, este sitio no estaba conservado en el promotor de ratón. Estas observaciones suscitaron la posibilidad de que el sitio de unión a Myc conservado en particular pudiera jugar un papel en la regulación de la expresión de hTERT por
c-Myc.
Ejemplo 10 Virus oncolítico ilustrativo
Basándose en los principios ilustrados en el ejemplo 4, se realizó el siguiente experimento como modelo para un virus oncolítico basado en el adenovirus de tipo Ad2. Se realizó una construcción en la que el gen de replicación de adenovirus E1a se colocó bajo el control del promotor de hTERT, que activaría la construcción en células cancerosas que expresaban telomerasa. Como control positivo, se realizó una construcción similar en la que E1a se puso bajo el control de promotor de CMV, que activaría la transcripción en cualquier célula.
Se obtuvieron los siguientes reactivos. pBR322, enzimas de restricción: NEB, Bervely, MA. Adenovirus tipo 2 (Ad2), reactivos de cultivo de tejidos: Gibco/BRL, Grand Island, NY. Sistemas de transfección de mamífero Profection: Promega, Madison, WI. Líneas celulares tumorales y normales. ATCC, Manassas, VA, excepto la línea BJ, que se obtuvo en J. Smith, U. of Texas Southwestern Medical Center.
En resumen, se construyó un plásmido basado en pBR322 que contiene el genoma del adenovirus de tipo 2 con deleciones de los nucleótidos 356-548 (región de promotor de E1a) y los nucleótidos 27971-30937 (E3). Se insertó una región de clonación múltiple en el punto de deleción del promotor de E1a y posteriormente se clonó el promotor de hTERT (nucleótidos -239 a -36) o el promotor de CMV (del nucleótido -524 al -9). La numeración de la secuencia de CMV está de acuerdo con Akrigg et al., Virus Res 2:107, 1985. La numeración de la secuencia de Ad2 está de acuerdo con "DNA Tumor Viruses: Molecular Biology of Tumor Viruses", J. Tooze ed., Cold Spring Harbor Laboratory,
NY.
Estos ADN plasmídicos se digirieron con SnaBI para liberar ITR, y después se extrajeron con fenol-cloroformo, se precipitaron y se utilizaron para transfectar células 293A para la propagación del virus. Se realizaron varias vueltas de purificaciones en placa usando células A549, y se expandió un aislado final en estas mismas células. Los virus se titularon por ensayos en placas en células 293A y se ensayaron con respecto a la presencia de secuencias Ad 5' WT por PCR. El ADN se aisló a partir de los virus por extracción HIRT.
La construcción del promotor de hTERT se denominó AdphTERT-E1dlE3. La construcción del promotor de CMV se denominó AdCMV-E1dlE3.
La figura 4 muestra el efecto de estos virus sobre líneas de células normales y cancerosas. Cada línea celular se cultivo a 5 x 10 en formato de 48 pocillos y se infectó a una MOI=20, \sim 24 horas después del cultivo. Las células después se cultivaron durante un período de 17-48 días y se alimentaron cada cuatro días. Las fotografías mostradas en la figura se tomaron siete días después de la infección. La fila superior muestra los resultados de las células que no se infectaron viralmente (control negativo). La fila central muestra los resultados de las células infectadas con adenovirus oncolítico, en el que el gen de replicación E1a está unido operativamente al promotor de hTERT. La fila inferior muestra los resultados de las células infectadas con adenovirus en los que E1a está unido operativamente al promotor de CMV (control positivo). Los resultados se resumen en la tabla 2:
TABLA 2 Efecto de virus oncolíticos sobre células cancerosas y no cancerosas
4
5
Todas las líneas celulares ensayadas se lisaron eficazmente por AdCMV-E1dlE3 el día 17 después de la infección. Todas las líneas tumorales se lisaron por AdphTERT-E1dlE3 en un marco de tiempo similar, pero ligeramente retrasado, mientras que las líneas normales no mostraron ningún signo de efecto citopático permanecieron sanas hasta las 6 semanas después de la infección.
En un experimento paralelo, cada línea celular se infecto con un adenovirus que contenía el gen que codificaba la proteína fluorescente verde como marcador visual (MOI = 100) para determinar la eficacia de transducción relativa de estas células por vectores de adenovirus. Las líneas celulares presentaron un amplio intervalo de eficacia de transducción (\sim 1-2% hasta el 100%). Incluso las células que se transducen de forma deficiente pueden erradicarse eficazmente con el adenovirus controlado por hTERT.
Conjuntamente, los resultados confirman que un virus oncolítico puede construirse poniendo un elemento genético esencial para la replicación del virus bajo el control de un promotor de hTERT. Se producen replicación y lisis en células cancerosas, pero no en las células no malignas diferenciadas.
La figura 5 es un mapa del adenovirus oncológico usado en el experimento de infección mostrado en la figura 4. Comprende la repetición terminal invertida (ITR) del adenovirus (Ad2); seguido del promotor de longitud media de hTERT (phTERT176) unido operativamente a la región E1a de adenovirus; seguido del resto del adenovirus en el que se ha delecionado la región E3 (\DeltaE3). Debajo se muestran algunas construcciones modificadas. La construcción central comprende una secuencia adicional entre el promotor de hTERT y la región E1a. La secuencia HI es un intrón artificial obtenido por ingeniería genética a partir de un adenovirus y secuencias donadoras y aceptoras de ayuste de intrones de inmunoglobulina. Se cree que la colocación de un intrón en el gen de replicación de adenovirus con el promotor de hTERT promoverá el procesamiento y el transporte del ARN heteronuclear, facilitando de esta manera la formación de partículas virales replicadas. La tercera construcción de adenovirus es similar, con la excepción de que la región E1a usada es mayor en el extremo 5' por 51 nucleótidos. Se cree que esto puede promover también una replicación condicional más eficaz del virus oncolítico.
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Depósito biológico
El clon lambda denominado \lambdaG\varphi5 (a partir del cual se determinó la SEC ID Nº: 1) se depositó bajo los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209 Estados Unidos, el 14 de agosto de 1997, con el número de acceso 98505.
SEC ID Nº: 1 (secuencia del gen hTERT, Acceso del GenBank AF121948)
6
7
8
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SEC ID Nº: 2 (secuencia de mTERT, Acceso del GenBank AF121949)
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Claims (20)

1. Un virus oncolítico que tiene un genoma en el que un promotor de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) está unido operativamente a un elemento genético esencial para la replicación o montaje del virus, donde el promotor promueve la transcripción del elemento genético en células que expresan la telomerasa transcriptasa inversa (TERT), con lo que promueve la replicación del virus, y donde la replicación del virus en una célula conduce la lisis de la célula.
2. El virus oncolítico de la reivindicación 1, que es un adenovirus de replicación condicional.
3. El virus oncolítico de la reivindicación 1, que es un herpesvirus de replicación condicional.
4. Un polinucleótido para el montaje del virus oncolítico de la reivindicación 1, en el que un promotor de la telomerasa transcriptasa inversa (TERT) está unido operativamente a un elemento genético esencial para la replicación o montaje de un virus.
5. El virus oncolítico o polinucleótido de cualquier reivindicación anterior, donde el elemento genético esencial para la replicación o montaje de un virus es un gen E4, E1a, E1b o E2 de adenovirus o un gen ICP6 o ICP4 del virus del herpes simple.
6. El adenovirus oncolítico de la reivindicación 2, donde el elemento genético esencial para la replicación o montaje es una región E1a de adenovirus.
7. El virus oncolítico o polinucleótido de cualquier reivindicación anterior, donde el polinucleótido promotor es un promotor para la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT).
8. El virus oncolítico o polinucleótido de cualquier reivindicación anterior, donde la secuencia de nucleótidos del promotor está contenida en el fago \lambdaG\varphi5.
9. El virus oncolítico o polinucleótido de cualquier reivindicación anterior, donde el promotor tiene una o más de las siguientes características:
a)
comprende una secuencia de al menos aproximadamente 100 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 1;
b)
comprende una secuencia de al menos aproximadamente 500 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 1;
c)
comprende una secuencia de al menos aproximadamente 100 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 2;
d)
comprende una secuencia de al menos aproximadamente 500 nucleótidos consecutivos de la SEC ID Nº: 2; o
e)
hibrida con un polinucleótido complementario a una secuencia que tiene las características a), b), c) o d) en condiciones rigurosas, y tiene la características de promover preferentemente la transcripción en células que expresan TERT.
10. El virus oncolítico o polinucleótido de cualquier reivindicación anterior, donde el polinucleótido promotor tiene una o más de las siguientes características:
a) comprende la secuencia desde la posición -117 a la posición -36 con respecto al sitio de inicio de la traducción (posición 13545) de la SEC ID Nº: 1;
b) comprende la secuencia desde la posición -239 a la posición -36 con respecto al sitio de inicio de la traducción (posición 13545) de la SEC ID Nº: 1;
c) comprende la secuencia desde la posición -117 a la posición +1 con respecto al sitio de inicio de la traducción (posición 13545) de la SEC ID Nº: 1;
d) comprende la secuencia desde la posición -239 a la posición +1 con respecto al sitio de inicio de la traducción (posición 13545) de la SEC ID Nº: 1;
e) consta de no más de 82 nucleótidos consecutivos; o
f) hibrida con un polinucleótido complementario a una secuencia que tiene las características a), b), c) o d) en condiciones rigurosas, y tiene la característica de promover preferentemente la transcripción en células que expresan TERT.
11. El virus oncolítico o polinucleótido de cualquier reivindicación anterior, que comprende además una región codificante cuya expresión es tóxica para la célula o que hace que la célula sea más susceptible a los efectos tóxicos de un fármaco.
12. El virus oncolítico o polinucleótido de la reivindicación anterior, donde la región codificante codifica timidina quinasa y el fármaco es ganciclovir.
13. Un método para seleccionar un virus que tiene las características de un virus oncolítico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende proporcionar un virus oncolítico en el que dicho promotor de TERT está unido operativamente a un elemento genético requerido para la replicación o montaje del virus, usar el virus para infectar una célula que expresa TERT y una célula que no expresa TERT, y seleccionar el virus si destruye la célula que expresa TERT.
14. Un método para producir un virus oncolítico de acuerdo con las reivindicaciones 1-12, que comprende unir operativamente dicha secuencia del promotor de TERT a dicho elemento genético para formar un gen unido; introducir el gen unido por transfección en una célula que expresa telomerasa; y después propagar el virus obtenido a partir de la célula.
15. Un método in vitro para destruir una célula que expresa la telomerasa transcriptasa inversa, que comprende poner en contacto la célula in vitro con el virus oncolítico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12.
16. El método de la reivindicación 15, donde la célula es una célula cancerosa.
17. El método de la reivindicación 16, donde el cáncer se selecciona entre el grupo compuesto por cáncer de pulmón, cáncer pancreático, meduloblastoma, carcinoma cervical y fibrosarcoma.
18. Un medicamento que comprende el virus oncolítico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para uso en medicina.
19. Uso del virus oncolítico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 19, donde el cáncer se selecciona entre el grupo compuesto por cáncer de pulmón, cáncer pancreático, meduloblastoma, carcinoma cervical y fibrosarcoma.
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