ES2942210T3 - Vectores de ADN no integradores para modificación genética de células - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende al menos un promotor y un elemento S/MAR, en el que dicho elemento S/MAR se encuentra aguas abajo de dicho promotor y en el que la secuencia de ácido nucleico de dicho elemento S/MAR (secuencia S/MAR) comprende al menos 3 motivos de secuencia ATTA (SEQ ID NO: 1) por 100 nucleótidos en un tramo de como máximo 200 nucleótidos; la presente invención se refiere además a una composición ya una célula huésped que comprende dicho polinucleótido, y al polinucleótido para uso en medicina y para uso en el tratamiento de enfermedades genéticas. La presente invención también se refiere a un kit ya un dispositivo que comprende dicho polinucleótido, ya métodos y usos relacionados con el polinucleótido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores de ADN no integradores para modificación genética de células

La presente divulgación se refiere a un polinucleótido que comprende al menos un promotor y un elemento S/MAR, en el que dicho elemento S/MAR está situado aguas abajo de dicho promotor y en el que la secuencia de ácido nucleico de dicho elemento S/MAR (secuencia S/MAR) comprende al menos 3 motivos de secuencia ATTA (SEQ ID NO:1) por cada 100 nucleótidos en un tramo de 200 nucleótidos como máximo; la presente divulgación se refiere además a una composición y a una célula huésped que comprende dicho polinucleótido, y al polinucleótido para su uso en medicina y para su uso en el tratamiento de enfermedades genéticas. La presente divulgación también se refiere a un kit y a un dispositivo que comprenden dicho polinucleótido, y a procedimientos y usos relacionados con el polinucleótido.

La modificación genética de las células se utiliza de forma rutinaria en los cultivos celulares modernos con fines científicos. Sin embargo, el uso de las técnicas correspondientes en el tratamiento de enfermedades hereditarias causadas por mutaciones de genes, aun siendo muy deseable, sigue viéndose obstaculizado por el problema de que los procedimientos disponibles sólo suelen proporcionar una modificación transitoria, como los protocolos de transfección transitoria, mientras que los procedimientos que proporcionan una modificación estable de las células suelen basarse en la integración del transgén en el genoma de la célula huésped. Sin embargo, la integración de un transgén, aunque se dirija a un locus específico, conlleva el riesgo de inducir una mutación deletérea, que puede provocar, por ejemplo, cáncer como efecto secundario del tratamiento.

Las regiones de unión andamio/matriz (S/MAR), también conocidas como regiones de unión andamio (SAR) o regiones asociadas a la matriz (MAR) son conocidas como secuencias en el genoma de organismos eucariotas que median la unión de la matriz nuclear. Las S/MARS son secuencias ricas en AT, y algunos motivos ricos en AT se encontraron más enriquecidos (Liebeich et al. (2002), NAR 30(15): 3433.- Se ha propuesto una variedad de vectores para el mantenimiento estable en células basados en motivos S/MAR, por ejemplo en los documentos US 6.410.314 B1, US 5.985.607 A, WO 2010/018444 A2 y en Haase et al. (2010), BMC Biotechnology 10:20; además, se identificaron efectos epigenéticos que influyen en la replicación de dichos vectores (Haase et al.(2013), PLOS One 8(11):e79262). No obstante, aún no se dispone de vectores basados en S/MAR lo suficientemente estables para su uso en terapia génica.

Existe, no obstante, una necesidad en la técnica de medios y procedimientos mejorados para la transfección estable de células, en particular utilizando elementos S/MAR y evitando los riesgos que conlleva la integración del transgén en el genoma de la célula huésped. Este problema se resuelve con los medios y procedimientos aquí descritos.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polinucleótido según la reivindicación 1; además, la divulgación se refiere a un polinucleótido que comprende al menos un promotor y un elemento S/MAR, en el que dicho elemento S/MAR está situado aguas abajo de dicho promotor y en el que la secuencia de ácido nucleico de dicho elemento S/MAR (secuencia S/MAR) comprende al menos 3 motivos de secuencia ATTA por cada 100 nucleótidos en un tramo de al menos 200 nucleótidos.

Tal como se utilizan en lo sucesivo, los términos "tener", "comprender" o "incluir" o cualquier variación gramatical arbitraria de los mismos se utilizan de forma no exclusiva. Por lo tanto, estos términos pueden referirse tanto a una situación en la que, además de la característica introducida por estos términos, no hay ninguna otra característica presente en la entidad descrita en este contexto, como a una situación en la que hay una o más características adicionales presentes. A modo de ejemplo, las expresiones "A tiene B", "A comprende B" y "A incluye B" pueden referirse tanto a una situación en la que, además de B, ningún otro elemento está presente en A (es decir, una situación en la que A consiste única y exclusivamente en B) como a una situación en la que, además de B, uno o más elementos adicionales están presentes en la entidad A, como el elemento C, los elementos C y D o incluso otros elementos.

Además, como se utiliza en lo que sigue, los términos "preferentemente", "más preferentemente", "muy preferentemente", "particularmente", "más particularmente", "específicamente", "más específicamente" o términos similares se utilizan junto con características opcionales, sin restringir otras posibilidades. Así pues, las características introducidas por estos términos son características opcionales y no pretenden restringir en modo alguno el alcance de las reivindicaciones. La invención puede, como reconocerá el experto en la materia, llevarse a cabo utilizando características alternativas. Del mismo modo, las características introducidas por "en una realización de la invención" o expresiones similares pretenden ser características opcionales, sin ninguna restricción con respecto a otras realizaciones de la invención, sin ninguna restricción con respecto al ámbito de la invención y sin ninguna restricción con respecto a la posibilidad de combinar las características introducidas de tal manera con otras características opcionales o no opcionales de la invención.

Además, si no se indica lo contrario, el término "aproximadamente" se refiere al valor indicado con la precisión técnica comúnmente aceptada en el campo pertinente, preferentemente se refiere al valor indicado ± 20%, más preferentemente ± 10%, más preferentemente ± 5%. Además, el término "esencialmente" indica que las desviaciones que influyen en el resultado o uso indicado están ausentes, es decir, las desviaciones potenciales no hacen que el resultado indicado se desvíe más de ± 20%, más preferentemente ± 10%, más preferentemente ± 5%. Por lo tanto, "constituido esencialmente por" significa que incluye los componentes especificados pero excluye otros componentes, excepto los materiales presentes como impurezas, los materiales inevitables presentes como resultado de los procesos utilizados para proporcionar los componentes y los componentes añadidos con un fin distinto al de lograr el efecto técnico de la invención. Por ejemplo, una composición definida utilizando la frase "constituida esencialmente por" abarca cualquier aditivo, excipiente, diluyente, soporte o similar aceptable y conocido. Preferentemente, una composición constituida esencialmente por un conjunto de componentes comprenderá menos del 5% en peso, más preferentemente menos del 3% en peso, aún más preferentemente menos del 1%, lo más preferentemente menos del 0,1% en peso de componente(s) no especificado(s). En el contexto de las secuencias de ácidos nucleicos, el término "esencialmente idénticas" indica un valor de % de identidad de al menos el 80%, preferentemente al menos el 90%, más preferentemente al menos el 98%, más preferentemente al menos el 99%. Como se comprenderá, el término esencialmente idéntico incluye el 100% de identidad. Lo anterior se aplica al término "esencialmente complementario" mutatis mutandis.

El término "polinucleótido", tal como se utiliza aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico lineal o circular. El término engloba tanto los polinucleótidos monocatenarios como los parcial o totalmente bicatenarios. Preferentemente, el polinucleótido es ARN o ADN, incluido ADNc. Además, también se incluyen polinucleótidos modificados químicamente, incluidos polinucleótidos modificados de forma natural, como polinucleótidos glicosilados o metilados, o derivados modificados artificialmente, como polinucleótidos biotinilados. El polinucleótido de la presente invención se proporcionará, preferentemente, como polinucleótido aislado (es decir, aislado de su contexto natural) o en forma modificada genéticamente. El polinucleótido de la invención comprende al menos un promotor activo en una célula huésped y un elemento S/MAR; además, el polinucleótido tiene la actividad biológica de replicarse episólicamente en una célula huésped, todo ello como se especifica a continuación. Preferentemente, el polinucleótido tiene una longitud de como máximo 1 Mb, más preferentemente de como máximo 500 kb, aún más preferentemente de como máximo 200 kb, lo más preferentemente de como máximo 100 kb. Preferentemente, el polinucleótido es un polinucleótido no natural; por lo tanto, preferentemente, el nucleótido es un polinucleótido artificial. También preferentemente, el polinucleótido es un polinucleótido quimérico; más preferentemente, el polinucleótido comprende al menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga a las restantes secuencias de ácido nucleico que comprende.

Tal como se utiliza aquí, el término polinucleótido, preferentemente, incluye variantes de los polinucleótidos específicamente indicados. Más preferentemente, el término polinucleótido se refiere a los polinucleótidos específicos indicados. El término "variante de polinucleótido", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una variante de un polinucleótido relacionado con el presente documento que comprende una secuencia de ácido nucleico caracterizada porque la secuencia puede derivarse de la secuencia de ácido nucleico específica antes mencionada mediante al menos una sustitución, adición y/o supresión de nucleótidos, en la que la variante de polinucleótido tendrá la actividad o actividades biológicas especificadas para el polinucleótido específico. Por lo tanto, debe entenderse que una variante de polinucleotídica tal como se menciona de acuerdo con la presente invención tendrá una secuencia de ácido nucleico que difiere debido a al menos una sustitución, deleción y/o adición de nucleótidos. Preferentemente, dicha variante polinucleotídica comprende un ortólogo, un parálogo u otro homólogo del polinucleótido específico o de una subsecuencia funcional del mismo, por ejemplo, de un elemento S/MAR. También preferentemente, dicha variante polinucleotídica comprende un alelo natural del polinucleótido específico o de una subsecuencia funcional del mismo. Las variantes polinucleotídicas también abarcan polinucleótidos que comprenden una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridar con los polinucleótidos específicos antes mencionados o con subsecuencias funcionales de los mismos, preferentemente, en condiciones de hibridación estrictas. Un ejemplo preferido de condiciones de hibridación estrictas son las condiciones de hibridación en cloruro sódico /citrato sódico 6x (= SSC) a aproximadamente 45°C, seguidas de uno o más pasos de lavado en SSC 0,2x, SDS 0,1% a 50 a 65°C. El experto en la materia sabe que estas condiciones de hibridación difieren dependiendo del tipo de ácido nucleico y, por ejemplo, cuando hay disolventes orgánicos presentes, en cuanto a la temperatura y concentración del tampón. El experto en la materia sabe que estas condiciones de hibridación difieren en función del tipo de ácido nucleico y, por ejemplo, cuando hay disolventes orgánicos presentes, con respecto a la temperatura y la concentración del tampón. Por ejemplo, en "condiciones estándar de hibridación", la temperatura varía en función del tipo de ácido nucleico entre 42°C y 58°C en tampón acuoso con una concentración de O.lx a 5x SSC (pH 7,2). Si en el tampón mencionado hay disolvente orgánico, por ejemplo formamida al 50%, la temperatura en condiciones estándar es de aproximadamente 42°C. Las condiciones de hibridación para los híbridos ADN:ADN son preferentemente, por ejemplo, 0,1x SSC y 20°C a 45°C, preferentemente entre 30°C y 45°C. Las condiciones de hibridación para los híbridos a DN:ARN son preferentemente, por ejemplo, 0,1x SSC y 30°C a 55°C, preferentemente entre 45°C y 55°C. Las temperaturas de hibridación antes mencionadas se determinan, por ejemplo, para un ácido nucleico con aproximadamente 100 pb (= pares de bases) de longitud y un contenido de G+C del 50% en ausencia de formamida; en consecuencia, el experto en la materia puede considerar más apropiadas otras condiciones más adecuadas para ADN con bajo contenido de G+C, que en principio son conocidas por el experto en la materia. El experto en la materia sabe determinar las condiciones de hibridación necesarias consultando los libros de texto estándar. Alternativamente, las variantes polinucleotídicas pueden obtenerse mediante técnicas basadas en PCR, como la amplificación del ADN basada en cebadores oligonucleotídicos mixtos, es decir, utilizando cebadores degenerados contra dominios conservados de un polipéptido de la presente invención. Los dominios conservados de un polipéptido pueden identificarse comparando la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido o la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la presente invención con secuencias de otros organismos. Como molde, puede utilizarse ADN o ADNc de bacterias, hongos, plantas o, preferentemente, de animales. Además, las variantes incluyen polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que son al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% o al menos un 99% idénticas a las secuencias de ácido nucleico específicamente indicadas o a sus subsecuencias funcionales. Además, también se incluyen los polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos que son al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 98% o al menos un 99% idénticas a las secuencias de aminoácidos específicamente indicadas. Los valores porcentuales de identidad se calculan, preferentemente, sobre toda la región de la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos. El trabajador cualificado dispone de una serie de programas basados en diversos algoritmos para comparar distintas secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman ofrecen resultados especialmente fiables. Para realizar los alineamientos de secuencias se utilizó el programa PileUp (J. Mol. Evolution, 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) o los programas Gap y BestFit (Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) y Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)), se utilizan preferentemente. Preferentemente, dichos programas se utilizan con sus parámetros estándar. Los valores de identidad de secuencia arriba indicados en porcentaje (%) se determinarán, preferentemente, utilizando el programa GAP en toda la región de secuencia con la siguiente configuración: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 y Average Mismatch: 0.000, que, a menos que se especifique lo contrario, se utilizarán siempre como ajustes estándar para las alineaciones de secuencias.

Un polinucleótido que comprende un fragmento de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico específicamente indicadas, dicho polinucleótido que retiene la actividad o actividades indicadas, también se engloba como un polinucleótido variante de la presente invención. Un fragmento tal como se entiende en el presente documento, preferentemente, comprende al menos 200, preferentemente al menos 300, más preferentemente al menos 400 nucleótidos consecutivos de cualquiera de las secuencias específicas de ácido nucleico; o codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 100, preferentemente al menos 200, más preferentemente al menos 300 aminoácidos consecutivos de cualquiera de las secuencias específicas de aminoácidos y que sigue teniendo la actividad indicada.

Los polinucleótidos de la presente invención consisten, consisten esencialmente o comprenden las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente. Por lo tanto, también pueden contener otras secuencias de ácido nucleico. En concreto, los polinucleótidos de la presente invención pueden codificar, por ejemplo, proteínas de fusión o marcadores seleccionables. Dichas proteínas de fusión pueden comprender como parte adicional polipéptidos para controlar la expresión (por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes, amarillas, azules o rojas, fosfatasa alcalina y similares) o las denominadas "etiquetas" que pueden servir como marcador detectable o como medida auxiliar para fines de purificación. Las etiquetas para los distintos fines son bien conocidas en la técnica y se describen en otro lugar del presente documento.

También preferentemente, el polinucleótido comprende al menos una secuencia de carga. El término "secuencia de carga", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una secuencia de ácido nucleico de interés para ser transferida y mantenida de forma estable en una célula huésped. Preferentemente, la secuencia de carga es una secuencia de ácido nucleico que codifica un polinucleótido, por ejemplo un ARN, y/o un polipéptido de interés. Preferentemente, el polipéptido de interés es un polipéptido terapéutico, más preferentemente un Receptor de Células T (TCR), más preferentemente un receptor de células T humano o quimérico, un Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), preferentemente MARTI TCR, o un polipéptido carente en células afectadas con una enfermedad genética como se especifica en otra parte del presente documento. Así, por ejemplo, preferentemente, el polinucleótido comprende al menos una secuencia de carga que codifica un polipéptido que proporciona actividad fenilalanina-hidroxilasa (EC 1.14.16.1) para el tratamiento de la fenilcetonuria. En una realización preferente, la secuencia de carga está intercalada entre el al menos un promotor y el elemento S/MAR. En una realización preferente adicional, la secuencia de carga está intercalada entre el al menos un promotor y el elemento S/MAR, en el que dicho elemento S/MAR está flanqueado por un donante de empalme y un aceptor de empalme; por lo tanto, preferentemente, el elemento S/MAR se empalma a partir de una transcripción que codifica la secuencia de carga. Así, en una realización preferente, el polinucleótido comprende además una secuencia codificante que codifica un polipéptido, en la que dicha secuencia codificante que codifica un polipéptido está intercalada entre dicho promotor y dicho elemento S/MAR. En otra realización preferente, la secuencia que codifica un polipéptido está intercalada entre el al menos un promotor y el elemento S/MAR, en el que dicho elemento S/MAR está flanqueado por un donante de empalme y un aceptor de empalme; así, preferentemente, el elemento S/MAR se empalma a partir de una transcripción que codifica el polipéptido.

Preferentemente, la secuencia que codifica un marcador seleccionable y la secuencia de carga están intercaladas por una secuencia que permite la expresión de dos (o más) polipéptidos en una célula eucariota a partir de un ARNm, por ejemplo, una secuencia de entrada ribosómica interna (IRE^s ) o, más preferentemente, una secuencia peptídica de autocicatrización como, más preferentemente, una secuencia peptídica 2A (P2A) de teschovirus-1 porcino. Las secuencias apropiadas son conocidas en la técnica, por ejemplo de Kim et al. (2011) PLoS ONE 6(4): e18556.

Preferentemente, el polinucleótido es un ADN. Preferentemente, el polinucleótido comprende además secuencias de control de expresión que permiten la expresión de genes en procariotas y/o eucariotas, preferentemente en células huésped eucariotas o fracciones aisladas de las mismas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido, preferentemente en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en células eucariotas, preferentemente células de mamífero, son bien conocidos en la técnica.

Preferentemente, comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción y, opcionalmente, señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización de la transcripción. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales y translacionales. Ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levadura o el promotor SMVP-, U6-, H1I-, 7S^k-, CMV- EFS-, SV40-, o RSV (virus del sarcoma de Rous), CMV-enhancer, SV40-enhancer o un intrón de globina en células de mamíferos y otros animales. Además, en un polinucleótido de la presente invención pueden incluirse secuencias de control de expresión inducibles o específicas del tipo celular. Las secuencias de control de la expresión inducible pueden comprender secuencias operadoras tet o lac o secuencias inducibles por choque térmico u otros factores ambientales. Las secuencias de control de expresión adecuadas son bien conocidas en la técnica. Además de los elementos responsables del inicio de la transcripción, dichos elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, como el sitio SV40-poly-A o el sitio tk-poly-A, aguas abajo del polinucleótido.

El término "célula huésped", tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier célula capaz de recibir y replicar de forma estable el polinucleótido. Preferentemente, la célula huésped es una célula eucariota, preferentemente una célula vegetal o de levadura, por ejemplo una célula de una cepa de levadura de panadería, o es una célula animal. Más preferentemente, la célula huésped es una célula de insecto o una célula de mamífero, en particular una célula de ratón o de rata. Aún más preferentemente, la célula huésped es una célula de mamífero, más preferentemente una célula humana. Preferentemente, la célula huésped es una célula progenitora CD34+; un trombocito CD61+; un linfocito B CD19+; un monocito CD14+; un granulocito CD15+; un linfocito T citotóxico CD3+, preferentemente también positivo para CD8 y CD45; un Linfocito T Auxiliar CD3+, preferentemente también positivo para CD4 y CD45; un Linfocito T Activado CD3+, preferentemente también positivo para CD25 y CD45, un Linfocito Infiltrante de Tumor, o una célula Asesina Natural (NK). Como comprenderá el experto en la materia, el polinucleótido puede tener además secuencias que permitan la replicación en una célula bacteriana, en particular un origen bacteriano de replicación. Preferentemente, la célula bacteriana es una célula de una cepa bacteriana de laboratorio, más preferentemente una célula de Escherichia coli.

El término "promotor" es, en principio, conocido por el experto en la materia como un elemento genético que dirige, opcionalmente en concierto con otros elementos reguladores, el nivel de transcripción de un gen dado. Un promotor puede ser constitutivo, es decir, proporcionar un nivel constante de transcripción esencialmente independiente del estado de una célula huésped, o puede estar regulado, es decir, proporcionar niveles de transcripción en función del estado de una célula huésped. Además, un promotor puede ser específico del tipo de célula y/o tejido, es decir, proporcionar un nivel detectable de transcripción sólo en unos pocos o en un único tipo de célula. Preferentemente, el promotor según la presente invención es activo en la célula huésped como se especifica anteriormente. Como comprenderá el experto en la materia, la selección del promotor puede depender del tipo de célula huésped a la que se dirige; en la técnica se conocen promotores adecuados para tipos celulares específicos, así como promotores constitutivos. Preferentemente, el promotor es un promotor eucariota, más preferentemente un promotor eucariota constitutivo, incluso más preferentemente un promotor eucariota fuerte. Preferentemente, el promotor es un promotor EF1alfa (factor de elongación 1 alfa), un promotor UbiC (ubiquitina C), un promotor ROSA 26, un promotor PGK (fosfoglicerato quinasa), y/o un promotor CAG (alfa-actina de pollo), más preferentemente es un promotor EF1alfa. También es preferible que el promotor sea un promotor eucariota específico de célula y/o tejido. En el presente documento, el término "promotor" se utiliza para el promotor especificado anteriormente, mientras que cualquier otro promotor potencialmente presente en el polinucleótido se denomina "promotor secundario". Así, preferentemente, el promotor es un promotor que dirige la transcripción a la secuencia S/MAR en una célula huésped; también preferentemente, un promotor que no dirige la transcripción a la secuencia S/MAR del polinucleótido, por ejemplo, siendo un promotor procariota, estando aislado transcripcionalmente de la secuencia S/MAR, y/o siendo un promotor que dirige la transcripción lejos de la secuencia S/MAR, es un promotor secundario. Preferentemente, el promotor comprende menos de 1000, más preferentemente menos de 250, aún más preferentemente menos de 100, lo más preferentemente menos de 20 pares de bases contiguas correspondientes a un promotor de Apolipoproteína B; así, preferentemente, el polinucleótido no comprende un promotor de Apolipoproteína B humana, más preferentemente no comprende un promotor de Apolipoproteína B.

Preferentemente, la secuencia S/MAR está situada inmediatamente aguas abajo del promotor y, si está presente, del gen marcador seleccionable como se especifica a continuación.

Preferentemente, estar situado "inmediatamente aguas abajo" es carecer de una señal de terminación de la transcripción intermedia, más preferentemente es carecer de un gen intermedio. Así, preferentemente, las transcripciones iniciadas en el promotor y, si están codificados, incluyendo la secuencia marcadora detectable comprenden preferentemente una secuencia S/MAR transcrita, más preferentemente comprenden la secuencia S/m Ar completa comprendida en el polinucleótido; como comprenderá el experto en la materia a la vista de la descripción en otra parte del presente documento, el polinucleótido puede incluir además sitios de empalme que medien la escisión de la secuencia S/MAR de la transcripción primaria; así, más preferentemente, preferentemente, al menos las transcripciones primarias iniciadas en el promotor y, si están codificados, incluyendo la secuencia marcadora detectable comprenden preferentemente una secuencia S/MAR transcrita, más preferentemente comprenden la secuencia S/MAR completa comprendida en el polinucleótido. También preferentemente, el término "inmediatamente aguas abajo" incluye un polinucleótido en el que el promotor y la secuencia S/MAR están separados por secuencias de ácido nucleico alargadas, siempre que no esté intercalada una señal de terminación de la transcripción entre el promotor y la S/MAR. Preferentemente, la secuencia que está intercalada entre el promotor o, si está presente, el codón de parada del gen marcador seleccionable y la secuencia S/MAR tiene una longitud de como máximo 2 kb, más preferentemente como máximo 0,5 kb, aún más preferentemente como máximo 0,2 kb, aún más preferentemente como máximo 0,1 kb, más preferentemente como máximo 50 pb.

El término "elemento S/MAR", también conocido bajo la designación "región de unión andamio/matriz", es, en principio, conocido por el experto en la materia para referirse a una secuencia de ADN que media la unión de la matriz nuclear de una célula eucariota a dicho ADN. Las secuencias S/MAR suelen proceder de secuencias del ADN de cromosomas eucarióticos. Existe una gran variedad de secuencias S/MAR, y las secuencias están disponibles en bases de datos públicas, por ejemplo, como se describe en Liebich et al. (2002), Nucleic Acids Res. Biol., 30, 312-374). Según la presente invención, la secuencia de ácido nucleico de dicho elemento S/MAR (denominada hasta ahora secuencia S/MAR) comprende al menos 3 motivos de secuencia ATTA por cada 100 nucleótidos en un tramo de 200 nucleótidos como máximo. Así, el motivo comprendido en la secuencia S/MAR comprende una multitud del motivo de cuatro nucleótidos 5-ATTA-3'. Preferentemente, la secuencia S/MAR tiene una longitud de al menos 200 nucleótidos, más preferentemente de al menos 300 nucleótidos, aún más preferentemente de al menos 400 nucleótidos, lo más preferentemente de al menos 500 nucleótidos. Preferentemente, la secuencia S/MAR tiene una longitud de 3 kb como máximo, más preferentemente de 2 kb como máximo, aún más preferentemente de 1,5 kb como máximo, aún más preferentemente de 1 kb como máximo, más preferentemente de 0,9 kb como máximo. En una realización preferente, la secuencia S/MAR tiene una longitud máxima de 0,7 kb, más preferentemente de 500 pb, más preferentemente de 250 pb. Así, preferentemente, la secuencia S/MAR tiene una longitud de 0,2 kb a 3 kb, más preferentemente de 0,3 kb a 2 kb, aún más preferentemente de 0,4 kb a 1,5 kb, más preferentemente de 0,5 kb a 1 kb. Como se comprenderá, la indicación "comprende n motivos de secuencia por cada 100 nucleótidos" se refiere al número medio de dichos motivos de secuencia calculado por cada 100 pares de bases de secuencia y, en consecuencia, puede ser un número fraccionario. Por ejemplo, el número de motivos de secuencia ATTA por cada 100 pares de bases en SEQ ID NO:6 es de 34 / 525 pares de bases * 100 pares de bases = 6,5. Preferentemente, el número de motivos de secuencia por 100 pares de bases se determina sobre toda la longitud de la secuencia S/MAR; en caso de duda, por ejemplo, cuando no se puede determinar un límite de la secuencia S/MAR, el número de motivos de secuencia por 100 pares de bases de un polinucleótido, preferentemente, es el número más alto determinable para cualquier ventana de 200 pb dentro de dicho polinucleótido, más preferentemente es el número más alto determinable para cualquier ventana de 500 pb dentro de dicho polinucleótido. Preferentemente, la secuencia S/MAR comprende al menos 4 motivos de secuencia ATTA por cada 100 nucleótidos en un tramo de al menos 200 nucleótidos, más preferentemente al menos 5 motivos de secuencia ATTA por cada 100 nucleótidos en un tramo de al menos 200 nucleótidos, aún más preferentemente al menos 6 motivos de secuencia ATTA por cada 100 nucleótidos en un tramo de al menos 200 nucleótidos. También preferentemente, la secuencia S/MAR comprende al menos 3 motivos de secuencia ATTA por 100 nucleótidos en un tramo de al menos 400 nucleótidos, más preferentemente al menos 4 motivos de secuencia ATTA por 100 nucleótidos en un tramo de al menos 400 nucleótidos, aún más preferentemente al menos 5 motivos de secuencia ATTA por 100 nucleótidos en un tramo de al menos 400 nucleótidos, más preferentemente al menos 6 motivos de secuencia ATTA por 100 nucleótidos en un tramo de al menos 400 nucleótidos. También preferentemente, la secuencia S/MAR comprende al menos 3 motivos de secuencia ATTA por cada 100 nucleótidos en un tramo de al menos 500 nucleótidos, más preferentemente al menos 4 motivos de secuencia ATTA por cada 100 nucleótidos en un tramo de al menos 500 nucleótidos, aún más preferentemente al menos 5 motivos de secuencia ATTA por cada 100 nucleótidos en un tramo de al menos 500 nucleótidos, más preferentemente al menos 6 motivos de secuencia ATTA por cada 100 nucleótidos en un tramo de al menos 500 nucleótidos. Así, preferentemente, la secuencia S/MAR comprende al menos 10 motivos de secuencia ATTA sobre una secuencia de 500 nucleótidos, más preferentemente al menos 20 motivos de secuencia ATTA sobre una secuencia de 500 nucleótidos, aún más preferentemente al menos 30 motivos de secuencia ATTA sobre una secuencia de 500 nucleótidos. Preferentemente, al menos el 80%, más preferentemente al menos el 90%, más preferentemente al menos el 95% de los motivos ATTA en la secuencia S/^m A^r están separados por de 9 a 13, preferentemente por 10 a 12, más preferentemente por 11 pares de bases, respectivamente.

Preferentemente, el elemento S/MAR comprende motivos de secuencia adicionales, preferentemente dentro de la secuencia que comprende los motivos ATTA descritos anteriormente. Preferentemente, el tramo de secuencia de dicho elemento S/MAR que comprende dichos motivos de secuencia ATTA comprende además al menos un motivo de secuencia ATTTA (SEQ ID NO:2), preferentemente al menos 2 motivos de secuencia ATTTA, más preferentemente al menos 4 motivos de secuencia ATTTA, más preferentemente al menos 8 motivos de secuencia ATTTA. También preferentemente, el tramo de secuencia de dicho elemento S/MAR que comprende dichos motivos de secuencia ATTA y, opcionalmente, dicho(s) motivo(s) ATTTA, comprende además al menos uno, preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos cuatro, lo más preferentemente al menos seis motivos palindrómicos, preferentemente motivos TAAATATTTTA (SEQ ID NO:3). Preferentemente, dichos motivos TAAATATTTTA son contiguos con al menos un motivo ATTA en el extremo 5' y/o en el extremo 3'. También preferentemente, el tramo de secuencia del elemento S/MAR que comprende dichos motivos de secuencia ATTA comprende al menos uno, preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos tres, aún más preferentemente al menos cuatro, más preferentemente al menos cinco motivos de secuencia ATTATAAATATTTTAATTA (SEQ ID NO:4), más preferentemente motivos de secuencia ATTTATAAATATTTTAATTA (SEQ ID NO:5).

También preferentemente, la secuencia S/MAR tiene un bajo contenido de G+C. El experto en la materia sabe cómo calcular el contenido de C+G de una secuencia conocida contando todas las bases de guanina y citidina de la secuencia y dividiendo el resultado acumulado por el número de nucleótidos de la secuencia. Preferentemente, el tramo de secuencia del elemento S/MAR que comprende dichos motivos de secuencia ATTA tiene un contenido de G+C de como máximo el 30%, más preferentemente como máximo el 20%, aún más preferentemente como máximo el 15%, aún más preferentemente como máximo el 10%, más preferentemente como máximo el 5%. Preferentemente, en los casos en los que no se pueda determinar el límite de un elemento S/MAR, la secuencia utilizada para calcular el contenido de G+C es la misma que se utiliza para calcular el número de motivos ATTA por cada 100 pares de bases, tal y como se ha especificado anteriormente. También es preferible que la secuencia S/MAR tenga un número reducido de dinucleótidos CG. Preferentemente, el tramo de secuencia de dicho elemento S/MAR que comprende dichos motivos de secuencia comprende como máximo 6 motivos de secuencia CG, más preferentemente como máximo 4, aún más preferentemente como máximo 2, lo más preferentemente no comprende un motivo de secuencia CG.

Preferentemente, la secuencia S/MAR comprende una secuencia S/MAR de un gen de Apolipoproteína B, preferentemente un gen de Apolipoproteína B humana, más preferentemente una secuencia 3' S/MAR de un gen de Apolipoproteína B humana. Más preferentemente, la secuencia S/MAR comprende una variante de un gen de la Apolipoproteína B humana, más preferentemente de una secuencia 3' S/MAR de un gen de la Apolipoproteína B humana. Así, preferentemente, la secuencia S/MAR comprende una secuencia al menos un 70% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:6, preferentemente de SEQ ID NO:7 u 8. Más preferentemente, la secuencia S/MAR comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO:6, preferentemente de SEQ ID NO:7, más preferentemente SEQ ID NO:8. En una realización preferente, la secuencia S/MAR comprende una secuencia al menos un 70% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 15, más preferentemente la secuencia S/MAR comprende la secuencia de SEQ ID NO: 15.-

Preferentemente, el polinucleótido comprende una señal poli-A aguas abajo del elemento S/MAR: Más preferentemente, el polinucleótido comprende una señal poli-A y una señal de terminación de la transcripción corriente abajo del elemento S/MAR. También preferentemente, el elemento S/MAR está flanqueado por un donante de empalme y un aceptor de empalme; así, en una realización preferente, se transcribe una transcripción a partir del promotor, a partir de cuya transcripción se empalma la secuencia del elemento S/MAR. También es preferible que la secuencia S/MAR se separe de la transcripción que codifica el marcador seleccionable después de la transcripción. También preferentemente, el polinucleótido comprende además un origen bacteriano (secundario) de replicación como se especifica en el presente documento y/o un gen marcador seleccionable bacteriano. Preferentemente, el origen bacteriano de replicación y el promotor que impulsa la expresión del gen marcador seleccionable bacteriano son procariota-específicos, es decir, más preferentemente, no son funcionales en una célula huésped. También preferentemente, el origen bacteriano de replicación y/o el gen marcador seleccionable bacteriano, preferentemente todos los elementos activos en una célula procariota comprendidos en el polinucleótido, están aislados de las secuencias residuales comprendidas en el polinucleótido por la presencia de al menos un elemento aislante, más preferentemente por estar flanqueados por elementos aislantes. Preferentemente, el origen bacteriano de replicación y/o el gen marcador seleccionable bacteriano, preferentemente todos los elementos activos en una célula procariota, están aislados de las secuencias residuales comprendidas en el polinucleótido por la presencia de al menos un elemento aislante en el extremo 5' y de al menos un elemento aislante en el extremo 3'. Más preferentemente, el origen bacteriano de replicación y/o el gen marcador seleccionable bacteriano, preferentemente todos los elementos activos en una célula procariota comprendidos en el polinucleótido, están aislados del promotor por la presencia de al menos un elemento aislante, más preferentemente por estar flanqueados por elementos aislantes. Preferentemente, dicho(s) elemento(s) aislante(s) es(son) un elemento antirrepresivo40 (SEQ ID NO:11) o una variante del mismo y/o un elemento S/MAR.

Así, preferentemente, el polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO:7 u 8 o de una secuencia al menos 70% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:7 u 8; preferentemente de SEQ ID NO:12 o de una secuencia al menos 70% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:12, más preferentemente de SEQ ID NO:13 o de una secuencia al menos un 70% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:13, más preferentemente de SEQ ID NO:14 o de una secuencia al menos un 70% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:14. Preferentemente, el polinucleótido comprende la secuencia de SEQ ID NO:14 con la secuencia de ácido nucleico que codifica GFP sustituida por una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido diferente, preferentemente un polipéptido terapéutico, más preferentemente un Receptor de Células T (TCR) humano, Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), preferentemente MARTI TCR.

Preferentemente, el polinucleótido comprende además una secuencia codificante que codifica un polipéptido marcador seleccionable, estando dicha secuencia marcadora seleccionable intercalada entre el promotor del polinucleótido y el elemento S/MAR del polinucleótido, preferentemente en el que dicho promotor y dicha secuencia marcadora seleccionable constituyen juntos un gen marcador seleccionable. En el presente documento, el término "secuencia marcadora seleccionable" se utiliza como abreviatura de la expresión "secuencia codificadora que codifica un polipéptido marcador seleccionable". El término "marcador seleccionable" es en principio comprendido por el experto en la materia y se refiere a una secuencia de ácido nucleico que confiere, cuando se expresa en una célula huésped, resistencia a al menos una condición que media la presión selectiva a una célula huésped cuando se aplica a la misma. Los marcadores seleccionables son conocidos en la técnica para células procariotas y eucariotas. Preferentemente, el marcador seleccionable es un marcador seleccionable de una célula eucariota. Preferentemente, el marcador seleccionable es un polipéptido marcador seleccionable, más preferentemente un polipéptido marcador seleccionable que tiene actividad transportadora y/o enzimática que elimina un compuesto selectivo de una célula huésped o modifica dicho compuesto selectivo para hacerlo inactivo. Preferentemente, el gen marcador seleccionable codifica además al menos un intrón, preferentemente aguas arriba de la secuencia que codifica el polipéptido marcador seleccionable. Preferentemente, el marcador seleccionable es un marcador que media la resistencia a la puromicina, a la blasticidina, a la neomicina y/o a la zeocina, más preferentemente a la puromicina. Así, preferentemente, el promotor y el marcador seleccionable constituyen conjuntamente un gen de resistencia a la puromicina, un gen de resistencia a la blasticidina, un gen de resistencia a la neomicina o un gen de resistencia a la zeocina, más preferentemente un gen de resistencia a la puromicina. En una realización preferente, el marcador seleccionable es un polipéptido que proporciona resistencia a un conjunto específico de condiciones de crecimiento, preferentemente presencia y/o ausencia de señales de proliferación. Así, en una realización preferente, el marcador seleccionable es un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR), ambos conocidos en principio en la técnica. Preferentemente, el TCR y/o el CAR tienen una especificidad conocida, de manera que, preferentemente, la señalización de células T puede inducirse en células huésped que comprenden dicho TCR y/o CAR. Preferentemente, en tal caso, la célula huésped es una célula T o una célula NK. Preferentemente, el gen marcador seleccionable carece de señal poli-A y de señal(es) de terminación de la transcripción. Así, en una realización preferente, el polinucleótido comprende además una secuencia codificante que codifica un marcador seleccionable (secuencia de marcador seleccionable), estando dicha secuencia de marcador seleccionable intercalada entre dicho promotor y dicho elemento S/MAR, en el que dicho promotor y dicha secuencia de marcador seleccionable juntos constituyen un gen marcador seleccionable, y en el que dicho marcador seleccionable es un marcador seleccionable de una célula eucariota

Preferentemente, el marcador seleccionable es la puromicina acetiltransferasa (Genbank Acc No. KX548903.1 (SEQ ID NO:9), codificada por los nucleótidos 535 a 1134 del Genbank Acc No. KX548903.1 (SEQ ID NO:10)). Así, el gen marcador seleccionable, preferentemente, comprende una secuencia de ácido nucleico que a) causa la expresión de un polipéptido de resistencia a la puromicina que comprende la secuencia de SEQ ID NO:9; b) causa la expresión de un polipéptido de resistencia a la puromicina que comprende una secuencia al menos un 70% idéntica a la secuencia de SEQ ID NO:9; c) comprende la secuencia de SEQ ID NO:10; d) comprende una secuencia idéntica en al menos un 70% a la secuencia de SEQ ID NO:10, e) comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de resistencia a la puromicina que comprende, y preferentemente consiste en, la secuencia de SEQ ID NO:9, y/o f) comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de resistencia a la puromicina que comprende, y preferentemente consiste en, una secuencia idéntica en al menos un 70% a la secuencia de SEQ ID NO:9.

Tal como se utiliza aquí, el término "replicante" se refiere a la actividad del polinucleótido para inducir la producción de al menos dos réplicas de dicho polinucleótido en una célula huésped durante un ciclo de replicación celular. Así, preferentemente, la replicación de un polinucleótido en una célula huésped se determina determinando la presencia del polinucleótido tras una serie de divisiones celulares, en las que se habría esperado que se diluyera un polinucleótido no replicante. Preferentemente, la replicación es una replicación estable, es decir, es una replicación hasta tal punto que el polinucleótido sigue siendo detectable en una población de células huésped después de una media de 50 divisiones celulares, más preferentemente después de una media de 100 divisiones celulares, más preferentemente después de una media de 250 divisiones celulares. Preferentemente, la detección de un polinucleótido en una población de células huésped se realiza mediante PCR en condiciones estándar.

El término replicación "episomal" es, en principio, conocido por el experto en la materia para referirse a la replicación de un polinucleótido sin integrarse en el genoma celular, es decir, sin unirse covalentemente al genoma celular. Así, preferentemente, la replicación episomal de un polinucleótido es la replicación de dicho polinucleótido como una unidad de replicación autónoma. Preferentemente, la replicación episomal consiste en el mantenimiento del polinucleótido en la célula huésped en forma de molécula de ADN de doble cadena cerrada circularmente. Como comprenderá el experto en la materia, la replicación real de dicho polinucleótido puede implicar otras formas, por ejemplo, en replicación en círculo rodante. El mantenimiento episomal del ADN circular se verifica preferentemente mediante el procedimiento de rescate de plásmidos conocido por la persona experta; es decir, preferentemente, preparando un lisado de células huésped y transformando el ADN comprendido en el mismo en células bacterianas apropiadas, por ejemplo, células E. coli; si un número adecuado de colonias bacterianas obtenibles por dicho procedimiento comprende el ADN circular como un plásmido que tiene el mismo patrón de restricción y/o secuencia que el ADN circular original, se asume, preferentemente, que el ADN circular se mantuvo episomal. Otro procedimiento para verificar el mantenimiento episomal, que también conoce el experto en la materia, es el ADN/ADN blot (procedimiento "Southern Blot"); así, preferentemente, se prepara ADN total de células huésped y se digiere con una o más enzimas de restricción; si en un Southern Blot utilizando el plásmido original como sonda sólo son visibles bandas correspondientes al ADN circular original, se concluye preferentemente que el plásmido se mantiene episomal. Más preferentemente, el mantenimiento episomal se verifica como se describe aquí en los Ejemplos.

De acuerdo con esto, el término "replicación episomal", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la actividad de un polinucleótido para inducir la producción de al menos dos réplicas de dicho polinucleótido en una célula huésped durante un ciclo de replicación celular mientras dicho polinucleótido está presente en dicha célula como una entidad que se replica de forma autónoma; y la replicación episomal estable es la replicación episomal hasta tal punto que el polinucleótido es todavía detectable en la célula huésped después de al menos 50 divisiones celulares, preferentemente después de al menos 100 divisiones celulares, más preferentemente, después de al menos 250 divisiones celulares, más preferentemente, después de al menos 500 divisiones celulares. Preferentemente, dicho número de divisiones celulares es el número medio de divisiones celulares para una población de células.

El polinucleótido de la presente invención preferentemente carece de un origen de replicación del virus simio 40 (SV40), un origen de replicación del papilomavirus bovino (BPV) y un origen de replicación del virus de Epstein-Barr (EBV), preferentemente carece de un origen de replicación de poliomavirus, un origen de replicación de papilomavirus y un origen de replicación de herpesvirus; más preferentemente carece de un origen de replicación de un virus que infecte a eucariotas. Más preferentemente, el vector carece de cualquier origen de replicación eucariota conocido. Sin embargo, preferentemente, el polinucleótido comprende además un origen de replicación procariota, preferentemente bacteriano, en particular un origen de replicación de E. coli. Preferentemente, el origen procariota de replicación es el único origen de replicación incluido en el polinucleótido.

Ventajosamente, se encontró en el trabajo subyacente a la presente invención que combinando un elemento S/MAR como se especifica con un promotor que lee en dicho elemento S/MAR, se obtiene un polinucleótido que es altamente estable en forma episomal en células huésped, incluso en ausencia de un origen de replicación dedicado. Además, se descubrió que la eficacia del establecimiento del polinucleótido podía mejorarse aún más utilizando un gen de resistencia a la puromicina, asegurando la transcripción en el elemento S/MAR a través del gen de resistencia, y aislando transcripcionalmente la combinación promotor - S/MAR de otros promotores potencialmente presentes en el polinucleótido.

Las definiciones anteriores se aplican mutatis mutandis a lo siguiente. Las definiciones y explicaciones adicionales que se dan más adelante también se aplican a todas las realizaciones descritas en esta memoria descriptiva mutatis mutandis.

La presente invención se refiere además a una composición según la reivindicación 9; otra divulgación se refiere a una composición que comprende un polinucleótido según la presente invención.

El término "composición", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una composición de materia que comprende los compuestos tal como se especifican y, opcionalmente, uno o más vehículos aceptables. Preferentemente, la composición es una composición farmacéuticamente aceptable; así, preferentemente, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los compuestos de la presente invención pueden formularse como sales, preferentemente farmacéuticamente aceptables. Las sales preferentes comprenden acetato, metilester, HCl, sulfato, cloruro y similares.

El vehículo o vehículos deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los demás ingredientes de la formulación y no ser nocivos para el receptor de la misma. El vehículo empleado puede ser, por ejemplo, un sólido, un gel o un líquido. Ejemplos de soportes farmacéuticos sólidos son la lactosa, la terra alba, la sacarosa, el talco, la gelatina, el agar, la pectina, la acacia, el estearato de magnesio, el ácido esteárico y similares. Ejemplos de vehículos líquidos son la solución salina tamponada con fosfato, el jarabe, el aceite como el aceite de cacahuete y el aceite de oliva, el agua, las emulsiones, varios tipos de agentes humectantes, las soluciones estériles y similares. Del mismo modo, el vehículo o diluyente puede incluir material de retardo bien conocido en la técnica, como el monoestearato de glicerilo o el diestearato de glicerilo solos o con una cera. Dichos vehículos adecuados comprenden los mencionados anteriormente y otros bien conocidos en la técnica, véase, p. ej, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania. El diluyente o diluyentes se seleccionan de forma que no afecten a la actividad biológica de los compuestos de la composición. Ejemplos de tales diluyentes son el agua destilada, la solución salina fisiológica, las soluciones de Ringer, la solución de dextrosa y la solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica también puede incluir otros vehículos, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos y similares.

Preferentemente, la composición media la entrada del polinucleótido en una célula huésped. Así, preferentemente la composición comprende al menos un agente de transfección. La selección de un agente de transfección adecuado puede depender de la célula huésped diana, así como de la aplicación específica prevista. Los agentes de transfección, las condiciones de transfección adecuadas y los criterios de selección de los mismos son bien conocidos en la técnica. También preferentemente, la composición comprende partículas similares a virus. Así, preferentemente, el polinucleótido se empaqueta en partículas similares a virus, es decir, preferentemente, el polinucleótido está comprendido en las partículas similares a virus.

Las composiciones farmacéuticas se administran, preferentemente, por vía tópica o sistémica. Las vías de administración convencionalmente utilizadas para la administración de fármacos son la administración oral, intravenosa o parenteral, así como la inhalación. Sin embargo, dependiendo de la naturaleza y el modo de acción de un compuesto, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse también por otras vías. Por ejemplo, los compuestos polinucleotídicos pueden administrarse en un enfoque de terapia génica mediante el uso de vectores virales o virus o liposomas, como se ha especificado anteriormente. Además, los compuestos pueden administrarse en combinación con otros fármacos, ya sea en una composición farmacéutica común o como composiciones farmacéuticas separadas, en las que dichas composiciones farmacéuticas separadas pueden suministrarse en forma de kit de piezas. Los compuestos se administran, preferentemente, en formas de dosificación convencionales preparadas combinando los fármacos con soportes farmacéuticos estándar según procedimientos convencionales.

Estos procedimientos pueden consistir en mezclar, granular y comprimir o disolver los ingredientes según convenga a la preparación deseada. Se apreciará que la forma y el carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable vienen dictados por la cantidad de principio activo con el que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas.

Una dosis terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica se refiere a una cantidad de los compuestos a utilizar en una composición farmacéutica de la presente invención que previene, mejora o trata los síntomas que acompañan a una enfermedad o afección a la que se hace referencia en esta memoria descriptiva. La eficacia terapéutica y la toxicidad de dichos compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico, y puede expresarse como la relación, LD50/ED50.

El régimen de dosificación será determinado por el médico tratante y otros factores clínicos; preferentemente de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente. Como es bien sabido en las artes médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, como el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto concreto que se va a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, el estado general de salud y otros fármacos que se administren simultáneamente. Los progresos pueden controlarse mediante evaluaciones periódicas. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el rango de 1 a 1000 |jg; sin embargo, se prevén dosis por debajo o por encima de este rango ejemplar, especialmente teniendo en cuenta los factores antes mencionados. Generalmente, el régimen como administración regular de la composición farmacéutica debe estar en el rango de 1 jg a 10 unidades mg por día. Si el régimen es una infusión continua, también debe estar en el rango de 1 jg a 10 mg unidades por kilogramo de peso corporal por minuto, respectivamente. Los progresos pueden controlarse mediante evaluaciones periódicas. Sin embargo, dependiendo del sujeto y del modo de administración, la cantidad de sustancia administrada puede variar en un amplio rango para proporcionar desde aproximadamente 0,01 mg por kg de masa corporal hasta aproximadamente 10 mg por kg de masa corporal. En caso de que se administre un vector viral, en particular un vector viral adenoasociado, las dosis preferentes son de 5 * 1011, a 2 * 1013 partículas virales o genomas virales / kg de peso corporal; como se comprenderá, estas dosis ejemplares pueden modificarse dependiendo, además de los factores descritos anteriormente, de factores adicionales como el tipo de virus, el órgano diana, y similares.

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas mencionadas en el presente documento se administran al menos una vez para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección mencionada en esta memoria descriptiva. Sin embargo, dichas composiciones farmacéuticas pueden administrarse más de una vez, por ejemplo de una a cuatro veces al día hasta un número no limitado de días.

Las composiciones farmacéuticas específicas se preparan de una manera bien conocida en el arte farmacéutico y comprenden al menos un compuesto activo mencionado anteriormente en mezcla o asociado de otro modo con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Para elaborar esas composiciones farmacéuticas específicas, el compuesto o compuestos activos se mezclarán normalmente con un vehículo o diluyente, o se encerrarán o encapsularán en una cápsula, sobre, cache, papel u otros contenedores o vehículos adecuados. Las formulaciones resultantes se adoptarán al modo de administración, es decir, en forma de comprimidos, cápsulas, supositorios, soluciones, suspensiones o similares. Las recomendaciones de dosificación se indicarán en las instrucciones del prescriptor o del usuario para anticipar los ajustes de dosis en función del receptor considerado.

La presente invención también se refiere a un polinucleótido según la reivindicación 1, una composición según la reivindicación 9, y/o una célula huésped según la reivindicación 10, para su uso en medicina. La presente invención se refiere además a un polinucleótido según la reivindicación 1, una composición según la reivindicación 9, y/o una célula huésped según la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de enfermedades genéticas.

El término "enfermedad genética", tal como se utiliza aquí, se refiere a una enfermedad causalmente vinculada a una o más modificaciones, preferentemente mutaciones, en el genoma de un individuo. Así, preferentemente, la enfermedad genética está causalmente vinculada a uno o más cambios epigenéticos, más preferentemente está causalmente vinculada a una o más mutaciones genéticas. Como se comprenderá, los síntomas de una enfermedad genética a menudo están causados por la expresión de un gen mutado y/o la falta de expresión de un gen que proporciona la función normal del producto génico en uno o más tejido(s) y/o tipo(s) celular(es) específico(s). Así, puede ser preferible tratar la enfermedad genética sólo en aquellas células en las que la mutación contribuye a la enfermedad. Preferentemente, la enfermedad genética es una enfermedad monogénica, es decir, está causada por una alteración genética en un gen. Más preferentemente, la enfermedad genética es una enfermedad recesiva monogénica, es decir, está causada por alteraciones genéticas en ambos alelos de un gen; por lo tanto, preferentemente, la mejora de los síntomas se espera mediante la provisión de al menos una copia inalterada del gen afectado. Más preferentemente, la enfermedad genética es la fenilcetonuria, la alcaptonuria, la amaurosis congénita de Leber, la coroideremia o la enfermedad de Stargardt. En una realización preferente, la enfermedad genética es el cáncer.

La presente invención también se refiere a un kit que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1 y un compuesto mediador de la entrada celular.

El término "kit", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una colección de los compuestos, medios o reactivos de la presente invención antes mencionados que pueden o no estar envasados juntos. Los componentes del kit pueden estar compuestos por viales separados (es decir, como un kit de piezas separadas) o suministrados en un único vial. Además, debe entenderse que el kit de la presente invención, preferentemente, debe utilizarse para practicar los procedimientos mencionados anteriormente. Preferentemente, se prevé que todos los componentes se suministren listos para su uso en la práctica de los procedimientos mencionados. Además, el kit, preferentemente, contiene instrucciones para llevar a cabo dichos procedimientos. Las instrucciones pueden proporcionarse mediante un manual de usuario en papel o en formato electrónico. Además, el manual puede incluir instrucciones para interpretar los resultados obtenidos al llevar a cabo los procedimientos mencionados utilizando el kit de la presente invención. Como se entenderá de lo anterior, la descripción del kit que comprende polinucleótidos, preferentemente, se refiere a un kit que comprende vectores correspondientes mutatis mutandis.

Preferentemente, el kit comprende además al menos un compuesto mediador de la entrada celular para el polinucleótido que comprende, el término "compuesto mediador de la entrada celular" se refiere a cualquier medio adecuado para hacer que un polinucleótido del kit entre en el interior de una célula huésped, preferentemente una célula huésped. Los compuestos adecuados que median la entrada de células (medios de administración) son conocidos en la técnica e incluyen, en particular, medios de transfección, composiciones de envasado y similares. Preferentemente, el polinucleótido de la presente invención está preenvasado en un medio de administración, por ejemplo, en partículas víricas, más preferentemente en partículas víricas con replicación defectuosa, más preferentemente en partículas similares a virus (VLPs). La persona experta conoce los medios de administración que proporcionan diferentes especificidades para los receptores celulares, de modo que pueden seleccionarse los medios de administración apropiados para una célula huésped diana determinada.

La presente invención se refiere además a un dispositivo que comprende un polinucleótido según la reivindicación 1, una composición según la reivindicación 9, y/o una célula huésped según la reivindicación 10.

El término "dispositivo", tal como se utiliza aquí se refiere a un sistema de medios que comprende al menos los medios operativamente vinculados entre sí para permitir la administración del compuesto o de la composición de la presente invención. Los medios preferidos para administrar polinucleótidos, composiciones y células huésped son bien conocidos en la técnica. La forma de vincular los medios de forma operativa dependerá del tipo de medios incluidos en el dispositivo y del tipo de administración prevista. Preferentemente, en tal caso los medios están compuestos por un único dispositivo. En consecuencia, dicho dispositivo puede incluir una unidad de suministro para la administración del compuesto o composición y una unidad de almacenamiento para guardar dicho compuesto o composición hasta su administración. Sin embargo, también se contempla que los medios de la invención actual pueden aparecer como dispositivos separados en tal realización y son, preferentemente, empaquetados juntos como un kit. El experto en la materia se dará cuenta de cómo enlazar los medios sin más. Los dispositivos preferidos son los que pueden aplicarse sin los conocimientos particulares de un técnico especializado. En una realización preferente, el dispositivo es una jeringa, más preferentemente con una aguja, que comprende el compuesto o la composición de la invención. En otra realización preferente, el dispositivo es un equipo de infusión intravenosa (IV) que comprende el compuesto o la composición. En otra realización preferente, el dispositivo es un dispositivo endoscópico que comprende el compuesto o medicamento para lavar un lugar de administración, o que comprende además una aguja para la aplicación tópica del compuesto o composición, por ejemplo a un tumor. En otra realización preferente, el dispositivo es un inhalador que comprende el compuesto de la presente invención, en el que, más preferentemente, dicho compuesto está formulado para su administración en forma de aerosol.

La presente solicitud también se refiere a un procedimiento según la reivindicación 14; también se divulga un procedimiento para transfectar de forma estable una célula huésped, que comprende

a) poner en contacto dicha célula huésped con un polinucleótido según la presente invención, una composición según la presente invención, y/o una célula huésped según la presente invención, y,

b) transfectar de forma estable una célula huésped.

El procedimiento para transfectar de forma estable una célula huésped de la presente invención, preferentemente, es un procedimiento in vitro. Además, puede comprender etapas adicionales a las mencionadas explícitamente. Por ejemplo, otros pasos pueden referirse, por ejemplo, a proporcionar una célula huésped o una muestra que comprenda la misma para el paso a), y/o aplicar presión selectiva a las células huésped contactadas. Además, una o varias de dichas etapas pueden ser realizadas por equipos automatizados.

El término "transfectar de forma estable" una célula huésped se entiende que se refiere a la introducción de un polinucleótido, preferentemente un polinucleótido heterólogo, en una célula de forma que el polinucleótido sea replicado de forma estable por la célula huésped como se especifica anteriormente. Preferentemente, la transfección estable comprende la replicación episomal estable del polinucleótido. Preferentemente, la transfección estable comprende, tras el contacto, la aplicación de presión selectiva a la célula huésped para seleccionar la presencia de un marcador seleccionable. La presión selectiva se aplica después del contacto, excluyendo opcionalmente un primer intervalo de tiempo que permita al polinucleótido establecerse dentro de la célula huésped; la duración de dicho primer intervalo de tiempo que permita al polinucleótido establecerse dentro de la célula huésped dependerá principalmente del tipo de célula huésped contactada y del tipo de marcador seleccionable utilizado; preferentemente, la duración de dicho primer intervalo de tiempo que permita al polinucleótido establecerse dentro de la célula huésped es de 1 h a 48 h, más preferentemente de 2 h a 24, más preferentemente de 3 h a 16 h. Sin embargo, la duración de dicho primer marco temporal que permite al polinucleótido establecerse dentro de la célula huésped también puede ser cero, es decir, la presión selectiva puede aplicarse inmediatamente después del contacto o incluso durante el contacto. La presión selectiva puede aplicarse de forma continua, es decir, esencialmente en todos los puntos temporales tras el primer lapso de tiempo que permite que el polinucleótido se establezca dentro de la célula huésped, más preferentemente para evitar que proliferen las células huésped que no comprenden el polinucleótido; o puede aplicarse de forma transitoria, más preferentemente para eliminar las células que no han recibido el polinucleótido. Preferentemente, la aplicación transitoria de presión selectiva se utiliza en los casos en que las células se transfieren de nuevo a un organismo después de dicho contacto. Sin embargo, también se prevé que no se aplique ninguna presión selectiva, en particular en los casos en los que se sabe que la eficacia de la transferencia del polinucleótido a las células huésped diana es suficientemente alta y/o en los que una población pura de células huésped transgénicas no es de gran importancia. En una realización preferente, también puede obtenerse una población de células transfectadas de forma estable permitiendo que se exprese una secuencia de carga que codifica un polipéptido detectable como se especifica anteriormente, y eligiendo las células que expresan la secuencia de carga, por ejemplo, mediante clasificación celular, preferentemente FACS. En una realización preferente, la transfección estable comprende la replicación episomal estable del polinucleótido, preferentemente replicación episomal hasta tal punto que el polinucleótido todavía es detectable en una población de células huésped después de una media de 50 divisiones celulares.

El término "puesta en contacto", tal como se utiliza en el contexto de los procedimientos de la presente invención, es comprendido por el experto en la materia. Preferentemente, el término se refiere a poner al menos un polinucleótido, vector y/o célula huésped de la presente invención en contacto físico con una célula huésped, por ejemplo, permitiendo que la célula huésped y el compuesto o compuestos interactúen. Preferentemente, el contacto incluye el suministro de al menos un polinucleótido de la presente invención en el interior de una célula huésped, preferentemente a través de un medio de suministro como se ha especificado anteriormente.

La presente divulgación también se refiere a un procedimiento para tratar una enfermedad genética en un sujeto, que comprende

a) poner en contacto a dicho sujeto con un polinucleótido según la presente invención, una composición según la presente invención, y/o una célula huésped según la presente invención, y,

b) de este modo, tratar la enfermedad genética en dicho sujeto.

El procedimiento para tratar enfermedades genéticas de la presente divulgación, preferentemente, es un procedimiento in vivo. Además, puede comprender etapas adicionales a las mencionadas explícitamente. Por ejemplo, los pasos adicionales pueden referirse, por ejemplo, a proporcionar una célula huésped o una muestra que comprenda la misma para el paso a), y/o volver a administrar dicha muestra o célula huésped al sujeto. Así, el procedimiento para tratar enfermedades genéticas, comprende los pasos del procedimiento para transfectar de forma estable una célula huésped como se ha especificado anteriormente. Además, una o varias de dichas etapas pueden ser realizadas por equipos automatizados.

Además, la presente invención se refiere a un uso según la reivindicación 15; también se divulga un uso de un polinucleótido de la presente invención para modificar genéticamente de forma estable una célula huésped.

Asimismo, la presente divulgación se refiere a un uso de un polinucleótido según la presente invención, una composición según la presente invención, y/o una célula huésped según la presente invención, para la fabricación de un medicamento. Y a un uso de un polinucleótido según la presente invención, una composición según la presente invención, y/o una célula huésped según la presente invención, para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad genética, preferentemente una enfermedad monogénica, más preferentemente una enfermedad monogénica recesiva, más preferentemente fenilcetonuria, alcaptonuria, Amaurosis Congénita de Leber, Coroideremia, o enfermedad de Stargardt. En una realización preferente, la enfermedad genética es el cáncer, como se ha especificado anteriormente.

Asimismo, la presente divulgación se refiere a un uso de un polinucleótido según la presente invención, una composición según la presente invención, y/o una célula huésped según la presente invención, para la modificación genética de una célula primaria, preferentemente un fibroblasto dérmico primario, para la generación de una Célula Madre Pluripotente Inducida (IPSCs). Preferentemente, dicha célula primaria es una célula primaria de ratón o humana.

El término "célula primaria" es entendido por el experto en la materia como opuesto a una célula de una línea celular cultivada; así, preferentemente, una célula primaria es una célula derivada de un organismo vivo y que ha sido cultivada durante un máximo de 20 pasajes, más preferentemente un máximo de 15 pasajes, aún más preferentemente un máximo de 10 pasajes, aún más preferentemente un máximo de 5 pasajes. Lo más preferible es que las células primarias sean células derivadas directamente del tejido de un ser vivo, preferentemente un ratón o un ser humano.

El término "célula madre" también es entendido por el experto en la materia para referirse a una célula no diferenciada o poco diferenciada con el potencial de diferenciación en al menos dos tipos celulares, preferentemente al menos cinco tipos celulares, más preferentemente al menos un linaje celular completo. Preferentemente, la célula madre es una célula madre totipotente, más preferentemente una célula madre pluripotente. El término "célula madre pluripotente inducida" o "IPSC" se refiere a una célula madre pluripotente derivada de una célula diferenciada, preferentemente una célula primaria diferenciada. Los procedimientos para generar las IPSC son conocidos en la técnica e incluyen, preferentemente, la expresión de cuatro factores de transcripción en la célula (por ejemplo, de Takahashi et al. (2006), Cell. 126 (4): 663).

La presente divulgación también se refiere a un uso de un polinucleótido según la presente invención, una composición según la presente invención, y/o una célula huésped según la presente invención, para la modificación genética de células madre embrionarias. La presente divulgación también se refiere a un uso de un polinucleótido según la presente invención, una composición según la presente invención, y/o una célula huésped según la presente invención, para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad genética, preferentemente enfermedad monogénica, más preferentemente enfermedad monogénica recesiva, más preferentemente fenilcetonuria, alcaptonuria, Amaurosis Congénita de Leber, Coroideremia, o enfermedad de Stargardt, en el que dicho medicamento comprende células huésped que comprenden un polinucleótido de la presente invención.

La presente divulgación también se refiere a un uso de un polinucleótido según la presente invención, una composición según la presente invención, y/o una célula huésped según la presente invención, para la modificación genética de células madre para generar un animal transgénico. La presente divulgación se refiere además a un uso de un polinucleótido según la presente invención, una composición según la presente invención, y/o una célula huésped según la presente invención, para la producción de un animal transgénico.

El término "animal transgénico", tal como se utiliza aquí, se refiere a un animal que comprende al menos un polinucleótido heterólogo, preferentemente introducido en dicho animal por procedimientos de ingeniería genética. Preferentemente, el animal transgénico comprende al menos una, más preferentemente al menos 10, aún más preferentemente al menos 1000, aún más preferentemente al menos 10000 células que comprenden al menos un polinucleótido según la presente invención.

Asimismo, la presente divulgación se refiere a un uso de un polinucleótido según la presente invención, una composición según la presente invención, y/o una célula huésped según la presente invención, para la modificación genética de embriones unicelulares mediante inyección pronuclear.

Tal como lo entiende el experto en la materia, el término "inyección pronuclear" se refiere a la inyección de material genético, preferentemente un polinucleótido de la presente invención, en el núcleo de un ovocito fecundado, preferentemente para crear un animal transgénico.

La presente divulgación se refiere además al uso del polinucleótido según la presente invención o la composición según la presente invención para modificar la expresión génica en una célula huésped. Para ello, pueden incluirse en forma expresable secuencias polinucleotídicas que codifican ácidos nucleicos interferentes no codificantes. El ácido nucleico interferente no codificante que se expresa a partir del polinucleótido, por tanto, puede ser típicamente un ARN antisentido, ARNsi, microARN o ribozima. De este modo, la expresión génica puede modificarse, es decir, regularse a la baja, utilizando el polinucleótido o la composición según la presente invención. Los vectores de expresión para ácidos nucleicos interferentes no codificantes que comprenden el polinucleótido de la invención tienen una estabilidad y un rendimiento de expresión mejorados, pero podrían expresar simultáneamente los ácidos nucleicos interferentes no codificantes funcionales en una célula huésped o en un organismo huésped. Por lo tanto, las construcciones de expresión que comprenden el polinucleótido de la invención y un polinucleótido en forma expresable que codifica un ácido nucleico interferente no codificante, tal como se ha especificado anteriormente, también pueden utilizarse para el silenciamiento de genes en un contexto clínico, es decir, para tratar enfermedades o trastornos, incluidos los mencionados en esta memoria descriptiva en otro lugar. Debido a la mejora de las características de estabilidad y expresión, también se pueden mejorar los enfoques de silenciamiento de genes.

Figuras y Leyendas

Fig. 1: Eficacia del establecimiento y análisis de la población de células modificadas genéticamente: A) Una placa de cultivo celular con colonias teñidas con Crystal Violet que se han formado tras 4 semanas de selección con Puromicina; la eficiencia de establecimiento del vector fue de aproximadamente el 40%; B) Detección FACS de la fluorescencia de GFP en células seleccionadas con Puromicina; la fluorescencia es muy homogénea y el número de células no fluorescentes es extremadamente bajo; 1= pEPI, 2= pSMARt.

Fig. 2: Resultado del rescate de plásmidos de vectores pS/MARt a partir de poblaciones celulares establecidas. Rescate de plásmidos y análisis de restricción tras la transformación bacteriana de ADN total derivado de células Hek293T establecidas con ADN plasmídico pS/MARt y pEPI.

Fig. 3: Southern blot de vectores pSMARt mantenidos en células seleccionadas: se utilizaron como sondas oligonucleótidos que hibridaban con el gen GFP de pS/MART para detectar ADN vectorial restringido por BamHI en extractos de células huésped (pS/MARt1 a 3); el vector no transfectado se utilizó como control ("pS/MARt(+)").

Fig. 4: Mapa vectorial de pS/MART; ori: origen bacteriano de replicación, P2A: secuencia que codifica el péptido 2A de autocicatrización del teschovirus-1 porcino, apolipoB MAR: Secuencia S/MAR del gen de la apolipoproteína B.

Fig. 5: Ensayo de formación de colonias con diferentes versiones de pSMARt en células Hek293T y HeLa

Fig. 6: pSMARt se retiene eficazmente en las células en división también en ausencia de selección continua

Fig. 7: La eficacia de establecimiento de pSMARt es independiente del marcador de selección (A), pero la presencia de un elemento aislante antes del promotor aumenta su eficacia de establecimiento (B); Fig 7 A : 1=pEPI, 2 pSMARt-Ele40-GFP-2A-Puro, 3=pSMARt-Ele40-GFP-2A-G418; B: 1=pSMARt-UCOE, 2=pSMARt-Ele40, 3=pSMARt, 4=pEPI

Fig. 8: Los vectores pSMARt se retienen eficazmente en células CD3+ humanas primarias durante más de un mes.

Fig. 9: La introducción de uniones de empalme flanqueando el SMAR mejora el establecimiento de los vectores en las células en división. (1) pEPI, (2) pS/MARt, (3) NP, (4) NP-SPlice (1,2,3,4 todos con (3-inf MAR) (5) pS/MARt.

Fig. 10: pSMARt se mantiene en células madre embrionarias de ratón (mESC) y la presencia del vector no influye en el comportamiento de las células.

Fig. 11: Los vectores pSMARt son activos durante la embriogénesis y la diferenciación, y son resistentes al silenciamiento epigenético

Fig. 12: pSMARt mantiene la expresión del transgén GFP durante la diferenciación de células madre

Fig. 13: Comparación de células CAR-T modificadas con vectores pSMARt y lentivirus; destrucción tumoral en tiempo real, producción de interferón y análisis de citotoxicidad.

Fig. 14: Análisis de la destrucción tumoral in vivo

Fig. 15: Análisis de muestras tumorales y mantenimiento in vivo de células T CAR modificadas con pSMARt y lentivirus; 1= control del isotipo, 2= no tratadas, 3= tratadas con células T simuladas, 4= células T transducidas con lentivirus que codifica para el CAR anti CEA humano, 5= células T transfectadas con pSMARt que codifica para el CAR anti CEA humano

Fig. 16: Datos de expresión de los vectores pS/MARt y Nano que contienen las secuencias de empalme. Las poblaciones celulares Hek293T establecidas con diferentes versiones de pS/MARt se analizaron para determinar la expresión del transgén 35 días después de la entrega del ADN y la selección en puromicina (0,5 ug/ml) mediante citometría de flujo (A). Se evaluó la expresión relativa del transgén GFP y se normalizó con respecto a la expresión del gen de mantenimiento GAPDH (B). La figura muestra que la introducción de secuencias de empalme mejora la expresión del transgén al mejorar la cantidad de ARN en las células. Figura (A): (1) pS/MARt, (2) Nano-S/MARt, (3) Nano-S/MARt-splice; Figura (B): (1) pS/MARt, (2) Nano-S/MARt, (3) Nano-S/MARt-splice.

Los siguientes Ejemplos son meramente ilustrativos de la invención. No deben interpretarse, en modo alguno, como una limitación del ámbito de la invención.

Ejemplo 1: Eficacia del establecimiento y análisis de la población de células modificadas genéticamente (Fig.

1)

La eficacia en la generación de células con expresión estable se evaluó en un ensayo de formación de colonias utilizando pS/MARt en comparación con pEPI (Fig. 4, SEQ ID NO:14). Tras la administración del ADN, se aislaron las células positivas para la expresión del transgén GFP mediante clasificación FACS (FACS Aria II) y se sembraron 100 células en una placa de cultivo celular de 6 cm. A continuación, se cultivaron durante 4 semanas en presencia de 0,5 |jg/ml de puromicina. Después de 4 semanas, las células se fijaron con PFA y las colonias se tiñeron con Crystal Violet. El número de colonias se considera la eficacia del establecimiento del vector, es decir, el número de colonias que se forman por cada número de células clasificadas por FACS que se siembran. La generación de líneas celulares estables es muy eficaz, ya que más del 40 % de las células transfectadas llegan a establecerse (Fig. 1A)). El número de células que expresaban el transgén (GFP) se estimó mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 1 b), pS/MARt genera poblaciones modificadas en las que la expresión del transgén es homogénea sin un número significativo de células negativas.

La eficacia de la generación de células con expresión estable se evaluó mediante citometría de flujo. Las células Hek293T se transfectaron con pEPI o pS/MARt. Las células se cultivaron durante 35 días y luego se sometieron a un análisis FACS para determinar la proporción de células que seguían expresando el transgén (GFP) y su intensidad de fluorescencia media. Los paneles superiores de la Fig 1 B) muestran que pS/MARt genera una población de células modificadas genéticamente en las que la expresión del transgén es robusta y homogénea. Esto contrasta con las células transfectadas con pEPI, que muestran niveles heterogéneos y bajos de expresión del transgén. Los gráficos de barras muestran que en estos grupos celulares no hay una población significativa de células negativas en las líneas pS/MARt, mientras que las líneas pEPI han silenciado predominantemente o perdido la expresión del transgén. Además, en las líneas pS/MARt la expresión media del transgén es sustancialmente mayor. Detalles experimentales: transfección celular con JetPEI, selección con 0,5 ug/ml de Puro y 1mg/ml de G418 para pEPI.

Ejemplo 2: Rescate plasmídico de vectores pS/MARt a partir de poblaciones celulares establecidas (Fig.2)

Se realizaron experimentos de rescate de ADN para determinar el estado episomal y la integridad molecular del vector en células de mamífero.

El ADN vectorial se aisló de células establecidas con el plásmido pS/MARt o pEPI. Estas células se expandieron en presencia del antibiótico Puromicina (0,5 ug/ml) durante 1 semana y se siguieron expandiendo durante al menos 30 días sin antibiótico. Para el rescate de plásmidos, el ADNg de las células establecidas se extrajo con el kit Blood&Tissue DNAeasy (Qiagen) y se transformó en DH10B E.Coli. Las bacterias se cultivaron en placas LB-Agar con Kanamicina (50 ug/ml). se cultivaron 12 colonias en medio LB líquido con Kanamicina (50 ug/ml) durante una noche y se extrajo ADN plasmídico con el MiniprepKit (Qiagen). Para el análisis, las minipreparaciones de ADN se digirieron con la enzima de restricción BamHI (Thermo Fisher) durante 10 min a 37 °C y el patrón de restricción se abordó en un gel de agarosa al 1%. Como control, el ADN utilizado para transfectar las células al principio del procedimiento de establecimiento se digirió con la misma enzima y se utilizó como referencia. (A) Se analizaron 12 muestras representativas aisladas de pS/MART y se demostró que eran molecularmente equivalentes al vector de ADN original, mientras que el ADN rescatado de células establecidas con pEPI (B) se mostró molecularmente disímil al vector original, con bandas difuminadas que mostraban claramente reordenamientos del ADN original.

Ejemplo 3: Los vectores pS/MARt se mantienen de forma episomal en células modificadas (Fig. 3)

Para demostrar aún más que los vectores pS/MARt modificaban las células de mamífero como un episoma, se determinó físicamente la estructura mediante el análisis Southern Blot. Se analizaron poblaciones de células Hek293T cultivadas durante al menos 30 días tras la transfección del ADN. El ADN genómico se extrajo con el kit Blood&Tissue DNAeasy (Qiagen) y se digirió durante la noche a 37 °C con la enzima de restricción BamHI (NEB). A continuación, el ADN celular total se separó en un gel de agarosa al 1% y se transfirió a una membrana de nailon. Se utilizaron oligonucleótidos correspondientes al gen GFP del vector para generar la sonda radiactiva utilizada para detectar el ADN pS/MARt dentro del ADN celular. La presencia en las muestras de una única banda que tiene el mismo tamaño que el vector de control demuestra el estado episomal de pS/MARt en las poblaciones celulares de mamíferos establecidas. La ausencia de frotis y/o bandas alternativas demuestra que los vectores no se reorganizaron ni se integraron en el genoma celular.

Ejemplo 3: Eficacia en la generación de células con expresión estable (Fig.5)

La eficacia en la generación de células con expresión estable mediante una serie de vectores de ADN pS/MARt que albergan componentes de la ApoL-MAR y la beta-IFN-MAR se evaluó en un ensayo de formación de colonias. Tras la administración del ADN, se aislaron las células positivas para la expresión del gen informador GFP mediante clasificación FACS (FACS Aria II) y se sembraron 100 en una placa de cultivo celular de 6 cm. A continuación, las células se cultivaron durante 4 semanas en presencia de 0,5 g/ml de Puromicina. Después de 4 semanas, las células se fijaron con PFA y las colonias se tiñeron con Crystal Violet y se cuantificaron. El número de colonias se considera como la eficiencia de establecimiento del vector. El ensayo muestra que los vectores diseñados con el ApoL MAR, la secuencia Core o el Fragmento 2 son los más eficientes en la generación de células modificadas genéticamente.

Ejemplo 4: Estabilidad en ausencia de selección (Fig. 6)

Para evaluar si la secuencia aislante podía evitar el silenciamiento o la pérdida de vectores de ADN, se midió la expresión transgénica de GFP en células transfectadas con (A) pSMARt-insulator-GFP-2a-Puro beta interferón MAR o (B) pSMARt-insulator-GFP-2a-Puro ApoL MAR en ausencia de selección antibiótica. Las células se transfectaron con vectores de ADN y se cultivaron en 1 ug/ml de Puromicina. Al cabo de una semana, se dividieron las células y se eliminó el fármaco de un grupo representativo de células de cada transfección.

(1) pSMARt-insulator-GFP-2a-Puro beta interferón MAR - cultivado en selección continua

(2) pSMARt-insulador GFP-2A-Puro beta interferón MAR - selección eliminada

(3) pSMARt-insulator-GFP-2a-Puro ApoL MAR - cultivado en selección continua

(4) pSMARt-insulator GFP-2A-Puro ApoL MAR - selección eliminada

Ejemplo 5: Eficacia de establecimiento (Fig. 7)

Para evaluar la influencia del marcador de selección en la eficiencia de establecimiento, se realizaron ensayos de formación de colonias como se describe en la Figura 5. La Figura 7 (A) muestra que la eficacia de establecimiento con el vector de ADN pS/MARt es independiente del marcador de selección antibiótico. El marcador de selección mejora la eficacia de establecimiento cuando está ligado transcripcionalmente al motivo S/MAR. La Figura 7 (B) ilustra la mejora de la eficacia del establecimiento con la incorporación adicional de un elemento aislante entre el esqueleto bacteriano y el promotor eucariota.

Ejemplo 6: Estabilidad en células primarias (Fig.8)

Para evaluar la eficacia de nuestro sistema de vectores de ADN para transfectar células CD3+ humanas primarias y medir sus perfiles de expresión, se transfectaron tres variantes del sistema de vectores pS/MARt y pEPI que codifican GFP y se probó su capacidad para proporcionar una expresión sostenida del gen informador GFP en células T humanas. Los vectores de ADN se administraron a PBMC recién aisladas mediante electrotransferencia (Nucleofector Device Y, Lonza) y las células se cultivaron en presencia de IL-2 (5|jg/ml, Biolegend) durante 35 días. Cada 7 días se comprobó la expresión del transgén en las células y se estimuló su crecimiento añadiendo en el medio anticuerpos anti-CD28 (Bioegend) y anti-CD3 (Biolegend). El pS/MARt que porta la versión central del gen ApoLMAR es capaz de generar un mayor número de células que expresan el transgén en comparación con la secuencia completa de ApoL­ MAR, con el pS/MARt que alberga el pIPN MAR y con el pEPI.

Ejemplo 7: Empalme MAR (Fig.9)

Para demostrar que la eficiencia del establecimiento podría mejorarse mediante la introducción de secuencias de empalme, se generaron una serie de vectores de ADN con y sin los sitios donador y aceptor de empalme que flanquean el elemento MAR. Para evaluar la influencia de los elementos de empalme en la eficacia de establecimiento, se realizaron ensayos de formación de colonias como se describe en la Figura 5.

La eficiencia de establecimiento de los vectores de ADN se mejora significativamente al mejorar y minimizar la columna vertebral bacteriana. Con las mejoras enumeradas anteriormente, a saber, el marcador de selección y las secuencias insulator, y su columna vertebral más moderna y mejorada, pS/MARt se establece de forma más eficaz que pEPI. A su vez, la minimalización de la espina dorsal Figura 9 (3) mejora aún más este aspecto. La introducción de secuencias de empalme para eliminar el elemento S/MAR del ARNm casi duplica la eficacia de esta clase de vectores. Este efecto puede reproducirse con composiciones similares de vectores que comprenden diferentes elementos S/MAR (5-6).

Ejemplo 8: pS/MARt en células madre (Fig. 10)

Para evaluar si pS/MARt podía modificar eficazmente las células madre sin daño molecular, se generaron líneas estables de células madre. La línea de células madre embrionarias de ratón E14 (mESC) se estableció con el vector pS/MARt-GFP. La expresión del gen informador GFP se midió 1 mes después de la administración del ADN mediante microscopía de fluorescencia (A). Las mESC modificadas con pS/MARt-GFP se tiñeron para los marcadores de pluripotencia más comunes, lo que demuestra que la presencia del vector episomal no altera sus características pluripotentes.

Ejemplo 9: pS/MARt en embriogénesis (Fig. 11 y 12)

Se inyectaron mESC marcados con pSMARt-GFP en blastocistos de ratones C57BL/6, lo que dio lugar a la formación de quimeras. Los órganos hematopoyéticos de estas quimeras, como el bazo y la médula ósea, se tiñeron con un marcador de la superficie de la sangre (CD45) y su fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo. Se utilizaron un ratón C57BL/6 y un ratón con expresión constitutiva de UBC::GFP como controles negativo y positivo, respectivamente. (Fig. 11)

pS/MARt media la expresión persistente de un transgen durante la diferenciación hematopoyética. mESC fueron forzadas a diferenciarse en HSC y fueron analizadas por Citometría de Flujo antes (día 0) y después (día 6) del proceso de diferenciación. Tanto las células parentales como las marcadas se diferenciaron con éxito en CMH y las células marcadas con pS/MARt-GFP mantuvieron la expresión del gen informador durante todo el procedimiento. (Fig. 12)

Ejemplo 10: comparación con lentivirus (Fig. 13)

(A) Células CD3+ seleccionadas de dos donantes sanos diferentes se modificaron con vectores de ADN S/MARt que expresaban el CAR272, que proporciona dirección contra el epítopo humano CEA, y su actividad citolítica se confirmó en células MCF-7 (una línea celular de cáncer de mama) mediante ensayos citotóxicos y de liberación de interferón-y.

(B) Las células T modificadas con el sistema de vectores S/MARt que expresan el CAR272 muestran una actividad de destrucción mejorada en comparación con las células CD3+ modificadas con lentivirus que llevan el mismo casete de expresión.

Ejemplo 11: Eliminación de tumores (Fig. 14 y 15)

Análisis in vivo de células CAR-T producidas con el sistema S/MARt DNA Vector, lentivirus y el NanoS/MARt DNA Vector de nueva generación. (Fig. 14)

Ratones NOD/SCID (n=6) fueron inoculados subcutáneamente con 2*10® células tumorales HT29. Se inyectaron 3*105 células T CAR+ generadas con el vector de ADN S/MARt, lentivirus y de nueva generación en la vena de la cola de cada ratón sin quimio ni radioterapia previas en el día 7 tras la inyección de células tumorales. La eficacia dirigida al tumor de las células modificadas se comparó con la de las células CD3+ electroporadas simuladas y se registró como crecimiento tumoral (A) y supervivencia de los ratones (B).

Los tumores superados (aislados de los tumores descritos anteriormente) fueron explantados, disociados y analizados para detectar la presencia de la diana CAR (Fig. 15). Se analizó la frecuencia de CD3 CAR+ en las masas tumorales, así como la presencia de CD3 que expresaban CAR en el bazo.

Los tumores restantes comprenden sólo células tumorales que carecen del epítopo objetivo, lo que ilustra que las células T tratadas con S/MARt fueron eficaces para matar y eliminar células tumorales a niveles al menos comparables a los del control lentiviral. Además, se siguen detectando células CAR-T positivas infiltradas en el tumor y poblando el bazo, lo que indica que el vector de ADN se sigue expresando activamente en las células T transgénicas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. - Un polinucleótido que comprende al menos un promotor y un elemento S/MAR, en el que dicho elemento S/MAR está situado aguas abajo de dicho promotor y en el que la secuencia de ácido nucleico de dicho elemento S/MAR (secuencia S/MAR) comprende al menos 3 motivos de secuencia ATTA (SEQ ID NO:1) por cada 100 nucleótidos en un tramo de al menos 200 nucleótidos, en el que dicho elemento S/MAR está flanqueado por un donante de empalme y un aceptor de empalme.

2. -E l polinucleótido de la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido comprende además una secuencia codificante que codifica un polipéptido, en el que dicha secuencia codificante que codifica un polipéptido está intercalada entre dicho promotor y dicho elemento S/MAR.

3. - El polinucleótido de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho polinucleótido comprende además una secuencia codificante que codifica un marcador seleccionable (secuencia de marcador seleccionable), estando dicha secuencia de marcador seleccionable intercalada entre dicho promotor y dicho elemento S/MAR, en el que dicho promotor y dicha secuencia de marcador seleccionable juntos constituyen un gen marcador seleccionable, y en el que dicho marcador seleccionable es un marcador seleccionable de una célula eucariota.

4. - El polinucleótido de la reivindicación 3, en el que dicho gen marcador seleccionable es un gen de resistencia a la puromicina, un gen de resistencia a la blasticidina, un gen de resistencia a la neomicina o un gen de resistencia a la zeocina.

5. - El polinucleótido de la reivindicación 3 o 4, en el que dicho gen marcador seleccionable es un gen de resistencia a la puromicina.

6. - El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se transcribe una transcripción a partir de dicho promotor, a partir de cuya transcripción se empalma la secuencia del elemento S/MAR.

7. - El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho polinucleótido carece de un origen de replicación de un virus simio 40 (SV40), un origen de replicación del virus del papiloma bovino (BPV) y un origen de replicación del virus de Epstein-Barr (EBV).

8. - El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho polinucleótido se replica episomalmente en una célula huésped, preferentemente en el que la replicación episomal es replicación episomal estable, preferentemente en una célula de mamífero

9. - Una composición que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, preferentemente en la que dicha composición es una composición farmacéutica.

10. - Una célula huésped que comprende el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, preferentemente en la que dicha célula huésped es una célula progenitora CD34+; un trombocito CD61+; un linfocito B CD19+; un monocito CD14+; un granulocito CD15+; un Linfocito T Citotóxico CD3+, preferentemente también positivo para CD8 y CD45; un Linfocito T Auxiliar CD3+, preferentemente también positivo para CD4 y CD45; un Linfocito T Activado CD3+, preferentemente también positivo para CD25 y CD45, un Linfocito Infiltrante Tumoral, o una célula Natural Killer (N^k ).

11. - Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una composición según la reivindicación 9, y/o una célula huésped según la reivindicación 10, para su uso en medicina, preferentemente, para su uso en el tratamiento de enfermedades genéticas.

12. - Un kit que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un compuesto mediador de la entrada celular.

13. - Un dispositivo que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, una composición según la reivindicación 9, y/o una célula huésped según la reivindicación 10.

14. - Un procedimiento para transfectar de forma estable una célula huésped, que comprende

a) poner en contacto dicha célula huésped con un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y/o una composición según la reivindicación 9, y/o una célula huésped según la reivindicación 10, y, b) por tanto, transfectar de forma estable una célula huésped.

15. - Uso de un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para modificar genéticamente de forma estable una célula huésped.