KR20200079244A - 세포의 유전자 변형을 위한 비통합형 dna 벡터 - Google Patents

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마티아스 보차
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Abstract

본 발명은 유전자 요법, 생체외 세포 요법, 줄기 세포 요법에서, 특히 항원 또는 치료적 유전자를 코딩하는 벡터의 발현을 개선시키기 위해 유용한 자기-복제성 비통합형 에피솜 척추동물 발현 벡터의 분야에 관한 것이다. 이러한 재조합 DNA 분자는 생물공학, 유전자이식 유기체, 유전자 요법, 줄기 세포 요법, 치료적 백신접종, 농업 및 DNA 백신에서 유용하다. 보다 특히, 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 엘리먼트를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 S/MAR 엘리먼트는 상기 프로모터의 하류에 위치하고 상기 S/MAR 엘리먼트의 핵산 서열 (S/MAR 서열)은 200개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 3개의 서열 모티프 ATTA (SEQ ID NO:1)를 포함하며, 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 숙주 세포, 및 의약에서의 사용 및 유전자 질환의 치료에서의 사용을 위한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트 및 장치, 및 폴리뉴클레오티드에 관련된 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

세포의 유전자 변형을 위한 비통합형 DNA 벡터
본 발명은 유전자 요법, 생체외 세포 요법, 줄기 세포 요법에서, 보다 특히, 벡터 코딩되는 항원 또는 치료적 유전자의 발현을 개선시키기 위해 유용한 자기-복제성 비통합형 에피솜 척추동물 발현 벡터의 분야에 관한 것이다. 이러한 재조합 DNA 분자는 생물공학, 유전자이식 유기체, 유전자 요법, 줄기 세포 요법, 치료적 백신접종, 농업 및 DNA 백신에서 유용하다. 보다 특히, 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 엘리먼트를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이고, 상기 S/MAR 엘리먼트는 상기 프로모터의 하류에 위치되고 상기 S/MAR 엘리먼트 (S/MAR 서열)의 핵산 서열은 200개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 3개의 서열 모티프 ATTA (SEQ ID NO:1)를 포함하며, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 숙주 세포, 및 의약에서의 사용 및 유전자 질환의 치료에서의 사용을 위한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트 및 장치, 및 폴리뉴클레오티드에 관한 방법 및 용도에 관한 것이다.
세포의 유전자 변형은 과학 목적을 위한 현대 세포 배양에서 일상적으로 사용된다. 그러나, 유전자의 돌연변이로 인해 초래되는 유전 질환의 치료에서 해당 기술의 사용은 매우 바람직하지만, 이용가능한 방법들이 일시적 형질감염 프로토콜과 같은, 일시적 변형만을 제공하는 반면, 바이러스 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스 트랜스포존 벡터 등을 사용하여 세포의 안정한 변형을 제공하는 방법은 일반적으로 숙주 세포 게놈으로의 이식유전자의 통합에 의존한다는 문제로 인해 여전히 방해받고 있다. 그러나, 특별한 유전자좌를 표적화하더라도, 이식유전자의 통합은 예를 들어, 치료의 부작용으로서 암을 초래할 수도 있는 유해한 돌연변이를 유도시킬 위험성을 품고 있다.
스캐폴드-부착 영역 (scaffod-attachment region)(SAR) 또는 매트릭스-회합 영역 (matrix-associated region) (MAR)이라고도 알려진, 스캐폴드/매트릭스 부착 영역 (Scaffold/matrix attachment region)(S/MAR)은 핵 매트릭스의 부착을 매개하는 진핵생물 유기체 게놈 내 서열로서 알려져 있다. S/MARS는 AT 풍부 서열이고, 일부 AT-풍부 모티프는 더욱 농축된 것으로 확인되었다 (Liebeich et al., (2002), NAR 30(15): 3433). 예를 들어 US 6,410,314 B1 및 [Haase et al., (2010), BMC Biotechnology 10:20]에서 다양한 벡터가 S/MAR 모티프 기반 세포에서 안정한 유지를 위해 제안되었고, 게다가, 이러한 벡터의 복제에 대해 영향력을 갖는 후성유전학적 효과가 확인되었다 (Haase et al., (013), PLOS One 8(11):e79262). 그럼에도 불구하고, 유전자 요법에서 사용하기에 충분히 안정한 S/MAR 기반 벡터가 요구된다.
최적 이하의 발현도, 유전자 침묵화 및 낮은 정착률이 당분야에서 설명되는 S/MAR 기반 벡터의 주요한 한계점을 대표한다.
그러므로, 특히 S/MAR 엘리먼트를 사용하고 숙주 세포의 게놈으로의 이식유전자의 통합에 관여된 위험을 피하면서, 세포의 안정한 형질감염을 위한 개선된 수단 및 방법이 요구된다. 이러한 문제는 본 명세서에 개시된 수단 및 방법을 통해서 해결된다.
본 발명은 비통합형 에피솜 유전자 요법 및 줄기 세포 요법, 보다 특히 자기-복제성 비통합형 에피솜 S/MAR 발현 벡터의 이식유전자 발현 및 벡터 정착 효율의 개선, 및 비바이러스 벡터에 의한 항생제 내성 마커 유전자 전달의 제거를 위해 유용한 벡터에 관한 것이다.
표적 척추동물 세포에서 자기-복제성 비통합형 에피솜 S/MAR 발현 벡터의 발현 및 정착 효율을 개선시킨 개선된 벡터 방법 및 조성물이 개시된다.
본 발명의 일 목적은 표적 척추동물 세포에서 자기 복제성 비통합형 에피솜 S/MAR 발현 벡터의 개선된 발현을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 표적 척추동물 세포에서 자기 복제성 비통합형 에피솜 S/MAR 발현 벡터의 개선된 정착 효율을 제공하는 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 기술은 다음의 단계들을 포함하는 표적 척추동물 세포에서 자기-복제성 비통합형 에피솜 S/MAR 발현 벡터의 발현 및 정착 효율을 개선시키기 위한 방법을 제공한다: a) i) 박테리아 복제 기원 및 선별 마커를 포함하는 박테리아 복제-선별 영역; ii) 프로모터, 5' UTR, 이식유전자, 및 3' UTR을 포함하는, 척추동물 세포에서 이식유전자의 발현을 위한 전사 유닛; iii) 상기 3' UTR 내에 위치된 S/MAR 삽입부를 포함하는, 에피솜 S/MAR 발현 벡터를 제공하는 단계; 및 b) S/MAR는 상기 3' UTR 내에서 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접되도록 에피솜 S/MAR 발현 벡터를 변형시켜서, 최종 자기-복제성 비통합형 에피솜 S/MAR 발현 벡터가 척추동물 세포의 형질감염 이후에 발현 및 정착 효율이 개선되는 것인 단계를 포함한다. 추가 실시형태에서 상기 S/MAR 내부 AATAAA 전사 종결 모티프를 함유한다. 추가 실시형태에서 상기 S/MAR 내 상기 AATAAA 전사 종결 모티프는 AATATT 모티프로 치환된다. 추가 실시형태에서 상기 S/MAR은 인간 인터페론 베타 S/MAR, M18 S/MAR, ApoL1 S/MAR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시형태에서 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접된 상기 SMAR은 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 및 SEQ ID NO: 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서 상기 박테리아 복제 기원은 R6K 감마 복제 기원이다. 추가 실시형태에서 상기 박테리아 복제 기원은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 R6K 감마 복제 기원이다. 추가 실시형태에서 상기 선별 마커는 SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 RNA-IN 조절 RNA-OUT 기능성 변이체이다. 추가 실시형태에서 상기 선별 마커는 SEQ ID NO: 6과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 RNA-IN 조절 RNA-OUT RNA를 코딩하는 RNA-OUT RNA 선별 마커이다. 추가 실시형태에서 박테리아 복제 기원 및 선별 마커를 포함하는 상기 박테리아 복제-선별 영역은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 R6K 기원-RNA-OUT RNA 선별 마커 박테리아 복제-선별 영역이다. 추가 실시형태에서 상기 5' UTR은 인트론을 더 코딩한다. 추가 실시형태에서 상기 전사 유닛은 프로모터의 상류에 위치된 발현 인핸서를 더 코딩한다. 추가 실시형태에서 상기 발현 인핸서는 SEQ ID NO: 27, 및 SEQ ID NO: 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서 상기 스플라이스 도너 부위는 SEQ ID NO:25와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서 상기 스플라이스 억셉터 부위는 SEQ ID NO: 26과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서 상기 자기-복제성 비통합형 에피솜 S/MAR 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 나노플라스미드 벡터, 통합-결핍형 렌티바이러스 벡터, 및 비통합형 렌티바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 기술은 a) 프로모터, 5' UTR, 이식유전자, 및 3' UTR을 포함하는, 척추동물 세포에서 이식유전자의 발현을 위한 항생제 마커 무함유 전사 유닛; b) 상기 3' UTR 내에 위치된 S/MAR로서, 상기 S/MAR는 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접된 것인 S/MAR; c) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 R6K 감마 복제 기원; 및 d) SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 RNA-IN 조절 RNA-OUT 기능성 변이체를 포함하는 RNA-OUT RNA 선별 마커를 포함하는, 항생제 마커 무함유의 공유적으로 폐쇄된 원형 재조합 DNA 분자를 제공한다. 추가 실시형태에서 상기 R6K 감마 복제 기원 및 상기 RNA-OUT RNA 선별 마커는 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 R6K 기원-RNA-OUT RNA 선별 마커 박테리아 복제-선별 영역을 포함한다. 추가 실시형태에서 상기 S/MAR은 인간 인터페론 베타 S/MAR, M18 S/MAR, ApoL1 S/MAR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시형태에서 상기 S/MAR은 내부 AATAAA 전사 종결 모티프를 함유한다. 추가 실시형태에서 상기 S/MAR 내 상기 AATAAA 전사 종결 모티프는 AATATT 모티프로 치환된다. 추가 실시형태에서 상기 S/MAR은 인간 인터페론 베타 S/MAR, M18 S/MAR, ApoL1 S/MAR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시형태에서 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접된 상기 SMAR은 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 및 SEQ ID NO: 23로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서 상기 5' UTR은 인트론을 더 코딩한다. 추가 실시형태에서 상기 전사 유닛은 프로모터의 상류에 위치된 발현 인핸서를 더 코딩한다. 추가 실시형태에서 상기 발현 인핸서는 SEQ ID NO: 27, 및 SEQ ID NO: 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서 상기 스플라이스 도너 부위는 SEQ ID NO: 25와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서 상기 스플라이스 억셉터 부위는 SEQ ID NO: 26과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 기술은 a) 프로모터, 5' UTR, 이식유전자, 및 3' UTR을 포함하는, 척추동물 세포에서 이식유전자의 발현을 위한 전사 유닛; b) 상기 3' UTR 내에 위치된 S/MAR로서, 상기 S/MAR에는 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접된 것인 S/MAR; c) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 R6K 감마 복제 기원; 및 d) SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 RNA-IN 조절 RNA-OUT 기능성 변이체를 포함하는 RNA-OUT RNA 선별 마커를 포함하는, 공유적으로 폐쇄된 원형 재조합 DNA 분자를 제공한다. 추가 실시형태에서 상기 R6K 감마 복제 기원 및 상기 RNA-OUT RNA 선별 마커는 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 R6K 기원-RNA-OUT RNA 선별 마커 박테리아 복제-선별 영역을 포함한다. 추가 실시형태에서 상기 S/MAR은 인간 인터페론 베타 S/MAR, M18 S/MAR, ApoL1 S/MAR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시형태에서 상기 S/MAR은 내부 AATAAA 전사 종결 모티프를 함유한다. 추가 실시형태에서 상기 S/MAR 내 상기 AATAAA 전사 종결 모티프는 AATATT 모티프로 치환된다. 추가 실시형태에서 상기 S/MAR은 인간 인터페론 베타 S/MAR, M18 S/MAR, ApoL1 S/MAR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시형태에서 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접된 상기 SMAR은 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 및 SEQ ID NO: 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서 상기 5' UTR은 인트론을 더 코딩한다. 추가 실시형태에서 상기 전사 유닛은 프로모터의 상류에 위치된 발현 인핸서를 더 코딩한다. 추가 실시형태에서 상기 발현 인핸서는 SEQ ID NO: 27, 및 SEQ ID NO: 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서 상기 스플라이스 도너 부위는 SEQ ID NO:25와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 추가 실시형태에서 상기 스플라이스 억셉터 부위는 SEQ ID NO: 26과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다.
3' UTR 내에서 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접된 S/MAR을 갖는 최종 플라스미드는 놀랍게도 측접된 스플라이스 도너 및 억셉터 부위가 부재하는 3' UTR 내 S/MAR을 갖는 플라스미드에 비해서 개선된 정착성 및 이식유전자 발현성을 갖는다.
도 1은 스플라이스 도너 (SD) 분지점 및 스플라이스 억셉터 (SA) 영역을 갖는 pCI 인트론을 도시한다.
도 2는 인터페론 베타 S/MAR (위), 및 SD 인터페론 베타 S/MAR SA 유도체 (중간)를 비롯하여, 내부 AATAAA 폴리아데닐화 신호가 돌연변이된 SD 인터페론 베타 S/MAR SA 유도체 (아래)를 도시한다.
도 3은 SD 및 SA 부위가 측접된 인터페론 베타 S/MAR 유도체 M18을 도시한다.
도 4는 SD 및 SA 부위가 측접된 805 bp (위) 또는 525 bp (아래) apoB S/MAR을 도시한다.
도 5는 pMAX-UCOE-coGFP P2A-PuroR-NP (pSMARt UCOE) 벡터를 도시한다.
도 6은 NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SMAR-SV40 pA (NP-UCOE) 및 NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SD SMAR-SA SV40 pA (NP-UCOE-SP) 벡터를 도시한다.
도 7은 NTC9385R-SP-UCOE-CMV-GFP SMARter (NP-SMARter-SP) 및 NTC9385R- SP-UCOE-CMV-GFP CMARter (NP-CMARter-SP) 벡터를 도시한다.
도 8은 NTC9385R-UCOE EF1-coGFP SD-SMAR SA SV40 pA (NP-UCOE-EF1-SP) 및 NTC9385R-UCOE EF1-coGFP-SD SMAR R6K-R-OUT-SA pA (UCOE-EF1-SP-NP) 벡터를 도시한다.
도 9는 NTC9385R-SP-ELE40-CMV-GFP CMARter (NP-Ele40-CMARter-SP) 벡터를 도시한다.
도 10은 측접된 SD 및 SA 부위가 존재 및 부재하는 정착된 S/MAR 벡터의 개선된 발현을 도시한다. 좌측 패널: 스플라이스 접합부가 존재 및 부재하는 S/MAR 벡터가 정착된 HEK293T 세포의 MFI. 벡터는 NP 박테리아 영역, 게놈 절연인자 UCOE, CMV 프로모터에 의해 구동되는 발현 카세트 GFP-2A-PuroR, 및 SD 및 SA 부위가 측접하는 S/MAR이 존재 (Nano-S/MAR-스플라이스 = NP-UCOE-SP; NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SD SMAR-SA SV40 pA 도 6) 또는 부재 (NP-UCOE; NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SMAR-SV40 pA, 도 6)하는 3' UTR 내 인터페론 베타 S/MAR을 함유한다. 우측 패널: 개선된 전사 발현은 실시간 PCR 분석으로 확인한다. 이식유전자 GFP의 발현은 하우스키핑 유전자 GAPDH에 대해 정규화하였다.
도 11은 측접된 SD 및 SA 부위가 존재 및 부재하는 정착된 S/MAR 벡터의 개선된 발현을 도시한다. 스플라이싱 접합부가 측접한 상이한 S/MAR을 보유하는 벡터가 확립된 세포 (HEK293T 및 초대 마우스 배아 섬유아세포)의 MFI. 벡터 명칭은 도 5, 6 및 7에 도시된 바와 같다.
도 12는 측접된 SD 및 SA 부위가 존재 및 부재하는 S/MAR 벡터의 개선된 확립성을 도시한다. 측접된 SD 및 SA 부위가 존재 및 부재하는 2개의 상이한 SMAR을 보유하는 벡터가 존재하는 HEK293T에서 수행된 콜로닝 형성 어세이. pEPI는 3' UTR 인터페론 베타 S/MAR이 존재하는 CMV 프로모터 플라스미드 벡터이다.
도 13: 유전자 변형된 세포 개체군의 분석 및 정착 효율: A) 푸로마이신을 사용한 4주 선별 후 형성된 콜로니를 크리스탈 바이올렛 염색한 세포 배양 플레이트; 벡터 정착 효율은 대략 40%였다; b) 푸로마이신 선별된 세포에서 GFP 형광도의 FACS 검출; 형광도는 매우 균질하고 비형광발광 세포의 수는 매우 낮다.
도 14: 정착된 세포 개체군으로부터 pS/MARt 벡터의 플라스미드 구제 결과: 플라스미드 구제 실험에서 수득된 박테리아 콜로니 (1번 내지 12번) 유래 DNA는 BamHI로 분해시키고 아가로스 겔 전기영동으로 분해하였다; "p/SMART"로 표시된 레인은 상기와 동일하게 처리된 본래 플라스미드를 보유하는 박테리아 콜로니 유래 DNA를 함유한다.
도 15: 선별된 세포에서 유지된 pSMARt 벡터의 서던 블롯: pS/MART의 GFP 유전자와 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드가 숙주 세포 유래 추출물 중 BamHI 제한효소 처리된 벡터 DNA (pS/MARt1 내지 3)를 검출하기 위한 프로브로 사용되었다; 비형질감염 벡터가 대조군으로서 사용되었다 ("pS/MARt(+)").
도 16: pS/MART의 벡터 맵; ori: 박테리아 복제 기원, P2A: 돼지 테스코바이러스-1 유래 자가 절단성 2A 펩티드를 코딩하는 서열, 아포리포B MAR: 아포리포단백질 B 유전자 유래 S/MAR 서열.
표 1: pNTC 다중 클로닝 부위 측접된 R6K 기원-RNA-OUT 선별 마커 벡터.
표 2: A549 및 HEK293 세포주로 형질감염 후 S/MAR 벡터의 일시적 발현.
표 3: A549 및 HEK293 세포주로 형질감염 후 S/MAR 벡터의 일시적 발현.
표 4: A549 및 HEK293 세포주로 형질감염 후 S/MAR 벡터의 일시적 발현.
SEQ ID NO:1: R6K 감마 기원
SEQ ID NO:2: 1 CpG R6K 감마 기원
SEQ ID NO:3: CpG 무함유 R6K 감마 기원
SEQ ID NO:4: 연장형 R6K 감마 기원
SEQ ID NO:5: RNA-OUT 선별 마커
SEQ ID NO:6: RNA-OUT 안티센스 리프레서 RNA
SEQ ID NO:7: 2 CpG RNA-OUT 선별 마커
SEQ ID NO:8: NheI 및 KpnI 제한효소 부위가 측접된 R6K 감마 기원-RNA-OUT 박테리아 영역
SEQ ID NO:9: NheI 및 KpnI 제한효소 부위가 측접된 1 CpG R6K 감마 기원-2 CpG RNA-OUT 박테리아 영역
SEQ ID NO:10: pNTC-NP1 폴리링커 trpA R6K-RNA-OUT 폴리링커 클로닝 카세트: EcoRI/HindIII
SEQ ID NO:11: pNTC-NP2 폴리링커 trpA R6K-RNA-OUT 폴리링커 클로닝 카세트: EcoRI/HindIII
SEQ ID NO:12: pNTC-NP3 폴리링커 trpA R6K-RNA-OUT 폴리링커 클로닝 카세트: EcoRI/HindIII
SEQ ID NO:13: pNTC-NP4 폴리링커 trpA R6K-RNA-OUT 폴리링커 클로닝 카세트: EcoRI/HindIII
SEQ ID NO:14: pNTC-NP5 폴리링커 trpA R6K-RNA-OUT 폴리링커 클로닝 카세트: KasI/HindIII
SEQ ID NO:15: pNTC-NP6 폴리링커 trpA R6K-RNA-OUT 폴리링커 클로닝 카세트: EcoRI/SacI
SEQ ID NO:16: pNTC-NP7 폴리링커 trpA R6K-RNA-OUT 폴리링커 클로닝 카세트: BssHII/BssHII
SEQ ID NO:17: pNTC-3xCpG NP1 폴리링커 R6K-RNA-OUT 폴리링커 클로닝 카세트: HindIII/EcoRI
SEQ ID NO:18: 5' BglII-XhoI 부위 및 3' EcoRI 제한 효소 부위가 측접된 인간 인터페론 베타 S/MAR
SEQ ID NO:19: 5' BglII 부위 및 3' BamHI 제한 효소 부위가 측접된 스플라이스 도너-인간 인터페론 베타 S/MAR-스플라이스 억셉터
SEQ ID NO:20: 5' BglII 부위 및 3' BamHI 제한 효소 부위가 측접된 스플라이스 도너-인간 인터페론 베타 S/MAR (-AATAAA)-스플라이스 억셉터
SEQ ID NO:21: 5' BglII 부위 및 3' BamHI 제한 효소 부위가 측접된 스플라이스 도너-인간 인터페론 베타 M18 S/MAR-스플라이스 억셉터
SEQ ID NO:22: 5' BglII 부위 및 3' BamHI 제한 효소 부위가 측접된 스플라이스 도너-805 bp 인간 아포리포단백질 B S/MAR-스플라이스 억셉터
SEQ ID NO:23: 5' NsiI 부위 및 3' BamHI 제한 효소 부위가 측접된 스플라이스 도너-525 bp 인간 아포리포단백질 B S/MAR-스플라이스 억셉터
SEQ ID NO:24: pCI 인트론
SEQ ID NO:25: pCI 스플라이스 도너
SEQ ID NO:26: pCI 스플라이스 억셉터 (쥐과 IgG)
SEQ ID NO:27: Ele40 발현 인핸서
SEQ ID NO:28: A2UCOE 발현 인핸서
SEQ ID NO:29: 스플라이스 억셉터 공통 서열
SEQ ID NO: 30: 서열 모티프
SEQ ID NO: 31: 서열 모티프
SEQ ID NO: 32: 서열 모티프
SEQ ID NO: 33: 서열 모티프
SEQ ID NO: 34: 서열 모티프
SEQ ID NO: 35: 서열 모티프
SEQ ID NO: 36: 푸로마이신 아세틸트랜스퍼라제, 합성 구성체
SEQ ID NO: 37: 푸로마이신 아세틸트랜스퍼라제 코딩 서열, 합성
SEQ ID NO: 38: 억제방지 엘리먼트40
SEQ ID NO: 39: CMV 프로모터 - S/MAR 서열
SEQ ID NO: 40: CMV 프로모터 - 푸로마이신 - S/MAR 서열
SEQ ID NO: 41: 엘리먼트40-GPF-P2A-푸로마이신-S/MAR
하기에서 사용되는 용어 "가지다", "포함하다" 또는 "포괄하다" 또는 이의 임의의 문법적 변형은 비제한적인 방식으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 이들 용어에 의해 도입되는 특성이외에, 이 문맥에서 기술된 실체에 추가 특성이 존재하지 않는 상황 및 하나 이상의 추가 특성이 존재하는 상황 둘 모두를 의미할 수 있다. 예로서, 표현 "A는 B를 가지다", "A는 B를 포함하다" 및 "A는 B를 포괄하다"는 B 이외에, 다른 엘리먼트가 A에 존재하지 않는 상황 (즉, A가 오직 독점적으로 B로 이루어지는 상황) 및 B 이외에 하나 이상의 추가 엘리먼트, 예컨대 엘리먼트 C, 엘리먼트 C 및 D 또는 더 추가의 엘리먼트가 존재하는 상황 둘 모두를 의미할 수 있다.
더 나아가서, 하기에서 사용되는 용어 "바람직하게", "보다 바람직하게", "가장 바람직하게", "특히", "보다 특히", "특별히", "보다 특별히" 또는 유사한 용어는 추가의 가능성을 제한하지 않으면서, 선택적 특성과 함께 사용된다. 따라서, 이들 용어에 의해 도입되는 특성은 선택적 특성이고 임의 방식으로 청구항의 범주를 제한하려는 의도가 아니다. 당업자가 인식하게 되는 바와 같이, 본 발명은 대안적인 특성을 사용해 수행될 수 있다. 유사하게, "본 발명의 일 실시형태에서" 또는 유사한 표현으로 도입되는 특성은 본 발명의 추가 실시형태에 대한 임의의 제한없이, 본 발명의 범주에 대한 임의의 제한없이, 그리고 본 발명의 다른 선택적 또는 비선택적 특성을 이러한 방식으로 도입되는 특성과 조합할 가능성에 대한 임의의 제한없이, 선택적 특성으로 의도한다.
게다가, 달리 표시하지 않으면, 용어 "약"은 관련 분야에서 통상적으로 허용되는 기술적 정밀도를 갖는 표시된 값에 관한 것이고, 바람직하게는 표시된 값 ± 20%, 보다 바람직하게 ± 10%, 가장 바람직하게 ± 5%에 관한 것이다. 또한, 용어 "본질적으로"는 표시된 결과 또는 용도에 대해 영향력을 갖는 편차가 부재하는 것을 의미하고, 다시 말해서, 잠재적인 편차는 표시된 결과가 ± 20%, 보다 바람직하게 ± 10%, 가장 바람직하게 ± 5% 초과로 벗어나게 하지 않는다. 따라서, "본질적으로 이루어지다"는 명시된 성분들을 포함하지만, 불순물로서 존재하는 물질, 성분을 제공하기 위해 사용된 과정의 결과로서 존재하는 불가피한 물질, 및 본 발명의 기술적 효과를 달성하기 위한 것 이외의 목적으로 첨가되는 성분을 제외한 다른 성분들의 배제를 의미한다. 예를 들어, "본질적으로 이루어지다"라는 어구를 사용해 정의된 조성물은 임의의 공지된 허용가능한 첨가제, 부형제, 희석제, 담체 등을 포괄한다. 바람직하게, 성분 세트로 본질적으로 이루어진 조성물은 5 중량% 미만, 보다 바람직하게 3 중량% 미만, 보다 더 바람직하게 1 중량% 미만, 가장 바람직하게 0.1 중량% 미만의 비명시된 성분(들)을 포함하게 될 것이다. 핵산 서열의 문맥에서, 용어 "본질적으로 동일한"은 적어도 80%, 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 98%, 가장 바람직하게 적어도 99%의 동일성% 값을 의미한다. 이해하게 되는 바와 같이, 용어 본질적으로 동일한은 100% 동일성을 의미한다. 상기는 용어 "본질적으로 상보성"에 준용하여 적용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 원형 핵산 분자를 의미한다. 이 용어는 단일뿐만 아니라 부분 또는 완전 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 RNA이거나 또는 cDNA를 포함하는 DNA이다. 게다가, 천연 발생 변형 폴리뉴클레오티드 예컨대 당화 또는 메틸화 폴리뉴클레오티드 또는 인공적으로 변형된 유도체 예컨대 바이오틴화 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게, 단리된 폴리뉴클레오티드 (즉, 이의 천연 환경에서 단리) 또는 유전자 변형된 형태로서 제공될 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 활성인 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 엘리먼트를 포함하고; 게다가 폴리뉴클레오티드는 모두 하기 본 명세서에서 명시되는 바와 같이, 숙주 세포에서 에피솜으로 복제되는 생물학적 활성을 갖는다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 1 Mb 이하, 보다 바람직하게 500 kb 이하, 보다 더 바람직하게 200 kb 이하, 가장 바람직하게 100 kb 이하의 길이를 갖는다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 비천연 발생 폴리뉴클레오티드이고; 따라서, 바람직하게, 뉴클레오티드는 인공 폴리뉴클레오티드이다. 또한 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 키메라 폴리뉴클레오티드이고; 보다 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 포함하는 나머지 핵산 서열과 이종성인 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 폴리뉴클레오티드는 바람직하게, 특별히 표시된 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다. 보다 바람직하게, 용어 폴리뉴클레오티드는 표시된 특별한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체"는 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해서 상기 언급된 특별한 핵산 서열로부터 유래될 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산 서열을 포함하는 본 명세서에 관련된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이고, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 특별한 폴리뉴클레오티드에 대해 명시된 바와 같은 생물학적 활성 또는 활성들을 가질 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 변이체는 적어도 하나의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 첨가로 인해 상이한 핵산 서열을 갖게 된다는 것을 이해해야 한다. 바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드 변이체는 특별한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 기능적 하위서열, 예를 들어 S/MAR 엘리먼트의 오르쏘로그, 파라로그 또는 다른 상동체를 포함한다. 또한 바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드 변이체는 특별한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 기능적 하위서열의 천연 발생 대립유전자를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 또한 상기 언급된 특별한 폴리뉴클레오티드 또는 이의 기능적 하위서열과, 바람직하게는 엄격 하이브리드화 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 이들 엄격 조건은 당업자에게 공지되어 있고, 표준 참고서에서 확인할 수 있다. 엄격 하이브리드화 조건에 대한 바람직한 예는 6x 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트 (= SSC) 중에 대략 45℃에서 하이브리드화 조건, 이후에 0.2x SSC, 0.1% SDS 중에 50 내지 65℃에서 1회 이상의 세척 단계이다. 당업자는 이들 하이브리드화 조건이 핵산 유형, 및 예를 들어 유기 용매가 존재할 때에 따라서, 온도 및 완충액의 농도에 대해 상이하다는 것을 알고 있다. 예를 들어, "표준 하이브리드화 조건" 하에서, 온도는 핵산의 유형에 따라서 0.1x 내지 5x SSC (pH 7.2)의 농도인 수성 완충액 중에서 42℃ 내지 58℃로 상이하다. 유기 용매, 예를 들어 50% 포름아미드가 상기 언급된 완충액에 존재하면, 표준 조건 하에서 온도는 대략 42℃이다. DNA:DNA 하이브리드를 위한 하이브리드화 조건은 바람직하게 예를 들어 0.1x SSC 및 20℃ 내지 45℃, 바람직하게 30℃ 내지 45℃이다. DNA:RNA 하이브리드를 위한 하이브리드화 조건은 바람직하게, 예를 들어 0.1x SSC 및 30℃ 내지 55℃, 바람직하게 45℃ 내지 55℃이다. 상기 언급된 하이브리드화 온도는 예를 들어 대략 100 bp (= 염기쌍) 길이 및 50% G+C 함량의 핵산에 대해서 포름아미드 부재 하에서 결정되며; 따라서, 당업자에게 공지된 원칙으로, 저-G+C DNA에 보다 적합한 다른 조건은 당업자가 보다 적절하다고 확인할 수 있다. 당업자는 표준 참고서를 참조하여 필요한 하이브리드화 조건을 결정하는 방법을 알고있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 변이체는 PCR-기반 기술 예컨대 본 발명의 폴리펩티드의 보존된 도메인에 대한 축퇴성 프라이머를 사용하는, DNA의 혼합 올리고뉴클레오티드 프라이머-기반 증폭법을 통해 수득가능하다. 폴리펩티드의 보존된 도메인은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 핵산 서열 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 다른 유기체의 서열과의 서열 비교를 통해 확인할 수 있다. 주형으로서, 박테리아, 진균, 식물, 또는 바람직하게는 동물 유래의 DNA 또는 cDNA를 사용할 수 있다. 또한, 변이체는 특별히 표시된 핵산 서열 또는 이의 기능적 하위서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%가 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 게다가, 또한 특별히 표시된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%가 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다. 동일성 백분율 값은 바람직하게, 전체 아미노산 또는 핵산 서열 영역 상에서 계산된다. 다양한 알고리즘을 기반으로 하는 일련의 프로그램이 상이한 서열을 비교하기 위해 당업자에게 이용가능하다. 이러한 문맥에서, 니들만 (Needleman) 및 분치 (Wunsch) 또는 스미스 (Smith) 및 워터맨 (Waterman)의 알고리즘은 특히 신뢰할만한 결과를 제공한다. 서열 정렬을 수행하기 위해, 바람직하게는 프로그램 PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) 또는 프로그램 Gap and BestFit (Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) 및 Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)))이 사용된다. 바람직하게, 상기 프로그램은 그들의 표준 매개변수와 함께 사용된다. 백분율 (%)로서 상기에 언급된 서열 동일성 값은 바람직하게는, 달리 명시하지 않으면 서열 정렬을 위한 표준 설정으로서 항상 사용되는, 하기의 설정으로 전체 서열 영역 상에서 프로그램 GAP을 사용해 결정될 것이다: 갭 가중치: 50, 길이 가중치: 3, 평균 일치도: 10.000 및 평균 불일치도: 0.000.
임의의 특별히 표시된 핵산 서열의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 표시된 활성 또는 활성들을 보유하는 것인 상기 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오티드로서 포괄된다. 본 명세서에서 의미하는 단편은, 바람직하게는 특별한 핵산 서열의 어느 하나의 적어도 200개, 바람직하게 적어도 300개, 보다 바람직하게 적어도 400개의 연이은 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 특별한 아미노산 서열의 어느 하나의 적어도 100개, 바람직하게 적어도 200개, 보다 바람직하게 적어도 300개의 연이은 아미노산을 포함하고 표시된 활성을 여전히 보유하는 아미노산 서열을 코딩한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 언급된 핵산 서열로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지거나, 또는 그를 포함한다. 따라서, 그들은 역시 추가의 핵산 서열을 함유한다. 특히, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 융합 단백질 또는 선별 마커를 코딩할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 추가 부분으로서 발현을 모니터링하기 위한 폴리펩티드 (예를 들어, 녹색, 노란색, 파란색 또는 빨간색 형광성 단백질, 알칼리 포스파타제 등)로서 또는 검출가능한 마커로서 또는 정제 목적을 위한 보조 척도로서 제공될 수 있는 이른바 "태그"를 포함할 수 있다. 상이한 목적을 위한 태그는 당분야에 충분히 공지되어 있고 본 명세서의 다른 곳에 기술되어 있다.
또한 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 카고 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "카고 서열"은 숙주 세포로 전달되어 안정하게 유지되는 관심 핵산 서열에 관한 것이다. 바람직하게, 카고 서열은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 RNA, 및/또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이다. 바람직하게, 관심 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드, 보다 바람직하게 T 세포 수용체 (TCR), 보다 바람직하게 인간 또는 키메라 T 세포 수용체, 키메라 항원 수용체 (CAR), 바람직하게 MART1 TCR, 또는 본 명세서의 다른 곳에 명시된 바와 같이 유전자 질환에 영향을 미치는 세포에서 결여된 폴리펩티드이다. 따라서, 예를 들어, 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 페닐케톤뇨증의 치료를 위해 페닐알라닌-히드록실라제 활성 (EC 1.14.16.1)을 제공하는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 카고 서열을 포함한다.
바람직하게, 선별 마커 및 카고 서열을 코딩하는 서열은 하나의 mRNA로부터 세포 내에서 2종 (또는 그 이상)의 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 서열, 예를 들어 내부 리보솜 진입 서열 (IRES) 또는, 보다 바람직하게, 자기-절단성 펩티드 서열 예컨대, 가장 바람직하게, 돼지 테스코바이러스-1 유래 펩티드 2A (P2A) 서열이 개재된다. 적절한 서열은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어, [Kim et al. (2011) PLoS ONE 6(4): e18556]을 참조한다.
바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 원핵생물 및/또는 진핵생물, 바람직하게 진핵생물 숙주 세포에서 유전자의 발현을 허용하는 발현 제어 서열 또는 이의 단리된 분획을 더 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드의 발현은 바람직하게는, 번역가능한 mRNA로 폴리뉴클레오티드의 전사를 포함한다. 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 발현을 보장하는 조절 엘리먼트는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 바람직하게 그들은 전사의 개시를 보장하는 조절 서열, 및 임의로는 전사의 종결 및 전사물의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가의 조절 엘리먼트는 전사를 비롯하여 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 진핵생물 숙주 세포에서 발현을 허용하는 조절 엘리먼트의 예는 효모의 AOX1 또는 GAL1 프로모터 또는 SMVP-프로모터, U6-프로모터, H1-프로모터, 7SK-프로모터, CMV-프로모터, EFS-프로모터, SV40-프로모터, 또는 RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 포유동물 및 다른 동물 세포에서의 글로빈 인트론이 있다. 게다가, 유도성 또는 세포 유형-특이적 발현 제어 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 유도성 발현 제어 서열은 tet 또는 lac 오퍼레이터 서열 또는 열충격 또는 다른 환경 인자에 의해 유도가능한 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 제어 서열은 당분야에서 충분히 공지되어 있다. 전사의 개시를 담당하는 엘리먼트 이외에도, 이러한 조절 엘리먼트는 또한 폴리뉴클레오티드의 하류에 또한 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드를 수용하여 안정하게 복제할 수 있는 임의의 세포에 관한 것이다. 바람직하게, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 바람직하게 식물 또는 효모 세포, 예를 들어 빵 효모 균주의 세포이거나, 또는 동물 세포이다. 보다 바람직하게, 숙주 세포는 곤충 세포 또는 포유동물 세포, 특히 마우스 또는 래트 세포이다. 보다 더 바람직하게, 숙주 세포는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다. 바람직하게, 숙주 세포는 CD34+ 전구체 세포; CD61+ 혈소판; CD19+ B-림프구; CD14+ 단핵구; CD15+ 과립구; 바람직하게는 CD8 및 CD45도 역시 양성인, CD3+ 세포독성 T-림프구; 바람직하게는 CD4 및 CD45도 역시 양성인 CD3+ 헬퍼 T-림프구; 바람직하게는 CD25 및 CD45도 역시 양성인 CD3+ 활성화된 T-림프구, 종양 침윤성 림프구, 또는 자연 살해 (NK) 세포이다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 또한 박테리아 세포에서 복제를 허용하는 서열, 특히 박테리아 복제 기원을 가질 수 있다. 바람직하게, 박테리아 세포는 실험실 박테리아 균주의 세포, 보다 바람직하게는 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 세포이다.
용어 "프로모터"는 원칙적으로, 임의로는 추가의 조절 엘리먼트와 협력하여, 소정 유전자의 전사 수준을 지정하는 유전자 엘리먼트로서 당업자에게 공지되어 있다. 프로모터는 항상성일 수 있는데, 즉 숙주 세포의 상태와 본질적으로 독립적으로 일정한 전사 수준을 제공하거나, 또는 조절될 수 있는데, 다시 말해서 숙주 세포의 상태를 신뢰하여 전사 수준을 제공할 수 있다. 게다가, 프로모터는 세포 유형 및/또는 조직 특이적일 수 있는데, 다시 말해서, 오직 소수 또는 오직 한 세포 유형에서만 검출가능한 전사 수준을 제공할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 프로모터는 상기 본 명세서에 명시된 바와 같이 숙주 세포에서 활성이있다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 프로모터의 선택은 표적화를 의도하는 숙주 세포의 유형에 따라 좌우될 수 있으며, 특별한 세포 유형에 적합한 프로모터를 비롯하여 항상성 프로모터는 당분야에 공지되어 있다. 바람직하게, 프로모터는 진핵생물 프로모터, 보다 바람직하게 항상성 진핵생물 프로모터, 보다 더욱 바람직하게 강력한 진핵생물 프로모터이다. 바람직하게, 프로모터는 EF1알파 (연장 인자 1 알파) 프로모터, UbiC (유비퀴틴 C) 프로모터, ROSA 26 프로모터, PGK (포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, 및/또는 CAG (닭 알파-액틴) 프로모터이고, 보다 바람직하게는 EF1알파 프로모터이다. 또한 바람직하게, 프로모터는 세포-특이적 및/또는 조직-특이적 진핵생물 프로모터이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 상기 명시된 바와 같은 프로모터에 대해 사용되는 반면, 폴리뉴클레오티드에 잠재적으로 존재하는 임의의 다른 프로모터는 또한 "2차 프로모터"라고 한다. 따라서, 바람직하게, 프로모터는 숙주 세포에서 S/MAR 서열로의 전사를 지정하는 프로모터이고; 또한 바람직하게, 폴리뉴클레오티드의 S/MAR로의 전사를 지정하지 않는 프로모터, 예를 들어 원핵생물 프로모터, S/MAR 서열로부터 전사적으로 절연된 것, 및/또는 S/MAR 서열로부터 떨어져서 전사를 지정하는 프로모터는 2차 프로모터이다. 바람직하게, 프로모터는 아포리포단백질 B 프로모터에 상응하는 1000개 미만, 보다 바람직하게 250개 미만, 보다 더 바람직하게 100개 미만, 가장 바람직하게 20개 미만의 인접한 염기쌍을 포함하며; 따라서,바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 인간 아포리포단백질 B 프로모터를 포함하지 않고, 보다 바람직하게는 아포리포단백질 B 프로모터를 포함하지 않는다.
바람직하게, S/MAR 서열은 프로모터, 및 존재한다면, 하기 본 명세서에 명시된 바와 같은 선별 마커 유전자의 바로 하류에 위치된다. 바람직하게, "바로 하류"에 위치되다는 개재되는 전사 종결 신호가 결여된 것이고, 보다 바람직하게는 개재 유전자가 결여된 것이다. 따라서, 바람직하게, 프로모터에서 개시되고, 코딩되었으면, 검출가능한 마커 서열을 포함하는 전사물은 바람직하게는 전사된 S/MAR 서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오티드에 포함된 완전한 S/MAR 서열을 포함하며; 본 명세서의 다른 부분의 설명을 고려하여 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 1차 전사물로부터 S/MAR 서열의 삭제를 매개하는 스플라이싱 부위를 더 포함할 수 있고; 따라서, 보다 바람직하게, 바람직하게, 적어도 프로모터에서 개시되고, 코딩되었으면, 검출가능한 마커 서열을 포함하는 적어도 1차 전사물은 바람직하게는 전사된 S/MAR 서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오티드에 포함된 완전한 S/MAR 서열을 포함한다. 또한 바람직하게, 용어 "바로 하류에"는 전사 종결 신호가 프로모터 및 S/MAR에 개재되지 않는다면, 프로모터 및 S/MAR 서열은 연장된 핵산 서열에 의해 이격되는 것인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게, 프로모터 또는 존재한다면, 선별 마커 유전자의 중지 코돈 및 S/MAR 서열에 개재되는 서열은 2 kb 이하, 보다 바람직하게 0.5 kb 이하, 보다 더 바람직하게 0.2 kb 이하, 보다 더바람직하게 0.1 kb 이하, 가장 바람직하게 50 bp 이하의 길이를 갖는다.
"스캐폴드/매트릭스 부착 영역"이라는 명칭으로도 알려진, 용어 "S/MAR 엘리먼트"는 원칙적으로, 상기 DNA에 진핵생물 세포의 핵 매트릭스의 부착을 매개하는 DNA 서열과 관련된 것으로 당업자에게 공지되어 있다. S/MAR 서열은 전형적으로 진핵생물 염색체의 DNA 내 서열로부터 유래된다. 다양한 S/MAR 서열이 이용가능하고, 서열은 예를 들어 [Liebich et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 312-374]에 기술된 바와 같이 공공 데이타베이스로부터 입수가능하다. 본 발명에 따라서, S/MAR 엘리먼트의 핵산 서열 (여기서는 S/MAR 서열이라고 함)은 200개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 3개의 서열 모티프 ATTA를 포함한다. 따라서, S/MAR 서열에 포함된 모티프는 다수의 4-뉴클레오티드 모티프 5'-ATTA-3'를 포함한다. 바람직하게, S/MAR 서열은 적어도 200개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게 적어도 300개 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게 적어도 400개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 적어도 500개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 바람직하게, S/MAR 서열은 3 kb 이하, 보다 바람직하게 2 kb 이하, 보다 더 바람직하게 1.5 kb 이하, 보다 더 바람직하게 1 kb 이하, 가장 바람직하게 0.9 kb 이하의 길이를 갖는다. 따라서, 바람직하게, S/MAR 서열은 0.2 kb 내지 3 kb, 보다 바람직하게 0.3 kb 내지 2 kb, 보다 더 바람직하게 0.4 kb 내지 1.5 kb, 가장 바람직하게 0.5 kb 내지 1 kb의 길이를 갖는다. 이해하게 되는 바와 같이, "100개 뉴클레오티드 당 n개 서열 모티프를 포함하다"라는 표시는 100 염기쌍의 서열 당 계산된 상기 서열 모티프의 평균 개수에 관한 것이며, 따라서, 분수일 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:6 중 100 염기쌍 당 ATTA 서열 모티프의 개수는 34 / 525 염기쌍 * 100 염기쌍 = 6.5이다. 바람직하게, 100 염기쌍 당 서열 모티프의 개수는 S/MAR 서열의 전체 길이 상에서 결정되며; 의심스러운 경우에, 예를 들어 S/MAR 서열의 경계를 결정할 수 없으면, 폴리뉴클레오티드의 100 염기쌍 당 서열 모티프의 개수는 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 내에 200 bp의 임의 창에 대해 결정된 최고 값이고, 보다 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오티드 내 500 bp의 임의 창에 대해 결정가능한 최고 값이다. 바람직하게, S/MAR 서열은 200개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 4개 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게 200개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 5개 서열 모티프 ATTA, 여전히 보다 바람직하게 200개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 6개 서열 모티프 ATTA를 포함한다. 또한 바람직하게, S/MAR 서열은 400개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 3개 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게 400개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 4개 서열 모티프 ATTA, 보다 더 바람직하게 400개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 5개 서열 모티프 ATTA, 가장 바람직하게 400개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 6개 서열 모티프를 포함한다. 또한 바람직하게, S/MAR 서열은 500개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 3개 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게 500개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 4개 서열 모티프 ATTA, 보다 더 바람직하게 500개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 5개 서열 모티프 ATTA, 가장 바람직하게 500개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 6개 서열 모티프 ATTA를 포함한다. 따라서, 바람직하게, S/MAR 서열은 500개 뉴클레오티드의 서열 상에 적어도 10개 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게 500개 뉴클레오티드의 서열 상에 적어도 20개 서열 모티프 ATTA, 보다 더 바람직하게 500개 뉴클레오티드의 서열 상에 적어도 30개 서열 모티프 ATTA를 포함한다. 바람직하게, S/MAR 서열 내 ATTA 모티프의 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95%는 각각 9 내지 13, 바람직하게 10 내지 12, 가장 바람직하게 11 염기쌍만큼 이격된다.
바람직하게, S/MAR 엘리먼트는 바람직하게는 상기 본 명세서에 기술된 ATTA 모티프를 포함하는 서열 내에 추가의 서열 모티프를 포함한다. 바람직하게, 상기 ATTA 서열 모티프를 포함하는 상기 S/MAR 엘리먼트의 서열 스트렛치는 적어도 하나의 서열 모티프 ATTTA, 바람직하게 적어도 2개의 서열 모티프 ATTTA, 보다 바람직하게 적어도 4개의 서열 모티프 ATTTA, 가장 바람직하게 적어도 8개의 서열 모티프 ATTTA를 더 포함한다. 또한 바람직하게, 상기 ATTA 서열 모티프 및 임의로는 상기 ATTTA 모티프(들)를 포함하는 상기 S/MAR 엘리먼트의 서열 스트렛치는 적어도 하나, 바람직하게 적어도 2개, 보다 바람직하게 적어도 4개, 가장 바람직하게 적어도 6개의 팔린드롬 모티프, 바람직하게 모티프 TAAATATTTTA (SEQ ID NO:30)를 더 포함한다. 바람직하게, 상기 모티프 TAAATATTTTA는 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 적어도 하나의 모티프 ATTA가 인접한다. 또한 바람직하게, 상기 ATTA 서열 모티프를 포함하는 S/MAR 엘리먼트의 서열 스트렛치는 적어도 하나, 바람직하게 적어도 2개, 보다 바람직하게 적어도 3개, 보다 더 바람직하게 적어도 4개, 가장 바람직하게 적어도 5개의 서열 모티프 ATTATAAATATTTTAATTA (SEQ ID NO:31), 보다 바람직하게 서열 모티프 ATTTAATTATAAATATTTTAATTA (SEQ ID NO:32)를 포함한다.
또한 바람직하게, S/MAR 서열은 낮은 G+C 함량을 갖는다. 당업자는 서열 내 모든 구아닌 및 시티닌 염기를 세고 누적 결과를 서열 내 뉴클레오티드의 개수로 나누어서 기지 서열의 C+G 함량을 계산하는 방법을 알고있다. 바람직하게, 상기 서열 모티프 ATTA를 포함하는 S/MAR 엘리먼트의 서열 스트렛치는 30% 이하, 보다 바람직하게 20% 이하, 여전히 보다 바람직하게 15% 이하, 보다 더 바람직하게 10% 이하, 가장 바람직하게 5% 이하의 G+C 함량을 갖는다. 바람직하게, S/MAR 엘리먼트의 경계를 결정할 수 없는 경우에, G+C 함량의 계산에 사용되는 서열은 상기 본 명세서에 명시된 바와 같이 100 염기쌍 당 ATTA 모티프의 개수를 계산하기 위해 사용된 것과 동일하다. 또한 바람직하게, S/MAR 서열은 적은 개수의 CG 디뉴클레오티드를 갖는다. 바람직하게, 상기 서열 모티프를 포함하는 상기 S/MAR 엘리먼트의 서열 스트렛치는 6개 이하의 서열 모티프 CG, 보다 바람직하게 4개 이하, 보다 더 바람직하게 2개 이하의 서열 모티프 CG를 포함하고, 가장 바람직하게는 서열 모티프 CG를 포함하지 않는다.
바람직하게, S/MAR 서열은 아포리포단백질 B 유전자, 바람직하게 인간 아포리포단백질 B 유전자의 S/MAR 서열, 보다 바람직하게 인간 아포리포단백질 B 유전자의 3' S/MAR 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, S/MAR 서열은 인간 아포리포단백질 B 유전자, 보다 바람직하게 인간 아포리포단백질 B 유전자의 3' S/MAR 서열의 변이체를 포함한다. 따라서, 바람직하게, S/MAR 서열은 SEQ ID NO:33, 바람직하게 SEQ ID NO:34 또는 35의 서열과 적어도 70%가 동일한 서열을 포함한다. 보다 바람직하게, S/MAR 서열은 SEQ ID NO:33, 바람직하게 SEQ ID NO:34, 보다 바람직하게 SEQ ID NO:35의 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 S/MAR 엘리먼트의 하류에 폴리-A 신호를 포함하고; 보다 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 S/MAR 엘리먼트의 하류에 폴리-A 신호 및 전사 종결 신호를 포함한다. 또한 바람직하게, S/MAR 엘리먼트에는 스플라이스 도너 및 스플라이스 억셉터가 측접되고, 따라서 바람직하게, S/MAR 서열은 바람직하게는 전사 이후에 선별 마커를 코딩하는 전사물로부터 스플라이싱된다. 또한 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 상기 본 명세서에 명시된 바와 같은 (2차) 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자를 더 포함한다. 바람직하게, 박테리아 복제 기원 및 박테리아 선별 마커 유전자의 발현을 구동하는 프로모터는 원핵생물-특이적이고, 다시 말해서, 보다 바람직하게, 숙주 세포에서 비기능성이다. 또한 바람직하게, 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자, 바람직하게 폴리뉴클레오티드에 포함된 원핵생물 세포에서 활성인 모든 엘리먼트는 적어도 하나의 절연 엘리먼트의 존재에 의해서, 보다 바람직하게 절연 엘리먼트가 측접하여 폴리뉴클레오티드에 포함된 잔여 서열로부터 절연된다. 바람직하게, 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자, 바람직하게 원핵생물 세포에서 활성인 모든 엘리먼트는 5' 말단에 적어도 하나의 절연성 엘리먼트의 존재 및 3' 말단에 적어도 하나의 절연성 엘리먼트의 존재에 의해 폴리뉴클레오티드에 포함된 잔여 서열로부터 절연된다. 보다 바람직하게, 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자, 바람직하게 폴리뉴클레오티드에 포함된 원핵생물 세포에서 활성인 모든 엘리먼트는 적어도 하나의 절연 엘리먼트의 존재에 의해서, 보다 바람직하게 절연 엘리먼트의 측접에 의해서 프로모터로부터 절연된다. 바람직하게, 상기 절연 엘리먼트(들)는 억제방지성 엘리먼트40 엘리먼트 (SEQ ID NO:38) 또는 이의 변이체 및/또는 S/MAR 엘리먼트이다.
따라서, 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:34 또는 35의 서열 또는 SEQ ID NO:34 또는 35의 서열과 적어도 70%가 동일한 서열; 바람직하게 SEQ ID NO:39의 서열 또는 SEQ ID NO:39의 서열과 적어도 70%가 동일한 서열, 보다 바람직하게 SEQ ID NO:40의 서열 또는 SEQ ID NO:40의 서열과 적어도 70%가 동일한 서열, 가장 바람직하게 SEQ ID NO:40의 서열 또는 SEQ ID NO:41의 서열과 적어도 70%가 동일한 서열을 포함한다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 GFP를 코딩하는 핵산 서열이 상이한 폴리펩티드, 바람직하게 치료적 폴리펩티드, 보다 바람직하게 인간 T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체 (CAR), 바람직하게 MART1 TCR을 코딩하는 핵산 서열에 의해 치환된 SEQ ID NO:41 의 서열을 포함한다.
바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 선별 마커 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 더 포함하고, 상기 선별 마커 서열는 폴리뉴클레오티드의 프로모터 및 폴리뉴클레오티드의 S/MAR 엘리먼트가 개재되고, 바람직하게 상기 프로모터 및 상기 선별 마커 서열는 함께 선별 마커 유전자를 구성한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "선별 마커 서열"은 "선별 마커 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열"이라는 표현의 약칭으로서 사용된다. 용어 "선별 마커"는 원칙적으로 당업자가 이해하며 숙주 세포에서 발현될 때, 그에 적용시 숙주 세포에 대한 선택압을 매개하는 적어도 하나의 조건에 대한 내성을 부여하는 핵산 서열에 관한 것이다. 선별 마커는 원핵생물 및 진핵생물 세포에 대한 것이 당분야에 공지되어 있다. 바람직하게, 선별 마커는 진핵생물 세포의 선별 마커이다. 바람직하게, 선별 마커는 선별 마커 폴리펩티드, 보다 바람직하게 숙주 세포로부터 선택적 화합물을 제거하거나 또는 상기 선택적 화합물을 불활성으로 만들도록 변형시키는 수송체 및/또는 효소 활성을 갖는 선별 마커 폴리펩티드이다. 바람직하게, 선별 마커 유전자는 바람직하게 선별 마커 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 상류에, 적어도 하나의 인트론을 더 코딩한다. 바람직하게, 선별 마커는 푸로마이신, 블라스티시딘, 네오마이신, 및/또는 제오신, 보다 바람직하게는 푸로마이신에 대한 내성을 매개하는 마커이다. 따라서, 바람직하게, 프로모터 및 선별 마커는 함께 푸로마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 또는 제오신 내성 유전자, 보다 바람직하게 푸로마이신 내성 유전자를 구성한다. 바람직하게, 선별 마커 유전자는 폴리-A 신호 및 전사 종결 신호(들)가 없다.
바람직하게 선별 마커는 유전자은행 수탁번호 KX548903.1 (SEQ ID NO:37))의 뉴클레오티드 535 내지 1134에 의해 코딩되는 푸로마이신 아세틸트랜스퍼라제 (유전자은행 수탁번호 KX548903.1) (SEQ ID NO:36)이다. 따라서, 선별 마커 유전자는 바람직하게, a) SEQ ID NO:36의 서열을 포함하는 푸로마이신 내성 폴리펩티드의 발현을 야기시키고/시키거나; b) SEQ ID NO:36의 서열과 적어도 70%가 동일한 서열을 포함하는 푸로마이신 내성 폴리펩티드의 발현을 야기시키고/시키거나; c) SEQ ID NO:37의 서열을 포함하고/하거나; d) SEQ ID NO:37의 서열과 적어도 70%가 동일한 서열을 포함하고/하거나; e) SEQ ID NO:36의 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 푸로마이신 내성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고/하거나, f) SEQ ID NO:36의 서열과 적어도 70%가 동일한 서열을 포함하고, 바람직하게는 그로 이루어진 푸로마이신 내성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "복제하는"은 세포의 복제 주기 동안 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 복제물의 생산을 유도하는 폴리뉴클레오티드의 활성에 관한 것이다. 따라서, 바람직하게, 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 복제는 일련의 세포 분열 이후에 폴리뉴클레오티드의 존재를 결정하여 결정되며, 여기서 복제되지 않은 폴리뉴클레오티드는 희석되어 버릴 것으로 예상된다. 바람직하게, 복제는 안정한 복제인데, 다시 말해서, 평균 50회 세포 분열 이후, 보다 바람직하게 평균 100회 세포 분열, 가장 바람직하게 평균 250회 세포 분열 이후 숙주 세포 개체군에서 폴리뉴클레오티드가 여전히 검출가능한 정도로의 복제이다. 바람직하게, 숙주 세포 개체군에서 폴리뉴클레오티드의 검출은 표준 조건 하에서 PCR을 통해 수행된다.
용어 "에피솜" 복제는 원칙적으로 세포 게놈으로의 통합없이, 즉 세포 게놈에 공유적으로 부착되지 않는, 폴리뉴클레오티드의 복제에 관한 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 바람직하게, 폴리뉴클레오티드의 에피솜 복제는 자율 복제 유닛으로서 상기 폴리뉴클레오티드의 복제이다. 바람직하게, 에피솜 복제는 원형으로 폐쇄된 이중 가닥 DNA 분자의 형태로 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 유지이다. 당업자가 이해하게 되는 바와 같이, 상기 폴리뉴클레오티드의 실제 복제는 다른 형태, 예를 들어 롤링 써클 복제를 포함할 수 있다. 원형 DNA의 에피솜 유지는 바람직하게 당업자에게 공지된 플라스미드 구제 절차, 즉 바람직하게는 숙주 세포의 용해물을 준비하는 단계 및 이에 포함된 DNA로 적절한 박테리아 세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포를 형질전환시키는 단계에 의해 검증되며; 상기 방법으로 수득가능한 적합한 수의 박테리아 콜로니가 원래의 원형 DNA와 동일한 제한효소 패턴 및/또는 서열을 갖는 플라스미드로서 원형 DNA를 포함하면, 바람직하게는 그 원형 DNA가 에피솜으로 유지되었다고 추정된다. 역시 당업자에게 공지된, 에피솜 유지를 검증하는 추가 방법은 DNA/DNA 블롯팅 ("서던 블롯" 방법)이고; 따라서, 바람직하게, 숙주 세포의 전체 DNA를 준비하여 하나 이상의 제한 효소(들)로 분해시키고, 프로브로서 원래 플라스미드를 사용하는 서던 블롯에서, 원래의 원형 DNA에 해당하는 밴드만이 가시적이면, 바람직하게, 플라스미드가 에피솜으로 유지된다고 결론내린다. 보다 바람직하게, 에피솜 유지는 본 명세서의 실시예에 기술된 대로 검증한다.
따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "에피솜으로 복제되는"은 세포 복제 주기 동안 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 복제물의 생산을 유도하는 상기 폴리뉴클레오티드의 활성에 관한 것으로서, 그 동안에 상기 폴리뉴클레오티드는 자율적인 복제 독립체로서 상기 세포에 존재하며, 안정한 에피솜 복제는 폴리뉴클레오티드가 적어도 50회 세포 분열 이후, 바람직하게 적어도 100회 세포 분열 이후, 보다 바람직하게, 적어도 250회 세포 분열 이후, 가장 바람직하게, 적어도 500회 세포 분열 이후에 숙주 세포에서 여전히 검출가능한 정도로의 에피솜 복제이다. 바람직하게, 상기 세포 분열 횟수는 세포 개체군에 대한 평균 세포 분열 횟수이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 복제 기원, 소 유두종 바이러스 (BPV) 복제 기원, 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 복제 기원이 없고; 바람직하게는 폴리오마바이러스 복제 기원, 파필로마바이러스 복제 기원, 및 헤르페스바이러스 복제 기원이 없고; 보다 바람직하게 진핵생물-감염 바이러스의 복제 기원이 없다. 보다 바람직하게, 벡터는 임의의 기지의 진핵생물 복제 기원이 없다. 그러나, 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 원핵생물, 바람직하게 박테리아 복제 기원, 특히 이. 콜라이 복제 기원을 더 포함한다. 바람직하게, 원핵생물 복제 기원은 폴리뉴클레오티드에 포함되는 유일한 복제 기원이다.
유리하게, 명시된 바와 같은 S/MAR 엘리먼트를 상기 S/MAR 엘리먼트로 입력되는 프로모터와 조합함으로써, 폴리뉴클레오티드는 전용 복제 기원 부재 하에서도, 숙주 세포에서 에피솜 형태로 매우 안정하게 수득된다는 것이 본 발명의 기초가 되는 작업에서 확인되었다. 게다가, 폴리뉴클레오티드의 정착 효율이 푸로마이신 내성 유전자의 사용, 내성 유전자를 통한 S/MAR 엘리먼트로의 전사 보장, 및 폴리뉴클레오티드에 잠재적으로 존재하는 다른 프로모터로부터 전사적으로 프로모터 - S/MAR 조합의 절연을 통해서 더욱 개선될 수 있다는 것을 확인하였다.
상기에서 이루어진 정의들은 하기에서 준용하여 적용된다. 이하에서 더욱 이루어지는 추가의 정의 및 설명은 또한 본 명세서에 기술된 모든 실시형태에 대해서 준용하여 적용된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "조성물"은 명시된 바와 같은 화합물 및 임의로는 하나 이상의 허용가능한 담체를 포함하는 물질의 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 조성물은 약학적으로 허용가능한 조성물이며; 따라서, 바람직하게, 담체는 약학적으로 허용가능한 담체이다. 본 발명의 화합물은 바람직하게 약학적으로 허용가능한 염으로서 제제화될 수 있다. 바람직한 염은 아세테이트, 메틸에스테르, HCl, 술페이트, 클로라이드 등을 포함한다.
담체(들)는 제제의 다른 성분과 상용성이고 이의 수령체에게 유해하지 않다는 의미에서 허용가능해야만 한다. 적용되는 담체는 예를 들어 고형, 겔 또는 액상일 수 있다. 고형 약학 담체의 예에는 락토스, 백토, 수크로스, 탈크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등이 있다. 액상 담체의 예에는 포스페이트-완충 염수액, 시럽, 오일 예컨대 땅콩유 및 올리브유, 물, 에멀션, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등이 있다. 유사하게, 담체 또는 희석제는 당분야에 충분히 공지된 시간 지연 재료, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 상기 적합한 담체는 상기에 언급된 것들 및 당분야에 충분히 공지된 다른 것들을 포함하며, 예를 들어 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]를 참조한다. 희석제(들)는 조성물 중 화합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예에는 증류수, 생리적 염수, 링거액, 덱스트로스 액, 행크액이 있다. 또한, 약학 조성물 또는 제제는 또한 다른 담체, 보강제 또는 무독성, 비치료적, 비면역원성 안정화제 등을 포함할 수도 있다.
바람직하게, 조성물은 숙주 세포로 폴리뉴클레오티드의 진입을 매개한다. 따라서, 바람직하게 조성물은 적어도 하나의 형질감염제를 포함한다. 적절한 형질감염제의 선택은 표적 숙주 세포를 비롯하여, 고려되는 특별한 용도에 따라 좌우될 수 있다. 그러므로, 형질감염제, 적절한 형질감염 조건을 비롯하여, 선택 기준은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 또한 바람직하게, 조성물은 바이러스-유사 입자를 포함한다. 따라서, 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 바이러스-유사 입자에 패키징되며, 다시 말해서, 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 바이러스-유사 입자에 포함된다.
약학 조성물은 바람직하게 국소로 또는 전신으로 투여된다. 약물 투여에 통상적으로 사용되는 적합한 투여 경로는 경구, 정맥내 또는 비경구 투여를 비롯하여 흡입이 있다. 그러나, 화합물의 작용 방식 및 속성에 따라서, 약학 조성물은 또한 다른 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 화합물은 상기 본 명세서에 명시된 바와 같이, 바이러스 벡터 또는 바이러스 또는 리포솜을 사용하여 유전자 요법 접근법으로 투여될 수 있다. 게다가, 화합물은 통상의 약학 조성물에서 또는 개별 약학 조성물로서 다른 약물과 병용하여 투여될 수 있고, 상기 개별 약학 조성물은 부분품 키트의 형태로 제공될 수 있다. 화합물은 바람직하게는 통상의 절차에 따라서 표준 약학 담체와 약물을 조합하여 제조된 통상의 제형으로 투여된다. 이들 절차는 바람직한 조제물로 적절하게 성분을 혼합, 과립화 및 압착 또는 용해시키는 것을 포함시킬 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특징은 조합하려는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 충분히 공지된 변수들에 의해 영향받는다는 것을 이해하게 될 것이다.
약학 조성물의 치료적 유효 용량은 본 명세서에서 언급되는 질환 또는 병태를 동반하는 증상을 예방, 경감 또는 치료시키는 본 발명의 약학 조성물에서 사용하려는 화합물의 양을 의미한다. 이러한 화합물의 치료적 효능 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차, 예를 들어 ED50 (개체군의 50%에서 치료적으로 유효한 용량) 및 LD50 (개체군의 50%에서 치명적인 용량)를 통해 결정될 수 있다. 치료적 효과 및 독성 효과 간 용량 비율은 치료 지수이고, 이것은 LD50/ED50의 비율로서 표시될 수 있다.
용량 용법은 바람직하게는 상기 기술된 방법 중 어느 하나에 따라서, 임상의 및 다른 임상 인자들에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 충분히 공지된 바와 같이, 어느 한 환자에 대한 용량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여하려는 특정 화합물, 성별, 투여 시기 및 경로, 일반 건강 및, 동시 투여되는 다른 약물을 포함한, 많은 인자들에 의존적이다. 진행은 주기적인 평가를 통해 모니터링할 수 있다. 전형적인 용량은 예를 들어, 1 내지 1000 ㎍ 범위일 수 있지만, 특히 상기 언급된 인자들을 고려하여 이러한 예시적인 범위 이하 또는 이상의 용량이 계획된다. 일반적으로, 약학 조성물의 정기적인 투여로서의 용법은 1일 당 1 ㎍ 내지 10 mg 유닛의 범위여야 한다. 용법이 연속 주입이면, 또한 각각 분 당 체중 킬로그램 당 1 ㎍ 내지 10 mg 유닛의 범위여야 한다. 진행은 주기적인 평가를 통해 모니터링할 수 있다. 그러나, 대상체 및 투여 방식에 따라서, 투여 물질의 분량은 체질량 kg 당 약 0.01 mg 내지 체질량 kg 당 약 10 mg을 제공하는 광범위한 범위에서 다양할 수 있다. 바이러스 벡터, 특히 아데노-연합 바이러스 벡터가 투여되는 경우에, 바람직한 용량은 5 x 1011, 내지 2 x 1013 바이러스 입자 또는 바이러스 게놈/kg 체중이고; 이해하게 되는 바와 같이, 이러한 예시적인 용량은 상기에 기술된 인자들 이외에도, 바이러스, 표적 장기 등의 유형과 같은 추가의 인자들에 따라서 변형될 수 있다.
본 명세서에서 언급되는 약학 조성물 및 제제는 본 명세서에서 열거되는 질환 또는 병태를 치료 또는 경감 또는 예방하기 위해 적어도 1회 투여된다. 그러나, 상기 약학 조성물은 1회 초과, 예를 들어 비제한적인 일수까지 1일 1회 내지 4회 투여될 수 있다.
특별한 약학 조성물은 약학 분야에 충분히 공지된 방식으로 제조되며 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와의 혼합물로 또는 아니면 회합되어 상기 본 명세서에 언급된 적어도 하나의 활성 화합물을 포함한다. 이들 특별한 약학 조성물을 제조하기 위해서, 활성 화합물(들)은 일반적으로 담체 또는 희석제와 혼합될 것이거나, 또는 캡슐, 샤세, 카세, 종이 또는 다른 적합한 용기 또는 비히클에 밀봉 또는 캡슐화된다. 최종 제제는 투여 방식에 맞춰 채택될 것이며, 즉, 정제, 캡슐, 좌제, 용액, 현탁액 등의 형태이다. 용량 추천은 고려되는 수령체에 따라서 용량 조정을 예측하기 위해 처방자 또는 사용자 설명서에 표시될 것이다.
본 발명은 또한 의약에서 사용을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전자 질환의 치료에서 사용을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 질환"은 개체의 게놈 내 하나 이상의 변형, 바람직하게 돌연변이와 인과적으로 연관된 질환에 관한 것이다. 따라서, 바람직하게, 유전자 질환은 하나 이상의 후생적 변화와 인과적으로 연관되며, 보다 바람직하게는 하나 이상의 유전자 돌연변이와 인과적으로 연관된다. 이해하게 되는 바와 같이, 유전자 질환의 증상은 종종 하나 이상의 특별한 조직(들) 및/또는 세포 유형(들)에서 유전자 생성물의 정상 기능을 제공하는 유전자의 발현 결여 및/또는 돌연변이된 유전자의 발현에 의해 야기된다. 따라서, 돌연변이가 질환의 원인이 되는 세포에서만 유전자 질환을 치료하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게, 유전자 질환은 단일유전자 질환인데, 즉, 한 유전자 내 유전자 변경에 의해 야기된다. 보다 바람직하게, 유전자 질환은 단일유전자 열성 질환이고, 다시 말해서 유전자의 양쪽 대립유전자 내 유전자 변경에 의해 야기되며; 따라서, 바람직하게, 증상의 경감은 영향받은 유전자의 적어도 하나의 비변경된 카피의 제공을 통해서 기대된다. 가장 바람직하게, 유전자 질환은 페닐케톤뇨증, 알캅톤뇨증, 레베르 선천적 흑내장, 맥락막 결손증, 또는 스타르가르트 질환이다.
본 발명은 또한 세포 진입을 매개하는 화합물 및 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "키트"는 함께 포장될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 본 발명의 상기 언급된 화합물, 수단 또는 시약의 컬렉션을 의미한다. 키트의 성분은 개별 바이알 (즉, 개별 부분품의 키트로서)에 포함될 수 있거나 또는 단일 바이알에 제공될 수 있다. 게다가, 본 발명의 키트는 바람직하게는 상기 본 명세서에 언급된 방법을 실시하는데 사용하려는 것임을 이해해야 한다. 바람직하게, 모든 성분은 상기 언급된 방법을 실시하기 위해 즉석 사용 (ready-to-use) 방식으로 제공되는 것이 계획된다. 또한, 키트는 바람직하게는 상기 방법을 수행하기 위한 설명서를 함유한다. 설명서는 종이 또는 전자 형태로 사용자의 매뉴얼로 제공될 수 있다. 또한, 매뉴얼은 본 발명의 키트를 사용하여 상기 언급된 방법을 수행할 때 수득된 결과를 해석하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 상기로부터 이해하게 되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트의 설명은 바람직하게는 준용하여 상응하는 벡터를 포함하는 키트에 관한 것이다.
바람직하게, 키트는 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 세포 진입을 매개하는 적어도 하나의 화합물을 더 포함하고, 용어 "세포 진입을 매개하는 화합물"은 키트의 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포의 내부, 바람직하게 숙주 세포로 진입하게 하는데 적합한 임의의 수단에 관한 것이다. 세포 진입을 매개하는 적합한 화합물 (전달 수단)은 당분야에 공지되어 있고 특히 형질감염 수단, 패키징 조성물 등을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전달 수단, 예를 들어 바이러스 입자, 보다 바람직하게 복제-결함성 바이러스 입자, 가장 바람직하게 바이러스-유사 입자 (VLP)에 사전 패키징된다. 당업자는 세포 수용체에 상이한 특이성을 제공하는 전달 수단을 알고 있어서, 소정 표적 숙주 세포에 적절한 전달 수단을 선택할 수도 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하는 장치에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "장치"는 본 발명의 화합물 또는 조성물의 투여를 허용하도록 적어도 서로 작동적으로 연결된 수단을 포함하는 수단의 시스템에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드, 조성물, 숙주 세포를 투여하기 위해 바람직한 수단은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 작동되는 방식으로 수단을 연결시키는 방법은 장치에 포함되는 수단의 유형, 계획되는 투여의 종류에 의존하게 될 것이다. 바람직하게, 그러한 경우에 수단은 단일 장치로 포함된다. 따라서 상기 장치는 화합물 또는 조성물의 투여를 위한 전달 유닛 및 투여까지 상기 화합물 또는 조성물을 저장하기 위한 저장 유닛을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명의 수단은 이러한 실시형태에서 개별 장치로서 존재할 수 있고, 바람직하게는 키트로서 함께 패키징될 수 있다는 것을 또한 고려한다. 당업자는 추가의 고생없이 수단들을 연결하는 방법을 인식하게 될 것이다. 바람직한 장치는 전문 기술자의 특정 지식없이도 적용할 수 있는 것이다. 바람직한 실시형태에서, 장치는 본 발명의 화합물 또는 조성물을 포함하는, 보다 바람직하게는 바늘이 존재하는 시린지이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 장치는 화합물 또는 조성물을 포함하는 정맥내 주입 (IV) 장비이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 장치는 투여 부위를 플러싱하기 위한 화합물 또는 약물을 포함하거나, 또는 예를 들어 종양에 화합물 또는 조성물의 국소 도포를 위한 바늘을 더 포함하는 내시경 장치이다. 여전히 다른 바람직한 실시형태에서 장치는 본 발명의 화합물을 포함하는 흡입기이고, 여기서 보다 바람직하게, 상기 화합물은 에어로졸로서 투여를 위해 제제화된다.
본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는, 숙주 세포를 안정하게 형질감염시키기 위한 방법에 관한 것이다:
a) 상기 숙주 세포를 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포와 접촉시키는 단계, 및
b) 그리하여, 숙주 세포를 안정하게 형질감염시키는 단계.
본 발명의 숙주 세포를 안정하게 형질감염시키기 위한 방법은 바람직하게는 시험관내 방법이다. 게다가, 상기 명확하게 언급된 것들에 더하여, 단계들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 예를 들어 단계 a)에서 숙주 세포 또는 이를 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 및/또는 접촉된 숙주 세포에 선택압을 적용하는 단계에 관한 것일 수 있다. 뿐만 아니라, 하나 이상의 상기 단계들은 자동화 장비를 통해 수행될 수 있다.
숙주 세포를 안정하게 형질감염시키는이라는 용어는 폴리뉴클레오티드, 바람직하게 이종성 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입시켜서 폴리뉴클레오티드가 상기 본 명세서에 명시된 바와 같은 숙주 세포에 의해 안정하게 복제되는 것에 대한 것으로 당업자는 이해한다. 바람직하게, 안정한 형질감염은 폴리뉴클레오티드의 안정한 에피솜 복제를 포함한다. 바람직하게, 안정한 형질감염 단계는 접촉 단계 이후에 선별 마커의 존재에 대해 선택되도록 숙주 세포에 선택압을 적용하는 단계를 포함한다. 선택압은 접촉 이후에, 임의로는 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드가 정착되는 것을 허용하는 제1 시간 기간을 배제하고, 적용되며; 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드가 정착되는 것을 허용하는 상기 제1 시간 기간의 지속기간은 대체로 접촉되는 숙주 세포의 유형 및 사용되는 선별 마커의 종류에 의존적이게 되며; 바람직하게, 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드가 정착되는 것을 허용하는 상기 제1 시간 기간의 지속기간은 1시간 내지 48시간, 보다 바람직하게는 2시간 내지 24시간, 가장 바람직하게는 3시간 내지 16시간이다. 그러나, 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드가 정착하도록 허용하는 상기 제1 시간 기간의 지속기간은 또한 0일 수 있는데, 즉 선택압이 접촉 직후 또는 심지어 접촉 동안에 적용될 수 있다. 선택압은 연속적으로, 즉 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 숙주 세포가 증식되는 것을 방지하도록, 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드가 정착되도록 허용하는 제1 시간 기간 이후 본질적으로 모든 시점에 적용될 수 있거나; 또는 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오티드를 수용하지 않은 세포를 제거하기 위해 일시적으로 적용될 수 있다. 바람직하게, 선택압의 일시적 적용은 세포가 상기 접촉 이후에 유기체에게 다시 전달되는 경우에 사용된다. 그러나, 또한 특히 표적 숙주 세포로 폴리뉴클레오티드의 전달 효율이 충분히 높다고 알려진 경우 및/또는 유전자이식 숙주 세포의 순수 개체군이 중요하지 않은 경우에는 선택압이 적용되지 않는 것을 계획한다.
본 발명의 방법의 문맥에서 사용되는 용어 "접촉하는"은 당업자가 이해하고 있다. 바람직하게, 이 용어는 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 숙주 세포와 물리적으로 접촉되게 하는 것, 예를 들어 숙주 세포 및 화합물(들)이 상호작용하도록 허용하는 것에 관한 것이다. 바람직하게, 접촉은 바람직하게는 상기에 명시된 전달 수단을 통해서, 숙주 세포의 내부로 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드의 전달을 포함한다.
본 발명은 또한 하기의 단계들을 포함하는, 대상체에서 유전자 질환을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다:
a) 상기 대상체를 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포와 접촉시키는 단계, 및
b) 그리하여 상기 대상체에서 유전자 질환을 치료하는 단계.
본 발명의 유전자 질환을 치료하기 위한 방법은 바람직하게는 생체내 방법이다. 게다가, 상기 명확하게 언급된 것들 외의 단계들도 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 단계 a)에서 숙주 샘플 또는 이를 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 및/또는 대상체에게 상기 샘플 또는 숙주 세포를 재투여하는 단계에 관한 것일 수 있다. 따라서, 유전자 질환을 치료하기 위한 방법은 상기 명시된 바와 같이 숙주 세포를 안정하게 형질감염시키기 위한 방법의 단계들을 포함한다. 게다가, 하나 이상의 상기 단계들은 자동화 장비를 통해 수행될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 숙주 세포를 안정하게 유전자 변형시키기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 의약의 제조를 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 그리고 유전자 질환, 바람직하게는 단일유전자 질환, 보다 바람직하게는 단일유전자 열성 질환, 가장 바람직하게 페닐케톤뇨증, 알캅톤뇨증, 레베르 선천적 흑내장, 맥락막 결손증, 또는 스타르가르트 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유도 만능 줄기 세포 (IPSC)의 생성을 위한, 초대 세포, 바람직하게 초대 피부 섬유아세포의 유전자 변형을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 초대 세포는 마우스 또는 인간 초대 세포이다.
용어 "초대 세포"는 배양된 세포주의 세포에 반대되는 것으로 당업자는 이해하며, 따라서, 바람직하게, 초대 세포는 살아있는 유기체로부터 유래되어 20 계대 이하, 보다 바람직하게 15 계대 이하, 보다 더 바람직하게 10 계대 이하, 보더 더 바람직하게 5 계대 이하로 배양된 세포이다. 가장 바람직하게, 초대 세포는 살아있는, 바람직하게 마우스 또는 인간의 조직으로부터 직접적으로 유래된 세포이다.
용어 "줄기 세포"는 또한 적어도 2종의 세포 유형, 바람직하게 적어도 5종의 세포 유형, 보다 바람직하게 적어도 하나의 완전한 세포 계통으로 분화되는 잠재성을 갖는 미분화 또는 저분화 세포에 관한 것으로 당업자는 이해한다. 바람직하게, 줄기 세포는 전능 줄기 세포, 보다 바람직하게는 만능 줄기 세포이다. 용어 "유도 만능 줄기 세포" 또는 "IPSC"는 분화된 세포, 바람직하게는 분화된 초대 세포로부터 유래된 만능 줄기 세포에 관한 것이다. IPSC를 생성시키는 방법은 당분야에 공지되어 있고, 바람직하게는 세포에서 4종의 전사 인자의 발현을 포함한다 (예를 들어, [Takahashi et al. (2006), Cell. 126 (4):663] 참조).
본 발명은 또한 배아 줄기 세포의 유전자 변형을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전자 질환, 바람직하게 단일유전자 질환, 보다 바람직하게 단일유전자 열성 질환, 가장 바람직하게 페닐케톤뇨증, 알캅톤뇨증, 레베르 선천적 흑내장, 맥락막 결손증, 또는 스타르가르트 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이고, 여기서 상기 의약은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 또한 유전자이식 동물을 생성시키기 위해 줄기 세포의 유전자 변형을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 유전자이식 동물의 생산을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자이식 동물"은 바람직하게는 유전자 조작 방법을 통해서 상기 동물에게 도입된, 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동물에 관한 것이다. 바람직하게, 유전자이식 동물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나, 보다 바람직하게 적어도 10개, 여전히 보다 바람직하게 적어도 1000개, 보다 더 바람직하게 적어도 10000개 세포를 포함한다.
또한, 본 발명은 전핵 주입을 통해서 단일 세포 배아의 유전자 변형을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 용어 "전핵 주입"은 바람직하게는 유전자이식 동물을 생성시키기 위해, 유전 물질, 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 수정된 난모세포의 핵에 주입하는 것에 관한 것이다.
추가 정의:
AF: 항생제-무함유.
amp: 암피실린.
ampR: 암피실린 내성 유전자.
항생제 선별 마커: 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자, 예를 들어 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자, 푸로마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자.
ApoB: 아포리포단백질 B.
대략: 본 명세서에서 사용시, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 명시된 기준값과 동일하거나 또는 유사한 값이다.
박테리아 영역: 박테리아 숙주에서 증식 및 선별에 요구되는 플라스미드 벡터의 영역.
bp: 염기쌍.
ccc: 공유적으로 폐쇄된 원형.
cI: 람다 리프레서.
cITs857: 온도 감수성을 부여하는 C에서 T (Ala에서 Thr)로의 돌연변이가 더 도입된 람다 리프레서. cITs857은 28-30℃에서는 기능성 리프레서이지만 37-42℃에서는 대체로 불활성이다. cI857이라고도 한다.
CatR: 클로람페니콜 내성 유전자.
cmv: 사이토메갈로바이러스.
이. 콜라이 (E. coli): 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 그람 음성 박테리아.
EGFP: 증강 녹색 형광 단백질 (Enhanced green fluorescent Protein).
ELE40: 항-리프레서 엘리먼트 엘리먼트 (anti-repressor element Element) 40, [Kwaks et al., 2003, Nat Biotechnol. 21:553]에 개시된 STAR40.
EP: 전기천공.
정착 효율: 자기-복제성 비통합형 에피솜 S/MAR 발현 벡터가 형질감염 이후에 에피솜으로 안정하게 유지되는 세포의 백분율.
진핵생물 발현 벡터: RNA 중합효소 I, II 또는 III 프로모터를 사용하는 표적 진핵생물 세포 또는 유기체에서 mRNA, 단백질 항원, 단백질 치료제, shRNA, RNA 또는 마이크로RNA 유전자의 발현을 위한 벡터.
진핵생물 영역: 표적 유기체에서 플라스미드 기능에 요구되는 서열 및/또는 진핵생물 서열을 코딩하는 플라스미드의 영역. 이것은 RNA Pol II 인핸서, 프로모터, 이식유전자 및 폴리-A 서열을 포함하는 표적 유기체에서 하나 이상의 이식유전자의 발현에 요구되는 플라스미드 벡터의 영역을 포함한다. 이것은 또한 RNA Pol I 또는 RNA Pol III 프로모터, RNA Pol I 또는 RNA Pol III 발현된 이식유전자 또는 RNA를 사용하는 표적 유기체에서 하나 이상의 이식유전자의 발현에 요구되는 플라스미드 벡터의 영역을 포함한다. 진핵생물 영역은 임의로는 다른 기능성 서열, 예컨대 진핵생물 전사 종결자, 초나선화-유도된 DNA 듀플렉스 안정화 (SIDD) 구조, S/MAR, 경계 엘리먼트 등을 포함할 수 있다.
엑손: 전사되어서 인트론 제거를 위한 RNA 스플라이싱의 완료이후에 성숙한 mRNA 생성물 내에 존재하는 유전자에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열.
발현 인핸서: 인접한 프로모터의 발현을 개선시키는 DNA 서열. 예를 들어, [Saunders et al., 2015 PloS One 10:e0120096]에서 고찰된 바와 같은, Ele40, UCOE, 항-리프레서 엘리먼트, 또는 안정화 항-리프레서 (STAR) 엘리먼트.
발현 벡터: 표적 유기체에서 mRNA, 단백질 항원, 단백질 치료제, shRNA, RNA 또는 마이크로RNA 유전자의 발현을 위한 벡터.
g: 그램, 킬로그램의 경우 kg.
관심 유전자: 표적 유기체에서 발현시키려는 유전자. 단백질 또는 펩티드 항원, 단백질 또는 펩티드 치료제를 코딩하는 mRNA 유전자, 및 RNA 치료제를 코딩하는 mRNA, shRNA, RNA 또는 마이크로RNA, 및 RNA 백신을 코딩하는 mRNA, shRNA, RNA 또는 마이크로RNA 등이 포함된다.
GFP: 녹색 형광 단백질.
Hr(s): 시간(들).
ID: 피부내.
IM: 근육내.
면역 반응: 항원 반응성 세포 (예를 들어, 항원 반응성 T 세포) 또는 항체 (예를 들어, 항원 반응성 IgG) 반응.
인트론: 전사되어서 그 이후에 RNA 스플라이싱에 의해서 성숙한 mRNa 생성물에서 제거되는 유전자에 의해 코딩되는 뉴클레오티드 서열.
ITR: 반전된 말단 반복부 (Inverted Terminal Repeat).
kan: 카나마이신.
kanR: 카나마이신 내성 유전자.
Kd: 킬로달톤.
코작 (kozak) 서열: 효율적인 번역 개시를 보장하는 ATG 출발 코돈 바로 상류의 최적 공통 DNA 서열 gccRccATG (R = G 또는 A).
MFI: 중간 형광 강도 (Medium Fluorescent Intensity).
미니써클: 생체내 또는 시험관내 부위-특이적 재조합 또는 시험관내 제한효소 분해/결찰을 통해 부모 플라스미드로부터 박테리아 영역이 제거된 공유적으로 폐쇄된 원형 플라스미드 유도체. 미니써클 벡터는 박테리아 세포에서 복제 부전이다.
mRNA: 메신저 RNA.
mSEAP: 쥐과의 분비형 알칼리 포스파타제.
NA: 적용불가.
나노플라스미드™ 벡터: RNA 선별 마커를 R6K, ColE2 또는 ColE2 관련 복제 기원과 조합한 박테리아 영역을 갖는 벡터. 예를 들어, [Williams, 2014. DNA plasmids with improved expression. 국제 공개 특허 출원 WO2014035457]에 기술된 NTC9385C, NTC9685C, NTC9385R, NTC9685R 벡터 및 변형물이 있고 참조로 본 명세서에 포함된다.
비통합형 렌티바이러스 벡터: [Verghese et al., 2014 Nucleic Acids Research 42:e53]에 기술된 바와 같은 에피솜 LTR 원형의 유지를 위한 S/MAR 및 돌연변이된 인테그라제를 갖는 렌티바이러스 벡터.
NP: 나노플라스미드.
NTC8385: NTC8385, NTC8485 및 NTC8685 플라스미드는 항생제 내성 마커 예컨대 kanR 대신에 짧은 RNA (RNA-OUT) 선별 마커를 함유하는 항생제-무함유 pUC 기원 벡터이다. 이들 RNA-OUT 기반 항생제-무함유 벡터의 생성 및 적용은 Williams, JA 2008 국제 공개 특허 출원 WO2008153733에 기술되어 있고 참조로 본 명세서에 포함된다.
NTC8485: NTC8485는 항생제 내성 마커 예컨대 kanR 대신에 짧은 RNA (RNA-OUT) 선별 마커를 함유하는 항생제-무함유 pUC 기원 벡터이다. NTC8485의 생성 및 적용은 Williams, JA 2010 US 특허 출원 20100184158에 기술되어 있고 참조로 본 명세서에 포함된다.
NTC8685: NTC8685는 항생제 내성 마커 예컨대 kanR 대신에 짧은 RNA (RNA-OUT) 선별 마커를 함유하는 항생제-무함유 pUC 기원 벡터이다. NTC8685의 생성 및 적용은 [Williams, 상동, 2010]에 기술되어 있고 참조로 본 명세서에 포함된다.
NTC9385R: 참조로 본 명세서에 포함되는 [Williams, 상동, 2014]에 기술되고 NTC9385R 나노플라스미드™ 벡터는 측접된 NheI 및 KpnI 부위를 통해서 진핵생물 영역에 연결된 스페이서 영역 코딩된 NheI-trpA 종결자-R6K 기원 RNA-OUT-KpnI 박테리아 영역 (SEQ ID NO:8)을 갖는다.
OD600: 600 nm에서의 광학 밀도.
PBS: 포스페이트 완충 염수.
PCR: 중합효소 연쇄 반응.
pDNA: 플라스미드 DNA.
pINT pR pL 벡터: pINT pR pL attHK022 통합형 발현 벡터는 [Luke et al., 2011 Mol Biotechnol 47:43]에 기술되어 있고 참조로 본 명세서에 포함된다. 발현시키려는 표적 유전자는 pL 프로모터의 하류에 클로닝된다. 벡터는 열 유도성 표적 유전자 발현을 허용하는, 온도 유도성 cI857 리프레서를 코딩한다.
PL 프로모터: 람다 프로모터 좌측. PL은 OL1, OL2 및 OL3 리프레서 결합 부위에 cI 리프레서 결합에 의해 억제되는 강력 프로모터이다. 온도 감수성 cI857 리프레서는 30℃에서 cI857 리프레서가 기능성이고 유전자 발현을 억제하지만, 37-42℃에서 리프레서가 불활성화되어 유전자 발현이 뒤따르므로 열 유도에 의한 유전자 발현의 제어를 허용한다.
PL (OL1 G에서 T) 프로모터: 람다 프로모터 좌측. PL은 OL1, OL2 및 OL3 리프레서 결합 부위에 cI 리프레서 결합에 의해 억제되는 강력 프로모터이다. 온도 감수성 cI857 리프레서는 30℃에서 cI857 리프레서가 기능성이고 유전자 발현을 억제하지만, 37-42℃에서 리프레서가 불활성화되어 유전자의 발현이 뒤따르므로 열 유도에 의한 유전자 발현의 제어를 허용한다. OL1에 cI 리프레서 결합은 OL1 G에서 T로의 돌연변이에 의해 감소되어 그 결과로 [Williams, 상동, 2014]에 기술된 바와 같이 30℃ 및 37-42℃에서 증가된 프로모터 활성이 일어난다.
플라스미드: 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있는 염색체 DNA와 분리된 염색체외 DNA 분자.
플라스미드 카피수: 세포 당 플라스미드의 카피 개수. 플라스미드 카피수의 증가는 플라스미드 생산 수율을 증가시킨다.
Pol: 중합효소.
폴리A: 폴리아데닐화 신호 또는 부위. 폴리아데닐화는 RNA 분자에 폴리(A) 꼬리부의 첨가이다. 폴리아데닐화 신호는 RNA 절단 복합체에 의해 인식되는 서열 모티프를 함유한다. 대부분의 인간 폴리아데닐화 신호는 AAUAAA 모티프 및 그에 대한 5' 및 3'에 보존 서열을 함유한다. 일반적으로 사용되는 폴리A 신호는 토끼 β 글로빈 (RBG), 소 성장 호르몬 (BGH), SV40 초기 또는 SV40 후기 폴리A 신호로부터 유래된다.
pUC 기원: 고온에서 카피수를 증가시키는 G에서 A로의 전이 및 ROP 음성 조절인자의 결실이 존재하는, pBR322-유래 복제 기원.
pUC 무함유: pUC 기원을 함유하지 않는 플라스미드. pUC 기원의 비복제성 단편, 예를 들어 RNAI 선별 마커를 포함할 수 있다.
pUC 플라스미드: pUC 기원을 함유하는 플라스미드.
PuroR: 푸로마이신 내성 유전자.
R6K 플라스미드: NTC9385R, NTC9685R, NTC9385R2-O1, NTC9385R2-O2, NTC9385R2a-O1, NTC9385R2a-O2, NTC9385R2b-O1, NTC9385R2b-O2, NTC9385Ra-O1, NTC9385Ra-O2, NTC9385RaF, 및 NTC9385RbF 벡터를 비롯하여 참조로 본 명세서에 포함되는 [Williams, 상동, 2014]에 기술된 R6K 복제 기원을 함유하는 변형 및 대체 벡터. 당분야에 공지된 대체 R6K 벡터는 제한없이 pCOR 벡터 (Gencell), pCpGfree 벡터 (Invivogen), 및 pGM169를 포함한 CpG 무함유 유니버시티 오브 옥스포드 (University of Oxford) 벡터를 포함한다.
R6K 복제 기원: DNA 복제를 개시하기 위해 R6K Rep 단백질에 의해 특이적으로 인식되는 영역. 제한없이 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4로서 개시된 R6K 감마 복제 기원 서열, 및 참조로 본 명세서에 포함되는 Drocourt 등의 미국 특허 7244609에 기술된 바와 같은 CpG 무함유 형태 (예를 들어, SEQ ID NO:3)를 포함한다. R6K 복제 기원-RNA-OUT 박테리아 영역: 증식을 위한 R6K 복제 기원 및 RNA-OUT 선별 마커를 함유 (예를 들어, SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17).
Rep: 복제
복제 중간체: 플라스미드 복제의 조기 종료로 인한 선형 DNA 단편.
Rep 단백질 의존적 플라스미드: 복제가 트랜스로 제공되는 복제 (Rep) 단백질에 의존적인 플라스미드이다. 예를 들어, Rep 단백질이 숙주 균주 게놈으로부터 발현되는 R6K 복제 기원, ColE2-P9 복제 기원 및 ColE2 관련 복제 기원 플라스미드. 수많은 추가의 Rep 단백질 의존적 플라스미드가 당분야에 공지되어 있고, 이들 다수는 참조로 본 명세서에 포함되는 [del Solar et al., 상동, 1998]에 요약되어 있다.
레트로바이러스 벡터: 분열하는 세포를 감염시킬 수 있는 통합형 바이러스 벡터. 또한 전송 플라스미드라고도 한다. 플라스미드는 레트로바이러스 LTR 측접된 발현 유닛을 코딩한다. 전송 플라스미드는 바이러스 입자를 만드는데 요구되는 엔벨로프 및 패키징 플라스미드와 함께 생산 세포를 형질감염시킨다.
RNA-IN: 삽입 서열 10 (IS10) 코딩된 RNA-IN, RNA RNA-OUT의 일부에 대한 안티센스 및 상보성 RNA. RNA-IN이 mRNA의 미번역된 리더에 클로닝되는 경우에, RNA-IN와 RNA-OUT의 어닐링은 RNA-IN의 하류에서 코딩되는 유전자의 번역을 감소시킨다.
RNA-IN 조절된 선별 마커: 염색체에서 발현되는 RNA-IN 조절된 선별 마커. 플라스미드 유래 RNA-OUT 안티센스 리프레서 RNA (SEQ ID NO:6)의 존재 하에서, RNA-IN의 하류에서 코딩되는 단백질의 발현이 억제된다. RNA-IN 조절된 선별 마커는 1) 독성 물질 (예를 들어, SacB)을 생성시킴으로써 또는 그 자체로 상기 세포에게 치명적이거나 또는 유독성인 단백질, 2) 상기 세포의 성장에 필수적인 유전자 (예를 들어, RNA-IN tetR 리프레서 유전자에 의해 조절되는 murA 필수 유전자)의 전사를 억제하여 상기 박테리아 세포에게 치명적이거나 또는 유독성인 리프레서 단백질을 조절하도록 구성된다. 예를 들어, RNA-OUT 플라스미드 선별/증식을 위한 염색체에서 발현되는 RNA-IN-SacB 세포주가 [Williams, 상동, 2008]에 기술되어 있고, 참조로 본 명세서에 포함시킨다. 당분야에 기술된 대체 선별 마커가 SacB를 대체할 수 있다.
RNA-OUT: 삽입 서열 10 (IS10) 코딩된 RNA-OUT, RNA-IN의 하류에서 발현되는 트랜스포존 유전자에 하이브리드화되고, 이의 번역을 감소시키는 안티센스 RNA. RNA-OUT RNA (SEQ ID NO:6) 및 RNA-IN-SacB 세포주에서 염색체 발현된 상보성 RNA-IN SacB의 서열은, 제한없이, RNA-OUT A08/RNA-IN S49 쌍, RNA-OUT A08/RNA-IN S08 쌍, 및 RNA-OUT 5' TTCGC 서열의 CG를 비-CpG 서열로 변형시킨 RNA-OUT A08의 CpG 무함유 변형을 포함하는, [Mutalik et al., 2012 Nat Chem Biol 8:447]에 기술된 것과 같은, 대체 기능성 RNA-IN/RNA-OUT 결합쌍을 도입시키도록 변형될 수 있다. RNA-OUT RNA 내 2개 CpG 모티프 (이 중 하나는 RNA-IN 상보성 영역에 존재)가 제거된 CpG 무함유 RNA-OUT 선별 마커의 예는 [Williams 2015. Replicative minicircle vectors with improved expression. US 특허 출원 US 2015/0275221]에 기술되었고 참조로 본 명세서에 포함시킨다. 2개 CpG 모티프를 제거시키기 위한 다수의 대체 치환 (각각의 CpG를 CpA, CpC, CpT, ApG, GpG, 또는 TpG로 돌연변이시킴)을 이용하여 CpG 무함유 RNA-OUT을 만들 수 있다.
RNA-OUT 선별 마커: 이. 콜라이 전사 프로모터 및 RNA-OUT RNA가 측접된 종결자 서열을 포함하는 RNA-OUT 선별 마커 DNA 단편. DraIII 및 KpnI 제한 효소 부위가 측접된 RNA-OUT 프로모터 및 종결자 서열을 이용하는, RNA-OUT 선별 마커, 및 aRNA-OUT 플라스미드 전파를 위한 디자이너 염색체 발현 RNA-IN-SacB 세포주를 는 [Williams, 상동, 2008]에 기술되어 있고 참조로 본 명세서에 포함시킨다. RNA-OUT RNA (SEQ ID NO:6)가 측접하는 SEQ ID NO: 5의 RNA-OUT 프로모터 및 종결자 서열은 이종성 프로모터 및 종결자 서열로 치환될 수 있다. 예를 들어, RNA-OUT 프로모터는 당분야에 공지된 CpG 무함유 프로모터, 예를 들어 참조로 본 명세서에 포함되는 [Williams, 상동, 2008]에 기술된 I-EC2K 프로모터 또는 P5/6 5/6 또는 P5/6 6/6 프로모터로 치환될 수 있다. RNA-OUT 프로모터의 2개 CpG 모티프가 제거된 2 CpG RNA-OUT 선별 마커는 SEQ ID NO: 7로 제공된다. RNA-OUT RNA 중 2개의 CpG 모티프 (이 중 하나는 RNA-IN 상보성 영역에 존재) 및 RNA-OUT 프로모터 중 2개 CpG 모티프가 제거된, CpG 무함유 RNA-OUT 전사 유닛의 예는 [Williams, 상동, 2015]에 기술되어 있고 참조로 본 명세서에 포함시킨다. CpG 무함유 RNA-OUT 선별 마커를 도입시킨 벡터는 [Williams, 상동, 2008]에 기술된 RNA-OUT 플라스미드 전파를 위한 RNA-IN-SacB 세포주를 사용하여 수크로스 내성에 대해 선별될 수 있다. 대안적으로, 이들 세포주의 RNA-IN 서열은 변형되어서 RNA-IN에 상보성인 CpG 무함유 RNA-OUT 영역을 완벽하게 일치시키는데 필요한 1 bp 변화를 도입시킬 수 있다.
RNA 중합효소 II 프로모터: mRNA, 대부분 소형 핵 RNA 및 마이크로RNA를 합성하기 위해 RNA 중합효소 II를 동원하는 프로모터. 예를 들어, 항상성 프로모터 예컨대 인간 또는 쥐과 CMV 프로모터, 연장 인자 1 (EF1) 프로모터, 닭 β-액틴 프로모터, 다른 종 유래의 β-액틴 프로모터, 연장 인자-1 α (EF1 α) 프로모터, 포스포글리세로키나제 (PGK) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 인간 혈청 알부민 (SA) 프로모터, 비장 병소-형성 바이러스 (SFFV) 프로모터, α-1 안티트립신 (AAT) 프로모터, 티록신 결합 글로불린 (TBG) 프로모터, 사이토크롬 P450 2E1 (CYP2E1) 프로모터 등. 벡터는 또한 조합 프로모터 예컨대 닭 β-액틴/CMV 인핸서 (CAG) 프로모터, 연장 인자 1α (EF1α) 프로모터와 조합된 인간 또는 쥐과 CMV-유래 인핸서 엘리먼트, 연장 인자 1α (EF1α) 프로모터와 조합된 인간 또는 쥐과 CMV-유래 인핸서 엘리먼트의 CpG 무함유 형태, α-페토단백질 MERII 인핸서와 조합된 알부민 프로모터 등, 또는 다양한 조직 특이적 또는 유도성 프로모터, 예컨대 근육-특이적 프로모터 근육 크레아틴 키나제 (MCK), 및 C5-12 또는 간-특이적 프로모터 ApoE-hAAT, 아포리포단백질 A-I (ApoAI) 등을 이용할 수 있다.
RNA 중합효소 III 프로모터: tRNA, 5S 리보솜 RNA, 및 다른 소형 RNA를 합성하기 위해 RNA 중합효소 III을 동원하는 프로모터. 예를 들어, 클래스 I 프로모터 예컨대 5s rRNA 프로모터, 클래스 II 프로모터 예컨대 tRNA 프로모터, 클래스 III 프로모터 예컨대 U6 소형 핵 RNA 프로모터 또는 H1 핵 RNase P 프로모터 등.
RNA 선별 마커: RNA 선별 마커는 선별성을 제공하도록 염색체 발현 표적 유전자를 조절하는 플라스미드 유래 발현의 비번역 RNA이다. 이것은 참조로 본 명세서에 포함되는 [Crouzet J and Soubrier F 2005 US 특허 6,977,174]에 기술된 바와 같이 넌센스 억제성 선별가능 염색체 표적을 조절하는 플라스미드 유래의 넌센스 억제성 tRNA일 수 있다. 이것은 또한 플라스미드 유래 안티센스 리프레서 RNA일 수있고, 참조로 본 명세서에 포함되는 비제한적인 목록은 RNA-IN 조절된 표적을 억제하는 RNA-OUT (Williams, 상동, 2008), RNAII 조절된 표적을 억제하는 pMB1 플라스미드 기원 코팅된 RNAI (Grabherr R, Pfaffenzeller I. 2006 US 특허 출원 US20060063232; Cranenburgh RM. 2009; US 특허 7,611,883), RNA II 조절된 표적을 억제하는 IncB 플라스미드 pMU720 기원 코딩된 RNAI (Wilson IW, Siemering KR, Praszkier J, Pittard AJ. 1997. J Bacteriol 179:742-53), Hok 조절된 표적을 억제하는 플라스미드 R1의 ParB 유전자좌 Sok, flmA 조절된 표적을 억제하는 F 플라스미드의 Flm 유전자좌 FlmB (Morsey MA, 1999 US 특허 US5922583)를 포함한다. RNA 선별 마커는 [Wagner EGH, Altuvia S, Romby P. 2002. Adv Genet 46:361-98] 및 [Franch T, and Gerdes K. 2000. Current Opin Microbiol 3:159-64]에 기술된 것과 같이 당분야에 공지된 다른 천연 안티센스 리프레서 RNA일 수 있다. RNA 선별 마커는 또한 [Na D, Yoo SM, Chung H, Park H, Park JH, Lee SY. 2013. Nat Biotechnol 31:170-4]에 기술된 바와 같이 합성 소형 RNA 발현된 SgrS, MicC 또는 MicF 스캐폴드와 같은 조작된 리프레서 RNA일 수도 있다. RNA 선별 마커는 또한 [Williams, 상동, 2015]에 기술된 바와 같이 조절하려는 표적 유전자 예컨대 SacB에 융합된 표적 RNA를 억제하는 선별 마커의 일부로서 조작된 리프레서 RNA일 수도 있다.
ROP: 프라이머의 리프레서.
RSM: RNA 선별 마커.
SA: 스플라이스 억셉터, 공통 서열 YYYYYYYYYYYAGRW는 SEQ ID NO:29로서 제시된다. 효율적으로 스플라이싱된 SA 부위를 생성시키기 위해서, 스플라이스 분지점 (공통 서열 YTNAY)이 스플라이스 억셉터 부위의 상류에 포함된다 (도 1 참조).
SacB: 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 레반수크라제를 코딩하는 구조적 유전자. 그람 음성 박테리아에서 SacB의 발현은 수크로스의 존재 하에서 유독성이다.
SD: 스플라이스 도너, 공통 서열 AGGTRAGT.
SEAP: 분비형 알칼리 포스파타제.
선별 마커: 선별 마커, 예를 들어 카나마이신 내성 유전자 또는 RNA 선별 마커.
선별 마커: 선별 마커, 예를 들어, 카나마이신 내성 유전자 또는 RNA 선별 마커.
SIDD: 초나선화-유도된 DNA 듀플렉스 안정화 (supercoiling-induced DNA duplex destabilized) (SIDD) 구조. 벡터에 도입되었을 때, 이들 부위는 탈안정화시키려는 벡터 내 다른 서열의 감수성을 변경시킬 수 있다. 이것은 기능을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터에 SIDD 부위의 첨가는 프로모터의 나선 탈안정화를 감소시킬 수 있다. 이것은 일부 프로모터가 프로모터 나선 탈안정화에 따라 발현이 증가되는데 반해, 다른 것들은 프로모터 나선 탈안정화에 따라 발현이 감소될 것이므로 프로모터에 따라서, 프로모터 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
shRNA: 짧은 헤어핀 RNA.
S/MAR: 본 명세서의 다른 곳에 명시된 바와 같은 스캐폴드/매트릭스 부착 영역. 핵 매트릭스에 DNA 부착을 매개하는 진핵생물 서열.
스페이서 영역: 본 명세서에서 사용되는 스페이서 영역은 진핵생물 영역 서열의 5' 및 3' 말단을 연결하는 영역이다. 진핵생물 영역 5' 및 3' 말단은 전형적으로 플라스미드 벡터 내 박테리아 복제 기원 및 박테리아 선별 마커에 의해 이격된다.
SR: 스페이서 영역.
SV40 기원: 복제 기원을 함유하는 원숭이 바이러스 40 게놈 DNA.
SV40 인핸서: 72 bp 및 임의로는 21 bp 인핸서 반복부를 함유하는 원숭이 바이러스 40 게놈 DNA.
표적 항원: 면역 반응을 증가시킬 수 있는, 면역원성 단백질 또는 펩티드 에피토프, 또는 단백질 및 에피토프의 조합. 표적 항원은 감염성 질환의 병원체 또는 알레르기 적용으로 부터 유래되거나 또는 암, 알레르기 또는 자가면역 질환과 같은 적용을 위한 숙주 유기체로부터 유래될 수 있다. 표적 항원은 당분야에서 충분히 정의되어 있다. 일부 예가 [Williams, 상동, 2008]에 기술되어 있고 참조로 본 명세서에 포함된다.
TE 완충액: 대략 10 mM Tris pH 8 및 1 mM EDTA를 함유하는 용액.
TetR: 테트라사이클린 내성 유전자.
전사 종결자: 박테리아: 전사를 위한 오페론 또는 유전자의 끝을 표시하는 DNA 서열. 이것은 고유한 전사 종결자일 수 있거나 또는 Rho-의존적 전사 종결자일 수 있다. 고유한 종결자, 예컨대 trpA 종결자의 경우에, mRNA-DNA-RNA 중합효소 3원 복합체를 파괴하는 헤어핀 구조가 전사물 내에 형성된다. 대안적으로, Rho-의존적 전사 종결자는 신생 mRNA-DNA-RNA 중합효소 3원 복합체를 파괴하기 위해, Rho 인자, RNA 헬리카제 단백질 복합체를 요구한다. 진핵생물: 폴리A 신호는 '종결자'는 아니고, 대신에 폴리A 부위에서 내부 절단은 뉴클레아제 분해를 위해 3'UTR RNA 상의 비캡핑된 5' 말단을 남긴다. 뉴클레아제가 RNA Pol II를 따라 잡아서 종결을 일으킨다. 종결은 RNA Pol II 휴지 부위의 도입에 의해 폴리 A 부위의 짧은 영역 내에서 촉진될 수 있다 (진핵생물 전사 종결자). RNA Pol II의 휴지는 폴리A 절단 이후에 3' UTR mRNA로 도입된 뉴클레아제가 휴지 부위에서 RNA Pol II를 따라잡는 것을 허용한다. 당분야에 공지된 진핵생물 전사 종결자의 비제한적인 목록은 C2x4 및 가스트린 종결자를 포함한다. 진핵생물 전사 종결자는 mRNA의 적절한 3'-말단 프로세싱을 증강시켜 mRNA 수준을 상승시킬 수 있다.
형질감염: 당분야에 공지되고 참조로 본 명세서에 포함되는 세포로 핵산을 전달하기 위한 방법 [예를 들어, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA), ISCOM, 리포솜, 니오솜, 비로솜, 키토산 및 다른 생분해성중합체, 비세입자, 미세구, 나노입자, 나노캡슐, 전기천공, 뉴클레오펙션, 압전 투과법, 초음파천공, 이온영동, 초음파, SQZ 고속 세포 변형 매개 막 파괴법, 코로나 플라스마, 플라스미 촉진 전달법, 조직 내성 플라스미, 레이저 미세천공법, 충격파 에너지, 자기장, 비접촉 자기투과법, 유전자 총, 미세바늘, 미세연마법, 유체역학 전달법, 고압 꼬리 정맥 주사법 등].
이식유전자: 표적 유기체에서 발현을 위해 벡터에 클로닝되는 관심 유전자.
ts: 온도 감수성.
㎍: 마이크로그램.
㎕: 마이크로리터.
UCOE: 편재성 염색질 개방 엘리먼트 (Ubiquitous Chromatin Opening Element), 예컨대 [Muller-Kuller et al., 2015, Nucleic Acids Research 43:1577]에 개시된 바와 같은 A2UCOE 또는 최소 유도체.
UTR: mRNA의 비번역 영역 (코딩 영역의 5' 또는 3').
벡터: 바이러스 (예를 들어, 알파바이러스, 폭스바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노바이러스 관련 바이러스, 통합-결핍형 렌티바이러스 벡터 등) 및 비바이러스 (예를 들어, 플라스미드, 나노플라스미드, MIDGE, 전사적 활성 PCR 단편, 미니써클, 박테리오파지 등) 벡터를 포함하는, 유전자 전달 비히클. 이들은 당분야에 충분히 공지되어 있고 참조로 본 명세서에 포함된다.
벡터 골격: 이식유전자 또는 표적 항원 코딩 영역이 부재하는, 진핵생물 영역 및 박테리아 영역.
척추동물 발현 벡터: RNA 중합효소 I, II 또는 III 프로모터를 사용하여 표적 척추동물 세포 또는 유기체에서 mRNA, 단백질 항원, 단백질 치료제, shRNA, RNA 또는 마이크로RNA 유전자의 발현을 위한 벡터.
바람직한 실시형태의 상세한 설명
본 기술은 일반적으로 에피솜 복제 및 이식유전자 발현을 개선시키는 자기-복제성 비통합형 에피솜 척추동물 발현 벡터 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 기술은 벡터 예컨대 비바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 (예를 들어, 에피솜 통합-결핍 렌티바이러스 벡터, 비통합형 렌티바이러스 벡터, 에피솜 레트로바이러스 벡터 등)의 발현 및 에피솜 복제를 개선시키기 위해 실시될 수 있다.
개선된 에피솜 복제는 본 명세서에서 본 기술을 도입하지 않은 플라스미드와 비교하여 개선된 시험관내 또는 생체내 비통합형 에피솜 벡터 정착 및/또는 유지로서 정의된다. 개선된 플라스미드 발현은 본 명세서에서 본 기술을 도입하지 않은 이식유전자를 코딩하는 플라스미드와 비교하여 개선된 시험관내 또는 생체내 이식유전자 발현 수준 및/또는 발현 지속기간으로서 정의된다. 본 명세서에서 인용되는 모든 참조는 그들 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 기술의 플라스미드 변형 방법은 놀랍게도 효율적인 정착성의 자기-복제성 비통합형 에피솜 벡터를 제공하는 해법을 제공한다는 것이 확인되었다.
본 명세서에 개시되는 벡터 방법 및 조성물은 비 SD-SA 형태와 비교하여 개선된 발현 및 또는 에피솜 정착성 (개선된 성능)을 갖는 3' UTR SD-SMAR-SA 조성물이다. 개선된 성능은 성능 개선이 다양한 S/MAR에서 관찰되므로 S/MAR 특이적인 것은 아니다. 또한 개선된 성능은 성능 개선이 다양한 프로모터, 5' UTR, 이식유전자, 및 폴리A 신호와 연결된 SD-SMAR-SA에서 관찰되므로, 벡터 전사 유닛 특이적인 것이 아니다. 개선된 성능은 상류 인트론 존재 또는 부재에서 관찰된다. 따라서, 본 개시의 3' UTR SD-SMAR-SA 벡터는 자기-복제성 비통합형 에피솜 척추동물 발현 벡터 성능을 개선시키기 위해 광범위하게 적용가능하다.
비SD-SA 형태와 비교하여 3' UTR SD-SMAR-SA의 개시된 개선된 성능은 종래 기술 관점에서 놀라운 것이다. 예를 들어, [Le Hir et al., 2003 Trends in Biochemical Sciences 28:215]는 'Matsumoto 등 [51]이 이들 번역 효과가 인트론 위치에 매우 의존적이라는 것을 확인했다는 것을 교시한다. 그들 연구에서, 5' UTR에 위치된 인트론은 매우 자극적이었지만, 3' UTR에 위치된 동일 인트론은 상응하는 인트론 부재의 mRNA의 수준 이하로 번역을 억제하였다. '.......' 그럼에도 불구하고, 이식유전자의 발현을 최적화시키는데 관심이 있는 연구자들의 경우에, 인트론 위치가 중요한 변수라는 것을 인지하는 것이 중요하다. 잠재적으로 억제되는 번역이외에도, 3' UTR 내 인트론은 하기 기술된 바와 같이 mRNA의 넌센스-매개 붕괴 (NMD)를 촉발할 수 있어서, 보더 더 낮은 단백질 발현을 초래한다. [Barrett et al., 2012 Cell. Mol. Life Sci. 69:3613]은 '5'UTR과 대조적으로, 3'UTR이 상대적으로 적은 인트론 (5%)을 갖는다는 것을 확인하였다고 교시한다 [21]. 후위된 포유동물 유전자에서 인트론 획득의 드문 경우를 조사한 연구는 이들 유전자의 3'UTR 내 인트론의 존재가 넌센스-매개 붕괴에 의한 유전자 발현의 하향 조절을 야기하였다는 것을 발견하였다 [52]. 발현에 대한 이러한 음성적인 효과는 3'UTR 인트론의 낮은 출현율에 대한 설명을 제공한다.' 본 발명의 적용을 제한하지 않지만, 측접된 스플라이스 도너 및 스플라이스 억셉터의 스플라이스 부위 첨가는 3' UTR이 S/MAR 서열을 코딩한다는 점에서 개시된 발명에서 기대치 않은 이득을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 임의의 소정 문의 서열, 예를 들어 SEQ ID NO: 2, 및 대상 서열 간 동일성 정도를 의미한다. 대상 서열은 예를 들어 소정 문의 서열과 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 서열 동일성 백분율을 결정하기 위해서, 문의 서열 (예를 들어, 핵산 서열)은 당분야에 충분히 공지된 임의의 적합한 서열 정렬 프로그램, 예를 들어 핵산 서열의 정렬을 그들 전체 길이에 걸쳐 수행 (전역 정렬)하도록 허용하는, 컴퓨터 프로그램 ClustalW (버전 1.83, 디폴트 매개변수)를 사용하여 하나 이상의 대상 서열에 대해 정렬한다. [Chema et al., 2003 Nucleic Acids Res., 31:3497-500]. 바람직한 방법에서, 서열 정렬 프로그램 (예를 들어, ClustalW)은 문의 및 하나 이상의 대상 서열 간 최고 일치도를 계산하고, 그들을 정렬하여서, 동일성, 유사성, 및 편차를 결정할 수 있다. 하나 이상의 뉴클레오티드의 갭이 문의 서열, 대상 서열 또는 둘 모두에 삽입되어, 서열 정렬을 최대화할 수 있다. 핵산 서열의 신속한 쌍별 정렬을 위해서, 적합한 디폴트 매개변수는 특정한 정렬 프로그램에 적합한 것을 선택할 수 있다. 출력은 서열 간 상관성을 반영하는 서열 정렬이다. 문의 서열에 대한 대상 핵산 서열의 동일성 백분율을 더 결정하기 위해서, 서열은 정렬 프로그램을 사용하여 정렬되고, 정렬에서 동일한 일치부 개수를 문의 서열의 길이로 나누고 그 결과에 100을 곱한다. 동일성 백분율 값은 가장 가까운 십분의 일로 반올림될 수 있다는 것을 주의한다. 예를 들어, 78.11, 78.12, 78.13, 및 78.14는 78.1로 반내림되는 반면, 78.15, 78.16, 78.17, 78.18, 및 78.19는 78.2로 반올림된다.
이제 도면으로 돌아가서, 도 1은 pCI 인트론 (위), 스플라이스 도너 (SD) 영역 (중간) 및 분지점 및 스플라이스 억셉터 (SA) 영역 (아래)의 주석달린 맵을 도시한다. 도 2는 인터페론 베타 S/MAR (위), 및 SD 인터페론 베타 S/MAR SA 유도체 (중간)를 비롯하여, 내부 AATAAA 폴리아데닐화 신호가 돌연변이된 SD 인터페론 베타 S/MAR SA 유도체 (아래)의 주석달린 맵을 도시한다. 도 3은 SD 및 SA 부위가 측접된 인터페론 베타 S/MAR 유도체 M18의 주석달린 맵을 도시한다. 도 4는 SD 및 SA 부위가 측접된 805 bp (위) 또는 525 bp (아래) apoB S/MAR의 주석달린 맵을 도시한다. 도 5는 pMAX-UCOE-coGFP P2A-PuroR-NP (pSMARt UCOE) 벡터의 주석달린 맵을 도시한다. 도 6은 NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SMAR-SV40 pA (NP-UCOE) 및 NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SD SMAR-SA SV40 pA (NP-UCOE-SP) 벡터의 주석달린 맵을 도시한다. 도 7은 NTC9385R-SP-UCOE-CMV-GFP SMARter (NP-SMARter-SP) 및 NTC9385R-SP-UCOE-CMV-GFP CMARter (NP-CMARter-SP) 벡터의 주석달린 맵을 도시한다. 도 8은 NTC9385R-UCOE EF1-coGFP SD-SMAR SA SV40 pA (NP-UCOE-EF1-SP) 및 NTC9385R-UCOE EF1-coGFP-SD SMAR R6K-R-OUT-SA pA (UCOE-EF1-SP-NP) 벡터의 주석달린 맵을 도시한다. 도 9는 NTC9385R-SP-ELE40-CMV-GFP CMARter (NP-Ele40-CMARter-SP) 벡터의 주석달린 맵을 도시한다. 도 10은 측접된 SD 및 SA 부위가 존재 및 부재하는 정착된 S/MAR 벡터의 개선된 발현을 도시한다. 좌측 패널: 스플라이스 접합부가 존재 및 부재하는 S/MAR 벡터가 정착된 HEK293T 세포의 MFI. 벡터는 NP 박테리아 영역, 게놈 인슐레이터 UCOE, CMV 프로모터에 의해 구동되는 발현 카세트 GFP-2A-PuroR, 및 SD 및 SA 부위가 측접된 S/MAR이 존재 (Nano-S/MAR-스플라이스 = NP-UCOE-SP; NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SD SMAR-SA SV40 pA 도 6) 또는 부재 (NP-UCOE; NTC9385R-UCOE-CMV-coGFP P2A-PuroR-SMAR-SV40 pA, 도 6)하는, 3' UTR 내 인터페론 베타 S/MAR을 함유한다. 우측 패널: 개선된 전사 발현은 실시간 PCR 분석으로 확인한다. 이식유전자 GFP의 발현은 하우스키핑 유전자 GAPDH에 대해 정규화된다. 도 11은 측접된 SD 및 SA 부위가 존재 및 부재하는 정착된 S/MAR 벡터의 개선된 발현을 도시한다. 스플라이싱 접합부가 측접된 상이한 S/MAR을 보유하는 벡터가 정착된 세포 (HEK293T 및 초대 마우스 배아 섬유아세포)의 MFI. 벡터 명칭은 도 5, 6 및 7과 같다. 도 12는 측접된 SD 및 SA 부위가 존재 및 부재하는 S/MAR 벡터의 개선된 정착성을 도시한다. 측접된 SD 및 SA 부위가 존재 및 부재하는 2종의 상이한 S/MAR (인터페론 베타 S/MAR; ApoB S/MAR, 805 bp)을 보유하는 벡터가 존재하는 HEK293T에서 수행된 콜로니 형성 어세이. pEPI는 3' UTR 인터페론 베타 S/MAR이 존재하는 CMV 프로모터 플라스미드 벡터이다.
실시예
본 기술의 방법은 하기 실시예를 통해 더욱 예시된다. 이들은 예시로 제공되며 본 개시의 범주를 임의 방식으로 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1: pUC, 및 R6K 복제 기원 플라스미드 생산
RNA-OUT 항생제 무함유 선별 마커 배경: 항생제-무함유 선별은 [Williams, 상동, 2008]에 기술된 바와 같이 파지 람다 부착 부위 염색체 통합된 pCAH63-CAT RNA-IN-SacB (P5/6 6/6)를 함유하는 이. 콜라이 균주에서 수행된다. SacB (바실러스 서브틸리스 레반수크라제)는 수크로스 존재 하에서 이. 콜라이 세포에 치명적인 대항 선별 마커이다. RNA-IN-SacB 전사물로부터 SacB의 번역은 플라스미드 코딩된 RNA-OUT에 의해 개시된다. 이것은 SacB 매개된 치명성의 억제에 의해, 수크로스 존재 하에서 플라스미드 선별을 촉진한다.
R6K 기원 벡터 복제 및 생산 배경: R6K 감마 플라스미드 복제 기원은 복제 개시 단량체로서 다수의 반복된 'iteron'에 결합하는 단일 플라스미드 복제 단백질 η을 요구한다. 증식을 위해 특수 세포주를 요구하는 조건부 복제 기원 예컨대 R6K 감마의 사용은 벡터가 환자의 내생적 균총에게 전달되면 복제하지 않게 되므로 안전역을 첨가한다.
복제에 요구되는 핵심 서열을 함유하는 고도로 최소화된 R6K 감마 유래 복제 기원 (SEQ ID NO:1)은 [Williams, 상동, 2014]에 기술되어 있고 본 명세서에 참조로 포함된다. 스페이서 영역에 이러한 최소화된 R6K 기원 및 RNA-OUT AF 선별 마커를 포함하는 NTC9385R 나노플라스미드™ 골격은 [Williams, 상동, 2014]에 기술되어 있고, 참조로 본 명세서에 포함된다. [Williams, 상동, 2014]은 R6K 기원 나노플라스미드™ 벡터의 선별 및 증식을 위해 파지 HK022 부착 부위 통합된 pL 프로모터 열 유도성 η P42L, P106L 및 F107S 고카피수 돌연변이체 복제 (Rep) 단백질을 발현하는 숙주 균주를 기술한다. 이것은 R6K 기원 벡터가 조작된 Rep 단백질-발현 이. 콜라이 숙주 균주 내에서만 복제할 수 있으므로 추가의 나노플라스미드™ 안전 인자이다.
진탕 플라스크 생산: pUC 기원 플라스미드 생산은 이. 콜라이 균주 DH5α [F-Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK-, mK+) phoA supE44 λ-thi-1 gyrA96 relA1] (Invitrogen, Carlsbad CA)에서 수행하였다. R6K 기원-RNA-OUT 수크로스 선별 나노플라스미드™ 벡터는 숙주 균주 NTC940211 DH5α attλ::P5/6 6/6-RNA-IN- SacB, catR; attHK022::pL (OL1-G에서 T) P42L-P106I-F107S 또는 NTC1050811 DH5α attλ::P5/6 6/6-RNA-IN- SacB, catR; attHK022::pL (OL1-G to T) P42L-P106I-F107S P113S (P3-), SpecR StrepR; attφ80::pARA-CI857ts, tetR에서 수행하였다. 진탕 플라스크 생산은 전매의 Plasmid+ 진탕 배양 배지를 사용하여 수행하였다. 씨드 배양은 글리세롤 스톡 또는 콜로니로부터 출발하였고 50 ㎍/mL 항생제 (ampR 또는 kanR 선별 플라스미드 경우) 또는 6% 수크로스 (RNA-OUT 선별 플라스미드 경우)를 함유하는 LB 배지 한천 플레이트 상에 스트리킹하였다. 플레이트를 30-32℃에서 성장시켰고, 세포를 배지에 재현탁시켰으며 ampR 또는 kanR 선별 플라스미드의 경우 50 ㎍/mL 항생제 또는 RNA-OUT 플라스미드에 대한 선별을 위해서 0.5% 수크로스를 함유하는 500 mL Plasmid+ 진탕 플라스크에 대략 2.5 OD600 접종원을 제공하는데 사용하였다. 플라스크는 포화까지 진탕하면서 성장시켰다.
실시예 2: S/MAR 벡터 구축
pNTC-NP1, pNTC-NP2, pNTC-NP3, pNTC-NP4, pNTC-NP5, pNTC-NP6, pNTC-NP7, 벡터는 pUC57 기반 벡터의 폴리링커 영역에 클로닝된 R6K 감마 기원-RNA-OUT 박테리아 복제-선별 영역 (SEQ ID NO:8)을 코딩한다. pNTC-3xCpG NP1 벡터는 pUC57 기반 벡터의 폴리링커 영역에 클로닝된 1 CpG R6K 감마 기원- 2 CpG RNA-OUT 박테리아 복제-선별 영역 (SEQ ID NO:9)을 코딩한다. 각각의 벡터는 R6K 복제-RNA-OUT 선별을 위해 표적 벡터를 개조하는데 사용할 수 있는 상이한 측접된 제한효소 부위를 갖는다. pNTC-NP 1-7 벡터 및 pNTC-3xCpG NP1에서 R6K-RNA-OUT 삽입부를 측접시킨 5' 및 3' 폴리링커 서열은 표 1에 표시된다.
표 1: pNTC 다중 클로닝 부위 측접된 R6K 기원-RNA-OUT 선별 마커 벡터
Figure pct00001
a R6K 및 서열 CACGTTGTG의 RNA-OUT을 이격시키는 비-팔린드롬의 독특한 3 bp NNN 스티키 말단 DraIII 부위 (CACNNNGTG)는 방향성 다중-단편 결찰 반응으로 별개의 bpNTC 벡터 유래의 RNA-OUT 및 R6K를 조립하는데 사용될 수 있다. R6K-RNA-OUT에 대한 S/MAR 벡터 pUC 기원-항생제 선별 박테리아 골격 개조 (즉, Nanoplasmid, NP, 벡터)는 다음의 단계를 통해 수행되었다:
1) 표적 S/MAR 벡터에서 pUC 기원 및 항생제 선별 마커 영역에 측접되는 제한효소 부위를 선별하는 단계;
2) pNTC-NP 적합성 폴리링커 -R6K-RNA-OUT 폴리링커 카세트 (pNTC- NP1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7; 표 1)를 확인하는 단계;
3) 선별된 제한효수 분해 접근법 및 표준 리가제 매개 클로닝을 사용하여 pUC 기원 항생제 선별 마커영역을 절단하고 선별된 R6K 기원 RNA-OUT 영역으로 치환하는 단계.
일부 경우에서, R6K 기원 및 RNA-OUT 유닛은 비팔린드롬 DraIII 링커 부위를 사용하여 별개의 제한효소 단편으로부터 다수 단편 결찰로 조립하였다 (표 1 참조).
원래 pUC 기원- 항생제 선별 마커 벡터 (예를 들어, pSMARt UCOE; 도 5) 및 개조된 R6K 기원-RNA-OUT 항생제 무함유 선별 마커 벡터 (예를 들어, NP-UCOE: 도 6)의 예시적인 벡터 맵 및 벡터 특징이 도시되어 있다.
SD-S/MAR-SA 3' UTR은 다음과 같이 합성 유전자로서 만들었다. 5' BglII 및 NsiI 클로닝 부위 및 3' XhoI 클로닝 부위가 존재하는 스플라이스 도너 부위 (SEQ ID NO: 25) (도 1)를 S/MAR의 5'에 도입시켰고, 한편으로 5' EcoRI 및 3' BamHI 클로닝 부위가 존재하는 스플라이스 억셉터 부위 (SEQ ID NO: 26) (도 1)는 S/MAR의 3'에 도입시켰다. 유전자는 Genscript (Piscataway, NJ)에서 합성하였고 표준 제한효소 단편 결찰 매개 클로닝법을 사용해 현존 SMAR-NP 벡터 내 S/MAR 대신에 클로닝하였다. 예를 들어, 인터페론 베타 S/MAR (SEQ ID NO: 18) (예를 들어, NP-UCOE 벡터, 도 6)은 스플라이스 도너-인터페론 베타 S/MAR-스플라이스 억셉터 (SEQ ID NO:19) (예를 들어, NP-UCOE-SP 벡터, 도 6; NP-UCOE-EF1-SP, 도 8) 또는 스플라이스 도너-인터페론 베타 S/MAR (-AATAAA)-스플라이스 억셉터 (SEQ ID NO:20) 또는 스플라이스 도너-인터페론 베타 M18 S/MAR-스플라이스 억셉터 (SEQ ID NO:21)로 치환하였다. 스플라이스 도너-인터페론 베타 S/MAR (-AATAAA)은 AATATT(T) MAR 모티프를 갖는 S/MAR 코팅된 AATAAA(N) 전사 종결 신호를 제거하도록 디자인되었다 (도 2). 805 bp ApoB S/MAR은 스플라이스 도너-805 bp ApoB S/MAR-스플라이스 억셉터 버전 (SEQ ID NO: 22) (예를들어, NP-SMARter-SP, 도 7)으로 치환된 한편 525 bp ApoB S/MAR은 스플라이스 도너-525bp ApoB S/MAR-스플라이스 억셉터 버전 (SEQ ID NO: 23) (예를 들어, NP-CMARter-SP, 도 7; NP-Ele40-CMARter-SP, 도 9)으로 치환하였다. 대안적인 이식유전자, 프로모터, 5' UTR 인트론, 또는 ELE40 또는 UCOE 엘리먼트가 존재하는 추가의 NP 구성체는 표준 제한효소 단편 결찰 매개 클로닝법을 통해 만들었다. 모든 구성체는 제한효소 분해 및 시퀀싱을 통해 올바른지 검증하였다.
실시예 3: 일시적 형질감염 이후 S/MAR 벡터 발현
부착성 HEK293 (인간 배아 신장) 및 A549 (인간 폐 암종), 세포주는 미국 균주 자원 센터 (American Type Culture Collection) (Manassas, VA, USA)에서 입수하였다. 세포주는 10% 태아 소 혈청을 함유하는 둘베코의 변형 이글 배지/F12에서 증식시켰고 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 시약 (0.25% 트립신-EDTA) 및 통상의 방법론을 사용하여 분할하였다. 형질감염의 경우, 세포를 24-웰 조직 배양 디쉬 상에 플레이팅하였다. 플라스미드는 제조사 (Invitrogen)의 지시서에 따라서 Lipofectamine 2000을 사용해 세포를 형질감염시켰다.
EGFP 결정을 위한 총 세포 용해물은 세포를 세포 용해 완충액 (CelLytic M, Sigma, St Louis, MO, USA)에 재현탁시키고, 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시켜 세포를 용해시킨 후에, -80℃에서 냉동-해동 순환을 통해 준비하였다. 용해된 세포는 원심분리를 통해 맑게 만들었고 상청액은 FLX800 마이크로플레이트 형광 판독기 (Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 통해 EGFP에 대해 어세이하였다. 결과는 표 2-4에 요약되어 있다.
표 2: A549 및 HEK293 세포주로 형질감염 후 S/MAR 벡터의 일시적 발현
Figure pct00002
a 표시된 결과는 형질감염 후 2일의 평균 형광 유닛 ± 표준 편차이다.
표 3: A549 및 HEK293 세포주로 형질감염 후 S/MAR 벡터의 일시적 발현
Figure pct00003
a 표시된 결과는 형질감염 후 2일에 평균 형광 유닛 ± 표준 편차이다.
표 2 및 3에 표시된 결과는 UCOE-EF1 프로모터 무 인트론 coGFP 이식유전자 전사 유닛을 사용하여 SD/SA가 측접된 인간 IFNB SMAR은 SD/SA 부위가 부재하는 인간 IFNB SMAR과 비교하여 HEK293 및 A549 세포주 둘 모두에서 발현을 개선시키는 것을 입증한다. 개선된 발현은 2 SD/SA 구성 (측접 SMAR, 또는 측접 SMAR+R6K-RNA-OUT NP 박테리아 영역)에서 관찰되었다. SD/SA가 측접된 M18 SMAR (인간 IFNB SMAR에서 유래)은 SD/SA가 측접된 동등한 인간 IFNB SMAR에 비해 더 높은 발현을 갖는다.
또한, 표 3의 결과는 UCOE-CMV 프로모터 pCI 인트론 coGFP 이식유전자 전사 유닛에서 개선된 발현 (즉, 5' UTR 코딩된 인트론이 존재 또는 부재하는 2종의 상이한 프로모터에 의한 개선된 발현)을 보인다. 개선된 발현은 또한 상이한 폴리아데닐화 신호 (SV40 또는 RBG 유래)에서도 관찰된다.
표 4: A549 및 HEK293 세포주로 형질감염 후 S/MAR 벡터의 일시적 발현
Figure pct00004
a 제시된 결과는 형질감염 후 2일의 평균 형광 유닛 ± 표준 편차이다.
표 4에 제시된 결과는 SD/SA가 측접된 인간 IFNB SMA이 UCOE-EF1 프로모터 무 인트론 coGFP 이식유전자 전사 유닛 및 UCOE-CMV 프로모터 pCI 인트론 coGFP 이식유전자 전사 유닛을 갖는 SD/SA 부위 부재의 인간 IFNB SMAR과 비교하여 HEK293 및 A549 세포주 둘 모두에서 발현을 개선 (즉, 5' UTR 코팅된 인트론이 존재 또는 부재하는, 2종의 상이한 프로모토에 의한 개선된 발현)시킨다는 것을 더욱 입증한다. 추가적으로, SD/SA가 측접된 CMARter SMAR은 SD/SA가 측접된 인간 IFNB SMAR에 비해서 더 높은 발현을 갖는다. 또한, AATATT(T) MAR 모티프로 S/MAR AATAAA(N) 전사 종결 신호의 치환은 기능성 S/MAR을 생성시켜서 당분야에 기술된 S/MAR 엘리먼트로부터 전사 종결자 신호를 제거하기 위해 이러한 접근법을 사용할 수 있다는 것을 입증하였다. 대체 모티프, 예를 들어, [Liebeich et al., 상동, 2002]가 기술한 바와 같은 S/MAR에 농축된 AT 풍부 모티프가 AATATT(T)를 대신할 수 있다. 이러한 AATAAA 모티프 치환 방법은 당분야의 S/MAR의 적응을 AATAAA 모티프-매개 미성숙 전사 종결을 통한 발현의 감소없이, 본 발명의 3'UTR에서 이용할 수 있게 한다.
종합하여, 결과는 본 발명의 벡터가 당분야에 기술된 S/MAR 기반 벡터의 최적 이하의 발현 수준 한계를 해결한다는 것을 입증한다.
실시예 4: 에피솜 정착 이후 S/MAR 벡터 발현
NP-UCOE (도 6) 및 NP-UCOE-SP (도 6)로부터의 발현은 세포주 HEK293에서 에피솜 정착 이후에 결정하였다. 세포는 적어도 30일간 확장 이전 1주일 동안 푸로마이신 (0.5 ㎍/mL)의 적용을 요구하는 표준 프로토콜을 사용해 정착시켰다 (Wong and Harbottle, 2013 Mol Ther Nucleic Acids 2:e115). 정착된 개체군은 FACS를 통해 리포터 유전자 GFP의 발현에 대해 분석하였고 GFP RNA 수준은 qPCR을 통해 평가하였다. 결과 (도 10)는 SD/SA가 측접된 인간 IFNB SMA이 HEK293 세포주에서 에피솜 정착 이후에 SD/SA 부위가 없는 인간 IFNB SMAR과 비교하여 mRNA 전사 및 GFP 이식유전자 발현을 개선시킨다는 것을 입증한다. 제2 실험은 SD-S/MAR-SA 벡터 NP-UCOE-SP (도 6), NP-SMARter-SP (도 7) 및 NP-CMARter-SP (도 7)의 GFP 이식유전자 발현이 HEK293 세포주 및 초대 마우스 배아 섬유아세포에서 에피솜 정착이후에 비 SD-SA 벡터 NP-UCOE (도 6)와 비교하여 개선되었다는 것을 입증하였다.
정착된 세포주를 사용한 이들 결과는 본 발명의 벡터가 당분야에 기술된 S/MAR 기반 벡터의 유전자 침묵화 한계를 해결한다는 것을 입증한다.
실시예 5: 에피솜 정착 후 S/MAR 벡터 발현
정착된 세포에서의 효율을 또한 측접된 SD 및 SA 부위가 존재 및 부재하는 2종의 상이한 S/MAR (인터페론 베타 S/MAR; ApoB S/MAR, 805 bp)을 보유하는 벡터를 사용하여 콜로니 형성 어세이 (Wong and Harbottle, 상동, 2013)를 통해 HEK293T에서 시험하였다. 결과는 SD 및 SA 부위가 측접된 인터페론 베타 S/MAR 및 ApoB S/MAR 둘 모두는 생성된 정착된 세포에서 효율을 급격히 개선 (즉, 최고 개수의 콜로니 생산)시켰다는 것을 입증하였다 (도 12). 이들 결과는 본 발명의 벡터가 당분야에 기술된 S/MAR 기반 벡터의 낮은 정착률을 해결한다는 것을 입증한다.
실시예 6: 유전자 변형된 세포 개체군의 정착 효율 및 분석 (도 1)
안정하게 발현되는 세포 생성 효율은 pS/MARt (도 4, SEQ ID NO:41)를 사용한 콜로니 형성 어세이에서 평가하였다. DNA 전달 시, GFP 이식유전자 발현에 양성인 세포는 FACS 분류법 (FACS Aria II)을 통해 단리하였고 100개 세포를 6 cm 세포 배양 디쉬에 플레이팅하였다. 이어서, 그들을 0.5 ㎍/mL의 푸로마이신 존재 하에 4주 동안 배양하였다. 4주 후에, 세포를 PFA로 고정하였고 콜로니는 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 콜로니 개수는 벡터 정착 효율로서, 즉 플레이팅된 FACS 분류 세포 개수 당 형성된 콜로니 개수로서 간주된다. 안정한 세포주의 생성은 형질감염된 세포의 40% 이상이 정착되어서 매우 효과적이다 (도 1A)). 이식유전자 (GFP) 발현 세포의 개수는 유세포측정법으로 추산하였다. 도 1b)에 도시된 바와 같이, pS/MARt는 이식유전자의 발현이 유의한 개수의 음성 세포없이 균질한 변형된개체군을 생성시킨다.
실시예 7: 정착된 세포 개체군으로부터 pS/MARt 벡터의 플라스미드 구제 (도 2)
DNA 벡터가 변형된 세포 내에서 무결성으로 에피솜으로 유지되는가를 결정하기 위한 효과적인 방법은 그들이 미경험 박테리아로 온전하게 구제될 수 있는가를 검증하는 것이다. 그렇게 하기 위해서, 플라스미드 pS/MARt로 변형된 현재 정착된 세포주를 1주일 동안 항생제 푸로마이신 (0.5 ㎍/mL)의 존재 하에서 배양하였고 벡터 무결성을 평가하기 위해서 항생제없이 적어도 30일 동안 확장시켰다. 총 DNA는 Blood&Tissue DNAeasy 키트 (Qiagen)를 사용하여 세포로부터 준비하였고 DH10B 이. 콜라이 세포를 형질전환시켰다. 박테리아는 카나마이신 (50 ㎍/mL)이 존재하는 LB-한천 플레이트 상에서 성장시켰다. 12개 콜로니는 카나마이신 (50 ㎍/mL)이 존재하는 액체 LB 배지에서 밤새 성장시켰고 플라스미드 DNA는 MiniprepKit (Qiagen)로 추출하였다. 분석을 위해서, DNA 미니 조제물을 제한효소 BamHI (Thermo Fisher)으로 10분 동안 37℃에서 분해시켰고 제한효소 패턴을 1% 아가로스 겔 상에서 확인하였다. 대조군으로서 정착 절차의 시작 시 세포를 형질감염시키는데 사용된 DNA를 동일한 효소로 분해시켰고 기준으로서 러닝시켰다. 이들 겔은 온전한 pS/MARt DNA가 안정하게 변형된 세포주로부터 단리될 수 있고 모든 예에서 DNA가 원래의 형질감염된 벡터와 동일하였다는 것을 예시한다.
실시예 8: pS/MARt 벡터는 변형된 세포에서 에피솜으로 유지된다 (도 3)
pS/MARt 벡터가 에피솜으로서 포유동물 세포에서 변형되었다는 것을 더욱 입증하기 위해서, 서던 블롯 분석을 통해 구조를 물리적으로 결정하였다. DNA 형질감염 이후 적어도 30일 동안 배양된 Hek293T 세포 개체군을 분석하였다. 게놈 DNA는 Blood&Tissue DNAeasy 키트 (Qiagen)로 추출하였고 밤새 37℃에서 제한 효소 BamHI (NEB)으로 분해하였다. 그 다음으로 총 세포 DNA를 1% 아가로스 겔 상에서 분리시켰고 나일론 멤브레인으로 옮겼다. 벡터의 GFP 유전자에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 세포 DNA 내에서 pS/MARt DNA를 검출하기 위해 사용되는 방사성 프로브를 생성시켰다. 대조군 벡터와 동일한 크기를 갖는 단일 밴드의 샘플의 존재는 정착된 포유동물 세포 개체군에서 pS/MARt의 에피솜 상태를 입증한다. 번짐 및/또는 대체 밴드의 부재는 벡터가 세포 게놈으로 통합되거나 또는 재배열되지 않았다는 것을 입증한다.
본 명세서에 개시된 벡터 방법 및 조성물 및 상기 제시된 평가는 3' UTR SD-SMAR-SA 조성물이 비 SD-SA 버전과 비교해 발현 및 또는 에피솜 정착을 개선시켰다는 것을 입증한다. 개선된 성능은 성능 개선이 다양한 S/MAR에서 관찰되므로 S/MAR 특이적이 아니다. 개선된 성능은 또한 성능 개선이 다양한 프로모터, 5' UTR, 이식유전자, 및 폴리A 신호와 연결된 SD-SMAR-SA에서 관찰되므로, 벡터 전사 유닛 특이적이 아니다. 개선된 성능은 상류 인트론 존재 또는 부재에서 관찰된다. 따라서, 본 개시의 3' UTR SD-SMAR-SA 벡터는 자기-복제성 비통합형 에피솜 척추동물 발현 벡터 성능을 개선시키는데 광범위하게 적용가능하다.
본 기술의 벡터에서 당분야에 기술된 임의의 인트론 스플라이스 도너 부위는 pCI 인트론 유래된 스플라이스 도너를 대체할 수 있다. 유사하게, 당분야에 기술된 임의의 인트론 스플라이스 억셉터 부위는 pCI 인트론 유래 스플라이스 억셉터를 대체할 수 있다. 예를 들어, 스플라이스 도너 및 억셉터는 HTLV-IR-토끼 β 글로빈 하이브리드 인트론, HTLV-IR CMV 하이브리드 인트론, CMV 인트론, CpG 무함유 인트론 I 140, 인간 β 글로빈 쥐과 IgG 키메라 인트론, 아데노바이러스 리더-쥐과 IgG 키메라 인트론, 토끼 β 글로빈 인트론, 절두형 CMV 인트론, CAG (닭 β 액틴-토끼 β 글로빈) 인트론, [Williams, 상동, 2014]에 개시된 CMV-토끼 β 글로빈 하이브리드 인트론 또는 당분야에 기술된 다른 인트론으로부터 유래될 수 있다.
당분야에 기술된 다양한 대체 S/MAR가 또한 본 기술의 벡터에서 사용될 수 있다. 필요하다면, 내부 폴리A 부위는 본 명세서에 기술된 바와 같이 모티프 치환으로 제거될 수 있다.
벡터는 본 명세서에 제공되는 실시예와 상이한 다양한 이식유전자, 예를 들어 다양한 병원체에 대한 항원 유전자, 또는 치료 유전자, 예컨대 저산소증 유도 인자, 케라티노사이트 성장 인자, 인자 IX, 인자 VIII, 판코니 빈혈 상보군 A 단백질, 호모젠티세이트 디옥시게나제 등 또는 폴리단백질 예컨대 리프로그래밍 인자 폴리단백질을 코딩할 수 있다.
유사하게, 벡터는 본 명세서에 제공되는 CMV 및 연장 인자 1 (EF1) 프로모터 예와 상이한 다양한 RNA Pol II 프로모터, 예를 들어, 항상성 프로모터 예컨대 닭 β-액틴 프로모터, 다른 종 유래 β-액틴 프로모터, 포스포글리세로키나제 (PGK) 프로모터, 비장 병소-형성 바이러스 (SFFV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 인간 혈청 알부민 (SA) 프로모터, 티록신 결합 글로빈 (TBG) 프로모터, 사이토크롬 P450 2E1 (CYP2E1) 프로모터 등을 이용할 수 있다. 벡터는 또한 조합 프로모터 예컨대 닭 β-액틴/CMV 인핸서 (CAG) 프로모터, 연장 인자 1α (EF1α) 프로모터와 조합된 인간 또는 쥐과 CMV-유래 인핸서 엘리먼트, 연장 인자 1α (EF1α) 프로모터와 조합된 인간 또는 쥐과 CMV-유래 인핸서 엘리먼트의 CpG 무함유 버전, α-페토단백질 MERII 인핸서와 조합된 알부민 프로모터 등, 또는 당분야에 공지된 다양한 조직 특이적 또는 유도성 프로모터 예컨대 근육 특이적 프로모터 근육 크레아틴 키나제 (MCK), 및 C5-12 또는 간-특이적 프로모터 아포리포단백질 A-I (ApoAI), α-1 안티트립신 (AAT) 프로모터, AAT-TTR 프로모터, SERP-TTR 프로모터, 및 ApoE-hAAT, 또는 T-세포 프로모터 예컨대 hTCR8.1, CD4 및 WASp를 이용할 수 있다.
추가적으로, 나노플라스미드 골격에서, R6K 복제 기원, 및 RNA 선별 마커의 다양한 배향이 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 기술의 벡터에서 R6K 복제 기원, 및 RNA 선별 마커의 8개 배향 중 어느 하나를 사용할 수 있다 (즉, ← Pol III 복제 기원 RSM→; ← Pol III 복제 기원 ← RSM; Pol III 복제 기원 → RSM →; Pol III 복제 기원 → ← RSM; ← RSM Pol III 복제 기원 →; ← RSM ← Pol III 복제 기원; RSM → Pol III 복제 기원 →; RSM → ← Pol III 복제 기원). 또한, 당분야에 공지된 다양한 RNA 선별 마커가 RNA-OUT를 대체할 수 있다. 따라서, 독자는 본 발명의 개선된 자기-복제성 비통합형 척추동물 벡터가 비통합형 복제 플라스미드 코딩되는 이식유전자 발현을 개선시키는 접근법을 제공한다는 것을 이해하게 될 것이다.
따라서, 본 개시의 범주는 예시된 실시형태가 아니라, 첨부된 청구항에 의해 결정되어야 한다.
<110> Deutsches Krebsforschungszentrum Nature Technology Coropration Bozza, Matthias Harbottle, Richard Williams, James <120> NON-INTEGRATING DNA VECTORS FOR THE GENETIC MODIFICATION OF CELLS <130> DK14791PC1 <160> 41 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R6K gamma origin <400> 1 ggcttgttgt ccacaaccgt taaaccttaa aagctttaaa agccttatat attctttttt 60 ttcttataaa acttaaaacc ttagaggcta tttaagttgc tgatttatat taattttatt 120 gttcaaacat gagagcttag tacgtgaaac atgagagctt agtacgttag ccatgagagc 180 ttagtacgtt agccatgagg gtttagttcg ttaaacatga gagcttagta cgttaaacat 240 gagagcttag tacgtactat caacaggttg aactgctgat c 281 <210> 2 <211> 281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 CpG R6K gamma origin <400> 2 ggcttgttgt ccacaaccat taaaccttaa aagctttaaa agccttatat attctttttt 60 ttcttataaa acttaaaacc ttagaggcta tttaagttgc tgatttatat taattttatt 120 gttcaaacat gagagcttag tacgtgaaac atgagagctt agtacattag ccatgagagc 180 ttagtacatt agccatgagg gtttagttca 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tacgtactat 360 caacaggttg aactgctgat cttcagatc 389 <210> 5 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-OUT selectable marker <400> 5 gtagaattgg taaagagagt cgtgtaaaat atcgagttcg cacatcttgt tgtctgatta 60 ttgatttttg gcgaaaccat ttgatcatat gacaagatgt gtatctacct taacttaatg 120 attttgataa aaatcatta 139 <210> 6 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA-OUT antisense repressor RNA <400> 6 tcgcacatct tgttgtctga ttattgattt ttggcgaaac catttgatca tatgacaaga 60 tgtgtatct 69 <210> 7 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 CpG RNA-OUT selectable marker <400> 7 gtagaattgg taaagagagt tgtgtaaaat attgagttcg cacatcttgt tgtctgatta 60 ttgatttttg gcgaaaccat ttgatcatat gacaagatgt gtatctacct taacttaatg 120 attttgataa aaatcatta 139 <210> 8 <211> 466 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R6K gamma origin -RNA-OUT bacterial replication-selection region flanked by NheI and KpnI restriction sites <400> 8 gctagcccgc ctaatgagcg ggcttttttt tggcttgttg tccacaaccg ttaaacctta 60 aaagctttaa aagccttata tattcttttt tttcttataa aacttaaaac cttagaggct 120 atttaagttg ctgatttata ttaattttat tgttcaaaca tgagagctta gtacgtgaaa 180 catgagagct tagtacgtta gccatgagag cttagtacgt tagccatgag ggtttagttc 240 gttaaacatg agagcttagt acgttaaaca tgagagctta gtacgtacta tcaacaggtt 300 gaactgctga tccacgttgt ggtagaattg gtaaagagag tcgtgtaaaa tatcgagttc 360 gcacatcttg ttgtctgatt attgattttt ggcgaaacca tttgatcata tgacaagatg 420 tgtatctacc ttaacttaat gattttgata aaaatcatta ggtacc 466 <210> 9 <211> 439 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 CpG R6K gamma origin - 2 CpG RNA-OUT bacterial replication-selection region flanked by NheI and KpnI restriction sites <400> 9 gctagctggc ttgttgtcca caaccattaa accttaaaag ctttaaaagc cttatatatt 60 cttttttttc ttataaaact taaaacctta gaggctattt aagttgctga tttatattaa 120 ttttattgtt caaacatgag agcttagtac gtgaaacatg agagcttagt acattagcca 180 tgagagctta gtacattagc catgagggtt tagttcatta aacatgagag cttagtacat 240 taaacatgag agcttagtac atactatcaa caggttgaac tgctgatctg tacagtagaa 300 ttggtaaaga gagttgtgta aaatattgag ttcgcacatc ttgttgtctg attattgatt 360 tttggcgaaa ccatttgatc atatgacaag atgtgtatct accttaactt aatgattttg 420 ataaaaatca ttaggtacc 439 <210> 10 <211> 565 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pNTC-NP1 polylinker trpA R6K-RNA-OUT polylinker cloning cassette: EcoRI-HindIII <400> 10 gaattcgagc tcggtacctc gcgaatgcat ctaggggacg gccgctagcc cgcctaatga 60 gcgggctttt ttttggcttg ttgtccacaa ccgttaaacc ttaaaagctt taaaagcctt 120 atatattctt ttttttctta taaaacttaa aaccttagag gctatttaag ttgctgattt 180 atattaattt tattgttcaa acatgagagc ttagtacgtg aaacatgaga gcttagtacg 240 ttagccatga gagcttagta cgttagccat gagggtttag ttcgttaaac atgagagctt 300 agtacgttaa acatgagagc ttagtacgta ctatcaacag gttgaactgc tgatccacgt 360 tgtggtagaa ttggtaaaga gagtcgtgta aaatatcgag ttcgcacatc ttgttgtctg 420 attattgatt tttggcgaaa ccatttgatc atatgacaag atgtgtatct accttaactt 480 aatgattttg ataaaaatca ttaggagcta gcattgggtc atcggatccc gggcccgtcg 540 actgcagagg cctgcatgca agctt 565 <210> 11 <211> 584 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pNTC-NP2 polylinker trpA R6K-RNA-OUT polylinker cloning cassette: EcoRI-HindIII <400> 11 gaattcgagc tcggtacctc gcgaatgcat ctaggggacg gccgctagcc cgcctaatga 60 gcgggctttt ttttggcttg ttgtccacaa ccgttaaacc ttaaaagctt taaaagcctt 120 atatattctt ttttttctta taaaacttaa aaccttagag gctatttaag ttgctgattt 180 atattaattt tattgttcaa acatgagagc ttagtacgtg aaacatgaga gcttagtacg 240 ttagccatga gagcttagta cgttagccat gagggtttag ttcgttaaac atgagagctt 300 agtacgttaa acatgagagc ttagtacgta ctatcaacag gttgaactgc tgatccacgt 360 tgtggtagaa ttggtaaaga gagtcgtgta aaatatcgag ttcgcacatc ttgttgtctg 420 attattgatt tttggcgaaa ccatttgatc atatgacaag atgtgtatct accttaactt 480 aatgattttg ataaaaatca ttaggactag tcccgggcgc tagttattaa tattgggtca 540 tcggatcccg ggcccgtcga ctgcagaggc ctgcatgcaa gctt 584 <210> 12 <211> 557 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pNTC-NP3 polylinker trpA R6K-RNA-OUT polylinker cloning 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taaaccttaa aagctttaaa agccttatat attctttttt ttcttataaa 180 acttaaaacc ttagaggcta tttaagttgc tgatttatat taattttatt gttcaaacat 240 gagagcttag tacgtgaaac atgagagctt agtacgttag ccatgagagc ttagtacgtt 300 agccatgagg gtttagttcg ttaaacatga gagcttagta cgttaaacat gagagcttag 360 tacgtactat caacaggttg aactgctgat ccacgttgtg gtagaattgg taaagagagt 420 cgtgtaaaat atcgagttcg cacatcttgt tgtctgatta ttgatttttg gcgaaaccat 480 ttgatcatat gacaagatgt gtatctacct taacttaatg attttgataa aaatcattag 540 gtaccgagct cgaattc 557 <210> 14 <211> 503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pNTC-NP5 polylinker trpA R6K-RNA-OUT polylinker cloning cassette: KasI-HindIII <400> 14 ggcgccgcta gcccgcctaa tgagcgggct tttttttggc ttgttgtcca caaccgttaa 60 accttaaaag ctttaaaagc cttatatatt cttttttttc ttataaaact taaaacctta 120 gaggctattt aagttgctga tttatattaa ttttattgtt caaacatgag agcttagtac 180 gtgaaacatg agagcttagt acgttagcca tgagagctta gtacgttagc catgagggtt 240 tagttcgtta aacatgagag cttagtacgt taaacatgag agcttagtac gtactatcaa 300 caggttgaac tgctgatcca cgttgtggta gaattggtaa agagagtcgt gtaaaatatc 360 gagttcgcac atcttgttgt ctgattattg atttttggcg aaaccatttg atcatatgac 420 aagatgtgta tctaccttaa cttaatgatt ttgataaaaa tcattaggta ccacatgtcc 480 tgcagaggcc tgcatgcaag ctt 503 <210> 15 <211> 539 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pNTC-NP6 polylinker trpA R6K-RNA-OUT polylinker cloning cassette: EcoRI-SacI <400> 15 gaattctgca gatatccatc acactggcgg ccgctagccc gcctaatgag cgggcttttt 60 tttggcttgt tgtccacaac cgttaaacct taaaagcttt aaaagcctta tatattcttt 120 tttttcttat aaaacttaaa accttagagg ctatttaagt tgctgattta tattaatttt 180 attgttcaaa catgagagct tagtacgtga aacatgagag cttagtacgt tagccatgag 240 agcttagtac gttagccatg agggtttagt tcgttaaaca tgagagctta gtacgttaaa 300 catgagagct tagtacgtac tatcaacagg ttgaactgct gatccacgtt gtggtagaat 360 tggtaaagag agtcgtgtaa aatatcgagt tcgcacatct tgttgtctga ttattgattt 420 ttggcgaaac catttgatca tatgacaaga tgtgtatcta ccttaactta atgattttga 480 taaaaatcat taggtaccgg gccccccctc 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aatttcttat gactcaaagt 660 cctaaccaca aagaaaagat tgttaattag attgcatgaa tattaagact tatttttaaa 720 attaaaaaac cattaagaaa agtcaggcca tagaatgaca gaaaatattt gcaacacccc 780 agtaaagaga attgtaatat gcagattata aaaagaagtc ttacaaatca gtaaaaaata 840 aaactagaca aaaatttgaa cagatgaaag agaaactcta aataatcatt acacatgaga 900 aactcaatct cagaaatcag agaactatca ttgcatatac actaaattag agaaatatta 960 aaaggctaag taacatctgt ggcaatattg atggtatata accttgatat gatgtgatga 1020 gaacagtact ttaccccatg ggcttcctcc ccaaaccctt accccagtat aaatcatgac 1080 aaatatactt taaaaaccat taccctatat ctaaccagta ctcctcaaaa ctgtcaaggt 1140 catcaaaaat aagaaaagtc tgaggaactg tcaaaactaa gaggaaccca aggagacatg 1200 agaattatat gtaatgtggc attctgaatg agatcccaga acagaaaaag aacagtagct 1260 aaaaaactaa tgaaatataa ataaagtttg aactttagtt ttttttaaaa aagagtagca 1320 ttaacacggc aaagccattt tcatattttt cttgaacatt aagtacaagt ctataattaa 1380 aaatttttta aatgtagtct ggaacattgc cagaaacaga agtacagcag ctatctgtgc 1440 tgtcgcctaa ctatccatag ctgattggtc taaaatgaga tacatcaacg ctcctccatg 1500 ttttttgttt tctttttaaa tgaaaaactt tattttttaa gaggagtttc aggttcatag 1560 caaaattgag aggaaggtac attcaagctg aggaagtttt cctctattcc tagtttactg 1620 agagattgca tcatgaatgg gtgttaaatt ttgtcaaatg ctttttctgt gtctatcaat 1680 atgaccatgt gattttcttc tttaacctgt tgatgggaca aattacgtta attgattttc 1740 aaacgttgaa ccacccttac atatctggaa taaattctac ttggttgtgg tgtatatttt 1800 ttgatacatt cttggattct ttttgctaat attttgttga aaatgtttgt atctttgttc 1860 atgagagata ttggtctgtt gttttctttt cttgtaatgt cattttctag ttccggtatt 1920 aaggtaatgc tggcctagtt gaatgattta ggaagtattc cctctgcttc tgtcttctga 1980 aagagattgt agaaagttga tacaattttt ttttctttaa atatttgata gaattcttac 2040 tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcg gatcc 2085 <210> 20 <211> 2085 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Splice donor-human Interferon beta S/MAR (-AATAAA)-splice acceptor flanked by 5' BglII site and 3' BamHI restriction enzyme sites <400> 20 agatctatgc atgcagaagt tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa 60 gacaggtctc gagctcgatg ataatgaatg tctaagttaa tgcagaaacg gagagacata 120 ctatattcat gaactaaaag acttaatatt gtgaaggtat actttctttc cacataaatt 180 tgtagtcaat atgttcaccc caaaaaagct gtttgttaac ttgccaacct cattctaaaa 240 tgtatataga agcccaaaag acaataacaa aaatattctt gtagaacaaa atgggaaaga 300 atgttccact aaatatcaag atttagagca aagcatgaga tgtgtgggga tagacagtga 360 ggctgataaa atagagtaga gctcagaaac agacccattg atatatgtaa gtgacctatg 420 aaaaaaatat ggcattttac aatgggaaaa tgatgatctt tttctttttt agaaaaacag 480 ggaaatatat ttatatgtaa aaaatatttg ggaacccata tgtcatacca tacacacaaa 540 aaaattccag tgaattataa gtctaaatgg agaaggcaaa actttaaatc ttttagaaaa 600 taatatagaa gcatgccatc atgacttcag tgtagagaaa aatttcttat gactcaaagt 660 cctaaccaca aagaaaagat tgttaattag attgcatgaa tattaagact tatttttaaa 720 attaaaaaac cattaagaaa agtcaggcca tagaatgaca gaaaatattt gcaacacccc 780 agtaaagaga attgtaatat gcagattata aaaagaagtc ttacaaatca gtaaaaaata 840 tttctagaca aaaatttgaa cagatgaaag agaaactcta aataatcatt acacatgaga 900 aactcaatct cagaaatcag agaactatca ttgcatatac actaaattag agaaatatta 960 aaaggctaag taacatctgt ggcaatattg atggtatata accttgatat gatgtgatga 1020 gaacagtact ttaccccatg ggcttcctcc ccaaaccctt accccagtat aaatcatgac 1080 aaatatactt taaaaaccat taccctatat ctaaccagta ctcctcaaaa ctgtcaaggt 1140 catcaaaaat aagaaaagtc tgaggaactg tcaaaactaa gaggaaccca aggagacatg 1200 agaattatat gtaatgtggc attctgaatg agatcccaga acagaaaaag aacagtagct 1260 aaaaaactaa tgaaatataa atattttttg aactttagtt ttttttaaaa aagagtagca 1320 ttaacacggc aaagccattt tcatattttt cttgaacatt aagtacaagt ctataattaa 1380 aaatttttta aatgtagtct ggaacattgc cagaaacaga agtacagcag ctatctgtgc 1440 tgtcgcctaa ctatccatag ctgattggtc taaaatgaga tacatcaacg ctcctccatg 1500 ttttttgttt tctttttaaa tgaaaaactt tattttttaa gaggagtttc aggttcatag 1560 caaaattgag aggaaggtac attcaagctg aggaagtttt cctctattcc tagtttactg 1620 agagattgca tcatgaatgg gtgttaaatt ttgtcaaatg ctttttctgt gtctatcaat 1680 atgaccatgt gattttcttc tttaacctgt tgatgggaca aattacgtta attgattttc 1740 aaacgttgaa ccacccttac atatctggaa tattttctac ttggttgtgg tgtatatttt 1800 ttgatacatt cttggattct ttttgctaat attttgttga aaatgtttgt atctttgttc 1860 atgagagata ttggtctgtt gttttctttt cttgtaatgt cattttctag ttccggtatt 1920 aaggtaatgc tggcctagtt gaatgattta ggaagtattc cctctgcttc tgtcttctga 1980 aagagattgt agaaagttga tacaattttt ttttctttaa atatttgata gaattcttac 2040 tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcg gatcc 2085 <210> 21 <211> 868 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Splice donor-human Interferon beta M18 S/MAR-splice acceptor flanked by 5' BglII site and 3' BamHI restriction enzyme sites <400> 21 agatctatgc atgcagaagt tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa 60 gacaggtctc gagaagcttg atctaaataa acttataaat tgtgagagaa attaatgaat 120 gtctaagtta atgcagaaac ggagagacat actatattca tgaactaaaa gacttaatat 180 tgtgaaggta tactttcttt ccacataaat ttgtagtcaa tatgttcacc ccaaaaaagc 240 tgtttgttaa cttgccaacc tcattctaaa atgtatatag aagcccaaaa gacaataaca 300 aaaatattct tgtagaacaa aatgggaaag aatgttccac taaatatcaa gatttagagc 360 aaagcatgag atgtgtgggg atagacagtg aggctgataa aatagagtag agctcagaaa 420 cagacccatt gatatatgta agtgacctat gaaaaaaata tggcatttta caatgggaaa 480 atgatgatct ttttcttttt tagaaaaaca gggaaatata tttatatgta aaaaataaaa 540 gggaacccat atgtcatacc atacacacaa aaaaattcca gtgaattata agtctaaatg 600 gagaaggcaa aactttaaat cttttagaaa ataatataga agcatgccat catgacttca 660 gtgtagagaa aaatttctta tgactcaaag tcctaaccac aaagaaaaga ttgttaatta 720 tgaatgattt aggaagtatt ccctctgctt ctgtcttctg aaagagattg tagaaagttg 780 atacaatttt tttttcttta aatatttgat agagaattct tactgacatc cactttgcct 840 ttctctccac aggtgtccac tcggatcc 868 <210> 22 <211> 927 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Splice donor-805 bp human Apolipoprotein B S/MAR-splice acceptor flanked by 5' BglII site and 3' BamHI restriction enzyme sites <400> 22 agatctatgc atgcagaagt tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa 60 gacaggtctc gaggcctacc ggagagcctt gccttgcaaa ggcagacagt cagtgaggaa 120 gactatgtgg cacatgaaga caccagaggt gttcctcagg atcaaagtat gtacaagcct 180 ttgtgaatat tttttccttc tcacttggca aatacaattc ctgagatcaa taacctcgtc 240 tttttaattt tttcctcgtc tttttaacta tttataaaat attgaattat aaaatatgta 300 attataaata ctttaattat aaaatatgta attataaata ctttaattat aaaatatgta 360 attataaata ctttataaaa tatgtaatta taaaatatgt aattataaac attttaatta 420 taaaatatgt aattataaac attttaatta taaaatatgt aattataaac attttaatta 480 taaaatatgt aattataaac attttaatta taaaatatgt aattataaac attttaatta 540 taaaatattt aattataaac attttaatta taaaatattt aattataaat attttaatta 600 taaaatattt aattataaat attttaatta taaaatattt aattataaat attttaatta 660 taaaatattt aattataaat actttaatta taaaatattt aattataaat attttaatta 720 taaaatattt aattataaat attttaatta taaatatttt aattataaaa tatttaatta 780 taaaaacaca attacctcat ctttttaaat atttttgcaa aatatttccc tccataattt 840 ctccgtttcc atttttattc tgttacttaa atgaattctt actgacatcc actttgcctt 900 tctctccaca ggtgtccact cggatcc 927 <210> 23 <211> 647 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Splice donor-525 bp human Apolipoprotein B S/MAR-splice acceptor flanked by 5' NsiI site and 3' BamHI restriction enzyme sites <400> 23 atgcatgcag aagttggtcg tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg 60 tctcgagatt tataaaatat tgaattataa aatatgtaat tataaatact ttaattataa 120 aatatgtaat tataaatact ttaattataa aatatgtaat tataaatact ttataaaata 180 tgtaattata aaatatgtaa ttataaacat tttaattata aaatatgtaa ttataaacat 240 tttaattata aaatatgtaa ttataaacat tttaattata aaatatgtaa ttataaacat 300 tttaattata aaatatgtaa ttataaacat tttaattata aaatatttaa ttataaacat 360 tttaattata aaatatttaa ttataaatat tttaattata aaatatttaa ttataaatat 420 tttaattata aaatatttaa ttataaatat tttaattata aaatatttaa ttataaatac 480 tttaattata aaatatttaa ttataaatat tttaattata aaatatttaa ttataaatat 540 tttaattata aatattttaa ttataaaata tttaattata aaaacacaat tagaattctt 600 actgacatcc actttgcctt tctctccaca ggtgtccact cggatcc 647 <210> 24 <211> 197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCI intron <400> 24 gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa 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tttcttcaca 360 atatggatat gcatcttctt ttgaaaatgt taaagtaaat tacctctctt ttcagatact 420 gtcttcatgc gaacttggta tcctgtttcc atcccagcct tctataaccc agtaacatct 480 tttttgaaac cagtgggtga gaaagacacc tggtcaggaa cgcggaccac aggacaactc 540 aggctcaccc acggcatcag actaaaggca aacaaggact ctgtataaag taccggtggc 600 atgtgtatta gtggagatgc agcctgtgct ctgcagacag ggagtcacac agacactttt 660 ctataatttc ttaagtgctt tgaatgttca agtagaaagt ctaacattaa atttgattga 720 acaattgtat attcatggaa tattttggaa cggaatacca aaaaatggca atagtggttc 780 tttctggatg gaagacaaac ttttcttttt aaattttatc ttatatattt gaggttgacc 840 acatgacctt aaggatacat atagacagta aactggttac tacagtgaag caaattaaca 900 tatctaccat cttacatagt tacatttttt tgtgtgacag gaacagctaa aatctacgta 960 tttaacaaaa atcctaaaga caatacattt ttattaacta tagccctcat gatgtacatt 1020 agatc 1025 <210> 28 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A2UCOE expression enhancer <400> 28 gcctacagct caagccacat ccgaaggggg agggagccgg gagctgcgcg cggggccgcc 60 ggggggaggg gtggcaccgc 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gaatattttt tccttctcac ttggcaaata 780 caattcctga gatcaataac ctcgtctttt taattttttc ctcgtctttt taactattta 840 taaaatattg aattataaaa tatgtaatta taaatacttt aattataaaa tatgtaatta 900 taaatacttt aattataaaa tatgtaatta taaatacttt ataaaatatg taattataaa 960 atatgtaatt ataaacattt taattataaa atatgtaatt ataaacattt taattataaa 1020 atatgtaatt ataaacattt taattataaa atatgtaatt ataaacattt taattataaa 1080 atatgtaatt ataaacattt taattataaa atatttaatt ataaacattt taattataaa 1140 atatttaatt ataaatattt taattataaa atatttaatt ataaatattt taattataaa 1200 atatttaatt ataaatattt taattataaa atatttaatt ataaatactt taattataaa 1260 atatttaatt ataaatattt taattataaa atatttaatt ataaatattt taattataaa 1320 tattttaatt ataaaatatt taattataaa aacacaatta cctcatcttt ttaaatattt 1380 ttgcaaaata tttccctcca taatttctcc gtttccattt ttattctgtt acttaaat 1438 <210> 40 <211> 2038 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV Promoter - Puromycin - S/MAR sequence <400> 40 ggcattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60 catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240 aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300 ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360 tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc 420 ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480 ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa 540 tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag aggtatgacc gagtacaagc 600 ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg tcccccgggc cgtacgcacc ctcgccgccg 660 cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgaccc ggaccgccac atcgagcggg 720 tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg 780 tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg 840 cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc 900 agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg 960 ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc 1020 ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc 1080 gcaacctccc cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg 1140 aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc ctgacttctc cactcctggc 1200 aggctgagtg aaataaagga cttgttattt catctcgagg cctaccggag agccttgcct 1260 tgcaaaggca gacagtcagt gaggaagact atgtggcaca tgaagacacc agaggtgttc 1320 ctcaggatca aagtatgtac aagcctttgt gaatattttt tccttctcac ttggcaaata 1380 caattcctga gatcaataac ctcgtctttt taattttttc ctcgtctttt taactattta 1440 taaaatattg aattataaaa tatgtaatta taaatacttt aattataaaa tatgtaatta 1500 taaatacttt aattataaaa tatgtaatta taaatacttt ataaaatatg taattataaa 1560 atatgtaatt ataaacattt taattataaa atatgtaatt ataaacattt taattataaa 1620 atatgtaatt ataaacattt taattataaa atatgtaatt ataaacattt taattataaa 1680 atatgtaatt ataaacattt taattataaa atatttaatt ataaacattt taattataaa 1740 atatttaatt ataaatattt taattataaa atatttaatt ataaatattt taattataaa 1800 atatttaatt ataaatattt taattataaa atatttaatt ataaatactt taattataaa 1860 atatttaatt ataaatattt taattataaa atatttaatt ataaatattt taattataaa 1920 tattttaatt ataaaatatt taattataaa aacacaatta cctcatcttt ttaaatattt 1980 ttgcaaaata tttccctcca taatttctcc gtttccattt ttattctgtt acttaaat 2038 <210> 41 <211> 6189 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Element40-GPF-P2A-Puromycin-S/MAR <400> 41 ggcattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60 catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240 aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300 ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360 tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc 420 ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480 ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa 540 tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag aggtcgttta gtgaaccgtc 600 agatcactag tagctttatt gcggtagttt atcacagtta aattgctaac gcagtcagtg 660 ctcgactgat cacaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggagg ccaatagaaa 720 ctgggcttgt cgagacagag aagattcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 780 gacatccact ttgcctttct ctccacaggg gtaccgaagc cgctagcgct accggtcgcc 840 accatgcccg ccatgaagat cgagtgccgc atcaccggca ccctgaacgg cgtggagttc 900 gagctggtgg gcggcggaga gggcaccccc gagcagggcc gcatgaccaa caagatgaag 960 agcaccaaag gcgccctgac cttcagcccc tacctgctga gccacgtgat gggctacggc 1020 ttctaccact tcggcaccta ccccagcggc tacgagaacc ccttcctgca cgccatcaac 1080 aacggcggct acaccaacac ccgcatcgag aagtacgagg acggcggcgt gctgcacgtg 1140 agcttcagct accgctacga ggccggccgc gtgatcggcg acttcaaggt ggtgggcacc 1200 ggcttccccg aggacagcgt gatcttcacc gacaagatca tccgcagcaa cgccaccgtg 1260 gagcacctgc accccatggg cgataacgtg ctggtgggca gcttcgcccg caccttcagc 1320 ctgcgcgacg gcggctacta cagcttcgtg gtggacagcc acatgcactt caagagcgcc 1380 atccacccca gcatcctgca gaacgggggc cccatgttcg ccttccgccg cgtggaggag 1440 ctgcacagca acaccgagct gggcatcgtg gagtaccagc acgccttcaa gacccccatc 1500 gccttcgcca gatctggcag cggcgccacc aacttcagcc tgctgaagca ggccggcgac 1560 gtggaggaaa accctgggcc catgaccgag tacaagccca cggtgcgcct cgccacccgc 1620 gacgacgtcc cccgggccgt acgcaccctc gccgccgcgt tcgccgacta ccccgccacg 1680 cgccacaccg tcgacccgga ccgccacatc gagcgggtca ccgagctgca agaactcttc 1740 ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag gtgtgggtcg cggacgacgg cgccgcggtg 1800 gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg 1860 cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc aacagatgga aggcctcctg 1920 gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca ccgtcggcgt ctcgcccgac 1980 caccagggca agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc 2040 gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg 2100 ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg 2160 acccgcaagc ccggtgcctg aagatctatg catgcagaag ttggtcgtga ggcactgggc 2220 aggtaagtat caaggttaca agacaggtcg acttctccac tcctggcagg ctgagtgaaa 2280 taaaggactt gttatttcat ctcgaggcct accggagagc cttgccttgc aaaggcagac 2340 agtcagtgag gaagactatg tggcacatga agacaccaga ggtgttcctc aggatcaaag 2400 tatgtacaag cctttgtgaa tattttttcc ttctcacttg gcaaatacaa ttcctgagat 2460 caataacctc gtctttttaa ttttttcctc gtctttttaa ctatttataa aatattgaat 2520 tataaaatat gtaattataa atactttaat tataaaatat gtaattataa atactttaat 2580 tataaaatat gtaattataa atactttata aaatatgtaa ttataaaata tgtaattata 2640 aacattttaa ttataaaata tgtaattata aacattttaa ttataaaata tgtaattata 2700 aacattttaa ttataaaata tgtaattata aacattttaa ttataaaata tgtaattata 2760 aacattttaa ttataaaata tttaattata aacattttaa ttataaaata tttaattata 2820 aatattttaa ttataaaata tttaattata aatattttaa ttataaaata tttaattata 2880 aatattttaa ttataaaata tttaattata aatactttaa ttataaaata tttaattata 2940 aatattttaa ttataaaata tttaattata aatattttaa ttataaatat tttaattata 3000 aaatatttaa ttataaaaac acaattacct catcttttta aatatttttg caaaatattt 3060 ccctccataa tttctccgtt tccattttta ttctgttact taaataattc tgcagtcgac 3120 ggttactgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactctaccg cgggcccggg 3180 atccaccgga tctagataac tgatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact 3240 tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 3300 tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 3360 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 3420 tgtatcttac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 3480 gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 3540 tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 3600 cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttacggga tacctgtccg cctttctccc 3660 ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 3720 cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 3780 atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 3840 agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 3900 gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 3960 gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 4020 tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 4080 agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 4140 gattttggtc atgccgtctc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg 4200 cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag 4260 ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag 4320 ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca 4380 ggcatcgcca tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgctcgcct tgagcctggc 4440 gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag 4500 accggcttcc atccgagtac gtgctctctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg 4560 gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt 4620 ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag 4680 ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc gagtacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt 4740 ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc ttgcagttca ttcagggcac cggacaggtc 4800 ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga 4860 gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg 4920 agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat cataatatta ttgaagcatt tatcagggtt 4980 cgtctcgtcc cggtctcctc ccatgcatgt caatattggc cattagccat attattcatt 5040 ggttatatag cataaatcaa tattggctat tggccattgc atacgttgta tctatatcat 5100 aatatgtaca aagcttgatc aagaaagcac tccgggctcc agaaggagcc ttccaggcca 5160 gctttgagca taagctgctg atgagcagtg agtgtcttga gtagtgttca gggcagcatg 5220 ttaccattca tgcttgactt ctagccagtg tgacgagagg ctggagtcag gtctctagag 5280 agttgagcag ctccagcctt agatctccca gtcttatgcg gtgtgcccat tcgctttgtg 5340 tctgcagtcc cctggccaca cccagtaaca gttctgggat ctatgggagt agcttcctta 5400 gtgagctttc ccttcaaata ctttgcaacc aggtagagaa gtttggagtg aaggttttgt 5460 tcttcgtttc ttcacaatat ggatatgcat cttcttttga aaatgttaaa gtaaattacc 5520 tctcttttca gatactgtct tcatgcgaac ttggtatcct gtttccatcc cagccttcta 5580 taacccagta acatcttttt tgaaaccagt gggtgagaaa gacacctggt caggaacgcg 5640 gaccacagga caactcaggc tcacccacgg catcagacta aaggcaaaca aggactctgt 5700 ataaagtacc ggtggcatgt gtattagtgg agatgcagcc tgtgctctgc agacagggag 5760 tcacacagac acttttctat aatttcttaa gtgctttgaa tgttcaagta gaaagtctaa 5820 cattaaattt gattgaacaa ttgtatattc atggaatatt ttggaacgga ataccaaaaa 5880 atggcaatag tggttctttc tggatggaag acaaactttt cttctttaaa ataaatttta 5940 ttttatatat ttgaggttga ccacatgacc ttaaggatac atatagacag taaactggtt 6000 actacagtga agcaaattaa catatctacc atcgtacata gttacatttt tttgtgtgac 6060 aggaacagct aaaatctacg tatttaacaa aactcctaaa gacaatacat ttttattaac 6120 tatagccctc atgatgtaca ttagatctgt acatttatat tggctcatgt ccaatatgac 6180 cgccatgtt 6189

Claims (33)

  1. 하기 단계를 포함하는, 표적 척추동물 세포에서 자기-복제성 비통합형 에피솜 S/MAR 발현 벡터의 발현 및 정착 효율을 개선시키기 위한 방법:
    a. i. 박테리아 복제 기원 및 선별 마커를 포함하는 박테리아 복제-선별 영역;
    ii. 프로모터, 5' UTR, 이식유전자, 및 3' UTR을 포함하는, 척추동물 세포에서 이식유전자의 발현을 위한 전사 유닛;
    iii. 상기 3' UTR 내에 위치되는 S/MAR 삽입부
    를 포함하는 에피솜 S/MAR 발현 벡터를 제공하는 단계; 및
    b. 상기 3' UTR 내에서 S/MAR에 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접되도록 에피솜 S/MAR 발현 벡터를 변형시켜서, 최종 자기-복제성 비통합형 에피솜 S/MAR 발현 벡터가 척추동물 세포의 형질감염 이후에 개선된 발현 및 정착 효율을 갖는 것인 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 S/MAR 삽입부는 내부 AATAAA 전사 종결 모티프를 함유하는 것인 개선 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 S/MAR 내 상기 AATAAA 전사 종결 모티프는 AATATT 모티프로 치환되는 것인 개선 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 S/MAR은 인간 인터페론 베타 S/MAR, M18 S/MAR, 아포리포단백질 B S/MAR로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 개선 방법.
  5. 제1항에 있어서, 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접된 상기 SMAR은 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 및 SEQ ID NO: 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것인 개선 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 복제 기원은 R6K 감마 복제 기원인 개선 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 복제 기원은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 R6K 감마 복제 기원인 개선 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 선별 마커는 SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 RNA-IN 조절 RNA-OUT 기능성 변이체인 개선 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 선별 마커는 SEQ ID NO: 6과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 RNA-IN 조절 RNA-OUT RNA를 코딩하는 RNA-OUT RNA 선별 마커인 개선 방법.
  10. 제1항에 있어서, 박테리아 복제 기원 및 선별 마커를 포함하는 상기 박테리아 복제-선별 영역은 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 R6K 기원-RNA-OUT RNA 선별 마커 박테리아 복제-선별 영역인 개선 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 5' UTR은 인트론을 더 코딩하는 것인 개선 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 전사 유닛은 프로모터의 상류에 위치된 발현 인핸서를 더 코딩하는 것인 개선 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 발현 인핸서는 SEQ ID NO: 27, 및 SEQ ID NO: 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것인 개선 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 스플라이스 도너 부위는 SEQ ID NO:25와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것인 개선 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 스플라이스 억셉터 부위는 SEQ ID NO: 26과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것인 개선 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 자기-복제성 비통합형 에피솜 S/MAR 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 나노플라스미드 벡터, 통합-결핍형 렌티바이러스 벡터, 및 비통합형 렌티바이러스 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 개선 방법.
  17. 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 엘리먼트를 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 S/MAR 엘리먼트는 상기 프로모터의 하류에 위치되고, 상기 S/MAR 엘리먼트의 핵산 서열 (S/MAR 서열)은 200개 뉴클레오티드 이하의 스트렛치 상에서 100개 뉴클레오티드 당 적어도 3개의 서열 모티프 ATTA를 포함하고, 상기 S/MAR 엘리먼트에는 스플라이스 도너 및 스플라이스 억셉터가 측접되고, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 R6K 감마 복제 기원을 더 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, 상기 프로모터는 숙주 세포에서 카고 폴리펩티드 및/또는 선별 마커의 발현을 위한 전사 유닛에 포함되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서, 상기 전사 유닛은 프로모터, 5' UTR, 이식유전자, 및 3' UTR을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 S/MAR은 상기 3' UTR 내에 위치되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  21. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S/MAR에는 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 RNA-IN 조절 RNA-OUT 기능성 변이체를 포함하는 RNA-OUT RNA 선별 마커를 더 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  23. 공유적으로 폐쇄된 원형 재조합 DNA 분자로서,
    a. 프로모터, 5' UTR, 이식유전자, 및 3' UTR을 포함하는, 척추동물 세포에서 이식유전자의 발현을 위한 전사 유닛;
    b. 상기 3' UTR 내에 위치하는 S/MAR로서, 상기 S/MAR에는 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접되는 것인 S/MAR;
    c. SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 R6K 감마 복제 기원; 및
    d. SEQ ID NO: 5, 및 SEQ ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 RNA-IN 조절 RNA-OUT 기능성 변이체를 포함하는 RNA-OUT RNA 선별 마커
    를 포함하는 것인 재조합 DNA 분자.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R6K 감마 복제 기원 및 상기 RNA-OUT RNA 선별 마커는 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 17로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 R6K 기원-RNA-OUT RNA 선별 마커 박테리아 복제-선별 영역을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 분자.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S/MAR은 내부 AATAAA 전사 종결 모티프를 함유하는 것인 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 분자.
  26. 제17항 내지 제22항 및 제24항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S/MAR 내 상기 AATAAA 전사 종결 모티프는 AATATT 모티프로 치환되는 것인 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 분자.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 S/MAR은 인간 인터페론 베타 S/MAR, M18 S/MAR, 아포리포단백질 B S/MAR로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 분자.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 스플라이스 도너 부위 및 3' 스플라이스 억셉터 부위가 측접되는 상기 SMAR은 SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, 및 SEQ ID NO: 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 분자.
  29. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' UTR은 인트론을 더 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 분자.
  30. 제17항 내지 제22항 및 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 유닛은 프로모터의 상류에 위치된 발현 인핸서를 더 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 분자.
  31. 제17항 내지 제22항 및 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 인핸서는 SEQ ID NO: 27, 및 SEQ ID NO: 28로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 분자.
  32. 제17항 내지 제22항 및 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스플라이스 도너 부위는 SEQ ID NO:25와 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 분자.
  33. 제17항 내지 제22항 및 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스플라이스 억셉터 부위는 SEQ ID NO: 26과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드 또는 재조합 DNA 분자.
KR1020207010722A 2017-09-19 2018-09-19 세포의 유전자 변형을 위한 비통합형 dna 벡터 KR20200079244A (ko)

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