KR20210141997A - 세포의 유전적 변형을 위한 발현 작제물 - Google Patents

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도이체스 크렙스포르슝스첸트룸
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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 프로모터, 적어도 하나의 발현 가능한 작제물, 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이며, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 통합 작제물 또는 비-통합성 벡터 작제물이고, 상기 S/MAR 요소는 상기 프로모터 및 상기 발현 가능한 작제물의 하류에 위치하고, 상기 S/MAR 요소는 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 및 숙주 세포뿐만 아니라 이에 관련된 용도 및 방법에 관한 것이다.

Description

세포의 유전적 변형을 위한 발현 작제물
본 발명은 적어도 하나의 프로모터, 적어도 하나의 발현 가능한 작제물, 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이며, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 통합 작제물 또는 비-통합성 벡터 작제물이고, 상기 S/MAR 요소는 상기 프로모터 및 상기 발현 가능한 작제물의 하류에 위치하고, 상기 S/MAR 요소에는 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있다. 본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 및 숙주 세포뿐만 아니라 이에 관련된 용도 및 방법에 관한 것이다.
세포의 유전적 변형은 과학적 목적을 위해 현대 세포 배양에서 일상적으로 사용된다. 그러나, 유전자의 돌연변이에 의해 유도된 유전 질환의 치료에 해당 기법을 사용하는 것은, 매우 바람직하지만, 이용 가능한 방법이 보통 일시적 변형, 예컨대 일시적 전달감염 프로토콜만을 제공하는 반면, 세포의 안정적인 변형을 제공하는 방법은 보통 숙주 세포의 게놈 내로 트랜스유전자를 통합하는 것에 의존한다는 문제로 인해 여전히 지장을 받고 있다. 그러나, 트랜스유전자의 통합은, 특이적 유전자위를 표적으로 삼는 경우에도, 유해한 돌연변이를 유도할 위험이 있으며, 이는, 예를 들어 치료의 부작용으로서 암을 유발할 수 있다.
스캐폴드-부착 영역(SAR) 또는 매트릭스-연관 영역(MAR)으로도 알려진 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S/MAR)은 핵 매트릭스의 부착을 매개하는 진핵 유기체의 게놈 내 서열로 알려져 있다. 또한, S/MAR 서열은 인슐레이터(insulator) 특성을 가져서, 응축된 염색질 도메인의 전사 활성 영역으로의 연장 및 원부 인핸서와 프로모터의 상호작용을 방지하는 것으로 확인되었다(Yusufzai & Felsenfeld (2004), PNAS 101(23), 8620). S/MARS는 AT-풍부 서열이며, 일부 AT-풍부 모티프가 추가 농축되는 것으로 확인되었다(Liebeich et al. (2002), NAR 30(15): 3433). 다양한 벡터가 S/MAR 모티프에 기반한 세포에서의 안정적인 유지를 위해, 예로 US 6,410,314 B1 및 문헌[Haase et al. (2010), BMC Biotechnology 10:20]에서 제안되었다; 또한, 이러한 벡터의 복제에 영향을 미치는 후성 유전적 효과가 확인되었다(Haase et al.(2013), PLOS One 8(11):e79262). 그럼에도 불구하고, 유전자 치료법에 사용할 만큼 충분히 안정적인 S/MAR-기반 벡터는 여전히 이용 가능하지 않다.
그럼에도 불구하고, 장기간에 걸쳐 트랜스유전자의 만족스러운 발현을 유지하면서, 특히 S/MAR 요소를 사용하는, 세포의 안정적인 전달감염을 위한 개선된 수단 및 방법에 대한 필요성이 당분야에 존재한다. 상기 문제는 본원에서 개시되는 수단 및 방법에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명은 적어도 하나의 프로모터, 적어도 하나의 발현 가능한 작제물, 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이며, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 통합 작제물 또는 비-통합성 벡터 작제물이고, 상기 S/MAR 요소는 상기 프로모터 및 상기 발현 가능한 작제물의 하류에 위치하고, 상기 S/MAR 요소에는 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있다.
하기에서 사용되는 용어 "갖는다", "포함한다" 또는 "포함된다" 또는 이의 모든 임의적인 문법적 변형은 비-배타적 방식으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 이들 용어에 의해 도입된 특성에 더하여, 상기와 관련하여 기재된 대상에 추가 특성이 존재하지 않는 상황 및 하나 이상의 추가 특성이 존재하는 상황을 모두 나타낼 수 있다. 일례로서, 표현 "A는 B를 갖는다", "A는 B를 포함한다" 및 "A에는 B가 포함된다"는 B에 더하여, A에 다른 요소가 존재하지 않는 상황(즉, A가 단독으로 그리고 배타적으로 B로 구성되는 상황) 및 B에 더하여, 대상 A에 하나 이상의 추가 요소, 예컨대 요소 C, 요소 C 및 D 또는 더 많은 요소가 존재하는 상황을 모두 나타낼 수 있다.
또한, 하기에서 사용되는 용어 "바람직하게는", "보다 바람직하게는", "가장 바람직하게는", "특히", "보다 특히", "구체적으로", "보다 구체적으로" 또는 유사한 용어는 추가 가능성을 제한하지 않고, 선택적 특성과 함께 사용된다. 따라서, 이들 용어에 의해 도입된 특성은 선택적 특성이며 청구항의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하려는 것이 아니다. 본 발명은, 당업자가 인식할 바와 같이, 대안적 특성을 사용함으로써 수행될 수 있다. 유사하게, "본 발명의 하나의 구현예에서" 또는 유사한 표현에 의해 도입되는 특성은 본 발명의 추가 구현예에 관해 임의의 제한 없이, 본 발명의 범위에 관해 임의의 제한 없이 그리고 이러한 방식으로 도입된 특성을 본 발명의 다른 선택적 또는 비-선택적 특성과 조합할 가능성에 관해 임의의 제한 없이, 선택적 특성으로 의도된다.
또한, 달리 나타내지 않는 한, 용어 "약"은 관련 분야에서 일반적으로 허용되는 기술적 정밀도로 나타낸 값에 관한 것이며, 바람직하게는 나타낸 값 ± 20%, 보다 바람직하게는 ± 10%, 가장 바람직하게는 ± 5%에 관한 것이다. 또한, 용어 "본질적으로"는 나타낸 결과 또는 용도에 영향을 미치는 편차가 없음을 시사한다, 즉 잠재적인 편차로 인해 나타낸 결과가 ± 20% 초과, 보다 바람직하게는 ± 10% 초과, 가장 바람직하게는 ± 5% 초과로 벗어나지 않게 한다. 따라서, "~로 본질적으로 구성되는"은 특정된 성분을 포함하지만, 불순물로 존재하는 물질, 성분을 제공하기 위해 사용된 공정의 결과로 존재하는 회피 불가능한 물질, 및 본 발명의 기술적 효과를 달성하는 것 이외의 목적을 위해 첨가된 성분을 제외한 다른 성분을 제외함을 의미한다. 예를 들어, 어구 "~로 본질적으로 구성되는"을 사용하여 정의된 조성물은 임의의 알려진 허용 가능한 첨가제, 부형제, 희석제, 담체 등을 포괄한다. 바람직하게는, 한 세트의 성분으로 본질적으로 구성되는 조성물은 5중량% 미만, 보다 바람직하게는 3중량% 미만, 더욱 바람직하게는 1중량% 미만, 가장 바람직하게는 0.1중량% 미만의 특정되지 않은 성분(들)을 포함할 것이다. 핵산 서열과 관련하여, 용어 "본질적으로 동일한"은 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 동일성% 값을 시사한다. 이해될 바와 같이, 용어 본질적으로 동일한에는 100% 동일성이 포함된다. 상기 내용은 용어 "본질적으로 상보적인"에 필요한 변경을 가하여 적용된다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 선형 또는 원형 핵산 분자를 나타낸다. 이 용어는 단일뿐만 아니라 부분적으로 또는 전체적으로 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 포괄한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 cDNA를 포함하는 DNA이며, 보다 바람직하게는 DNA이다. 또한, 자연 발생 변형된 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 글리코실화 또는 메틸화 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오타이드 또는 인공적으로 변형된 유도체, 예컨대 바이오틴화 폴리뉴클레오타이드로 이루어진다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 바람직하게는, 단리된 폴리뉴클레오타이드(즉, 자연 발생적인 조건에서 단리됨) 또는 유전적으로 변형된 형태로, 제공될 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에서 활성이 있는 적어도 하나의 프로모터, 적어도 하나의 발현 가능한 작제물, 및 S/MAR 요소를 포함한다; 또한, 폴리뉴클레오타이드는 모두 본원에서 아래에 특정된 바와 같은, 숙주 세포에서 발현 가능한 작제물의 발현을 제공하는 생물학적 활성을 갖는다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 최대 1 Mb, 보다 바람직하게는 최대 500 kb, 더욱 바람직하게는 최대 200 kb, 가장 바람직하게는 최대 100 kb의 길이를 갖는다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 비-자연 발생 폴리뉴클레오타이드이다; 따라서, 바람직하게는, 뉴클레오타이드는 인공 폴리뉴클레오타이드이다. 또한 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 키메라 폴리뉴클레오타이드이다; 보다 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 이것이 포함하는 나머지 핵산 서열과 이종성인 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드에는 임의의 동원체 및/또는 말단소체 서열이 없다. 또한 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드는 상기 프로모터의 상류에 전사 인슐레이터 요소를 포함한다. 바람직한 전사 인슐레이터 요소는 본원에서 특정된 바와 같은 요소-40 및 S/MAR 요소이다. 따라서, 바람직하게는, 프로모터 및 발현 가능한 작제물은 적어도 하나의 인슐레이션 요소의 존재에 의해, 보다 바람직하게는 인슐레이션 요소의 측면 존재에 의해 폴리뉴클레오타이드에 포함된 잔여 서열과 절연된다.
바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 원핵생물 및/또는 진핵생물에서, 바람직하게는 진핵 숙주 세포 또는 이의 단리된 분획에서 유전자의 발현을 허용하는 추가 발현 제어 서열을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현은 바람직하게는 번역 가능한 mRNA로의, 폴리뉴클레오타이드의 전사를 포함한다. 진핵 세포에서의, 바람직하게는 포유류 세포에서의 발현을 확실히 하는 조절 요소는 당분야에 잘 알려져 있다. 이들은, 바람직하게는, 전사의 개시를 확실히 하는 조절 서열 및, 선택적으로, 전사의 종결 및 전사체의 안정화를 확실히 하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절 요소에는 전사뿐만 아니라 번역 인핸서가 포함될 수 있다. 진핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 조절 요소의 예는 효모에서의 AOX1 또는 GAL1 프로모터 또는 포유류 및 다른 동물 세포에서의 SMVP-, U6-, H1-, 7SK-, CMV- EFS-, SV40-, 또는 RSV-프로모터(라우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이다. miRNA 또는 siRNA의 발현을 위해 바람직한 조절 서열도 당분야에 알려져 있다. 또한, 유도 가능한 또는 세포 유형-특이적 발현 제어 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수 있다. 유도 가능한 발현 제어 서열은 tet 또는 lac 오퍼레이터 서열 또는 열 충격 또는 다른 환경적 요인에 의해 유도 가능한 서열을 포함할 수 있다. 적합한 발현 제어 서열은 당분야에 잘 알려져 있다. 전사의 개시에 관여되는 요소에 더하여, 이러한 조절 요소는 또한 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위를, 폴리뉴클레오타이드의 하류에 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 폴리뉴클레오타이드에는, 바람직하게는, 구체적으로 나타낸 폴리뉴클레오타이드의 변이체가 포함된다. 보다 바람직하게는, 용어 폴리뉴클레오타이드는 나타낸 특정 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체"는 서열이 적어도 하나의 뉴클레오타이드 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 상기 언급된 특정 핵산 서열로부터 유래될 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산 서열을 포함하는 본원과 관련된 폴리뉴클레오타이드의 변이체에 관한 것이며, 여기서 폴리뉴클레오타이드 변이체는 특정 폴리뉴클레오타이드에 대해 특정된 바와 같은 생물학적 활성 또는 활성들을 가질 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 언급되는 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 변이체는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 부가로 인해 상이한 핵산 서열을 가질 것임이 이해되어야 한다. 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오타이드 변이체는 특정 폴리뉴클레오타이드의 또는 이의 기능적 하위서열의, 예로 S/MAR 요소의 오르소로그, 파라로그 또는 또 다른 상동체를 포함한다. 또한 바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오타이드 변이체는 특정 폴리뉴클레오타이드의 또는 이의 기능적 하위서열의 자연 발생 대립유전자를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 또한, 바람직하게는, 엄격한 혼성화 조건 하에, 상기 언급된 특정 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 기능적 하위서열에 혼성화할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포괄한다. 이들 엄격한 조건은 당업자에게 알려져 있으며 표준 교과서에서 확인될 수 있다. 엄격한 혼성화 조건에 대한 바람직한 예는 대략 45℃에서 6x 나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트(= SSC) 중의 혼성화 조건에 이어, 50 내지 65℃에서 0.2x SSC, 0.1% SDS 중 하나 이상의 세척 단계이다. 당업자는 이들 혼성화 조건이 핵산의 유형에 따라 그리고, 예를 들어 유기 용매가 존재하는 경우, 온도 및 완충액의 농도에 따라 상이함을 알고 있다. 예를 들어, "표준 혼성화 조건" 하에서 온도는 핵산의 유형에 따라 0.1x 내지 5x SSC의 농도를 갖는 수성 완충액(pH 7.2) 중 42℃ 내지 58℃로 상이하다. 유기 용매, 예를 들어 50% 포름아미드가 상기 언급된 완충액 중에 존재하는 경우, 표준 조건 하의 온도는 대략 42℃이다. DNA:DNA 하이브리드에 대한 혼성화 조건은 바람직하게는 예를 들어 0.1x SSC 및 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 30℃ 내지 45℃이다. DNA:RNA 하이브리드에 대한 혼성화 조건은 바람직하게는, 예를 들어, 0.1x SSC 및 30℃ 내지 55℃, 바람직하게는 45℃ 내지 55℃이다. 상기 언급된 혼성화 온도는, 예를 들어 포름아미드의 부재 하에 대략 100 bp(= 염기쌍) 길이 및 G+C 함량 50%를 갖는 핵산에 대해 결정된다; 따라서, 원칙적으로 당업자에게 알려진, 낮은-G+C DNA에 보다 적합한 다른 조건이 당업자에 의해 보다 적절한 것으로 확인될 수 있다. 당업자는 표준 교과서를 참조함으로써 필요한 혼성화 조건을 결정하는 방법을 알고 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드 변이체는 PCR-기반 기법, 예컨대 DNA의 혼합 올리고뉴클레오타이드 프라이머-기반 증폭에 의해, 즉 본 발명의 폴리펩타이드의 보존된 도메인에 대한 축중 프라이머를 사용하여 수득 가능하다. 폴리펩타이드의 보존된 도메인은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 다른 유기체의 서열의 서열 비교에 의해 확인될 수 있다. 주형으로서, 박테리아, 진균, 식물로부터의 또는, 바람직하게는, 동물로부터의 DNA 또는 cDNA가 사용될 수 있다. 또한, 변이체에는 구체적으로 나타낸 핵산 서열 또는 이의 기능적 하위서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 또한, 구체적으로 나타낸 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 포괄된다. 동일성% 값은, 바람직하게는, 전체 아미노산 또는 핵산 서열 영역에 걸쳐 계산된다. 다양한 알고리즘에 기반한 일련의 프로그램이 상이한 서열을 비교하기 위해 당업자에게 이용 가능하다. 상기와 관련하여, Needleman 및 Wunsch 또는 Smith 및 Waterman의 알고리즘이 특히 신뢰할 수 있는 결과를 제공한다. 서열 정렬을 수행하기 위해, 프로그램 PileUp(J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153) 또는 프로그램 Gap 및 BestFit(Needleman and Wunsch(J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)) 및 Smith 및 Waterman(Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)))이 바람직하게 사용된다. 바람직하게는, 상기 프로그램은 이의 표준 파라미터와 함께 사용된다. 퍼센트(%)로 상기 인용된 서열 동일성 값은, 바람직하게는, 하기 설정: 갭 가중치: 50, 길이 가중치: 3, 평균 매치: 10.000 및 평균 미스매치: 0.000으로 전체 서열 영역에 걸쳐 프로그램 GAP을 사용하여 결정될 것이며, 이는, 달리 특정되지 않는 한, 항상 서열 정렬을 위한 표준 설정으로 사용될 것이다.
임의의 구체적으로 나타낸 핵산 서열의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 나타낸 활성 또는 활성들을 보유하는 상기 폴리뉴클레오타이드도 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오타이드로 포괄된다. 본원에서 의미하는 단편은, 바람직하게는, 특정 핵산 서열 중 어느 하나의 적어도 200, 바람직하게는 적어도 300, 보다 바람직하게는 적어도 400 연속 뉴클레오타이드를 포함하거나; 특정 아미노산 서열 중 어느 하나의 적어도 100, 바람직하게는 적어도 200, 보다 바람직하게는 적어도 300 연속 아미노산을 포함하며 여전히 나타낸 활성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 핵산 서열로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이를 포함한다. 따라서, 이들은 추가 핵산 서열을 또한 함유할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 예로 융합 단백질 또는 선별 마커를 인코딩할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 발현을 모니터링하기 위한 추가적인 일부 폴리펩타이드(예로, 녹색, 황색, 청색 또는 적색 형광 단백질, 알칼리성 포스파타제 등)로서 또는 검출 가능한 마커로 또는 정제 목적을 위한 보조 조치로 작용할 수 있는 소위 "태그"를 포함할 수 있다. 상이한 목적을 위한 태그는 당분야에 잘 알려져 있고 본원의 다른 곳에 기재되어 있다.
폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 발현 가능한 작제물을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "발현 가능한 작제물"은 숙주 세포 내로 전달되고 발현되는 관심 핵산 서열에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 발현 가능한 작제물에는 본원에서 특정된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 적어도 하나의 유전자 산물이 숙주 세포에서 생산되도록 유도하는 모든 핵산 서열이 포함된다. 따라서, 발현 가능한 작제물은, 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드 자체에 의해 제공되는 것에 부가하여 이차 프로모터를 필요로 하지 않는다. 그러나, 발현 가능한 작제물이 관심 서열 또는 서열들의 전사를 유도하거나 추가적으로 유도하는, 본원에서 아래에 특정된 바와 같은 이차 프로모터를 포함하는 것도 예상된다. 바람직하게는, 발현 가능한 작제물은 하나를 초과하는 유전자 산물을 인코딩한다; 따라서, 발현 가능한 작제물은, 예로, 2개의 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있고, 그 중 하나는 본원에서 아래에 특정된 바와 같은 선별 마커일 수 있다. 바람직하게는, 유전자 산물은 miRNA, siRNA, 및 mRNA를 포함하는 RNA이며, 바람직하게는, mRNA이고; 및/또는 유전자 산물은 본원에서 다른 곳에 특정된 바와 같은 폴리펩타이드이다. 따라서, 바람직하게는, 발현 가능한 작제물은 폴리뉴클레오타이드, 예로 관심 RNA 및/또는 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열이다.
바람직하게는, 인코딩되는 RNA는 간섭, 비-코딩 핵산이다. 이에 따라, 폴리뉴클레오타이드로부터 발현되는 비-코딩 간섭 핵산은 전형적으로 안티센스 RNA, siRNA, miRNA, 또는 리보자임일 수 있다. 이에 의해, 숙주 세포에서의 유전자 발현은 본원에서 특정된 바와 같이 폴리뉴클레오타이드를 사용함으로써 변형될, 즉 하향-조절될 수 있고, 이는 본 명세서에서 다른 곳에 언급된 것들을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 특정된 폴리뉴클레오타이드의 개선된 안정성 및 발현 특징으로 인해, 유전자 침묵화 접근이 또한 개선될 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 관심 RNA는 치료용 RNA이다. 본원에서 사용되는 용어 "치료용 RNA"는 상기 치료용 RNA를 포함하는 숙주 세포의 생리적 및/또는 대사 상태에서의 변화를 매개하는 임의의 RNA에 관한 것이다. 따라서, 바람직하게는, 치료용 RNA는 본원에서 상기 특정된 간섭, 비-코딩 RNA, 특히 siRNA, miRNA, 안티센스 RNA, 또는 리보자임이다. 예로 유전자 침묵화에서 사용하기 위한 간섭 핵산을 설계하는 수단 및 방법은 당업자에게 알려져 있다. 보다 바람직하게는, 치료용 RNA는 본원에서 아래에 특정된 바와 같이 치료용 폴리펩타이드 또는 이의 서브유닛 또는 활성 단편을 인코딩하는 mRNA이다. 바람직하게는, 치료용 RNA는 상기 치료용 RNA를 포함하는 숙주 세포의 생리적 및/또는 대사 상태에서의 변화를 매개하고, 이에 따라 바람직하게는 본원에서 다른 곳에 특정된 바와 같이, 질환 또는 장애의 완화 또는 치료에 기여한다.
관심 폴리펩타이드는, 원칙적으로, 숙주 세포에서 그 과발현이 바람직한 임의의 폴리펩타이드일 수 있다. 높은 및/또는 계속되는 발현이 요망되는 폴리펩타이드가 바람직하다. 바람직하게는, 관심 폴리펩타이드는 치료용 폴리펩타이드이다. 본원에서 사용되는 용어 "치료용 폴리펩타이드"는 상기 치료용 폴리펩타이드를 포함하는 숙주 세포 및/또는 이러한 숙주 세포와 직접 또는 바람직하게는 체액을 통해, 보다 바람직하게는 혈액, 림프, 타액, 뇌척수액 및/또는 간질액을 통해, 유체 접촉하고 있는 세포의 생리적 및/또는 대사 상태에서의 변화를 매개하는 임의의 폴리펩타이드에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 치료용 폴리펩타이드는 숙주 세포 및/또는 이러한 숙주 세포와 직접 또는 유체 접촉하고 있는 세포의 생리적 및/또는 대사 상태에서의 변화를 매개하며, 이에 따라 바람직하게는 본원에서 다른 곳에 특정된 바와 같이, 질환 또는 장애의 완화 또는 치료에 기여하는 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 치료용 폴리펩타이드는, 바람직하게는 본원에서 아래에 특정된 바와 같은, 항체이다. 또한 바람직하게는, 치료용 폴리펩타이드는 T 세포 수용체(TCR), 보다 바람직하게는 인간 또는 키메라 T 세포 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR), 바람직하게는 MART1 TCR, 또는 본원에서 다른 곳에 특정된 바와 같은 유전 질환을 앓는 세포에 부재하는 폴리펩타이드이다. 따라서, 예로, 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 페닐케톤뇨증의 치료를 위해 페닐알라닌-하이드록실라제 활성을 제공하는 폴리펩타이드(EC 1.14.16.1)를 인코딩하는, 또는 범맥락막위축을 치료하기 위해 REP1 유전자를 인코딩하는, 또는 레버 선천성 흑암시를 치료하기 위해 RPE65 유전자를 인코딩하는, 또는 혈우병의 치료를 위해 인자 VIII, IX 및/또는 X를 인코딩하는, 또는 어셔병을 치료하기 위해 USH2a 유전자를 인코딩하는 적어도 하나의 발현 가능한 작제물을 포함한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 광의의 개념으로 사용되며 구체적으로 이들이 요망되는 결합 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체(예로 이중특이적 항체), 단일쇄 항체, 나노바디로도 알려진 단일-도메인-항체(VHH), 및 항체 단편을 포괄한다. 바람직하게는, 항체는 단일쇄 항체 또는 VHH(나노바디)이다. 바람직하게는, 항체는 치료용 항체이다, 즉, 질환-관련 분자, 바람직하게는 치료 관련성을 갖는 폴리펩타이드에 대해 결합 활성을 가지며, 상기 질환-관련 분자에 의해 유도되거나 악화되는 질환 또는 장애의 치료에 기여한다. 본원에서 관련된 바와 같이, "항체 단편"은 이의 항원-결합 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다. 항체의 파파인 소화는 "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성하며, 각각 단일 항원-결합 부위, 및 그 명칭이 쉽게 결정화하는 그 능력을 반영하는, 잔여 "Fc" 단편을 갖는다. 펩신 처리는 2개의 항원-조합 부위를 가지며 여전히 항원과 가교할 수 있는 F(ab')2 단편을 산출한다. "Fv"는 전체 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 바람직하게는, 2-쇄 Fv 종은 단단히, 비-공유 연합된 1개 중쇄 및 1개 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 단일쇄 Fv(scFv) 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv 종에서와 유사한 "이량체" 구조로 연합할 수 있도록 가요성 펩타이드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 상기 구성에서 각각의 가변 도메인의 3개 초가변 영역(상보성 결정 영역(CDR)으로도 나타내는, HVR)은 상호작용하여 항원-결합 부위를 정의한다. 종합적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3개의 HVR만 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖지만, 전체 결합 부위에 비해 더 낮은 친화도를 갖는다. 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 나타내며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드쇄(VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개 도메인 간 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 페어링하게 되고 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 및 Hollinger et al., PNAS USA 90 (1993) 6444-6448]에 보다 자세히 기재되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디도 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]에 기재되어 있다. 용어 "단일-도메인 항체"(VHH) 또는 "나노바디"는 하나의 가변 항체 도메인을 포함하는 항체 단편에 관한 것이며, 원칙적으로, 당업자에게 알려져 있다. 검토는, 예로 문헌[Muyldermanns et al. (2009), Vet Immunol Immunopathol. 128(1-3):178]에서 제공된다. 바람직하게는, VHH는 바람직하게는 표적 폴리펩타이드로 면역화된 알파카, 단봉낙타, 쌍봉낙타, 라마, 또는 상어로부터 수득된, 중쇄 항체의 CDR을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 항-종양 항원 항체, 보다 바람직하게는 항-종양 특이적 항원 항체, 더욱 바람직하게는 항-암배아 항원(CEA) 항체, 더욱 바람직하게는 단일쇄 항-CEA 항체이며, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:16에 의해 인코딩된다.
바람직하게는, 발현 가능한 작제물은 선별 마커 폴리펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열을 포함하거나 추가로 포함하며, 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드의 프로모터 및/또는 이차 프로모터 및 상기 선별 마커 서열은 함께 선별 마커 유전자를 구성한다. 본원에서 사용되는 용어 "선별 마커 서열"은 표현 "선별 마커 폴리펩타이드를 인코딩하는 코딩 서열"에 대한 약칭으로 사용된다. 용어 "선별 마커"는 원칙적으로 당업자에 의해 이해되며, 숙주 세포에서 발현되는 경우, 적용되는 경우 숙주 세포에 대한 선택 압력을 매개하는 적어도 하나의 조건에 대해 내성을 부여하는 핵산 서열에 관한 것이다. 원핵 및 진핵 세포에 대한 선별 마커는 당분야에 알려져 있다. 바람직하게는, 선별 마커는 진핵 세포의 선별 마커이다. 바람직하게는, 선별 마커는 선별 마커 폴리펩타이드, 보다 바람직하게는 트랜스포터 및/또는 숙주 세포로부터 선택 화합물을 제거하거나 이를 불활성으로 만들기 위해 상기 선택 화합물을 변형하는 효소 활성을 갖는 선별 마커 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 선별 마커 유전자는 바람직하게는 선별 마커 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열의 상류에, 적어도 하나의 인트론을 추가로 인코딩한다. 바람직하게는, 선별 마커는 퓨로마이신, 블라스티시딘, 네오마이신에 및/또는 제오신에 대한, 보다 바람직하게는 퓨로마이신에 대한 내성을 매개하는 마커이다. 따라서, 바람직하게는, 프로모터 및 선별 마커는 함께 퓨로마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 또는 제오신 내성 유전자, 보다 바람직하게는 퓨로마이신 내성 유전자를 구성한다. 바람직하게는, 선별 마커는, 특정 세트의 성장 조건, 바람직하게는 증식 신호의 존재 및/또는 부재에 대한 내성을 제공하는 폴리펩타이드이다. 따라서, 바람직하게는, 선별 마커는 T-세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)이며, 둘 다 원칙적으로 당분야에 알려져 있다. 바람직하게는, TCR 및/또는 CAR은, 바람직하게는, T 세포 신호전달이 상기 TCR 및/또는 CAR을 포함하는 숙주 세포에서 유도될 수 있도록 하는, 알려진 특이성을 갖는다. 바람직하게는, 이러한 경우, 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다. 바람직하게는, 선별 마커 유전자에는 폴리-A 신호 및 전사 종결 신호(들)가 없다. 따라서, 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 선별 마커를 인코딩하는 코딩 서열(선별 마커 서열)을 추가로 포함하며, 상기 선별 마커 서열은 발현 가능한 작제물에 포함되고, 바람직하게는 상기 프로모터 및/또는 이차 프로모터 및 상기 선별 마커 서열은 함께 선별 마커 유전자를 구성하고, 상기 선별 마커는 진핵 세포의 선별 마커이다. 바람직하게는 선별 마커는 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제이다(Genbank Acc No. KX548903.1(SEQ ID NO:10)의 뉴클레오타이드 535 내지 1134에 의해 인코딩되는, Genbank Acc No. KX548903.1(SEQ ID NO:9)). 따라서, 선별 마커 유전자는, 바람직하게는, a) SEQ ID NO:9의 서열을 포함하는 퓨로마이신 내성 폴리펩타이드의 발현을 유도하고; b) SEQ ID NO:9의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는 퓨로마이신 내성 폴리펩타이드의 발현을 유도하고; c) SEQ ID NO:10의 서열을 포함하고; d) SEQ ID NO:10의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하고, e) SEQ ID NO:9의 서열을 포함하는, 바람직하게는 이로 구성되는 퓨로마이신 내성 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 및/또는 f) SEQ ID NO:9의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하는, 바람직하게는 이로 구성되는 퓨로마이신 내성 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
본원에서 특정된 바와 같이, 발현 가능한 작제물은 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 요소에 개재하며, 여기서 상기 S/MAR 요소는 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있다; 따라서, 바람직하게는, S/MAR 요소는 발현 가능한 작제물을 포함하는 전사체로부터 스플라이스되어 나온다. 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체 부위는 당분야에 알려져 있다. 바람직하게는, 발현 가능한 작제물을 인코딩하는 서열은 적어도 하나의 프로모터 및 S/MAR 요소에 개재하며, 여기서 상기 S/MAR 요소는 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 그 측면에 있다; 따라서, 바람직하게는, S/MAR 요소는 폴리펩타이드, 바람직하게는 치료용 폴리펩타이드를 인코딩하는 전사체로부터 스플라이싱되어 나온다.
바람직하게는, 발현 가능한 작제물은 바람직하게는 하나의 mRNA로부터 진핵 세포에서 2개(또는 그 초과)의 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 서열, 예로 내부 리보솜 진입 서열(IRES) 또는, 보다 바람직하게는, 자가-절단 펩타이드 서열, 예컨대, 가장 바람직하게는, 돼지 테스코바이러스-1로부터의 펩타이드 2A(P2A) 서열이 개재된, 선별 마커 및 관심 RNA 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 적절한 서열은 당분야에, 예로 문헌[Kim et al. (2011) PLoS ONE 6(4): e18556]으로부터 알려져 있다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드를 수신하거나, 통합하거나, 안정하게 복제할 수 있고, 발현 가능한 작제물을 발현할 수 있는 임의의 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 식물 또는 효모 세포, 예로 빵 효모 균주의 세포이거나, 동물 세포이다. 보다 바람직하게는, 숙주 세포는 곤충 세포 또는 포유류 세포, 특히 마우스 또는 래트 세포이다. 더욱 바람직하게는, 숙주 세포는 포유류 세포이며, 가장 바람직하게는 인간 세포이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 CD34+ 전구 세포; CD61+ 혈소판; CD19+ B-림프구; CD14+ 단핵구; CD15+ 과립구; 바람직하게는 또한 CD8 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 세포독성 T-림프구; 또한, CD4 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 헬퍼 T-림프구; 바람직하게는 또한 CD25 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 활성화 T-림프구, 종양 침윤 림프구, 또는 자연 살해(NK) 세포이다. 또한 바람직하게는, 숙주 세포는 배아 줄기(ES) 세포, 유도된 다능성 줄기 세포(IPS) 세포, 기도 상피 세포, 섬유아세포, 또는 망막 상피 세포이다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 추가적으로 박테리아 세포에서의 복제를 허용하는 서열, 특히 박테리아 복제 기원을 가질 수 있다. 바람직하게는, 박테리아 세포는 박테리아의 실험실 균주 세포, 보다 바람직하게는 대장균 세포이다.
용어 "프로모터"는, 원칙적으로, 선택적으로 추가 조절 요소와 함께, 주어진 유전자의 전사 수준을 유도하는 유전 요소로서 당업자에 알려져 있다. 프로모터는 구성적, 즉 본질적으로 숙주 세포의 상태와 무관하게 일정한 전사 수준을 제공할 수 있거나, 조절될, 즉 숙주 세포의 상태에 의존하여 전사 수준을 제공할 수 있다. 또한, 프로모터는 세포 유형 및/또는 조직 특이적, 즉 소수의 또는 단 하나의 세포 유형에서만 검출 가능한 전사 수준을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로모터는 본원에서 상기 특정된 바와 같이 숙주 세포에서 활성이다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 프로모터의 선택은 표적화를 위한 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 수 있다; 특정 세포 유형에 적합한 프로모터뿐만 아니라 구성적 프로모터가 당분야에 알려져 있다. 바람직하게는, 프로모터는 진핵 프로모터, 보다 바람직하게는 구성적 진핵 프로모터, 더욱 바람직하게는 강력한 진핵 프로모터이다. 바람직하게는, 프로모터는 EF1알파(연장 인자 1 알파) 프로모터, UbiC(유비퀴틴 C) 프로모터, ROSA 26 프로모터, PGK(포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, 및/또는 CAG(닭 알파-액틴) 프로모터이며, 보다 바람직하게는 EF1알파 프로모터이다. 또한 바람직하게는, 프로모터는 세포- 및/또는 조직-특이적 진핵 프로모터이다. 본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 상기 특정된 바와 같이 프로모터에 대해 사용되는 반면, 추가적으로 폴리뉴클레오타이드 상에 존재할 수 있는 임의의 다른 프로모터는 "이차 프로모터"로 나타낸다. 따라서, 바람직하게는, 프로모터는 숙주 세포에서 S/MAR 서열로의 전사를 유도하는 프로모터이다; 또한 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드의 S/MAR 서열로의 전사를 유도하지 않는 프로모터, 예로 원핵 프로모터이고, S/MAR 서열과 전사적으로 절연되고, 및/또는 S/MAR 서열로부터 떨어져서 전사를 유도하는 프로모터는 이차 프로모터이다. 바람직하게는, 프로모터는 아포리포단백질 B 프로모터에 대응하는 1000 미만, 보다 바람직하게는 250 미만, 더욱 바람직하게는 100 미만, 가장 바람직하게는 20 미만의 인접한 염기쌍을 포함한다; 따라서, 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 인간 아포리포단백질 B 프로모터를 포함하지 않으며, 보다 바람직하게는 아포리포단백질 B 프로모터를 포함하지 않는다.
바람직하게는, 발현 가능한 작제물은 프로모터의 바로 하류에 위치하고 및/또는 S/MAR 서열은 발현 가능한 작제물의 바로 하류에 위치한다. 바람직하게는, "바로 하류에" 위치하는 것은 개재 전사 종결 신호가 없으며, 보다 바람직하게는 개재 유전자가 없다. 따라서, 바람직하게는, 프로모터에서 개시되었고 발현 가능한 작제물 서열을 포함하는 전사체는 바람직하게는 전사된 S/MAR 서열을 포함하며, 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드에 포함된 전체 S/MAR 서열을 포함한다; 본원의 다른 곳에서의 기재의 측면에서 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드에는 바람직하게는 일차 전사체로부터 S/MAR 서열의 절제를 매개하는 스플라이싱 부위가 추가로 포함된다; 따라서, 보다 바람직하게는, 적어도 프로모터에서 개시되었고 발현 가능한 마커 서열을 포함하는 일차 전사체는 바람직하게는 전사된 S/MAR 서열을 포함하며, 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드에 포함된 전체 S/MAR 서열을 포함한다. 또한 바람직하게는, 용어 "바로 하류에"에는 전사 종결 신호가 프로모터 및 S/MAR에 개재하지 않는 한, 프로모터 및 S/MAR 서열이 연장된 핵산 서열에 의해 분리되는 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 바람직하게는, 프로모터 및 발현 가능한 작제물의 첫 번째 뉴클레오타이드에 개재하는 서열, 또는 발현 가능한 작제물의 마지막 뉴클레오타이드 및 S/MAR 서열에 개재하는 서열은 최대 2 kb, 보다 바람직하게는 최대 0.5 kb, 더욱 바람직하게는 최대 0.2 kb, 보다 더 바람직하게는 최대 0.1 kb, 가장 바람직하게는 최대 50 bp의 길이를 갖는다.
또한 명명 "스캐폴드/매트릭스 부착 영역" 하에 알려진, 용어 "S/MAR 요소"는, 원칙적으로, 상기 DNA로의 진핵 세포의 핵 매트릭스의 부착을 매개하는 DNA 서열에 관련된 것으로 당업자에게 알려져 있다. S/MAR 서열은 전형적으로 진핵 염색체의 DNA 내 서열로부터 유래된다. 다양한 S/MAR 서열이 이용 가능하며, 서열은 공개 데이터베이스로부터, 예로, 문헌[Liebich et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30, 312-374]에 기재된 바와 같이 이용 가능하다. 본 발명에 따르면, 상기 S/MAR 요소의 핵산 서열(지금까지 S/MAR 서열로 나타냄)은 바람직하게는 최대 200 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 3개의 서열 모티프 ATTA(SEQ ID NO:1)를 포함한다. 따라서, S/MAR 서열에 포함된 모티프는 여러 개의 4-뉴클레오타이드 모티프 5'-ATTA-3'을 포함한다. 바람직하게는, S/MAR 서열은 적어도 200 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 적어도 300 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 400 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 적어도 500 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 바람직하게는, S/MAR 서열은 최대 3 kb, 보다 바람직하게는 최대 2 kb, 더욱 바람직하게는 최대 1.5 kb, 보다 더 바람직하게는 최대 1 kb, 더욱 바람직하게는 최대 0.5 kb, 가장 바람직하게는 최대 0.25 kb의 길이를 갖는다. 따라서, 바람직하게는, S/MAR 서열은 0.2 kb 내지 3 kb, 보다 바람직하게는 0.3 kb 내지 2 kb, 더욱 바람직하게는 0.4 kb 내지 1.5 kb, 가장 바람직하게는 0.5 kb 내지 1 kb의 길이를 갖는다. 이해될 바와 같이, 표시 "100 뉴클레오타이드 당 n개의 서열 모티프를 포함한다"는 서열의 100 염기쌍 당 계산된 상기 서열 모티프의 평균 갯수에 관한 것이며, 이에 따라 분수일 수 있다. 예로 SEQ ID NO:6에서 100 염기쌍 당 ATTA 서열 모티프의 갯수는 34 / 525 염기쌍 * 100 염기쌍 = 6.5이다. 바람직하게는, 100 염기쌍 당 서열 모티프의 갯수는 S/MAR 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정된다; 의심스러운 경우, 예로, S/MAR 서열의 경계가 결정될 수 없는 경우, 폴리뉴클레오타이드의 100 염기쌍 당 서열 모티프의 갯수는, 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오타이드 내의 200 bp의 임의의 윈도우에 대해 결정 가능한 최대 갯수이고, 보다 바람직하게는 상기 폴리뉴클레오타이드 내의 500 bp의 임의의 윈도우에 대해 결정 가능한 최대 갯수이다. 바람직하게는, S/MAR 서열은 최대 200 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 4개의 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게는 최대 200 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 5개의 서열 모티프 ATTA, 더욱 바람직하게는 최대 200 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 6개의 서열 모티프 ATTA를 포함한다. 또한 바람직하게는, S/MAR 서열은 최대 400 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 3개의 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게는 최대 400 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 4개의 서열 모티프 ATTA, 더욱 바람직하게는 최대 400 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 5개의 서열 모티프 ATTA, 가장 바람직하게는 최대 400 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 6개의 서열 모티프 ATTA를 포함한다. 또한 바람직하게는, S/MAR 서열은 최대 500 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 3개의 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게는 최대 500 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 4개의 서열 모티프 ATTA, 더욱 바람직하게는 최대 500 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 5개의 서열 모티프 ATTA, 가장 바람직하게는 최대 500 뉴클레오타이드의 연장물에 걸쳐 100 뉴클레오타이드 당 적어도 6개의 서열 모티프 ATTA를 포함한다. 따라서, 바람직하게는, S/MAR 서열은 500 뉴클레오타이드의 서열에 걸쳐 적어도 10개의 서열 모티프 ATTA, 보다 바람직하게는 500 뉴클레오타이드의 서열에 걸쳐 적어도 20개의 서열 모티프 ATTA, 더욱 바람직하게는 500 뉴클레오타이드의 서열에 걸쳐 적어도 30개의 서열 모티프 ATTA를 포함한다. 바람직하게는, S/MAR 서열 내 ATTA 모티프의 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%는 각각 9 내지 13, 바람직하게는 10 내지 12, 가장 바람직하게는 11 염기쌍에 의해 분리된다.
바람직하게는, S/MAR 요소는, 바람직하게는 본원에서 상술된 ATTA 모티프를 포함하는 서열 내에, 추가적인 서열 모티프를 포함한다. 바람직하게는, 상기 ATTA 서열 모티프를 포함하는 상기 S/MAR 요소의 서열 연장물은 적어도 하나의 서열 모티프 ATTTA(SEQ ID NO:2), 바람직하게는 적어도 2개의 서열 모티프 ATTTA, 보다 바람직하게는 적어도 4개의 서열 모티프 ATTTA, 가장 바람직하게는 적어도 8개의 서열 모티프 ATTTA를 추가로 포함한다. 또한 바람직하게는, 상기 ATTA 서열 모티프, 및 선택적으로 상기 ATTTA 모티프(들)를 포함하는 상기 S/MAR 요소의 서열 연장물은 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 2개의, 보다 바람직하게는 적어도 4개의, 가장 바람직하게는 적어도 6개의 회문나선 모티프, 바람직하게는 모티프 TAAATATTTTA(SEQ ID NO:3)를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 모티프 TAAATATTTTA는 5' 말단 및/또는 3' 말단 상에서 적어도 하나의 모티프 ATTA에 인접한다. 또한 바람직하게는, 상기 ATTA 서열 모티프를 포함하는 S/MAR 요소의 서열 연장물은 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 2개의, 보다 바람직하게는 적어도 3개의, 더욱 바람직하게는 적어도 4개의, 가장 바람직하게는 적어도 5개의 서열 모티프 ATTATAAATATTTTAATTA(SEQ ID NO:4), 보다 바람직하게는 서열 모티프 ATTTAATTATAAATATTTTAATTA(SEQ ID NO:5)를 포함한다.
또한 바람직하게는, S/MAR 서열은 낮은 G+C 함량을 갖는다. 당업자는 서열 내 모든 구아닌 및 시티딘 염기를 계수하고 누적 결과를 서열 내 뉴클레오타이드의 갯수로 나눔으로써 알려진 서열의 C+G 함량을 어떻게 계산하는지 안다. 바람직하게는, 상기 서열 모티프 ATTA를 포함하는 S/MAR 요소의 서열 연장물은 최대 30%, 보다 바람직하게는 최대 20%, 보다 더 바람직하게는 최대 15%, 더욱 바람직하게는 최대 10%, 가장 바람직하게는 최대 5%의 G+C 함량을 갖는다. 바람직하게는, S/MAR 요소의 경계가 결정될 수 없는 경우, G+C 함량의 계산을 위해 사용되는 서열은 본원에서 상기 특정된 바와 같이, 100 염기쌍 당 ATTA 모티프의 갯수를 계산하기 위해 사용되는 것과 동일하다. 또한 바람직하게는, S/MAR 서열은 적은 수의 CG 디뉴클레오타이드를 갖는다. 바람직하게는, 상기 서열 모티프를 포함하는 상기 S/MAR 요소의 서열 연장물은 최대 6개의 서열 모티프 CG, 보다 바람직하게는 최대 4개, 더욱 바람직하게는 최대 2개를 포함하며, 가장 바람직하게는 서열 모티프 CG를 포함하지 않는다.
바람직하게는, S/MAR 서열은 아포리포단백질 B 유전자, 바람직하게는 인간 아포리포단백질 B 유전자의 S/MAR 서열, 보다 바람직하게는 인간 아포리포단백질 B 유전자의 3' S/MAR 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, S/MAR 서열은 인간 아포리포단백질 B 유전자의, 보다 바람직하게는 인간 아포리포단백질 B 유전자의 3' S/MAR 서열의 변이체를 포함한다. 따라서, 바람직하게는, S/MAR 서열은 SEQ ID NO:6, 바람직하게는 SEQ ID NO:7 또는 8의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, S/MAR 서열은 SEQ ID NO:6, 바람직하게는 SEQ ID NO:7, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:8의 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게는, S/MAR 서열은 SEQ ID NO:15의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하며, 보다 바람직하게는 S/MAR 서열은 SEQ ID NO:15의 서열을 포함한다. 또한 바람직하게는, S/MAR 서열은 베타-인터페론 유전자, 바람직하게는 인간 베타-인터페론 유전자의 S/MAR 서열, 보다 바람직하게는 인간 베타-인터페론 유전자의 S/MAR 서열을 포함한다. 따라서, 바람직하게는, S/MAR 서열은 SEQ ID NO:17의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함하며; 보다 바람직하게는, S/MAR 서열은 SEQ ID NO:17의 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 S/MAR 요소의 하류에 폴리-A 신호를 포함한다: 보다 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 S/MAR 요소의 하류에 폴리-A 신호 및 전사 종결 신호를 포함한다. S/MAR 요소는 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있다; 따라서, 바람직하게는, 전사체는 프로모터로부터 전사되며, 이 전사체로부터 S/MAR 요소의 서열이 스플라이스되어 나온다. 또한 바람직하게는, S/MAR 서열은 바람직하게는 전사 후 선별 마커를 인코딩하는 전사체에서 스플라이스되어 나온다. 또한 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 본원에서 상기 특정된 바와 같이 (이차) 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 박테리아 복제 기원 및 박테리아 선별 마커 유전자의 발현을 유도하는 프로모터는 원핵생물-특이적이다, 즉, 보다 바람직하게는, 숙주 세포에서 비-기능적이다. 또한 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드에 포함된 원핵 세포에서 바람직하게는 모든 요소가 활성인, 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자는 적어도 하나의 인슐레이션 요소의 존재에 의해, 보다 바람직하게는 인슐레이션 요소가 측면에 있음으로써 폴리뉴클레오타이드에 포함된 잔여 서열과 절연된다. 바람직하게는, 원핵 세포에서 바람직하게는 모든 요소가 활성인, 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자는 5' 말단의 적어도 하나의 인슐레이션 요소 및 3' 말단의 적어도 하나의 인슐레이션 요소의 존재에 의해 폴리뉴클레오타이드에 포함된 잔여 서열과 절연된다. 보다 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드에 포함된 원핵 세포에서 바람직하게는 모든 요소가 활성인, 박테리아 복제 기원 및/또는 박테리아 선별 마커 유전자는 적어도 하나의 인슐레이션 요소의 존재에 의해, 보다 바람직하게는 인슐레이션 요소가 측면에 있음으로써 프로모터와 절연된다. 바람직하게는, 상기 인슐레이션 요소(들)는 항-억제 요소40 요소(SEQ ID NO:11) 또는 이의 변이체 및/또는 S/MAR 요소이다.
따라서, 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:7 또는 8의 서열 또는 SEQ ID NO:7 또는 8의 서열과 적어도 70% 동일한 서열; 바람직하게는 SEQ ID NO:12의 서열 또는 SEQ ID NO:12의 서열과 적어도 70% 동일한 서열, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO:13의 서열 또는 SEQ ID NO:13의 서열과 적어도 70% 동일한 서열, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO:14의 서열 또는 SEQ ID NO:14의 서열과 적어도 70% 동일한 서열을 포함한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 상이한 폴리펩타이드, 바람직하게는 치료용 폴리펩타이드, 보다 바람직하게는 인간 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 바람직하게는 MART1 TCR을 인코딩하는 핵산 서열에 의해 대체된 GFP를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 SEQ ID NO:14의 서열을 포함한다.
바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 통합 작제물이다. 본원에서 사용되는 용어 "통합 작제물"에는 상기 숙주 세포 내로 도입되는 경우 검출 가능한 비율로 숙주 세포의 게놈 내로 공유 통합되는 활성을 갖는 모든 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 바람직하게는, 통합 작제물은 전달감염된 fmol 폴리뉴클레오타이드 당 적어도 100건의 통합 이벤트 비율, 보다 바람직하게는 전달감염된 fmol 폴리뉴클레오타이드 당 적어도 1000건의 통합 이벤트 비율, 더욱 바람직하게는 전달감염된 fmol 폴리뉴클레오타이드 당 적어도 104건의 통합 이벤트 비율, 가장 바람직하게는 전달감염된 fmol 폴리뉴클레오타이드 당 적어도 105건의 통합 이벤트 비율로 통합된다. 바람직하게는, 통합 작제물에는 진핵 복제 기원이 없으며, 바람직하게는 복제 기원이 없고, 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드가 복제하고 안정하게 유지되도록 유도하는 핵산 서열이 없다. 따라서, 바람직하게는, 통합 작제물은 숙주 세포에서, 바람직하게는 포유류 세포에서, 에피솜으로 복제하지 않으며, 바람직하게는 자율 복제하지 않는다. 바람직하게는, 통합 작제물은 적어도 하나의 통합 신호를 포함한다.
통합 신호는, 원칙적으로, 당분야에 알려져 있으며, 숙주 세포의 게놈 내로 상기 통합 신호를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 공유 통합하기 위해 내부에 포함된 숙주 세포 또는 재조합 시스템을 유도하는 모든 종류의 신호가 포함된다. 따라서, 바람직하게는, 통합 신호는 선형 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드의 자유 말단이며, 이는 VD(J) 재조합을, 또는 바람직하게는, 적합한 상동성 서열을 포함하는 경우, 상동성 재조합을 유도할 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 본원에서 특정된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드는 이중-가닥, 선형 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 이중-가닥, 선형 DNA이다. 또한 바람직하게는, 통합 신호는 재조합효소 인식 서열, 바이러스 통합 신호, 전위 가능한 요소 등이다. 따라서, 바람직하게는, 통합 신호는 cre 또는 lox 재조합 부위, 람다 부착 부위, 아연 핑거 재조합효소 인식 부위, 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 인식 부위, 또는 세린 통합효소 인식 부위, 예로 스트렙토마이세스(Streptomyces) 파지 φC31로부터 유래된 PhiC31 통합효소에 대한 인식 부위이다. 따라서, 바람직하게는, 통합 신호에 의해 매개되는 통합은 비-서열 특이적, 본질적으로 서열 특이적, 또는 서열 특이적일 수 있다.
또한 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 비-통합성 벡터 작제물이다. 본원에서 사용되는 용어 "비-통합성 벡터 작제물"은 숙주 세포 게놈 내로 통합되지 않고 숙주 세포에서 소정 시기 동안 유지되는 폴리뉴클레오타이드 작제물에 관한 것이다. 바람직하게는, 비-통합성 벡터 작제물은 당분야에 알려져 있거나 본원에서 다른 곳에 기재된 방법에 의해, 바람직하게는 PCR에 의해 평균 50회 세포 분열 후, 보다 바람직하게는 평균 100회 세포 분열 후 숙주 세포에서 검출 가능하다. 본원에서 사용되는 용어 비-통합성 벡터 작제물은 폴리뉴클레오타이드가 복제하고 적어도 상기 언급된 시기 동안 안정하게 유지되도록 유도하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본원에서 나타낸 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드가 복제하고 안정하게 유지되도록 유도하는 적어도 하나의 핵산 서열은 S/MAR 서열에 부가하여 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 서열이다. 따라서, 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드가 복제하고 안정하게 유지되도록 유도하는 적어도 하나의 핵산 서열은 S/MAR 서열이 아니다. 바람직하게는, 비-통합성 벡터 작제물은, 바람직하게는 동원체 및 말단소체를 포함하는, 인공 염색체이다. 바람직하게는, 비-통합성 벡터 작제물은 인간 인공 염색체이다. 보다 바람직하게는, 비-통합성 벡터 작제물은 에피솜으로, 즉 원형 형태로 복제하는 작제물이다. 따라서, 바람직하게는, 비-통합성 벡터 작제물은 비-통합성 바이러스 벡터 작제물이다.
본원에서 사용되는 용어 "비-통합성 바이러스 벡터 작제물"은 숙주 세포 게놈 내로 통합되지 않고 숙주 세포에서, 바람직하게는 본원에서 상기 특정된 바와 같이, 소정 시기 동안 유지되고 바이러스-유래 복제 신호를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 작제물에 관한 것이다. 따라서, 비-통합성 바이러스 벡터 작제물은, 바람직하게는, 통합효소 활성을 함유하지 않도록 변형된 바이러스에 기반한다. 하나의 대안으로서, 비-통합성 바이러스 벡터 작제물은, 바람직하게는, 매우 낮은 빈도로만 숙주 세포의 게놈 내로 통합하는 바이러스로부터 유래되어, 바람직하게는 105 감염된 세포에서 1건 미만의 통합, 보다 바람직하게는 106 감염된 세포에서 1건 미만의 통합, 더욱 바람직하게는 107 감염된 세포에서 1건 미만의 통합, 가장 바람직하게는 108 감염된 세포에서 1건 미만의 통합으로 이어진다. 따라서, 바람직하게는, 비-통합성 바이러스 벡터 작제물은 아데노-연관 바이러스(AAV), 헤르페스바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40), 또는 유두종바이러스에 기반한 바이러스 벡터 작제물이다. 바람직하게는, 비-통합성 바이러스 벡터 작제물은 비-통합성 렌티바이러스 작제물이다.
본원에서 사용되는 용어 "복제하는"은 세포 복제 주기 동안 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드의 적어도 2개 복제물의 생산을 유도하는 폴리뉴클레오타이드의 활성에 관한 것이다. 따라서, 바람직하게는, 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 복제는 일련의 세포 분열 후 폴리뉴클레오타이드의 존재를 결정함으로써 결정되며, 여기서 비-복제 폴리뉴클레오타이드는 희석되어 나갈 것으로 예상되었을 것이다. 바람직하게는, 복제는 안정한 복제이다, 즉 폴리뉴클레오타이드가 평균 50회 세포 분열 후 숙주 세포 집단에서 여전히 검출 가능한 정도로의 복제이다. 바람직하게는, 숙주 세포 집단에서 폴리뉴클레오타이드의 검출은 표준 조건 하에 PCR에 의해 수행된다.
용어 "에피솜" 복제는, 원칙적으로, 세포 게놈 내로 통합되지 않는, 즉 세포 게놈 내로 공유 통합되지 않는, 폴리뉴클레오타이드의 복제에 관한 것으로 당업자에게 알려져 있다. 따라서, 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드의 에피솜 복제는 자율 복제 단위로서의 상기 폴리뉴클레오타이드의 복제이다. 바람직하게는, 에피솜 복제는 원형으로 폐쇄된 이중-가닥 DNA 분자 형태의 숙주 세포 내 폴리뉴클레오타이드의 유지이다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 상기 폴리뉴클레오타이드의 실제 복제에는 다른 형태, 예로 롤링 써클 복제에서의 형태가 관여될 수 있다. 원형 DNA의 에피솜 유지는 바람직하게는 당업자에게 알려진 플라스미드 구제 절차에 의해; 즉, 바람직하게는, 숙주 세포의 용해액을 제조하고 내부에 포함된 DNA를 적절한 박테리아 세포, 예로 대장균 세포 내로 형질전환함으로써 확인된다; 상기 방법에 의해 수득 가능한 적합한 수의 박테리아 콜로니가 원래 원형 DNA와 동일한 제한효소 패턴 및/또는 서열을 갖는 플라스미드로서 원형 DNA를 포함하는 경우, 바람직하게는, 원형 DNA가 에피솜으로 유지되는 것으로 추정된다. 또한 당업자에게 알려진, 에피솜 유지를 확인하는 추가 방법은, DNA/DNA 블로팅("써던 블롯" 방법)이다; 따라서, 바람직하게는, 숙주 세포의 전체 DNA는 하나 이상의 제한 효소(들)로 제조되고 소화된다; 탐침으로 원래 플라스미드를 사용하는 써던 블롯에서 원래 원형 DNA에 대응하는 밴드만 가시적인 경우, 바람직하게는 플라스미드가 에피솜으로 유지된다고 결론내린다. 보다 바람직하게는, 에피솜 유지는 실시예에서 본원에 기재된 바와 같이 확인된다.
따라서, 본원에서 사용되는 용어 "에피솜으로 복제하는"은, 상기 폴리뉴클레오타이드가 자율 복제 대상으로서 상기 세포에 존재하면서 세포 복제 주기 동안 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드의 적어도 2개 복제물의 생산을 유도하는 폴리뉴클레오타이드의 활성에 관한 것이며; 안정한 에피솜 복제는 폴리뉴클레오타이드가 적어도 50회 세포 분열 후 숙주 세포에서 여전히 검출 가능한 정도로의 에피솜 복제이다. 바람직하게는, 세포 분열의 상기 언급된 횟수는 세포 집단에 있어서의 평균 세포 분열 횟수이다.
유리하게는, 본 발명의 기저가 되는 작업에서, 특정된 바와 같은 스플라이싱 부위가 측면에 있는 S/MAR 요소를 발현 가능한 작제물 및 상기 S/MAR 요소를 해독하는 프로모터와 조합함으로써, 폴리뉴클레오타이드가 세포 게놈 내로 통합되거나 비-통합성 바이러스 벡터로서 유지되는 경우라도, 숙주 세포에서 높고 오래-지속되는 발현을 제공하는 폴리뉴클레오타이드가 수득됨이 확인되었다.
상기에서 이루어진 정의는 필요한 변경을 가하여 하기에 적용된다. 아래에서 추가 수행된 추가적인 정의 및 설명이 또한 본 명세서에 기재된 모든 구현예에 필요한 변경을 가하여 적용된다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "조성물"은 특정된 바와 같은 화합물 및 선택적으로 하나 이상의 허용 가능한 담체(들)를 포함하는 해당 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 조성물이다; 따라서, 바람직하게는, 담체는 약학적으로 허용 가능한 담체이다. 본 발명의 화합물은 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한, 염으로 제형화될 수 있다. 바람직한 염은 아세테이트, 메틸에스테르, HCl, 설페이트, 클로라이드 등을 포함한다.
담체(들)는 제형물의 다른 구성분과 상용성이고 이의 수신체에 유해하지 않은 개념에서 허용 가능해야 한다. 채택되는 담체는, 예를 들어, 고체, 겔 또는 액체일 수 있다. 고체 약학 담체의 예시는 락토스, 백토, 수크로스, 활석, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등이다. 액체 담체의 예시는 포스페이트-완충 식염수 용액, 시럽, 오일, 예컨대 땅콩 오일 및 올리브 오일, 물, 에멀젼, 다양한 유형의 수화제, 멸균 용액 등이다. 유사하게, 담체 또는 희석제에는 당분야에 잘 알려진 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노-스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 단독으로 또는 왁스와 함께 포함될 수 있다. 상기 적합한 담체는 상기 언급된 것들 및 당분야에 잘 알려진 다른 것들을 포함하며, 예로, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]을 참고한다. 희석제(들)는 조성물 중 화합물의 생물학적 활성에 영향을 주지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 생리 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 행크 용액이다. 또한, 약학 조성물 또는 제형물에는 다른 담체, 아주반트, 또는 무독성, 비치료용, 비면역원성 안정화제 등이 포함될 수 있다.
바람직하게는, 조성물은 숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오타이드의 진입을 매개한다. 따라서, 바람직하게는 조성물은 적어도 하나의 전달감염제를 포함한다. 적절한 전달감염제의 선택은 표적 숙주 세포뿐만 아니라 계획되는 구체적 적용에 의존할 수 있다. 전달감염제, 적절한 전달감염 조건뿐만 아니라 이에 대한 선택 기준은 당분야에 잘 알려져 있다. 또한 바람직하게는, 조성물은 바이러스-유사 입자를 포함한다. 따라서, 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스-유사 입자로 패키징된다, 즉 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스-유사 입자에 포함된다; 따라서, 보다 바람직하게는, 조성물은 특정된 바와 같이 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전 조작된 바이러스 입자를 포함한다. 바람직하게는, 바이러스-유사 입자 또는 바이러스 입자는 본원에서 상기 특정된 바와 같은 바이러스로부터 유래된다.
약학 조성물은, 바람직하게는, 국소 또는 전신 투여된다. 약물 투여를 위해 통상적으로 사용되는 적합한 투여 경로는 경구, 정맥내, 또는 비경구 투여뿐만 아니라 흡입이다. 그러나, 화합물의 성질 및 작용 방식에 따라, 약학 조성물은 다른 경로에 의해서도 투여될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 화합물은 본원에서 상기 특정된 바와 같이, 바이러스 벡터 또는 바이러스 또는 리포좀을 사용함으로써 유전자 치료 접근 방식으로 투여될 수 있다. 또한, 화합물은 공통 약학 조성물에서 또는 분리된 약학 조성물로서 다른 약물과 조합되어 투여될 수 있고 여기서 상기 분리된 약학 조성물은 부품 키트 형태로 제공될 수 있다. 화합물은, 바람직하게는, 통상적인 절차에 따라 약물을 표준 약학 담체와 조합함으로써 제조되는 통상적 투여형으로 투여된다. 이들 절차에는 원하는 제조물을 적절하게 구성분과 혼합, 과립화 및 압축 또는 용해시키는 것이 포함될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제의 형태 및 특징은 이것과 함께 조합될 활성 구성분의 양, 투여 경로 및 다른 잘 알려진 변수에 의해 지정됨이 이해될 것이다.
치료 유효 용량의 약학 조성물은 본 명세서에서 나타내는 질환 또는 병태에 동반되는 증상을 방지하거나, 완화하거나, 치료하는 본 발명의 약학 조성물에서 사용될 화합물의 양을 나타낸다. 이러한 화합물의 치료 유효성 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약학 절차, 예로 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량) 및 LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량)에 의해 결정될 수 있다. 치료 및 독성 효과 간 용량 비가 치료 지수이며, 비, LD50/ED50으로 표현될 수 있다.
투여량 요법은 주치의 및 다른 임상 요인에 의해; 바람직하게는 상술된 방법 중 어느 하나에 따라 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 환자에 대한 투여량은 환자의 체격, 체표면적, 연령, 투여될 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반 건강, 및 병행 투여되는 다른 약물을 포함하는 여러 요인에 따라 달라진다. 진행은 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 전형적인 용량은, 예를 들어, 1 내지 1000 μg 범위일 수 있다; 그러나, 상기 예시적인 범위보다 낮거나 높은 용량이, 특히 상기 언급된 요인을 고려하여 계획된다. 일반적으로, 약학 조성물의 정기 투여 요법은 1일 당 1 μg 내지 10 mg 단위의 범위일 것이다. 연속 주입요법인 경우, 이는 또한 각각 분 당, 체중 kg 당 1 μg 내지 10 mg 단위의 범위일 것이다. 진행은 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 그러나, 대상체 및 투여 방식에 따라, 성분 투여량은 약 0.01 mg/체질량 kg 내지 약 10 mg/체질량 kg을 제공하도록 넓은 범위에 걸쳐 변할 수 있다. 바이러스 벡터의 경우, 특히 아데노-연관 바이러스 벡터가 투여되는 경우, 바람직한 용량은 5 x 1011 내지 2 x 1013 바이러스 입자 또는 바이러스 게놈/체중 kg이다; 이해될 바와 같이, 이들 예시적 용량은 상술된 요인에 추가하여, 바이러스 유형, 표적 기관 등과 같은 추가적인 요인에 따라 변형될 수 있다.
본원에서 나타내는 약학 조성물 및 제형물은 본 명세서에서 인용되는 질환 또는 병태를 치료하거나 완화하거나 방지하기 위해 적어도 1회 투여된다. 그러나, 상기 약학 조성물은 1일 1회 초과, 예를 들어 1일 1회 내지 4회에서 최대 제한되지 않는 일수까지 투여될 수 있다.
특정 약학 조성물은 약학 분야에 잘 알려진 방식으로 제조되며 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와의 혼합물로 또는 달리 연합된 본원에서 상기 나타내는 적어도 하나의 활성 화합물을 포함한다. 이들 특정 약학 조성물을 제조하기 위해, 활성 화합물(들)은 보통 담체 또는 희석제와 혼합되거나, 캡슐, 사체트, 카체트, 종이 또는 다른 적합한 용기 또는 비히클 중에 밀봉되거나 캡슐화될 것이다. 생성 제형물은 투여 방식에, 즉 정제, 캡슐, 좌약, 용액, 현탁액 등의 형태로 채택되어야 한다. 투여량 권장은 고려되는 수신체에 따른 용량 조정을 예상하기 위해 처방자 또는 사용자 지침에 나타내야 한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른, 바람직하게는 그 게놈 내로 통합된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의약에서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 유전 질환의 치료에서 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "유전 질환"은 개체의 게놈에서 하나 이상의 변형, 바람직하게는 돌연변이와 인과적으로 연관된 질환에 관한 것이다. 따라서, 바람직하게는, 유전 질환은 하나 이상의 후성적 변화와 인과적으로 연관되며, 보다 바람직하게는 하나 이상의 유전적 돌연변이와 인과적으로 연관된다. 이해될 바와 같이, 유전 질환의 증상은 종종 하나 이상의 특정 조직(들) 및/또는 세포 유형(들)에서 유전자 산물의 정상 기능을 제공하는 유전자의 발현 부재 및/또는 돌연변이된 유전자의 발현에 의해 발생된다. 따라서, 돌연변이가 질환에 기여하는 세포에서만 유전 질환을 치료하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 유전 질환은 단일유전자 질환이다, 즉 하나의 유전자에서의 유전적 변경에 의해 발생한다. 보다 바람직하게는, 유전 질환은 단일유전자 열성 질환이다, 즉 유전자의 두 대립유전자 모두에서의 유전적 변경에 의해 발생한다; 따라서, 바람직하게는, 이환 유전자의 적어도 하나의 변경되지 않은 카피의 제공에 의해 증상의 완화가 예상된다. 가장 바람직하게는, 유전 질환은 페닐케톤뇨증, 알캅톤뇨증, 레버 선천성 흑암시, 범맥락막위축, 혈우병, 어셔병, 또는 스타가르트병이다. 바람직한 구현예에서, 유전 질환은 암이다.
용어 "치료하는" 및 "치료"는 본원에서 나타내는 질환 또는 장애 또는 이에 동반된 증상의 상당한 정도까지의 완화를 나타낸다. 본원에서 사용되는 상기 치료에는 또한 본원에서 나타내는 질환 또는 장애에 관한 건강의 전체 복원이 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 치료가 치료받을 모든 대상체에서 효과적이 아닐 수 있음이 이해되어야 한다. 그러나, 이 용어는, 바람직하게는, 본원에서 나타내는 질환 또는 장애를 앓는 대상체의 통계적으로 유의미한 부분이 성공적으로 치료될 수 있음을 필요로 할 것이다. 부분이 통계적으로 유의미한지 여부는 다양한 잘 알려진 통계적 평가 도구, 예로, 신뢰도 구간의 결정, p-값 결정, 스튜던트 t-평가, 만-휘트니 평가 등을 사용하여 당업자에 의해 더 이상의 어려움 없이 결정될 수 있다. 바람직한 신뢰도 구간은 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%이다. p-값은, 바람직하게는, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 또는 0.0001이다. 바람직하게는, 치료는 주어진 코호트 또는 집단의 대상체의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%에 대해 효과적일 것이다.
용어 "대상체"는 후생동물 유기체에 관한 것이다. 바람직하게는, 대상체는 동물, 보다 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간이다. 바람직하게는, 대상체는 본원에서 상기 특정된 바와 같은 유전 질환을 앓고 있다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하는 장치에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "장치"는 본 발명의 화합물 또는 조성물의 투여를 허용하기 위해 적어도 서로에 대해 작동 가능하게 연결된 수단을 포함하는 수단의 시스템에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드, 조성물, 또는 숙주 세포를 투여하기 위한 바람직한 수단은 당분야에 잘 알려져 있다. 작동하는 방식으로 수단을 연결하는 방법은 장치 내에 포함된 수단의 유형 및 계획되는 투여의 종류에 따라 다를 것이다. 바람직하게는, 수단은 이러한 경우에 단일 장치에 의해 포함된다. 이에 따라 상기 장치에는 화합물 또는 조성물의 투여를 위한 전달부 및 투여 시까지 상기 화합물 또는 조성물을 보관하기 위한 보관부가 포함될 수 있다. 그러나, 본 발명의 수단이 이러한 구현예에서 별도 장치로 나타날 수 있고, 바람직하게는, 키트로서 함께 패키징될 수 있는 점도 고려된다. 당업자는 더 이상의 어려움 없이 수단을 연결하는 방법을 인식할 것이다. 바람직한 장치는 전문 기술자의 특별한 지식 없이도 적용될 수 있는 것들이다. 바람직한 구현예에서, 장치는 본 발명의 화합물 또는 조성물을 포함하는, 보다 바람직하게는 바늘이 있는, 주사기이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 장치는 화합물 또는 조성물을 포함하는 정맥내 주입(IV) 설비이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 장치는 투여 부위를 플러싱하기 위한 화합물 또는 약제를 포함하거나, 예로 종양에, 화합물 또는 조성물을 국소 적용하기 위한 바늘을 추가로 포함하는, 내시경 장치이다. 또 다른 바람직한 구현예에서 장치는 본 발명의 화합물을 포함하는 흡입장치이며, 여기서 보다 바람직하게는, 상기 화합물은 에어로졸 투여용으로 제형화된다.
본 출원은 또한, 하기 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 발현 가능한 작제물을 안정하게 발현하는 방법에 관한 것이다:
a) 상기 숙주 세포를 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 단계, 및,
b) 이에 따라, 숙주 세포에서 발현 가능한 작제물을 안정하게 발현하는 단계.
본 발명의 숙주 세포에서 발현 가능한 작제물을 안정하게 발현하는 방법은, 바람직하게는, 시험관내 방법이다. 또한, 이는 상기 명시적으로 언급된 것들에 추가 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는, 예로, 단계 a)에 대한 것과 동일한 것을 포함하는 숙주 세포 또는 샘플을 제공하고, 및/또는 접촉된 숙주 세포에 대해 선택적 압력을 적용하는 것이 관련될 수 있다. 또한, 하나 이상의 상기 단계는 자동화된 설비에 의해 수행될 수 있다.
숙주 세포에서 용어 "안정하게 발현하는"은 당업자에 의해, 발현 가능한 작제물이 본원에서 상기 특정된 바와 같이 숙주 세포에 의해 안정하게 발현되도록 발현 가능한 작제물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 이종성 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하는 것에 관한 것임이 이해된다. 바람직하게는, 안정한 전달감염은 폴리뉴클레오타이드의 안정한 에피솜 복제를 포함하지 않는다. 바람직하게는, 안정한 발현은, 접촉 후, 선별 마커의 존재를 선택하기 위해 숙주 세포에 선택적 압력을 가하는 것을 포함한다. 선택적 압력은 접촉 후 적용되며, 선택적으로 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포 내에 확립하도록 허용하는 첫 번째 시간 프레임을 제외한다; 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포 내에 확립하도록 허용하는 상기 첫 번째 시간 프레임 기간은 대부분 접촉되는 숙주 세포의 유형 그리고 사용되는 선별 마커의 종류에 따라 달라질 것이다; 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포 내에 확립하도록 허용하는 상기 첫 번째 시간 프레임의 기간은 1 내지 48시간, 보다 바람직하게는 2 내지 24시간, 가장 바람직하게는 3 내지 16시간이다. 그러나, 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포 내에 확립하도록 허용하는 상기 첫 번째 시간 프레임의 기간은 또한 0일 수 있다, 즉 선택적 압력이 접촉 직후 또는 접촉 동안에도 적용될 수 있다. 선택적 압력은 연속적으로, 즉 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포 내에 확립하도록 허용하는 첫 번째 시간 프레임 후 본질적으로 모든 시점에, 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는 숙주 세포가 증식하는 것을 방지하기 위해 적용될 수 있거나; 일시적으로, 보다 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드를 수여받지 않은 세포를 제거하기 위해 적용될 수 있다. 바람직하게는, 선택적 압력의 일시적 적용은 폴리뉴클레오타이드가 통합성 작제물인 경우 또는 세포가 상기 접촉 후 유기체 내로 다시 전달되는 경우에 사용된다. 그러나, 선택적 압력이 적용되지 않는, 특히 폴리뉴클레오타이드의 표적 숙주 세포 내로의 전달 효율이 충분히 높은 것으로 알려진 경우 및/또는 트랜스제닉 숙주 세포의 순수한 집단이 크게 중요하지 않은 경우도 예상된다. 바람직한 구현예에서, 안정하게 전달감염된 세포집단은 또한 발현 가능한 작제물이 본원에서 상기 특정된 바와 같이 발현될 검출 가능한 폴리펩타이드를 인코딩하는 것을 허용하고, 카고(cargo) 서열을 발현하는 세포를, 예로 세포 정렬, 바람직하게는 FACS에 의해 선택함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 방법과 관련하여 사용되는 용어 "접촉"은 당업자에 의해 이해된다. 바람직하게는, 이 용어는 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 숙주 세포와 물리적으로 접촉시키는, 예로 숙주 세포 및 화합물(들)이 상호작용하도록 허용하는 것에 관한 것이다. 바람직하게는, 접촉에는, 바람직하게는 상기 특정된 바와 같은 전달 수단을 통한, 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드의 숙주 세포 내부로의 전달이 포함된다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 유전 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다:
a) 상기 대상체를 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포와 접촉시키는 단계, 및
b) 이에 따라, 상기 대상체에서 유전 질환을 치료하는 단계.
본 발명의 유전 질환을 치료하는 방법은, 바람직하게는, 생체내 방법이다. 또한, 이는 상기 명시적으로 언급된 것들 외에 추가 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는, 예로, 단계 a)에 대한 것과 동일한 것을 포함하는 숙주 세포 또는 샘플을 제공하는 것, 및/또는 대상체 내로의 상기 샘플 또는 숙주 세포의 재-투여에 관한 것일 수 있다. 따라서, 유전 질환을 치료하는 방법은, 상기 특정된 바와 같이 숙주 세포를 안정하게 전달감염시키는 방법의 단계를 포함한다. 또한, 하나 이상의 상기 단계는 자동화된 설비에 의해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 숙주 세포를 안정하게 유전적으로 변형하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 그리고 유전 질환, 바람직하게는 단일유전자 질환, 보다 바람직하게는 단일유전자 열성 질환, 가장 바람직하게는 F의 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 유전 질환은 본원에서 상기 특정된 바와 같이, 암이다.
또한, 본 발명은 일차 세포, 바람직하게는 일차 피부 섬유아세포의 유전적 변형을 위한, 유도된 다능성 줄기 세포(IPSC)의 생성을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 일차 세포는 마우스 또는 인간 일차 세포이다.
용어 "일차 세포"는 배양된 세포주의 세포와 대비되어 당업자에 의해 이해된다; 따라서, 바람직하게는, 일차 세포는 생명체로부터 유래되고 최대 20 계대, 보다 바람직하게는 최대 15 계대, 더욱 바람직하게는 최대 10 계대, 보다 더 바람직하게는 최대 5 계대 동안 배양된 세포이다. 가장 바람직하게는, 일차 세포는 생명체, 바람직하게는 마우스 또는 인간의 조직으로부터 직접 유래된 세포이다.
용어 "줄기 세포"는 또한 적어도 2개 세포 유형, 바람직하게는 적어도 5개 세포 유형, 보다 바람직하게는 적어도 하나의 전체 세포 계통으로의 분화에 대한 잠재력을 갖는 비- 또는 저-분화된 세포에 관한 것으로 당업자에 의해 이해된다. 바람직하게는, 줄기 세포는 전능 줄기 세포, 보다 바람직하게는 다능성 줄기 세포이다. 용어 "유도된 다능성 줄기 세포" 또는 "IPSC"는 분화된 세포, 바람직하게는 분화된 일차 세포로부터 유래된 다능성 줄기 세포에 관한 것이다. IPSC를 생성하는 방법은 당분야에 알려져 있으며, 바람직하게는, 세포에서의 4개 전사 인자(예로, 문헌[Takahashi et al. (2006), Cell. 126 (4):663]으로부터의)의 발현이 포함된다.
본 발명은 또한 배아 줄기 세포, 바람직하게는 비-인간 배아 줄기 세포의 유전적 변형을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에서 상기 특정된 바와 같은 유전 질환의 치료용 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이며, 바람직하게는 여기서 상기 약제는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
본 발명은 또한, 트랜스제닉 동물, 바람직하게는 비-인간 동물을 생성하기 위한 줄기 세포의 유전적 변형을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 트랜스제닉 동물, 바람직하게는 비-인간 동물의 생산을 위한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "트랜스제닉 동물"은, 바람직하게는 유전 조작 방법에 의해 상기 동물 내로 도입된, 적어도 하나의 이종성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 동물에 관한 것이다. 바람직하게는, 트랜스제닉 동물은 본 발명에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의, 보다 바람직하게는 적어도 10개의, 보다 더 바람직하게는 적어도 1000개의, 더욱 바람직하게는 적어도 10000개의 세포를 포함한다.
또한, 본 발명은 전핵 주입에 의한, 단세포 배아, 바람직하게는 비-인간 단세포 배아의 유전적 변형을 위한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 본 발명에 따른 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 용어 "전핵 주입"은 바람직하게는 트랜스제닉 동물, 바람직하게는 비-인간 동물을 생성하기 위해, 수정된 난모세포의 핵 내로의 유전 물질, 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 주입에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 숙주 세포에서 유전자 발현을 변형하는 데 있어서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 발현 가능한 작제물의 하류에 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있는 S/MAR 요소를 포함시키는 단계를 포함하는, 프로모터 및 발현 가능한 작제물을 포함하는 진핵 발현 작제물의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 S/MAR 요소의 측면에 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체를 포함시키는 단계를 포함하는, 프로모터, 발현 가능한 작제물, 및 S/MAR 요소를 포함하는 진핵 발현 작제물의 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 진핵 발현 작제물의 발현을 증가시키기 위한 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있는 S/MAR 요소의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 S/MAR 요소를 포함하는 진핵 발현 작제물의 발현을 증가시키기 위한 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체의 용도에 관한 것이다.
진핵 발현 작제물의 발현을 증가시키는 방법 및 용도는, 바람직하게는, 시험관내 방법 또는 용도이다. 그러나, 이들은, 바람직하게는, 또한, 예로 치료 방법의 일환으로서, 생체내 방법 또는 용도일 수 있다. 방법 및 용도는 구체적으로 언급된 것들에 부가하여 추가 단계를 포함할 수 있다. 추가적인 단계는, 예로 개선된 발현이 요망되는 숙주 세포의 제공, 상기 진핵 발현 작제물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 제공, 숙주 세포와 상기 폴리뉴클레오타이드의 접촉, 상기 접촉 후 상기 숙주 세포의 인큐베이션, 상기 진핵 발현 작제물의 산물 수확에 관한 것일 수 있다. 방법 또는 용도가 생체내 방법 또는 용도인 경우, 이는 대상체에 접촉된 세포를 투여하는 단계 또는 재투여하는 단계를 포함할 수 있다.
용어 "진핵 발현 작제물"은 둘 다 본원에서 상기 특정된 바와 같은, 적어도 발현 가능한 작제물 및 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것임이 당업자에 의해 이해되며, 이는 발현 가능한 작제물이 진핵 세포, 바람직하게는 숙주 세포에서 발현되도록 유도한다. 바람직하게는, 진핵 발현 작제물은 본원에서 상기 특정된 바와 같은 추가 발현 제어 서열, 특히 전사 종결인자를 포함한다.
용어 "발현 증가"는 S/MAR 요소만을, 즉, 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있지 않은 S/MAR 요소를 포함하는 발현 작제물에 비해 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있는 S/MAR 요소를 포함하는 진핵 발현 작제물의 발현 증가에 관한 것으로 이해된다. 바람직하게는, 발현 증가는 전사 증가이다. 보다 바람직하게는, 발현 증가는 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함하는 발현 가능한 작제물의 전사 증가에 의한 폴리펩타이드의 생산 증가이다.
상기 측면에서, 하기 구현예가 바람직하다:
1. 적어도 하나의 프로모터, 적어도 하나의 발현 가능한 작제물, 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 통합 작제물 또는 비-통합성 벡터 작제물이고, 상기 S/MAR 요소가 상기 프로모터 및 상기 발현 가능한 작제물의 상류에 위치하고, 상기 S/MAR 요소는 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있는 폴리뉴클레오타이드.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 통합 작제물 또는 비-통합성 바이러스 벡터 작제물인 폴리뉴클레오타이드.
3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 통합 작제물인 폴리뉴클레오타이드.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 통합 작제물이 적어도 하나의 통합 신호를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
5. 구현예 4에 있어서, 상기 통합 신호가 선형 폴리뉴클레오타이드의 자유 말단, 재조합효소 인식 서열, 바이러스 통합 신호, 또는 전위 가능한 요소인 폴리뉴클레오타이드.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드에 진핵 복제 기원이 없고, 바람직하게는 복제 기원이 없는 폴리뉴클레오타이드.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포에서, 바람직하게는 포유류 세포에서 에피솜으로 복제하지 않는 폴리뉴클레오타이드.
8. 구현예 1 또는 3에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 비-통합성 바이러스 벡터 작제물인 폴리뉴클레오타이드.
9. 구현예 8에 있어서, 상기 비-통합성 바이러스 벡터 작제물이 비-통합성 렌티바이러스 작제물, 아데노-연관 바이러스 작제물, 시미안 바이러스 40 작제물, 유두종바이러스 작제물, 아데노바이러스 작제물, 간염 바이러스 작제물, 또는 헤르페스바이러스 작제물인 폴리뉴클레오타이드.
10. 구현예 8 또는 9에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포에서, 바람직하게는 포유류 세포에서 에피솜으로 복제하는 폴리뉴클레오타이드.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 발현 가능한 작제물이 폴리펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열, siRNA를 인코딩하는 서열, miRNA를 인코딩하는 서열, 안티센스 RNA를 인코딩하는 서열, 및/또는 리보자임을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 치료용 폴리펩타이드, 바람직하게는 인간 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 바람직하게는 MART1 TCR인 폴리뉴클레오타이드.
13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 발현 가능한 작제물이 선별 마커를 인코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 발현 가능한 작제물이 적어도 2개의 코딩 서열을 포함하며, 바람직하게는 그 중 하나가 선별 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 발현 가능한 작제물이 선별 마커를 인코딩하는 코딩 서열(선별 마커 서열)을 포함하며, 상기 프로모터 및 상기 선별 마커 서열이 함께 선별 마커 유전자를 구성하고, 상기 선별 마커가 진핵 세포의 선별 마커인 폴리뉴클레오타이드.
16. 구현예 15에 있어서, 상기 선별 마커 유전자가 퓨로마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 또는 제오신 내성 유전자이고, 바람직하게는 퓨로마이신 내성 유전자인 폴리뉴클레오타이드.
17. 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 전사체가 상기 프로모터로부터 전사되고, 이 전사체로부터 S/MAR 요소의 서열이 스플라이스되어 나오는 폴리뉴클레오타이드.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, S/MAR 요소 하류의 폴리-A 신호가 상기 스플라이싱에서 보유되는 폴리뉴클레오타이드.
19. 구현예 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 숙주 세포가 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포인 폴리뉴클레오타이드.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드에 임의의 동원체 및/또는 말단소체 서열이 없는 폴리뉴클레오타이드.
21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 프로모터의 상류에 전사 인슐레이터 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
22. 구현예 21에 있어서, 상기 인슐레이터 요소가 요소-40 및/또는 S/MAR 요소인 폴리뉴클레오타이드.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터 및 발현 가능한 작제물이 적어도 하나의 인슐레이션 요소의 존재에 의해, 보다 바람직하게는 인슐레이션 요소가 측면에 있음으로써 폴리뉴클레오타이드에 포함된 잔여 서열과 절연되는 폴리뉴클레오타이드.
24. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
25. 바람직하게는 그 게놈 내로 통합된, 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
26. 구현예 25에 있어서, 상기 숙주 세포가 CD34+ 전구 세포; CD61+ 혈소판; CD19+ B-림프구; CD14+ 단핵구; CD15+ 과립구; 바람직하게는 또한 CD8 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 세포독성 T-림프구; 바람직하게는 또한 CD4 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 헬퍼 T-림프구; 바람직하게는 또한 CD25 및 CD45에 대해 양성인, CD3+ 활성화 T-림프구, 종양 침윤 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 유도된 다능성 줄기 세포(IPS) 세포, 기도 상피 세포, 섬유아세포, 또는 망막 상피 세포인 숙주 세포.
27. 구현예 25 또는 26에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 숙주 세포의 염색체에 공유 결합된 숙주 세포.
28. 의약에서 사용하기 위한 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드, 구현예 24에 따른 조성물, 및/또는 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에 따른 숙주 세포.
29. 유전 질환의 치료에서 사용하기 위한 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드, 구현예 24에 따른 조성물, 및/또는 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에 따른 숙주 세포.
30. 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드, 구현예 24에 따른 조성물, 및/또는 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에 따른 숙주 세포를 포함하는 장치.
31. 하기 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 발현 가능한 작제물을 안정하게 발현하는 방법:
a) 상기 숙주 세포를 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 구현예 24에 따른 조성물과 접촉시키는 단계, 및
b) 이에 따라, 숙주 세포에서 발현 가능한 작제물을 안정하게 발현하는 단계.
32. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 유전 질환을 치료하는 방법:
a) 상기 대상체를 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드, 구현예 24에 따른 조성물, 및/또는 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에 따른 숙주 세포와 접촉시키는 단계, 및
b) 이에 따라, 상기 대상체에서 유전 질환을 치료하는 단계.
33. 숙주 세포를 안정하게 유전적으로 변형하기 위한, 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 구현예 24에 따른 조성물의 용도.
34. 숙주 세포를 안정하게 유전적으로 변형하기 위한, 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드, 구현예 24에 따른 조성물, 및/또는 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에 따른 숙주 세포의 용도.
35. 약제의 제조를 위한, 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드, 구현예 24에 따른 조성물, 및/또는 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에 따른 숙주 세포의 용도.
36. 유전 질환, 바람직하게는 단일유전자 질환, 보다 바람직하게는 단일유전자 열성 질환, 가장 바람직하게는 페닐케톤뇨증, 알캅톤뇨증, 레버 선천성 흑암시, 범맥락막위축, 또는 스타가르트병의 치료용 약제의 제조를 위한, 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드, 구현예 24에 따른 조성물, 및/또는 구현예 25 내지 27 중 어느 하나에 따른 숙주 세포의 용도.
37. 상기 발현 가능한 작제물의 하류에 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있는 S/MAR 요소를 포함시키는 단계를 포함하는, 프로모터 및 발현 가능한 작제물을 포함하는 진핵 발현 작제물의 발현을 증가시키는 방법.
38. 구현예 37에 있어서, 상기 진핵 발현 작제물이 전사 종결인자를 추가로 포함하는 방법.
39. 구현예에 있어서, 상기 S/MAR 요소가 상기 발현 가능한 작제물 및 상기 전사 종결인자 간에 포함되는 방법.
40. 구현예 37 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 S/MAR 요소가 상기 프로모터에서 개시된 일차 전사체로부터 스플라이스되어 나오는 방법.
41. 구현예 37 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 구현예 24에 따른 조성물을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
42. 구현예 37 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 숙주 세포를 상기 발현 작제물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 구현예 24에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
43. 진핵 발현 작제물의 발현을 증가시키기 위한 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있는 S/MAR 요소의 용도.
44. 구현예 43에 있어서, 상기 진핵 발현 작제물이 프로모터 및 발현 가능한 작제물을 포함하는 용도.
45. 구현예 44에 있어서, 상기 용도가 상기 발현 가능한 작제물의 하류에 상기 S/MAR 요소를 포함시키는 것을 포함하는 용도.
46. 구현예 44 또는 45에 있어서, 상기 진핵 발현 작제물이 전사 종결인자를 추가로 포함하는 용도.
47. 구현예 46에 있어서, 상기 용도가 상기 발현 가능한 작제물 및 상기 전사 종결인자 간 상기 S/MAR 요소를 포함시키는 것을 포함하는 용도.
48. 구현예 43 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 상기 용도가 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 구현예 24에 따른 조성물을 제공하는 것을 포함하는 용도.
49. 구현예 43 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 용도가 숙주 세포를 상기 발현 작제물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 구현예 1 내지 23 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 구현예 24에 따른 조성물과 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 용도.
본 명세서에서 인용되는 모든 참고문헌은 이의 전체 개시 내용 및 본 명세서에서 구체적으로 언급된 개시 내용에 관한 참조로서 본원에 포함된다.
도 1: 발현 카세트의 도식적 표시. a) GFP-S/MAR 벡터. 발현 카세트는 자가-절단 서열 P2A에 의해 구분된 리포터 유전자 GFP 및 선별 마커 퓨로마이신의 발현을 유도하는 도처(ubiquitous) 프로모터(프로모터)로 구성된다. 발현 카세트에는 S/MAR 서열 및 전사 종결인자(폴리A)가 뒤따른다. b) 발현 카세트는 동일한 요소로 구성되지만, S/MAR 서열은 스플라이싱 공여체(SD) 및 스플라이싱 수신체(SA) 부위가 측면에 있다.
도 2: GFP-S/MAR 및 GFP-S/MAR스플라이스 벡터로 확립된 Hek293T 세포 집단을 유세포 측정에 의해 DNA 전달 및 퓨로마이신(0.5 ug/ml) 중 선택 35일 후 트랜스유전자 발현에 대해 분석하였다(a). 트랜스유전자 GFP의 상대 발현을 평가하고 하우스키핑 유전자 GAPDH의 발현에 대해 정상화하였다(b). 도면은 스플라이싱 서열의 도입이 세포에서 RNA 양을 증강시킴으로써 트랜스유전자 발현을 개선함을 나타낸다.
도 3: 트랜스포존 매개 발현 카세트의 도식적 표시. a) GFP-S/MAR 벡터. 발현 카세트는 자가-절단 서열 P2A에 의해 구분된 리포터 유전자 GFP 및 선별 마커 퓨로마이신의 발현을 유도하는 도처 프로모터(프로모터)로 구성된다. 5' 및 3' ITR은 발현 카세트 전위 및 세포 표적 게놈 내로의 통합을 매개한 서열이다. 발현 카세트에는 S/MAR 서열 및 전사 종결인자(폴리A)가 뒤따른다. b) 발현 카세트는 동일한 요소로 구성되지만, S/MAR 서열은 스플라이싱 공여체(SD) 및 스플라이싱 수신체(SA) 부위가 측면에 있다.
도 4: 콜로니 형성 검정(a) 및 확립된 세포에서의 트랜스유전자 발현 분석(b). 안정하게 발현하는 세포의 생성 효율을 콜로니 형성 검정에 의해 평가하였다. Hek293T 내로의 DNA 전달 후, GFP 트랜스유전자 발현에 대해 양성인 세포를 FACS 정렬(FACS Aria II)을 통해 단리하고 6 cm 세포 배양 디쉬 내로 접종하였다. 이어서 이들을 1 μg/ml 퓨로마이신의 존재 하에 3주 동안 배양하였다. 3주 후, 세포를 PFA로 고정하고, 크리스털 바이올렛(Crystal Violet)으로 염색하고 계수하였다. 콜로니의 수를 벡터 확립의 효율로 간주한다. 안정한 세포주의 생성은 작제물 번호 2로 현저히 더 효과적이며 여기서 MAR 서열은 스플라이싱 부위가 측면에 있다(p<0.00001). 트랜스유전자 GFP의 발현을 세포 집단의 형광 세기로 확립된 Heks293T에서 평가하였다. 리포터 유전자 GFP의 발현은 작제물 2로 변형된 Hek293T 세포에서 현저하게 더 높다(p<0.05); 1 = GFP-Puro-S/MAR, 2 = GFP-Puro-S/MAR 스플라이스.
하기 실시예는 본 발명을 단순 예시할 것이다. 이들은 어떻게든, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되서는 안 된다.
실시예 1: 도 1에 나타낸 바와 같은 선형 작제물을 정제하고 Hek293T 세포 내로 전달감염시켰다. 세포를 퓨로마이신(0.5 μg/ml)을 함유하는 배지 중에 35일 동안 선택하고, 이후 FACS에서의 상대 GFP 발현(GAPDH 대비 GFP RNA의 양) 및 평균 형광 세기(MFI)를 결정하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 트랜스유전자 mRNA 및 단백질 수준은 S/MAR 서열의 측면에 있는 스플라이싱 부위에 의해 증가된다.
SEQUENCE LISTING <110> Deutsches Krebsforschungszentrum <120> Expression constructs for the genetic modification of Cells <130> DK15777EP <150> EP19163509.3 <151> 2019-03-18 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atta 4 <210> 2 <211> 5 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 attta 5 <210> 3 <211> 11 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 taaatatttt a 11 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 attataaata ttttaatta 19 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atttaattat aaatatttta atta 24 <210> 6 <211> 525 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atttataaaa tattgaatta taaaatatgt aattataaat actttaatta taaaatatgt 60 aattataaat actttaatta taaaatatgt aattataaat actttataaa atatgtaatt 120 ataaaatatg taattataaa cattttaatt ataaaatatg taattataaa cattttaatt 180 ataaaatatg taattataaa cattttaatt ataaaatatg taattataaa cattttaatt 240 ataaaatatg taattataaa cattttaatt ataaaatatt taattataaa cattttaatt 300 ataaaatatt taattataaa tattttaatt 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gtgtgggtcg cggacgacgg cgccgcggtg 1800 gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg 1860 cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc aacagatgga aggcctcctg 1920 gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca ccgtcggcgt ctcgcccgac 1980 caccagggca agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc 2040 gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg 2100 ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg 2160 acccgcaagc ccggtgcctg aagatctatg catgcagaag ttggtcgtga ggcactgggc 2220 aggtaagtat caaggttaca agacaggtcg acttctccac tcctggcagg ctgagtgaaa 2280 taaaggactt gttatttcat ctcgaggcct accggagagc cttgccttgc aaaggcagac 2340 agtcagtgag gaagactatg tggcacatga agacaccaga ggtgttcctc aggatcaaag 2400 tatgtacaag cctttgtgaa tattttttcc ttctcacttg gcaaatacaa ttcctgagat 2460 caataacctc gtctttttaa ttttttcctc gtctttttaa ctatttataa aatattgaat 2520 tataaaatat gtaattataa atactttaat tataaaatat gtaattataa atactttaat 2580 tataaaatat gtaattataa atactttata 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tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag 4320 ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca 4380 ggcatcgcca tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgctcgcct tgagcctggc 4440 gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag 4500 accggcttcc atccgagtac gtgctctctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg 4560 gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt 4620 ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag 4680 ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc gagtacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt 4740 ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc ttgcagttca ttcagggcac cggacaggtc 4800 ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga 4860 gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg 4920 agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat cataatatta ttgaagcatt tatcagggtt 4980 cgtctcgtcc cggtctcctc ccatgcatgt caatattggc cattagccat attattcatt 5040 ggttatatag cataaatcaa tattggctat tggccattgc atacgttgta tctatatcat 5100 aatatgtaca aagcttgatc aagaaagcac 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aagatttaga gcaaagcatg agatgtgtgg 300 ggatagacag tgaggctgat aaaatagagt agagctcaga aacagaccca ttgatatatg 360 taagtgacct atgaaaaaaa tatggcattt tacaatggga aaatgatgat ctttttcttt 420 tttagaaaaa cagggaaata tatttatatg taaaaaataa aagggaaccc atatgtcata 480 ccatacacac aaaaaaattc cagtgaatta taagtctaaa tggagaaggc aaaactttaa 540 atcttttaga aaataatata gaagcatgcc atcatgactt cagtgtagag aaaaatttct 600 tatgactcaa agtcctaacc acaaagaaaa gattgttaat tagattgcat gaatattaag 660 acttattttt aaaattaaaa aaccattaag aaaagtcagg ccatagaatg acagaaaata 720 tttgcaacac cccagtaaag agaattgtaa tatgcagatt ataaaaagaa gtcttacaaa 780 tcagtaaaaa ataaaactag acaaaaattt gaacagatga aagagaaact ctaaataatc 840 attacacatg agaaactcaa tctcagaaat cagagaacta tcattgcata tacactaaat 900 tagagaaata ttaaaaggct aagtaacatc tgtggcaata ttgatggtat ataaccttga 960 tatgatgtga tgagaacagt actttacccc atgggcttcc tccccaaacc cttaccccag 1020 tataaatcat gacaaatata ctttaaaaac cattacccta tatctaacca gtactcctca 1080 aaactgtcaa ggtcatcaaa aataagaaaa gtctgaggaa 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tttttttctt taaatatctt 1980 gatagaattc 1990

Claims (15)

  1. 적어도 하나의 프로모터, 적어도 하나의 발현 가능한 작제물, 및 S/MAR 요소를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 통합 작제물 또는 비-통합성 벡터 작제물이며, 상기 S/MAR 요소는 상기 프로모터 및 상기 발현 가능한 작제물의 하류에 위치하고, 상기 S/MAR 요소는 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있고, 그리고 상기 폴리뉴클레오타이드는 통합 작제물인 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 통합 신호를 포함하는 통합 작제물이며, 바람직하게 상기 통합 신호는 선형 폴리뉴클레오타이드의 자유 말단, 바이러스 통합 신호, 또는 전위 가능한 요소인 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 비-통합성 바이러스 벡터 작제물, 바람직하게는 비-통합성 렌티바이러스 작제물, 아데노-연관 바이러스 작제물, 시미안 바이러스 40 작제물, 유두종바이러스 작제물, 아데노바이러스 작제물, 간염 바이러스 작제물, 또는 헤르페스바이러스 작제물인 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 가능한 작제물은 폴리펩타이드를 인코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열, siRNA를 인코딩하는 서열, miRNA를 인코딩하는 서열, 안티센스 RNA를 인코딩하는 서열, 및/또는 리보자임을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 치료용 폴리펩타이드, 바람직하게는 인간 T 세포 수용체(TCR), 키메라 항원 수용체(CAR), 바람직하게는 MART1 TCR인 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 전사체는 상기 프로모터로부터 전사되며, 이 전사체로부터 S/MAR 요소의 서열이 스플라이싱되어 나오는 폴리뉴클레오타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포로서, 바람직하게는 그 게놈 내로 통합된 숙주 세포.
  9. 의약에서 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제7항에 따른 조성물, 및/또는 제8항에 따른 숙주 세포.
  10. 유전 질환의 치료에서 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 제7항에 따른 조성물, 및/또는 제8항에 따른 숙주 세포.
  11. 숙주 세포를 안정하게 유전적으로 변형하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 및/또는 제7항에 따른 조성물의 용도.
  12. 프로모터 및 발현 가능한 작제물을 포함하는 진핵 발현 작제물의 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 발현 가능한 작제물의 하류에 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있는 S/MAR 요소를 포함시키는 단계를 포함하는 방법.
  13. 진핵 발현 작제물의 발현을 증가시키기 위한 스플라이스 공여체 및 스플라이스 수신체가 측면에 있는 S/MAR 요소의 용도.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계를 포함하는 방법 또는 용도.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 상기 진핵 발현 작제물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법 또는 용도.
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