DE69834022T2

DE69834022T2 - Fusionproteine für intra- und interzelluläre transport und deren verwendungen

Info

Publication number: DE69834022T2
Application number: DE69834022T
Authority: DE
Inventors: Francis Peter O'HARE; Daphne Gillian ELLIOTT
Original assignee: Marie Curie Cancer Care
Current assignee: Marie Curie Cancer Care
Priority date: 1997-01-23
Filing date: 1998-01-23
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2018-01-24
Also published as: AU5674998A; WO1998032866A1; US20020106378A1; ATE321869T1; AU735830B2; US6251398B1; ES2264809T3; DE69834022D1; EP0961829A1; US20040197346A1; US6017735A; EP0961829B1; JP2001508304A; CA2278002A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbesserungen, Modifikationen und Entwicklungen bezüglich Transportproteinen, intrazellulärem Transport und deren Anwendungen. In speziellen Ausführungsformen betrifft die Erfindung Fusionsproteine, die Transportproteine umfassen, welche Sequenzen aus dem Herpesvirus-VP22 oder aus Homologen oder Fragmenten davon zusammen mit Sequenzen anderer Proteine umfassen; und Verfahren für deren Herstellung und Verwendung. In speziellen Ausführungsformen betrifft die Erfindung Fusionsproteine für die Zellzyklusregulation und Materialien sowie Verfahren für deren Herstellung und Verwendung. In speziellen Beispielen betrifft die Erfindung Fusionsproteine mit sowohl Säugetier-p53-Funktionalität als auch Herpesvirus-VP22-Funktionalität. Andere Aspekte der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und den Ansprüchen.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Von Relevanz für die vorliegende Anmeldung ist die frühere internationale Patentenanmeldung WO 97/05265 der Erfinder der vorliegenden Erfindung (O'Hare und Elliott; nach dem für diese Anmeldung beanspruchten Prioritätsdatum veröffentlicht), die das VP22-Protein und seine Eigenschaften sowie Verwendungen betrifft. Auf ähnliche Weise betrifft der Artikel der Erfinder der vorliegenden Erfindung (Elliott und O-Hare in Cell 88, 223-233 (1997)) interzelluläres Trafficking und Proteintransport durch ein Herpesvirus-Strukturprotein.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, dass das HSV-1-Virionprotein VP22 über einen ungewöhnlichen interzellulären Traffickingmechanismus verfügt; eine Wirkung, die insbesondere in der Patentschrift WO 97/05265 beschrieben ist. VP22 ist ein 38-kDa-Protein, das in primär-exprimierenden transfizierten Säugetierzellen hauptsächlich im Zytoplasma vorliegt, wo es mit zellulären Mikrotubuli (siehe beigefügte Zeichnung 1) assoziiert. Eine bemerkenswerte Eigenschaften von VP22 ist jedoch seine Fähigkeit, sich in einer Monoschicht von nicht-exprimierenden Zellen auszubreiten. VP22 wird aus dem Zytoplasma einer exprimie renden Zelle in die benachbarten Zellen transportiert, wo es sich im Zellkern (1b) anhäuft. Dieser Transportmechanismus ist noch nicht vollständig klar, wobei es sich gezeigt hat, dass dieser über einen Golgi-unabhängigen Weg erfolgt und das Actincytoskelett verwenden kann. HIV-1-Tat (Ensoli et al. (1993), Fawell et al. (1994)) und eine geringe Anzahl an anderen Nicht-Virus-Proteinen (Jackson et al. (1992)) sind mit interzellulären Traffickingeigenschaften versehen worden, wobei keines davon dieses Phänomen so deutlich zeigt wie das VP22. Eine weitere wichtige Eigenschaft von VP22 ist, dass es von den nicht transfizierten Zellen, wo es sich im Zellkern anhäuft, aufgenommen werden kann, wenn es exogen auf das Medium einer nicht transfizierten Zellmonoschicht aufgebracht wird.
Der Stand der Technik umfasst im Allgemeinen eine Reihe von Antigenen, immunmodulierenden Proteinen, Proteinen, die bei Verabreichung (an eine Zelle, die diese enthält) eines entsprechenden Arzneimittels oder einer Aktivatorverbindung bedingt zytotoxisch oder letal sind, Proteinen zur Zellzyklusregulation und anderen therapeutischen und diagnostischen Proteinen, insbesondere in Form von Protein- und Polynucleotidsequenzen, die eine genetische Manipulation durch Standardverfahren ermöglichen. Nachstehend sind Verweise auf manche Beispiele für diese Materialien angeführt.
Unter Zellzyklusregulationsproteinen ist beispielsweise das Protein p53 als Tumorsuppressor bekannt. p53 ist ein nukleares 53-kDa-Phosphoprotein (1c). Wildtyp-p53-Proteine und mutierte p53-Proteine sind mittels rekombinanter Vakziniaviren (Ronen et al., Nucleic Acids Research 20, 3.435-3441 (1992)) exprimiert worden. p53 dient zur Regulation der Zellzyklusprogression und kann bei DNA-Schaden durch einen komplexen Signaltransduktionsmechanismus Zellarrest oder Apoptose induzieren (Levine 1997). Eine gescheiterte Synthese von p53 oder, was häufiger vorkommt, einer Synthese einer mutierten Form des Proteins kann zu unkontrollierter Zellvermehrung und Tumorbildung führen. Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass die exogene Zugabe von funktionellem p53 vom Wildtyp den Zellzyklusarrest und/oder die Apoptose beschleunigen kann, was zu Tumorregression führt; Beispiele dafür umfassen Zervixkarzinom (Hamada et al. (1996)) und Brustkrebsxenotransplantate (Nielsen et al. (1997)). Eine Reihe von p53-Transportsystemen sind in vivo und in vitro verwendet worden, wie z.B. intravenöse Injektion eines p53:Liposom-Komplexes (Kumar et al. (1997)), direkte Transfektion (Zheng et al. (1996)) und adenoviral vermittelter Transfer (Hamada et al. (1996), Sandig et al. (1997)), wobei der Transport von funktionellem Protein in einen ausreichend hohen Prozentsatz von überlebenden Zellen nach wie vor schwierig ist.
Aus dem US-Patent 5.484.710 (La Jolla: JC Reed et al.) sind außerdem Regulationselemente in Zusammenhang mit Genen bekannt, die mit Zelltod in Verbindung gebracht werden, der durch das p53-Tumorsuppressorprotein gesteuert wird, sowie weitere Proteine sowie deren Analoga für die Zellzyklusregulation.
Eine Version des VP22-Proteins, die mit einem 10-Aminosäureepitop aus dem HCMV-UL-83-Gen (zur Ermöglichung der Erkennung durch einen monoklonalen Antikörper) markiert ist, ist in J. Leslie et al., Virology 220, 60-68 (1996), offenbart.
Es bleibt wünschenswert, spezielle weitere Zelltransportkonstrukte für geeignete Proteine bereitzustellen.
Zusammenfassung und Beschreibung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden gekuppelte (gekoppelte) Proteine bereitgestellt, umfassend Transportproteinsequenzen, welche Sequenzen aus dem Herpesvirus-VP22 oder aus Homologen oder Fragmenten davon umfassen, zusammen mit Sequenzen aus anderen Proteinen, die aus Folgenden ausgewählt sind: (a) Proteinen zur Zellzykluskontrolle; (b) Proteinen, die bei Verabreichung (an eine Zelle, die diese enthält) eines entsprechenden Arzneimittels, eines Prodrugs oder einer Aktivatorverbindung (die hierin ansonsten als Suizidproteine bezeichnet werden) bedingt zytotoxisch oder letal sind; (c) Antigensequenzen oder Antigenproteinen (die z.B. länger als 12 Aminosäurereste sind) aus mikrobiellen und viralen Antigenen und Tumorantigenen; (d) immunmodulierenden Proteinen; und (e) therapeutischen Proteinen. Beispiele für diese Art von Proteinen sind nachstehend angeführt.
Somit kann das Kuppeln oder die Fusion an eine Aminosäuresequenz mit der Transportfunktion von VP22-Protein ein zweckdienliches Abgabekonstrukt für erwähnte Proteine dieser Art bereitstellen. Wenn der Kontext es zulässt, umfassen "Kopplungsprodukte" und ähnliche Ausdrücke Verweise auf Fusionsproteine.
Die gekoppelten Proteine sind vorzugsweise Fusionsproteine, die in bekannten geeigneten Wirtszellen ohne weiteres exprimiert werden können. Entsprechende Polynucleotidsequenzen können unter Verwendung von Elementen von an sich bekannter und rekombinanter Standard-DNA-Verfahren und einfach verfügbaren Adaptationen davon hergestellt und manipuliert werden. Für bestimmte Anwendungen können bei Wunsch jedoch chemisch-gekoppelte Produkte verwendet werden, die aus individuellen Proteinkomponenten gemäß einer beliebigen Vielfalt von an sich bekannten chemischen Kopplungsverfahren hergestellt werden können.
VP22 oder eine funktionelle Subsequenz davon, gegebenenfalls mit einem zusätzlichen Polypeptidschwanz zum Koppeln, kann durch chemisches Koppeln auf beliebige bekannte geeignete standardisierte Weise an andere Proteine oder eine Nucleinsäure gebunden werden.
In vorliegender Erfindung werden darüber hinaus Polynucleotide bereitgestellt, die für die hierin beschriebenen Fusionsproteine kodieren, einschließlich Sequenzen, die VP22 und anderen Proteinen der oben angeführten Art entsprechen, sowie Expressionskassetten, Plasmide, Vektoren und rekombinante Zellen, die die Polynucleotide umfassen. Diese können analog zu oder leicht anpassbar an rekombinante Standard-DNA-Verfahren gebildet und verwendet werden. Folglich können entsprechende Polynucleotide für ein Fusionspolypeptid kodieren, das eine Sequenz mit der Transportfunktion des Herpesvirus-VP22-Proteins und eine Sequenz mit einer der hierin beschriebenen Funktionen umfasst. Das Polynucleotid kann in einem offenen Leseraster enthalten sein, der operabel an eine geeignete Promotersequenz gebunden ist, und kann gemäß den erfindungsgemäßen Beispielen Teil eines Expressionsvektors bilden, der beispielsweise das in einem Plasmid getragene Polynucleotid umfasst. Der Expressionsvektor kann beispielsweise ein rekombinanter Virusvektor oder ein nichtviraler Transfektionsvektor sein. Die Vektoren können beispielsweise Analoga oder Beispiele für Vektoren sein, die in der WO 97/05265 oder der WO 92/05263, WO 94/21807 oder WO 96/26267 angeführt oder beschrieben sind. Bei Nucleotidsequenzen, die zur Herstellung eines funktionellen Polypeptids transkribiert und translatiert werden können, führt die Degeneration des genetischen Codes zu einer Reihe von Nucleotidsequenzen, die für das gleiche Polypeptid kodieren. In der vorliegenden Erfindung sind sämtliche derartige Sequenzen enthalten.
Folglich können hierin beschriebene Produkte gemäß der Erfindung als transportierbare Proteine verwendet werden, die von einer Targetzellpopulation beispielsweise so aufgenommen werden können, dass eine Effektorfunktion, die der an das VP22 gekoppelten Polypeptidsequenz entspricht, unter den oben angeführten Arten in den Targetzellen stattfinden kann, die das Produkt aufgenommen haben. Deshalb können die Targetzellen beispielsweise gewünschte Tumorantigenepitope präsentieren, wenn die Polypeptidsequenz aus einem gewählten Tumorantigen stammt, oder Zellzyklusregulationswirkungen unterzogen werden, wenn die Polypeptidsequenz aus einem Zellzyklusregulationsprotein stammt, oder zu einem bestimmten Grad nach einer zusätzlichen Behandlung mit einem Prodrug, bei dem die Polypeptidsequenz aus einem entsprechenden "Suizidprotein" stammt, gegenüber Zelltötung oder – verletzung anfällig werden. Bei der Verwendung können viele der hierin beschriebenen Produkte als Fusionsproteine in einem ersten Teil der Targetzellpopulation exprimiert werden, daraus exportiert werden und von einem zweiten Teil der Targetzellpopulation, die das Protein nicht direkt herstellen, aufgenommen werden. Die Erfindung betrifft auch Säugetier- und mikrobielle Wirtszellen, die solche Vektoren oder andere Polynucleotide, die für die Fusionsproteine kodieren, umfassen, sowie deren Herstellung und Verwendung.
Ein wie hierin beschriebenes Fusionspolypeptid kann zu einer Targetzellpopulation transportiert werden, indem ein Polynucleotid oder ein anderer Vektor, der für das Fusionspolypeptid kodiert, in einen ersten Teil der Targetzellpopulation beispielsweise durch Transfektion oder Mikroinjektion eingeführt wird; das kodierende Polynucleotid expomiert wird, um das Fusionspolypeptid herzustellen, wodurch dieses aus dem ersten Teil der Targetzellpopulation exportiert wird und von einem zweiten Teil der Targetzellpopulation aufgenommen wird, der das Fusionspolypeptid nicht direkt herstellt.
Kopplungsprodukte (einschließlich chemisch-gekuppelter Produkte) können auch in eine Targetzellpopulation transportiert werden, indem die Zellen direkt einem Kopplungsproduktpräparat ausgesetzt werden, wodurch diese von den Targetzellen aufgenommen werden.
In dieser Beschreibung steht "VP22" für das Protein VP22 von HSV, z.B. von HSV1, und transportaktive Fragmente sowie Homologe davon, einschließlich transportaktiver Homologe aus anderen Herpesviren, einschließlich Varicella-Zoster-Virus (VZV), equines Herpesvirus (EHV) und bovines Herpesvirus (BHV); modifizierte und mutante Proteine sowie Fusionspolypeptide und Kopplungsprodukte, die eine Homologie damit und eine Transportfunktion aufweisen, die einer Transportfunktion von VP22 von HSV1 entspricht; und betrifft damit in Zusammenhang auch Nucleinsäuresequenzen, die für jede der obigen in Form von nackter DNA oder RNA oder eines Vektors oder größeren Nucleinsäuresequenzen, einschließlich solcher Sequenzen wie Subsequenzen, kodieren.
Unter den Subsequenzen des Herpesvirus-VP22-Proteins mit Transportaktivität haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass die Transportaktivität beispielsweise in Polypeptiden vorliegt, die den Aminosäuren 60-301 und 159-301 der vollständigen HSV1-VP22-Sequenz (1-301) entsprechen; hinsichtlich der Sequenz siehe beispielsweise 4 in der WO 97/05265. Ein Polypeptid, das aus den Aminosäuren 175-301 der VP22-Sequenz besteht, weist eine deutlich geringere Transportaktivität auf und wird in Zusammenhang mit vorliegender Erfindung weniger bevorzugt. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung in einem Aspekt gekoppelte Proteine und Fusionsproteine, die eine Subsequenz von VP22 umfassen, welche eine Sequenz aufweist, die vorzugsweise von etwa aa 159 (oder früher, zum N-Terminus hin, in der nativen VP22-Sequenz) bis etwa aa 301 reicht und zumindest (bezogen auf die vollständige VP22-Sequenz) eine Deletion zumindest eines Ab schnitts der VP22-Sequenz aufweist, die sich beispielsweise vom N-Terminus zum zitierten Ausgangspunkt hin erstrecken kann, beispielsweise eine Deletion der vollständigen Sequenz oder von Teilen der Sequenz von etwa aa 1-158. (Eine solche Deletion kann sich auch weiter zum C-Terminus hin, beispielsweise bis etwa aa 175, erstrecken, was weniger bevorzugt wird.) Beispielsweise werden Teilsequenzen im Bereich von etwa aa 60-301 bis etwa aa 159-301 bereitgestellt.
Hierin in Betracht gezogene VP22-Sequenzen erstrecken sich auf homologe Proteine und Fragmente, die auf den Sequenzen von VP22-Protein-Homologen aus anderen Herpesviren basieren; beispielsweise stellt die Erfindung entsprechende Derivate und Anwendungen für bekannte VP22-Homolog-Sequenzen aus VZV (z.B. sämtliche oder homologe Abschnitte der Sequenz von aa 1-320) aus MDV (z.B. sämtliche oder homologe Abschnitte der Sequenz von aa 1-249) und aus BHV (z.B. sämtliche oder homologe Abschnitte der Sequenz von aa 1-258) bereit. Die Sequenzen der entsprechenden Proteine aus HSV2, VZV, BHV und MDV sind in öffentlichen Protein/Nucleinsäuresequenzdatenbanken verfügbar. Beispielsweise ist folglich innerhalb der EMBL/Genbank-Datenbank eine VP22-Sequenz aus HSV2 als Geneintrag UL49 unter der Zugangsnummer Z86099, die das vollständige Genom des HSV2-Strangs HG52 enthält, verfügbar; das vollständige Genom von VZV, einschließlich des homologen Gens bzw. Proteins, ist unter den Zugangsnummern X04370, M14891, M16612 verfügbar; die entsprechende Proteinsequenz aus BHV ist als "Viriontegumentprotein des bovinen Herpesvirus 1" unter der Zugangsnummer 021137 verfügbar; und die entsprechende Sequenz aus MDV ist als Geneintrag UL49 unter der Zugangsnummer L10283 als "homologe Sequenzgene des Gallid-Herpesvirus Typ 1" verfügbar. In diesen Proteinen, insbesondere jenen aus HSV2 und VZV, können entsprechende Deletionen, beispielsweise von Sequenzen, die gegenüber aa 1-159 von VP22 aus HSV1 homolog sind, vorgenommen werden. Homologien zwischen diesen sind mittels Standardalgorithmen und Software, die beispielsweise in der WO 95/12673 auf Seite 9 angeführt sind, leicht zugänglich.
Zudem eignen sich auch chimäre VP-22-Proteine und -Proteinsequenzen in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, z.B. eine Proteinsequenz aus VP22 des HSV1, wobei Teile davon mit einer homologen Sequenz aus dem entsprechenden VP22-Homolog eines anderen Herpesvirus ersetzt wurden. Beispielsweise können C-Terminus-Sequenzen aus VP22 von HSV2 oder aus VP22-Homologen von BHV in die Sequenz des Polypeptids 159-301 aus VP22 von HSV1 substituiert werden.
Es wurde herausgefunden, dass die Deletion einer C-Terminus-Sequenz mit einer Länge von 34 Aminosäuren aus VP22 von HSV1 die Transportaktivität aufhebt, wodurch dieser Sequenzbereich essentielle Elemente für die Transportaktivität enthält. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden gekuppelte Polypeptide und Fusionspolypeptide, die eine 34 Aminosäuren lange C-Terminus-Sequenz aus VP22 oder eine Variante davon enthalten, zusammen mit einer Sequenz aus einem weiteren Protein bereitgestellt, das aus Folgendem ausgewählt ist: (a) einem Protein zur Zellzyklusregulation; (b) Proteinen, die bei Verabreichung (an eine Zelle, die diese enthält) eines entsprechenden Arzneimittels oder einer Aktivatorverbindung bedingt zytotoxisch oder letal sind; (c) Antigensequenzen oder Antigenproteinen (die z.B. länger als 12 Aminosäurereste sind) aus mikrobiellen und viralen Antigenen und Tumorantigenen; (d) immunmodulierenden Proteinen; und (e) therapeutischen Proteinen. Diese werden beispielsweise für den Gebrauch durch Verabreichung in Form von Protein an Zellen bereitgestellt, die diese aufnehmen. Gekoppelte Produkte von modifizierten terminalen Fragmenten mit zumindest einer Mutation Insertion oder Deletion in Bezug auf die 34 Aminosäuren lange C-Terminus-Sequenz von HSV1-VP22 werden ebenfalls bereitgestellt.
Es wurde auch herausgefunden, dass für die Transportaktivität erforderliche Sequenzen ein oder eine Vielzahl an Aminosäuresequenzmotiven oder deren Homologe aus der C-Terminus-Sequenz aus VP22 von HSV1 oder anderen Herpesviren enthalten, die aus Folgenden ausgewählt werden können: RSASR, RTASR, RSRAR, RTRAR, ATATR, worin der dritte oder vierte A-Rest dupliziert werden kann, wie beispielsweise in RSAASR. Entsprechende Fusionspolypeptide mit Proteinen der hierin angeführten Arten werden ebenfalls bereitgestellt.
Zusätzlich zu ihren hierin anderswo angeführten Verwendungen können die gekoppelten Polypeptide und Fusionspolypeptide auch zur Erhöhung der Antikörper verwendet werden, die in diagnostischen und Monitoring-spezifischen Bindungstests auf an sich bekannte Art und Weise verwendet werden können, beispielsweise zum Monitoring der intrazellulären Lokalisierung der gekoppelten Proteine oder Fusionsproteine selbst oder deren Komponenten.
(Das "VP22" hierin dient nicht dazu, natürliches nichtmodifiziertes VP22-Protein oder entsprechendes Gen in seiner natürlichen und nichtmodifizierten Assoziation mit Herpesviren in ihren verschiedenen natürlichen Lebensphasen, z.B. in Assoziation mit Herpesviren, die keiner genomischen Veränderung unterzogen worden sind, zu enthalten. Das "VP22" bezieht sich jedoch auf das entsprechende Protein oder Gen eines Virus, das beispielsweise bezüglich seines/r UL49/VP22-Gens oder -Funktion verändert worden ist oder in dessen Genom ein zusätzliches VP22-Gen oder VP22-Hybridgen eingesetzt worden ist.)
Die Kopplungsprodukte oder Fusionsproteine auf der Basis von VP22 können mehrere Molekulgrößen aufweisen. Die Produkte können in der Praxis beispielsweise bis zu etwa 70 kDa oder mehr, z.B. 90 kDa oder 100 kDa oder mehr, bezüglich der Größe des an VP22 zu koppelnden oder zu fusionierenden Proteins betragen. Die erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfassen Beispiele, bei denen das Fusionspeptid z.B. zumindest 13 Reste oder mehr als etwa 12 Aminosäurereste lang ist, und beispielsweise kein 12 Reste langes Antigenepitopprotein ist. Die zu fusionierenden Proteine können mitunter auch mehr als 27 oder 32 kDa betragen, beispielsweise können sie auch eine andere Größe als 27 kDa aufweisen. Eines der Proteine, das so gekoppelt werden kann, p53, weist an sich eine Größe von etwa 53 kDa auf. Das gekoppelte Polypeptid oder Fusionsprotein, einschließlich der VP22-Komponente, kann eine Größe von bis zu etwa 120 kDa, z.B. bis zu etwa 80 kDa oder 100 kDa, aufweisen.
Gelegentlich wird die VP22-Sequenz vorzugsweise an ihrem N-Terminus an die Sequenz des gewählten anderen Proteins einer der hierin angeführten Arten fusioniert. Fusionen am C-Terminus werden mitunter dementsprechend weniger bevorzugt.
In den erfindungsgemäßen Polypeptiden können auch Mutationen der konstituierenden Aminosäuresequenzen (einschließlich der hierin angeführten immunmodulierenden und anderen Proteinen) in den Fusionspolypeptiden und anderen gekuppelten Proteinen aufgenommen sein. Hierin sind Proteine mit mutierten Sequenzen so enthalten, dass sie z.B. hinsichtlich Sequenz, Funktion und Antigeneigenschaft oder anderer Funktionen homolog bleiben, wobei ein Protein die entsprechende Elternsequenz aufweist. Solche Mutationen können vorzugsweise z.B. solche sein, bei denen es zu konservativen Aminosäureänderungen, z.B. Änderungen zwischen Aminosäuren mit im Großen und Ganzen ähnlichen molekularen Eigenschaften, kommt. Austauschungen innerhalb der aliphatischen Gruppe Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin können beispielsweise als konservativ bezeichnet werden. Manchmal kann eine Substitution von Glycin für eine der eben angeführten ebenfalls als konservativ bezeichnet werden. Austauschungen innerhalb der aliphatischen Gruppe Aspartat und Glutamat können auch als konservativ bezeichnet werden. Austauschungen innerhalb der Amidgruppe Asparagin und Glutamin können auch als konservativ bezeichnet werden. Austauschungen innerhalb der Hydroxygruppe Serin und Threonin können auch als konservativ bezeichnet werden. Austauschungen innerhalb der aromatischen Gruppe Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan können auch als konservativ bezeichnet werden. Austauschungen innerhalb der basischen Gruppe Lysin, Arginin und Histidin können auch als konservativ bezeichnet werden. Austauschungen innerhalb der schwefelhältigen Gruppe Methionin und Cystein können auch als konservativ bezeichnet werden. Manchmal kann eine Substitution innerhalb der Gruppe Methionin und Leucin auch als konservativ bezeichnet werden. Bevorzugte konservative Substitutionsgruppen sind Aspartat-Glutamat, Asparagin-Glutamin, Valin-Leucin-Isoleucin, Alanin-Valin, Phenylalanin-Tyrosin und Lysin-Arginin. Ansonsten können mutierte Sequenzen Insertion und/oder Deletionen umfassen. Die mutierten Proteinsequenzen können zusätzlich oder alternativ dazu durch Polynucleotide kodiert sein, die unter stringenten Bedingungen mit dem geeigneten Strang an natürlich vorkommenden Polynucleotiden, die für das Elternprotein kodieren, hybridisieren, und können auf positive Ergebnisse in bekannten Funktionstests, die sich auf das Elternprotein beziehen, untersucht werden. ("Stringente Bedingungen" sind sequenzabhängig und je nach Bedingung unterschiedlich. Im Allgemeinen können stringente Bedingungen so gewählt sein, dass sie etwa 5°C niedriger sind als die Schmelztemperatur (Tm) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH. Die Tm ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und einem definierten pH), bei der 50% der Targetsequenz an eine perfekt übereingestimmte Sonde hybridisieren. Üblicherweise sind die stringenten Bedingungen so, dass die Salzkonzentration zumindest etwa 0,02 molar bei einem pH von 7 und die Temperatur zumindest etwa 60°C beträgt. Da andere Faktoren die Hybridisierungsstringenz beeinflussen können, einschließlich, unter anderen, der Basenzusammensetzung und Größe der komplementären Stränge, der Gegenwart von organischen Lösungsmitteln und des Grads der Basenfehlpaarung, spielt die Kombination der Parameter eine wichtigere Rolle als die absolute Messung der einzelnen Parameter.)
Koppeln mit Zellzyklusregulationsproteinen
In einer nützlichen Klasse der erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann VP22 mit an sich bekannten Zellzyklusregulationsproteinen gekoppelt werden. Folglich kann VP22 in einem Beispiel der Erfindung, bei dem es um Zellzyklusregulation geht, wie insbesondere in einem nachstehenden Beispiel beschrieben wird, mit dem p53-Protein gekoppelt werden. Zweck und Verwendung in vorliegender Erfindung können darin bestehen, Zellzyklusprogression, insbesondere bei malignen Zellen, zu blockieren.
VP22 eignet sich auch zur Kopplung mit cyclinabhängigen Kinasehemmern, wie z.B. p16, p21 oder p27. Eine normale Zellzyklusprogression erfordert diese Proteine; die Abwesenheit derselbigen kann den Zellzyklus dereprimieren, und entsprechende Kopplungsprodukte können zur Behandlung von Krebszellen verwendet werden.
VP22-Kopplungsprodukte eignen sich darüber hinaus auch zur Modulation von A-poptosen, um beispielsweise einen Zelltod vom Apoptosetyp zu induzieren, indem eine apoptische Proteindomäne, die an VP22 gekoppelt ist, wie z.B. das Apoptoseprotein bax oder dessen bekanntes identifiziertes, Apoptose induzierendes Peptid oder das bekannte, damit in Zusammenhang stehende, Protein bad oder bak, in eine Zelle eingeführt wird. Auch hierin kann das Kopplungsprodukt entweder in Form eines Proteins oder einer DNA, die dafür kodiert, angewendet werden. VP22-Kopplungsprodukte können in Form von VP22 mit bekannten Proteinen der bcl2-Familie, wie z.B. bcl2 selbst, bcl-xL oder bclw, verwendet werden, um die Apoptose bei Wunsch zu maskieren oder zu hemmen, wie z.B. bei der Behandlung von Neurodegenerationen.
Zur Beschleunigung der Apoptose können andere VP22-Kopplungsprodukte verwendet werden, die VP22, verbunden mit bekannten ICE-ähnlichen Proteasen, umfassen. VP22-Bindungsprodukte mit Inhibitoren von ICE-ähnlichen Proteasen, z.B. Pseudosubstrate, können verwendet werden, um die Apoptose-stimulierenden Wirkungen der Proteasen selbst zu maskieren oder diese zu überwinden.
Folglich wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Fusionspolypeptid bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz mit der Transportfunktion eines Herpesvirus-VP22-Proteins sowie eine Sequenz mit der Zellzyklusregulationsfunktionalität des p53-Proteins umfasst. Das Fusionspolypeptid kann beispielsweise im Wesentlichen die p53-Sequenz voller Länge oder im Wesentlichen die VP22-Sequenz voller Länge oder beides umfassen.
Die Fusion mit VP22 kann folglich zum Transport eines Mittels zur Zellzyklusregulation, wie z.B. p53, verwendet werden. (Wenn in der Beschreibung hierin auf p53 und verwandte Peptide Bezug genommen wird, ist klar, dass, wenn es der Zusammenhang zulässt, alternative Zellzyklusregulationsmittel, wie z.B. p53-Analoga sowie andere Zellzyklusregulationsproteine, die hierin erwähnt werden und auf die hierin Bezug genommen wird, ebenfalls in Betracht gezogen werden, wie auch, etwas allgemeiner, alternative Fusions- oder Kopplungspartner für VP22 jedes beliebigen hierin angeführten Typs.) Bei Expression in einer Subpopulation von Expressionszellen kann ein solches Fusionsprotein mittels VP22-Transportmechanismus aus den Expressionszellen in einen signifikanten Abschnitt von umgebenden Zellen transportiert werden, woraufhin das fremde gebundene Polypeptid seine Funktionalität ausüben kann.
Durch diesen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden auch entsprechende Polynucleotide bereitgestellt, die für ein Fusionspolypeptid kodieren, das eine Sequenz mit der Transportfunktion des Herpesvirus-VP22-Proteins und eine Sequenz mit der menschlichen/Säugetier-Zellzyklusregulationsfunktion des p53-Proteins umfasst. Das Polynucleotid kann in einem offenen Leseraster enthalten sein, der operabel an eine geeignete Promotersequenz gebunden ist.
Das Polynucleotid kann gemäß den Beispielen der vorliegenden Erfindung Teil eines Expressionsvektors bilden, der z.B. das in einem Plasmid getragene Polynucleotid umfasst. Der Expressionsvektor kann beispielsweise ein Virusvektor oder ein nichtviraler Transfektionsvektor sein. Die Vektoren können z.B. Analoga oder Beispiele für jene in der WO 97/05265 oder von Elliott und O'Hare (1997) beschriebenen und darauf Bezug genommenen sein.
In der vorliegenden Erfindung sind zudem Verfahren zur Hemmung der Zellteilung bereitgestellt, die das Freilegen der Zellen, die keine ausreichende Menge an aktivem/freiem p53 aufweisen, um ihren Zellzyklus zu arretieren, umfassen, damit sie mit einem wie hierin beschriebenen Fusionspolypeptid kontaktiert werden.
Unter den erfindungsgemäßen Verfahren gibt es ein Verfahren zur Hemmung der Tumorzellteilung, die das Freilegen einer in einer Tumorzellmasse vorliegenden Tumorzelle umfasst, wobei die Tumorzelle keine ausreichende Menge an aktivem/freiem p53 umfasst, um ihren Zellzyklus zu arretieren, damit sie mit einem wie hierin beschriebenen Vektor kontaktiert wird, wodurch es dazu kommt, dass die Zelle ein wie hierin beschriebenes Fusionspolypeptid exprimiert und andere Zellen der Tumorzellenmasse freilegt, um mit dem Fusionspolypeptid kontaktiert zu werden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt (siehe nachstehende Beschreibung), dass VP22-p53 an viele nicht-transfektierte Zellen in einer Monoschicht transportiert werden kann. Das Fusionsprotein kann für den Zellzyklusarrest und/oder die Induktion von Apoptosen funktionell sein, beispielsweise sowohl in primär-exprimierenden Zellen als auch in Zellen, die VP22 über eine Ausbreitung von Zelle zu Zelle erhalten haben. Das Fusionsprotein kann beispielsweise auf die p53-negative Osteosarkomzelllinie SAOS-2 (Diller et al. (1990)) aufgebracht werden. Das in diesen Zellen exprimierte funktionelle p53 führt zu Zellzyklusarrest an der G₁-S-Grenze und schließlich zum Zelltod, was mittels konfokaler Mikroskopie und Antikörpern gegen spezifische Zellzyklusmarker getestet werden kann. Die Funktion des p53-Fusionsproteins kann auch in anderen tumorerzeugenden Zelllinien verwendet und überprüft werden, bei denen p53 vorliegt, jedoch spezifische und gut charakterisierte Punktmutationen, die zur Nichtfunktionalität führen, aufweist.
Eine Reihe von Vektorsystemen, wie z.B. retrovirale oder adenovirale Infektion oder die Injektion von Protein-Liposom-Komplexen, kann ohne weiteres angepasst werden, um erfindungsgemäße Beispiele zur Verabreichung von Zellzyklusregulationsproteinen an Zellen und Gewebe zu behandelnder menschlicher und nichtmenschlicher tierischer Probanden zu ergeben. In Zusammenhang mit Forschungen am p53-Protein allein wurde klar, dass das Hinzufügen von p53-Protein vom Wildtyp kanzeröses Zellwachstum in vivo herabsetzen kann. Eine Reihe von therapeutischen Anwendungen von nichtinvasivem Transport von VP22-Kopplungsprodukten mit Zellzyklusregulationsproteinen sind dem auf dem Fachgebiet versierten Leser klar.
Beispielsweise kann nackte DNA für eine VP22-Proteinfusion mit einem Tumoreffektorprotein, wie z.B. p53, in einen Tumor, z.B. einen festen Tumor, der mittels molekularer Diagnostik aufgrund von Mangel an funktionellem p53 ausgewählt wird, injiziert werden.
Rekombinante Viren, die für VP22-p53 und äquivalent funktionierende Fusionsproteine kodieren und diese exprimieren können, können wie erwähnt verwendet werden. Ein Adenovirus kann beispielsweise VP22-p53 exprimieren und kann von einem tu morspezifischen Promoter abhängig gemacht werden, um ein essentielles Virusgen, wie z.B. E1a, anzutreiben. Noch allgemeiner kann ein rekombinanter Virusvektor, der eine solche Fusion trägt, defekt, nichtreplizierend oder replikationseingeschränkt sein, sodass die Replikation von Bedingungen abhängt, die im Targetgewebe oder der -zelle vorliegen, nicht jedoch in normalen Zellen oder Nicht-Targetzellen.
In bestimmten erfindungsgemäßen Beispielen kann das Protein mit p53-Funktionalität beispielsweise Varianten oder Mutanten von p53 umfassen, beispielsweise solche Varianten, wie sie in der WO 97/04092 (Rhone Poulenc Rorer SA: Bracco L, Conseiller E) beschrieben sind ("Neue p53-Varianten, bei denen beispielsweise die Oligomerisationsdomäne durch einen Leucin-Zipper ersetzt ist, was sich zur Behandlung von hyperproliferativen Störungen, insbesondere von Krebs und Restenose eignet"), worin unter anderen die nachstehenden Proteinvarianten beschrieben sind: (a) Varianten des Proteins p53, bei dem zumindest Teile der Oligomerisationsdomäne deletiert und durch eine Leucin-Zipper-Domäne ersetzt sind; (b) p53-Varianten, die vorzugsweise in transformierten Zellen aktiv sind, wo die gesamte oder Teile zumindest einer funktionelle(n) Domäne deletiert und durch eine heterologe Domäne, die vorzugsweise in solchen Zellen aktiv ist, ersetzt ist/sind; (c) p53-Varianten mit einer Deletion im C-Terminusabschnitt von Rest 366, gefolgt von einer 19 Aminosäuren langen Sequenz (die durch ein in der Beschreibung reproduziertes 76-bp-Fragment kodiert ist), die den letzten Abschnitt des alternativ gespleißten Abschnitts des Mäuse-p53 darstellt; und (d) chimäres Protein mit einer transaktivierenden Domäne, einer DNA-Bindungsdomäne, einer Zellkern-Lokalisierungsdomäne und einer Oligomerisationsdomäne, worin die DNA-Bindungsdomäne und die Zellkern-Lokalisierungsdomäne die Aminosäuren 75-325 oder 75-336 vom menschlichen p53 vom Wildtyp umfassen.
In weiteren erfindungsgemäßen Beispielen können Vektoren und Fusionsproteine für p53-Polypeptid-Varianten kodieren oder diese umfassen, die chimäre p53-Sequenzen, einschließlich heterologer Tetramerisationsdomänen, umfassen, die ausgehend aus den Beschreibungen WO 96/16989 und US-Patent 5.573.925 (Wistar Institute of Anatomy & Biology: Halazonetis TD) adaptiert und in entsprechender Art und Weise verwendet werden können. In solchen erfindungsgemäßen Beispielen können die p53-Sequenzen ein chimäres p53-Protein mit einer nativen p53-Sequenz und einer heterologen Tetramerisationsdomäne umfassen, die Homotetramere so bilden, dass das resultierende chimäre Protein nicht mit dem p53-Mutanten vom Wildtyp oder Tumortyp heterooligomerisiert wird und die native p53-Funktionalität zur Tumorsuppression nicht stört.
Fusionsproteine und Vektoren gemäß weiteren Beispielen der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen, insbesondere von Krebs- und Autoimmunerkrankungen, z.B. Restenose, und insbesondere zur Behandlung von Zellen mit einer p53-Mutation, die auch das Protein MDM2 in großer Menge exprimieren, einschließlich beispielsweise HPV-verwandter Krebszellen, verwendet werden. Sie können auch verwendet werden, um hyperproliferierende Zellen in vitro zu töten. Solche Varianten können aktive und stabile Tumorsuppressoren und Apoptose induzierende Mittel umfassen und werden als aktiv angesehen, wenn das Protein vom Wildtyp nicht aktiv ist, was bedeutet, dass sie weder durch dominant negative oder onkogene Mutanten noch durch andere Zellproteine inaktiviert werden (da die Leucin-Zipper-Domäne die Bildung von inaktiven Mischoligomeren verhindert).
Fusionsproteine und Vektoren können gemäß weiteren erfindungsgemäßen Beispielen auch in Medikamenten zur Unterdrückung des neoplastischen Phänotyps von Krebszellen, denen das p53-Protein vom Wildtyp fehlt, auf eine Art und Weise verwendet werden, die dem Gebrauch des p35-Gens vom Wildtyp entspricht, das in EP 0.710.722 (Univ. California: Chen P, Lee W) beschrieben ist, worin Gene und retrovirale Vektoren u.a. zum Zwecke der Unterdrückung des neoplastischen Phänotyps in Krebszellen, wie z.B. Osteosarkomzellen, Lungenkarzinomzellen, Kolonkarzinomzellen, Lymphomzellen, Leukämiezellen, Weichteilsarkomzellen, oder Brust-, Blase- oder Prostatakarzinomzellen, beschrieben sind.
Fusionsproteine und Vektoren können gemäß weiteren erfindungsgemäßen Beispielen auch auf eine Art und Weise verwendet werden, die jener in der WO 95/12660 (Univ Texas System: Roth JA et al.) beschriebenen entspricht, worin das rekombi nante Adenovirus beschrieben ist, das ein Adenovirusvektorkonstrukt trägt, das einen Expressionsbereich umfasst, der für p53 kodiert und fähig ist, das p53 beispielsweise in menschlichen malignen Zellen zu exprimieren und u.a. für den regionalen Transport von Tumorsuppressorgen p53 an erkrankte Zellen verwendet werden kann, um entweder die p53-Funktion von p53-defizienten Zellen wiederherzustellen oder das Tumorwachstum in Zellen mit abnormalem p53 zu unterdrücken und in der Folge maligne Erkrankungen von Menschen, wie z.B. Brust- und Lungenkrebs, zu behandeln. Ein solches Adenovirus kann auch für In-vitro-Analysen und Mutagenesestudien verschiedener p53-Gene verwendet werden.
Fusionsproteine und Vektoren können gemäß weiteren erfindungsgemäßen Beispielen auch als Inhibitoren der Hepatitis-B-Virus- (HBV-) Replikation auf eine Art und Weise verwendet werden, die jener im US-Patent 5.635.473 und in der WO 96/11017 (Mogam Biotechnology Research Institute: H-S Lee et al.) beschriebenen entspricht.
Screening-Tests zur Identifizierung von Mitteln, die den Grad des Zelltods wirksam erhöhen und als p53-Analoga dienen sowie Apoptose in Zellen induzieren können, sind beispielsweise im US-Patent 5.484.710 (La Jolla: JC Reed et al), insbesondere in Beispiel IV davon, beschrieben. Als alternative erfindungsgemäße Ausführungsformen werden auch Fusionsproteine und verwandte Materialien in Betracht gezogen, die eine VP22-Funktionalität sowie eine Bax-Protein-Funktionalität aufweisen. In Bezug auf das Bax-Protein wird auf das US-Patent 5.484.710 und die darin angeführten Verweise verwiesen.
Koppeln mit "Suizidproteinen":
In einer weiteren Klasse von erfindungsgemäßen Ausführungsformen kann VP22 oder eine funktionelle Subsequenz davon mit beispielsweise einem "Suizidprotein" geeignet gekoppelt oder damit fusioniert werden, wie z.B. der bekannten Thymidinkinase, der Nitroreductase oder einem anderen Enzym oder funktionellen Fragment davon, das für einen ähnlichen Zweck als anwendbar gilt. Das Kopplungsprodukt kann in Zellen penetrieren, die (bei Thymidinkinase) mit Ganciclovir oder einem an deren Arzneimitteln (Prodrugs) der gleichen Familie zu behandeln sind, sodass das Prodrug in den Zellen, die das "Suizidgen"-Produkt enthalten, zu einer aktiven Form überführt wird, um die Zellen zu töten.
Geeignete Beispiele für nützliche bekannte Suizidgene und entsprechende Prodrugs sind beispielsweise in der WO 94/13824 (Univ Curie Paris: M Caruso et al.), in der WO 95/05835 (Baylor College: S Chen et al.) und in der WO 93/08288 (Cancer Research Campaign Technology: G Anzelark et al.) sowie in der WO 93/01281 (US DHHS: RM Blaese et al.) angeführt und durch Verweise aufgenommen und umfassen, neben Thymidinkinase (Suizidgen) und Ganciclovir/Acyclovir (Prodrug), Nitroreductase (Suizidgen) und CB1954 (Prodrug) sowie Cytosindeaminase (Suizidgen) und 5-Fluorcytosin (Prodrug). Diese und andere Suizidproteine sowie entsprechende Arzneimittel bzw. Prodrugs sind ebenfalls in "Genetic Prodrug Activation Therapy" von A Rigg und K Sikora, Molecular Medicine Today, 359-366 (Aug. 1997) besprochen und deren Verwendung dargelegt.
Wenn die VP22-TK-Fusion in Form von DNA auf eine beliebige in der WO 97/05265 oder von Elliott und O'Hare (1997) beschriebene Weise präsentiert wird, kann eine Targetzelle mit dem Gen transfiziert werden, das für diese Fusion kodiert, und die exprimierte Fusion kann anschließend aus der Zelle, in der sie exprimiert wurde, in umgebende Zellen transloziert werden, wodurch bei Behandlung mit Ganciclovir etc. ein Tötungseffekt auf solche Zellen ausgeübt wird, wobei es sich bei dem Effekt um einen Effekt handelt, der sich von bekannten Bystander-Effekten unterscheidet und zusätzlich dazu auftreten kann. Alternativ dazu kann eine solche VP22-TK-Fusion, wie bei anderen Ausführungsformen, auch direkt als Protein aufgebracht werden.
Koppeln mit Antigenen
In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung beispielsweise Transportproteine, die mit VP22 oder dessen aktiven Fragmenten in Bezug stehen und in Fusionspolypeptiden fusioniert sind oder ansonsten mit antigenen Sequenzen oder Proteinen (z.B. länger als 12 Aminosäurereste sind) gekoppelt sind, die beispielsweise aus be liebigen Antigenmaterialien oder anderen nachstehend angeführten Proteinen und Peptiden ausgewählt sind.
Zusätzlich zu den Fusionspolypeptiden und Kopplungsprodukten stellt die Erfindung Kopplungshybride bereit, die VP22 umfassen, das an eine DNA gekoppelt ist, die beispielsweise geeignete bekannte Regulationselemente umfassen kann, sodass sie transkribiert und translatiert werden kann, und enthält ein offenes Leseraster, das für jedes beliebige nachstehend angeführte Protein kodiert.
Koppeln mit Antigenen: VP22 kann geeignet mit Beispielen von mikrobiellen und viralen Antigenen und Tumorantigenen, wie z.B. den nachstehend angeführten, gekoppelt werden.
Die Behandlung mit Kopplungsprodukten von VP22, die, wie hierin bereitgestellt, Antigene von Pathogenen umfasst, kann nützliche Immunantworten gegen entsprechende Pathogene evozieren. Beispiele für solche Antigene sind Papilloma-Virus-L1- oder -L2-Protein, HIV-gag-, -pol-, -env- und -nef-Proteine, Chlamydiaantigene (wie z.B. das Chlamydien-spezifische Major Outer Membrane Protein, MOMP) und Chlamydien-spezifische Hitzeschockproteine.
VP22 kann auch geeignet mit Antigenen aus Mycobakterien, wie z.B. als Antigen aus dem Mycobacterium tuberculosis, gekoppelt werden.
Alternativ dazu kann das Antigen ein tumorassoziiertes Antigen sein, wodurch die Antitumoraktivität der CTL, die mit der Tumorzelldepletion assoziiert werden, verstärkt wird. Es wurde herausgefunden, dass sich spezifische Cytokine, wie z.B. der Tumornekrosefaktor-α, Interferon-gamma, Interleukin-2, Interleukin-4 und Interleukin-7, darauf bezogen insbesondere geeignet sind. Tumorassoziierte Antigene und ihre Rolle bei der Immunbiologie bestimmter Krebsarten wird beispielsweise von P. van der Bruggen et al. in Current Opinion in Immunology 4(5), 608-612 (1992), besprochen. Bestimmte Beispiele für solche Antigene, die zur Verwendung in Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung beabsichtigt werden, sind E6- und E7- Antigene des menschlichen Papillomavirus (insbesondere beispielsweise von den Typen 6, 11, 16, 18 etc.); aus dem Epstein-Barr-Virus stammende Proteine, z.B. jene, die in den Verweisen 24 und 25 von P. van der Bruggen et al. (siehe oben) identifiziert sind; Antigene der MAGE-Serie, wie sie in T. Boon, Adv Cancer Res 58, 177-210 (1992), bestimmt sind, und/oder MZ2-E und andere Antigene, wie von P. van der Bruggen et al. in Science 254, 1643-1647 (1991), bestimmt; Melanomproteine, wie z.B. menschliche Tyrosinase; und Mucine, wie z.B. jene, die von P.O. Livingston in Current Opinion in Immunology 4(5), 624-629 (1992), bestimmt sind, z.B. MUC1, wie von J. Burchell et al. in Int J Cancer 44, 691-696 (1989), bestimmt.
VP22 kann auch geeignet mit Virusproteinen, wie z.B. Glykoproteinantigenen, beispielsweise aus Herpesviren, wie z.B. gH oder gD oder gB des Herpes-simplex-Virus, oder gp50 des Pseudorabiesvirus als Beispiel für ein Antigen eines veterinären Pathogens, in diesem Fall eines veterinären Virus, gekoppelt werden.
VP22 kann folglich geeignet mit Antigenen nach dem Stand der Technik von Behandlungen maligner Tumoren gekoppelt werden, einschließlich Studien, die das Potenzial von therapeutischen Impfungen gegen Tumoren unter Einsatz autologer Materialien, die aus dem patienteneigenen Tumor stammen, betonen. Die diesem Ansatz zugrunde liegende Theorie besteht darin, dass Tumorzellen ein oder mehrere Proteine oder andere biologische Makromoleküle exprimieren können, die sich von normalen gesunden Zellen unterscheiden und deshalb verwendet werden könnten, um auf eine Immunantwort abzuzielen, damit Tumorzellen erkannt und zerstört werden.
Diese Tumortargets können ubiquitär in Tumoren eines bestimmten Typs vorliegen. Ein gutes Beispiel dafür ist Zervixkrebs, bei dem die Mehrzahl der Tumoren die menschlichen Papillomavirus-E6- und -E7-Proteine exprimieren. In diesem Fall ist das Tumortarget kein Selbstprotein, und folglich ist sein Potenzial als einzigartiger tumorspezifischer Marker für die Krebsimmuntherapie klar.
Es gibt immer mehr Beweise dafür, dass bestimmte Selbstproteine auch als Tumortargetantigene verwendet werden können. Dies geht auf die Beobachtung zurück, dass sie gleichmäßig in Tumorzellen, jedoch nicht in normalen gesunden Zellen exprimiert werden. Beispiele dafür umfassen die Familie der MAGE-Proteine. Es wird angenommen, dass noch mehr als Tumortargets geeignete Selbstproteine identifiziert werden müssen.
Tumorassoziierte Antigene und ihre Rolle in der Immunbiologie bestimmter Krebsarten sind beispielsweise von P. van der Bruggen et al. in Current Opinion in Immunology 4(5), 608-612 (1992), besprochen. Andere solche Antigene der MAGE-Serie sind in T. Boon, Adv Cancer Res 58, 177-210 (1992), bestimmt, und MZ2-E- und andere verwandte Tumorantigene sind von P. van der Bruggen et al. in Science 254, 1643-1647 (1991), bestimmt; tumorassoziierte Mucine werden von P.O. Livingston in Current Opinion in Immunology 4(5), 624-629 (1992), erwähnt, z.B. MUC1, wie von J. Burchell et al. in Int J Cancer 44, 691-696 (1989), erwähnt.
Koppeln mit immunmodulierenden Proteinen
Erfindungsgemäße Ausführungsformen, die in der Immunmodulation angewandt werden, umfassen beispielsweise folgende. VP22 kann geeignet mit Beispielen für Cytokine oder, wie nachstehend angeführt, anderen immunmodulierenden Verbindungen gekoppelt werden. Folglich kann VP22 auch geeignet mit immunmodulierenden Proteinen, z.B. jenen, die die Immunantwort verstärken, einschließlich Cytokin, Interleukin 1, Interleukin 2 und dem Granulocyten-Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), gekoppelt werden. Solche Produkte können beispielsweise auf analoge Art und Weise, wie beispielsweise in der WO 96/26267 oder WO 97/14808 beschrieben, verwendet werden, um die für einen Targetzelltyp, z.B. einen Tumorzelltyp, der dem Produkt entweder in vitro oder in vivo ausgesetzt worden ist, spezifische Immunantwort zu verändern, beispielsweise zu verstärken.
Der hierin verwendete Ausdruck "immunmodulierendes Protein" und ähnliche Bezeichnungen umfasst ein Protein bzw. Proteine, die eine Wirtsimmunantwort gegen über einem mutanten Virus oder Protein, das dadurch kodiert ist, oder gegenüber einem Antigen, wie z.B. einem Immunogen aus einem Pathogen oder einer dem Virus exogenen Quelle, oder gegenüber einem tumorassoziierten Antigen verstärken oder unterdrücken. Bei immunmodulierenden Proteinen handelt es sich normalerweise nicht um solche Proteine, die gegenwärtig in ihnen selbst als Immunogene (Antigene) verwendet werden. Ein immunmodulierendes Protein kann ein natürliches Element eines menschlichen oder nichtmenschlichen tierischen Immunsystems, z.B. eines Säugetierimmunsystems, mit einer funktionellen Bindungskapazität für einen anderen natürlichen Bestandteil eines solchen Immunsystems sein. Alternativ dazu kann ein immunmodulierendes Protein ein Protein sein, das von einem Pathogen kodiert ist, das eine funktionelle Bindungskapazität für einen natürlichen Bestandteil eines solchen Immunsystems aufweist.
Alternativ dazu kann ein immunmodulierendes Protein ein künstliches Protein sein, beispielsweise ein Fragment eines natürlichen immunmodulierenden Proteins, oder ein Mutein eines solchen Proteins oder Fragments oder ein Fusionsprotein, das all diese aufnimmt. Viele immunmodulierenden Proteine und genetische Materialien, die für diese kodieren, sowie deren Nucleotid- und Aminosäuresequenzen sind in der Literatur auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung bekannt und in Gensequenzdatenbanken, wie z.B. der EMBL-Datenbank, verfügbar, und einige sind im Handel in Form von gentechnisch verändertem Material zum Klonen und für andere Manipulationen erhältlich.
Immunmodulierende Proteine, die, wie hierin beschrieben, mit VP22 gekoppelt sind, können beispielsweise für Sequenzen geeignet sein, die für die Spezies nativ sind, welche eine Behandlung mit diesen Kopplungsprodukten oder mit DNA erhalten sollen, z.B. in Form von rekombinanten Viren, z.B. ein immunmodulierendes Protein vom menschlichen Typ zur Behandlung eines menschlichen Probanden.
Beispiele für geeignete bekannte immunmodulierende Proteine in diesem Zusammenhang umfassen Cytokine, Chemokine, Bestandteile des Komplementsystems, Immunsystem-Hilfs- sowie -Adhäsionsmoleküle und deren Rezeptoren für menschli che oder nichtmenschliche tierische Spezifitäten. Geeignete Beispiele umfassen GM-CSF, IL-2, IL-12, Lymphotactin, CD40 und CD40L. Weitere geeignete Beispiele umfassen Interleukine, wie z.B. Interleukine 1 bis 15, Interferon alpha, beta oder gamma, Tumornekrosefaktor, Granulocyten-Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF), Granulocytenkolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), Chemokine, wie z.B. Neutrophile aktivierendes Protein (NAP), chemische Makrophagenattraktans und -Aktivierungsfaktor (MCAF), RANTES, Makrophagenentzündungspeptide MIP-1a und MIP-1b, Bestandteil des Komplementsystems und deren Rezeptoren oder ein Hilfsmolekül, wie z.B. B7.1, B7.2, ICAM-1, -2 oder -3 und Cytokinrezeptoren.
OX40 und OX40-Ligand (OX40L) (gp34) (siehe z.B. WO 95/12673, WO 95/21251 und WO 21915) stellen darüber hinaus geeignete Beispiele für immunmodulierende Proteine dar. Immunmodulierende Proteine können für verschiedene Zwecke eine menschliche oder nichtmenschliche tierische Spezifität aufweisen und für vorliegende Zwecke, je nach Fall und Eignung, durch extrazelluläre Domänen und andere Fragmente mit der Bindungsspezifität von natürlich vorkommenden Proteinen und Muteine davon und ihre Fusionsproteine mit anderen Polypeptidsequenzen, beispielsweise mit konstanten Domänen der Immunglobulinschwerketten, dargestellt sein. Wenn Nucleotidsequenzen, die für mehr als ein immunmodulierendes Protein kodieren, eingeführt werden, können sie beispielsweise mehr als ein Cytokin oder eine Kombination von Cytokinen und Hilfs/Adhäsionsmolekülen umfassen.
Immunantworten, die durch die Verwendung von solchen VP22-Kopplungsprodukten oder durch Vektoren, die dafür kodieren, ausgelöst werden, können Immunantworten unterschiedlicher Typen umfassen, wie z.B. eine Antwort gegen ein viral kodiertes Protein und/oder eine Antwort gegen ein Wirtsantigen, was eine Antwort darstellt, die durch einen Virusvektor oder die Expression eines dadurch kodierten heterologen Gens, z.B. des Kopplungsprodukts mit VP22, stimuliert wird. Anwendungsmöglichkeiten für die wie hierin beschriebenen Mutantenvirusvektoren sind z.B. der Schutz eines Probanden einer anfälligen Spezies gegen eine Infektion durch einen entspre chenden Virus vom Wildtyp, wenn der Proband damit behandelt wird, z.B. damit infiziert ist, beispielsweise durch direkte Immunisierung.
Ein mit VP22 zu koppelndes immunmodulierendes Protein kann an sich ein Hybrid- oder Fusionsprotein sein, das eine Polypeptidregion umfasst, die eine Homologie gegenüber einem immunmodulierenden Protein und eine Funktionalität davon aufweist, wobei das immunmodulierende Protein an eine Polypeptidregion mit einer weiteren Homologie und gegebenenfalls einer weiteren Funktionalität gebunden ist. Das immunmodulierende Protein kann bezüglich Funktionalität das gp34-Protein sein, dieses umfassen oder diesem entsprechen, das als Bindungspartner für menschliches Ox-40 bestimmt wurde (siehe W. Godfrey et al., J Exp Med 180(2), 757-762 (1994), und darin enthaltene Verweise, einschließlich S. Miura et al., Mol Cell Biol 11(3), 1313-1325 (1991)). Die Version dieser Proteinfunktionalität, die im Mutantenvirusgenom kodiert werden kann, kann der natürlichen gp34-Sequenz selbst oder einem Fragment davon oder einem Hybridexpressionsprodukt entsprechen, das beispielsweise auf der extrazellulären (C-terminalen) (Bindungs)Domäne von gp34 basiert, die an ein anderes Protein fusioniert ist, z.B. an eine konstante Region einer Immunglobulinschwerkette, wie z.B. Human-IgG1, wobei beispielsweise die extrazelluläre Domäne von gp34 (ein Typ-2-Membranprotein) an ihrem N-Terminus an den C-Terminus der konstanten Immunglobulindomäne fusioniert ist.
Andere immunmodulierte Proteine können auch in solchen Derivat- und Hybridformen getragen und exprimiert werden, einschließlich wie hierin angeführte mutierte Formen.
In bestimmten Beispielen kann das immunmodulierende Protein ein Cytokin, vorzugsweise einen Granulocyten-Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF), z.B. Mäuse- oder vorzugsweise Human-GM-CSF, umfassen.
Sowohl Mäuse- als auch Human-GM-CSF ist allgemein bekannt: Das Mäuse-GM-CSF-Gen kodiert für ein Polypeptid mit 141 Aminosäuren, wobei das reife sekretierte Glykoprotein, je nach Glykosylierungsgrad, ein Molekulargewicht von 14 kDa bis 30 kDa aufweist. Der GM-CSF ist generisch gesehen ein Mitglied der Familie des hämatopoetischen Wachstumsfaktors und wurde zuerst durch seine Fähigkeit, die In-vitro-Koloniebildung bei hämatopoetischen Vorfahren zu stimulieren, definiert und bestimmt. GM-CSF ist ein potenter Aktivator von Neutrophilen, Eosinophilen und Makrophagen-Monocyten-Funktionen und verstärkt die Migration, Phagocytose, Haupthistokompatibilitätskomplex- (MHC-) Expression und initiiert eine Kaskade von bioaktiven Molekülen, die wiederum das Immunsystem stimulieren. GM-CSF wird gegenwärtig klinischen Bewertungen zur Behandlung von Neutropenie, gefolgt von Chemotherapie, und als Adjuvens bei der Krebstherapie unterzogen.
Die angewandte heterologe Nucleotidsequenz kann ein heterologes Gen, ein Genfragment oder eine Kombination von Genen umfassen, mit der Maßgabe, dass sie für ein wie oben definiertes immunmodulierendes Protein kodiert.
Gemäß den erfindungsgemäßen Beispielen können Kombinationen von zwei oder mehr immunmodulierenden Proteinen für den hierin beschriebenen Zweck verwendet werden. In bestimmten Beispielen, die nur zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung dienen, können Kombinationen mit IL2, GMCSF, Lymphotactin und/oder CD40L miteinander oder mit anderen der oben angeführten immunmodulierenden Proteinen verwendet werden. Jede dieser binären Kombinationen der oben angeführten immunmodulierenden Proteine sind auch in dieser Offenbarung angeführt und liegen innerhalb des Schutzumfangs.
Andere Kopplungsprodukte
In bestimmten Ausführungsformen kann sich die vorliegende Erfindung für Gentherapieanwendungen eignen. Folglich kann beispielsweise VP22 auch geeignet mit Beispielen für Gene gekoppelt werden, die bei Gentherapien verwendet werden bzw. deren Verwendung vorgeschlagen wird, einschließlich des Gens für die Humanadenosindeaminase (ADA), wie beispielsweise in der WO 92/10564 (KW Culver et al. US Secretary for Commerce & Cellco Inc.), WO 89/12109 & EP 0.420.911 (IH Pastan et al.) angeführt, und des Gens für zystische Fibrose und Varianten des Gens, die in der WO 91/02796 (L-C Tsui et al., HSC Research & University of Michigan), WO 92/05273 (FS Collins & JM Wilson, University of Michigan) und WO 94/12649 (RJ Gregory et al., Genzyme Corp.) beschrieben ist.
VP22 kann auch geeignet mit bekannten Transkriptionsregulationsproteinen, wie z.B. NF-AT, gekoppelt werden, das durch die Translokation zum Nucleus aktiviert wird und die Transkription von Interleukin, z.B. von IL1, induziert. Das Kuppeln mit VP22 kann hierin dazu verwendet werden, die Retention des gekoppelten Produkts im Cytoplasma zu vermeiden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch gekoppelte Proteine und Fusionsproteine, bei denen eine Linkersequenz bereitgestellt ist, die ermöglicht, dass das Fusionsprotein intrazellulär gespalten wird, um die Trennung eines wie oben angeführten Antigenteils aus dem Transportproteinteil zu ermöglichen. Eine Spaltung induzierende Sequenz kann beispielsweise die Aminosäuresubsequenz RVCSNPPCETHETGTTNTATATSN oder andere Spaltungssequenzen umfassen, die beispielsweise von AC Wilson et al. in Genes and Development 9, 2445-2458 (1995), angeführt sind.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus Verfahren zur Behandlung von Zellen mit wie hierin beschriebenen Kopplungsprodukten bereit, sodass immunogene, immunmodulierende, zytotoxische/letale oder therapeutische Wirkungen erzielt werden.
Beispiele für wie hierin beschriebene Materialien und Verfahren eignen sich zur Modulation von Zellaktivität, mit beispielsweise der Absicht und der Wirkung, Immunantworten, beispielsweise zur Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen, zu erzeugen oder zu verändern; sie dienen beispielsweise der Erzeugung von Immunantworten gegen Pathogene oder Tumoren.
Andere Verwendungen für bestimmte Materialien und Verfahren hiervon umfassen die Regulation der Genexpression in Zellen, z.B. für korrektive Gentherapien und/oder zur Reduktion oder Regulation von Tumorzellwachstum und -aktivität. Zell behandlungen gemäß der vorliegenden Erfindung können in vitro, ex vivo oder in vivo erfolgen.
Unter den VP22-Derivaten, die gemäß den Aspekten der vorliegenden Erfindung als transportaktive Substanzen und zur Kopplung mit zu transportierenden Materialien für die hierin anderweitig dargelegten Zwecke verwendet werden können, sind Peptide, die eine transportaktive funktionelle Sequenz aus dem C-Terminus-Abschnitt von VP22 umfassen.
Nicht einschränkende Beispiele von Behandlungsverfahren unter Verwendung der hierin beschriebenen Materialien umfassen die Behandlung von Antigen präsentierenden Zellen oder diese enthaltenden Zellpräparaten mit einer Fusion von VP22 und einem Antigen, z.B. einem der oben angeführten Antigene (oder mit einem Vektor, z.B. einem Virusvektor, der für eine solche Fusion kodiert), um die Bearbeitung des Antigens und die Präsentierung mittels MHCl-Weg zu bewirken, sodass eine CTL-Antwort gegenüber dem Antigen erhalten wird. Die so bereitgestellten Verfahren umfassen das Priming und die Vermehrung von T-Zellen und adoptive Immuntherapie unter Verwendung der so erhaltenen Materialien auf eine Weise, die ansonsten zu bekannten Priming-, Expansions- und adoptiven Immuntherapieverfahren analog ist.
Eine Reihe von Vektorsystemen wie z.B. retrovirale oder adenovirale Infektion oder die Injektion von Protein-Liposom-Komplexen sowie Herpesvirusvektorsysteme können ohne weiteres angepasst werden, um Beispiele für die vorliegende Erfindung zu ergeben. Beispielsweise kann nackte DNA für eine VP22-Proteinfusion mit einem Protein von einem der hierin angeführten Arten in ein zu behandelndes Gewebe gemäß der Art und dem Zweck des zu transportierenden Proteins injiziert werden. Rekombinante Viren können wie erwähnt zum Kodieren und zur Expression von VP22-Fusionsproteinen verwendet werden. Ein rekombinanter Virusvektor, der eine solche Fusion trägt, kann defekt, nichtreplizierend oder replikationseingeschränkt sein, sodass die Replikation von Bedingungen abhängt, die im Targetgewebe oder der -zelle vorliegen, nicht jedoch in normalen Zellen oder Nicht-Targetzellen.
Vektoren und Fusionsproteine von erfindungsgemäßen Beispielen können in der Gentherapie eingesetzt werden sowie zur Behandlung von oder zum Schutz gegen abnormale Zellvermehrung, insbesondere bei Krebs, jedoch auch bei Psoriasis, Atherosklerose und arterieller Restenose, und zum Induzieren von Apoptose von beispielsweise sich vermehrenden Lymphozyten, und zwar zur Toleranzinduktion, um beispielsweise Transplantatabstoßungen zu verhindern oder Autoimmunerkrankungen, wie z.B. systemischen Lupus erythematodes oder rheumatische Arthritis, zu behandeln.
Zusätzlich zu medizinisch-therapeutischen Anwendungen kann die hierin dargelegte Wirkung auch mittels Tests, die durch die Erfindung bereitgestellt sind, ausgewertet werden, die auf Substrat-Enzym-Wechselwirkungen oder der Wechselwirkung von Proteinen, die in unterschiedlichen Zellpopulationen exprimiert sind, beruhen.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform ist zudem anhand der beigefügten Zeichnungen sowie der nachstehend beschriebenen Materialien und Verfahren beschrieben, ohne dass dabei eine Einschränkung der Erfindung beabsichtigt wird.
In den beigefügten Zeichnungen wird in
1 veranschaulicht, dass
scheintransfizierte cos-1-Zellen mit Antikörpern für BP22 (1a), p53 (1c) und dem CMV-Epitop (1d) durch indirekte Immunfluoreszenz markiert wurden, um den Grad der Hintergrundmarkierung einzustellen. Zellen, die mit pc49epB (1b) transfiziert und für VP22 markiert wurden, zeigen eine typische VP22-Cytoplasma-Struktur mit einer klaren Ausbreitung zu den Nuclei der angrenzenden Zellen hin. Zellen, die mit dem VP22-p53-Fusionsproteinkonstrukt p4953ep+10 transfiziert sind, wurden für VP22 und p53 (1e und 1f) oder VP22 und das Epitop (1g und 1h) markiert, wobei das Fusionsprotein in den Nuclei der an die Primärexpressionszelle angrenzenden Zellen nachgewiesen werden kann.
2 ist eine Plasmidkarte zur Veranschaulichung von p4953ep+10, das für ein Fusionsprotein kodiert, das die Sequenzen VP22, p53 und eine Epitop-Tag-Sequenz aufweist.
In 3 wird veranschaulicht, dass
Proteinextrakte aus cos-1-Zellen, die mit einer Reihe von Plasmidkonstrukten transfiziert sind, mittels Western-Blot analysiert wurden. Das Feld ganz links wurde mit einem Antikörper gegen VP22 sondiert, was zeigte, dass pUL49epB- und pc49epB-Plasmide, die für VP22 allein kodieren, ein Protein mit 38 kDa erzeugen, wobei das VP22-p53-Fusionsprotein, das aus p4953ep+10 exprimiert ist, ein Protein mit etwa 90 kDa mit sehr geringem Abbau bildet.
Das Feld ganz rechts wurde mit einem Antikörper gegen p53 sondiert, was zeigte, dass Zellen, die mit Plasmiden transfiziert sind und entweder für p53 allein (pcB6+p53) oder das p4953ep+10-Fusionsproteinkonsrukt kodieren, ein p53-Protein mit 53 kDa ergeben. Das p4953ep+10-Konstrukt synthetisiert auch das VP22-p53-Fusionsprotein mit 90 kDa, wobei das p53 in dieser Probe ein Abbauprodukt oder eher ein endogen induziertes p53 sein kann.
Materialien und Verfahren
Zellkultur und Transfektion
Cos-1-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem MEM, das mit 10% Serum eines neugeborenen Kalbs ergänzt war, bei 37°C mit 5% CO₂ gezüchtet.
Transfektionen wurden unter Anwendung des BES/CaCl₂-Verfahrens (Elliott und O-Hara (1997)) mit 200 ng Testplasmid mit 1.800 ng pUB19 durchgeführt. Die Transfektionen wurden 48 h lang fortschreiten gelassen, wonach die Monoschichten zur Analyse mittels Immunfluoreszenz oder Western-Blot gesammelt wurden.
Immunfluoreszenz und Antikörper
Zellmonoschichten auf Deckgläsern wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 100% Methanol fixiert und, wie von Elliot und O'Hare (1997) beschrieben, markiert. Sämtliche Antikörper wurden in PBS + 10% Serum verdünnt. VP22 wurde unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers AGV30 (1:500) nachgewiesen; p53 wurde mit einem monoklonalen Mäuse-Antikörper DO-1 (Santa-Cruz Ltd) nachgewiesen; das CMV-Epitop wurde mit einem monoklonalen Mäuse-Antikörper CMV LNA (Capricorn Ltd) nachgewiesen. Aufnahmen wurden mittels konfokalem Mikroskop Bio-Rad MRC600 erhalten.
Plasmidkonstrukte
Das VP22-p53-Fusionsproteinkonstrukt wurde durch Klonieren eines p53-PCR-Fragments voller Länge C-terminal zu VP22 in eine einzigartige Bam-Stelle gebildet, wobei sowohl VP22 als auch das CMV-Epitop im Rahmen gehalten wurden.
Western-Blot-Analyse
Western-Blots wurden mit Anti-VP22 (1:10.000) und Anti-p53 (1:1.000) untersucht.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung konstruierten ein Epitop-markiertes In-Frame-VP22-p53-Fusionsproteinkonstrukt voller Länge (2). Dieser Vektor bildet bei einer Expression in Cos-1-Zellen ein Fusionsprotein mit etwa 90 kDa bei sehr geringem Proteinabbau, wie durch Western-Blot-Analyse (3) ermittelt wurde. Beim Testen zum Transport durch interzelluläres Trafficking scheint das Fusionsprotein exakt gleich wie VP22 allein zu funktionieren. Es befindet sich im Cytoplasma von primär-transfizierten Zellen, wie durch Immunfluoreszenz unter Verwendung von Methanol-fixierten Cos-1-Zellmonoschichten gezeigt wurde, die mit Anti-VP22- (1e und 1g), -p53- (1f) oder -Epitop- (1h) Antikörpern markiert waren, und kann sich sehr wirksam in Nuclei benachbarter Zellen bewegen. Die relative Trans portwirksamkeit ist nicht empirisch bestimmt worden, wobei es scheint, dass sie etwas weniger wirksam als VP22 allein ist.
In weiteren Experimenten wurden p53-negative Osteosarkomzellen mit nackter DNA (mittels Calciumphosphatverfahren) transfiziert, die durch Expression entweder für (a) VP22 vom Wildtyp, (b) p53 vom Wildtyp oder (c) VP22-p53-Fusionsprotein, das oben beschrieben ist, kodiert. Die transfizierten Zellen (b) und (c) zeigten, dass sie im Gegensatz zu den Kontrollzellen (a) einer Apoptose unterzogen werden konnten, was darauf hinweist, dass das VP22-p53-Fusionsprotein die Funktionalität von p53 beibehält.
In Varianten der hier angeführten Beispiele können VP22-Deletionskonstrukte mit reduzierter Fusionsproteingröße nach Wunsch hergestellt werden, um beispielsweise den Grad oder das Ausmaß des Transports zu verbessern, ohne dabei die Proteinfunktion zu verlieren.
In weiteren Varianten kann die Reihenfolge der Komponenten der Fusion variiert werden; beispielsweise können die p53- und VP22-Sequenzen ohne weiteres mit zufrieden stellenden Ergebnissen in der Reihenfolge sein, die der Reihenfolge entgegengesetzt ist, welche mit dem in 2 dargelegten Plasmid in Zusammenhang steht.
Die vorliegende Offenbarung erstreckt sich auf Modifikationen und Variationen der hierin gegebenen Beschreibung einschließlich der beigefügten Ansprüche, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung offensichtlich sind.
Zusätzliche Verweise

Diller, L., Kassel, J. Nelson, C.E., Gryka, M.A., Litwak, G., Gebhardt, M. Bressac, B., Ozturk, M., Baker, S.J., Vogelstein, B. und S.H. Friend, (1990) p53 functions as a cell cycle control protein in osteosarcomas. Mol. Cell. Bio. 10:5772-5781.
Elliott G. und P. O'Hare (1997) Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell 88:223-233.
Ensoli, B., Buonaguro, L., Barillari, G., Fiorelli, V., Gendelman, R., Morgan, R.A., Wingfield, P. und R. C. Gallo. (1993) Release uptake and effects of extracellular human immunodeficiency virus Tat protein on cell growth and viral transactivation. J. Virol. 67:277-287.
Fawell, S., Seery, J., Daikh, Y., Moore, C., Chen, L.L., Pepinsky, B. und J. Barsoum. (1994) Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 91:664-668.
Hamada, K., Alemany, R., Zhang, W-W, Hittelman, W.N., Lotan, R., Roth, J.A. und M.F. Mitchell. (1996) Adenovirus-mediated transfer of a wild-type p53 gene and induction of apoptosis in cervical cancer. Cancer Research 56:3047-3054.
Jackson, A., Friedman, S., Zhan, X., Engleka, K.A., Forough R. und T. Maciag. (1992) Heat shock induces the release of fibroblast growth factor 1 from NIH3T3 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 89:10691-10695.
Kumar, X, M., Srinivas, S., Detolla, L.J., Yu S.F., Stass, S.A. und A.J. Mixson. (1997) Parenteral gene therapy with p53 inhibits human breast cancer tumors in vivo through a bystander effect without evidence of toxicity. Hum Gene Therapy 8:177-185.
Levine, A.J. (1997) p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 88:323-331.
Nielsen, L.L.; Dell, J., Maxwell, E., Armstrong, L., Maneval, D. und J.J. Catino. (1997) Efficacy of p53 adenovirus-mediated gene therapy against human breast cancer xenografts. Cancer Gene Therapy 4:129-138.
Sandig, V., Brand, K., Herwig, S., Lukas, J., Bartek, J. und M. Strauss. (1997) Adenovirally transferred p16 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death. Nature Med. 3:313-319.
Zheng, P.S., Iwasaka, T., Ouchida, M., Fukuda, K., Yokoyama, M. und H. Sugimori. (1996) Growth suppression of a cervical cancer cell line (TMCC-1) by the human wild type p53 gene. Gynecol Oncol. 60:245-250.

Claims

Gekoppelte Polypeptide und Fusionspolypeptide, umfassend: (i) eine Herpesvirus-VP22-Polypeptidsequenz mit der Eigenschaft, dass sie ein transportaktives Polypeptid ist, das einen Transport in Zellen vermitteln kann, zusammen mit (ii) einem Protein oder einer Polypeptidsequenz, ausgewählt aus: (a) einem Protein zum Blockieren der Zellzyklusprogression, das entweder ein p53-Protein zum Blockieren der Zellzyklusprogression oder ein cyclinabhängiger Kinase-Inhibitor ist; (b) einem Suizidprotein, das bedingt zytotoxisch oder letal ist, d.h. zytotoxisch oder letal ist, wenn einer Zelle, die das Suizidprotein enthält, ein entsprechendes Prodrug oder eine entsprechende Aktivatorverbindung verabreicht wird; (c) einer anderen mikrobiellen oder viralen antigenen Sequenz als einem Epitop mit einer Länge von 10 Aminosäuren, für welches das HCMV-Gen UL-83 kodiert; oder einer antigenen Sequenz von einem Papilloma-Virus-L1- oder -L2-Protein, einem HIV-gag-, -pol-, -env- oder -nef-Polypeptid, einem Chlamydiaantigen, einem mycobakteriellen Antigen oder einem MAGE-Protein; oder (d) einem immunmodulierenden Protein, das ein Komplementkomponentenprotein oder ein Cytokinrezeptorprotein ist, oder GM-CSF, Lymphotactin, CD40, CD40L oder einem von IL-1 bis IL-15, Interferon alpha, beta oder gamma, Tumornekrosefaktor, einem Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor, Granulocytenkolonie stimulierenden Faktor, Neutrophile aktivierenden Protein, chemischen Makrophagenattraktans und Aktivierungsfaktor, MIP-1a oder MIP-1b, B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2 oder ICAM-3, OX40 oder OX40L.
Polypeptid nach Anspruch 1, das ein Fusionspolypeptid ist, worin die Sequenz (ii) ein p53-Protein zum Blockieren der Zellzyklusprogression oder ein cyclinabhängiger Kinase-Inhibitor ist.
Polypeptid nach Anspruch 2, worin die Sequenz (ii) ein p53-Protein zum Blockieren der Zellzyklusprogression ist.
Polypeptid nach Anspruch 2, worin die Sequenz (ii) ein cyclinabhängiger Kinase-Inhibitor ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, worin die Sequenz (ii) von einem Suizidprotein stammt.
Polypeptid nach Anspruch 5, worin das Suizidprotein Thymidinkinase oder Nitroreductase ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, das ein Fusionspolypeptid ist und zwischen den Sequenzen (i) und (ii) eine Spaltung induzierende Linkersequenz umfasst.
Polynucleotid, das für ein Fusionspolypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
Polynucleotid nach Anspruch 8, worin die Sequenz für ein Fusionspolypeptid kodiert, das (i) eine Herpesvirus-VP22-Polypeptidsequenz mit der Eigenschaft, dass sie ein transportaktives Polypeptid ist, dass einen Transport in Zellen vermitteln kann; und (ii) ein p53-Protein zum Blockieren der Zellzyklusprogression oder einen cyclinabhängigen Kinase-Inhibitor umfasst.
Expressionsvektor, umfassend ein Polynucleotid nach Anspruch 8.
Expressionsvektor nach Anspruch 10, worin das Polynucleotid in einem Virusvektor enthalten ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 10, worin das Polynucleotid in einem Liposom-Protein-Komplex enthalten ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 11 oder 12, ein Polynucleotid nach Anspruch 9 umfassend.
Verwendung eines Fusionspolypeptids nach Anspruch 2 bei der Herstellung eines Medikaments zum Blockieren der Zellzyklusprogression von malignen Zellen.
Verwendung eines Vektors nach Anspruch 13, worin die Sequenz für ein Polypeptid nach Anspruch 3 kodiert, bei der Herstellung eines Medikaments zum Blockieren der Zellzyklusprogression von malignen Zellen.