DE10001230A1 - Immunisierungsmittel - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusionsprotein, umfassend Zell-Import/Export-Signalsequenzen und ein zur Immunisierung eines Individuums gegen eine Erkrankung geeignetes Antigen, und eine hierfür kodierende DNA sowie die Verwendung beider zur Immunisierung eines Individuums gegen Erkrankungen, insbesondere Infektions-bedingte, Autoimmun- und Tumor-Erkrankungen.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fusionsprotein und eine
hierfür kodierende DNA sowie die Verwendung beider zur
Immunisierung eines Individuums gegen Erkrankungen,
insbesondere Infektions-bedingte, Autoimmun- und Tumor-
Erkrankungen.
Bei vielen Erkrankungen wird zunehmend versucht, durch
Immunisierungs-Maßnahmen eine Prophylaxe und/oder Therapie zu
erreichen. Solche Erkrankungen sind z. B. virale und
Tumorerkrankungen, wobei letztere insbesondere solche sind,
die mit humanen Papillomviren (HPV) assoziiert sind. Durch die
Immunisierungs-Maßnahmen werden Antikörper induziert bzw.
cytotoxische T-Zellen stimuliert, die gegen mit diesen
Erkrankungen assoziierte Antigene gerichtet sind. Allerdings
zeigen diese Maßnahmen oft nicht den gewünschten Erfolg.
Insbesondere erfolgt vielfach keine ausreichende Stimulierung
von cytotoxischen T-Zellen, was letztlich eine Prophylaxe oder
Therapie verhindert.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde,
ein Mittel bereitzustellen, mit dem ein Individuum gegen
Erkrankungen, insbesondere virale und Tumor-Erkrankungen,
immunisiert werden kann, wobei die vorstehenden Nachteile
vermieden werden.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den
Patentansprüchen erreicht.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des
Anmelders, daß in Proteinen, z. B. dem VP22-Protein von Herpes
Simplex Virus Typl (HSV 1), Sequenzen vorliegen, die diesen
Proteinen bzw. heterologen mit diesen Proteinen verbundenen
Proteinen die Fähigkeit verleihen, in Zellen einzutreten und
aus diesen wieder auszutreten, wobei dies auch umgekehrt
erfolgen kann. Solche Sequenzen werden nachstehend mit "Zell-
Import/Export-Signalsequenzen" bezeichnet. Ferner hat der
Anmelder erkannt, daß Antigene, die Zell-Import/Export-
Signalsequenzen aufweisen, zu einer effizienteren Stimulierung
von cytotoxischen T-Zellen und somit zu einer wirksameren
Immunisierung eines Individuums führen als dies mit den
Antigenen alleine möglich ist. Es wird auf die nachstehenden
Beispiele verwiesen.
Erfindungsgemäß werden diese Erkenntnisse des Anmelders
genutzt, ein Fusionsprotein bereitzustellen, das Zell-
Import/Export-Signalsequenzen und ein zur Immunisierung eines
Individuums gegen eine Erkrankung geeignetes Antigen umfaßt.
Der verwendete Ausdruck "Zell-Import/Export-Signalsequenzen"
umfaßt Sequenzen jeglicher Art und Herkunft, die Proteinen
bzw. Fusionsproteinen die Fähigkeit verleihen, in Zellen
einzutreten und aus diesen wieder auszutreten, wobei dies auch
umgekehrt erfolgen kann. Die Sequenzen können künstlicher Art
sein oder von in der Natur vorliegenden Proteinen, z. B.
viralen Proteinen, insbesondere dem VP22-Protein von HSV 1,
stammen. Die Sequenzen können in Wildtyp- oder veränderter
Form vorliegen, wobei letztere Form Veränderungen der
Aminosäuresequenz, wie Additionen, Deletionen, Substitutionen
und/oder Inversionen von ein oder mehreren Aminosäuren umfaßt.
Der verwendete Ausdruck "Individuum" umfaßt ein Individuum
jeglicher Art und Herkunft, das Erkrankungen aufweisen kann,
gegen die eine Immunisierung denkbar ist. Beispiele eines
solchen Individuums sind der Mensch und das Tier sowie Zellen
von diesen. Als Erkrankungen sind z. B. zu nennen, Infektions
bedingte Erkrankungen, wie Virus-Infektionen, z. B. durch
Hepatitis B-, Hepatitis C-, Herpes Simplex-, HI- oder
Influenza-Virus, Protozoen-Infektionen, z. B. durch Plasmodien,
bakterielle Infektionen, z. B. durch Pseudomonaden, Autoimmun-
Erkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, Diabetes und Multiple
Sklerose, und Tumor-Erkrankungen, wie solche, die mit HPV,
insbesondere HPV 16 oder HPV 18, assoziiert sind,
beispielsweise Carcinome des oberen Respirationstraktes oder
Anogenital-Carcinome, insbesondere das Cervix-Carcinom und
seine Vorstufen, wie cervikale intraepitheliale Neoplasie (CIN
I-III), Carcinome in situ (CIS), etc.
Der verwendete Ausdruck "ein zur Immunisierung eines
Individuums gegen Erkrankungen geeignetes Antigen" umfaßt ein
Antigen jeglicher Art und Herkunft, das sich zur Immunisierung
eines Individuums gegen eine Erkrankung eignet. Hinsichtlich
der Ausdrücke "Individuum" und "Erkrankung" wird auf
vorstehende Ausführungen verwiesen. Das Antigen kann
künstlicher Art oder ein in der Natur vorliegendes Protein
(Polypeptid), bzw. ein Teil (Peptid) davon sein. Ferner kann
das Protein ein Virus-Protein, wie ein HBV-Oberflächenprotein,
HCV-Glykoprotein E2, HSV-Glykoprotein B, HIV-Glykoprotein gp
160 oder IV-Hemagglutinin, ein Protozoen-Protein, wie PyHEP
17, ein Tumor-Protein, wie ein durch HPV kodiertes Protein,
insbesondere ein frühes HPV-Protein, z. B. E6 oder E7, oder ein
aus dem Individuum stammendes Protein sein. Ferner kann das
Protein in Wildtyp- oder veränderter Form vorliegen, wobei
letztere Form Veränderungen der Aminosäuresequenz, wie
Additionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen
von ein oder mehreren Aminosäuren umfaßt. Günstig kann es
sein, wenn das Protein in Form eines CD8+-T-Zell Epitops
vorliegt. Ein solches Epitop wird von CD8+-T-Zellen erkannt,
d. h. das Epitop ist HLA restringiert. CD8+-Zell Epitope von
Proteinen können durch dem Fachmann bekannte Verfahren,
insbesondere durch Verwendung eines Softwaresystems des NIH
(NIH bioinformation service http:/bimas.dcrt.nih.gov.cgi
bin/molbio/ken_parker_comboform) ermittelt werden.
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins können
übliche Verfahren verwendet werden. Es wird auf Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N. Y. (1989)
verwiesen. Ein bevorzugtes Fusionsprotein umfaßt VP22 und E7
bzw. VP22 und E71-60.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine
Nukleinsäure, die für ein vorstehendes Fusionsprotein kodiert.
Eine solche Nukleinsäure ist z. B. eine RNA oder eine DNA.
Günstig ist es, wenn die Nukleinsäure mit für ihre Expression
geeigneten Elementen oder in Verbindung mit einem Vektor
vorliegt. Beispiele solcher Elemente sind Promotoren und
Enhancer, wie CMV-, SV40-, RVS-40-, Metallothionein I und
Polyhedrin-Promotor bzw. CMV- und SV40-Enhancer. Günstig ist
es, wenn die Promotoren und/oder Enhancer gewebespezifisch
sind. Weitere für die Expression geeignete Sequenzen gehen aus
Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology
185, Academic Press, San Diego, CA (1990) hervor.
Darüberhinaus können als Vektoren jegliche für die Expression
in Säugerzellen geeignete Vektoren verwendet werden. Dies sind
z. B. pMSX, pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4 sowie von pcDNAI/amp,
pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2,
pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo und pHyg stammende Vektoren.
Auch können als Vektoren Viren, z. B. Adenovirus, Vaccinia-
Virus, Lenti-Virus, Alpha-Virus oder Adeno-assoziiertes Virus
verwendet werden. Besonders bevorzugt sind Retroviren, wie
MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GALV.
Zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure (DNA)
insbesondere von Vektoren, die eine solche enthalten, können
übliche Verfahren verwendet werden. Es wird auf Sambrook et
al., supra, verwiesen. Eine bevorzugte DNA kodiert für das
Fusionsprotein VP22-E7 bzw. VP22-E71-60. Eine solche DNA wurde
bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und
Zellkulturen) als E.coli DH5alpha pcDNA 3.1-VP22-E7#48 unter
DSM 13231 am 12. Januar 2000 bzw. als E.coli DHSalpha pcDNA
3.1-VP22-E71-60#87 unter DSM 13232 am 12. Januar 2000
hinterlegt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine
pharmazeutische Zusammensetzung. Eine solche umfaßt ein
vorstehendes Fusionsprotein und/oder eine vorstehende
Nukleinsäure sowie übliche Hilfsstoffe, wobei von dem
Fusionsprotein und/oder der Nukleinsäure jeweils ein oder
mehrere unterschiedliche Vertreter vorliegen können.
Der verwendete Ausdruck "übliche Hilfsstoffe" umfaßt jegliche
Hilfsstoffe, die sich für eine pharmazeutische Zusammensetzung
zur Immunisierung eines Individuums eignen. Solche Hilfsstoffe
sind z. B. Immunisierungs-Adjuvantien, gepufferte
Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, z. B. Öl/Wasser-
Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen, Cytokine etc.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, Individuen,
insbesondere den Menschen und Tiere, gegen mit Erkrankungen,
z. B. virale und Tumorerkrankungen, assoziierte Antigene zu
immunisieren. Solche Erkrankungen werden vorstehend näher
erläutert. Zur Immunisierung eines Individuums wird (werden)
diesem ein erfindunsgemäßes Fusionsprotein und/oder eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure, vorzugsweise in Form einer
erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung,
verabreicht. Die Verabreichungsmenge hängt dabei davon ab, ob
ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein oder eine
erfindungsgemäße Nukleinsäure verwendet wird. Auch hängt die
Verabreichungsmenge davon ab, ob die Immunisierung des
Individuums mehr auf eine Induktion von Antikörpern oder mehr
auf eine Stimulierung von cytotoxischen T-Zellen abzielt.
Beide Möglichkeiten der Immunisierung können durch die
vorliegende Erfindung erreicht werden. Desweiteren hängt die
Verabreichungsmenge davon ab, ob die Immunisierung als
prophylaktische oder therapeutische Behandlung beabsichtigt
ist. Darüber hinaus spielt das Alter, das Geschlecht und das
Gewicht des Individuums eine Rolle für die Bestimmung der
Verabreichunsmenge. Jedenfalls kann die Art und die
Verabreichungsmenge des erfindunsgemäßen Gegenstandes
individuell durch den behandelnden Arzt eingestellt werden.
Fig. 1 zeigt eine für das erfindungsgemäße Fusionsprotein
VP22-E7 kodierende DNA.
Fig. 2 zeigt die cytotoxische Aktivität von Milzzellen
pcDNA3.1(+) E7 bzw. pcDNA3.1(-) VP22-E7
immunisierter C57B1/6 Mäuse. Primärkulturen (C1-F1,
C2-F2) aus C57B1/6 Mäusen nach Immunisierung mit
100 µg pcDNA3.1(-) VP22-E7 bzw. pcDNA3.1(+)E7 und
pcDNA3.1(-), wobei die letzteren beiden als
Kontrolle dienen, werden zweimal, entweder mit E749-
57-Peptid (E7-Peptid), oder RMA-E7 Zellen
restimuliert und im Cytotoxicitätstest analysiert.
Als Zielzellen werden RMA-E7 Zellen (⬩i Speidel et
al. Eur. J. Immunol. 27 (1997), 2391-2399), RMA Zellen
(▲i Ljungreen et al., J. Exp. Med. 162, (1985), 1747-
1757) oder E749-57-PePtld beladene RMA Zellen
verwendet (∎i Feldkamp et al., Eur. J. Immunol. 23
(1993), 2242-2249). E/Z = Verhältnis von CTL (E) zu
Zielzellen (Z) im Ansatz.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele
erläutert.
Es wird ein Expressionsvektor hergestellt, der für ein
erfindungsgemäßes Fusionsprotein kodiert, welches das VP22
Protein von HSV1 als Zell-Import/Export-Signalsequenzen und
das E7-Protein von HPV 16 als Antigen umfaßt. Hierzu wird der
Vektor pBCHGVP22 verwendet, der eine für VP22 kodierende DNA
enthält. Durch eine PCR-Reaktion wird diese DNA amplifiziert
und als Fragment von ca. 930 bp erhalten. Dieses weist am 5'-
Ende eine BamHI-Restriktionsstelle und ATG und am 3'-Ende die
Restriktionsstellen EcoRV-Stopp-HindIII auf. Das Fragment wird
in den entsprechend gespaltenen Vektor pBlueskriptIIKS(+)
Ferner wird der Vektor #510 verwendet, der eine für das HPV 16
E7-Protein kodierende DNA flankiert von zwei EcoRV-
Restriktionsstellen, enthält. Dieser Vektor wird mit EcoRV
gespalten und die HPV 16 E7-Protein kodierende DNA wird als
Fragment von ca 297 bp erhalten. Dieses Fragment wird in den
mit EcoRV gespaltenen Vektor pBlueskript-VP22 inseriert. Es
wird der Vektor pBluescript VP22-E7 erhalten.
Nach Spaltung des Vektors pBluescript VP22-E7 mit den
Restriktionsenzymen BamHI und Hindill wird die für das
erfindungsgemäße Fusionsprotein VP22-E7 kodierende DNA isoliert
und in die entsprechend gespaltenen Expressionsvektoren
pET28a(+) und pcDNA3.1(-) inseriert, wodurch die
erfindungsgemäßen Expressionsvektoren pET28a(+)-VP22-E7 und
pcDNA3.1(-)-VP22-E7 erhalten werden. Der erstere
Expressionsvektor eignet sich für die Expression in
Prokaryonten während der letztere für die Expression in
Eukaryonten geeignet ist.
Der Expressionsvektor pET28a(+)-VP22-E7 kodiert für ein
Doppel-Fusions-Protein aus 6 Histidin-Resten (N-
Terminuspartner) und dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein
VP22-E7 (C-Terminuspartner). pET28a(+)-VP22-E7 wird zur Trans
formation von E.coli BL21 verwendet. Die Bakterien werden in
einem LB-Medium mit 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit
1 mM Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induziert. Durch
Zugabe von 6 M Guanidinhydrochlorid wird eine Lyse der
Bakterien erreicht, anschließend wird mit dem Lysat eine
Chromatographie (Ni-NTA-Resin) in Gegenwart von 8 M Harnstoff
entsprechend der Angaben des Herstellers (Qiagen) des Chroma
tographie-Materials durchgeführt. Das gebundene Doppel-
Fusionsprotein wird in einem Puffer mit pH 3,5 eluiert. Nach
seiner Neutralisierung wird das Doppel-Fusionsprotein einer 18
% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen und mit Coo
massie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J. O. und Kornberg, R. D.,
J. Mol. Biol. 149 (1975), 709-733).
Es zeigt sich, daß ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein in
hochreiner Form hergestellt werden kann.
Hierzu werden sechs C57/B1/6 Mäuse mit dem Expressionsvektor
pcDNA3.1(-)VP-22 von Beispiel 1 immunisiert. Aus den
Mäusemilzen werden Lymphozyten-Primärkulturen isoliert,
gesplittet und cytotoxische T-Zellen zweimal mit RMA-E7 Zellen
oder E7-Peptid in vitro restimuliert. Danach wird die
cytotoxische Aktivität der T-Zellen auf verschiedene
Zielzellen (RMA-E7, E7-Peptid-beladene und unbeladene RMA-
Zellen) in Cytotoxizitätstests analysiert (vgl. Fig. 2).
Es zeigt sich, daß durch den erfindungsgemäßen
Expressionsvektor eine cytotoxische T-Zell-Aktivität, sowohl
nach Restimulierung mit RMA-E7 Zellen (F1) als auch nach
Restimulierung mit E7-Peptid (F2) erhaben wird. Keine
cytotoxische T-Zell-Aktivität wird allerdings erhalten, wenn
der Kontroll-Expressionsvektor pcDNA3.1(+) E7 bzw. pcDNA3.1(-)
verwendet wird, was die überlegene Wirkung der vorliegenden
Erfindung gegenüber der Verwendung eines Antigens ohne Zell-
Import/Export-Signalsequenzen verdeutlicht (vgl. auch Tabelle
1).
Claims (13)
1. Fusionsprotein, umfassend Zell-Import/Export-
Signalsequenzen und ein zur Immunisierung eines
Individuums gegen eine Erkrankung geeignetes Antigen.
2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die Zell-Import-
Export-Signalsequenzen von einem viralen Protein stammen.
3. Fusionsprotein nach Anspruch 2, wobei das virale Protein
VP22 von HSV-1 ist.
4. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das
Antigen ein Tumorantigen ist.
5. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das
Antigen ein virales Protein ist.
6. Fusionsprotein nach Anspruch 5, wobei das virale Protein E6
von HPV stammt.
7. Fusionsprotein nach Anspruch 6, wobei das HPV-Protein E6
oder E7 ist.
8. DNA, kodierend für das Fusionsprotein nach einem der
Ansprüche 1-7.
9. DNA nach Anspruch 8, wobei die DNA auf einem Virus-Vektor
vorliegt.
10. DNA nach Anspruch 9, wobei der Virus-Vektor ein
Adenovirus-, Vaccinia Virus-, Lenti-Virus-, Alpha-Virus
oder ein Adeno-assoziiertes Virus ist.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das
Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1-7, und/oder die
DNA nach einem der Ansprüche 8-10 sowie übliche
Hilfsstoffe.
12. Verwendung des Fusionsproteins nach einem der Ansprüche
1-7, der DNA nach einem der Ansprüche 8-10 oder der
pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 11 zur
Immunisierung eines Individuums gegen eine Erkrankung.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Erkrankung eine
Infektions-bedingte, Autoimmun- oder Tumor-Erkrankung
ist.
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