DE69824013T2

DE69824013T2 - Impfstoff gegen hpv

Info

Publication number: DE69824013T2
Application number: DE69824013T
Authority: DE
Inventors: Claudine Bruck; Teresa Cabezon Silva; Anne-Marie E.F. Delisse; Catherine Marie G. Gerard; Angela Lombardo-Bencheikh
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1997-08-22
Filing date: 1998-08-17
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2018-08-18
Also published as: CA2301920A1; ATE267211T1; US20020182221A1; NZ502632A; HUP0004327A1; AU732946B2; GB9717953D0; TR200000480T2; BR9812139A; NO20000850D0; CN1276833A; ZA987591B; EP1007551A2; PL339009A1; DE69824013D1; AU9263998A; UY25146A1; IL134392A0; CA2301920C; EP1007551B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Fusionsproteine, die ein Protein oder einen Teil eines Proteins, das T-Helferepitope bereitstellt, und ein Antigen aus einem humanen Papilloma-Virus umfassen, die Anwendung in der Behandlung oder Prophylaxe von durch humanes Papillom induzierten Tumoren finden. Insbesondere betrifft die Erfindung Fusionsproteine, die E6- oder E7-Protein aus HPV-Stamm 16 oder 18 umfassen, gebunden an Protein D aus Haemophilus influenza B.
Papilloma-Viren sind kleine nackte DNA-Tumorviren (7,9 Kilobasen, doppelsträngig), die hoch artenspezifisch sind. Über 70 individuelle humane Papilloma-Virus-HPV)-Genotypen wurden beschrieben. Papilloma-Viren werden auf der Basis der Ursprungsart (human, bovin, etc.) und des genetischen Verwandtheitsgrades mit anderen Papilloma-Viren aus der gleichen Art klassifiziert. HPVs sind allgemein spezifisch für die Haut- oder Schleimhautoberflächen und werden allgemein klassifiziert in "geringes" und "hohes" Risiko auf der Basis des seltenen bzw. häufigen Nachweises in abnormalem oder Tumorgewebe. HPVs mit niedrigem Risiko verursachen gewöhnlich gutartige Läsionen (Warzen oder Papillomen), die für mehrere Monate oder Jahre fortbestehen. HPVs mit hohem Risiko sind mit Krebs verbunden. Die stärkste positive Assoziation zwischen einem HPV-Virus und menschlichem Krebs ist diejenige, die zwischen HPV16 und 18 und dem Zervixkarzinom existiert. Mehr als zehn andere HPV-Typen wurden ebenfalls in Zervixkarzinomen gefunden, einschließlich HPV31 und HPV33, obwohl mit geringerer Häufigkeit.
Eine genitale HPV-Infektion bei jungen geschlechtlich aktiven Frauen ist häufig, und die meisten Individuen klären entweder die Infektion, oder, falls sich Läsionen entwickeln, bilden sich diese zurück. Nur eine Untergruppe von infizierten Individuen besitzt Läsionen, die zu einer höhergradigen intraepithelialen Neoplasie fortschreiten, und nur ein Bruchteil von diesen schreitet weiter zu einem invasiven Karzinom fort.
Die molekularen Ereignisse, die zur einer HPV-Infektion führen, wurden noch nicht klar festgestellt. Der Mangel an einem angemessenen in- vitro-System zu Vermehrung von humanen Papilloma-Viren hat den Fortschritt zur besten Information über den viralen Zyklus behindert.
Bis heute wurden die unterschiedlichen Typen von HPVs mit Hilfe der Klonierungssysteme in Bakterien und in neuerer Zeit durch PCR-Amplifikation isoliert und charakterisiert. Die molekulare Organisation der HPV-Genome wurde auf einer vergleichenden Basis mit derjenigen des gut charakterisierten bovinen Papilloma-Virus Typ 1 (BPV1) definiert.
Obwohl kleinere Variationen auftreten, besitzen alle beschriebenen HPV-Genome wenigstens sieben frühe Gene, E1 bis E7, und zwei späte Gene, L1 und L2. Zusätzlich beherbergt eine stromaufwärts gelegene regulatorische Region die Regulationssequenzen, die die meisten Transkriptionsereignisse des HPV-Genoms zu kontrollieren scheinen.
E1- und E2-Gene sind an der viralen Replikation bzw. Transkriptionskontrolle beteiligt und neigen dazu, durch virale Integration unterbrochen zu werden. E6 und E7 sind an der viralen Transformation beteiligt. E5 wurde ebenfalls mit diesem Prozeß in Verbindung gebracht.
Bei den im Zervixkarzinom beteiligten HPVs, wie HPV16 und 18, beginnt der onkogene Prozeß nach der Integration viraler DNA. Die Integration führt zur Inaktivierung von Genen, die für die Kapsidproteine L1 und L2 codieren, und der Verlust der E2-Repressorfunktion führt zur Deregulation des E6/E7 offenen Leserasters, was eine kontinuierliche Überexpression der zwei frühen Proteine E6 und E7 einrichtet, die zu einem allmählichen Verlust der normalen Zelldifferenzierung und zur Entwicklung des Karzinoms führen wird. E6 und E7 überwinden den normalen Zellzyklus durch Inaktivierung der hauptsächlichen Tumorsuppressorproteine, p53 und pRB, das Retinoblastom-Genprodukt.
Ein Zervixkarzinom ist häufig bei Frauen und entwickelt sich über eine präkanzeröse intermediäre Stufe zum invasiven Karzinom, das häufig zum Tod führt. Die intermediäre Stufe der Krankheit ist als zervikale intraepitheliale Neoplasie bekannt und wird mit zunehmender Schwere als I bis III eingestuft (CIN I–III).
Klinisch manifestiert sich eine HPV-Infektion des weiblichen Anogenitaltraktes als zervikale flache Kondylomen, deren Merkmal die Koilozytose ist, die vornehmlich die oberflächlichen und intermediären Zellen des zervikalen Schuppenepithels beeinträchtigt.
Koilozyten, die das Ergebnis einer zytopathischen Wirkung des Virus sind, erscheinen als mehrkernige Zellen mit einem perinukleären klaren Halo. Das Epithel ist verdickt, wobei eine abnormale Keratinisierung verantwortlich für das warzenartige Erscheinungsbild der Läsion ist.
Solche flachen Kondylomen, wenn sie positiv für die HPV16- oder 18-Serotypen sind, sind Hochrisikofaktoren für die Entwicklung hin zur zervikalen intraepithelialen Neoplasie (CIN) und Karzinom in situ (CIS), die selbst als Vorläuferläsionen des invasiven Zervixkarzinoms betrachtet werden.
Die natürliche Historie der onkogenen HPV-Infektion zeigt drei konsekutive Phasen, und zwar:

(1) eine latente Infektionsphase,
(2) eine Phase der intranukleären viralen Replikation mit dem Produkt vollständiger Virionen, die dem Auftreten von Koilozyten entspricht. In dieser Stufe produziert das HPV seinen vollen Bereich von Proteinen, einschließlich E2, E5, E6, E7, L1 und L2.
(3) eine Phase der viralen Integration in das Zellgenom, die das Einsetzen der bösartigen Transformation auslöst und CIN II und CIN III/CIS mit fortschreitendem Verschwinden von Koilozyten entspricht. In dieser Stufe wird die Expression von E2 herabreguliert, und die Expression von E6 und E7 wird gesteigert. Zwischen CIN II/III und CIN III/Zervixkarzinom verändert sich die virale DNA vom episomalen in den Basalzellen zur Integration von nur E6- und E7-Genen (Tumorzellen). 85% aller Zervixkarzinome sind Schuppenzellkarzinome, am häufigsten bezogen auf den HPV16-Serotyp. 10% und 5% sind Adenokarzinome bzw. Adenoschuppenzellkarzinome, und beide Typen sind hauptsächlich auf den HPV18-Serotyp bezogen. Dennoch existieren andere onkogene HPVs.

WO 96/19496 offenbart Varianten der humanen Papilloma-Virus-E6- und -E7-Proteine, insbesondere Fusionsproteine von E6/E7 mit einer Deletion sowohl im E6- als auch im E7-Protein. Diese Deletionsfusionsproteine sollen immunogen sein.
Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die entweder ein E6- oder E7- oder ein E6/E7-Fusionsprotein umfassen, gebunden an einen immunologischen Fusionspartner mit T-Zell-Epitopen.
In einer bevorzugten Form der Erfindung stammt der immunologische Fusionspartner aus Protein D von Haemophilus influenza B. Bevorzugt umfaßt das Protein D-Derivat etwa das erste Drittel des Proteins, insbesondere etwa die ersten 100 bis 110 N-terminalen Aminosäuren. Das Protein D kann lipidiert sein (Lipoprotein D). Andere immunologische Fusionspartner schließen das Nichtstrukturprotein aus dem Influenzavirus ein, NS1 (Hämagglutinin). Typischerweise werden die 81 N-terminalen Aminosäuren verwendet, obwohl unterschiedliche Fragmente verwendet werden können, vorausgesetzt sie schließen T-Helfer-Epitope ein.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform Fusionsproteine bereit, die Protein D-E6 aus HPV16, Protein D-E7 aus HPV17, Protein D-E7 aus HPV18, Protein D-E6 aus HPV18 und Protein D-E6/E7 aus sowohl HPV16 als auch 18 umfassen. Der Protein-D-Teil umfaßt bevorzugt das erste Drittel des Protein D. Man wird einsehen, daß andere E6- und E7-Proteine aus anderen HPV-Untertypen verwendet werden können.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt in E. coli exprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine mit einem Histidin-Schwanz exprimiert, der 5 bis 9 und bevorzugt 6 Histidinreste umfaßt. Diese sind vorteilhaft zur Unterstützung der Reinigung.
Das Protein E7 kann in einer bevorzugten Ausführungsform eine Mutation tragen, um die Bindung für die rb-Stelle (Retinoblastom-Genprodukt) zu reduzieren und damit jede potentielle Transformierungsfähigkeit zu eliminieren. Bevorzugte Mutationen für HPV16-E7 beinhalten den Austausch von Cys₂₄ gegen Glycin oder Glutaminsäure₂₆ gegen Glutamin. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das E7-Protein diese beiden Mutationen.
Bevorzugte Mutationen für HPV18-E7 beinhalten den Austausch von Cys₂₇ gegen Glycin und/oder Glutaminsäure₂₉ gegen Glutamin. Wiederum bevorzugt sind beide Mutationen vorhanden.
Einzelne oder doppelte Mutationen können ebenfalls in die p53-Region von E₆ eingeführt werden, um jede potentielle Transformierungsfähigkeit zu eliminieren.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein E6E7-Fusionsprotein aus HPV bereitgestellt, das an einen immunologischen Fusionspartner gebunden ist. Ein bevorzugter immunologischer Fusionspartner ist Protein D, besonders bevorzugt das erste Drittel von Protein D.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine DNA bereit, die die Proteine der vorliegenden Erfindung codiert. Solche Sequenzen können in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert und in einem geeigneten Wirt exprimiert werden.
Eine DNA-Sequenz, die die Proteine der vorliegenden Erfindung codiert, kann unter Verwendung von Standard-DNA-Synthesetechniken synthetisiert werden, wie durch enzymatische Ligation, wie beschrieben von D. M. Roberts et al., Biochemistry 1985, 24, 5090–5098, durch chemische Synthese, durch enzymatische Polymerisation in vitro oder durch PCR-Technik unter Verwendung von z. B. einer wärmestabilen Polymerase oder durch eine Kombination dieser Techniken.
Die enzymatische Polymerisation von DNA kann in vitro unter Verwendung einer DNA-Polymerase, wie DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment), in einem geeigneten Puffer, der die Nukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP nach Bedarf enthält, bei einer Temperatur von 10 bis 37°C, allgemein in einem Volumen von 50 µl oder weniger, durchgeführt werden. Die enzymatische Ligation von DNA-Fragmenten kann unter Verwendung einer DNA-Ligase, wie T4-DNA-Ligase, in einem geeigneten Puffer, wie 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,01 M MgCl₂, 0,01 M Dithiothreit, 1 mM Spermidin, 1 mM ATP und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin, bei einer Temperatur von 4°C bis Umgebungstemperatur, allgemein in einem Volumen von 50 ml oder weniger, durchgeführt werden. Die chemische Synthese des DNA-Polymers oder der DNA-Fragmente kann durch herkömmliche Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie durchgeführt werden, unter Verwendung von Festphasentechniken, wie denjenigen, die beschrieben werden in "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments – A Laboratory Manual" (Hrsg. H. G. Gassen und A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), oder in anderen wissenschaftlichen Veröffentlichungen, z. B. M. J. Gait, H. W. D. Matthes, M. Singh, B. S. Sproat und R. C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B. S. Sproat und W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M. D. Matteucci und M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M. D. Matteucci und M. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S. P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus und H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; und H. W. D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.
Das Verfahren der Erfindung kann durch herkömmliche rekombinante Techniken durchgeführt werden, wie beschrieben in Maniatis et al., Molecular Chloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982–1989.
Insbesondere kann das Verfahren die folgenden Schritte umfassen:

i) Herstellen eines replizierbaren oder integrierenden Expressionsvektors, der in einer Wirtszelle ein DNA-Polymer exprimieren kann, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Protein oder ein immunogenes Derivat davon codiert;
ii) Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor;
iii) Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des DNA-Polymers zur Erzeugung des Proteins erlauben; und
iv) Gewinnen des Proteins.

Der Begriff "Transformieren" wird hier verwendet, um die Einführung von Fremd-DNA in eine Wirtszelle zu bezeichnen. Dies kann z. B. durch Transformation, Transfektion oder Infektion mit einem geeigneten Plasmid oder viralen Vektor unter Verwendung z. B. herkömmlicher Techniken erreicht werden, wie beschrieben in Genetic Engineering, Hrsg. S. M. Kingsman und A. J. Kingsman, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, 1988. Der Begriff "transformiert" oder "Transformante" wird nachfolgend auf die resultierende Wirtszelle zutreffen, die das interessierende Fremdgen enthält und exprimiert.
Bevorzugt werden rekombinante Antigene der Erfindung in E. coli exprimiert. Die Expressionsstrategie schließt die Fusion von E7, E6 oder E6/E7-Fusion an den 1/3 N-terminalen Teil von Protein D aus Haemophilus influenzae B ein, ein immunologischer Fusionspartner, der T-Zell-Helferepitope bereitstellt. Ein Affinitäts-Polyhistidin-Schwanz wird am Carboxyterminus des Fusionsproteins konstruiert, was eine vereinfachte Reinigung erlaubt. Ein solches rekombinantes Antigen wird in E. coli als unlösliches Protein überexprimiert.
Bevorzugt werden die Proteine der Erfindung mit Thioredoxin in trans (TIT) koexprimiert. Die Koexpression von Thioredoxin in trans gegenüber in cis ist bevorzugt, um das Antigen frei von Thioredoxin ohne Notwendigkeit für Protease zu halten. Thioredoxin-Koexpression erleichtert die Solubilisierung der Proteine der Erfindung. Die Thioredoxin-Koexpression hat ebenfalls einen signifikanten Einfluß auf die Proteinreinigungsausbeute, auf die Löslichkeit und die Qualität des gereinigten Proteins.
Die Expressionsvektoren sind neu und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Die replizierbaren Expressionsvektoren können erfindungsgemäß hergestellt werden durch Spalten eines Vektors, der mit der Wirtszelle kompatibel ist, um ein lineares DNA-Segment mit einem intakten Replikon bereitzustellen, und Kombinieren des linearen Segments mit einem oder mehreren DNA-Molekülen, die zusammen mit dem linearen Segment das gewünschte Produkt codieren, wie das DNA-Polymer, das das Protein der Erfindung codiert, oder ein Derivat davon, unter ligierenden Bedingungen.
So kann das DNA-Polymer nach Wunsch vorgeformt oder während der Konstruktion des Vektors gebildet werden.
Die Wahl des Vektors wird zum Teil durch die Wirtszelle bestimmt werden, die prokaryontisch oder eukaryontisch sein kann, aber bevorzugt E. coli ist. Geeignete Vektoren schließen Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide und rekombinante Viren ein.
Die Herstellung des replizierbaren Expressionsvektors kann herkömmlich mit geeigneten Enzymen zur Restriktion, Polymerisation und Ligation der DNA durch Verfahren durchgeführt werden, die z. B. im oben zitierten Maniatis et al. beschrieben werden.
Die rekombinante Wirtszelle wird erfindungsgemäß hergestellt durch Transformieren einer Wirtszelle mit einem replizierbaren Expressionsvektor der Erfindung unter transformierenden Bedingungen. Geeignete transformierende Bedingungen sind herkömmlich und werden z. B. beschrieben im oben zitierten Maniatis et al. oder in "DNA Cloning", Bd. II, D. M. Glover, Hrsg., IRL Press Ltd., 1985.
Die Wahl der transformierenden Bedingungen wird durch die Wirtszelle bestimmt. So kann ein bakterieller Wirt, wie E. coli, mit einer Lösung aus CaCl₂ (Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) oder mit einer Lösung, die eine Mischung aus RbCl, MnCl₂, Kaliumacetat und Glycerin umfaßt, und anschließend mit 3-[N-Morpholino]-propan-sulfonsäure, RbCl und Glycerin behandelt werden. Säugetierzellen in Kultur können durch Calcium-Kopräzipitation der Vektor-DNA auf die Zellen transformiert werden. Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf eine Wirtszelle, die mit einem replizierbaren Expressionsvektor der Erfindung transformiert ist.
Das Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des DNA-Polymers erlauben, wird herkömmlich durchgeführt, wie z. B. beschrieben in Maniatis et al. und in "DNA Cloning", oben zitiert. So wird die Zelle bevorzugt mit Nährmittel versorgt und bei einer Temperatur von unter 50°C kultiviert.
Das Produkt wird durch herkömmliche Verfahren gemäß der Wirtszelle gewonnen. Wenn somit die Wirtszelle bakteriell ist, wie E. coli, kann sie physisch, chemisch oder enzymatisch lysiert und das Proteinprodukt aus dem resultierenden Lysat isoliert werden. Wenn die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist, kann das Produkt allgemein aus dem Nährmittelmedium oder aus zellfreien Extrakten isoliert werden. Herkömmliche Proteinisolierungstechniken schließen die selektive Präzipitation, Adsorptionschromatographie und Affinitätschromatographie, einschließlich einer monoklonalen Antikörper-Affinitätssäule, ein.
Wenn die Proteine der vorliegenden Erfindung mit einem Histidin-Schwanz (His-Tag) exprimiert werden, können die Proteine leicht durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Ionenmetall-Affinitätschromatographiesäule (IMAC) gereinigt werden.
Ein zweiter chromatographischer Schritt, wie Q-Sepharose, kann entweder vor oder nach der IMAC-Säule verwendet werden, um hochgereinigtes Protein zu liefern.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt zu wenigstens 80% rein, besonders bevorzugt 90% rein bereitgestellt, wie durch SDS-PAGE visualisiert. Das Protein, das als eine einzelne Hauptbande vorhanden ist, wenn es durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und Western-Blot-Analyse analysiert wird, zeigt weniger als 5% Proteinkontamination aus der Wirtszelle.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein erfindungsgemäßes Protein in einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten umfaßt. Eine bevorzugte Impfstoffzusammensetzung umfaßt zumindest Protein D-E6 aus HPV16 oder ein Derivat davon zusammen mit Protein D-E7 aus HPV16. Alternativ können E6 und E7 in einem einzelnen Molekül angeboten werden, bevorzugt in einer Fusion Protein D-E6/E7. Ein solcher Impfstoff kann gegebenenfalls eines oder beide E6- und E7-Proteine aus HPV18 enthalten, bevorzugt in Form eines Protein D-E6- oder Protein D-E7-Fusionsproteins oder Protein D-E6/E7-Fusionsproteins. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können andere HPV-Antigene aus HPV16 oder 18 enthalten. Insbesondere kann der Impfstoff L1- oder L2-Antigenmonomere enthalten. Alternativ können solche L1- oder L2-Antigene zusammen als virusartiges Partikel angeboten werden, oder das L1-Protein kann als virusartiges Partikel oder Capsomerstruktur angeboten werden. Solche Antigene, virusartigen Partikel und Capsomere sind als solche bekannt. Siehe z. B. wo 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 und WO 93/02184. Zusätzlich können frühe Proteine eingeschlossen werden, wie E2 oder bevorzugt E5. Der erfindungsgemäße Impfstoff kann zusätzlich Antigene aus anderen HPV-Stämmen umfassen, bevorzugt aus den Stämmen HPV6 11, HPV 31 oder 33.
Die Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in "Vaccine Design – The subunit and adjuvant approach" (Hrsg. Powell und Newman) Pharmaceutical Biotechnology, Bd. 6, Plenum Press 1995. Die Verkapselung in Liposomen wird von Fullerton beschrieben, US-PS 4 235 877 .
Die erfindungsgemäßen Proteine sind in der Impfstofformulierung der Erfindung bevorzugt mit einem Hilfsstoff vorhanden. Geeignete Hilfsstoffe schließen ein Aluminiumsalz ein, wie Aluminiumhydroxid-Gel (Alaun) oder Aluminiumphosphat, aber können ebenfalls ein Salz von Calcium, Eisen oder Zink sein, oder können eine unlösliche Suspension von acryliertem Tyrosin oder acylierten Zuckern, kationisch oder anionisch derivatisierten Polysacchariden oder Polyphosphazenen sein.
In der Formulierung der Erfindung ist es bevorzugt, daß die Hilfsstoffzusammensetzung eine bevorzugte TH1-Reaktion induziert. Geeignete Hilfsstoffsysteme schließen z. B. eine Kombination aus Monophosphoryllipid A, bevorzugt 3-des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL), zusammen mit einem Aluminiumsalz ein.
Ein verstärktes System beinhaltet die Kombination aus einem Monophosphoryllipid A und einem Saponin-Derivat, insbesondere die Kombination aus QS21 und 3D-MPL, wie in WO 94/00153 offenbart, oder eine weniger reaktogene Zusammensetzung, in der QS21 mit Cholesterin abgeschreckt ist, wie in WO 96/33739 offenbart.
Eine besonders wirksame Hilfsstofformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben und ist eine bevorzugte Formulierung.
Entsprechend wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Impfstoff bereitgestellt, der ein Protein D (oder Derivat davon)-E6 oder Protein D (oder Derivat davon)-E7 mit einem Monophosphoryllipid A oder Derivat davon als Hilfsstoff umfaßt.
Bevorzugt umfaßt der Impfstoff zusätzlich ein Saponin, besonders bevorzugt QS21.
Bevorzugt umfaßt die Formulierung zusätzlich eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer Impfstofformulierung bereit, welches das Vermischen eine Proteins der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten, wie 3D-MPL, umfaßt.
Die Erfindung wird weiter unter Verweis auf die folgenden Beispiele beschrieben:
Beispiel I: Konstruktion eines E. coli-Stammes, der die Fusion Protein D1/3-E7-His (HPV16) exprimiert
1) Konstruktion von Expressionsplasmid

a) Plasmid pMG MCS Prot D1/3 (= pRIT14589) ist ein Derivat von pMG81 (beschrieben in GB 951 3261.9, veröffentlicht als WO 97/01640), in dem die Codonen 4–81 der NS1-codierenden Region aus Influenza durch die Codonen ersetzt wurden, die den Resten Ser20→Thr127 des reifen Proteins D aus Haemophilus influenzae Stamm 772, Biotyp 2 entsprechen (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. S. 119–125). Der Sequenz von Prot- D1/3 folgt eine multiple Klonierungsstelle (11 Reste) und eine codierende Region für einen C-terminalen Histidin-Schwanz (6 His). Dieses Plasmid wird zur Expression der Fusion Protein D1/3-E7-His verwendet.
b) HPV-genomische E6- und E7-Sequenzen Typ HPV16 (siehe Dorf et al., Virology 1985, 145, S. 181–185) würden aus dem HPV16-Genom voller Länge amplifiziert, kloniert in pBR322 (erhalten vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für humane pathogene Papilloma-Viren – D 69120 – Heidelberg), und wurden in pUC19 subkloniert, um TCA301 (= pRIT14462) zu ergeben.

Konstruktion von Plasmid TCA 308 (= pRIT14501): ein Plasmid, das die Fusion Protein-D1/3-E7-His exprimiert.
Die den Aminosäuren 1→98 von Protein E7 entsprechenden Nukleotidsequenzen werden aus pRIT14462 amplifiziert. Während der Polymerasekettenreaktion wurden NcoI- und SpeI-Restriktionsstellen an den 5'- und 3'-Enden der E7-Sequenzen erzeugt, um die Insertion in die gleichen Stellen von Plasmid pMGMCS Prot D1/3 zu erlauben, um das Plasmid TCA308 (= pRIT14501) zu ergeben. Das Insert wurde sequenziert um zu verifizieren, daß während der Polymerasekettenreaktion keine Modifikation erzeugt worden war. Die Sequenz für die Fusion Protein-D1/3-E7-His (HPV16) ist in 1 beschrieben.
2) Transformation des AR58-Stammes
Plasmid pRIT14501 wurde in E. coli AR58 eingeführt (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), ein defektes λ-Lysogen, das einen wärmeempfindlichen Represser des λ-pL-Promotors enthält.
3) Wachstum und Induktion der Expression von Prot-D1/3-E7-His durch den Bakterienstamm
Zellen von AR58, die mit Plasmid pRIT14501 transformiert waren, wurden in 100 ml LB-Medium, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war, bei 30°C gezüchtet. Während der logarithmischen Phase des Wachstums wurden die Bakterien zu 39°C verschoben, um den λ-Repressor zu inaktivieren und die Synthese von Protein D1/3-E7-His einzuschalten. Die Inkubation bei 39°C wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Die Bakterien wurden pelletisiert und bei –20°C gelagert.
Beispiel II: Charakterisierung von Fusion Protein D1/3-E7-His (HPV16)
Gefrorene Zellen wurden aufgetaut in 10 ml PBS-Puffer resuspendiert. Die Zellen werden in einer French-Presse SLM Aminco bei 20 000 psi aufgebrochen (drei Passagen). Der Extrakt wird mit 16 000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Nach dem Zentrifugieren der oben beschriebenen Extrakte wurden Teilmengen des Überstandes und des Pellets durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Blotting analysiert. Eine Hauptbande mit ca. 33 kDa, die sich in der Pelletfraktion befand, wurde durch Coomassie-angefärbte Gele visualisiert und in Western-Blots durch polyklonales Kaninchen-Anti-Protein-D und durch Ni-NTA-Konjugat identifiziert, das an alkalische Kälberdarm-Phosphatase gekuppelt war (Qiagen Kat. Nr. 34510), die einen zugänglichen Histidin-Schwanz nachweist. Der Expressionsgrad stellt ca. 5% des Gesamtproteins dar, wie an einem Coomassie-angefärbten SDS-Polyacrylamidgel gezeigt.
Beispiel III: Reinigung von Protein D1/3-E7-His (HPV16)
Ein Liter Kultur von Bakterien, die Protein D1/3-E7-His exprimieren, wird mit 11 300 g für 30 min bei 4°C zentrifugiert, und das Zellpellet wird bis zur weiteren Behandlung bei –80°C aufgewahrt. Nach Resuspension in 75 ml PBS-Puffer werden die E. coli-Zellen in einer French-Presse (SLM Aminco^®) mit 20 000 psi aufgebrochen. Lysierte Zellen werden durch Zentrifugieren mit 17 000 g für 30 Minuten pelletisiert. Das Pellet, das das Protein D1/3-E7-His enthält, wird einmal in 30 ml 2 M NaCl, 50 mM Phosphat (pH 7,5) und dann zweimal in 30 ml 50 mM Phosphat (pH 7,5) gewaschen. Die Proteine werden nach 2 Stunden Inkubation des Pellets in 30 ml 8 M Harnstoff, 50 mM Phosphat (pH 7,5) bei RT solubilisiert. Zelltrümmer werden durch 15 min Zentrifugieren mit 17 000 g bei 4°C eliminiert. Die Proteinreinigung wird bei RT durchgeführt, 15 ml solubilisiertes Protein werden auf 5 ml Ni²⁺-NTA (Qiagen) Harz (Pharmacia-Säule XK 16/20) aufgetragen, die in 8 M Harnstoff, 50 mM Phosphat (pH 7,5) mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min voräquilibriert wurde. Die Säule wird im gleichen Puffer gewaschen, bis die Extinktion bei 280 nm die Basislinie erreicht. Das Protein wird mit einem 0–600 mM Imidazol-Grandienten in 8 M Harnstoff, 50 mM Phosphat (pH 7,5) eluiert. Die Fließgeschwindigkeit dieser zwei letzten Schritte wird auf 1 ml/min eingestellt. Eluierte Fraktionen werden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und durch Western-Blotting analysiert. Prot-D1/3-E7-His, visualisiert durch Coomassie-Blue-Anfärbung, durch einen polyklonalen Anti-Protein-D- oder durch einen monoklonalen Anti-E7-Antikörper, erscheint als einzelne Hauptbande mit ca. 32 kDa und wird als ein zu 95% reines Protein abgeschätzt. Keine E. coli-Verunreinigungen, verfolgt mit einem polyklonalen Anti-E. coli-Proteine-Antikörper, werden beobachtet.
Um Harnstoff zu eliminieren, werden 9 ml des gereinigten Antigens mit 1,33 mg/ml (Bradford) gegen 3 l PBS-Puffer über Nacht bei RT dialysiert, gefolgt von einer 4-stündigen Dialyse gegen frischen PBS-Puffer. 80% von harnstofffreiem Protein wird als lösliches Protein gewonnen. Zur Eliminierung verunreinigender Endotoxine werden 6 ml dialysiertes Protein mit 1 ml Affiprep-Polymyxin-Gel (Biorad) für 3 Stunden bei 4°C unter vorsichtigem Rühren inkubiert. Eine zweite Inkubation mit 500 µl Affiprep-Polymyxin-Harz wird durchgeführt, um den Endotoxin-Gehalt auf 8,8 EU/μg Protein zu minimieren. Nach Sterilfiltration an einer 0,22 μm-Filtervorrichtung (Millex 0,22 GV, Millipore) wird Prot-D1/3-E7-His mit 0,665 mg/ml auf Stabilität getestet. SDS-PAGE-Analyse zeigte keine Evolution des Proteins nach 7 Tagen Inkubation bei –20°C, 4°C, RT oder 37°C.
Beispiel IV: Konstruktion eines E. coli-Stammes, der die Fusion Protein D1/3-E6-His/HPV16 exprimiert
1. Konstruktion des Expressionsplasmids

a) Plasmid pMG MCS Prot D1/3 (= pRIT14589) ist ein Derivat von pMG81 (in WO 97/01640 beschrieben, worin die Codonen 4–81 der NS1-codierenden Region aus Influenza durch die Codonen ersetzt wurden, die den Resten Ser 20→Thr127 des reifen Protein D von Haemophilus influenzae Stamm 772, Biotyp 2 entsprechen (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. S. 119–125)). Der Sequenz von Prot-D1/3 folgt eine multiple Klonierungsstelle (11 Reste) und eine codierende Region für einen C-terminalen Histidin-Schwanz (6 His). Dieses Plasmid wird zur Expression der Fusion Protein D1/3-E6-His verwendet.
b) HPV-genomische E6- und -E7-Sequenzen Typ HPV16 (Seedorf et al., Virology 1985, 145, S. 181–185) wurden aus dem HPV16-Genom voller Länge amplifiziert, kloniert in pBR322 (erhalten vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für humane pathogene Papilloma-Viren – D 69120 Heidelberg), und wurden in pUC19 subkloniert, um TCA301 (= pRIT14462) zu ergeben.

Konstruktion von Plasmid TCA307 (= pRIT14497): ein Plasmid, das die Fusion Protein D1/3-E6-His (HPV16) exprimiert
Die den Aminosäuren 1→151 des E6-Proteins entsprechenden Nukleotidsequenzen wurden aus pRIT14462 amplifiziert. Während der Polymerasekettenreaktion wurden NcoI- und SpeI-Restriktionsstellen an den 5'- und 3'-Enden der E6-Sequenzen erzeugt, um die Insertion in die gleichen Stellen von Plasmid pMGMCS Prot-D1/3 zu erlauben, um Plasmid TCA307 (= pRIT14497) zu ergeben (siehe 2). Das Insert wurde sequenziert um zu verifizieren, daß keine Modifikation während der Polymerasekettenreaktion erzeugt worden war. Die codierende Sequenz für die Fusion Protein D1/3-E6-His ist in 3 beschrieben.
2. Transformation des AR58-Stammes
Plasmid pRIT14497 wurde in E. coli AR58 eingeführt (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), ein defektes λ-Sysogen, das einen wärmeempfindlichen Repressor des λ-pL-Promotors enthält.
3. Wachstum und Induktion der Expression von Prot-D1/3-E7-His durch den Bakterienstamm
Zellen von AR58, die mit Plasmid pRIT14497 transformiert waren, wurden in 100 ml LB-Medium, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war, bei 30°C gezüchtet. Während der logarithmischen Phase des Wachstums wurden die Bakterien zu 39°C verschoben, um den λ-Repressor zu inaktivieren und die Synthese von Protein D1/3-E7-His einzuschalten. Die Inkubation bei 39°C wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Die Bakterien wurden pelletisiert und bei –20°C gelagert.
4. Charakterisierung der Fusion Protein D1/3-E6-His (HPV16)
Herstellung von Extrakten
Gefrorene Zellen werden aufgetaut in 10 ml PBS-Puffer resuspendiert. Die Zellen werden in einer French-Presse SLM Aminco mit 20 000 psi aufgebrochen (drei Passagen). Der Extrakt wird mit 16 000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Analyse an Coomassie-angefärbten SDS-Polyacrylamidgelen und Western Blots
Nach dem Zentrifugieren der oben beschriebenen Extrakte wurden Teilmengen des Überstandes und des Pellets durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Blotting analysiert.
Eine Hauptbande mit ca. 32 kDa, die sich in der Pelletfraktion befand, wurde durch Coomassie-angefärbte Gele visualisiert und in Western-Blots durch polyklonales Kaninchen-Anti-Protein-D und durch Ni-NTA-Konjugat identifiziert, das an alkalische Kälberdarm-Phosphatase gekuppelt war (Qiagen Kat. Nr. 34510), die einen zugänglichen Histidin-Schwanz nachweist. Der Expressionsgrad stellt ca. 5% des Gesamtproteins dar.
5. Koexpression mit Thioredoxin
In einer analogen Weise zur Expression von Prot-D1/3-E7-Hind aus HPV18 (Beispiel XIII) wurde ein E. coli-Stamm AR58 mit einem Plasmid transformiert, das Thioredoxin und Protein D1/3-E7-His (HPV16) codiert.
Beispiel V: Reinigung von Prot-D1/3-E6-His (HPV16)
HPV16-Prot-D1/3-E6 rekombinantes Antigen wurde in E. coli (AR58) exprimiert. Die Expressionsstrategie schloß die Fusion von E6 an den 1/3-N-terminalen Teil von Protein D aus Haemophilus influenzae ein, einen immunologischen Fusionspartner, der T-Zell-Helferepitope bereitstellt. Ein Affinitäts-Polyhistidin-Schwanz wurde am Carboxy-Terminus des Fusionsproteins konstruiert. Das rekombinante Antigen wurde in E. coli als unlösliche Proteine überexprimiert.
Die Solubilisierung des Antigens erforderte Denaturierungsmittel. In Abwesenheit von Denaturierungsmittel fiel Prot-D1/3-E6-His bei neutralem pH aus. Um die Löslichkeitsprobleme zu umgehen, wurde die Koexpression dieser Proteine mit Thioredoxin in trans (TIT), einem Faltungspartner, durchgeführt.

Die bakteriellen Expressionen werden in LB-Medium in Gegenwart von 0,05 mg/ml Kanamycin bei 30°C plus 0,2 mg/ml Ampicillin durchgeführt, wenn Thioredoxin koexprimiert wird. Rekombinante Proteinexpression wird thermisch induziert durch Überführen der Zellen auf 42°C, wenn eine optische Dichte der Zelle (OD_600nm) von 0,4 erreicht wird. Die Proteinexpression wird für 4 Stunden aufrechterhalten. Die Reinigung wurde gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt.

Zellkulturpellet	60 OD₆₀₀ 1 mM Pefabloc, 2 M NaCl, PBS pH 7,4 (Puffer A)
French-Presse	Drei Durchgänge, 20 000 psi
Zentrifugieren	17 000 g, 30 min, 4°C
Pellet-Spülungen	2 M NaCl, PBS pH 7,4 (Puffer B) × 1 PBS pH 7,4 (Puffer C) × 2
Zentrifugieren	17 000 g, 30 min, 4°C
Pelletsolubilisierung	6 M Guanidinchlorid, 20 mM PO₄, pH 7,0 (Puffer D), über Nacht bei 4°C
Zentrifugieren	17 000 g, 30 min, 4°C
Überstand an IMAC	Äquilibrieren: 6 M Guanidinchlorid, 20 mM PO₄, pH 7,0 (Puffer D) Elution: Imidazolschritte (0,025 M, 0,1 M, 0,5 M) in 8 M Harnstoff, 20 mM PO₄, pH 7,0
Affiprep-Polymyxin	8 M Harnstoff, 20 mM PO₄, pH 7,0 (Puffer E), 2 h RT
Dialyse	4 M Harnstoff, 0,5 M Arginin, 150 mM NaCl, 10 mM PO₄, pH 6,8 (Puffer 2) 2 M Harnstoff, 0,5 M Arginin, 150 mM NaCl, 10 mM PO₄, pH 6,8 (Puffer J) 0 M Harnstoff, 0,5 M Arginin, 150 mM NaCl, 10 mM PO₄, pH 6,8 (Puffer K)

Die Zellen werden effizient durch Hochdruckhomogenisation unter Verwendung einer French-Presse aufgebrochen. Antigen wird mit hoher Konzentration von Proteindenaturierungsmittel extrahiert. Der erste Schritt bricht die bakterielle Zellwand auf, und Antigen wird aus der unlöslichen Bakterienfraktion extrahiert. Die folgende Reinigung wurde an 4 l Kultur durchgeführt.
Puffer

A. PBS/2 M NaCl/1 mM Pefabloc
B. PBS/2 M NaCl
C. PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8,1 mM NaH₂PO₄, 1,47 mM KH₂PO₄, pH 7,4
D. 6 M Guanidiniumchlorid, 20 mM PO₄(NaH₂PO₄(2H₂O)/K₂HPO₄(3H₂O)) pH 7,0

Das Ausgangsmaterial sind jeweils 10 Kolben mit 400 ml Kultur.
Zellpaste wird auf 60 OD₆₀₀ in Puffer A (240 ml Puffer A in diesem Fall) suspendiert, vor der Zelllyse durch drei Durchgänge durch eine French-Presse (20 000 psi). Lysierte Zellen werden für 30 min mit 15 000 g bei 4°C pelletiert. Das Bakterienzellenpellet, das das rekombinante Protein enthält, wird einmal in 240 ml Puffer B und dann zweimal in 240 ml Puffer C gewaschen.
Prot D E6-His (TIT) wird durch 240 ml Puffer D über Nacht bei 4°C an einem rotierenden Rad solubilisiert. Zelltrümmer werden für 30 min mit 15 000 g bei 4°C pelletisiert. Überstand (230 ml) wird bei –20°C gelagert. Das Material wird dann einer IMAC-Chromatographie unterworfen.
Der komplexierende Ligand NTA (Nitrilotriessigsäure) ist an einen Agaroseträger (Qiagen) gebunden. NTA-Ligand wird mit Nickel-Metallionen geladen, mit denen er über 4 der 6 Koordinationsstellen des Nickels wechselwirkt. Die zwei verbleibenden Koordinationsstellen von Nickel Wechselwirken stark mit Histidinresten des 6 × His-tagged Proteins. Die Elution wird durch Konkurrenz mit Imidazol erreicht, das an das Ni-NTA bindet und das tagged Antigen verdrängt.
Ni-NTA-Agarose Qiagen (Katalog-Nr. 30 250) wurde verwendet.
Lösungen

D: 6 M Guanidiniumchlorid, 20 mM PO₄(NaH₂PO₄(2H₂O)/K₂HPO₄(3H₂O)), pH 7,0
E: 8 M Harnstoff, 20 mM PO₄(NaH₂PO₄(2H₂O)/K₂HPO₄(3H₂O)), pH 7,0
F: E + 0,025 M Imidazol
G: E + 0,1 M Imidazol
H: E + 0,5 M Imidazol 0,5 M NaOH Entionisiertes Wasser 0,02% NaN₃

Reinigung

a) Das Harz (15 ml Harz/230 ml Probe) wird gepackt und in 10 Säulenvolumina (CV) von Puffer D mit 15 cm/h äquilibriert.
b) Überstand aus solubilisierter Fraktion wird auf die Säule mit 15 cm/h injiziert.
c) Säule wird mit 15 cm/h mit Puffer D gewaschen, bis OD 280 nm auf die Basislinie zurückkehrt.
d) Säule wird mit 2 CV von Puffer E mit 15 cm/h gewaschen. Die Waschfraktion wird wiedergewonnen.
e) Säule wird zuerst mit 5 CV von Puffer F eluiert. Eliminierung von 25 kD Hauptverunreinigung.
f) Säule wird dann mit 2 CV von Puffer G eluiert.
g) Säule wird schließlich mit 3 CV von Puffer H eluiert. Elution des Antigens. Antigen-positive Fraktionen werden vereinigt (30 ml).

Endotoxin wird durch Affiprep-Chromatographie entfernt.
Affi-Prep^®-Polymyxin-Träger besteht aus USP-Qualität Polymyxin B, gekoppelt an die Affi-Prep^®-Matrix. Aufgrund seiner hohen Affinität an die Lipid A-Einheit von Endotoxinen bindet Polymyxin B Endotoxinmoleküle mit hoher Kapazität und Selektivität.
Lösungen

E: 8 M Harnstoff, 20 mM PO₄(NaH₂PO₄(2H₂O)/K₂HPO₄(3H₂O)), pH 7,0 (pyrogenfrei) 0,5 M NaOH Entionisiertes pyrogenfreies Wasser

Verfahren

1) Affi-Prep^®-Polymyxin-Harz wird in 10 Volumina von 0,1 M NaOH gewaschen, gefolgt von 10 Volumina von pyrogenfreiem Wasser.
2) Harz wird in 10 Volumina von Puffer E äquilibriert.
3) 15 ml (halbes Reservoir) von IMAC-eluierter Probe werden mit 3 ml Affi-Prep^®-Polymyxin-Harz im diskontinuierlichen Modus inkubiert.
4) Inkubation wird für 4 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C an einem rotierenden Rad fortgesetzt.
5) Probe wird für 10 min mit 2000 g zentrifugiert (Beckman GS-6R).
6) Überstand, der das Antigen enthält, wird gesammelt und Endotoxinen und Proteintests unterworfen.
7) Harz wird verworfen.

Kleine Moleküle diffundieren durch eine semipermeable Membran, während große Moleküle zurückgehalten werden. Der Prozeß der Dialyse wird durch den Konzentrationsunterschied der gelösten Stoffe auf den zwei Seiten der Membran angetrieben. Neue Pufferlösung wird eingeführt, bis die Pufferzusammensetzung auf jeder Seite gleich ist.
Puffer

I: 4 M Harnstoff, 0,5 M Arginin, 0,15 M NaCl, 10 mM PO₄(NaH₂PO₄(2H₂O)/K₂HPO₄(3H₂O)), pH 6,8
J: 2 M Harnstoff, 0,5 M Arginin, 0,15 M NaCl, 10 mM PO₄(NaH₂PO₄(2H₂O)/K₂HPO₄(3H₂O)), pH 6,8
K: 0 M Harnstoff, 0,5 M Arginin, 0,15 M NaCl, 10 mM PO₄(NaH₂PO₄(2H₂O)/K₂HPO₄(3H₂O)), pH 6,8
1) Die Probe (15 ml) wird in einen Dialyseschlauch eingeführt (20,4 mm Durchmesser und 6 cm Höhe).
2) Der Dialyseschlauch wird in einen 2 l-Zylinder, der Puffer I enthält, unter Rühren bei 4°C für 2 Stunden gegeben.
3) Der Dialyseschlauch wird in einen 2 l-Zylinder (unter Rühren), der Puffer J enthält, bei 4°C für 2 Stunden gegeben.
4) Der Dialyseschlauch wird in einen 2 l-Zylinder, der Puffer K enthält (unter Rühren), bei 4°C über Nacht gegeben. Der Puffer wird ausgetauscht und die Dialyse für zwei weitere Stunden bei 4°C fortgesetzt.

Millipore Sterile Millex-GV 0,22 μ, 13 mm. Katalog-Nr.: SLGV0130S. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur (RT ca. 22°C) durchgeführt, das Antigen erscheint stabil.
Antigenlösung wird durch einen 0,2 μm-Filter filtriert, um etwaiges bakterielles Wachstum zu verhindern. Antigen wird bei –20°C in Nunc-Fläschchen aufbewahrt.
Charakterisierung
Protein D1/3-E6-His wird wie folgt charakterisiert:
Protein D1/3-E6-His ist ein 273 Aminosäuren langes Peptid mit 112 Aminosäuren, die aus dem Protein D-Teil stammen. Protein D1/3-E6-His hat ein theoretisches Molekulargewicht von 32 kD und wandert im SDS-PAGE als 33 kD-Protein. Protein D1/3-E6-His hat einen theoretischen isoelektrischen Punkt von 8,17.
Das virale Protein E6 ist ein basisches Protein, das 14 Cystein-Reste enthält, von denen 8 (Cys 30, 33, 63, 66 und Cys 103, 106, 136, 139) an zwei C-terminalen Zink-Bindungsmotiven beteiligt sind.
Protein D1/3-E6-His wird als unlösliches Protein im E. coli-AR 58-Stamm mit Thioredoxin in trans als Faltungspartner exprimiert. Die Zellkultur wird in einem 400 ml Kolben erzeugt.
5,4 mg von zu 95% reinem Protein werden pro Liter Kultur erhalten.
Beispiel VI: Konstruktion eines E. coli-Stammes, der die Fusion Protein D1/3-E6E7-His/HPV16 exprimiert
1. Konstruktion des Expressionsplasmids

a) Plasmid pMG MCS Prot D1/3 (= pRIT14589) ist ein Derivat von pMG81 (oben beschrieben), worin die Codonen 4–81 der NS1-codierenden Region aus Influenza durch die Codonen ersetzt wurden, die den Resten Ser 20 → Thr 127 des reifen Protein D von Haemophilus influenzae Stamm 772, Biotyp 2 entsprechen (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. S. 119–125)). Der Sequenz von Prot-D1/3 folgt eine multiple Klonierungsstelle (11 Reste) und eine codierende Region für einen C-terminalen Histidin-Schwanz (6 His). Dieses Plasmid wird zur Expression der Fusion Protein D1/3-E6E7-His verwendet.
b) HPV-genomische E6- und E7-Sequenzen Typ HPV16 (Seedorf et al., Virology 1985, 145, S. 181–185) wurden aus dem HPV16-Genom voller Länge amplifiziert, kloniert in pBR322 (erhalten vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für humane pathogene Papilloma-Viren – D 69120 Heidelberg), und wurden in pUC19 subkloniert, um TCA301 (= pRIT14462) zu ergeben.
c) Die codierenden Sequenzen für E6 und E7 in TCA301 (= pRIT14462) wurden mit einem synthetischen Oligonukleotid-Adapter modifiziert (inseriert zwischen die AflIII und NsiI-Stellen), der eine Deletion von 5 Nukleotiden zwischen den E6- und E7-Genen einführt, um das Stopp-Codon von E6 zu entfernen und fusionierte E6- und E7-codierende Sequenzen im Plasmid TCA309 (= pRIT14556) zu schaffen, siehe 4.

Konstruktion von Plasmid TCA311 (= pRIT14512): ein Plasmid, das die Fusion Protein D1/3-E6E7-His/HPV16 exprimiert
Die den Aminosäuren 1→249 des fusionierten E6E7-Proteins entsprechenden Nukleotidsequenzen wurden aus pRIT14556 amplifiziert. Während der Polymerasekettenreaktion wurden NcoI- und SpeI-Restriktionsstellen an den 5'- und 3'-Enden der fusionierten E6E7-Sequenzen erzeugt, um die Insertion in die gleichen Stellen von Plasmid pMGMCS Prot-D1/3 zu erlauben, um Plasmid TCA311 (= pRIT14512) zu ergeben (siehe 5). Das Insert wurde sequenziert um zu verifizieren, daß keine Modifikation während der Polymerasekettenreaktion erzeugt worden war. Die codierende Sequenz für die Fusion Protein D1/3-E6-His ist in 6 beschrieben.
2. Transformation des AR58-Stammes
Plasmid pRIT14512 wurde in E. coli AR58 eingeführt (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), ein defektes λ-Sysogen, das einen wärmeempfindlichen Repressor des λ-pL-Promotors enthält.
3. Wachstum und Induktion der Expression von Prot-D1/3-E6E7-His durch den Bakterienstamm
Zellen von AR58, die mit Plasmid pRIT14512 transformiert waren, wurden in 100 ml LB-Medium, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war, bei 30°C gezüchtet. Während der logarithmischen Phase des Wachstums wurden die Bakterien zu 39°C verschoben, um den λ-Repressor zu inaktivieren und die Synthese von Protein D1/3-E6E7-His einzuschalten. Die Inkubation bei 39°C wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Die Bakterien wurden pelletisiert und bei –20°C gelagert.
4. Charakterisierung der Fusion Proteins D1/3-E6E7-His
Gefrorene Zellen werden aufgetaut in 10 ml PBS-Puffer resuspendiert. Die Zellen werden in einer French-Presse SLM Aminco mit 20 000 psi aufgebrochen (drei Passagen). Der Extrakt wird mit 16 000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Nach dem Zentrifugieren der oben beschriebenen Extrakte wurden Teilmengen des Überstandes und des Pellets durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Blotting anaylsiert.
Eine Hauptbande mit ca. 48 kDa, die sich in der Pelletfraktion befand, wurde durch Coomassie-angefärbte Gele visualisiert und in Western-Blots durch polyklonales Kaninchen-Anti-Protein-D und durch Ni-NTA-Konjugat identifiziert, das an alkalische Kälberdarm-Phosphatase gekuppelt war (Qiagen Kat. Nr. 34510), die einen zugänglichen Histidin-Schwanz nachweist. Der Expressionsgrad stellt ca. 1% des Gesamtproteins dar.
Beispiel VIb
In einer analogen Weise wurde das Fusionsprotein aus Lipo D1/3 und E6-E7 aus HPV16 in E. coli in Gegenwart von Thioredoxin exprimiert. Der N-Terminus des Präproteins (388 Aminosäuren) enthält MDP-Reste, gefolgt von 16 Aminosäuren des Signalpeptids von Lipoprotein D (aus Haemophilus influenzae), das in vivo gespalten wird, um das reife Protein zu ergeben (370 Aminosäuren). Dem Lipoprotein-Teil (Aminosäuren 1 bis 127) folgen die Proteine E6 und E7 in Fusion. Der C-Terminus des Proteins ist durch TSGHHHHHH verlängert.
Das Protein wurde durch das folgende Protokoll gereinigt:
Beispiel VII: Reinigung von Lipoprotein D1/3-E6-E7-His (TIT)
A) Solubilisierung
Zellpaste wird auf 60 OD₆₀₀ in 2 M NaCl, 20 mm Phosphat (NaH₂PO₄/K₂HPO₄) pH 7,5 in Gegenwart von 1 mM Pefabloc als Proteaseinhibitor suspendiert, vor der Zelllyse durch drei Durchgänge durch eine French-Presse (20 000 psi). Lysierte Zellen werden für 30 min mit 15 000 g bei 4°C pelletisiert. Um den Endotoxin-Gehalt zu reduzieren, wird das Bakterienzellpellet, das das rekombinante Protein enthält, zweimal in 4 M Harnstoff, 2 m NaCl, 20 mM Phosphat (pH 7,5), einmal in 2% Empigen BB, 20 mM Phosphat (pH 7,5) und schließlich zweimal in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen, um Spuren von Detergens zu eliminieren (jede Spülung wird im gleichen Volumen durchgeführt, das für die Zellsuspension verwendet wird). LipoProt-D1/3-E6-E7-His (TIT) wird solubilisiert (im gleichen Volumen, das für die Zellsuspension verwendet wird) durch 8 M Harnstoff in 0,2 M β-Mercaptoethanol (= βMeOH), 20 mM PO₄ (pH 12) über Nacht bei 4°C, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation bei RT im gleichen Puffer. Zelltrümmer werden für 30 min mit 15 000 g bei 4°C pelletisiert. Überstand wird bei –20°C aufbewahrt.
B) Reinigung
1) Anionenaustauscherchromatographie an Q-Sepharose Fast Flow
225 ml gefrorene Probe werden bei Raumtemperatur in einem kalten Wasserbad aufgetaut und auf eine Q-Sepharose Fast Flow-Säule (Pharmacia, XK 26/20) aufgetragen, die in 8 M Harnstoff, 0,2 M βMeOH, 20 mM PO₄ (pH 12) (30 ml Harz/225 ml Überstand) mit 45 cm/h voräquilibriert wurde. Die Säule wird mit 8 M Harnstoff, 0,2 M βMeOH, 20 mM PO₄ (pH 12) gewaschen, bis der OD 280-nm-Wert die Basislinie erreicht, gefolgt von einem zweiten Waschschritt in 8 M Harnstoff, 20 mM Phosphat (pH 12) (in 2 Säulenvolumina). Die Elution wird durch NaCl-Schritte (0,1 M, 0,25 M, 0,5 M NaCl, jeder Schritt in ca. 2 Säulenvolumina) in 8 M Harnstoff, 20 mM Phosphat (pH 12) mit 45 cm/h durchgeführt. 0,5 M NaCl-eluierte Fraktionen werden vereinigt.
2) Ion Metal Affinity Chromatography (IMAC)
0,5 M NaCl-eluierte Fraktionen aus dem Q-Sepharose-Schritt werden gesammelt und gegen 0,2 M NaCl, 8 M Harnstoff, 20 mM Phosphat pH 10 dialysiert, bevor sie auf eine Ni²⁺-NTA (Qiagen)-Säule (XK 26/20, Pharmacia) aufgetragen werden, die in 8 M Harnstoff, 20 mM PO₄ pH 12 (10 ml Harz/61 ml Probe) mit 5,6 cm/h voräquilibriert wurde. Die Säule wird in 8 M Harnstoff, 20 mM PO₄ pH 12 gewaschen, bis die Basislinie erreicht wird, und dann mit 8 m Harnstoff, 20 mM PO₄ pH 10. Antigen wird durch Imidazol-Schritte (0,025 M, 0,05 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,5 M Imidazol, jeder Schritt in zwei Säulenvolumina) in 8 M Harnstoff, 20 mM PO₄ pH 10, mit 45 cm/h eluiert. 0,05 M Imidazol-eluierte Fraktionen werden vereinigt.
C) Aufkonzentrieren
Die IMAC-Probe wird ca. 5-fach (auf 0,407 mg/ml) an einer 5 kDa Filtron Omega-Membran in einer gerührten Zelle von AMICON bei RT aufkonzentriert.
D) Dialyse
Konzentrierte Probe wird bei RT gegen Schritte mit abnehmender Harnstoffkonzentration (4 M, 2 M Harnstoff) in 0,5 M Arginin, 150 mM NaCl, 10 mM PO₄ pH 6,8 dialysiert. Die letzte Dialyse gegen 0,5 M Arginin, 150 mM NaCl, 10 mM PO₄ pH 6,8 wird bei 4°C erreicht.
Ergebnisse
Der IMAC-Schritt kann eine 32 kD-Verunreinigung bei 0,025 M Imidazol eliminieren, die auch etwas Antigen eluierte. 0,05 M Imidazol-eluiertes Antigen wird als zu 90% rein gemäß Coomassie Blue-Anfärbung von SDS-PAGE abgeschätzt. Nach diesen zwei Reinigungsschritten ist die Probe frei von E. coli-Verunreinigungen. Western-Blotting-Analyse unter Verwendung spezifischer Antigen-N- und/oder -C-Terminus-Antikörper zeigt ein heterogenes Muster von Banden mit höherem und niedrigerem Molekulargewicht als das Protein voller Länge. Dieses Muster legt die Gegenwart von Aggregaten und unvollständig gereiftem Protein und/oder abgebautem Protein nahe, das mit dem Protein voller Länge zusammen gereinigt wurde.
Beispiel VIII: Konstruktion von E. coli-Stamm B1002, der die Fusion Protein D1/3-E7 exprimiert
Mutierter (Cys21→Gly, Glu26→Gln) Typ HPV16
1) Konstruktion von Expressionsplasmid
Ausgangsmaterial

a) Plasmid pRIT14501 (= TCA308), das für die Fusion Protein D1/3-E7-His codiert.
b) Plasmid LITMUS28 (New England Biolabs, Kat. Nr. 306–28), ein aus pUC stammender Klonierungsvektor.
c) Plasmid pMG MCS Prot-D1/3 (pRIT 14589), ein Derivat von pMG81 (oben beschrieben), in dem die Codonen 4–81 der NS1-codierenden Region aus Influenza durch die Codonen ausgetauscht wurden, die den Resten Ser 20→Thr 127 des reifen Protein D aus Haemophilus influenzae Stamm 772, Biotyp 2 entsprechen (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. S. 119–125). Der Sequenz von Prot-D1/3 folgt eine multiple Klonierungsstelle (11 Reste) und eine codierende Region für einen C-terminalen Histidin-Schwanz (6 His).

Konstruktion von Plasmid pRIT14733 (= TCA347): ein Plasmid, das die Fusion Protein D1/3-E7 mutiert (Cys24→Gly, Glu26→Gln) mit His-Schwanz exprimiert
Das NcoI-XbaI-Fragment aus pRIT14501 (= TCA308), das die codierende Sequenz des E7-Gens aus HPV16 trägt, verlängert mit einem His-Schwanz, wurde in einen intermediären Vektor Litmus 28 subkloniert, der zur Mutagenese nützlich ist, um pRIT14909 (= TCA337) zu ergeben. Doppelmutationen Cys24→Gly (Edmonds and Vousden, J. Virology 63: 2650 (1989)) und Glu26→Gln (Phelps et al., J. Virology 66: 2418–27 (1992)) wurden gewählt, um die Bindung an das Antionkogenprodukt des Retinoblastomgens (pRB) zu beeinträchtigen. Die Einführung der Mutationen in das E7-Gen wurde mit dem Kit "Quick Change Site directed Mutagenesis" (Stratagene Kat. Nr. 200518) realisiert, um Plasmid pRIT 14681 (= TCA343) zu ergeben. Nach Verifizierung des Vorliegens von Mutationen und der Integrität des vollständigen E7-Gens durch Sequenzierung wurde das mutierte E7-Gen in den Vektor pRIT14589 (= pMG MCS Prot-D1/3) eingeführt, um Plasmid pRIT14733 (= TCA347) zu ergeben (7).
Die Sequenz für die Fusion Protein D1/3-E7 mutiert (Cys24→Gly, Glu26→Gln)-His ist in 8 beschrieben.
2) Konstruktion von Stamm B1002, der Prot-D1/3-E7 mutiert
(Cys24→Gly, Glu26→Gln)-His/HPV16 exprimiert
Plasmid pRIT14733 wurde in E. coli AR58 eingeführt (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), ein defektes λ-Isogen, das einen wärmeempfindlichen Repressor des λ-pL-Promotors enthält, um Stamm B1002 durch Auswahl für Kanamycin-resistente Transformanten zu ergeben.
3) Wachstum und Induzierung der Expression von Prot-D1/3-E7 mutiert (Cys24→Gly, Glu26→Gln)-His/HPV16 durch den Bakterienstamm B1002
Zellen von AR58, transformiert mit Plasmid pRIT14733 (B1002-Stamm), wurden bei 30°C in 100 ml LB-Medium gezüchtet, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war. Während der logarithmischen Phase des Wachstums wurden die Bakterien zu 39°C verschoben, um den λ-Repressor zu inaktivieren und die Synthese von Prot-D1/3-E7 mutiert-His/HPV16 einzuschalten. Die Inkubation bei 39°C wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Bakterien wurden pelletisiert und bei –20°C gelagert.
4) Charakterisierung der Fusion Protein D1/3-E7 mutiert
(Cys24→Gly, Glu26→Gln)-His Typ HPV16
Gefrorene Zellen wurden aufgetaut in 10 ml PBS-Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden in einer French-Presse SLM Aminco mit 20 000 psi (drei Passagen) aufgebrochen. Der Extrakt wurde mit 16 000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Nach dem Zentrifugieren der oben beschriebenen Extrakte wurden Teilmengen des Überstandes und des Pellets durch SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese und Western Blotting analysiert.
Eine Hauptbande von ca. 33 kDa, die sich in der Pelletfraktion befand, wurde durch Coomassie-angefärbte Gele visualisiert und in Western Blots durch polyklonales Kaninchen-22 J 70-Anti-Protein D, durch monoklonales Anti-E7/HPV16 aus Zymed und durch Ni-NTA-Konjugat identifiziert, gekoppelt an alkalische Kälberdarm-Phosphatase (Qiagen Katalog-Nr. 34510), die einen zugänglichen Histidinschwanz nachweist. Der Expressionsgrad stellt ca. 3 bis 5% des Gesamtproteins dar.
Zellen von B1002 wurden aus der Kulturbouillon durch Zentrifugieren abgetrennt. Die konzentrierten Zellen von B1002 wurden bei –65°C gelagert.
Beispiel IX: Reinigung von Prot-D1/3-E7 (D-mutiert) HPV16 Allgemeines Reinigungsschema – HPV16 E7
a) Herstellung der Zellsuspension
Die gefrorenen aufkonzentrierten Zellen von B1002 wurden aufgetaut und in einem Zellaufbruchpuffer bei +4°C (siehe Tabelle 1) auf eine optische Enddichte OD₆₅₀ von 60 resuspendiert (entsprechend einer Zellkonzentration von ca. 25 g DCW l^–1).
b) Zellaufbrechen
Die Zellen wurden durch zwei Passagen mit 1000 bar durch einen Hochdruckhomogenisator (Rannie) aufgebrochen. Die aufgebrochene Zellsuspension wurde in einem auf 4°C gehaltenen Kolben gesammelt.
Zellaufbruchpuffer: Na₂HPO₄ (0,02 N), NaCl (2 M), pH mit HCl 3 N (Merck) auf 7,5 eingestellt
Reinigung
2a) Dynamische Membranfiltration (DMF^®-PALL FITRON)
2 l aufgebrochene Zellsuspension (OD 60) werden auf das DMF^® geladen, ein dynamisches Filtrationssystem von PALL, versehen mit einer Membran mit 0,2 μm-Kante.

– Aufkonzentrieren von 2 l zu 1 l, um Probe PCC1 zu ergeben
– Waschen bei konstantem Volumen mit 3 Volumina (3 l) Empigen-EDTA-Puffer (Konzentration EDTA 1,86 g, Empigen (30%) 3,33 ml, PO₄ ^3– 0,5 M 40,00 ml) ergab Probe PD1
– Aufkonzentrieren von 1 l auf 300 ml ergab Probe PCC2
– Waschen bei konstantem Volumen mit 10 Volumina (3 l) Empigen-Puffer (Konzentration pro 1: Empigen 30%, 3,33 ml, PO₄ ^3– 0,5 M 40 ml), pH 7,5 ergab Probe PD2
– Solubilisierung des Proteins durch Zugabe des gleichen Volumens (300 ml) Guanidinhydrochlorid 8 M-Puffer (Konzentration pro Liter: Gu·HCl 764 g; Empigen 30% 3,33 ml, PO₄ ^3– 0,5 M 40 ml) pH 7,5
– Gewinnung des Proteins: Auffangen des Permeats Probe P3 während des Aufkonzentrierens zum Anfangsvolumen (300 ml) und Diafiltration mit 3 Volumina Guanidinhydrochlorid 4 M-Puffer (Konzentration pro Liter: Gu·HCl 328,12 g, Empigen (30%) 3,33 ml, PO₄ ^3– 0,5 M 40,00 ml) pH 7,5.

All diese Schritte werden in einem kalten Raum (2–8°C) durchgeführt und der pH mit 0,5 M PO₄ ^3– eingestellt.
Die P3-Fraktion wird bei –20°C gelagert, während auf den nächsten Reinigungsschritt gewartet wird.
2b) Zn-komplexierende Sepharosechromatographie
Die P3-Fraktion wird aufgetaut und in eine gepackte und äquilibrierte Zn-komplexierende Sepharose-FF injiziert.
Danach wird die Säule:

– Gewaschen mit ca. 3 Volumina Guanidinhydrochlorid 4 M-Puffer (siehe oben) – Probe Zn-FT
– Gewaschen mit ca. 5 Volumina Harnstoff 4 M-Puffer (Konzentration pro Liter: Harnstoff 240,24 g, Empigen 3,33 ml, PO₄ ^3– 0,5 M, 40,00 ml) – Probe Zn-W
– Eluiert mit ca. 3 Volumina Harnstoff 4 M – Imidazol 20 mM Puffer (Konzentration pro Liter: Harnstoff 240,24 g, Empigen (30%) 3,33 ml, Imidazol (1,36 g), PO₄ ^3– 0,5 M, 40,00 ml, pH 7,5); Puffer wie oben, aber Konzentration von Imidazol pro Liter 34,04 g – Probe Zn-20
– Eluiert mit Harnstoff 4 M-Imidazol 500 mM bis zum Ende des UV-Peaks – Probe Zn-500
– Die Probe wird mit EDTA 50 mM und NaOH 0,5 M gewaschen. Zn-komplexierendes Sepharoseeluat (Zn-500) wird zwischen 2 und 8°C vor dem nächsten Reinigungsschritt gelagert.

Die Zn-komplexierenden Sepharosechromatographie-Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
2c) Q-Sepharose-Chromatographie
Die Zn-500-Fraktion wird in eine gepackte und äquilibrierte Q-Sepharose-FF injiziert.
Danach wird die Säule:

– Gewaschen mit ca. 7 Volumina Harnstoff 4 M-Puffer (siehe oben) – Probe QS-FT
– Gewaschen mit ca. 10 Volumina Harnstoff 4 M-Puffer ohne Empigen (Konzentration pro Liter: Harnstoff 240,24 g, PO₄ ^3– 0,5 M, 40,00 ml) – Probe QS-W1
– Gewaschen mit ca. 10 Volumina Harnstoff 6 M-Puffer ohne Empigen (Harnstoff 360,36 g/l) – Probe QS-W2
– Eluiert mit ca. 5 Volumina Harnstoff 6 M-NaCl 200 mM-Puffer (Konzentration pro Liter: Harnstoff 360,36 g, NaCl 11,69 g, 40,00 ml PO₄ ^3–)
– Eluiert mit ca. 3 Volumina Harnstoff 6 M-NaCl 500 mM-Puffer (wie oben, aber NaCl 29,22 g/l). Das genaue Ende der Fraktion wird durch das Ende des UV-Peaks bestimmt – Probe QS-500
– Eluiert mit 4 Volumina Harnstoff 4 M-NaCl 1 M-Puffer (Konzentration pro Liter: Harnstoff 360,36, NaCl 58,44 g, 40,00 ml PO₄ ^3– (0,5) – Probe QS-1 M

Die Säule wird dann mit NaOH 0,5 M gewaschen.
QS-Sepharose-Eluat (QS-500) wird bei 2 bis 8°C vor dem nächsten Reinigungsschritt gelagert. Die Q-Sepharose-Chromatographieschritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
2d) Ultrafiltration
Die QS-500-Fraktion wird dann an einer 10 kD-Ultrafiltrationseinheit (Ultrasette – Pall Filtron) behandelt.
Das Produkt wird zuerst auf ca. 1 mg/ml von Protein aufkonzentriert und dann gegen 10 Volumina Phosphatpuffer diafiltriert.
Das Permeat (Fraktion UF-P) wird verworfen und das Retentat (Fraktion UF-R) bei 2 bis 8°C gelagert, wo es auf die Endfiltration wartet.
Ultrafiltrationsschritte werden bei 2 bis 8°C durchgeführt.
2e) Endfiltration
Das fertige Volumen (UF-R-Fraktion) wird durch einen 0,22 μm-Sterilfilter (Millipak-Millipore) unter laminarem Fluß und in einem aseptischen Raum der Klasse 100 filtriert. Die Endkonzentration beträgt zwischen 0,5 und 1,0 μg/ml. Das sterile Volumen wird bei –20°C gelagert.
Vergleichsbeispiel X: Konstruktion eines E. coli-Stammes, der die Fusion Clyta-E6-His (HPV16) exprimiert
1. Konstruktion des Expressionsplasmids

a) Plasmid pRIT14497 (= TCA307), das für die Fusion Protein D1/3-E6-His/HPV16 codiert
b) Plasmid pRIT14661 (= DVA2), ein intermediärer Vektor, der die codierende Sequenz für die 117 C-terminalen Codonen von LytA von Streptococcus pneumoniae codiert. LytA stammt aus Streptococcus pneumoniae, das eine N-Acetyl-L-Alanin-Amidase synthetisiert, Amidase-LytA (codiert durch das LytA-Gen {Gene, 43 (1986) Seite 265–271}), ein Autolysin, das spezifisch bestimmte Bindungen im Peptidoglycan-Gerüst abbaut.

Die C-terminale Domäne des LytA-Proteins ist verantwortlich für die Affinität zum Cholin oder zu einigen Cholin-Analoga, wie DEAE.
1.b. Konstruktion von Plasmid pRIT14634 (= TCA332): ein Plasmid, das die Fusion Clyta-E6-His/HPV16 exprimiert

a) Der Schritt war die Reinigung des großen NcoI/AflII-Restriktionsfragments aus Plasmid pRIT14497 und die Reinigung des kleinen AflII-AflIII-Restriktionsfragments aus pRIT14661.
b) Der zweite Schritt war die Verbindung der Clyta-Sequenzen mit den E7-His-Sequenzen (NcoI und AflIII sind kompatible Restriktionsstellen), was zum Plasmid pRIT14634 führte (= TCA332), das für das Fusionsprotein Clyta-E6-His unter der Kontrolle des pL-Promotors codiert (siehe 9).

Die codierende Sequenz für das Fusionsprotein Clyta-E6-His ist in 10 beschrieben.
Transformation des AR58-Stammes
Plasmid pRIT14634 wurde in E. coli AR58 eingeführt (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), ein defektes λ-Lysogen, das einen wärmeempfindlichen Repressor des λ-pL-Promotors enthält.
Wachstum und Induzierung der Expression von Clyta-E6-His durch den Bakterienstamm
Zellen von AR58, transformiert mit Plasmid pRIT14634, wurden in 100 ml LB-Medium, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war, bei 30°C gezüchtet. Während der logarithmischen Phase des Wachstums wurden die Bakterien zu 39°C verschoben, um den λ-Repressor zu inaktivieren und die Synthese von Protein Clyta-E6-His einzuschalten. Die Inkubation bei 39°C wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Bakterien wurden pelletisiert und bei –20°C gelagert.
4. Charakterisierung der Fusion Clyta-E6-His
Gefrorene Zellen wurden aufgetaut und in 10 ml PBS-Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden in einer French-Presse SLM Aminco mit 20 000 psi (drei Passagen) aufgebrochen. Der Extrakt wurden mit 16 000 g für 3 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren der oben beschriebenen Extrakte wurden Teilmengen von Überstand und Pellet durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western Blotting analysiert. Eine Hauptbande mit ca. 33 kDa, die sich in der Pelletfraktion befand, wurde durch Coomassie-angefärbte Gele visualisiert und in Western Blots durch polyklonale Kaninchen-Anti-Clyta-Antikörper und durch Ni-NTA-Konjugat identifiziert, gekoppelt an alkalische Kälberdarm-Phosphatase (Qiagen Katalog-Nr. 34510), die zugänglichen Histidin-Schwanz nachweist. Der Expressionsgrad stellt ca. 3% des Gesamtproteins dar.
Vergleichsbeispiel XI: Konstruktion eines E. coli-Stammes, der die Fusion Clyta-E7-His (HPV16) exprimiert
1. Konstruktion des Expressionsplasmids
1.a. Ausgangsmaterialien

a) Plasmid pRIT14501 (= TCA308), das für die Fusion Prot-D1/3-E7-His/HPV16 codiert
b) Plasmid pRIT14661 (= DVA2), ein intermediärer Vektor, der die codierende Sequenz für die 117 C-terminalen Codonen von LytA von Streptococcus pneumoniae enthält.

1.b Konstruktion von Plasmid pRIT14626 (= TCA330): ein Plasmid, das die Fusion Clyta-E7-His/HPV16 exprimiert

a) Der erste Schritt war die Reinigung des großen NcoI-AflII-Restriktionsfragments aus Plasmid pRIT14501 und die Reinigung des kleinen AflII-AflIII-Restriktionsfragments aus pRIT14661.
b) Der zweite Schritt war die Verknüpfung von Clyta-Sequenzen mit den E7-His-Sequenzen (NcoI und AflIII sind kompatible Restriktionsorte), die zum Plasmid pRIT14626 (= TCA330) führten, das für das Fusionsprotein Clyta-E7-His unter der Kontrolle des pL-Promotors codiert (11).

Die codierende Sequenz für das Fusionsprotein Clyta-E7-His ist in 12 beschrieben.
2. Transformation des AR58-Stammes
Plasmid pRIT14626 wurde in E. coli AR58 eingeführt (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), ein defektes λ-Lysogen, das einen wärmeempfindlichen Repressor des λ-pL-Promotors enthält.
3. Wachstum und Induzierung der Expression von Clyta-E7-His durch den Bakterienstamm
Zellen von AR58, transformiert mit Plasmid pRIT14626, wurden in 100 ml LB-Medium, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war, bei 30°C gezüchtet. Während der logarithmischen Phase des Wachstums wurden die Bakterien zu 39°C verschoben, um den λ-Repressor zu inaktivieren und die Synthese des Proteins Clyta-E7-His einzuschalten. Die Inkubation bei 39°C wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Die Bakterien wurden pelletisiert und bei –20°C gelagert.
4. Charakterisierung der Fusion Clyta-E7-His
Gefrorene Zellen wurden aufgetaut und in 10 ml PBS-Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden in einer French-Presse SLM Aminco mit 20 000 psi aufgebrochen (drei Passagen). Der Extrakt wurde mit 16 000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Nach Zentrifugieren der oben beschriebenen Extrakte wurden Teilmengen von Überstand und Pellet durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blotting analysiert. Eine Hauptbande von ca. 35 kDa, die sich in der Pelletfraktion befand, wurde durch Coomassie-angefärbte Gele visualisiert und in Western Blots durch polyklonale Kaninchen-Anti-Clyta-Antikörper und durch Ni-NTA-Konjugat identifiziert, das an alkalische Kälberdarmphosphatase (Qiagen Katalog-Nr. 34510) gekoppelt war, die zugängliche Histidin-Schwänze nachweist. Der Expressionsgrad stellt ca. 5% des Gesamtproteins dar.
Vergleichsbeispiel XII: Konstruktion eines E. coli-Stammes, der die Fusion Clyta-E6E7-His (HPV16) exprimiert
1. Konstruktion des Expressionsplasmids
1.a. Ausgangsmaterialien

a) Plasmid pRIT14512 (= TCA311), das für die Fusion Prot-D1/3-E6E7-His/HPV16 codiert
b) Plasmid pRIT14661 (= DVA2), ein intermediärer Vektor, der die codierende Sequenz für die 117 C-terminalen Codonen von LytA von Streptococcus pneumoniae enthält.

1.b Konstruktion von Plasmid pRIT14629 (= TCA331): ein Plasmid, das die Fusion Clyta-E6E7-His/HPV16 exprimiert

a) Der erste Schritt war die Reinigung des großen NcoI-AflII-Restriktionsfragments aus Plasmid pRIT14512 und die Reinigung des kleinen AflII-AflIII-Restriktionsfragments aus pRIT14661.
b) Der zweite Schritt war die Verknüpfung von Clyta-Sequenzen mit den E7-His-Sequenzen (NcoI und AflIII sind kompatible Restriktionsorte), die zum Plasmid pRIT14629 (= TCA331) führten, das für das Fusionsprotein Cylta-E6E7-His unter der Kontrolle des pL-Promotors codiert (13).

Die codierende Sequenz für das Fusionsprotein Clyta-E6E7-His ist in 14 beschrieben.
2. Transformation des AR58-Stammes
Plasmid pRIT14629 wurde in E. coli AR58 eingeführt (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), ein defektes λ-Lysogen, das einen wärmeempfindlichen Repressor des λ-pL-Promotors enthält.
3. Wachstum und Induzierung der Expression von Clyta-E6E7-His durch den Bakterienstamm
Zellen von AR58, transformiert mit Plasmid pRIT14629, wurden in 100 ml LB-Medium, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war, bei 30°C gezüchtet. Während der logarithmischen Phase des Wachstums wurden die Bakterien zu 39°C verschoben, um den λ-Repressor zu inaktivieren und die Synthese des Proteins Clyta-E6E7-His einzuschalten. Die Inkubation bei 39°C wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Die Bakterien wurden pelletisiert und bei –20°C gelagert.
4. Charakterisierung der Fusion Clyta-E6E7-His
Gefrorene Zellen wurden aufgetaut und in 10 ml PBS-Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden in einer French-Presse SLM Aminco mit 20 000 psi aufgebrochen (drei Passagen). Der Extrakt wurde mit 16 000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Nach Zentrifugieren der oben beschriebenen Extrakte wurden Teilmengen von Überstand und Pellet durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blotting analysiert.
Eine Hauptbande von ca. 48 kDa, die sich in der Pelletfraktion befand, wurde durch Coomassie-angefärbte Gele visualisiert und in Western Blots durch polyklonale Kaninchen-Anti-Clyta-Antikörper und durch Ni-NTA-Konjugat identifiziert, das an alkalische Kälberdarmphosphatase (Qiagen Katalog-Nr. 34510) gekoppelt war, die zugängliche Histidin-Schwänze nachweist. Der Expressionsgrad stellt ca. 1% des Gesamtproteins dar.
Beispiel XIII: Prot-D1/3-E7-His (HPV18) (E. coli B1011)
Protein D1/3-E7-His-HPV exprimiert mit Thioredoxin in trans (E. coli B1012)
1) Konstruktion der Expressionsplasmide
1) a. Konstruktion des Plasmids TCA316 (= pRIT14532), ein Plasmid, das die Fusion Protein-D1/3-E7-His/HPV18 exprimiert
Ausgangsmaterialien

a) Plasmid pMG MCS Prot D1/3 (= pRIT14589) ist ein Derivat von pMG81 (beschrieben in GB 951 3261.9, veröffentlicht als WO 97/01640), in dem die Codonen 4–81 der NS1-codierenden Region aus Influenza durch die Codonen ersetzt waren, die den Resten Ser20→Thr127 von reifem Protein D aus Haemophilus influenzae Stamm 772, Biotyp 2 entsprechen (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. S. 119–125). Der Sequenz von Prot-D1/3 folgt eine multiple Klonierungsstelle (11 Reste) und eine codierende Region für einen C-terminalen Histidin-Schwanz (6 His) (siehe 15). Dieses Plasmid wird zur Expression der Fusion Protein D1/3-E7-His verwendet.
b) HPV-genomische E6- und E7-Sequenzen vom Prototyp HPV18 (siehe Cole et al., J. Md. Biol. (1987), 193, 599–608) wurden aus dem HPV16-Genom voller Länge amplifiziert, kloniert in pBR322 (erhalten vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für humane pathogene Papilloma-Viren – D 69120 – Heidelberg), und in pUC19 subkloniert, um TCA302 (= pRIT14467) zu ergeben.

Konstruktion von Plasmid TCA316 (= pRIT14532)
Die den Aminosäuren 1105 des Proteins E7 entsprechenden Nukleotidsequenzen wurden aus pRIT14467 amplifiziert. Während der Polymerasekettenreaktion wurden NcoI- und SpeI-Restriktionsstellen an den 5'- und 3'-Enden der E7-Sequenzen erzeugt, um die Insertion in die gleichen Stellen von Plasmid pMGMCS Prot-D1/3 zu erlauben, um Plasmid TCA316 (= pRIT14532) zu ergeben. Das Insert wurde sequenziert, und eine Modifikation gegenüber der E7/HPV18-Prototypsequenz wurde im E7-Gen identifiziert (Nukleotid 128G→A), die eine Substitution eines Glycins durch eine Glutaminsäure erzeugte (Aminosäure 43 in E7, Position 156 im Fusionsprotein). Die Sequenz für die Fusion Protein-D1/3-E7-His/HPV18 ist in 16 beschrieben.
1).b. Konstruktion von Plasmid TCA313 (= pRIT14523): ein Plasmid, das Thioredoxin exprimiert
Ausgangsmaterialien

a) Plasmid pBBR1MCS4 (R. Antoine und C. Locht, Mol. Microbiol. 1992, 6, 1785–1799; M. E. Kovach et al., Biotechniques 16 (5), 800–802), das kompatibel mit den Plasmiden ist, die ColE1- oder P15a-Ursprünge der Replikation enthalten.
b) Plasmid pMG42 (beschrieben in WO 93/04175), das die Sequenz des Promotors pL des λ-Phagen enthält.
c) Plasmid pTRX (Invitrogen, Kit Thiofusion K350-01), das die codierende Sequenz für Thioredoxin, gefolgt von einem AspA-Transkriptionsterminator trägt.

Konstruktion von Plasmid TCA313 (= pRIT14523)
Das Fragment EcoRI-NdeI aus pMG42, das den pL-Promotor trägt, und das NdeI-HindIII-Fragment aus pTRX, das die codierende Sequenz für Thioredoxin, gefolgt vom AspA-Terminator trägt, wurden gereinigt und in die EcoRI- und HindIII-Stellen des Plasmidvektors pBBR1MCS4 ligiert, um Plasmid TCA313 (= pRIT14523) zu ergeben (siehe 17).
Die Sequenz für Thioredoxin ist in 18 beschrieben.
2) Transformation des AR58-Stammes
2).a. Zum Erhalt des Stammes B1011, der Prot-D1/3-E7-His/HPV18 exprimiert
Plasmid pRIT14532 wurde in E. coli AR58 eingeführt (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), eine defektes λ-Lysogen, das einen wärmeempfindlichen Repressor des λ-pL-Promotors enthält, durch Selektion auf kanamycinresistente Transformanten.
2).b. Konstruktion von Stamm B1012, der Prot-D1/3-E7-His/HPV18 und Thioredoxin exprimiert
Plasmid pRIT14532 und pRIT14523 wurden in E. coli AR58 eingeführt (Mott et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci., 82: 88), ein defektes λ-Lysogen, das einen wärmeempfindlichen Repressor des λ-pL-Promotors enthält, durch doppelte Auswahl für kanamycin- und ampicillinresistente Transformanten.
3) Wachstum und Induzierung der Bakterienstämme B1011 und B1012 zur Expression von Prot-D1/3-E7-His/HPV18 mit und ohne Thioredoxin in trans
Zellen von AR58, transformiert mit Plasmid pRIT14532 (B1011-Stamm), und Zellen von AR58, transformiert mit den Plasmiden pRIT14532 und pRIT14523 (B1012-Stamm), wurden bei 30°C in 100 ml LB-Medium, das mit 50 μg/ml Kanamycin für den B1011-Stamm ergänzt war und mit 50 μg/ml Kanamycin und 100 μg/ml Ampicillin für den B1012-Stamm ergänzt war, gezüchtet. Während der logarithmischen Phase des Wachstums wurden die Bakterien zu 39°C verschoben, um den λ-Repressor zu inaktivieren und die Synthese von Protein D1/3-E7-His/HPV18 und Thioredoxin einzuschalten. Die Inkubation bei 39°C wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Bakterien wurden pelletisiert und bei –20°C gelagert.
Charakterisierung der Fusion Protein D1/3-E7-His/HPV18
Herstellung von Extrakten
Gefrorene Zellen werden aufgetaut und in 10 ml PBS-Puffer resuspendiert. Die Zellen werden in einer French-Presse SLM Aminco mit 20 000 psi aufgebrochen (drei Passagen). Der Extrakt wird mit 16 000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Analyse an Coomassie-angefärbten SDS-Polyacrylamidgelen und Western Blots
Nach Zentrifugieren der oben beschriebenen Extrakte wurden Teilmengen von Überstand und Pellet durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blotting analysiert.
Die Fusion Prot-D1/3-E7-His (ca. 31 kDa) wurde durch Coomassie-angefärbte Gele in der Pelletfraktion für Stamm B1011 visualisiert und teilweise in der überstehenden Fraktion für Stamm B1012 lokalisiert (30%) und wurde in Western Blots durch polyklonales Kaninchen-Anti-Protein-D und durch Ni-NTA-Konjugat identifiziert, das an alkalische Kälberdarmphosphatase (Qiagen Katalog-Nr. 34510) gekoppelt war, die zugängliche Histidin-Schwänze detektiert. Der Expressionsgrad stellt ca. 1–3% des Gesamtproteins dar, wie an einem Coomassie-angefärbten SDS-Polyacrylamidgel gezeigt.
Für den Extrakt von Stamm B1012 wurde das Thioredoxin (ca. 12 kDa) durch Coomassie-angefärbtes Gel im Überstand visualisiert und in Western Blots durch monoklonales Anti-Thioredoxin (Invitrogen R920-25) identifiziert.
Reinigung von Prot-D1/3-E7-His/HPV18
Rekombinantes HPV18-Prot-D1/3-E7-His wird in E. coli AR58-Stamm exprimiert (wie oben beschrieben). Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt (RT ca. 22°C). Proteine werden durch Überwachung von OD_280nm verfolgt. Zwischen den Schritten werden Antigen-positive Fraktionen bei –20°C aufgewahrt.
Gereinigtes Antigen ist für eine Woche bei –20°C und 4°C stabil (kein Abbau), aber scheint anfälliger für Oxidation nach Inkubation bei 37°C zu sein.
d) Löslichkeit
Die Proteinlöslichkeit ist pH-abhängig (siehe unten) mit einer Abnahme der Löslichkeit für pH < 7,4:

e) Das HPV18-Prot-D1/3-E7-Protein ist aus 227 Aminosäuren zusammengesetzt. Sein theoretisches Molekulargewicht beträgt 25,9 kDa und sein theoretischer isoelektrischer Punkt 5,83. Es wandert mit ca. 31,5 kDa im reduzierenden SDS-PAGE.

Beispiel XIV: Reinigung von HPV18-Protein D1/3-E7
a) Solubilisierung
Zellpaste wird auf 60 OD₆₀₀ in 2 M NaCl, 20 mM Phosphat
(NaH₂PO₄/K₂HPO₄) pH 7,6 vor der Zelllyse durch zwei Durchgänge durch einen Rannie-Disruptor suspendiert. Lysierte Zellen werden für 30 min mit 9 000 U/min in einem JA 10-Rotor bei 4°C pelletisiert. Zur Reduzierung der Endotoxinmenge wird das bakterielle Zellpellet, das das rekombinante Protein enthält, einmal in 5 mM EDTA, 2 M NaCl, PBS pH 7,4 gewaschen; einmal in 4 M Harnstoff, 20 mm Phosphat pH 7,4, und schließlich einmal in PBS pH 7,4, um Spuren von EDTA zu entfernen (jedes Waschen wird im zweifachen Volumen durchgeführt, das für die Zellsuspension verwendet wird). HPV18-Prot-D1/3-E7-His (TIT für Thioredoxin in trans) wird solubilisiert (im gleichen Volumen, das für die Zellsuspension verwendet wird) durch 6 M Guanidinchlorid, 50 mM PO₄ pH 7,6 über Nacht bei 4°C. Zelltrümmer werden für 30 min mit 9 000 U/min in einem JA-10-Rotor bei 4°C pelletisiert. Der Überstand wird mit 0,5% Empigen BB ergänzt und für 30 min bei RT inkubiert.
b) Reinigung
1).a. Immonbiliserte Metallaffinitätschromatographie
125 ml Probe werden auf eine Zn²⁺-komplexierende Sepharose FF-Säule geladen (XK 26/20, Pharmacia; 50 ml Gel/125 ml Solubilisierung), die in 0,5% Empigen BB, 6 M Guanidinchlorid, 50 mM PO₄ pH 7,6 mit 4 ml/min voräquilibriert wurde. Die Säule wird mit Guanidinchlorid 6 M, PO₄ 50 mM pH 7,6 gewaschen, bis die Basislinie erreicht ist, und dann mit 6 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 50 mM PO₄ pH 7,6. Antigen wird mit 0,25 M Imidazol in 6 M Harnstoff, 0,5 M NaCl, 50 mM PO₄ pH 7,6 mit 2 ml/min eluiert (1B). IMAC-eluierte Probe wird bei 4°C gegen PBS pH 7,4 dialysiert.
1).b. Affi-Prep^®-Polymyxin (Bio-Rad)
Zur Reduzierung des Endotoxingehalts werden 28 mg (37 ml) Antigen im Batch-Modus mit 2 ml Affiprep-Polymyxin-Harz, das in PBS pH 7,4 voräquilibriert wurde, über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteingewinnung wird auf 60% abgeschätzt und der Endotoxingehalt ist 6,5-fach reduziert.
1).c. Analyse
Gereinigtes Antigen, das an reduzierender SDS-PAGE analysiert wird, stellt eine Hauptbande mit 30 kDa mit einer zweiten bei 55 kDa nach Coomassie-Blue- oder Silberanfärbung dar. In einem nicht-reduzierenden SDS-PAGE erscheint HPV18-Prot-D1/3-E7-His hauptsächlich wie eine Schliere mit einem Molekulargewicht ≥ 175 kDa. Jedoch kann diese Oxidation durch Zugabe von 5 mM β-Mercaptoethanol umgekehrt werden. Diese Muster wird durch Anti-Prot-D- oder durch Anti-His-Western-Blottoing-Analyse bestätigt.
c) Stabilität
Gereinigtes Antigen ist für eine Woche bei –20°C und 4°C stabil (kein Abbau), aber erscheint anfälliger für Oxidation nach Inkubation bei 37°C.
d) Löslichkeit
Die Proteinlöslichkeit ist pH-abhängig (siehe unten) mit einer Abnahme der Löslichkeit für pH < 7,4.
HPV18-Prot-D1/3-E7-His-Protein ist aus 227 Aminosäuren zusammengesetzt. Sein theoretisches Molekulargewicht beträgt 25,9 kDa. Es wandert mit ca. 31,5 kDa im reduzierenden SDS-PAGE. Der theoretische isoelektrische Punkt beträgt 5,83.
Beispiel XV: Konstruktion von E. coli-Stamm B1098, der die Fusion Prot-D1/3-E7 mutiert (Cys21→Gly, Glu26→Gln) Typ HPV18 exprimiert
1) Konstruktion von Expressionsplasmid
Ausgangsmaterial

a) Plasmid pRIT14532 (= TCA316), das für die Fusion Protein D1/3-E7-His codiert.
b) Plasmid LITMUS28 (New England Biolabs, Kat. Nr. 306–28), ein aus pUC stammender Klonierungsvektor.
c) Plasmid pMG MCS Prot-D1/3 (pRIT 14589), ein Derivat von pMG81 (oben beschrieben), in dem die Codonen 4–81 der NS1-codierenden Region aus Influenza durch die Codonen ausgetauscht wurden, die den Resten Ser20→Thr127 des reifen Protein D aus Haemophilus influenzae Stamm 772, Biotyp 2 entsprechen (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. S. 119–125). Der Sequenz von Prot-D1/3 folgt eine multiple Klonierungsstelle (11 Reste) und eine codierende Region für einen C-terminalen Histidin-Schwanz (6 His).

Konstruktion von Plasmid pRIT14831 (= TCA355): ein Plasmid, das die Fusion Protein-D1/3-E7 mutiert (Cys27→Gly, Glu29→Gln) mit His-Schwanz exprimiert
Das NcoI-XbaI-Fragment aus pRIT14532 (= TCA316), das die codierende Sequenz des E7-Gens aus HPV18 trägt, verlängert mit einem His-Schwanz, wurde in einen intermediären Vektor Litmus 28 subkloniert, der zur Mutagenese nützlich ist, um pRIT14910 (= TCA348) zu ergeben. Durch Analogie mit E7/HPV16-Mutagenese wurden Doppelmutationen Cys27→Gly, Glu29→Gln gewählt, um die Bindung an das antionkogene Produkt des Retinoblastomgens (pRB) zu beeinträchtigen.
Die Einführung von Mutationen in das E7-Gen wurden mit dem Kit "Quick Change Site directed Mutagenesis" (Stratagene Katalog-Nr. 200518) realisiert. Als die Sequenzierung von pRIT14532 die Gegenwart einer Glutaminsäure in Position 43 von E7 anstelle eines Glycins in der Prototyp-Sequenz von HPV18 aufgezeigt hatte, wurden ein zweiter Durchlauf der Mutagenese realisiert, um ein Glycin in Position 43 einzuführen. Wir erhielten Plasmid pRIT14829 (= TCA353). Nach Bestätigung der Gegenwart von Mutationen und Integrität des vollständigen E7-Gens durch Sequenzierung wurde das mutierte E7-Gen in den Vektor pRIT14589 (= pMG MCS Prot-D1/3) eingeführt, um Plasmid pRIT14831 (= TCA355) zu ergeben (siehe 17).
Die Sequenz für die Fusion Protein D1/3-E7 mutiert (Cys27→Gly, Glu29→Gln)-His ist in 18 beschrieben.
2) Konstruktion von Stamm B1098, der Prot-D1/3-E7 mutiert (Cys27→Gly, Glu29→Gln)-His/HPV16 exprimiert
Plasmid pRIT14831 wurde in E. coli AR58 eingeführt (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), ein defektes λ-Isogen, das einen wärmeempfindlichen Repressor des λ-pL-Promotors enthält, um Stamm B1098 durch Auswahl für Kanamycin-resistente Transformanten zu ergeben.
3) Wachstum und Induzierung des Bakterienstammes B1098 zur Expression von Prot-D1/3-E7 mutiert (Cys27→Gly, Glu29→Gln)-His/HPV18
Zellen von AR58, transformiert mit Plasmid pRIT14831 (B1098-Stamm), wurden bei 30°C in 100 ml LB-Medium gezüchtet, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war. Während der logarithmischen Phase des Wachstums wurden die Bakterien zu 39°C verschoben, um den λ-Repressor zu inaktivieren und die Synthese von Prot-D1/3-E7 mutiert -His/HPV18 einzuschalten. Die Inkubation bei 39°C wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Bakterien wurden pelletisiert und bei –20°C gelagert.
4) Charakterisierung der Fusion Protein D1/3-E7 mutiert (Cys24→Gly, Glu26→Gln) – His-Typ HPV16
Gefrorene Zellen wurden aufgetaut in 10 ml PBS-Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden in einer French-Presse SLM Aminco mit 20 000 psi (drei Passagen) aufgebrochen. Der Extrakt wurde mit 16 000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Analyse an Coomassie-gefärbten SDS-Polyacrylamidgelen und Western-Blots
Nach dem Zentrifugieren der oben beschriebenen Extrakte wurden Teilmengen des Überstandes und des Pellets durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blotting analysiert.
Eine Hauptbande von ca. 31 kDa, die sich in der Pelletfraktion befand, wurde durch Coomassie-angefärbte Gele visualisiert und in Western Blots durch polyklonales Kaninchen-22 J 70-Anti-Protein D und durch monoklonales Penta-His identifiziert (Qiagen Katalog-Nr. 34660), das einen zugänglichen Histidinschwanz nachweist. Der Expressionsgrad stellt ca. 3 bis 5% des Gesamtproteins dar.
Beispiel XVI: Konstruktion eines E. coli-Stammes, der die Fusion Protein-D1/3-E6-His/HPV18 exprimiert
1. Konstruktion des Expressionsplasmids

a) Plasmid pMG MCS Prot-D1/3 (= pRIT14589) ist ein Derivat von pMG81 (oben schrieben), in dem die Codonen 4–81 der NS1-codierenden Region aus Influenza durch die Codonen ausgetauscht wurden, die den Resten Ser20→Thr127 von reifem Protein D aus Haemophilus influenzae Stamm 772, Biotyp 2 entsprechen (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. S. 119–125). Der Sequenz von Prot-D1/3 folgt eine multiple Klonierungsstelle (11 Reste) und eine codierende Region für einen C-terminalen Histidin-Schwanz (6 His). Dieses Plasmid wird zur Expression der Fusion Protein D1/3-E6-His verwendet. HPV-genomische E6- und E7-Sequenzen Typ HPV18 (Cole et al., J. Mol. Biol. 1987, 193, S. 599–608) wurden amplifiziert aus HPV18-Genom voller Länge, kloniert in pBR322 (erhalten vom Deutschen Krebsforschungsinszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für humane pathogene Papilloma-Viren – D 69120 – Heidelberg), und wurden in pUC19 subkloniert, um TCA302 (= pRIT14467) zu ergeben.

Konstruktion von Plasmid TCA314 (= pRIT14526): ein Plasmid, das die Fusion Protein-D1/3-E6-His/HPV18 exprimiert
Die den Aminosäuren 1→158 des E6-Proteins entsprechenden Nukleotidsequenzen wurden aus pRIT14467 amplifiziert. Während der Polymerasekettenreaktion wurden NcoI- und SpeI-Restriktionsstellen an den 5'- und 3'-Enden der E6-Sequenzen erzeugt, um die Insertion in die gleichen Stellen von Plasmid pMGMCS Prot-D1/3 zu erlauben, um Plasmid TCA314 (= pRIT14526) zu ergeben (siehe 21). Das Insert wurde sequenziert um zu verifizieren, daß keine Modifikation während der Polymerasekettenreaktion erzeugt worden war. Die codierende Sequenz für die Fusion Protein-D1/3-E6-His ist in 22 beschrieben.
Transformation des AR58-Stammes
Plasmid pRIT14526 wurde in E. coli AR58 eingeführt (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88), ein defektes λ-Lysogen, das einen wärmeempfindlichen Repressor des λ-pL-Promotors enthält.
3. Wachstum und Induktion der Expression von Prot-D1/3-E-His durch den bakteriellen Stamm
Zellen von Ar58, transformiert mit Plasmid pRIT14526, wurden in 100 ml LB-Medium, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war, bei 30°C gezüchtet. Während der logarithmischen Phase des Wachstums wurden die Bakterien zu 39°C verschoben, um den λ-Repressor zu inaktivieren und die Synthese von Protein D1/3-E6-His einzuschalten. Die Inkubation bei 39°C wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Bakterien wurden pelletisiert und bei –20°C gelagert.
4. Charakterisierung der Fusion Protein D/3-E6-His
Gefrorene Zellen werden aufgetaut und in 10 ml PBS-Puffer resuspendiert. Zellen werden in einer French-Presse SLM Aminco mit 20 000 psi aufgebrochen (drei Passagen). Der Extrakt wird mit 16 000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Nach Zentrifugieren der oben beschriebenen Extrakte wurden Teilmengen von Überstand und Pellet durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Blotting analysiert. Eine Hauptbande von ca. 32 kDa, lokalisiert in der Pelletfraktion, wurde durch Coomassie-angefärbte Gele visualisiert und in Western-Blots durch polyklonales Kaninchen-Anti-Protein D und durch Ni-NTA-Konjugat identifiziert, das an alkalische Kälberdarmphosphatase (Qiagen Katalog-Nr. 34510) gekoppelt war, die zugängliche Histidin-Schwänze detektiert. Der Expressionsgrad stellt ca. 3–5% des Gesamtproteins dar.
Beispiel XVII: Konstruktion eines E. coli-Stammes, der die Fusion Protein-D1/3-E6E7-His/HPV18 exprimiert
1. Konstruktion des Expressionsplasmids

a) Plasmid pMG MCS Prot-D1/3 (= pRIT14589) ist ein Derivat von pMG81 (oben beschrieben), in dem die Codonen 4–81 der NS1-codierenden Region aus Influenza durch die Codonen ersetzt wurden, die den Resten Ser 20→Thr127 von reifem Protein D aus Haemophilus influenzae Stamm 772, Biotyp 2 entsprechen (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. S. 119–125). Der Sequenz Prot-D1/3 folgt eine multiple Klonierungsstelle (11 Reste) und eine codierende Region für einen C-terminalen Histidin-Schwanz (6 His). Dieses Plasmid wird zur Expression der Fusion Protein D1/3-E6E7-His verwendet.
b) HPV-genomische E6- und E7-Sequenzen Typ HPV18 (Cole et al., J. Mol. Biol. 1987, 193, 599–608) wurden aus HPV18-Genom voller Länge amplifiziert, das in pBR322 kloniert wurde (erhalten vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum für humane pathogene Papillomaviren – D 69120 – Heidelberg), und wurden in pUC19 subkloniert, um TCA302 (= pRIT14467) zu ergeben.
c) Die codierenden Sequenzen für E6 und E7 in TCA302 (= pRIT14467) wurden mit einem synthetischen Oligonukleotid-Adapter modifiziert (inseriert zwischen die HgaI- und NsiI-Stellen), wodurch eine Deletion von 11 Nukleotiden zwischen den E6- und E7-Genen eingeführt, das Stoppcodon von E6 entfernt und fusionierte E6- und E7-codierende Sequenzen im Plasmid TCA320 (= pRIT14618) geschaffen wurden, siehe 23.

Konstruktion von Plasmid TCA328 (= pRIT14567): ein Plasmid, das die Fusion Protein-D1/3-E6E7-His/HPV18 exprimiert
Die den Aminosäuren 1→263 von fusioniertem E6E7-Protein entsprechenden Nukleotidsequenzen wurden aus pRIT14618 amplifiziert. Während der Polymerasekettenreaktion wurden NcoI- und SpeI-Restriktionsstellen an den 5'- und 3'-Enden der E6E7-fusionierten Sequenzen erzeugt, um die Insertion in die gleiche Stelle von Plasmid pMGMCS-Prot-D1/3 zu erlauben, um Plasmid TCA328 (= pRIT14567) zu ergeben (siehe 24). Das Insert wurde sequenziert um zu verifizieren, daß keine Modifikation während der Polymerasekettenreaktion erzeugt worden war. Die codierende Sequenz für die Fusion Protein-D1/3-E6E7-His ist in 25 beschrieben.
2. Transformation des AR58-Stammes
Plasmid pRIT14567 wurde in E. coli AR58 (Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 88) eingeführt, ein defektes λ-Lysogen, das einen wärmeempfindlichen Repressor des λ-pL-Promotors enthält.
3. Wachstum und Induktion der Expression von Prot-D1/3-E6E7-His durch den bakteriellen Stamm
Zellen von AR58, transformiert mit Plasmid pRIT14512, wurden in 100 ml LB-Medium, das mit 50 μg/ml Kanamycin ergänzt war, bei 30°C gezüchtet. Während der logarithmischen Phase des Wachstums wurden die Bakterien zu 39°C verschoben, um den λ-Represser zu inaktivieren und die Synthese von Protein D1/3-E6E7-His einzuschalten. Die Inkubation bei 39°C wurde für 4 Stunden fortgesetzt. Die Bakterien wurden pelletisiert und bei –20°C gelagert.
4. Charakterisierung der Fusion Protein-D1/3-E6E7-His
Gefrorene Zellen werden aufgetaut und 10 ml PBS-Puffer resuspendiert. Die Zellen werden in einer French-Presse SLM Aminco mit 20 000 psi (drei Passagen) aufgebrochen. Der Extrakt wird mit 16 000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Nach dem Zentrifugieren oder oben beschriebenen Extrakte wurden Teilmengen von Überstand und Pellet durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Western Blotting analysiert. Eine Hauptbande von ca. 48 kDa, die sich in der Pelletfraktion befand, wurde durch Coomassie-angefärbte Gele visualisiert und in Western Blots durch polyklonales Kaninchen-Anti-Protein-D und durch Ni-NTA-Konjugat identifiziert, das an alkalische Käberdarmphosphatase (Qiagen Katalog Nr. 34510) gekoppelt war, das zugängliche Histidin-Schwänze nachweist. Der Expressionsgrad stellt ca. 1% Gesamtprotein dar.
Beispiel XVIII: Impfstofformulierungen
Impfstoffe werden mit einem Protein aus den obigen Beispielen, exprimiert in E. coli aus dem Stamm AR58, und einem Hilfsstoff formuliert, wobei die Formulierung eine Mischung aus 3-des-O-acyliertem Monophosphoryl lipid A (3D-MPL) und Aluminiumhydroxid oder 3D-MPL und/oder QS21 umfaßt, gegebenenfalls in einer Öl/Wasser-Emulsion und gegebenenfalls mit Cholesterin formuliert.
3D-MPL: ist eine chemische entgiftete Form des Lipopolysaccharids (LPS) des Gram-negativen Bakteriums Salmonella minnesota.
Bei Smith Kline Beecham Biologicals durchgeführte Experimente haben gezeigt, daß 3D-MPL in Kombination mit verschiedenen Trägern sowohl die humorale als auch eine zelluläre TH1-Typ-Immunität stark steigert.
QS21: ist ein aus einem Rohextrakt der Rinde des Baumes Quillaja saponaria molina gereinigtes Saponin, das eine starke Hilfsstoffaktivität besitzt: es aktiviert sowohl die Antigen-spezifische Lymphoproliferation als auch CTLs für verschiedene Antigene.
Impfstoff, der ein Antigen der Erfindung und 3D-MPL und Alaun enthält, kann in analoger Weise zu der in WO 93/19780 oder 92/16231 beschriebenen hergestellt werden.
Bei Smith Kline Beecham Biologicals durchgeführte Experimente haben eine klare synergistische Wirkung von Kombinationen aus 3D-MPL und QS21 zur Induktion sowohl humoraler als auch zellulärer TH1-Typ-Immunreaktionen gezeigt. Impfstoffe, die ein solches Antigen enthalten, werden in US-PS 5 750 110 beschrieben.
Die Öl/Wasser-Emulsion ist aus zwei Ölen (α-Tocopherol und Squalen) und aus PBS, das Tween 80 als Emulgator enthält, zusammengesetzt. Die Emulsion umfaßte 5% Squalen, 5% Tocopherol, 0,4% Tween 80 und hatte eine durchschnittliche Teilchengröße von 180 nm und ist als SB62 bekannt (siehe WO 95/17210).
Bei Smith Kline Beecham Biologicals durchgeführte Experimente haben bewiesen, daß die Zugabe dieser O/W-Emulsion zu MPL/QS2l ihre immunstimulierenden Eigenschaften weiter erhöht.
Herstellung von Emulsion SB62 (2-faches Konzentrat)
Tween 80 wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gelöst, um eine 2%ige Lösung in PBS zu ergeben. Um 100 ml zweifache Konzentratemulsion zu liefern, werden 5 g DL-α-Tocopherol und ml Squalen sorgfältig zum Vermischen miteinander verwirbelt. 90 ml PBS/Tween-Lösung werden hinzugegeben und sorgfältig vermischt. Die resultierende Emulsion wird dann durch eine Spritze geleitet und schließlich unter Verwendung einer M110S-Microfluidics-Maschine mikrofluidisiert. Die resultierenden Öltröpfchen haben eine Größe von ca. 180 nm.
Herstellung von Prot-D1/3-E7-QS21/3D-MPL-Öl-in-Wasser-Formulierungen
Prot-D1/3-E7 (5 μg) wurde in 10-fach konzentriertem PBS pH 6,8 und H₂O vor der aufeinanderfolgenden Zugabe von SB62, 3D-MPL (5 μg), QS21 (5 μg) und 50 μg/ml Thiomersal als Konservierungsmittel in 5-minütigen Abständen verdünnt. Das Emulsionsvolumen ist gleich 50% des Gesamtvolumens (50 µl für eine Dosis von 100 µl). Alle Inkubationen wurden bei Raumtemperatur unter Rühren durchgeführt. Die Hilfsstoffkontrollen ohne Antigen wurden durch Ersetzen von Protein durch PBS hergestellt.
Tumorregressionsexperimente (HPV16) mit Prot-D-E7
Impfstoffantigen: Fusionsprotein Prot-D-E7
Protein D ist ein auf der Oberfläche des Gram-negativen Bakteriums Haemophilus influenzae exponiertes Lipoprotein. Der Einschluß der ersten 109 Reste des Protein D als Fusionspartner wird eingeschlossen, um dem Impfstoff-Antigen zusätzliche Helfereigenschaften zu verleihen. Das Antigen wurde mit QS21, 3D-MPL und SB62 wie oben beschrieben formuliert.
Beispiel XIX: Tumorregressionsexperimente in vivo
Tumorzellinie TC1
Primäre Lungenepithelzellen aus C57BL.6-Mäusen wurden durch HPV16-E6 und -E7 unsterblich gemacht und dann mit einem aktivierten ras-Onkogen transformiert, um eine kanzerogene Zellinie zu erzeugen, die E6 und E7 exprimiert (K. Y. Lin et al., 1996). Die E7-Expression wurde durch FACS-Analyse von fixierten und permeabilisierten TC1-Zellen unter Verwendung des Maus-Anti-HPV16-E7-Mab verifiziert (Triton Corp., Alameda, CA).
Tumorwachstum
In einer In-vitro-Kultur wachsende TC1-Zellen wurden trypsinisiert, zweimal in serumfreiem Medium gewaschen und in die rechte Seite der Mäuse subkutan injiziert. Zur Beurteilung der Behandlung etablierter Tumoren wurden TC1-Zellen mit einer Dosis von 3 × 10⁴ Zellen/Maus injiziert. Eine und zwei Wochen nach der Injektion der Tumorzellen wurden die Mäuse mit 5 μg in 100 µl von Prot-D1/3-E7-His in die Fußsohle (50 μl/Fußsohle) in PBS oder in 3D-MPL, QS21 und SB62 oder mit PBS oder mit Hilfsstoff allein geimpft. Fünf C57BL/6-Mäuse (Iffa Credo) wurden in jeder Gruppe verwendet. Die Mäuse wurden zweimal wöchentlich auf Tumorwachstum überwacht. Die mittleren Tumormasse/Gruppe ist in 26 gezeigt, wonach die mit Prot-D1/3-E7-His in PBS oder mit PBS oder Hilfsstoff allein geimpften Mäuse fortschreitend wachsende Tumoren entwickelten (0–1 tumorfreie Tiere/Gruppe). Im Gegensatz entwickelten vier von fünf Mäusen, die mit Prot-D1/3-E7-His in Hilfsstoff geimpft wurden, keinen Tumor, ein Tier entwickelte einen sehr kleinen und stabilen Tumor am Tag 40. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Protein Prot-D1/3-E7-His aus HPV16, formuliert in Hilfsstoff, die Regression von kleinen etablierten Tumoren induzieren kann, die dieses Antigen exprimieren.
Immunologische Auslesung
Proliferationstest
Für den In-vitro-Test wurden Lymphozyten durch Zerstoßen der Milz oder der Lymphknoten der Kniekehle aus den geimpften Mäusen am Tag 69 präpariert. Eine Teilmenge von 2 × 10⁵ Zellen wurde dreifach in Platten mit 96 Vertiefungen mit abnehmenden Konzentrationen (10, 1, 0,1 μg/ml) von Prot-D1/3-E7-His ausplattiert, das auf Latex-Mikroperlen (Sigma) aufgetragen war oder nicht, um die Zellen in vitro zu restimulieren (72 h). Die T-Zellproliferation wurde durch 3H-Thymidinaufnahme gemessen.
27 und 28 vergleichen die Fähigkeit von Prot-D-E7 zur Stimulierung der Proliferation von Milzzellen und Lymphknotenzellen, geprimed in vivo entweder durch PBS, 3D-MPL, QS21, SB62, Prot-D1/3-E7-His und Prot-D1/3-E7-His + Hilfsstoff aus 3D-MPL, QS21, SB62 und zeigen, daß hohe proliferative Reaktionen der Milz nur in den Mäusen nachgewiesen wurden, die mit Prot-D1/3-E7-His in Hilfsstoff immunisiert wurden, verglichen mit den anderen Gruppen.
Antikörperreaktion
Individuelle Seren wurden zum gleichen Zeitpunkt entnommen, zu dem die Organe entnommen wurden, und wurden indirekten ELISAs unterworfen.
5 μg/ml gereinigtes E7-Protein wurden als beschichtetes Antigen verwendet. Nach Sättigung in PBS + 1% Neugeborenenkälberserum für 1 h bei 37°C wurden die Serien seriell verdünnt (beginnend mit 1/100) im Sättigungspuffer und über Nacht bei 4°C oder für 90 min bei 37°C inkubiert. Nach Waschen in PBS, Tween 20 0,1% wurden biotinyliertes Ziege-Anti-Maus-Ig (1/1000) oder Ziege-Anti-Maus-Ig-Unterklasse (Gesamt-IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) Antiseren (1/5000) als zweite Antikörper verwendet, nach einer Inkubation für 90 min bei 37°C wurde an Peroxidase gekoppeltes Streptavidin hinzugegeben, und TMB (Tetramethylbenzidin/Peroxid) wurden als Substrat verwendet, und nach 10 min wurde die Reaktion mit H₂SO₄ 0,5 M angehalten und der OD₄₅₀-Wert bestimmt.
Die durch die in den unterschiedlichen Gruppen von Mäusen hervorgerufenen Unterklassen-spezifischen Anti-E7-Titer sind in 29 als Vergleich der relativen mittleren Mittelpunktsverdünnung des Serums gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß eine schwache Antikörperreaktion mit zwei Injektionen von Prot-D1/3-E7-HPV16 allein ausgelöst wird.
Viel mehr Anti-E7-Antikörper werden erzeugt, wenn Prot-D1/3-E7 in Gegenwart des Hilfsstoffs SB62, QS21 + 3D-MPL injiziert wurde.
Weder IgA noch IgM wurden in einer der Serumproben nachgewiesen, selbst im Serum der Mäuse, die Prot-D1/3-E7 im Hilfsstoff SB62, QS31 + 3D-MPL erhielten (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz wurde der Gesamt-IgG-Gehalt leicht erhöht durch die Impfung der Mäuse mit Port-D1/3-E7 allein und wurde stark erhöht durch die Zugabe des Hilfsstoffs SB62, QS21 + 3D-MPL zum Protein. Die Analyse der Konzentrationen der unterschiedlichen IgG-Unterklassen zeigt, daß eine gemischte Antikörperreaktion induziert wurde, da die Konzentration aller Typen der analysierten IgG-Unterklassen (IgGl, IgG2a und IgG2b) im Serum der Mäuse erhöht wurde, die das mit Hilfsstoff versehene Antigen erhielten, verglichen mit der im Serum der Mäuse beobachteten Konzentration, die das Antigen oder den Hilfsstoff allein erhielten. Der hauptsächlich gefundene Isotyp war IgG2b, der mehr als 80% des gesamten IgG darstellte. Dieser Isotyp soll allgemein mit der Induzierung einer TH1-Typ-Immunreaktion verbunden sein.
Beispiel XX: Tumorschutzexperimente in vivo
Mäuse wurden zweimal in einem 14-tägigen Intervall mit entweder PBS, Hilfsstoff aus Beispiel 1, 5 μg Prot-D1/3-E7-His oder 5 μg Prot-D1/3-E7-His im Hilfsstoff aus Beispiel 1 in die Fußsohle mit einem Volumen von 100 µl immunisiert (50 μl/Fußsohle).
Tumorwachstum
Vier Wochen nach der letzten Impfung wurden die Mäuse mit 2 × 10⁵ TC1-Zellen/Maus subkutan in die Seite exponiert. Die in einer In-vitro-Kultur wachsenden TC1-Zellen wurden trypsinisiert und zweimal in serumfreiem Medium gewaschen und injiziert. 5 in jeder Gruppe verwendete Mäuse wurden zweimal wöchentlich auf Tumorwachstum überwacht.
30 zeigt, daß die Impfung mit dem E7-Protein im Hilfsstoff SB62, QS21, 3D-MPL die Mäuse gegen die Entwicklung von Tumor schützt (nur ein Tier von 5 hat einen sehr kleinen und stabilen Tumor), in allen anderen Gruppen, die das E7-Protein ohne den Hilfsstoff oder nur den Hilfsstoff allein erhielten, entwickelten sich wachsende Tumoren.
Immunologische Auslesung
Drei Wochen nach der letzten Impfung, vor der Tumorexposition, wurden 5 Mäuse in jeder Gruppe zur immunologischen Auslesung getötet.
Proliferationstest
Zum In-vitro-Test wurden Lymphozyten wie oben beschrieben aus der Milz und aus den Lymphknoten der Kniekehle präpariert. Eine Teilmenge von 2 × 10⁵ Zellen wurde dreifach in Platten mit 96 Vertiefungen mit abnehmenden Konzentrationen (10, 1, 0,1 μg/ml) von Prot-D1/3-E7-His ausplattiert, beschichtet auf Latex-Mikroperlen (Sigma) oder nicht, um die Zellen in vitro zu restimulieren (72 h). Die T-Zellproliferation wurde durch 3H-Thymidinaufnahme gemessen.
Die 31 bzw. 32 zeigen, daß sowohl mit den Milzzellen als auch den Kniekehlen-Lymphknotenzellen, wie es unter den therapeutischen Bedingungen beobachtet wurde, eine bessere lymphoproliferative Aktivität für die Mäuse erhalten wurde, die das E7-Protein im Hilfsstoff SB62, QS21, 3D-MPL erhielten.
Antikörperreaktion: 33 zeigt, daß wie unter den therapeutischen Bedingungen eine bessere Antikörperreaktion im Serum der Mäuse beobachtet wurde, die mit dem Prot-D1/3-E7-Protein geimpft wurden, das im 3D-MPL, QS21-O/W-Hilfsstoff formuliert wurde. Eine gemischte Antikörperreaktion wurde ausgelöst, da alle IgG-Unterklassen getestet wurden (IgG2a, IgG2b, IgG1); auch in diesem Fall wurde festgestellt, daß IgG2b der vorherrschende Isotyp war, der 75% des Gesamt-IgG darstellt.
Beispiel XXI: Impfungsexperimente mit Prot-D1/3-E7 (HPV18)
Mäuse wurden zweimal im Abstand von 2 Wochen mit 5 μg in 100 µl von Prot-D1/3-18-E7-His in die Fußsohle (50 μl/Fußsohle) in PBS oder QS21, 3D-MPL und SB62, DQ MPL wie in WO 96/33739 beschrieben oder DQ-Alaun-MPL wie in WO 98/15827 beschrieben geimpft. Acht 6 bis 8 Wochen alte Balb/c-Mäuse (Iffa Credo) wurden in jeder Gruppe verwendet. 14 Tage nach der zweiten Impfung wurden die Milz und Lymphknoten zur immunologischen Auslesung entnommen und Blutproben zur Serologie entnommen.
– Immunologische Auslesung
Proliferationstest
Für den In-vitro-Test wurden Lymphozyten durch Zerstoßen der Milz oder der Kniekehlen-Lymphknoten aus den geimpften Mäusen am Tag 28 präpariert.
Eine Teilmenge von 2 × 10⁵ Zellen wurde dreifach in Platten mit 96 Vertiefungen mit abnehmenden Konzentrationen (10, 1, 0,1, 0,01 μg/ml) von Prot-D1/3-18-E7-His ausplattiert, um die Zellen in vitro zu restimulieren (72 h). Die T-Zellproliferation wurde durch die 3H-Thymidinaufnahme gemessen. Die Ergebnisse werden als Stimulationsindex ausgedrückt (cpm Probe/cpm Basislinie).
34 und 35 vergleichen die Fähigkeit von Prot-D1/3-18-E7 zur Stimulation der Proliferation von Milzzellen oder Lymphknotenzellen, die in vivo entweder durch Prot-D1/3-18-E7-His oder Prot-D1/3-18-E7-His + Hilfsstoff geprimed wurden, und zeigen, daß nur eine basale Lymphoproliferation bei den Mäusen beobachtet wird, die das Protein allein erhielten; im Gegensatz wurden hohe proliferative Reaktionen der Milz und sehr hohe Reaktionen der Lymphknoten in den mit Prot-D1/3-18-E7-His in Hilfsstoff immunisierten Mäusen detektiert.
Cytokinproduktion

– Die Cytokine (IL-5 und IFNg), die im Kulturüberstand nach einem 96-stündigen Zeitraum der In-vitro-Restimulation von Milz- oder Lymphknotenzellen mit Medium oder mit Prot-D1/3-18-E7 (1 oder 3 μg/ml) erzeugt wurden, wurden durch ELISA wie beschrieben gemessen:

– IFNg (Genzyme)
Die Quantifizierung von IFNγ wurde durch ELISA unter Verwendung von Reagenzien von Genzyme durchgeführt. Proben und Antikörperlösungen wurden mit 50 µl pro Vertiefung verwendet. Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dänemark) wurden über Nacht bei 4°C mit 50 µl von Hamster-Anti-Maus-IFNg beschichtet, das auf 1,5 μg/ml in Carbonatpuffer pH 9,5 verdünnt war. Die Platten wurden dann für 1 h bei 37°C mit 100 µl PBS inkubiert, das 1% Rinderserumalbumin und 0,1% Tween 20 enthielt (Sättigungspuffer). Zweifache Verdünnungen des Überstands aus der In-vitro-Stimulierung (ausgehend von 1/2) in Sättigungspuffer wurden zu den Anti-IFNg-beschichteten Platten gegeben und für 1 h 30 bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden 4-mal mit PBS Tween 0,1% (Waschpuffer) gewaschen, und Biotin-konjugiertes Ziege-Anti-Maus-IFNg, verdünnt in Sättigungspuffer auf eine Endkonzentration von 0,5 μg/ml, wurde zu jeder Vertiefung gegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde AMDEX-Konjugat (Amersham), verdünnt auf 1/10000 in Sättigungspuffer, für 30 min bei 37°C hinzugegeben. Die Platten wurden wie oben gewaschen und mit 50 µl TMB (Biorad) für 15 min inkubiert. Die Reaktion wurde mit H₂SO₄ 0,4 N beendet und bei 450 nm ausgelesen. Konzentrationen wurden unter Verwendung einer Standardkurve (Maus-IFNγ-Standard) durch SoftmaxPro (Gleichung mit vier Parametern) berechnet und in pg/ml ausgedrückt.
– IL5 (Pharmingen)
Die Quantifizierung von IL5 wurde durch ELISA unter Verwendung von Reagenzien von Pharmingen durchgeführt. Proben und Antikörperlösungen wurden mit 50 µl pro Vertiefung verwendet. Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dänemark) wurden über Nacht bei 4°C mit 50 µl von Ratte-Anti-Maus-IL5 beschichtet, das auf 1 μg/ml in Carbonatpuffer pH 9,5 verdünnt war. Die Platten wurden dann für 1 h bei 37°C mit 100 µl PBS inkubiert, das 1% Rinderserumalbumin und 0,1% Tween 20 enthielt (Sättigungspuffer). Zweifache Verdünnungen des Überstands aus der In-vitro-Stimulierung (ausgehend von 1/2) in Sättigungspuffer wurden zu den Anti-IFNg-beschichteten Platten gegeben und für 1 h 30 bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden 4-mal mit PBS Tween 0,1% (Waschpuffer) gewaschen, und Biotin-konjugiertes Ratte-Anti-Maus-IL5, verdünnt in Sättigungspuffer auf eine Endkonzentration von 1 μg/ml, wurde zu jeder Vertiefung gegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde AMDEX-Konjugat (Amersham), verdünnt auf 1/10000 in Sättigungspuffer, für 30 min bei 37°C hinzugegeben. Die Platten wurden wie oben gewaschen und mit 50 µl TMB (Biorad) für 15 min inkubiert. Die Reaktion wurde mit H₂SO₄ 0,4 N beendet und bei 450 nm ausgelesen. Konzentrationen wurden unter Verwendung einer Standardkurve (rekombinantes Maus-IL5) durch SoftmaxPro (Gleichung mit vier Parametern) berechnet und in pg/ml ausgedrückt.
Ausgehend von Milzzellen konnte kein IL5 in irgendeiner der getesteten Gruppen nachgewiesen werden, im Gegensatz wurde eine sehr hohe Erzeugung von IFNg in allen Gruppen beobachtet, mit nur einer geringen Zunahme in der Gruppe von Mäusen, die das mit SBAS1c versetzte Protein erhalten hatten, verglichen mit den anderen Gruppen. Dies legt die Induzierung einer Immunreaktion von TH1-Typ nahe.
Bezüglich der Lymphknotenzellen wurde eine sehr schwache IFNg-Produktion in der Gruppe von Mäusen erhalten, die das Protein allein erhalten hatten, und eine 5- bis 10-fache Zunahme wird beim Protein mit Hilfsstoff beobachtet. IL5 konnte nur in der Gruppe von Mäusen nachgewiesen werden, die das Protein mit SBAS2 als Hilfsstoff erhalten hatten.
36 und 37 vergleichen die Fähigkeit von Prot-D1/3-18-E7-His zur Stimulation der Produktion von Cytokinen (IFNg und IL5) nach In-vitro-Restimulation von Milz- bzw. Lymphknotenzellen.
Antikörperreaktion
Individuelle Seren wurden zum gleichen Zeitpunkt entnommen wie die Organe und direkten ELISAs unterworfen.
2,5 μg/ml von gereinigtem Prot-D1/3-18-E7-Protein HPV18 wurden als beschichtetes Antigen verwendet. Nach Sättigung in PBS + 1% Neugeborenenkälberserum für 1 h bei 37°C wurden die Seren seriell (ausgehend von 1/100) im Sättigungspuffer verdünnt und über Nacht bei 4°C oder für 90 min bei 37°C inkuziert. Nach Waschen in PBS Tween 20 0,1% wurden biotinyliertes Ziege-Anti-Maus-IgG (1/1000) oder Ziege-Anti-Maus-Ig-Unterklassen (Gesamt-IgG, Igel, IgG2a, IgG2b) Antiseren (1/5000) als zweite Antikörper verwendet, nach einer Inkubation für 90 min bei 37°C wurde an Peroxydase gekoppeltes Streptavidin hinzugegeben, und TMB (Tetramethylbenzidin/Peroxid) wurde als Substrat verwendet, nach 10 min wurde die Reaktion mit H₂SO₄ 0,5 M beendet, und der OD₄₅₀-Wert wurde bestimmt.
Eine sehr schwache Antikörperreaktion wird mit zwei Injektionen von Prot-D1/3-18-E7 allein ausgelöst. Der Gesamt-IgG-Gehalt wurde durch Zugabe von Hilfsstoffen zum Proteinimpfstoff stark erhöht.
Die Analyse der Konzentrationen der unterschiedlichen IgG-Unterklassen zeigt, daß wenn das Protein in Gegenwart von Hilfsstoffen injiziert wurde, DQS21, 3D-MPL oder SB62, QS21/3D-MPL, eine leichte Zunahme des IgG2a-Untertyp-Prozentanteils erhalten wurde: 28% IgG1, 48% IgG2a bzw. 43% IgG1, 44% IgG2a, verglichen mit 46% IgG1, 32% IgG2a bei Protein ohne Hilfsstoff. Die stärkste Antikörperreaktion wird mit dem Protein erhalten, das in DQ-Alaun formuliert ist, mit einer klaren Verschiebung der Isotyp-Konzentration (80% IgG1, 8% IgG2a). Da allgemein angenommen wird, daß der IgG2a-Isotyp in Balb/c-Mäusen mit der Induzierung einer Immunreaktion vom TH1-Typ verbunden ist, legen diese Ergebnisse nahe, daß die Hilfsstoffe DQS21, 3D-MPL und SB62-QS21/3D-MPL dazu neigen, das TH1-Typ-Profil der humoralen Reaktion zu erhöhen, während SBAS5 eine klare Reaktion vom TH2-Typ induziert.
38. Der Vergleich der Mittelpunktsverdünnung des Serums und der relative Prozentanteil der durch die Impfungen in den verschiedenen Gruppen von Mäusen hervorgerufenen unterschiedlichen Isotypen sind gezeigt.
Schlußfolgerung
Wir haben gezeigt, daß das fusionierte Protein 1/3-Prot-D und frühes Protein E7 von HPV16 eine hochwirksame systemische Antitumorimmunität induzierten, und es wurde ebenfalls gezeigt, daß das Fusionsprotein Prot-D1/3 und E7 von HPV18 immunogen in Mäusen ist. Impfung mit dem Prot-D1/3-E7-HPV16-Fusionsprotein schützte die Mäuse vor einer Tumorexposition mit E7-exprimierenden Tumorzellen und eliminierte kleine zuvor bestehende Tumore, die E7 von HPV16 exprimieren, die an einer von der Impfstellen entfernten Stelle injiziert wurden.
Wir haben gezeigt, daß das Prot-D1/3-E7-HPV16-Protein in Hilfsstoff die Helfer-T-Zellproliferation steigern kann, was nahelegt, daß die durch diesen Impfstoff induzierte Antitumor-Immunreaktion wenigstens teilweise mit einer CD⁴⁺-T-Zellreaktion verbunden ist.
Wir haben ebenfalls gezeigt, daß eine bessere Antikörperreaktion durch die Impfung mit Prot-D1/3-E7 in Gegenwart von 3D-MPL-haltigem Hilfsstoff ausgelöst wurde. Da der im Serum von C57BL/6-Mäusen gefundene hauptsächliche Isotyp IgG2b ist, legt dies nahe, daß eine Immunreaktion vom TH1-Typ hervorgerufen wurde.

Claims

Fusionsprotein, das humanes Papillomavirus-Antigen umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, die aus: i) E6-Protein, ii) E7-Protein, iii) E6E7-Fusionsprotein, (iv) E7-Protein, worin eine Mutation zur Reduzierung der Bindung für das Retinoblastomgenprodukt eingeführt ist, oder v) E6-Protein, worin eine Mutation in die p53-Region des E6-Proteins eingeführt ist, besteht; wobei das Protein an Protein D oder ein Derivat davon aus Haemophilus influenzae B gebunden ist, worin das Derivat von Protein D etwa die ersten 100 N-terminalen Aminosäuren von Protein D umfaßt.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 1, worin das Derivat von Protein D etwa das erste Drittel von Protein D umfaßt.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Derivat von Protein D lipidiert ist.
Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das humane Papillomavirus HPV16 oder HPV18 ist.
Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das mutierte HPV16-E7-Protein ein Element umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus (i) Austausch von Cys₂₄ gegen Glycin, (ii) Austausch von Glutaminsäure₂₆ gegen Glutamin und (iii) Austausch von Cys₂₄ gegen Glycin und Glutaminsäure₂₆ gegen Glutamin besteht.
Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das mutierte HPV18-E7-Protein ein Element umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus (i) Austausch von Cys₂₇ gegen Glycin, (ii) Austausch von Glutaminsäure₂₉ gegen Glutamin und (iii) Austausch von Cys₂₇ gegen Glycin und Glutaminsäure₂₉ gegen Glutamin besteht.
Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, das zusätzlich einen Histidin-Schwanz mit wenigstens 4 Histidin-Resten umfaßt.
DNA-Sequenz, die ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert.
Impfstoff, der ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und einen pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsstoff oder Exzipienten enthält.
Impfstoff gemäß Anspruch 9, der zusätzlich einen Hilfsstoff umfaßt.
Impfstoff gemäß Anspruch 9 oder 10, worin das Protein in einem Öl-in-Wasser-Emulsionsträger angeboten wird.
Impfstoff gemäß Anspruch 10 oder 11, worin der Hilfsstoff 3D-MPL oder QS21 oder beide umfaßt.
Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, der ein zusätzliches HPV-Antigen umfaßt.
Impfstoff gemäß Anspruch 13, worin das zusätzliche HPV-Antigen ein oder mehrere Mitglieder ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus E2, E5, L1 und L2 besteht.
Impfstoff gemäß Anspruch 14, worin L1 und L2 zusammen als virusartiges Partikel angeboten werden oder worin L1 allein als virusartiges Partikel oder Kapsomerstruktur angeboten wird.
Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Behandlung durch Immuntherapie eines Patienten, der an HPV-induzierten Tumorläsionen (gutartig oder bösartig) leidet.
Verwendung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Prävention einer HPV-Virusinfektion.
Vektor, der eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 8 enthält.
Vektor, der eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 8 und eine DNA-Sequenz enthält, die Thioredoxin kodiert, was die Koexpression des Fusionsproteins mit Thioredoxin in trans erlaubt.
Bakterielle Wirtszelle, die mit DNA-Sequenz gemäß Anspruch 8 transformiert ist.
Bakterielle Wirtszelle, die mit einem Vektor gemäß Anspruch 19 oder 20 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, welches das Transformieren einer Wirtszelle mit einer DNA-Sequenz, die das Protein kodiert, Exprimieren der Sequenz und Isolieren des gewünschten Produkts umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15, welches das Vermischen des Proteins mit einem geeigneten Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder anderen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten umfaßt.