KR20010023193A - Ｈｐｖ에 대한 백신 - Google Patents

Ｈｐｖ에 대한 백신 Download PDF

Info

Publication number
KR20010023193A
KR20010023193A KR1020007001821A KR20007001821A KR20010023193A KR 20010023193 A KR20010023193 A KR 20010023193A KR 1020007001821 A KR1020007001821 A KR 1020007001821A KR 20007001821 A KR20007001821 A KR 20007001821A KR 20010023193 A KR20010023193 A KR 20010023193A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
plasmid
hpv
vaccine
cells
Prior art date
Application number
KR1020007001821A
Other languages
English (en)
Inventor
클라우딘 브룩
테레사 카베존실바
안네-마리 에바 페르난데 델리쎄
캐더린 마리 기슬라인 제라드
안젤라 롬바르도-벤체이크
Original Assignee
장 스테판느
스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 장 스테판느, 스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈 에스.에이. filed Critical 장 스테판느
Publication of KR20010023193A publication Critical patent/KR20010023193A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 HPV 항원에 대한 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 면역학적 융합 파트너에 결합된 사람 유두종 바이러스(HPV) 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 HPV 유도된 병변을 예방하거나 치료하는데 유용한 백신 제형을 제공한다.

Description

ＨＰＶ에 대한 백신 {VACCINE AGAINST HPV}
본 발명은 사람 유두종 유도된 종양을 치료하거나 예방하는데 유용한, T 헬퍼 에피토프를 제공하는 단백질 또는 이것의 일부와 사람 유두종 바이러스로부터의 항원을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HPV 스트레인 16 또는 18로부터의 E6 또는 E7 단백질을 헤모필루스 인플루엔자 B로부터의 단백질 D에 결합된 형태로 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
유두종바이러스는 고도로 종 특이적인 작은 네이키드(naked) DNA 종양 바이러스(7.9 kb, 2본쇄)이다. 70가지가 넘는 사람 유두종바이러스(HPV) 유전자형이 밝혀졌다. 유두종바이러스는 종의 기원(사람, 소과동물 등) 및 동일한 종으로부터의 그 밖의 유두종바이러스와의 유전적 관련 정도를 기준으로 하여 분류된다. HPV는 피부 또는 점막 표면에 대해 일반적으로 특이적이며, 비정상 조직 또는 종양 조직에서의 각각 희귀한 검출 및 보통의 검출을 기준으로 하여 "저(low)" 위험성 및 "고(high)" 위험성으로 대체로 분류된다. 저위험성 HPV는 수 개월 또는 수 년 동안 지속되는 양성 병변 (우종 또는 유두종)을 일반적으로 발생시킨다. 고위험성 HPV는 암과 관련이 있다. HPV 바이러스와 사람 암 사이의 가장 강력한 포지티브 관련성은 HPV 16 및 18과 경부암 사이에 존재하는 관련성이다. HPV 31과 HPV 33을 포함하여 10종이 넘는 다른 HPV 타입이 낮은 빈도이지만 경부암에서 또한 발견되었다.
성적으로 활발한 젊은 여성에서의 생식기 HPV 감염은 보편적이며, 대부분은 감염을 제거하거나, 병변이 발달하면, 이들 병변은 퇴화한다. 감염된 여성의 소수만이 고도의 상피내 종양으로 진행하며, 이들 중 일부만이 침입성암으로 더 진행한다.
HPV 감염에 이르게 되는 분자적 사건은 명확하게 정립되지 않았다. 사람 유두종바이러스를 증식시키는 적합한 생체외 시스템이 없었기 때문에, 바이러스 주기에 대한 최상의 정보로 발전되지 못했다.
현재, 다수의 타입의 HPV가 박테리아에서의 클로닝 시스템의 도움으로 및 보다 최근에는 PCR 증폭에 의해, 단리되고, 특징화되었다. HPV 게놈의 분자 조직은 잘 특징화된 소과동물 유두종바이러스 타입 1 (BPV1)의 분자 조직을 비교 기준으로 하여 규정되었다.
미미한 변화가 일어난다고 하더라도, 밝혀진 모든 HPV 게놈이 7개 이상의 초기 유전자인 E1 내지 E7와 2개의 후기 유전자인 L1 및 L2를 갖는다. 또한, 업스트림 조절 영역은 HPV 게놈의 대부분의 전사 사건을 조절하는 것으로 여겨지는 조절 서열을 함유한다.
E1 및 E2 유전자는 각각 바이러스 복제 및 전사 조절에 관여하며, 바이러스 조립에 의해 파괴되는 경향이 있다. E6 및 E7은 바이러스 형질전환에 관여한다. E5는 또한 이러한 프로세스에 관련되어 왔다.
경부암에 관여하는 HPV, 예를 들어 HPV 16 및 18의 경우, 온코진 프로세스는 바이러스 DNA의 조립 후에 개시된다. 조립되면 캡시드 단백질 L1 및 L2를 코딩하는 유전자가 불활성화되며, E2 리프레서 기능이 손실되면 E6/E7 오픈 리딩 프레임이 비조절되어, 2개의 초기 단백질 E6 및 E7이 계속 과발현 상태가 됨으로써, 정상적 세포 분화가 점차 사라지고, 암이 발달한다. E6 및 E7은 주요 종양 억제제 단백질인 p53 및 pRB(망막아세포종 유전자 생성물)를 각각 비활성화시킴으로써 정상적 세포 주기를 파괴시킨다.
경부암은 여성의 경우에 흔하며, 전암성 중간 단계를 거쳐, 자주 사망에 이르게 하는 침입성암으로 발전한다. 질병의 중간 단계는 상피내 종양으로서 공지되어 있으며, 심각도에 따라 I 내지 III으로 등급이 매겨진다 (CIN I-III).
임상적으로, 여성의 항문성기관의 HIV 감염은 경부 편평 콘딜로마로서 나타나며, 이것의 홀마크(hallmark)는 경부 편평 상피의 표면 및 중간 세포를 주로 침범하는 코일로시토시스(koilocytosis)이다.
바이러스의 세포병변효과의 결과인 코일로사이트(koilocyte)는 핵주위의 밝은 훈륜을 갖는 다핵세포로서 나타난다. 상피는 병변의 우종 외관의 원인이 되는 비정상적 각화에 의해 두꺼워진다.
HPV 16 또는 18 혈청형에 대해 포지티브인 경우에 이러한 편평 콘딜로마는 그 자체로 침입성 경부암의 전구체 병변으로서 간주되는 경부 상피내 종양(CIN) 및 원위치암(carcinoma in situ, CIS)으로의 발전에 대한 고위험성 인자이다.
온코진 HPV 감염의 발달 경로는 하기 3가지 연속 단계를 나타낸다:
(1) 잠복 감염 단계,
(2) 코일로사이트의 발생에 상응하는, 온전한 비리온의 생성물에 의한 핵내 바이러스 복제의 단계. 이 단계에서, HPV는 E2, E5, E6, E7, L1 및 L2를 포함하여 이것의 전범위의 단백질을 생성시킨다.
(3) 종양 형질전환을 개시시키고, 코일로사이트의 점진적 소실과 함께 CIN Ⅱ 및 CIN Ⅲ/CIS에 상응하는, 세포내 게놈으로의 바이러스 조립의 단계. 이 단계에서, E2의 발현은 하향 조절되고, E6 및 E7의 발현은 증가한다. CIN Ⅱ/Ⅲ과 CIN Ⅲ/경부암 사이에서, 바이러스 DNA는 기저 세포에서 에피솜으로 존재하다가 E6 및 E7 유전자(종양 세포)만의 조립으로 변한다. 모든 경부암의 85%는 HPV16 혈청형과 가장 우세하게 관련된 편평 세포암이다. 10% 및 5%는 각각 선암 및 아데노편평(adenosquamous) 세포암이며, 둘 모두의 타입은 HPV 18 혈청과 우세하게 관련되어 있다. 그럼에도 불구하고, 기타 온코진 HPV가 존재한다.
국제 특허 출원 WO 96/19496호에는 사람 유두종 바이러스 E6 및 E7 단백질의 변이체, 특히 E6 및 E7 단백질 둘 모두에서 결실이 일어난 E6/E7의 융합 단백질이 기재되어 있다. 이들 결실 융합 단백질은 면역원성인 것으로 여겨진다.
본 발명은 E6 또는 E7 또는 E6/E7 융합 단백질을, T 세포 에피토프를 갖는 면역학적 융합 파트너에 결합된 형태로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 형태에 있어서, 면역학적 융합 파트너는 헤모필루스 인플루엔자 B의 단백질 D로부터 유도된다. 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 단백질의 대략 최초 1/3, 특히 대략 최초 N 말단 100개 내지 110개 아미노산을 포함한다. 단백질 D는 지질화될 수 있다 (지단백질 D). 그 밖의 면역학적 융합 파트너로는 인플루엔자 바이러스로부터의 비구성 단백질인 NS1(헤마글루티닌)이 있다. 전형적으로, N 말단 81개 아미노산이 사용되지만, T 헬퍼 에피토프를 포함하는 한은 다른 단편이 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 면역학적 융합 파트너는 LYTA로서 공지된 단백질이다. 바람직하게는, 분자의 C 말단 부분이 사용된다. Lyta는 아미다아제 LYTA (펩티도글리칸 주쇄에 있는 특정 결합을 특이적으로 분해하는 자기분해제인 lytaA 젠(gen) {Gene, 43 (1986) page 265-272}에 의해 코딩됨)인 N-아세틸-L-알라닌 아미다아제를 합성하는 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유도된다. LYTA 단백질의 C 말단 도메인은 콜린 또는 몇몇 콜린 유사체, 예를 들어 DEAE에 대한 친화성의 원인이 된다. 이러한 특성은 융합 단백질을 발현시키는데 유용한 플라스미드를 발현시키는 대장균 C-LYTA을 개발하는데 이용되어 왔다. C-LYTA 단편을 아미노 말단에서 함유하는 하이브리드 단백질을 정제하는 방법은 문헌{Biotechnology: 10, (1992) page 795-798)에 기재되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 바람직한 구체예는 잔기 178에서 출발하여 C 말단에서 발견되는 Lyta 분자의 반복 부분을 이용한다. 특히 바람직한 형태는 잔기 188 내지 305를 포함한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 단백질 D - HPV 16으로부터의 E6, 단백질 D - HPV 16으로부터의 E7, 단백질 D - HPV 18로부터의 E7, 단백질 D - HPV 18로부터의 E6 및 단백질 D - HPV 16 및 18 둘 모두로부터의 E6E7을 제공한다. 단백질 D의 일부는 단백질 D의 최초 1/3을 포함한다. 그 밖의 E6 및 E7 단백질이 그 밖의 HPV 서브타입으로부터 이용될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
본 발명의 단백질은 대장균에서 발현되는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 단백질은 5개 내지 9개, 바람직하게는 6개의 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 테일과 함께 발현된다. 이들은 정제를 촉진시키는데 유리하다.
단백질 E7은 바람직한 구체예에서 rb 부위(망막아세포종 유전자 생성물)에 대한 결합을 감소시키고, 이로써 임의의 잠재적인 형질전환력을 제거하는, 변이를 함유한다. HPV 16 E7에 대한 바람직한 변이로는 Cys24가 글리신으로 치환되거나 글루탐산26이 글루타민으로 치환되는 것이 있다. 바람직한 구체예에 있어서, E7 단백질은 이들 변이 둘 모두를 함유한다.
HPV 18 E7에 대한 바람직한 변이로는 Cys27이 글리신으로 치환되고/되거나 글루탐산29이 글루타민으로 치환되는 것이 있다. 반복하여, 둘 모두의 변이가 존재하는 것이 바람직하다.
단일 또는 이중 변이가 E6의 p53 영역으로 또한 도입되어, 임의의 잠재적 형질전환력이 제거될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 면역학적 융합 파트너에 결합된 HPV로부터의 E6E7 융합 단백질이 제공된다. 바람직한 면역학적 융합 파트너는 단백질 D, 더욱 바람직하게는 단백질 D의 최초 1/3 이다.
본 발명은 본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA를 또한 제공한다. 이러한 서열은 적합한 발현 벡터내로 삽입되어, 적합한 숙주에서 발현될 수 있다.
본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA 서열은 표준 DNA 합성 기법, 예를 들어 효소 연결 [참조: D.M. Roberts et al. in Biochemistry 1985, 24, 5090-5098], 화학 합성, 생체외 효소 중합 또는 예를 들어 열안정성 중합효소를 사용하는 PCR 기술, 또는 이들 기법을 조합한 방법에 의해 합성될 수 있다.
DNA 효소 중합은 DNA 중합효소 I (클레노우 단편)과 같은 DNA 중합효소를 사용하여, 필수적인 누클레오시드 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 함유하는 적합한 완충액 중에서, 10 내지 37℃에서, 일반적으로 50㎕ 이하의 부피로 생체외에서 수행될 수 있다. DNA의 효소 연결은 T4 DNA와 같은 DNA 리가아제를 사용하여, 0.01M MgCl2, 0.01M 디티오트레이톨, 1mM 스퍼미딘, 1mM ATP 및 0.1㎎/㎖ 우혈청 알부민이 함유된 0.05M Tris(pH 7.4)와 같은 적합한 완충액 중에서, 4℃ 내지 주위 온도에서, 일반적으로 50㎖ 이하의 부피로 수행될 수 있다. DNA 중합체 또는 단편의 화학 합성은, 문헌[Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual (ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982)] 또는 그 밖의 학술 문헌[M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, and R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sroat, and W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 21, 719; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1981, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, and H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; and H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801]에 기재된 기법과 같은 고체상 기법을 사용하여, 통상적인 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포라미디트 화학에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌[Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989]에 기재된 바와 같은 통상적인 재조합 기법에 의해 수행될 수 있다.
특히, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:
i) 숙주 세포에서 단백질 또는 이것의 면역원성 유도체를 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 DNA 중합체를 발현시킬 수 있는 복제성 또는 삽입성 발현 벡터를 제조하는 단계;
ii) 숙주 세포를 상기 벡터로 형질전환시키는 단계;
iii) 상기 형질전환된 숙주 세포를, 상기 DNA 중합체가 상기 단백질을 생성시키게 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
iv) 상기 단백질을 회수하는 단계.
본원에 사용된 '형질전환'이란 용어는 외래 DNA를 숙주 세포에 도입시키는 것을 의미한다. 이것은 예를 들어 문헌[Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman and A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988]에 기재된 통상적인 기법을 사용하여 적합한 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 형질전환, 트랜스펙션 또는 인펙션시킴으로써 달성될 수 있다. '형질전환된' 또는 '형질전환체'란 용어는 이하에서 목적하는 외래 유전자를 함유하고 발현시키는 생성된 숙주 세포에 대해 사용될 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 항원은 대장균에서 발현된다. 발현 방법은 E7, E6 또는 E6/E7 융합체를, T 세포 헬퍼 에피토프를 제공하는 면역학적 융합 파트너인 헤모필루스 인플루엔자 B로부터의 단백질 D의 1/3 N 말단 부분에 융합시키는 것을 포함한다. 친화성 폴리히스티딘 테일은 융합 단백질의 카르복시 말단에서 공학처리되어 간단한 정제를 가능하게 한다. 이러한 재조합 항원은 대장균에서 불용성 단백질로서 과발현된다.
바람직하게는, 본 발명의 단백질은 트랜스 형태의 티오레독신(TIT)와 함꼐 동시발현된다. 트랜스 형태의 티오레독신 대 시스 형태의 티오레독신의 동시 발현은 항원을 프로테아제에 대한 필요없이 티오레독신이 없게 유지하기 위해 바람직하다. 티오레독신 동시발현은 본 발명의 단백질의 가용화를 용이하게 한다. 티오레독신 동시발현은 단백질 정제 수율, 정제된 단백질 용해도 및 질에 대해 또한 현저한 영향을 미친다.
발현 벡터는 신규하며, 또한 본 발명의 일부를 구성한다.
복제성 발현 벡터는, 본 발명에 따라, 숙주 세포와 양립가능한 벡터를 분해하여 온전한 레플리콘을 갖는 선형 DNA 세그먼트를 제공하고, 상기 선형 세그먼트를, 상기 선형 세그먼트와 함께 원하는 단백질, 예를 들어 본 발명의 단백질 또는 이것의 유도체를 연결 조건 하에 코드화하는 DNA 중합체를 코드화하는 하나 이상의 DNA 분자와 결합시킴으로써 제조될 수 있다.
따라서, DNA 중합체는 미리 형성되거나, 원하는 벡터를 구성하는 동안에 형성될 수 있다.
벡터의 선택은 원핵세포 또는 진핵세포, 바람직하게는 대장균일 수 있는 숙주 세포에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 적합한 벡터로는 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드 및 재조합 바이러스가 있다.
복제성 발현 벡터의 제조는 DNA의 제한, 중합 및 연결을 위한 적합한 효소를 사용하여, 예를 들어 상기 인용된 마니아티스 등의 문헌에 기재된 방법에 의해 통상적으로 수행될 수 있다.
재조합 숙주 세포는 본 발명에 따라, 숙주 세포를 형절전환 조건 하에 본 발명의 복제성 발현 벡터로 형질전환시킴으로써 제조된다. 적합한 형질전환 조건은 통상 사용되는 조건이며, 예를 들어 상기 인용된 마니아티스 등의 문헌 또는 문헌[DNA Cloning, Vol.Ⅱ, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985]에 기재되어 있다.
형질전환 조건의 선택은 숙주 세포에 의해 결정된다. 따라서, 대장균과 같은 박테리아 숙주를 CaCl2로 처리하거나(참조: Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110), RbC1, MnCl2, 칼륨 아세테이트 및 글리세롤의 혼합물을 포함하는 용액으로 처리한 후, 3-[N-모르폴리노]-프로판-술폰산, RbC1 및 글리세롤로 처리할 수 있다. 배양 중인 포유동물 세포는 벡터 DNA를 세포 상에 칼슘 공침시킴으로써 형질전환시킬 수 있다. 본 발명은 본 발명의 복제성 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포까지 또한 미친다.
형질전환된 숙주 세포를 DNA 중합체가 발현되게 하는 조건 하에 배양하는 것은, 예를 들어, 상기 인용된 마니아티스 등의 문헌 및 "DNA Cloning"에 기재된 바와 같이 통상적으로 수행된다. 따라서, 바람직하게는, 세포는 영양분을 공급받고, 50℃ 미만의 온도에서 배양된다.
생성물은 숙주 세포에 따라 통상적인 방법에 의해 회수된다. 따라서, 숙주 세포가 대장균과 같은 박테리아인 경우, 숙주 세포는 물리적, 화학적 또는 효소적으로 용해될 수 있고, 단백질 생성물은 생성된 용해물로부터 단리될 수 있다. 숙주 세포가 포유동물인 경우, 생성물은 영양 배지 또는 세포 비함유 추출물로부터 일반적으로 단리될 수 있다. 통상적인 단백질 단리 기법으로는 선택 침전, 흡착 크로마토그래피 및 모노클로날 항체 친화성 칼럼을 포함하는 친화성 크로마토그래피가 있다.
본 발명의 단백질이 히스티딘 테일(His tag)과 함께 발현되는 경우, 단백질은 이온 금속 친화성 크로마토그래피 칼럼(IMAC) 칼럼을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 용이하게 정제될 수 있다.
Q-세파로오스와 같은 제 2의 크로마토그래피 단계가 IMAC 칼럼 전 또는 후에 사용되어, 고도로 정제된 단백질을 생성시킬 수 있다. 면역학적 융합 파트너가 C-LYTA인 경우, 이러한 생성물을 정제시키기 위해 콜린 및/또는 DEAE에 대한 CLYTA의 친화성을 이용할 수 있다. C-LYTA 및 his 태그 둘 모두를 함유하는 생성물은 부분적 친화성 크로마토그래피를 포함하는 2단계 방법으로 용이하고 효율적으로 정제될 수 있다. 1가지 단계는 IMAC 칼럼에 대한 His 태그의 친화성을 포함하고, 나머지 단계는 콜린 또는 DEAE에 대한 LYTA의 C 말단 도메인의 친화성을 포함한다.
C-LYTA 및 히스티딘 태그 둘 모두를 포함하는 단백질은 신규하며, 이로써, 본 발명의 한 가지 일면을 구성한다. 이들은 간단한 2단계 부분적 친화성 방법에 의해 고수준으로 정제될 수 있다 (80% 보다 높고, 바람직하게는 90% 보다 높은 수준).
본 발명의 단백질은 SDS PAGE로 가시화시킨 경우 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 순도로 제공된다. 단백질은 환원 조건 하에 SDS PAGE에 의해 분석한 경우 주요 단일 밴드를 나타내며, 웨스턴 블롯 분석하면 5% 미만의 숙주 세포 단백질 오염을 나타낸다.
본 발명은 본 발명의 단백질을 약제학적으로 허용되는 부형제에 함유된 형태로 포함하는 약제 조성물을 또한 제공한다. 바람직한 백신 조성물은 적어도 단백질 D - HPV 16으로부터의 E6 또는 이것의 유도체를 단백질 D - HPV 16으로부터의 E7과 함께 포함한다. 또한, E6 및 E7은 하나의 분자, 바람직하게는 단백질 D E6/E7 융합체의 형태로 제공될 수 있다. 이러한 백신은 HPV 18로부터의 E6, E7 또는 둘 모두를, 바람직하게는 단백질 D - E6 또는 단백질 D - E7 융합 단백질 또는 단백질 D E6/E7 융합 단백질의 형태로 임의로 함유할 수 있다. 본 발명의 백신은 HPV 16 또는 18로부터의 그 밖의 HPV 항원을 함유할 수 있다. 특히, 백신은 L1 또는 L2 항원 단량체를 함유할 수 있다. 또한, 이러한 L1 또는 L2 항원은 바이러스류 입자로서 함께 제공될 수 있거나 L1 단백질만이 바이러스류 입자 또는 캡소머 구성물로서 제공될 수 있다. 이러한 항원, 바이러스류 입자 및 캡소머는 당 분야에 공지되어 있다 [참조: WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 ＆ WO93/02184]. 추가의 초기 단백질로는 E2 또는 바람직하게는 E5가 있을 수 있다. 본 발명의 백신은 그 밖의 HPV 스트레인, 바람직하게는 스트레인 HPV 6 11, HPV 31 또는 33으로부터의 항원을 추가로 포함할 수 있다.
백신 제제는 문헌[Vaccine Design - The subunit and adjuvant approach (Ed. Powell and Newman) Pharmaceutical Biotechnology Vol. 6 Plenum Press 1995]에 일반적으로 기재되어 있다. 리포솜 내에 캡슐화시키는 방법은 풀러톤(Fullerton)의 미국 특허 제 4,235,877호에 기재되어 있다.
본 발명의 단백질은 본 발명의 백신 제형에 보조제로 사용되는 것이 바람직하다. 적합한 보조제로는 알루미늄염, 예를 들어 알루미늄 히드록시드 겔 (명반) 또는 알루미늄 포스페이트가 있지만, 또한 칼륨, 철 또는 아연의 염일 수 있거나 아실화된 티로신 또는 아실화된 당, 양이온 또는 음이온 유도체화된 폴리사카라이드 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수 있다.
본 발명의 제형에 있어서, 보조제 조성물이 우선적 TH1 반응을 유도시키는 것이 비람직하다. 적합한 보조제 시스템으로는 예를 들어 모노포스포릴 리피드 A, 바람직하게는 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A (3D-MPL)와 알루미늄염의 조합물이 있다.
강화된 시스템은 모노포스포릴 리피드 A 및 사포닌 유도체의 조합물, 바람직하게는 WO 94/00153호에 기재된 QS21 및 3S-MPL의 조합물, 또는 QS21이 WO 96/33739호 기재된 바와 같이 콜레스테롤로 켄칭되는(quenched) 경우에는 덜 반응원성인 조성물이 있다.
QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 수중유 에멀션 형태로 포함하는 특히 효능있는 보조제 제형이 WO 95/17210호에 기재되어 있으며, 바람직한 제형이다.
따라서, 본 발명의 한 가지 구체예에 있어서, 모노포스포릴 리피드 A 또는 이것의 유도체가 보조제로 함유된 단백질 D (또는 이것의 유도체) - E6 또는 단백질 D (또는 이것의 유도체) - E7를 포함하는 백신이 제공된다.
바람직하게는 백신은 사포닌, 더욱 바람직하게는 QS21를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 제형은 수중유 에멀션 및 토코페롤을 추가로 포함한다. 본 발명은 본 발명의 단백질을 3D-MPL과 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 혼합시키는 것을 포함하여 백신 제형을 제조하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 추가로 설명될 것이다.
실시예 I: 융합 단백질-D1/3-E7-His (HPV16)을 발현시키는 대장균 스트레인의 구성
1) - 발현 플라스미드의 구성
a) - 플라스미드 pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589)는 인플루엔자로부터의 NS1 코딩 영역의 코돈 4 내지 81이 생물형 2인 헤모필루스 인플루엔자 스트레인 772 (참조: H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. p. 119-125)의 성숙 단백질 D의 잔기 Ser20 → Thr127에 상응하는 코돈에 의해 치환된 pMG81(WO97/01640호로서 공개된 영국 특허 출원 제 951 3261.9호에 기재되어 있음)의 유도체이다. Prot-D1/3의 서열은 다중 클로닝 부위(11개 잔기) 및 C 말단 히스티딘 테일(6 His)에 대한 코딩 영역 다음에 위치한다. 이러한 플라스미드는 융합 단백질 D1/3-E7-His를 발현시키기 위해 사용된다.
b) - HPV 게놈 E6 및 E7 서열 타입 HPV 16 (참조: Dorf et al., Virology 1985, 145, p. 181-185)을 pBR322 (입수처: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg)에서 클로닝된 HPV 16 온길이 게놈으로부터 증폭시키고, pUC19 내에 서브클로닝시켜서, TCA 301 (= pRIT14462)를 수득하였다.
플라스미드 TCA 308 (= pRIT14501)의 구성: 융합 단백질-D1/3-E7-His를 발현시키는 플라스미드
E7 단백질의 아미노산 1→98에 상응하는 누클레오티드 서열을 pRIT14462로부터 증폭시켰다. 중합효소 연쇄 반응 동안에, NcoI 및 SpeI 제한 부위를 E7 서열의 5' 및 3' 말단에 생성시켜서, 플라스미드 pMGMCS ProtD1/3의 동일한 부위에 삽입시킴으로써 플라스미드 TCA308(=pRIT14501)을 수득하였다. 삽입물을 시퀀싱하여, 중합효소 연쇄 반응 동안에 변형이 일어나지 않았음을 확인하였다. 융합 단백질-D1/3-E7-His (HPV 16)의 서열은 도 1에 도시되어 있다.
2)- AR58 스트레인의 형질전환
플라스미드 pRIT14501을 λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82-88) 내에 도입시켰다.
3) - 박테리아 스트레인의 증식 및 유도 - Prot-D1/3-E7-His의 발현
플라스미드 pRIT14501로 형질전환시킨 AR58의 세포를 30℃에서 카나마이신 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 중에서 증식시켰다. 증식의 로그기 동안에, 박테리아를 39℃로 시프팅시켜서, λ 리프레서를 불활성화시키고 단백질 D1/3-E7-His의 합성을 개시시켰다. 39℃에서의 인큐베이션을 4시간 동안 지속시켰다. 박테리아를 펠레트화시키고, -20℃에서 저장하였다.
실시예 Ⅱ: 융합 단백질 D1/3-E7-His (HPV16)의 특징화
동결된 세포를 해동시키고, PBS 완충액 10㎖ 중에서 재현탁시켰다. 세포를 20,000psi에서 프렌치(French) 압력 세포 프레스 SLM 아민코(Aminco)에서 분쇄시켰다 (3회 통과). 추출물을 4℃에서 30분간 16,000g로 원심분리시켰다.
상기한 바와 같이 추출물을 원심분리시킨 후, 상층액 및 펠레트의 분액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 펠레트 분획 내에 편재된 약 33kDa의 주요 밴드를 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, 토끼 폴리클로날 안티-단백질-D에 의해 및 접근가능한 히스티딘 테일을 검출하는 소 창자 알칼리 포스파타아제(Qiagen cat. no 34510)에 커플링된 Ni-NTA 컨쥬게이트에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 발현의 수준은 쿠마시 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 나타나는 바와 같이 전체 단백질의 약 5%를 나타낸다.
실시예 Ⅲ: 단백질-D1/3-E7-His (HPV16) 정제
단백질-D1/3-E7-His를 발현시키는 박테리아의 배양액 1ℓ를 4℃에서 30분간 11,300g로 원심분리시키고, 세포 펠레트를 -80℃로 방치시킨 후, 추가로 처리하였다. PBS 완충액 75㎖ 중에서 재현탁시킨 후, 대장균 세포를 20,000psi에서 프렌치 압력 세포 프레스(등록상표: SLM Aminco)에서 분쇄시켰다. 용해된 세포를 30분간 17,000g로 원심분리시켜서, 펠레트화시켰다. 단백질-D1/3-E7-His를 함유하는 펠레트를 2M NaCl, 50mM 포스페이트 pH 7.5 30㎖ 중에서 1회 세척한 후, 50mM 포스페이트 pH 7.5 중에서 2회 세척하였다. 단백질을, 펠레트를 실온에서 8M 우레아, 50mM 포스페이트 pH 7.5 30㎖ 중에서 2시간 인큐베이팅시킨 후 가용화시켰다. 세포 파편을 4℃에서 17,000g로 15분 원심분리시킴으로써 제거하였다. 단백질 정제를 실온에서 수행하고, 가용화된 단백질 15㎖를 8M 우레아, 50mM 포스페이트 pH 7.5 중에 예비평형시킨 Ni2+NTA (Qiagen) 수지 (Pharmacia column XK 16/20) 5㎖ 상에 1분 당 0.2㎖의 유속으로 적용시켰다. 칼럼을, 280nm에서의 흡광도가 기선에 도달할 때까지 동일한 완충액으로 세척하였다. 단백질을 8M 우레아, 50mM 포스페이트 pH 7.5 중의 0 내지 600mM 이미다졸 구배로 용리시켰다. 용리된 분획을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 쿠마시 블루 염색, 폴리클로날 안티 단백질 D 또는 모노클로날 안티 E7 항체에 의해 가시화된 ProtD1/3-E7-His는 약 32kD에서 주요 단일 밴드로서 나타나며, 95% 순도의 단백질인 것으로 평가되었다. 폴리클로날 안티 대장균 단백질 항체에 의해 밝혀진 대장균 오염물은 없었다.
우레아를 제거하기 위해, 1.33㎎/㎖의 정제된 항원 9㎖ (Bradford)를 실온에서 밤새 PBS 완충액 3ℓ에 대해 투석시킨 후, 새로운 PBS 완충액에 대해 4시간 투석시켰다. 우레아 비함유 단백질의 80%가 가용성 단백질로서 회수되었다. 오염성 내독소를 제거하기 위해, 투석된 단백질 6㎖를 4℃에서 3시간 동안 아피프렙(Affiprep) 폴리믹신 겔 (Biorad) 1㎖와 인큐베이팅시키면서 약하게 교반시켰다. 아피프렙 폴리믹신 수지 500㎕와의 두 번째 인큐베이션을 수행하여, 내독소 수준을 단백질 1㎍ 당 8.8 EU로 최소화시켰다. 0.22㎛ 필터 장치(Millex 0.22GV, Millipore) 상에서 멸균 여과시킨 후, 0.665㎎/㎖의 prot-D1/3-E7-His를 안정도에 대해 검정하였다. SDS PAGE 분석 결과, -20℃, 4℃, 실온 또는 37℃에서의 7일 인큐베이션 후 단백질의 전개는 없었다.
실시예 Ⅳ: 융합 단백질-D1/3-E6-his / HPV16을 발현시키는 대장균 스트레인의 구성
1. 발현 플라스미드의 구성
a) 플라스미드 pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589)는 인플루엔자로부터의 NS1 코딩 영역의 코돈 4 내지 81이 생물형 2인 헤모필루스 인플루엔자 스트레인 772 (참조: H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. p. 119-125)의 성숙 단백질 D의 잔기 Ser20 → Thr127에 상응하는 코돈에 의해 치환된 pMG81(WO97/01640호로서 공개된 영국 특허 출원 제 951 3261.9호에 기재되어 있음)의 유도체이다. Prot-D1/3의 서열은 다중 클로닝 부위(11개 잔기) 및 C 말단 히스티딘 테일(6 His)에 대한 코딩 영역 다음에 위치한다. 이러한 플라스미드는 융합 단백질 D1/3-E6-his를 발현시키기 위해 사용된다.
b) HPV 게놈 E6 및 E7 서열 타입 HPV16 (참조: Seedorf et al., Virology 1985, 145, p.181-185)를 pBR322(입수처: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg)에서 클로닝된 HPV 16 온길이 게놈으로부터 증폭시키고, pUC19 내에 서브클로닝시켜서, TCA 301 (= pRIT14462)를 수득하였다.
플라스미드 TCA 307 (=pRIT14497)의 구성: 융합 단백질-D1/3-E6-His/HPV16를 발현시키는 플라스미드
E6 단백질의 아미노산 1→151에 상응하는 누클레오티드 서열을 pRIT14462로부터 증폭시켰다. 중합효소 연쇄 반응 동안에, NcoI 및 SpeI 제한 부위를 E6 서열의 5' 및 3' 말단에 생성시켜서, 플라스미드 pMGMCS Prot D1/3의 동일한 부위 내로 삽입시킴으로써, 플라스미드 TCA307 (=pRIT14497)을 수득하였다 (도 2 참조). 삽입물을 시퀀싱하여, 중합효소 연쇄 반응 동안에 변형이 일어나지 않았음을 확인하였다. 융합 단백질-D1/3-E6-His에 대한 코딩 서열은 도 3에 도시되어 있다.
2. AR58 스트레인의 형질전환
플라스미드 pRIT14497을 λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82:88) 내에 도입시켰다.
3. 박테리아 스트레인의 증식 및 유도 - Prot-D1/3-E6-His의 발현
플라스미드 pRIT14497로 형질전환시킨 AR58의 세포를 30℃에서 카나마이신 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 중에서 증식시켰다. 증식의 로그기 동안에, 박테리아를 39℃로 시프팅시켜서, λ 리프레서를 불활성화시키고 단백질 D1/3-E6-his의 합성을 개시시켰다. 39℃에서의 인큐베이션을 4시간 동안 지속시켰다. 박테리아를 펠레트화시키고, -20℃에서 저장하였다.
4. 융합 단백질 D1/3-E6-his (HPV16)의 특징화
추출물의 제조
동결된 세포를 해동시키고, PBS 완충액 10㎖ 중에서 재현탁시켰다. 세포를 20,000psi에서 프렌치(French) 압력 세포 프레스 SLM 아민코에서 분쇄시켰다 (3회 통과). 추출물을 30분간 4℃에서 16,000g로 원심분리시켰다.
쿠마시 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 웨스턴 블롯 상에서의 분석
상기한 바와 같이 추출물을 원심분리시킨 후, 상층액 및 펠레트의 분액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
펠레트 분획 내에 편재된 약 32kDa의 주요 밴드를 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, 토끼 폴리클로날 안티-단백질-D에 의해 및 접근가능한 히스티딘 테일을 검출하는 소 창자 알칼리 포스파타아제(Qiagen cat. no 34510)에 커플링된 Ni-NTA 컨쥬게이트에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 발현의 수준은 전체 단백질의 약 5%를 나타낸다.
5. 티오레독신에 의한 동시발현
HPV18로부터의 prot D 1/3 E7 His의 발현(실시예 ⅩⅢ)에 대해 유사한 방식으로, 대장균 스트레인 AR58을 티오레독신 및 단백질 D 1/3 E7 His(HPV16)을 코드화하는 플라스미드로 형질전환시켰다.
실시예 Ⅴ: Prot D 1/3 E6 His (HPV 16)의 정제
HPV-16 ProtD1/3 E6 재조합 항원을 대장균(AR58)에서 발현시켰다. 발현 방법은 E6을, T 세포 헬퍼 에피토프를 제공하는 면역학적 융합 파트너인 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D의 1/3-N-말단 부분에 융합시키는 것을 포함하였다. 친화성 폴리히스티딘 테일을 융합 단백질의 카르복시 말단에 공학처리하였다. 재조합 항원을 대장균에서 불용성 단백질로서 과발현시켰다.
항원의 가용화에는 변성제가 필요하였다. 변성제의 부재하에, ProtD1/3-E6-His가 중성 pH에서 침전되었다. 용해도 문제를 방지하기 위해, 이들 단백질을 폴딩 파트너인 트랜스 형태의 티오레독신(TIT)과 동시발현시켰다.
박테리아 발현을 30℃에서의 카나마이신 0.05㎎/㎖ + 티오레독신이 동시발현되는 경우에는 암피실린 0.2㎎/㎖의 존재하에 LB 배지에서 수행하였다. 재조합 단백질 발현을, 세포를 세포 광학 밀도(OD600nm)가 0.4에 도달할 때에 42℃로 옮김으로써 열적으로 유도시켰다. 단백질 발현을 4시간 동안 유지시켰다. 정제를 하기 프로토콜에 따라 수행하였다.
세포 배양물 펠레트 60 OD
1mM 페파블록(pefabloc), 2M NaCl, PBS pH 7.4 (완충액 A)
프렌치 프레스 분쇄기 3회 통과
20,000 psi
원심분리 17,000g 30분, 4℃
펠레트 세척 2M NaCl, PBS pH 7.4 (완충액 B) x1
PBS pH 7.4 (완충액 C) x2
원심분리 17,000g 30분, 4℃
펠레트 가용화 6M 구아니딘 클로라이드, 20mM PO4, pH 7.0 (완충액 D) 4℃에서 밤새 수행
원심분리 17,000g 30분, 4℃
IMAC에서의 상층액 평형: 6M 구아니딘 클로라이드, 20mM PO4, pH 7.0 (완충액 D)
용리: 8M 우레아, 20mM PO4, pH 7.0 중에서의 이미다졸 단계 (0.025M, 0.1M, 0.5M)
아피프렙 폴리믹신 8M 우레아, 20mM PO4, pH 7.0 (완충액 E) 2시간 실온
투석 4M 우레아, 0.5M 아르기닌, 150mM NaCl, 10mM PO4, pH 6.8 (완충액 I)
2M 우레아, 0.5M 아르기닌, 150mM NaCl, 10mM PO4, pH 6.8 (완충액 J)
0M 우레아, 0.5M 아르기닌, 150mM NaCl, 10mM PO4, pH 6.8 (완충액 K)
세포를 프렌치 압력 세포 장치를 사용하여 고압 균질화시킴으로써 효율적으로 파괴시켰다. 항원을 고농도의 단백질 변성제를 사용하여 추출하였다. 이러한 제 1 단계 파괴에 의해 박테리아 세포벽이 개방되었고, 항원이 박테리아 불용성 분획으로부터 추출되었다. 하기 정제를 4ℓ 배양물에 대해 수행하였다.
완충액
A. PBS/ 2M NaCl/ 1mM 페파블록
B. PBS/ 2M NaCl
C. PBS: 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.1mM NaH2PO4, 1.47mM KH2PO4pH 7.4.
D. 6M 구아니디움 클로라이드, 20mM PO4(NaH2PO4(2 H2O)/ K2HPO4(3 H2O)) pH 7.0
출발 물질은 각각 배양액 400㎖의 10개의 플라스크였다.
세포 페이스트를, 프렌치 프레스 분쇄기(20,000psi)를 3회 통과시킴으로써 세포를 용해시키기 전에, 완충액 A(이 경우에는 완충액 A 240㎖) 중에서 60 OD600까지 현탁시켰다. 용해된 세포를 4℃에서 15,000g로 30분간 펠레트화시켰다. 재조합 단백질을 함유하는 박테리아 세포 펠레트를 완충액 B 240㎖로 1회 세척한 후, 완충액 C 240㎖로 2회 세척하였다.
Prot D E6-His(TIT)를 회전 바퀴 상에서 4℃에서 밤새 완충액 D 240㎖에 의해 가용화시켰다. 세포 파편을 4℃에서 15,000g로 30분간 펠레트화시켰다. 상층액(230㎖)을 -20℃에서 저장하였다. 그 후, 물질을 IMAC 크로마토그래피시켰다.
킬레이팅 리간드 NTA(니트릴로-트리-아세트산)을 아가로오스 지지체(Qiagen)에 부착시켰다. NTA 리간드를, 니켈의 6개 배위 자리 중의 4개를 통해 상호작용하는 니켈 금속 이온으로 충전시켰다. 니켈의 2개의 나머지 배위 자리는 6xHis-태그된 단백질의 히스티딘 잔기와 강력하게 상호작용한다. 용리를, Ni-NTA에 결합하고 태그된 항원을 치환하는 이미다졸과 경합시킴으로써 달성하였다.
Ni-NTA 아가로오스 (Qiagen, catalogue number: 30 250)을 사용하였다.
용액
D: 6M 구아니디움 클로라이드, 20mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O)), pH 7.0
E: 8M 우레아, 20mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O)), pH 7.0
F: E + 0.025M 이미다졸
G: E + 0.1M 이미다졸
H: E + 0.5M 이미다졸
0.5M NaOH
탈이온수
0.02% NaN3
정제
a) 수지(수지 15㎖ / 샘플 230㎖)를 팩킹시키고, 완충액 D의 10 칼럼 부피(C.V.)로 1시간 당 15cm로 평형시킨다.
b) 가용화된 분획으로부터의 상층액을 칼럼 상에 1시간 당 15cm로 주입시킨다.
c) 칼럼을, OD 280nm가 기선으로 복귀할 때까지 완충액 D로 1시간 당 15cm로 세척시킨다.
d) 칼럼을 완충액 E 2CV로 1시간 당 15cm로 세척시킨다. 세척 분획을 회수한다.
e) 칼럼을 완충액 F 5CV로 최초 용리시킨다. 25kD 주요 오염물을 제거시킨다.
f) 그 후, 칼럼을 완충액 G 2CV로 용리시킨다.
g) 칼럼을 완충액 H 3CV로 최종 용리시킨다. 항원이 용리된다. 항원 포지티브 분획을 풀링시킨다 (30㎖).
내독소는 아피프렙 크로마토그래피에 의해 제거시킨다.
아피-프렙[등록상표: Affi-Prep] 폴리믹신 지지체는 아피-프렙 매트릭스에 커플링된 USP 그레이드(Grade) 폴리믹신 B로 구성된다. 내독소의 리피드 A 부분에 대한 고친화성으로 인해, 폴리믹신 B는 높은 용량 및 선택도로 내독소 분자와 결합한다.
용액
E: 8M 우레아, 20mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O)), pH 7.0 (비발열성)
0.5M NaOH
탈이온된 비발열성 물
과정
1) 아피-프렙 폴리믹신 수지를 0.1M NaOH 10부피로 세척시킨 후, 발열원이 없는 물 10부피로 세척시킨다.
2) 수지를 완충액 E 10부피로 평형시킨다.
3) IMAC 용리된 샘플 15㎖(하프-풀(half-pool))를 배치 모드로 아피-프렙 폴리믹신 수지 3㎖와 인큐베이팅시킨다.
4) 인큐베이션을 실온에서 4시간 지속시키거나, 4℃에서 회전 바퀴 상에서 밤새 지속시킨다.
5) 샘플을 2000g로 10분간 원심분리시킨다 (Beckman GS-6R).
6) 항원을 함유하는 상층액을 수집하고, 내독소 및 단백질 검정을 수행한다.
7) 수지를 버린다.
작은 분자는 반투과막을 통해 확산되지만, 거대 분자는 남아있게 된다. 투석 작용은 막의 양면 상에 있는 용질의 농도차에 의해 유도된다. 새로운 완충 용액을, 양면 상에 있는 완충 조성물이 균등해질 때까지 도입시킨다.
완충액
I: 4M 우레아, 0.5M 아르기닌, 0.15M NaCl, 10mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O)) pH 6.8
J: 2M 우레아, 0.5M 아르기닌, 0.15M NaCl, 10mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O)) pH 6.8
K: 0M 우레아, 0.5M 아르기닌, 0.15M NaCl, 10mM PO4(NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O)) pH 6.8
1) 샘플(15㎖)를 투석 튜브(직경 20.4㎜, 높이 6㎝) 내에 도입시킨다.
2) 투석 튜브를 완충액 I를 함유하는 2ℓ 들이 실린더 내에서 교반 하에 4℃에서 2시간 동안 방치시킨다.
3) 투석 튜브를 완충액 J를 함유하는 2ℓ 들이 실린더 내에서 4℃에서 2시간 동안 방치시킨다 (교반 하에).
4) 투석 튜브를 완충액 K를 함유하는 2ℓ 들이 실린더 내에서 4℃에서 밤새 방치시킨다 (교반 하에). 완충액을 교환하고, 투석을 4℃에서 2시간 더 지속시킨다.
밀리포어 스테릴 밀렉스(Millipore Sterile Millex)-GV 0.22μ, 13㎜. 카탈로그 번호: SLGV0130S.
모든 단계는 실온(RT, 약 22℃)에서 수행되며, 항원은 안정한 것으로 나타난다.
항원 용액을 0.2㎛ 필터를 통해 여과시켜서, 임의의 박테리아 증식을 방지한다. 항원을 넝크(Nunc) 바이알에 넣어 -20℃에서 저장하였다.
특징화:
단백질 D1/3 E6 His는 다음과 같이 특징화된다:
단백질D1/3-E6-His는 단백질 D 부분으로부터 유래한 112개 아미노산을 갖는 273개 아미노산 길이의 펩티드이다. 단백질D1/3-E6-His는 32kD의 이론적 분자량을 가지며, SDS-PAGE에서 33kD 단백질로서 이동한다. 단백질D1/3-E6-His의 이론적 등전점은 8.17이다.
바이러스 단백질 E6은 14개 시스테인 잔기를 함유하는 염기성 단백질이며, 이들 시스테인 중 8개(Cys 30,33,63,66 및 Cys 103,106,136,139)는 2개의 C 말단 아연 결합성 모티프에 관여한다.
단백질D1/3-E6-His는 대장균-AR 58 스트레인에서, 폴딩 파트너인 트랜스 형태의 티오레독신과 함께 불용성 단백질로서 발현된다. 세포 배양액은 400㎖ 들이 플라스크에서 생성된다.
95% 순도의 단백질 5.4㎎이 배양물 1ℓ 당 수득된다.
실시예 VI: 융합 단백질-D1/3-E6E7-his / HPV16을 발현시키는 대장균 스트레인의 구성
1. 발현 플라스미드의 구성
a) 플라스미드 pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589)는 인플루엔자로부터의 NS1 코딩 영역의 코돈 4 내지 81이 생물형 2인 헤모필루스 인플루엔자 스트레인 772 (참조: H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. p. 119-125)의 성숙 단백질 D의 잔기 Ser20 → Thr127에 상응하는 코돈에 의해 치환된 pMG81(WO97/01640호로서 공개된 영국 특허 출원 제 951 3261.9호에 기재되어 있음)의 유도체이다. Prot-D1/3의 서열은 다중 클로닝 부위(11개 잔기) 및 C 말단 히스티딘 테일(6 His)에 대한 코딩 영역 다음에 위치한다. 이러한 플라스미드는 융합 단백질 D1/3-E6E7-his를 발현시키기 위해 사용된다.
b) HPV 게놈 E6 및 E7 서열 타입 HPV 16 (참조: Seedorf et al., Virology 1985, 145, p. 181-185)을 pBR322 (입수처: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg)에서 클로닝된 HPV 16 온길이 게놈으로부터 증폭시키고, pUC19 내에 서브클로닝시켜서, TCA 301 (= pRIT14462)를 수득하였다.
c) TCA301(=pRIT14462) 중의 E6 및 E7에 대한 코딩 서열을, E6과 E7 유전자 사이에 5개의 누클레오티드 결실을 도입시켜서, E6의 정지 코돈을 제거하고, 플라스미드 TCA309(=pRIT14556) 중의 융합된 E6 및 E7 코딩 서열을 생성시키는 합성 올리고누클레오티드 어댑터(Afl Ⅲ 및 Nsi I 부위 사이에 삽입됨)로 변형시켰다 (도 4 참조).
TCA 311(=pRIT14512)의 구성: 융합 단백질-D1/3-E6E7-His/HPV16을 발현시키는 플라스미드
융합된 E6E7 단백질의 아미노산 1→249에 상응하는 누클레오티드 서열을 pRIT14556으로부터 증폭시켰다. 중합효소 연쇄 반응 동안에, NcoI 및 SpeI 제한 부위를 E6E7 융합된 서열의 5' 및 3' 말단에 생성시켜서, 플라스미드 pMGMCS ProtD1/3의 동일한 부위에 삽입시킴으로써 플라스미드 TCA311(=pRIT14512)을 수득하였다 (도 5 참조). 삽입물을 시퀀싱하여, 중합효소 연쇄 반응 동안에 변형이 일어나지 않았음을 확인하였다. 융합 단백질-D1/3-His에 대한 코딩 서열은 도 6에 도시되어 있다.
2. AR58 스트레인의 형질전환
플라스미드 pRIT14512를 λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82-88) 내에 도입시켰다.
3. 박테리아 스트레인의 증식 및 유도 - Prot-D1/3-E6E7-His의 발현
플라스미드 pRIT14512로 형질전환시킨 AR58의 세포를 30℃에서 카나마이신 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 중에서 증식시켰다. 증식의 로그기 동안에, 박테리아를 39℃로 시프팅시켜서, λ 리프레서를 불활성화시키고 단백질 D1/3-E6E7-his의 합성을 개시시켰다. 39℃에서의 인큐베이션을 4시간 동안 지속시켰다. 박테리아를 펠레트화시키고, -20℃에서 저장하였다.
4. 융합 단백질 D1/3-E6E7-his의 특징화
동결된 세포를 해동시키고, PBS 완충액 10㎖ 중에서 재현탁시켰다. 세포를 20,000psi에서 프렌치 압력 세포 프레스 SLM 아민코(Aminco)에서 분쇄시켰다 (3회 통과). 추출물을 30분간 4℃에서 16,000g로 원심분리시켰다.
상기한 바와 같이 추출물을 원심분리시킨 후, 상층액 및 펠레트의 분액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
펠레트 분획 내에 편재된 약 48kDa의 주요 밴드를 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, 토끼 폴리클로날 안티-단백질-D에 의해 및 접근가능한 히스티딘 테일을 검출하는 소 창자 알칼리 포스파타아제(Qiagen cat. no 34510)에 커플링된 Ni-NTA 컨쥬게이트에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 발현의 수준은 전체 단백질의 약 1%를 나타낸다.
실시예: VIb
유사한 방식으로, Lipo D 1/3 및 HPV16으로부터의 E6-E7의 융합 단백질을 티오레독신의 존재 하에 대장균에서 발현시켰다. pre-단백질(388aa)의 N 말단은 MDP 잔기에 이어, 생체내에서 분해되어 성숙한 단백질(370aa)을 제공하는 지단백질 D(헤모필루스 인플루엔자로부터 유래됨)의 신호 펩티드의 16개 아미노산을 함유한다. 지단백질(aa 1 내지 127) 다음에는 융합된 형태의 단백질 E6 및 E7이 위치한다. 단백질의 C 말단은 TSGHHHHHH에 의해 연장된다.
단백질을 하기 프로토콜에 의해 정제시켰다.
실시예 Ⅶ: 지단백질 D1/3-E6-E7-His (TIT) 정제
A) 가용화
세포 페이스트를, 프렌치 프레스 분쇄기(20,000psi)를 3회 통과시킴으로써 세포를 용해시키기 전에, 프로테아제 억제제로서의 1mM 페파블록의 존재 하에, 2M NaCl, 20mM 포스페이트 (NaH2PO4/K2HPO4) pH 7.5로 60 OD600까지 현탁시켰다. 용해된 세포를 4℃에서 15,000g로 30분간 펠레트화시켰다. 내독소 수준을 저하시키기 위해, 재조합 단백질을 함유하는 박테리아 세포 펠레트를 4M 우레아, 2M NaCl, 20mM 포스페이트 pH 7.5로 2회 세척하고, 2% 엠피겐(Empigen) BB, 20mM 포스페이트 pH 7.5로 1회 세척한 후, 20mM 포스페이트 완충액 pH 7.0으로 최종 2회 세척하여, 미량의 세정제를 제거하였다 (각각의 세척은 세포 현탁액에 대해 사용된 부피와 동일한 부피로 수행됨). LipoProt.D1/3-E6-E7-His (TIT)를 0.2M β메르캅토에탄올(=βMeOH), 20mM PO4pH 12 중의 8M 우레아로 4℃에서 밤새 용해시킨 후(세포 현탁액에 사용된 부피와 동일한 부피로), 동일한 완충액에 대해 실온에서 2시간 인큐베이팅시켰다. 세포 파편을 4℃에서 15,000g로 30분간 펠레트화시켰다. 상층액을 -20℃에서 저장하였다.
B) 정제
1) Q-세파로오스 패스트 플로우에서의 음이온 교환 크로마토그래피
동결된 샘플 225㎖를 냉수욕 중에서 실온에서 해동시키고, 8M 우레아, 0.2M βMEOH, 20mM PO4pH 12 (수지 30㎖ / 상층액 225㎖) 중에서 45cm/h로 예비평형시킨 Q-세파로오스 패스트 플로우 칼럼 (Pharmacia, XK 26/20) 상에 적용시켰다. 칼럼을, OD 280nm가 기선에 도달할 때까지 8M 우레아, 0.2M βMEOH, 20mM PO4pH 12로 세척한 후, 8M 우레아, 20mM 포스페이트 pH 12로 세척하였다 (2 칼럼 부피로). 용리를 8M 우레아, 20mM 포스페이트 pH 12 중에서 45cm/h로 NaCl 단계(0.1M, 0.25M, 0.5M NaCl, 각각의 단계는 약 2 칼럼 부피로 수행됨)에 의해 수행하였다. 0.5M NaCl 용리된 분획을 풀링시켰다.
2) 이온 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC)
Q 세파로오스 단계로부터의 0.5M NaCl 용리된 분획을 풀링시키고, 0.2M NaCl, 8M 우레아, 20mM 포스페이트 pH 10에 대해 투석시킨 후, 8M 우레아, 20mM PO4pH 12 (수지 30㎖ / 샘플 61㎖) 중에서 5.6cm/h로 예비평형시킨 Ni2+NTA(Qiagen) 칼럼(XK 26/20, Pharmacia) 상에 로딩시켰다. 칼럼을, 기선에 도달할 때까지 8M 우레아, 20mM PO4pH 12로 세척시킨 후, 8M 우레아, 20mM PO4pH 10으로 세척시켰다. 항원을 8M 우레아, 20mM PO4pH 10 중에서 45cm/h로 이미다졸 단계(0.025M, 0.05M, 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.5M 이미다졸, 각각의 단계는 2 칼럼 부피로 수행됨)에 의해 용리시켰다. 0.05M 이미다졸 용리된 분획을 풀링시켰다.
C) 농축
Imac 샘플을 실온에서 AMICON으로부터의 교반된 셀 중에서 5kDa 필트론 오메가(Filtron Omega) 막 상에서 약 5배 농축시켰다 (0.407㎎/㎖까지).
D) 투석
농축된 샘플을 0.5M 아르기닌, 150mM NaCl, 10mM PO4pH 6.8 중에서 점강 우레아 농도 단계(4M, 2M 우레아)에 대해 실온에서 투석시켰다. 최종 투석을 0.5M 아르기닌, 150mM NaCl, 10mM PO4pH 6.8에 대해 4℃에서 수행하였다.
결과:
IMAC 단계는 0.025M 이미다졸에서 32kD 오염물을 제거할 수 있었으며, 또한 몇몇 항원을 용리시켰다. 0.05M 이미다졸 용리된 항원은 SDS-PAGE의 쿠마시 블루 염색에 의해 90% 순도인 것으로 평가되었다. 이들 두 정제 단계 후에, 샘플은 대장균 오염물이 없었다. 특정 항원-N 및/또는 C 말단 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅 분석 결과, 온길이 단백질 보다 높거나 낮은 분자량을 갖는 불균일 패턴이 나타났다. 이러한 패턴은 온길이 단백질과 동시정제된 응집물 및 불완전 프로세싱된 단백질 및/또는 분해된 단백질이 존재함을 제시한다.
실시예 Ⅷ: 변이된 (cys24→gly, glu26→gln) 융합 ProtD1/3-E7 타입 HPV16을 발현시키는 대장균 스트레인 B1002의 구성
1) 발현 플라스미드의 구성
출발 물질:
a)- 융합 ProtD1/3-E7-His를 코딩하는 플라스미드 pRIT 14501 (= TCA 308)
b)- pUC 유도된 클로닝 벡터인 플라스미드 LITMUS 28 (New England Biolabs cat no 306-28)
c)- 인플루엔자로부터의 NS1 코딩 영역의 코돈 4 내지 81이 생물형 2인 헤모필루스 인플루엔자 스트레인 772 (참조: H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. p. 119-125)의 성숙 단백질 D의 잔기 Ser20 → Thr127에 상응하는 코돈에 의해 치환된 pMG81(상기 참조)의 유도체인, 플라스미드 pMG MCS prot D1/3 (=pRIT 14589). Prot-D1/3의 서열은 다중 클로닝 부위(11개 잔기) 및 C 말단 히스티딘 테일(6 His)에 대한 코딩 영역 다음에 위치한다.
pRIT 14733(=TCA347)의 구성: His 테일을 갖는 변이된(cys24→gly, glu26→gln) 융합 단백질-D1/3-E7을 발현시키는 플라스미드
His 테일에 의해 연장된, HPV16으로부터의 E7 유전자의 코딩 서열을 함유하는 NcoI-XbaI 단편을 변이유발에 유용한 중간 벡터인 Litmus 28에 서브클로닝시켜서, pRIT 14909 (= TCA337)을 수득하였다. 이중 변이 cys24→gly (참조: Edmonds and Vousden, J. Virology 63: 2650 (1989)) 및 glu26→gln (참조: Phelps et al, J. Virology 66: 2418-27 (1992))를 망막아세포종 유전자(pRB)의 안티온코진 생성물에 대한 결합을 손상시키도록 선택하였다. E7 유전자에서의 변이의 도입을 키트 [Quick Change Site directed Mutagenesis (Stratagene cat no 200518)]로 수행하여, 플라스미드 pRIT 14681 (= TCA343)을 수득하였다. 시퀀싱에 의해 변이의 존재 및 완전한 E7 유전자의 온전성을 확인한 후, 변이된 E7 유전자를 벡터 pRIT 14589 (= pMG MCS ProtD1/3) 내에 도입시켜서, 플라스미드 pRIT 14733 (= TCA347)을 수득하였다 (도 7).
변이된(cys24→gly, glu26→gln) 융합 단백질-D1/3-E7-His에 대한 서열은 도 8에 도시되어 있다.
2)- 변이된(cys24→gly, glu26→gln) 융합 단백질-D1/3-E7-His/HPV16을 발현시키는 스트레인 B1002의 구성
플라스미드 pRIT 14733을 λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82-88) 내에 도입시켜서, 카나마이신에 대해 내성인 형질전환체에 대한 선택에 의해 스트레인 B1002를 수득하였다.
3)- 박테리아 스트레인 B1002의 증식 및 유도 - 변이된(cys24→gly, glu26→gln) ProtD1/3-E7-His/HPV16의 발현
플라스미드 pRIT14773(B1002 스트레인)으로 형질전환시킨 AR58의 세포를 30℃에서 카나마이신 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 중에서 증식시켰다. 증식의 로그기 동안에, 박테리아를 39℃로 시프팅시켜서, λ 리프레서를 불활성화시키고 변이된 단백질 D1/3-E7-His/HPV16의 합성을 개시시켰다. 39℃에서의 인큐베이션을 4시간 동안 지속시켰다. 박테리아를 펠레트화시키고, -20℃에서 저장하였다.
4)- 융합 ProtD1/3-E7 mut(cys24→gly, glu26→gln)-His 타입 HPV16의 특징화
동결된 세포를 해동시키고, PBS 완충액 10㎖ 중에서 재현탁시켰다. 세포를 20,000psi에서 프렌치 압력 세포 프레스 SLM 아민코에서 분쇄시켰다 (3회 통과). 추출물을 30분간 4℃에서 16,000g로 원심분리시켰다.
상기한 바와 같이 추출물을 원심분리시킨 후, 상층액 및 펠레트의 분액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
펠레트 분획 내에 편재된 약 33kDa의 주요 밴드를 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, 토끼 폴리클로날 22 J 70 안티-단백질-D에 의해, Zymed로부터의 모노클로날 안티 E7/HPV6에 의해 및 접근가능한히스티딘 테일을 검출하는 소 창자 알칼리 포스파타아제(Qiagen cat. no 34510)에 커플링된 Ni-NTA 컨쥬게이트에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 발현의 수준은 전체 단백질의 약 3 내지 5%를 나타낸다.
B1002의 세포를 원심분리에 의해 배양 브로쓰로부터 분리시켰다. B1002의 농축된 세포를 -65℃에서 저장하였다.
실시예 IX: PROTD1/3E7 (Dmutant) HPV 16의 정제
일반적 정제 설계도 - HPV 16 E7
a) 세포 현탁액의 제조
B1002의 동결된 농축 세포를 해동시키고, +4℃에서 (표 1 참조) 세포 파괴 완충액 중에서 60의 최종 광학 밀도 OD(약 25g DCW L-1의 세포 농도에 상응함)까지 재현탁시켰다.
b) 세포 파괴
세포를 고압 균질기(Rannie)를 통해 1000바아에서 2회 통과시킴으로써 파괴시켰다. 파괴된 세포 현탁액을 4℃로 유지된 플라스크 내에 수집하였다.
세포 파괴 완충액: Na2HPO4(0.02N), NaCl(2M) pH는 HCl 3N(Merck)로 7.5로 조정됨
정제
2a) 동력학적 막 여과 (DMF-PALL FILTRON)
파괴된 세포 현탁액 2ℓ(OD 60)을 0.2㎛ 컷-오프(cut-off) 막이 탑재된 PALL로부터의 동력학적 여과 시스템인 DMF상에 로딩시켰다.
2ℓ에서 1ℓ로 농축시켜 샘플 PCC1을 수득하고,
엠피겐-EDTA 완충액(진한 EDTA 1.86g, 엠피겐(30%) 3.33㎖, PO4 3-0.5M 40.00㎖) 3부피(3ℓ)로 일정한 부피로 세척하여 샘플 PD1을 수득하고,
1ℓ를 300㎖로 농축시켜 샘플 PCC2를 수득하고,
엠피겐 완충액(ℓ당 농도: 엠피겐 30%, 3.33㎖, PO4 3-0.5M 40㎖) pH 7.5 10부피(3ℓ)로 일정한 부피로 세척하여 샘플을 수득하고,
구아니디딘 히드로클로라이드 8M 완충액(ℓ당 농도:Gu.HCl 764g; 엠피겐 30% 3.33㎖, PO4 3-0.5M 40㎖) pH 7.5 동일 부피(300㎖)를 첨가시킴으로써 단백질을 가용화시키고,
단백질의 회수: 삼투물 - 샘플 P3를 수거하고,
초기 부피(300㎖)로 농축시키고,
구아니딘 히드로클로라이드 4M 완충액(ℓ당 농도: Gu.HCl 328.12g, 엠피겐(30%) 3.33㎖ PO4 3-0.5M 40.00㎖) pH 7.5 3부피로 다이아필트레이션시킨다.
이들 모든 단계를 저온실(2 내지 8℃), 0.5M PO4 3-로 조정된 pH에서 수행하였다.
P3 분획을 다음 정제 단계까지 -20℃에서 저장하였다.
2b) Zn-킬레이팅 세파로오스 크로마토그래피
P3 분획을 해동시키고, 패킹시키고 평형시킨 Zn-킬레이팅 세파로오스 FF에 주입시켰다.
그 후, 칼럼을,
구아니딘 히드로클로라이드 4M 완충액(상기 참조) 약 3부피로 세척하고 - 샘플 Zn-FT,
우레아 4M 완충액(ℓ당 농도: 우레아 240.24g 엠피겐 3.33㎖ PO4 3-0.5M 40.00㎖) 약 5부피로 세척하고 - 샘플 Zn-W,
이미다졸의 ℓ당 농도가 34.04g인 것을 제외하고는 상기와 같은 우레아 4M-이미다졸 20mM 완충액(ℓ당 농도: 우레아 240.24g 엠피겐(30%) 3.33㎖ 이미다졸(1.36g) PO4 3-0.5M 40.00㎖ pH 7.5) 약 3부피로 상기와 같이 용리시키고 - 샘플 Zn-20,
우레아 4M-이미다졸 500mM로 UV 피크의 종료점까지 용리시키고 - 샘플 Zn-500,
칼럼을 EDTA 50mM 및 NaOH 0.5M로 세척시켰다. Zn 킬레이팅 세파로오스 용리액 (Zn-500)을 다음 정제 단계를 위해 2 내지 8℃에서 저장하였다.
Zn 킬레이팅 세파로오스 크로마토그래피를 실온에서 수행하였다.
2c) Q-세파로오스 크로마토그래피
Zn-500 분획을 패킹시키고 평형시킨 Q-세파로오스 FF에 주입시켰다.
그 후, 칼럼을,
우레아 4M 완충액(상기 참조) 약 7부피로 세척하고 - 샘플 QS-FT,
엠피겐이 없는 우레아 4M 완충액(ℓ당 농도: 우레아 240.24g PO4 3-0.5M 40.00㎖) 약 10부피로 세척하고 - 샘플 QS-W1,
엠피겐이 없는 우레아 6M 완충액(우레아 360.36g/ℓ) 약 10부피로 세척하고 - 샘플 QS-W2,
우레아 6M-NaCl 200mM 완충액(ℓ당 농도: 우레아 360.36g NaCl 11.69g, 40.00㎖ PO4 3-) 약 5부피로 용리시키고,
우레아 6M-NaCl 500mM 완충액 (NaCl이 29.22g/ℓ인 것을 제외하고는 상기와 같음) 약 3부피로 용리시켰다. 분획의 정확한 종료점을 UV 피크의 종료점에 의해 결정하였다 - QS-500
우레아 4M-NaCl 1M 완충액 (ℓ당 농도: 우레아 360.36, NaCl 58.44g 40.00㎖ PO4 3-)(0.5) 4부피로 용리시켰다 - 샘플 QS-1M
그 후, 칼럼을 NaOH 0.5M로 세척하였다.
QS-세파로오스 용리액(QS-500)을 다음 정제 단계까지 2 내지 8℃에서 저장하였다.
Q-세파로오스 크로마토그래피를 실온에서 수행하였다.
2d) 한외여과
그 후, QS-500 분획을 10kD 한외여과 유닛(Ultrasette - Pall Filtron)에서 처리하였다.
생성물을 단백질 약 1㎎/㎖까지 최초 농축시킨 후, 포스페이트 완충액 10부피에 대해 다이아필트레이팅시켰다.
삼투물(분획 UF-P)를 버리고, 리텐테이트(분획 UF-R)를 최종 여과때까지 2 내지 8℃에서 저장하였다.
한외여과를 2 내지 8℃에서 수행하였다.
2e) 최종 여과
최종 벌크(UF-R 분획)를 층류 및 무균실 클래스 100에서 0.22㎛ 멸균 필터(Millipak-Millipore)를 통해 여과시켰다. 최종 농도는 0.5 내지 1.0㎍/㎖ 였다. 멸균 벌크를 -20℃에서 저장하였다.
실시예 Ⅹ: 융합 clyta-E6-his (HPV16)을 발현시키는 대장균 스트레인의 구성
1. 발현 플라스미드의 구성
a)- 융합 ProtD1/3-E6-His/HPV16을 코딩하는 플라스미드 pRIT14497 (= TCA307)
b) 스트렙토코쿠스 뉴모니아의 LytA의 117 C 말단 코돈에 대한 코딩 서열을 함유하는 중간 벡터인 플라스미드 pRIT14661 (= DVA2). Lyta는 아미다아제 LYTA인 N-아세틸-L-알라닌 (펩티도글리칸 주쇄에 있는 특정 결합을 특이적으로 분해하는 자기분해제인 lytA 유전자{Gene, 43 (1986) pag 265-272}에 의해 코딩됨)을 합성시키는 스트렙토코쿠스 뉴모니아로부터 유도된다. LYTA 단백질의 C 말단 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 몇몇 콜린 유사체에 대한 친화성의 원인이 된다.
1.b pRIT14634 (= TCA332)의 구성: 융합 clyta-E6-His/HPV16을 발현시키는 플라스미드
a) 첫번째 단계에서는, 플라스미드 pRIT14497로부터 거대한 NcoI-AflII 제한 단편을 정제하고, pRIT14661로부터 작은 AflII-AflIII 제한 단편을 정제하였다.
b) 두번째 단계에서는, clyta 서열을 E7-His 서열에 결합시켜서(NcoI 및 AflII은 양립가능한 제한 부위임), pL 프로모터의 조절 하에 융합 단백질 clyta-E6-His를 코딩하는 플라스미드 pRIT 14634를 생성시켰다. (도 9 참조)
융합 단백질 clyta-E6-His에 대한 코딩 서열은 도 10에 도시되어 있다.
AR58 스트레인의 형질전환
플라스미드 pRIT114634를 λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82-88) 내에 도입시켰다.
박테리아 스트레인의 증식 및 유도 - clyta-E6-His의 발현
플라스미드 pRIT14634로 형질전환시킨 AR58의 세포를 30℃에서 카나마이신 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 중에서 증식시켰다. 증식의 로그기 동안에, 박테리아를 39℃로 시프팅시켜서, λ 리프레서를 불활성화시키고 단백질 clyta-E6-his의 합성을 개시시켰다. 39℃에서의 인큐베이션을 4시간 동안 지속시켰다. 박테리아를 펠레트화시키고, -20℃에서 저장하였다.
4. 융합 clyta-E6-his의 특징화
동결된 세포를 해동시키고, PBS 완충액 10㎖ 중에서 재현탁시켰다. 세포를 20,000psi에서 프렌치(French) 압력 세포 프레스 SLM 아민코(Aminco)에서 분쇄시켰다 (3회 통과). 추출물을 30분간 4℃에서 16,000g로 원심분리시켰다. 상기한 바와 같이 추출물을 원심분리시킨 후, 상층액 및 펠레트의 분액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
펠레트 분획 내에 편재된 약 33kDa의 주요 밴드를 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, 토끼 폴리클로날 안티-단백질-D에 의해 및 접근가능한 히스티딘 테일을 검출하는 소 창자 알칼리 포스파타아제(Qiagen cat. no 34510)에 커플링된 Ni-NTA 컨쥬게이트에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 발현의 수준은 전체 단백질의 약 3%를 나타낸다.
실시예 ⅩⅠ: 융합 clyta-E7-his(HPV16)을 발현시키는 대장균 스트레인의 구성
1. 발현 플라스미드의 구성
1.a 출발 물질
a) 융합 ProtD1/3-E7-His/HPV16을 코딩하는 플라스미드 pRIT14501 (= TCA308)
b) 스트렙토코쿠스 뉴모니아의 LytA의 117C 말단 코돈에 대한 코딩 서열을 함유하는 중간 벡터인 플라스미드 pRIT14661 (= DVA2).
1.b 플라스미드 pRIT14626 (= TCA330)의 구성: 융합 clyta-E7-His/HPV16을 발현시키는 플라스미드
a) 첫번째 단계에서는, 플라스미드 pRIT14501로부터 거대한 NcoI-AflII 제한 단편을 정제하고, pRIT14661로부터 작은 AflII-AflIII 제한 단편을 정제하였다.
b) 두번째 단계에서는, clyta 서열을 E7-His 서열에 결합시켜서(NcoI 및 AflII은 양립가능한 제한 부위임), pL 프로모터의 조절 하에 융합 단백질 clyta-E7-His를 코딩하는 플라스미드 pRIT 14626 (= TCA330)을 생성시켰다. (도 11 참조)
융합 단백질 clyta-E7-His에 대한 코딩 서열은 도 12에 도시되어 있다.
2. AR58 스트레인의 형질전환
플라스미드 pRIT114626을 λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82-88) 내에 도입시켰다.
3. 박테리아 스트레인의 증식 및 유도 - clyta-E7-His의 발현
플라스미드 pRIT14626으로 형질전환시킨 AR58의 세포를 30℃에서 카나마이신 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 중에서 증식시켰다. 증식의 로그기 동안에, 박테리아를 39℃로 시프팅시켜서, λ 리프레서를 불활성화시키고 단백질 clyta-E7-his의 합성을 개시시켰다. 39℃에서의 인큐베이션을 4시간 동안 지속시켰다. 박테리아를 펠레트화시키고, -20℃에서 저장하였다.
4. 융합 clyta-E7-his의 특징화
동결된 세포를 해동시키고, PBS 완충액 10㎖ 중에서 재현탁시켰다. 세포를 20,000psi에서 프렌치(French) 압력 세포 프레스 SLM 아민코(Aminco)에서 분쇄시켰다 (3회 통과). 추출물을 30분간 4℃에서 16,000g로 원심분리시켰다. 상기한 바와 같이 추출물을 원심분리시킨 후, 상층액 및 펠레트의 분액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
펠레트 분획 내에 편재된 약 35kDa의 주요 밴드를 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, 토끼 폴리클로날 안티-단백질-D에 의해 및 접근가능한 히스티딘 테일을 검출하는 소 창자 알칼리 포스파타아제(Qiagen cat. no 34510)에 커플링된 Ni-NTA 컨쥬게이트에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 발현의 수준은 전체 단백질의 약 5%를 나타낸다.
실시예 ⅩⅡ: 융합 clyta-E6E7-his (HPV16)을 발현시키는 대장균 스트레인의 구성
1. 발현 플라스미드의 구성
1.a 출발 물질
a) 융합 ProtD1/3-E6E7-His/HPV16을 코딩하는 플라스미드 pRIT14512 (= TCA311)
b) 스트렙토코쿠스 뉴모니아의 LytA의 117 C 말단 코돈에 대한 코딩 서열을 함유하는 중간 벡터인 플라스미드 pRIT14661 (= DVA2)
1.b 플라스미드 pRIT14629 (= TCA331)의 구성: 융합 clyta-E6E7-His/HPV16을 발현시키는 플라스미드
a) 첫번째 단계에서는, 플라스미드 pRIT14512로부터 거대한 NcoI-AflII 제한 단편을 정제하고, pRIT14661로부터 작은 AflII-AflIII 제한 단편을 정제하였다.
b) 두번째 단계에서는, clyta 서열을 E7-His 서열에 결합시켜서(NcoI 및 AflII은 양립가능한 제한 부위임), pL 프로모터의 조절 하에 융합 단백질 clyta-E6E7-His를 코딩하는 플라스미드 pRIT 14629(=TCA331)를 생성시켰다. (도 13 참조)
융합 단백질 clyta-E6E7-His에 대한 코딩 서열은 도 14에 도시되어 있다.
2. AR58 스트레인의 형질전환
플라스미드 pRIT14629를 λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82-88) 내에 도입시켰다.
3. 박테리아 스트레인의 증식 및 유도 - clyta-E6E7-His의 발현
플라스미드 pRIT14629로 형질전환시킨 AR58의 세포를 30℃에서 카나마이신 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 중에서 증식시켰다. 증식의 로그기 동안에, 박테리아를 39℃로 시프팅시켜서, λ 리프레서를 불활성화시키고 단백질 clyta-E6E7-his의 합성을 개시시켰다. 39℃에서의 인큐베이션을 4시간 동안 지속시켰다. 박테리아를 펠레트화시키고, -20℃에서 저장하였다.
4. 융합 단백질 clyta-E6E7-his의 특징화
동결된 세포를 해동시키고, PBS 완충액 10㎖ 중에서 재현탁시켰다. 세포를 20,000psi에서 프렌치 압력 세포 프레스 SLM 아민코(Aminco)에서 분쇄시켰다 (3회 통과). 추출물을 30분간 4℃에서 16,000g로 원심분리시켰다.
상기한 바와 같이 추출물을 원심분리시킨 후, 상층액 및 펠레트의 분액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
펠레트 분획 내에 편재된 약 48kDa의 주요 밴드를 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, 토끼 폴리클로날 안티-단백질-D에 의해 및 접근가능한 히스티딘 테일을 검출하는 소 창자 알칼리 포스파타아제(Qiagen cat. no 34510)에 커플링된 Ni-NTA 컨쥬게이트에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 발현의 수준은 전체 단백질의 약 1%를 나타낸다.
실시예 ⅩⅢ: Prot D1/3 E7 his (HPV18)(대장균 B1011)
트랜스 형태의 티오레독신과 함께 발현된 단백질 D1/3 his HPV (대장균 B1012)
1) 발현 플라스미드의 구성
1).a. 융합 단백질-D1/3-E7-His/HPV18을 발현시키는 플라스미드 TCA316(=pRIT 14532)의 구성
출발 물질
a) 플라스미드 pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589)는 인플루엔자로부터의 NS1 코딩 영역의 코돈 4 내지 81이 생물형 2인 헤모필루스 인플루엔자 스트레인 772 (참조: H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. p. 119-125)의 성숙 단백질 D의 잔기 Ser20 → Thr127에 상응하는 코돈에 의해 치환된 pMG81(WO97/01640호로서 공개된 영국 특허 출원 제 951 3261.9호에 기재되어 있음)의 유도체이다. Prot-D1/3의 서열은 다중 클로닝 부위(11개 잔기) 및 C 말단 히스티딘 테일(6 His)에 대한 코딩 영역 다음에 위치한다 (도 15 참조). 이러한 플라스미드는 융합 단백질 D1/3-E7-his를 발현시키기 위해 사용된다.
b) 프로토타입 HPV18의 HPV 게놈 E6 및 E7 서열 (참조: Cole et al,J.Mol.Bio.(1987)193,599-608)을 pBR322(입수처: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg)에서 클로닝된 HPV 16 온길이 게놈으로부터 증폭시키고, pUC19 내에 서브클로닝시켜서, TCA 302 (= pRIT14467)를 수득하였다.
플라스미드 TCA 316 (= pRIT14532)의 구성
E7 단백질의 아미노산 1→105에 상응하는 누클레오티드 서열을 pRIT14467로부터 증폭시켰다. 중합효소 연쇄 반응 동안에, NcoI 및 SpeI 제한 부위를 E7 서열의 5' 및 3' 말단에 생성시켜서, 플라스미드 pMGMCS Prot D1/3의 동일한 부위에 삽입시킴으로써, 플라스미드 TCA316(=pRIT14532)를 수득하였다. 삽입물을 시퀀싱하고, 글리신을 글루탐산으로 치환시키는(E7 중의 aa 43, 융합 단백질 중의 위치 156) E7/HPV18 프로토타입 서열에 대한 변형을 E7 유전자(누클레오티드 128 G→A)에서 확인하였다. 융합 단백질 D1/3-E7-His/HPV18에 대한 서열은 도 16에 도시되어 있다.
1).b. 플라스미드 TCA313(=pRIT14523)의 구성: 티오레독신을 발현시키는 플라스미드
출발 물질
a) ColE1 또는 P15a 복제 기원을 함유하는 플라스미드와 양립가능한 플라스미드 pBBR1MCS4(참조: Antoine R. and C.Locht,Mol.Microbiol. 1992,6,1785-1799; M.E.Kovach et al. Biotechniques 16, (5), 800-802).
b) λ파지의 프로모터 pL의 서열을 함유하는 플라스미드 pMG42(참조: WO93/04175)
c) 티오레독신에 대한 코딩 서열에 이어 AspA 전사 종결제를 함유하는 플라스미드 pTRX (Invitrogen, kit Thiofusion K350-01).
플라스미드 TCA313(=pRIT14523)의 구성
pL 프로모터를 함유하는 pMG로부터의 EcoRI-NdeI 단편 및 티오레독신에 대한 코딩 서열에 이어 AspA 전사 종결제를 함유하는 pTRX로부터의 NdeI-HindIII 단편을, 정제하고, 플라스미드 벡터 pBBR1MCS4의 EcoRI 및 HindIII 부위 내에 연결시켜서, 플라스미드 TCA313(=pRIT14523)을 수득하였다 (도 17 참조).
티오레독신에 대한 서열은 도 18에 도시되어 있다.
2) AR58 스트레인의 형질전환
2).a. ProtD1/3-E7-His/HPV18을 발현시키는 스트레인 B1011의 수득
플라스미드 pRIT14532를, λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82-88) 내에 도입시키고, 카나마이신에 대해 내성인 형질전환체를 선택하였다.
2).b. ProtD1/3-E7-His/HPV18 및 티오레독신을 발현시키는 스트레인 B1012의 구성
플라스미드 pRIT14532 및 pRIT14523을 λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82-88) 내에 도입시키고, 카나마이신 및 암피실린에 대해 내성인 형질전환체를 2중 선택하였다.
3) 스트레인 B1011 및 B1012의 증식 및 유도 - 트랜스 형태의 티오레독신이 있는 형태의 Prot-D1/3-E7-His/HPV18의 발현 및 트랜스 형태의 티오레독신이 없는 형태의 Prot-D1/3-E7-His/HPV18의 발현
플라스미드 pRIT14532(B1011 스트레인)으로 형질전환시킨 AR58의 세포 및 플라스미드 pRIT14532와 pRIT14523(B1012 스트레인)으로 형질전환시킨 AR58의 세포를 30℃에서 B1011 스트레인을 위해 카나마이신 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 및 B1012 스트레인을 위해 카나마이신 50㎍/㎖ 및 암피실린 100㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 중에서 증식시켰다. 증식의 로그기 동안에, 박테리아를 39℃로 시프팅시켜서, λ 리프레서를 불활성화시키고 단백질 D1/3-E7-His/HPV18 및 티오레독신의 합성을 개시시켰다. 39℃에서의 인큐베이션을 4시간 동안 지속시켰다. 박테리아를 펠레트화시키고, -20℃에서 저장하였다.
융합 단백질 D1/3-E7-his/HPV18의 특징화
추출물의 제조
동결된 세포를 해동시키고, PBS 완충액 10㎖ 중에서 재현탁시켰다. 세포를 20,000psi에서 프렌치(French) 압력 세포 프레스 SLM 아민코(Aminco)에서 분쇄시켰다 (3회 통과). 추출물을 30분간 4℃에서 16,000g로 원심분리시켰다.
쿠마시 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 웨스턴 블롯에서의 분석
상기한 바와 같이 추출물을 원심분리시킨 후, 상층액 및 펠레트의 분액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다.
융합 protD1/3-E7-His(약 31kDa)를 스트레인 B1011에 대한 펠레트 분획에서 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, B1012에 대한 상층액 분획에서 부분 편재화시키고(30%), 접근가능한 히스티딘 테일을 검출하는 소 창자 알칼리 포스파타아제(Qiagen cat. no 34510)에 커플링된 Ni-NTA 컨쥬게이트에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 발현의 수준은 쿠마시 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 나타나는 바와 같이 전제 단백질의 약 1 내지 3%를 나타낸다.
스트레인 B1012의 추출물의 경우, 티오레독신(약 12KDa)를 상층액에서 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, 모노클로날 안티 티오레독신(Invitrogen R920-25)에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
PortD1/3 E7-his/HPV18의 정제
재조합 HPV18-ProtD1/3-E7-His를 대장균 AR58 스트레인(상기 참조)에서 발현시켰다. 모든 단계를 실온(약 22℃)에서 수행하였다. 단백질을 OD280nm모니터링하였다. 단계 사이에, 항원 포지티브 분획을 -20℃에서 유지시켰다.
정제된 항원은 -20℃ 및 4℃에서는 1주일간 안정하였지만(분해되지 않음), 37℃에서 인큐베이션된 후에는 산화되기 더욱 쉬워지는 것으로 나타났다.
d) 용해도
단백질 용해도는 pH 의존성(하기 참조)으로서, 용해도는 pH가 7.4 보다 작은 경우에 감소한다.
PBS pH 7.4 686㎍/㎖ 100%
PBS pH 7.2 560㎍/㎖ 81%
PBS pH 7.0 498㎍/㎖ 72%
PBS pH 6.8 327㎍/㎖ 48%
e) HPV18 ProtD1/3 E7 단백질은 227개 아미노산으로 구성되어 있다. 이것의 이론적 분자량은 25.9kDa이며, 이론적 등전점은 5.83이다. 이것은 환원성 SDS PAGE에서 약 31.5kDa에서 이동한다.
실시예 ⅩⅣ: HPV 18 단백질 D1/3 E7의 정제
a) 가용화
세포 페이스트를, 세포를 라니 분쇄기를 2회 통과시킴으로써 용해시키기 전에, 2M NaCl, 20mM 포스페이트 (NaH2PO4/K2HPO4) pH 7.6 중에서 60 OD600으로 현탁시켰다. 용해된 세포를 4℃에서 JA 10 회전자에서 9,000rpm으로 30분간 펠레트화시켰다. 내독소 수준을 저하시키기 위해, 재조합 단백질을 함유하는 박테리아 세포 펠레트를 5mM EDTA, 2M NaCl, PBS pH 7.4 중에서 1회 세척하고; 4M 우레아, 20mM 포스페이트 pH 7.4 중에서 1회 세척하고, PBS pH 7.4 중에서 최종 1회 세척하여, 미량의 EDTA를 제거하였다 (각각의 세척은 세포 현탁액에 대해 사용된 부피의 2배 부피로 수행됨). HPV18-Prot.D1/3-E7-His(트랜스 형태의 티오레독신의 경우 TIT)를 6M 구아니딘-클로라이드, 50mM PO4pH 7.6에 의해 4℃에서 밤새 가용화시켰다 (세포 현탁액에 대해 사용된 부피와 동일한 부피로). 세포 파편을 4℃에서 JA 10 회전자에서 9,000rpm에서 30분간 펠레트화시켰다. 상층액을 0.5% 엠피겐 BB로 보충하고, 실온에서 30분간 인큐베이팅시켰다.
b) 정제
1).a. 고정된 금속 친화성 크로마토그래피
샘플 125㎖를 0.5% 엠피겐 BB, 6M 구아니딘-클로라이드, 50mM PO4pH 7.6으로 예비평형시킨 Zn2+-킬레이팅 세파로오스 FF 칼럼(XK 26/20, Pharmacia; 겔 50㎖/가용화 125㎖) 상에 4㎖/분으로 로딩시켰다. 칼럼을, 기선에 도달할 때까지 구아니딘 클로라이드 6M, 50mM PO4pH 7.6으로 세척시킨 후, 6M 우레아, 0.5M NaCl, 50mM PO4pH 7.6으로 세척시켰다. 항원을 6M 우레아, 0.5M NaCl, 50mM PO4pH 7.6 중에서 0.25M 이미다졸에 의해 2㎖/분으로 용리시켰다 (도 1B). IMAC 용리된 샘플을 PBS pH 7.4에 대해 4℃에서 투석시켰다.
1).b. 아피-프렙 폴리믹신 (Bio-Rad)
내독소 수준을 저하시키기 위해, 항원 28㎎(37㎖)을, PBS pH 7.4로 예비평형시킨 아피프렙 폴리믹신 수지 2㎖와 배치 모드로 실온에서 밤새 인큐베이팅시켰다. 단백질 회수율을 60%로 평가되었고, 내독소 함량은 6.5배 감소하였다.
1).c. 분석
환원성 SDS-PAGE에서 분석된 정제된 항원은 쿠마시 블루 또는 은 염색 후, 주요 30kDa 밴드를 55kDa에 있는 두번째 밴드와 함께 나타내었다. 비환원성 SDS-PAGE의 경우, HPV-18-ProtD1/3-E7-His는 주로 175kDa 이상의 분자량을 갖는 얼룩으로 나타난다. 그러나, 이러한 산화는 5mM β-메르캅토-에탄올을 첨가시킴으로써 반전될 수 있다. 이러한 패턴은 안티 ProtD 또는 안티 His 웨스턴 블로팅 분석에 의해 확인된다.
c) 안정성
정제된 항원은 -20℃ 및 4℃에서 1주일간 안정하지만(분해되지 않음), 37℃에서 인큐베이션된 후 산화되기 더욱 쉬워지는 것으로 나타났다.
d) 용해도
단백질 용해도는 pH 의존성(하기 참조)으로서, 용해도는 pH가 7.4 보다 작은 경우에 감소한다.
PBS pH 7.4 686㎍/㎖ 100%
PBS pH 7.2 560㎍/㎖ 81%
PBS pH 7.0 498㎍/㎖ 72%
PBS pH 6.8 327㎍/㎖ 48%
HPV18-ProtD1/3-E7-His 단백질은 227개 아미노산으로 구성되어 있다. 이것의 이론적 분자량은 25.9kDa이다. 이것은 환원성 SDS PAGE에서 약 31.5kDa에서 이동한다. 이론적 등전점은 5.83이다.
실시예 ⅩⅤ: 변이된(cys27→gly, glu29→gln) 융합 ProtD1/3-E7 타입 HPV18을 발현시키는 대장균 스트레인 B1098의 구성
1) 발현 플라스미드의 구성
출발 물질:
a) 융합 단백질 ProtD1/3-E7-His를 코딩하는 플라스미드 pRIT 14532 (= TCA316)
b) pUC 유도된 클로닝 벡터인 플라스미드 LITMUS 28 (New England Biolabs cat no 306-28)
c) 인플루엔자로부터의 NS1 코딩 영역의 코돈 4 내지 81이 생물형 2인 헤모필루스 인플루엔자 스트레인 772 (참조: H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. p. 119-125)의 성숙 단백질 D의 잔기 Ser20 → Thr127에 상응하는 코돈에 의해 치환된 pMG81(상기 참조)의 유도체인, 플라스미드 pMG MCS prot D1/3 (=pRIT 14589). Prot-D1/3의 서열은 다중 클로닝 부위(11개 잔기) 및 C 말단 히스티딘 테일(6 His)에 대한 코딩 영역 다음에 위치한다.
플라스미드 pRIT 14831 (= TCA355)의 구성: His 테일을 갖는 변이된(cy27→gly, glu29→gln) 융합 단백질-D1/3-E7을 발현시키는 플라스미드
His 테일로 연장된 HPV18로부터의 E7 유전자의 코딩 서열을 함유하는 pRIT 14532 (= TCA316)으로부터의 NcoI-XbaI 단편을 변이유발에 유용한 중간 벡터 Litmus 28에 서브클로닝시켰다. E7/HPV16 변이유발과 유사한 방식으로, 이중 변이 cys27→gly 및 glu29→gln을 망막아세포종 유전자(pRB)의 안티온코진 생성물에 대한 결합을 손상시키도록 선택하였다.
E7 유전자에서의 변이의 도입을 키트 [Quick Change Site directed Mutagenesis (Stratagene cat no 200518)]로 수행하였다. pRIT14532을 시퀀싱한 결과, HPV18의 프로토타입 서열 중의 글리신 대신에 E7의 위치 43에 글루탐산이 존재하는 것으로 나타나는 경우, 제 2의 변이유발 사이클을 수행하여, 글리신을 위치 43에 도입시켰다. 본 발명자들은 플라스미드 14829(=TCA353)를 수득하였다. 시퀀싱에 의해 완전한 E7 유전자의 변이의 존재 및 온전성을 확인한 후, 변이된 E7 유전자를 벡터 pRIT 14589(=pMG MCS ProtD1/3)에 도입시켜서, 플라스미드 pRIT 14831(=TCA355)를 수득하였다 (도 17 참조).
변이된(cys27→gly, glu29→gln) 융합 단백질-D1/3-E7-His의 서열은 도 18에 도시되어 있다.
2) 변이된(cys27→gly, glu29→gln) ProtD1/3-E7-His/HPV18을 발현시키는 스트레인 B1098의 구성
플라스미드 pRIT 14831을, λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82-88) 내에 도입시키고, 카나마이신에 대해 내성인 형질전환체를 선택함으로써 스트레인 B1098을 수득하였다.
3) 박테리아 스트레인 B1098의 증식 및 유도 - 변이된(cys27→gly, glu29→gln) ProtD1/3-E7-His/HPV18의 발현
플라스미드 pRIT14831로 형질전환시킨 AR58의 세포(B1098 스트레인)를 30℃에서 카나마이신 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 중에서 증식시켰다. 증식의 로그기 동안에, 박테리아를 39℃로 시프팅시켜서, λ 리프레서를 불활성화시키고 변이된 ProtD1/3-E7-His/HPV18의 합성을 개시시켰다. 39℃에서의 인큐베이션을 4시간 동안 지속시켰다. 박테리아를 펠레트화시키고, -20℃에서 저장하였다.
4) 변이된(cys27→gly, glu29→gln) 융합 ProtD1/3-E7-His 타입 HPV18의 특징화
동결된 세포를 해동시키고, PBS 완충액 10㎖ 중에 재현탁시켰다. 세포를 20,000psi에서 프렌치(French) 압력 세포 프레스 SLM 아민코(Aminco)에서 분쇄시켰다 (3회 통과). 추출물을 30분간 4℃에서 16,000g로 원심분리시켰다.
쿠마시 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 웨스턴 블롯 상에서의 분석
상기한 바와 같이 추출물을 원심분리시킨 후, 상층액 및 펠레트의 분액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 펠레트 분획 내에 편재된 약 31kDa의 주요 밴드를 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, 토끼 폴리클로날 22 J 70 안티-단백질 D에 의해 및 접근가능한 히스티딘 테일을 검출하는 모노클로날 펜타-His(Qiagen cat. no 34660)에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 발현의 수준은 전체 단백질의 약 3 내지 5%를 나타낸다.
실시예 ⅩⅥ: 융합 단백질-D1/3-E6-his/HPV18을 발현시키는 대장균 스트레인의 구성
1. 발현 플라스미드의 구성
a) 플라스미드 pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589)는 인플루엔자로부터의 NS1 코딩 영역의 코돈 4 내지 81이 생물형 2인 헤모필루스 인플루엔자 스트레인 772 (참조: H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. p. 119-125)의 성숙 단백질 D의 잔기 Ser20 → Thr127에 상응하는 코돈에 의해 치환된 pMG81(상기 참조)의 유도체이다. Prot-D1/3의 서열은 다중 클로닝 부위(11개 잔기) 및 C 말단 히스티딘 테일(6 His)에 대한 코딩 영역 다음에 위치한다. 이러한 플라스미드는 융합 단백질 D1/3-E6-his를 발현시키기 위해 사용된다.
HPV 게놈 E6 및 E7 서열 타입 HPV16 (참조: Seedorf et al., Virology 1985, 145, p.181-185)를 pBR322(입수처: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg)에서 클로닝된 HPV 18 온길이 게놈으로부터 증폭시키고, pUC19 내에 서브클로닝시켜서, TCA 302 (= pRIT14467)를 수득하였다.
플라스미드 TCA 314(=pRIT14526)의 구성: 융합 단백질-D1/3-E6-His/HPV18을 발현시키는 플라스미드
E6 단백질의 아민노산 1→158에 상응하는 누클레오티드 서열을 pRIT14467로부터 증폭시켰다. 중합효소 연쇄 반응 동안에, NcoI 및 SpeI 제한 부위를 E6 서열의 5' 및 3' 말단에 생성시켜서, 플라스미드 pMGMCS Prot D1/3의 동일한 부위에 삽입시킴으로써, 플라스미드 TCA314(=pRIT14526)을 수득하였다 (도 21 참조). 삽입물을 시퀀싱하여, 변형이 중합효소 연쇄 반응 동안에 일어나지 않았음을 확인하였다. 융합 단백질-D1/3-E6-His에 대한 코딩 서열은 도 22에 도시되어 있다.
AR58 스트레인의 형질전환
플라스미드 pRIT14526를, λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82-88) 내에 도입시켰다.
3. 박테리아 스트레인의 증식 및 유도 - Prot-D1/3-E6-His의 발현
플라스미드 pRIT14526으로 형질전환시킨 AR58의 세포를 30℃에서 카나마이신 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 중에서 증식시켰다. 증식의 로그기 동안에, 박테리아를 39℃로 시프팅시켜서, λ 리프레서를 불활성화시키고 단백질 D1/3-E7-His의 합성을 개시시켰다. 39℃에서의 인큐베이션을 4시간 동안 지속시켰다. 박테리아를 펠레트화시키고, -20℃에서 저장하였다.
4. 융합 단백질 D1/3-E6-his의 특징화
동결된 세포를 해동시키고, PBS 완충액 10㎖ 중에서 재현탁시켰다. 세포를 20,000psi에서 프렌치 압력 세포 프레스 SLM 아민코(Aminco)에서 분쇄시켰다 (3회 통과). 추출물을 30분간 4℃에서 16,000g로 원심분리시켰다. 상기한 바와 같이 추출물을 원심분리시킨 후, 상층액 및 펠레트의 분액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 펠레트 분획 내에 편재된 약 32kDa의 주요 밴드를 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, 토끼 폴리클로날 안티-단백질-D에 의해 및 접근가능한 히스티딘 테일을 검출하는 소 창자 알칼리 포스파타아제(Qiagen cat. no 34510)에 커플링된 Ni-NTA 컨쥬게이트에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 발현의 수준은 전체 단백질의 약 3 내지 5%를 나타낸다.
실시예 ⅩⅦ: 융합 단백질 D1/3-E6E7-his/HPV18을 발현시키는 대장균 스트레인의 구성
1. 발현 플라스미드의 구성
a) 플라스미드 pMG MCS prot D1/3 (=pRIT14589)는 인플루엔자로부터의 NS1 코딩 영역의 코돈 4 내지 81이 생물형 2인 헤모필루스 인플루엔자 스트레인 772 (참조: H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. p. 119-125)의 성숙 단백질 D의 잔기 Ser20 → Thr127에 상응하는 코돈에 의해 치환된 pMG81(상기 참조)의 유도체이다. Prot-D1/3의 서열은 다중 클로닝 부위(11개 잔기) 및 C 말단 히스티딘 테일(6 His)에 대한 코딩 영역 다음에 위치한다. 이러한 플라스미드는 융합 단백질 D1/3-E6E7-his를 발현시키기 위해 사용된다.
b) HPV 게놈 E6 및 E7 서열 타입 HPV18 (참조: Cole et al,J.Mol.Bio.(1987)193,599-608)을 pBR322(입수처: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg)에서 클로닝된 HPV 18 온길이 게놈으로부터 증폭시키고, pUC19 내에 서브클로닝시켜서, TCA 302 (= pRIT14467)를 수득하였다.
c) TCA302(=pRIT14467) 중의 E6 및 E7에 대한 코딩 서열을, 합성 올리고누클레오티드 어댑터(Hga I 및 Nsi I 사이에 삽입됨)를 사용하여, E6과 E7 사이에 있는 11개 누클레오티드를 결실시키고, E6의 정지 코돈을 제거시키고, 융합된 E6 및 E7 코딩 서열을 플라스미드 TCA 320(=pRIT14618) 내에 생성시킴으로써 변형시켰다. (도 23 참조)
플라스미드 TCA328(=pRIT14567)의 구성: 융합 단백질-D1/3-E6E7-His/HPV18을 발현시키는 플라스미드
융합된 E6E7 단백질의 아미노산 1→263에 상응하는 누클레오티드 서열을 pRIT14618로부터 증폭시켰다. 중합효소 연쇄 반응 동안에, NcoI 및 SpeI 제한 부위를 E6E7 융합된 서열의 5' 및 3' 말단에 생성시켜서, 플라스미드 pMGMCS Prot D1/3의 동일한 부위에 삽입시킴으로써, 플라스미드 TCA328(=pRIT14567)을 수득하였다 (도 24 참조). 삽입물을 시퀀싱하여, 변형이 중합효소 연쇄 반응 동안에 일어나지 않았음을 확인하였다. 융합 단백질-D1/3-E6E7-His에 대한 코딩 서열은 도 25에 도시되어 있다.
2. AR58 스트레인의 형질전환
플라스미드 pRIT14567을, λpL 프로모터의 열감수성 리프레서를 함유하는 결함성 λ 리소겐인 대장균 AR58(참조: Mott et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82:88) 내에 도입시켰다.
3. 박테리아 스트레인의 증식 및 유도 - Prot-D1/3-E6E7-His의 발현
플라스미드 pRIT14512로 형질전환시킨 AR58의 세포를 30℃에서 카나마이신 50㎍/㎖가 보충된 LB 배지 100㎖ 중에서 증식시켰다. 증식의 로그기 동안에, 박테리아를 39℃로 시프팅시켜서, λ 리프레서를 불활성화시키고 단백질 D1/3-E7-His의 합성을 개시시켰다. 39℃에서의 인큐베이션을 4시간 동안 지속시켰다. 박테리아를 펠레트화시키고, -20℃에서 저장하였다.
4. 융합 단백질 D1/3-E6E7-his의 특징화
동결된 세포를 해동시키고, PBS 완충액 10㎖ 중에서 재현탁시켰다. 세포를 20,000psi에서 프렌치 압력 세포 프레스 SLM 아민코(Aminco)에서 분쇄시켰다 (3회 통과). 추출물을 30분간 4℃에서 16,000g로 원심분리시켰다. 상기한 바와 같이 추출물을 원심분리시킨 후, 상층액 및 펠레트의 분액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. 펠레트 분획 내에 편재된 약 48kDa의 주요 밴드를 쿠마시 염색된 겔에 의해 가시화시키고, 토끼 폴리클로날 안티-단백질-D에 의해 및 접근가능한 히스티딘 테일을 검출하는 소 창자 알칼리 포스파타아제(Qiagen cat. no 34510)에 커플링된 Ni-NTA 컨쥬게이트에 의해 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 발현의 수준은 전체 단백질의 약 1%를 나타낸다.
실시예 ⅩⅧ: 백신 제형
백신은 스트레인 AR58로부터의 대장균에서 발현된 상기 실시예로부터의 단백질로 제형화되며, 보조제로서, 제형은 3de-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A (3D-MPL) 및 알루미늄 히드록시드 또는 3D-MPL 및/또는 QS21을 임의로 오일/물 에멀션 형태로 포함하며, 임의로, 콜레스테롤로 제형된다.
3D-MPL: 그람 음성 박테리아인 살모넬라 미네소타의 리포폴리사카라이드(LPS)의 화학 제독된 형태. 스미쓰 클라인 비참 바이올로지칼스에서 수행된 실험에 의하면, 다수의 비히클과 조합된 3D-MPL은 체액성 및 TH1 타입 세포 면역성을 증강시키는 것으로 나타났다.
QS21: 강력한 보조제 활성을 갖는 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina) 나무의 수피의 미정제 추출물로부터의 정제된 일종의 사포닌: 이것은 몇몇 항원에 대해 항원 특이적 림프세포증식 및 CTL 둘 모두를 활성화시킨다.
본 발명의 항원과 3D-MPL 및 명반을 함유하는 백신은 WO93/19780호 또는 92/16231에 기재된 방식과 유사한 방식으로 제조될 수 있다.
스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈에서 수행된 실험에 의해, 체액성 및 TH1 타입 세포 면역 반응 둘 모두의 유도에서의 3D-MPL 및 QS21의 조합물의 명백한 상승 효과가 입증되었다. 이러한 항원을 함유하는 백신은 US 5750110호에 기재되어 있다
오일/물 에멀션은 2종의 오일(토코페롤 및 스쿠알렌)과 에멀션화제로성의 Tween80을 함유하는 PBS로 구성되어 있다. 에멀션은 5% 스쿠알렌, 5% 토코페롤, 0.4% 트윈 80으로 구성되고, 평균 입자 크기가 180mm이며, SB62로서 공지되어 있다 (WO 95/17210호 참조).
스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈에서 수행된 실험에 의해, 이러한 O/W 에멀션을 MPL/QS21에 첨가시키면 이들의 면역자극 특성이 더 증가되는 것으로 입증되었다.
에멀션 SB62의 제조 (2배 농축물)
Tween80을 포스페이트 완충 식염(PBS) 중에 용해시켜서, PBS 중의 2% 용액을 수득하였다. 2배 농축 에멀션 100㎖를 제공하기 위해, DL 알파 토코페롤 5g 및 스쿠알렌 5㎖를 와동시켜 완전 혼합시켰다. PBS/Tween 용액 90㎖를 첨가하고, 완전 혼합시켰다. 그 후, 생성된 에멀션을 세척기에 통과시키고, M110S 미세유동기를 사용하여 최종 미세유동시켰다. 생성된 오일 방울의 크기는 약 180nm 였다.
Prot.D1/3 E7 QS21/3D MPL 수중유 제형의 제조
ProtD1/3-E7(5㎍)을 10배 농축된 PBS pH 6.8 및 H2O 중에 희석시킨 후, SB62, 3D MPL(5㎍), QS21(5㎍) 및 방부제로서의 티오메르살 50㎍/㎖을 5분 간격으로 첨가시켰다. 에멀션 부피는 전체 부피의 50%와 같았다 (100㎕의 용량에 대해 50㎕). 모든 인큐베이션을 실온에서 수행하면서 교반시켰다. 항원이 없는 보조제 대조군을 단백질을 PBS로 대체시킴으로써 제조하였다.
PROT D E7에 의한 종양 퇴행 실험 (HPV 16)
백신 항원: 융합 단백질 ProtD E7
단백질 D는 그람 음성 박테리아인 헤모필루스 인플루엔자의 표면에 노출되어 있는 지단백질이다. 융합 파트너로서의 단백질 D의 최초의 109개 잔기의 함입은, 백신 항원에게 방관자(bystander) 도움 특성을 제공하도록 포함된다. 항원을 상기한 바와 같이 QS21 3D-MPL 및 SB62로 제형화시켰다.
실시예 ⅩⅨ: 생체내 종양 퇴행 실험
종양 세포계 TC1:
C57BL.6 마우스로부터의 1차 폐 상피세포를 HPV16 E6 및 E7에 의해 불멸화시킨 후, 활성화된 ras 온코진으로 형질전환시켜서, E6 및 E7를 발현시키는 종양형성성 세포계를 생성시켰다 (참조: Lin KY et al. 1996). E7 발현은 고정된 TC1 세포 및 투과될 수 있는 TC1 세포를 마우스 안티-HPV 16 E7 Mab(Triton Corp. Alameda, CA)를 사용하여 FACS 분석함으로써 입증되었다.
종양 성장:
TC1 세포가 증식하는 생체외 배양액을 트립신처리하고, 혈청 비함유 배지에서 2회 세척하고, 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 형성된 종양의 처리를 평가하기 위해, TC1 세포를 마우스 당 3X 104개 세포의 용량으로 주입시켰다. 종양 세포를 주입시킨 지 1주 및 2주 후에, 마우스를 PBS 또는 3D-MPL, QS21 및 SB62 중의 protD 1/3 E7 His 인트라 풋 패드(intra foot pad) 100㎕ 중의 5㎍로 백신접종시키거나, PBS 또는 보조제만으로 백신접종시켰다. 5마리의 C57BL/6 마우스 (Iffa Credo)를 각각의 군에 사용하였다. 마우스를 일주일에 2회 종양 성장에 대해 모니터하였다. 군 당 평균 종양 질량은 도 26에 도시되어 있고, PBS 중의 protD 1/3 E7 His 또는 PBS 또는 보조제만으로 백신접종된 마우스는 점점 성장하는 종양을 발달시켰다 (군 당 0 내지 1마리의 종양 비함유 마우스). 대조적으로, 보조제 중의 protD1/3 E7 His로 백신접종된 5마리 마우스 중의 4마리는 종양을 발달시키지 않았으며, 1마리는 40일째에 매우 작고 안정한 종양을 발달시켰다. 이러한 결과는 보조제 중에 제형화된 HPV16으로부터의 단백질 protD1/3 E7 His가 이러한 항원을 발현시키는 작게 형성된 종양의 퇴행을 유도시킬 수 있음을 나타낸다.
면역학적 판독
증식 검정:
생체외 검정의 경우, 림프구를, 69일된 백신접종시킨 마우스로부터의 비장 또는 슬와부 림프절을 분쇄시킴으로써 준비하였다. 2x105개 세포의 분액을, 라텍스 마이크로비드(Sigma) 상에 코팅되거나 되지 않은 protD 1/3 E7 His의 농도를 감소시키면서(10, 1, 0.1㎍/㎖), 96 웰 플레이트에서 3중으로 플레이팅시켜서, 세포를 생체외 재자극시켰다 (72시간).
도 27 및 28은 PBS, 3D-MPL, QS21 SB62, ProtD1/3 E7 His 및 ProtD1/3 E7 His + 3D-MPL, QS21, SB62의 보조제에 의해 생체내 프라이밍된 비장세포 및 림프절 세포의 증식을 자극하는 protD E7의 능력을 비교한 도면이며, 비장에서의 높은 증식 반응은 그 밖의 군과 비교되는 보조제 중의 protD1/3 E7 His로 면역된 마우스에서만 검출되었음을 나타낸다.
항체 반응
개개의 혈청을 장기를 취함과 동시에 취하고, 간접 ELISA를 수행하였다.
정제된 E7 단백질 5㎍/㎖을 코팅된 항원으로서 사용하였다. PBS + 1% 신생우혈청 중에 37℃에서 1시간 동안 포화시킨 후, 혈청을 포화 완충액 중에서 연속 희석시키고(1/100에서 출발함), 4℃에서 밤새 인큐베이팅시키거나, 37℃에서 90분 동안 인큐베이팅시켰다. PBS 중에서 세척시킨 후, Tween 20 0.1%, 비오티닐화된 염소 안티 마우스 Ig (1/1000) 또는 염소 안티 마우스 Ig 서브클래스(전체 IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) 항혈청(1/5000)을 제 2의 항체로서 사용하고, 37℃에서 90분 동안 인큐베이팅시킨 후, 퍼옥시다아제에 커플링된 스트렙타비딘을 첨가하고, TMB(테트라-메틸-벤지딘/퍼옥시드)를 기질로서 사용하고, 10분 후, 반응을 H2SO4 0.5M로 중지시키고, O.D.450을 결정하였다.
다수의 군의 마우스에서의 백신접종에 의해 유도되는 서브클래스 특이적 안티 E7 타이터를 혈청의 상대적 평균 중간점 희석의 비교로서 도 29에 나타내었다.
이들 결과는 약한 항체 반응이 ProtD 1/3 E7 HPV16만의 2회 주입에 의해 유도됨을 나타낸다.
ProtD1/3 E7이 보조제 SB62, QS21 + 3D-MPL의 존재하에 주입되면 훨씬 많은 안티-E7 항체가 생성되었다.
보조제 SB62, QS21 + 3D-MPL 중의 ProtD 1/3 E7이 투여된 마우스의 혈청 중의 임의의 혈청 샘플에서도 IgA 또는 IgM이 검출되지 않았다 (데이터는 도시되지 않음). 대조적으로, 전체 IgG 수준은 ProtD 1/3 E7만의 백신접종에 의해 약간 증가하였고, 보조제 SB62, QS21 + 3D-MPL을 단백질에 첨가시키면 크게 증가하였다. 다양한 IgG 서브클래스의 농축물의 분석한 결과, 혼합된 항체 반응은 분석된 모든 타입의 IgG 서브클래스(IgG1, IgG2a 및 IgG2b)의 농도가, 항원 또는 보조제 만이 투여된 마우스의 혈청에서 관찰되는 농도와 비교하여, 보조제가 함유된 항원이 투여된 마우스의 혈청에서 증가하는 것으로 나타났다. 밝혀진 주된 이소타입은 전체 IgG의 80%를 넘는 것으로 나타나는 IgG2b 였으며, 이러한 이소타입은 TH1 타입 면역 반응의 유도와 관련이 있는 것으로 여겨지는 것이 일반적이다.
실시예 ⅩⅩ: 생체내 종양 방어 실험
마우스를 PBS, 실시예 1의 보조제, protD1/3 E7 His 5㎍, 또는 실시예 1의 보조제 중의 protD1/3 E7 His로 부피 100㎕ 중의 인트라 풋 패드(50㎕/풋 패드)로 14일 간격으로 2회 면역시켰다.
종양 성장:
최근 백신접종한지 4주 후에, 마우스를 2x105개 TC1 세포/마우스로 옆구리에 피하 주사하였다. TC1 세포 증식하는 생체외 배양액을 트립신처리하고, 혈청 비함유 배지에서 2회 세척하고, 주입하고, 각각의 군에 사용된 5마리 마우스를 종양 성장에 대해 1주일에 2회 모니터하였다.
도 30은 SB62, QS21, 3D-MPL 보조제에 함유된 E7 단백질로 백신접종하면, 성장성 종양을 발달시키는 보조제 없이 E7 단백질이 투여되거나 보조제만이 투여된 모든 다른 군에서 마우스를 종양의 발달로부터 방어함을 나타낸다.
면역학적 판독
최근 백신접종 한지 3주 후에, 종양 공격 전에, 각각의 군 중의 5마리의 마우스를 희생시켜, 면역학적 판독을 수행하였다.
증식 검정
생체외 검정을 위해, 림프구를 비장 및 슬와부 배액성 림프절로부터 상기한 바와 같이 준비하였다.
2 x 105개 세포의 분액을 코팅되거나 비코팅된 protD 1/3 E7 His의 농도를 감소시키면서(10, 1, 0.1㎍/㎖) 라텍스 마이크로비드(Sigma) 상에 3중으로 96 웰 플레이트에 플레이팅시켜서, 세포를 생체외에서 재구성시켰다 (72시간). T 세포 증식을3H 티미딘 혼입에 의해 측정하였다.
도 31 및 32는 치료용 셋팅에서 관찰되는 바와 같이, 비장세포 또는 슬와부 림프절 세포 둘 모두에 의해, SB62 QS21, 3D-MPL 보조제에 함유된 E7 단백질이 투여된 마우스에 대해 우수한 림프세포증식 활성이 수득됨을 각각 나타낸다.
항체 반응
도 33은 치료용 셋팅에서와 같이, 우수한 항체 반응이, 3D-MPL, QS21 O/W 보조제 중에 제형화된 ProtD1/3 E7 단백질로 백신접종된 마우스의 혈청에서 관찰됨을 나타낸다. 혼합된 항체 반응은 시험된 모든 IgG 서브클래스 (IgG 2a, IgG2b, IgG1)에서 유도되었으며, 이 경우 또한, IgG2b가 우세한 이소타입으로 밝혀졌고, 전체 IgG의 75%를 나타내었다.
실시예 ⅩⅩⅠ: Prot D1/3 E7 (HPV18)에 의한 백신접종 실험
마우스를, PBS 또는 QS21, 3D-MPL 및 SB62, WO96/33739호에 기재된 DQ MPL 또는 WO98/15827호에 기재된 DQ 명반 MPL 중의 ProtD 1/3 18 E7 His 인트라 풋 패드(50㎕/풋 패드)dml 100㎕ 중의 5㎍으로 2주 간격으로 2회 백신접종하였다. 6 내지 8주된 Balb/c 마우스 (Iffa Credo) 8마리를 각각의 군에서 사용하였다.
14일 후(post II), 비장 및 림프절을 취하여 면역학적 판독을 수행하고, 혈청학을 위해 채혈하였다.
면역학적 판독:
증식 검정:
생체외 검정을 위해, 림프구를, 28일째의 백신접종된 마우스로부터 비장 또는 슬와부 림프절을 분쇄시킴으로써 준비하였다.
2 x 105개 세포의 분액을 코팅되거나 비코팅된 protD 1/3 E7 His의 농도를 감소시키면서(10, 1, 0.1㎍/㎖) 라텍스 마이크로비드(Sigma) 상에 3중으로 96 웰 플레이트에 플레이팅시켜서, 세포를 생체외에서 재구성시켰다 (72시간). T 세포 증식을3H 티미딘 혼입에 의해 측정하였다. 결과는 자극 지수로서 표현된다 (cpm 샘플/cpm 기선)
도 34 및 35는 ProtD1/3 18 E7 His 또는 Prot D1/3 18 E7 His + 보조제에 의해 프라이밍된 비장세포 또는 림프절 세포의 증식을 자극하는 protD 1/3 18 E7의 능력을 비교하며, 단백질만이 투여된 마우스에서는 기선 증식만이 나타나는 반면에, 보조제에 함유된 protD1/3 18 E7 His로 면역된 마우스에서는 비장에서의 높은 증식 반응 및 림프절에서의 매우 높은 반응이 검출됨을 나타낸다.
시토킨 생성
배지 또는 ProtD1/3 18 E7(1 또는 3㎍/㎖)에 의한 비장 또는 림프절 세포의 생체외 재구성 96시간 후에 배양 상층액에서 생성된 시토킨(IL-5 및 IFNg)을 공지된 ELISA에 의해 측정하였다:
IFNg (Genzyme)
IFNγ의 정량을 겐자임으로부터의 시제를 사용하여 ELISA에 의해 수행하였다. 샘플 및 항체 용액을 웰 당 50㎕로 사용하였다. 96 웰 마이크로타이터 플레이트(Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark)를 카보네이트 완충액(pH 9.5) 중에 1.5㎍/㎖로 희석시킨 햄스터 안티-마우스 IFNg 50㎕로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 그 후, 플레이트를 1% 우혈청 알부민 및 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS(포화 완충액) 100㎕로 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 포화 완충액 중의 생체외 자극(1/2에서 출발)으로부터의 상층액의 2배 희석액을 안티-IFNg 코팅된 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 PBS Tween 0.1%(세척 완충액)로 4회 세척하고, 최종 농도 0.5㎍/㎖의 포화 완충액 중에 희석된 비오틴 컨쥬게이팅된 염소 안티-마우스 IFNg를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 세척 단계 후, 포화 완충액 중에 1/10000 희석시킨 AMDEX 컨쥬게이트(Amersham)를 37℃에서 30분간 첨가시켰다. 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하고, TMB(Biorad) 50㎕와 15분간 인큐베이팅시켰다. 반응을 H2SO40.4N로 중지시키고, 450nm에서 판독하였다. 농도를 SoftmasPro(4원 매개 방정식)에 의해 표준 곡선(마우스 IFNγ 표준)을 이용하여 계산하고, pg/㎖로 나타내었다.
IL5(Pharmingen)
IL5의 정량을 파밍겐으로부터의 시제를 사용하여 ELISA에 의해 수행하였다. 샘플 및 항체 용액을 웰 당 50㎕로 사용하였다. 96 웰 마이크로타이터 플레이트(Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark)를 카보네이트 완충액(pH 9.5) 중에 1㎍/㎖로 희석시킨 래트 안티-마우스 IL5 50㎕로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 그 후, 플레이트를 1% 우혈청 알부민 및 0.1% Tween 20을 함유하는 PBS(포화 완충액) 100㎕로 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 포화 완충액 중의 생체외 자극(1/2에서 출발)으로부터의 상층액의 2배 희석액을 안티-IFNg 코팅된 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 30분간 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 PBS Tween 0.1%(세척 완충액)로 4회 세척하고, 최종 농도 1㎍/㎖의 포화 완충액 중에 희석된 비오틴 컨쥬게이팅된 래트 안티-마우스 IL5를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅시켰다. 세척 단계 후, 포화 완충액 중에 1/10000 희석시킨 AMDEX 컨쥬게이트(Amersham)를 37℃에서 30분간 첨가시켰다. 플레이트를 상기한 바와 같이 세척하고, TMB(Biorad) 50㎕와 15분간 인큐베이팅시켰다. 반응을 H2SO40.4N로 중지시키고, 450nm에서 판독하였다. 농도를 SoftmasPro(4개 매개변수 방정식)에 의해 표준 곡선(재조합 마우스 IL5)을 이용하여 계산하고, pg/㎖로 나타내었다.
비장 세포에서 출발하여, IL-5는 모든 시험된 군에서 검출되지 않은 반면에, IFNg 생성의 매우 높은 생성이 모든 군에서 관찰되었으며, SBAS1c가 보조제로 사용된 단백질이 투여된 마우스의 군에서는 그 밖의 군과 비교하여 단지 약간 더 증가하였다. 이것은 면역 반응의 TH1 타입의 유도를 제시한다.
림프절 세포에 대해, 매우 약한 IFNg 생성이 단백질만이 투여된 마우스의 군에서 얻어졌으며, 보조제가 사용된 단백질에서는 5 내지 10배 증가가 관찰되었다. IL5는 SBAS2 보조제에 함유된 단백질이 투여된 마우스의 군에서만 검출될 수 있었다.
도 36 및 37은 비장 또는 림프절 세포 각각의 생체외 재구성 후의 시토킨(IFNg 및 IL5)의 생성을 자극하는 ProtD1/3 18 E7 His의 능력을 비교한다.
항체 반응
각각의 혈청을 동시에 장기로서 취하여, 간접 ELISA를 수행하였다.
정제된 protD1/3 18E7 단백질 HPV18 2.5㎍/㎖을 코팅된 항원으로서 사용하였다. PBS + 1% 신생 우혈청 중에서 37℃에서 1시간 동안 포화시킨 후, 혈청을 포화 완충액 중에서 연속 희석시키고(1/100에서 출발), 4℃에서 밤새 또는 37℃에서 90분간 인큐베이팅시켰다. PBS Tween 20 0.1%로 세척시킨 후, 비오티닐화된 염소 안티 마우스 Ig (1/1000) 또는 염소 안티 마우스 Ig 서브클래스(전체 IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) 항혈청 (1/1000)을 제 2의 항체로서 사용하고, 37℃에서 90분 인큐베이팅시킨 후, 퍼옥시다아제에 커플링된 스트렙타비딘을 첨가하고, TMB(테트라-메틸-벤지딘/퍼옥시드)를 기질로서 사용하고, 10분 후, 반응을 H2SO40.5M로 중지시키고, O.D.450을 측정하였다.
매우 약한 항체 반응이 ProtD 1/3 18 E7만을 2회 주사시킴으로써 유도하였다. 전체 IgG 수준은 보조제를 단백질 백신에 첨가함으로써 크게 증가하였다.
다양한 IgG 서브클래스의 농도를 분석한 결과, 단백질이 보조제인 DQS21 3D-MPL 또는 SB62, QS21/3D-MPL의 존재하에 주사되는 경우, IgG2a 서브타입 백분율이, 보조제 없이 단백질 투여된 경우의 46% IgG1, 32% IgG2a와 비교하여, 각각 28% IgG1, 48% IgG2a 및 43% IgG1, 44% IgG2a로 약게 높게 수득됨을 나타내었다. 가장 강력한 항체 반응은 DQ 명반 중에 제형화된 단백질에 의해, 이소타입 농도의 명백한 시프트와 함께 수득되었다 (80% IgG1, 8% IgG2a). Balb/c 마우스 중의 IgG2a 이소타입이 면역 반응의 TH1 타입의 유도과 관련된 것으로 일반적으로 여겨지기 때문에, 이들 결과는 DQS21, 3D-MPL 및 SB62 QS21/3D-MPL 보조제가 체액성 반응의 TH1 타입 프로파일을 증가시키는 경향이 있는 반면에 SBAS5는 명백한 TH2 타입 반응을 유도시킴을 제시한다.
도 38. 혈청의 중간점 희석 및 다수의 마우스 군에서의 백신접종에 의해 유도된 다수의 이소타입의 상대적 백분율이 비교되어 있다.
결론:
본 발명자들은 융합 단백질인 1/3 Prot D과 HPV 16의 초기 단백질 E7이 효능있는 전신성 항종양 면역을 유도하며, 융합 단백질인 ProtD1/3과 HPV18의 E7이 마우스에서 면역원성인 것으로 또한 나타남을 입증하였다. prot D1/3 E7 HPV16 융합 단백질로 백신접종하면, 마우스를 E7 발현성 종양 세포에 의한 종양 공격으로부터 방어하며, 백신접종 부위로부터 떨어진 부위에 주사된 HPV16의 E7을 발현시키는 작은 예비형성된 종양을 제거시켰다.
본 발명자들은 보조제에 함유된 ProtD1/3 E7 HPV16 단백질이 헬퍼 T 세포 증식을 증강시킬 수 있으며, 이는 이러한 백신에 의해 유도된 항종양 면역 반응이 CD4+ T 세포 반응과 적어도 부분적으로 관련이 있음을 제시한다.
본 발명자들은 우수한 항체 반응이 3D-MPL 함유 보조제의 존재하에 ProtD1/3 E7로 백신접종시킴으로써 유도됨을 또한 입증하였다. C57BL/6 마우스의 혈청에서 발견된 우세한 이소타입은 IgG2b이었으며, 이는 TH1 타입 면역 반응이 유도됨을 제시한다.

Claims (23)

  1. 면역학적 융합 파트너에 결합된, E6 또는 E7 단백질 또는 E6/E7 융합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 융합 파트너가, 헤모필루스 인플루엔자 B로부터의 단백질 D 또는 이것의 단편, 헤모필루스 인플루엔자 B로부터의 지단백질 D 또는 이것의 단편, 인플루엔자 바이러스로부터의 NS1 또는 이것의 단편 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아로부터의 LYTA 또는 이것의 단편으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 단백질.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서, E6 또는 E7 단백질이 HPV16 또는 HPV18로부터 유도됨을 특징으로 하는 단백질.
  4. 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, E7 단백질이 변이됨을 특징으로 하는 단백질.
  5. 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, E6 단백질이 변이됨을 특징으로 하는 단백질.
  6. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 4개 이상의 히스티딘 잔기를 갖는 히스티딘 태그를 추가로 포함함을 특징으로 하는 단백질.
  7. 이종 단백질, 히스티딘 태그 및 C-LYTA 태그를 포함하는 융합 단백질.
  8. 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 코드화하는 DNA 서열.
  9. 제 1항 내지 7항에 따른 단백질과 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제를 함유하는 백신.
  10. 제 9항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 백신.
  11. 제 9항 또는 10항에 있어서, 단백질이 수중유 에멀션 비히클의 형태로 제공됨을 특징으로 하는 백신.
  12. 제 10항 또는 11항에 있어서, 보조제가 3D-MPL, QS21 또는 둘 모두를 포함함을 특징으로 하는 백신.
  13. 제 9항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 HPV 항원을 포함함을 특징으로 하는 백신.
  14. 제 9항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용됨을 특징으로 하는 백신.
  15. HPV 유도된 종양 병변(양성 또는 악성)에 걸린 환자의 면역치료용 백신을 제조하기 위한 제 1항 내지 7항에 따른 단백질의 용도.
  16. HPV 바이러스 감염 예방용 백신을 제조하기 위한 제 1항 내지 7항에 따른 단백질의 용도.
  17. 제 8항의 DNA 서열을 함유하는 벡터.
  18. 제 8항에 따른 DNA 서열과 티오레독신을 코드화하는 DNA 서열을 함유하는 벡터.
  19. 제 8항의 DNA 서열로 형질전환된 숙주.
  20. 제 17항 또는 18항의 벡터로 형질전환된 숙주.
  21. 제 19항에 있어서, 티오레독신을 코드화하는 DNA 서열로 추가로 형질전환된 숙주.
  22. 숙주 세포를 제 6항의 DNA 서열로 형질전환시키고, 이러한 서열을 발현시키고, 원하는 생성물을 단리시키는 것을 포함하여, 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 제조하는 방법.
  23. 제 1항 내지 7항에 따른 단백질을, 적합한 보조제, 희석제 또는 그 밖의 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합시키는 것을 포함하여, 제 9항 내지 13항 중 어느 한 항에 따른 백신을 제조하는 방법.
KR1020007001821A 1997-08-22 1998-08-17 Ｈｐｖ에 대한 백신 KR20010023193A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9717953.5 1997-08-22
GBGB9717953.5A GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-08-22 Vaccine
PCT/EP1998/005285 WO1999010375A2 (en) 1997-08-22 1998-08-17 Vaccine against hpv

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010023193A true KR20010023193A (ko) 2001-03-26

Family

ID=10817971

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020007001821A KR20010023193A (ko) 1997-08-22 1998-08-17 Ｈｐｖ에 대한 백신

Country Status (23)

Country Link
US (2) US6342224B1 (ko)
EP (1) EP1007551B1 (ko)
JP (1) JP2001513986A (ko)
KR (1) KR20010023193A (ko)
CN (1) CN1276833A (ko)
AT (1) ATE267211T1 (ko)
AU (1) AU732946B2 (ko)
BR (1) BR9812139A (ko)
CA (1) CA2301920C (ko)
CO (1) CO4810234A1 (ko)
DE (1) DE69824013T2 (ko)
ES (1) ES2221198T3 (ko)
GB (1) GB9717953D0 (ko)
HU (1) HUP0004327A3 (ko)
IL (1) IL134392A0 (ko)
MA (1) MA24638A1 (ko)
NO (1) NO20000850L (ko)
NZ (1) NZ502632A (ko)
PL (1) PL339009A1 (ko)
TR (1) TR200000480T2 (ko)
UY (1) UY25146A1 (ko)
WO (1) WO1999010375A2 (ko)
ZA (1) ZA987591B (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140131929A (ko) * 2012-01-24 2014-11-14 샌포드 리서치/유에스디 종양원성 바이러스성 폴리펩티드 양성 종양 치료용 폴리뉴클레오티드

Families Citing this family (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9706957D0 (en) 1997-04-05 1997-05-21 Smithkline Beecham Plc Formulation
NZ520579A (en) * 1997-10-24 2004-08-27 Invitrogen Corp Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites and methods for synthesizing double stranded nucleic acids
GB9820525D0 (en) 1998-09-21 1998-11-11 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
NZ511055A (en) 1998-10-05 2003-10-31 Pharmexa As Novel methods for therapeutic vaccination
SI1117421T1 (en) * 1998-10-05 2004-12-31 Pharamexa A/S Methods for therapeutic vaccination
DE69935606T9 (de) 1998-10-16 2021-03-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adjuvanzsysteme und impfstoffe
GEP20053446B (en) * 1999-05-13 2005-02-25 Wyeth Corp Adjuvant Combination Formulations
GB9921146D0 (en) * 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
GB0000891D0 (en) 2000-01-14 2000-03-08 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
US7015033B1 (en) 2000-05-25 2006-03-21 Aventis Pasteur Limited Co-expression of recombination proteins
AU2001272491A1 (en) * 2000-06-26 2002-01-08 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Triple fusion proteins comprising ubiquitin fused between thioredoxin and a polypeptide of interest
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
ATE354662T1 (de) * 2001-03-23 2007-03-15 Deutsches Krebsforsch Modifizierte hpv e6- und e7-gene und -proteine als impfstoff
CA2472055A1 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Improved mucosal vaccines and methods for using the same
US6861410B1 (en) * 2002-03-21 2005-03-01 Chiron Corporation Immunological adjuvant compositions
FR2839072A1 (fr) 2002-04-24 2003-10-31 Neovacs Produit d'expression d'un adn codant une proteine e7 mutee de hpv-16, composition immunogene contenant ledit produit d'expression et son procede de preparation
FR2839080B1 (fr) * 2003-04-03 2007-09-28 Neovacs Procede de preparation d'un produit d'expression d'un adn codant une proteine e7 mutee de hpv-16, par des cellules de la levure pichia pastoris
US20040009944A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
US20040013649A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-22 Inex Pharmaceuticals Corporation Cancer vaccines and methods of using the same
WO2004009768A2 (en) * 2002-07-18 2004-01-29 Invitrogen Corporation Viral vectors containing recombination sites
SI2255826T1 (sl) 2002-08-02 2016-07-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Neisserijski vakcinski sestavki, ki obsegajo kombinacijo antigenov
CA2496409A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-11 Glaxo Group Limited Immunogenic composition comprising an il-13 element and t cell epitopes, and its therapeutic use
CN1720060B (zh) * 2002-10-03 2011-12-14 惠氏控股公司 人乳头瘤病毒多肽和免疫原性组合物
ES2649048T3 (es) 2002-11-01 2018-01-09 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Procedimiento de secado
CN100443116C (zh) * 2002-11-07 2008-12-17 新纳几美国公司 治疗或预防肺炎球菌感染的组合物及其用途
KR101080628B1 (ko) * 2003-03-24 2011-11-08 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 효모에서 ｈｐｖ 31 ｌ1의 최적 발현
CZ297389B6 (cs) * 2003-07-03 2006-11-15 Ústav Molekulární Biologie Rostlin Av Cr Fúzní protein pro vakcinaci proti lidskému papillomaviru a zpusob jeho produkce
DE602004028262D1 (de) 2003-10-02 2010-09-02 Glaxosmithkline Biolog Sa B. pertussis antigene und ihre verwendung bei der vakzinierung
WO2005054438A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Invitrogen Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
CA2552508A1 (en) * 2003-12-31 2005-09-29 Pharmexa Inc. Inducing cellular immune responses to human papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions
US10941353B2 (en) * 2004-04-28 2021-03-09 Hydrocarbon Technology & Innovation, Llc Methods and mixing systems for introducing catalyst precursor into heavy oil feedstock
CA2564346C (en) 2004-04-28 2016-03-22 Headwaters Heavy Oil, Llc Ebullated bed hydroprocessing methods and systems and methods of upgrading an existing ebullated bed system
CN1950483A (zh) * 2004-04-28 2007-04-18 上游重油有限公司 固定床加氢处理法和系统，以及用来升级已有固定床系统的方法
GB0427131D0 (en) * 2004-12-10 2005-01-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel combination
GB0505996D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
NZ564606A (en) 2005-06-27 2010-10-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition comprising atleast two N. meningitidis capsular polysaccharides conjugated through a linker protein
US7732166B2 (en) * 2005-11-15 2010-06-08 Oncohealth Corporation Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
CA2659262C (en) 2006-07-28 2017-01-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved hpv vaccines and methods for using the same
WO2008031020A2 (en) * 2006-09-08 2008-03-13 Wyeth Arginine wash in protein purification using affinity chromatography
CN101516396B (zh) 2006-09-26 2013-10-09 传染性疾病研究院 包含合成佐剂的疫苗组合物
PL2086582T3 (pl) 2006-10-12 2013-04-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Kompozycja zawierająca adiuwant w postaci emulsji typu olej w wodzie
MX2009003325A (es) 2006-10-12 2009-04-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna que comprende un adyuvante de emulsion de aceite en agua.
US8968995B2 (en) 2008-11-12 2015-03-03 Oncohealth Corp. Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers
US20100003704A1 (en) 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
MY153679A (en) * 2007-01-15 2015-03-13 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US8034232B2 (en) * 2007-10-31 2011-10-11 Headwaters Technology Innovation, Llc Methods for increasing catalyst concentration in heavy oil and/or coal resid hydrocracker
TWI376385B (en) 2007-12-07 2012-11-11 Nat Health Research Institutes Production of lipidated proteins in e. coli
US8466259B2 (en) 2007-12-07 2013-06-18 National Health Research Institutes Adjuvants
US8142645B2 (en) * 2008-01-03 2012-03-27 Headwaters Technology Innovation, Llc Process for increasing the mono-aromatic content of polynuclear-aromatic-containing feedstocks
PE20142330A1 (es) 2008-12-09 2015-01-14 Pfizer Vaccines Llc Vacuna de peptido ch3 de ige
CA2653478A1 (en) * 2009-01-23 2010-07-23 Gregg Martin Automated wash system for industrial vehicles
JP2012526286A (ja) 2009-05-07 2012-10-25 オンコヘルス コーポレーション ヒトパピローマウイルス（ｈｐｖ）およびｈｐｖ関連癌の初期段階および後期段階の検出、スクリーニング、および診断のための高度または≧ｃｉｎ２の同定
US8287880B2 (en) 2009-06-02 2012-10-16 National Health Research Institutes Lipidated vaccine against dengue virus infection
US8722064B2 (en) 2009-06-05 2014-05-13 Infectious Disease Research Institute Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants
EP2445927B1 (en) * 2009-06-22 2014-04-23 National Health Research Institutes Lipidated tumor- associated antigens and immunotherapeutic compositions
WO2011013034A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Pfizer Vaccines Llc Antigenic tau peptides and uses thereof
AR074485A1 (es) * 2009-12-04 2011-01-19 Consejo Nac Invest Cient Tec Vacuna contra lesiones neoplasicas o cancerosas causadas por el virus del papiloma humano (vph), procedimientos, usos y metodos
CN102822672B (zh) 2010-01-08 2015-12-09 安科健康公司 用于诊断和筛选与hpv有关的癌症的高通量细胞基hpv免疫测定
JP2013521770A (ja) 2010-03-10 2013-06-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン組成物
WO2011154878A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Vaccines Llc Ige ch3 peptide vaccine
US9000139B2 (en) 2010-08-13 2015-04-07 Genexine, Inc. Composition for preventing or treating cervical cancer having human papillomavirus plasmodium and immunity enhancer
GB201015132D0 (en) 2010-09-10 2010-10-27 Univ Bristol Vaccine composition
TW201221642A (en) 2010-11-15 2012-06-01 Nat Health Research Institutes Method of producing lipidated polypeptides
TWI507413B (zh) 2010-11-15 2015-11-11 Nat Health Research Institutes 脂質化多抗原表位疫苗
EP3632463A1 (en) 2011-04-08 2020-04-08 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
US9790440B2 (en) 2011-09-23 2017-10-17 Headwaters Technology Innovation Group, Inc. Methods for increasing catalyst concentration in heavy oil and/or coal resid hydrocracker
PL2811981T3 (pl) 2012-02-07 2019-09-30 Infectious Disease Research Institute Ulepszone formulacje adiuwantowe zawierające agonistę TLR4 oraz sposoby ich zastosowania
NZ701881A (en) 2012-05-16 2016-10-28 Immune Design Corp Vaccines for hsv-2
US9644157B2 (en) 2012-07-30 2017-05-09 Headwaters Heavy Oil, Llc Methods and systems for upgrading heavy oil using catalytic hydrocracking and thermal coking
JP6517779B2 (ja) 2013-03-12 2019-05-22 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ヒトパピローマウイルスの改良型ワクチンおよびその使用方法
EP3711768A1 (en) 2013-04-18 2020-09-23 Immune Design Corp. Gla monotherapy for use in cancer treatment
US9463198B2 (en) 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
EP3915579A1 (en) 2013-12-31 2021-12-01 Infectious Disease Research Institute Single vial vaccine formulations
CN103772508B (zh) * 2014-01-15 2017-05-10 深圳泰来生物医药有限公司 免疫增强的人乳头瘤病毒感染及相关疾病的治疗性疫苗
EP3193905B1 (en) 2014-08-15 2024-04-03 Genexine, Inc. Compositions for use in treating cervical cancer
CA2963148C (en) 2014-10-28 2024-04-30 Agrivida, Inc. Methods and compositions for stabilizing trans-splicing intein modified proteases
WO2016090540A1 (zh) * 2014-12-08 2016-06-16 刘日廷 人乳头瘤病毒(hpv)18型致癌性e6和e7蛋白的抗原表位最小基序肽
JP5973007B2 (ja) * 2015-01-30 2016-08-17 ジェネクサイン・インコーポレーテッド ヒトパピローマウイルス変形体及び免疫増強剤を含む子宮頸癌の予防または治療用組成物
US11414608B2 (en) 2015-09-22 2022-08-16 Hydrocarbon Technology & Innovation, Llc Upgraded ebullated bed reactor used with opportunity feedstocks
US11414607B2 (en) 2015-09-22 2022-08-16 Hydrocarbon Technology & Innovation, Llc Upgraded ebullated bed reactor with increased production rate of converted products
TWI670280B (zh) * 2016-02-23 2019-09-01 財團法人國家衛生研究院 人類乳突病毒之脂質抗原及用於人類乳突病毒相關疾病之免疫治療組合物
MX2018013640A (es) 2016-05-16 2019-08-01 Infectious Disease Res Inst Liposomas pegiladas y metodos de uso.
US11421164B2 (en) 2016-06-08 2022-08-23 Hydrocarbon Technology & Innovation, Llc Dual catalyst system for ebullated bed upgrading to produce improved quality vacuum residue product
KR102505534B1 (ko) 2017-03-02 2023-03-02 하이드로카본 테크놀로지 앤 이노베이션, 엘엘씨 오염 침전물이 적은 업그레이드된 에뷸레이티드 베드 반응기
US11732203B2 (en) 2017-03-02 2023-08-22 Hydrocarbon Technology & Innovation, Llc Ebullated bed reactor upgraded to produce sediment that causes less equipment fouling
US11141377B2 (en) 2017-06-15 2021-10-12 Infectious Disease Research Institute Nanostructured lipid carriers and stable emulsions and uses thereof
CA3057131C (en) 2018-10-17 2024-04-23 Hydrocarbon Technology And Innovation, Llc Upgraded ebullated bed reactor with no recycle buildup of asphaltenes in vacuum bottoms
JP7460094B2 (ja) 2020-04-24 2024-04-02 ジェネクシン・インコーポレイテッド 子宮頸がんの治療方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2586428B1 (fr) * 1985-08-26 1988-11-25 Pasteur Institut Polypeptides et anticorps, caracteristiques du papillomavirus et leurs applications au diagnostic in vitro, a la prevention et/ou la lutte contre des infections a papillomavirus
DE3907721A1 (de) * 1989-03-10 1990-09-20 Behringwerke Ag Immunogene regionen auf dem e7-protein des humanen papillomvierus typ 16
DE4015044A1 (de) 1990-05-10 1991-11-14 Behringwerke Ag Seroreaktive epitope auf proteinen des menschlichen papillomavirus (hpv) 18
AU8762991A (en) 1990-09-26 1992-04-15 Bristol-Myers Squibb Company Human papilloma viral protein expression for use in vaccine compositions
IL105554A (en) * 1992-05-05 1999-08-17 Univ Leiden Peptides of human papillomavirus for use in preparations elicit a human T cell response
US5869445A (en) * 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
DE4441197C1 (de) * 1994-11-18 1996-03-28 Deutsches Krebsforsch Expressionsplasmide für Hefe
AUPN015794A0 (en) * 1994-12-20 1995-01-19 Csl Limited Variants of human papilloma virus antigens
AU4727296A (en) * 1995-02-24 1996-09-11 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
US5843752A (en) 1995-05-12 1998-12-01 Schering Corporation Soluble active hepatitis C virus protease
US6224870B1 (en) * 1997-01-24 2001-05-01 Genitrix, Ltd. Vaccine compositions and methods of modulating immune responses
US5958750A (en) * 1996-07-03 1999-09-28 Inctye Pharmaceuticals, Inc. Human hyaluronidase

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140131929A (ko) * 2012-01-24 2014-11-14 샌포드 리서치/유에스디 종양원성 바이러스성 폴리펩티드 양성 종양 치료용 폴리뉴클레오티드

Also Published As

Publication number Publication date
DE69824013T2 (de) 2005-06-02
IL134392A0 (en) 2001-04-30
HUP0004327A1 (en) 2001-03-28
ES2221198T3 (es) 2004-12-16
WO1999010375A3 (en) 1999-06-10
US6342224B1 (en) 2002-01-29
EP1007551B1 (en) 2004-05-19
AU732946B2 (en) 2001-05-03
CN1276833A (zh) 2000-12-13
UY25146A1 (es) 2000-12-29
JP2001513986A (ja) 2001-09-11
CO4810234A1 (es) 1999-06-30
DE69824013D1 (de) 2004-06-24
AU9263998A (en) 1999-03-16
NO20000850D0 (no) 2000-02-21
CA2301920A1 (en) 1999-03-04
MA24638A1 (fr) 1999-04-01
GB9717953D0 (en) 1997-10-29
US20020182221A1 (en) 2002-12-05
ATE267211T1 (de) 2004-06-15
HUP0004327A3 (en) 2003-08-28
TR200000480T2 (tr) 2000-07-21
CA2301920C (en) 2011-01-04
NZ502632A (en) 2002-03-28
ZA987591B (en) 2000-02-21
BR9812139A (pt) 2000-07-18
WO1999010375A2 (en) 1999-03-04
PL339009A1 (en) 2000-12-04
EP1007551A2 (en) 2000-06-14
NO20000850L (no) 2000-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20010023193A (ko) Ｈｐｖ에 대한 백신
JP3863559B2 (ja) 乳頭腫ウィルスワクチン
KR100824105B1 (ko) 백신접종을 위한 융합 단백질 및 조성물의 제조를 위해사용되는 ｍａｇｅ 군으로부터의 종양 관련 항원 유도체 및이들을 암호화하고 있는 핵산 서열
AU729336B2 (en) Vaccine
FERNANDO et al. Expression, purification and immunological characterization of the transforming protein E7, from cervical cancer‐associated human papillomavirus type 16
US20050031638A1 (en) Vaccine
JPH11510688A (ja) パピローマウイルスのポリプロテイン構築物
JPH11502415A (ja) モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）の高分子量主要外膜タンパク
WO2017092710A1 (zh) 一种人乳头瘤病毒58型l1蛋白的突变体
RU2161651C2 (ru) Очищенные белки вируса папилломы
US5888516A (en) Recombinant papillomavirus vaccines
CN109251235B (zh) 一种人乳头瘤病毒16型l1蛋白的突变体
WO2019233412A1 (zh) 一种人乳头瘤病毒18型l1蛋白的突变体
MXPA00001813A (en) Vaccine
CZ2000634A3 (cs) Vakcína
CA2204266C (en) Purified papillomavirus proteins
KR100394454B1 (ko) 트랜스페린수용체유전자들
MXPA00006323A (en) Human papillomavirus vaccine
JPH11506335A (ja) トランスフェリン受容体遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid