JP5973007B2

JP5973007B2 - ヒトパピローマウイルス変形体及び免疫増強剤を含む子宮頸癌の予防または治療用組成物

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Publication number: JP5973007B2
Application number: JP2015016637A
Authority: JP
Inventors: ユン・チュル・スン; サン・ホワン・セオ; ヨウ・スク・ス
Original assignee: ジェネクサイン・インコーポレーテッド
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2030-08-13
Also published as: JP2015091874A

Description

本発明は、ヒトパピローマウイルス変形体及び免疫増強剤を含む子宮頸癌の予防または治療用組成物に関し、より詳細には、ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）のタイプ１６及び１８の抗原であるＥ６及びＥ７の３次元構造が変形されるように組換えられた融合ポリペプチド、これを細胞外に分泌させるためのシグナルペプチド及び個体内免疫増強ペプチドを含む融合タンパク質は、ＨＰＶタイプ１６及び１８抗原特異的免疫反応を誘導し、ＨＰＶによって誘発される腫瘍を治療することができる。

子宮頸癌（ｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ）は、ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；ＨＰＶ）のうちタイプ１６と１８など高危険性ヒトパピローマウイルスの感染によって発生する疾患と知られている（ｚｕｒＨａｕｓｅｎ、Ｈｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１９９６、１２８８；Ｆ５５−Ｆ７８、ＭａｒｋＨｅｔａｌ．ＪＮａｔｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ１９９３、８５；９５８−９６４）。ＨＰＶタンパク質のうちＥ６とＥ７タンパク質が子宮頸癌の発生に主な役目をし、子宮頸癌患者の腫瘍組職で９９％発現されることが確認され、子宮頸癌の治療及び予防ワクチンを製造する主な目標物質である（ｖｏｎＫｎｅｂｅｌＤｏｅｂｅｒｉｔｚｅｔａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ１９９２、５１；８３１−８３４）。Ｅ６の場合、腫瘍抑制タンパク質として知られたｐ５３と結合し、ｐ５３の分解を促進させて、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）経路に細胞周期が進行されることを妨害し、Ｅ７は、腫瘍抑制因子網膜芽細胞腫タンパク質であるｐＲｂに結合し、これを不活性化させ、分解を促進させて、細胞周期がＳ期に進行されるようにする（Ｃｏｂｒｉｎｉｋｅｔａｌ．、ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍＳｃｉ１９９２、１７：３１２−５）。

しかしながら、子宮頸癌の治療のためにＨＰＶ１６Ｅ６とＥ７タンパク質を同時発現する核酸塩基配列組成物を使用した臨床実験でその治療効果が僅かであった（ＧａｒｃｉａＦｅｔａｌ．ＯｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌ２００４、１０３；３１７−３２６）。その結果は、単純にＨＰＶ抗原だけを投与することでは、子宮頸癌を治療または抑制する程度の抗原特異的免疫反応が生成されないことを意味する。

したがって、子宮頸癌の治療のためには、Ｅ６及びＥ７の免疫原性を増強させ、上記タンパク質自体の発癌生成能力を除去する戦略が必須である。

ｚｕｒＨａｕｓｅｎ、Ｈｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１９９６、１２８８；Ｆ５５−Ｆ７８ＧａｒｃｉａＦｅｔａｌ．ＯｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌ２００４、１０３；３１７−３２６

本発明の目的は、ＨＰＶによって惹起される疾患を予防または治療するにあたって、ＨＰＶのＥ６及びＥ７タンパク質自体の発癌能力を抑制しながらも、免疫原性が増強された新規な融合タンパク質及びこれをコーディングするポリヌクレオチドを提供することにある。

本発明の他の目的は、上記融合タンパク質を発現する組換えベクター、上記ベクターを含む宿主細胞及び上記宿主細胞を利用してタンパク質を発現する方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、上記融合タンパク質を利用したＨＰＶによって惹起される疾患の予防または治療用組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、上記組成物を利用してＨＰＶによって惹起される疾患を予防または治療する方法を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明は、
ヒトパピローマウイルスタイプ１６及び１８由来の、配列リスト配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する、Ｅ６及びＥ７の３次元構造が変形された融合ポリペプチドと；
上記ポリペプチドの分泌のためのシグナルペプチドと；
免疫増強ペプチドと；を含む融合タンパク質を提供する。

本発明は、また、本発明の融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。

本発明は、また、本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。

本発明は、また、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。

本発明は、また、本発明の形質転換宿主細胞を培養し、本発明の融合タンパク質を発現する方法を提供する。

本発明は、また、本発明の融合タンパク質、上記タンパク質を発現する組換えベクターで形質転換された宿主細胞及びその破砕物よりなる群から選択された１つ以上を有効成分として含む、個体でヒトパピローマウイルスによって惹起される疾患の予防または治療用組成物を提供する。

本発明は、また、有効量の本発明の組成物を個体に投与する段階を含む、個体でヒトパピローマウイルスによって惹起される疾患の予防または治療する方法を提供する。

本発明のＨＰＶタイプ１６及び１８由来のＥ６及びＥ７タンパク質の３次元構造が変形されるように組換えられた融合タンパク質、これを細胞外に分泌するためのシグナルペプチド及び個体内免疫増強ペプチドを含むように製造された融合タンパク質は、高いＨＰＶタイプ１６及び１８抗原特異的免疫反応を誘導し、ＨＰＶによって誘発される腫瘍を治療することができる。

抗癌治療モデルでネズミＣ５７ＢＬ／６に腫瘍細胞株であるＴＣ−１を皮下注入した後、本発明のＧＸ−１８８Ｅの治療を通じて現れるＨＰＶ１６Ｅ６特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞反応を示すグラフである。抗癌治療モデルでネズミＣ５７ＢＬ／６に腫瘍細胞株であるＴＣ−１を皮下注入した後、本発明のＧＸ−１８８Ｅの治療を通じて現れるＨＰＶ１６Ｅ７特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞反応を示すグラフである。抗癌治療モデルでネズミＣ５７ＢＬ／６に腫瘍細胞株であるＴＣ−１を皮下注入した後、本発明のＧＸ−１８８Ｅの治療を通じて現れるＨＰＶ１８Ｅ６特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞反応を示すグラフである。抗癌治療モデルでネズミＣ５７ＢＬ／６に腫瘍細胞株であるＴＣ−１を皮下注入した後、本発明のＧＸ−１８８Ｅの治療を通じて現れるＨＰＶ１８Ｅ７特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞反応を示すグラフである。抗癌治療モデルでネズミＣ５７ＢＬ／６に腫瘍細胞株であるＴＣ−１を皮下注入した後、本発明のＧＸ−１８８Ｅの治療を通じて現れる抗癌効果を示すグラフである。

以下、本発明の構成を具体的に説明する。
本発明は、ヒトパピローマウイルスタイプ１６及び１８由来の、配列リスト配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するＥ６及びＥ７の３次元構造が変形された融合ポリペプチドと；
上記ポリペプチドの分泌のためのシグナルペプチドと；
免疫増強ペプチドと；を含む融合タンパク質に関する。

本発明の融合タンパク質は、ヒトパピローマウイルスタイプ１６及び１８由来のＥ６及びＥ７の３次元構造が変形されるように組換えられた融合ポリペプチドを含むことができる。さらに具体的に、上記融合ポリペプチドは、ヒトパピローマウイルスタイプ１６由来のＥ６タンパク質のアミノ酸１番から８５番、Ｅ７タンパク質のアミノ酸１番から６５番、Ｅ６タンパク質のアミノ酸７１番から１５８番、Ｅ７タンパク質のアミノ酸５１番から９８番、ヒトパピローマウイルスタイプ１８由来のＥ６タンパク質のアミノ酸１番から８５番、Ｅ７タンパク質のアミノ酸１番から６５番、Ｅ６タンパク質のアミノ酸７１番から１５８番、Ｅ７タンパク質のアミノ酸５１番から１０５番が結合された融合ポリペプチドである。

最も具体的には、融合ポリペプチドは、配列リストの配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有することができる。

また、上記シグナルペプチドは、約２０〜３０個のアミノ酸を含むペプチドであって、細胞内で発現されたタンパク質、特にＥ６とＥ７融合ポリペプチドを含むタンパク質を細胞外に分泌させるペプチドを言う。また、これをコーディングする核酸配列を「分泌シグナル配列」という。本発明のＥ６及びＥ７融合ポリペプチドは、ウイルスに感染された細胞の核内で発現されるタンパク質（ｎｕｃｌｅｕｓｐｒｏｔｅｉｎ）なので、自体的な兔疫性が弱い。これより、分泌シグナル配列によって発現されたシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ）は、３次元構造が変形されたＥ６及びＥ７抗原の細胞外への分泌を誘導することによって、抗原特異的体液性免疫反応（ｈｕｍｏｒａｌｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ）及び細胞性免疫反応（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅ）の増加をもたらすことができる。

上記シグナルペプチドは、哺乳動物などを含む高等真核細胞で使用されるシグナルペプチドを使用することができ、例えば、ｔＰＡ、ＨＳＶｇＤｓ、または成長ホルモンの分泌シグナル配列などを使用することができる。さらに好ましくは、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を使用することができる。最も好ましくは、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有することができる。

また、免疫増強ペプチドは、免疫反応に関係する細胞（例えば、樹枝状細胞など）を活性化させて、免疫反応を増加させるペプチドを言う。

上記免疫増強ペプチドとして、ＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド（ｆｍｓ−ｌｉｋｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ３ｌｉｇａｎｄ）、フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、またはＯＸ４０などを使用することができる。さらに好ましくは、Ｆｌｔ３リガンドを使用することができる。上記Ｆｌｔ３リガンドは、樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ、ＤＣ）の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）と成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を誘導する因子（ｆａｃｔｏｒ）であって、抗原による免疫反応を増加させ、腫瘍抗原と融合された状態で優れた腫瘍減少効果を示すことができる。最も好ましくは、上記Ｆｌｔ３リガンドは、配列番号３に記載されたアミノ酸配列を有することができる。

本発明は、また、本発明の融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドに関する。
上記ポリヌクレオチドは、本発明の融合タンパク質をコーディングするもので、上記Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドは、配列番号４に記載された塩基配列からコーディングされることができるが、これに特に限定されない。また、上記シグナルペプチドは、配列番号５に記載された塩基配列からコーディングされることができるが、これに特に制限されない。上記免疫増強ペプチドは、配列番号６に記載された塩基配列からコーディングされることができるが、これに特に限定されない。

また、本発明のポリヌクレオチドは、化学的合成法または遺伝子操作技術によって製造されることができる。化学的合成法は、当業者によく知られており、任意の方法が使用されることができる。また、商業的核酸合成及び提供社によって依頼して購入することもできる。遺伝子操作技術によって製造する場合、例えば、従来に知られたＥ６及びＥ７の融合ポリペプチド、シグナルペプチド及び免疫増強ペプチドをコーディングする核酸断片をそれぞれ得、これら断片をフレームに合わせて連結することによって製作することができる。上記核酸断片を得る方法は、当業界によく知られており、当業者なら適切な制限酵素を利用して容易に連結することができる。本発明の具体的実施では、化学的合成法によって製造する方法が開示されている。

本発明は、また、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。
本発明において、「ベクター」というのは、ポリペプチドを暗号化するゲノム内に挿入された外部ＤＮＡを含む遺伝子作製物を言う。本発明と関連したベクターは、分泌シグナル配列、ヒトパピローマウイルスの３次元構造が変形されたＥ６とＥ７融合ポリペプチドをコーディングする核酸配列及び免疫増強ペプチドをコーディングする核酸配列などがゲノム内に挿入されたベクターであって、これらベクターは、プラスミドベクター、コズミドベクター、バクテリオファージベクター、酵母ベクター、またはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ−連関ウイルスベクターのようなウイルスベクターを例示することができる。

上記分泌シグナル配列は、細胞内で発現された腫瘍抗原を細胞外に分泌し、免疫細胞が認識することができるようにするペプチドを暗号化している核酸配列であって、例えばｔＰＡ、ＨＳＶｇＤｓ、または成長ホルモンの分泌シグナル配列などがある。好ましくは、哺乳動物などを含む高等真核細胞で使用される分泌シグナル配列を使用することができ、さらに好ましくは、ｔＰＡ（ｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を使用することができる。最も好ましくは、配列番号５に記載された塩基配列を有することができる。また、本発明の分泌シグナル配列は、宿主細胞で発現頻度が高いコドンに置換して使用することができる。

また、上記免疫増強ペプチドをコーディングする核酸配列は、免疫反応に関係する細胞（例えば、樹枝状細胞など）を活性化させて、免疫反応を増加させるペプチドをコーディングする核酸配列を言う。上記免疫増強ペプチドとして、ＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、またはＯＸ４０などを使用することができる。さらに好ましくは、免疫増強ペプチドとして、Ｆｌｔ３リガンドを使用することができる。また、本発明の免疫増強ペプチドをコーディングする核酸配列は、宿主細胞で発現頻度が高いコドンに置換して使用することができる。

また、本発明の組換えベクターに含まれる上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞で発現頻度が高いコドンに置換されることができる。本発明において使用された「宿主細胞で発現頻度が高いコドンに置換されたもの」または「コドン最適化」というのは、宿主細胞内でＤＮＡがタンパク質に転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）及び翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）されるとき、アミノ酸を指令するコドンの間に宿主によって選好度の高いコドンが存在するが、これら選好度が高いコドンに置換することによって、該核酸が暗号化するアミノ酸またはタンパク質の発現効率を増加させることを言う。

ここで、「宿主細胞」というのは、原核または真核細胞を含み、真核細胞は、真菌、酵母などを含む下等真核細胞だけでなく、哺乳動物などを含む高等真核細胞を含む。

本発明の組換えベクターは、宿主細胞で本発明の融合タンパク質をコーディングする核酸の発現に適した形態で上記融合タンパク質をコーディングする核酸を含むことができる。すなわち、本発明の組換えベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含み、これらは、発現される核酸配列と作動可能に連結されている。

「作動可能に連結されている」というのは、目的とするヌクレオチド配列（例えば、インビトロ転写／翻訳システムでまたは宿主細胞で）が、その発現が成り立つことができるようにする方式で上記調節配列に連結されていることを意味する。

「調節配列」という用語は、プロモータ、エンハンサー及び他の調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む意味である。調節配列には、多くの宿主細胞で目的とする核酸が構成的に発現され得るように指示すること及び特定の宿主細胞だけで目的とする核酸が発現され得るように指示すること（例えば、組職特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択及び所望のタンパク質発現の水準などのような因子によって変わることができることは、当業者なら理解することができる。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、上記融合タンパク質を発現することができる。

また、本発明のベクターは、例えば、標準組換えＤＮＡ技術によって製造されることができ、標準組換えＤＮＡ技術には、例えば、平滑末端及び接着末端ライゲイション、適切な末端を提供するための制限酵素処理、不適合な結合を防止するためにアルカリホスファターゼ処理によるリン酸基の除去及びＴ４ＤＮＡライゲースによる酵素的連結などが含まれる。化学的合成または遺伝子組換え技術によって得られたシグナルペプチドをコーディングするＤＮＡ、ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７の融合ポリペプチドをコーディングするＤＮＡ及び免疫増強ペプチドをコーディングするＤＮＡを適切な調節配列が含まれているベクターに組換えすることによって、本発明のベクターが製造されることができる。上記調節配列が含まれているベクターは、商業的に購入または製造することができ、本発明では、ＤＮＡワクチン製造用ベクターであるｐＧＸ２７を製造して使用した。

１つの様態として、本発明の組換えベクターは、本発明の融合タンパク質を生産するための細胞を製造する用途、遺伝子治療において遺伝子伝達のためのベクターまたはそれ自体として個体内に投与される薬剤学的活性成分として使用されることができる。

本発明は、また、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
上記宿主細胞の種類は、前述した通りである。

形質転換は、核酸を有機体、細胞、組職または器官に導入する公知の方法を使用することができ、当業者水準で理解され得る範囲内で宿主細胞によって適合な使用可能な技術を選択して行うことができる。このような方法には、電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）沈殿、シリコンカーバイド繊維を用いた撹拌、アグロバクテリア媒介された形質転換、ＰＥＧ、デキストラン硫酸、リポフェクタミンなどが含まれるが、これに限定されない。

本発明は、また、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、本発明の融合タンパク質を発現する方法に関する。

本発明の融合タンパク質は、形質転換宿主細胞を適切な培地で培養するか、または上記形質転換宿主細胞を任意の動物に導入した後、生体内で培養することによって、容易に発現及び大量生産することができる。

本発明は、また、本発明の融合タンパク質、上記タンパク質を発現する組換えベクターで形質転換された宿主細胞及びその破砕物よりなる群から選択された１つ以上を有効成分として含む、個体でヒトパピローマウイルスによって惹起される疾患の予防または治療用組成物に関する。

本発明において「個体」は、ヒト、猿、マウス、豚、牛及び兎などの哺乳動物を含むが、これらの例に限定されるものではない。

また、上記ウイルスによって誘発される疾患は、子宮頸癌、コンジローム、ほくろなどが含まれることができる。

また、本発明の組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含むことができる。上記担体には、乳糖、葡萄糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微細結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及びミネラルオイルなどが含まれる。上記組成物には、また、潤滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤及び防腐剤などがさらに含まれることができる。

本発明の組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、経口、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、粘膜、鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ）、器官内（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ）または皮下投与のような、任意の手段によって個体に直接的に投与されることができるが、これら方法に限定されるものではない。本発明の組成物は、インビトロで培養された細胞に投与され、上記培養された細胞を体内に投与することによって間接的に個体内に投与されることができる。本発明の組成物は、全身的にまたは局所的に投与されることができる。

本発明の組成物は、顆粒剤、散剤、液剤、錠剤、カプセル剤、または乾燥シロップ剤などの経口用製剤または注射剤などの非経口用剤形で製剤化することができるが、このような剤形に限定されるものではない。好ましくは、本発明の組成物は、液剤または注射剤の形態であることができる。

活性成分として、本発明の融合タンパク質、または組換え発現ベクターの効果的な量は、約０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であることができ、単一投与量及び配分された投与量で考慮されることができる。しかし、投与される活性成分の量は、治療される条件、患者の年齢及び体重、症状の軽重のような多様な因子を考慮して決定しなければならないので、前述した範囲に限定されるものではない。

本発明は、また、有効量の本発明の組成物を個体に投与する段階を含む、個体でヒトパピローマウイルスによって惹起される疾患の予防または治療する方法に関する。

本発明の薬剤学的組成物、その効能、投与方法及び投与量などに関する内容は、前述した通りである。

本発明の方法において、個体は、ヒト、猿、マウス、豚、牛及び兎などの哺乳動物を含むが、これら例に限定されるものではない。

また、上記ウイルスによって誘発される疾患は、子宮頸癌、コンジローム、ほくろなどを含むことができる。

以下、本発明による実施例及び本発明によらない比較例を通じて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲が下記提示された実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞ＧＸ−１８８ＥＤＮＡの構成
本発明の実施例において使用された略語は、次のように定義する。最適化された核酸配列、「ｔＰａ」または「ｔ」は、組職プラスミノゲン活性剤（ｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ）の分泌シグナル配列（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｓｉｇｎａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ）、「Ｆ」または「Ｆｌｔ３Ｌ」は、ｆｍｓ−ｌｉｋｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ３リガンドを意味する。

配列番号５の核酸配列を有するコドン最適化されたｔＰａ分泌シグナル配列と配列番号６の核酸配列を有するコドン最適化されたＦｌｔ３Ｌは、連結された形態で化学的に合成した。ベクターに挿入することを容易にするために末端にＫｐｎＩ（５’）、ＮｈｅＩ（３’）サイトを添加した。ＤＮＡワクチン製造用ベクターであるｐＧＸ１０（大韓民国特許公開２００３−００４７６６７号）をＫｐｎＩとＮｈｅＩ制限酵素で処理した後、合成したｔＰａ−Ｆｌｔ３Ｌをリガーゼで連結し、ｐＧＸ１０／ｔＦを製作した。

ＨＰＶ１６Ｅ６の１番アミノ酸から８５番アミノ酸を暗号化するコドン最適化された核酸配列、ＨＰＶ１６Ｅ７の１番アミノ酸から６５番アミノ酸を暗号化するコドン最適化された核酸配列、ＨＰＶ１６Ｅ６の７１番アミノ酸から１５８番アミノ酸を暗号化するコドン最適化された核酸配列、ＨＰＶ１６Ｅ７の５１番アミノ酸から９８番アミノ酸を暗号化するコドン最適化された核酸配列、ＨＰＶ１８Ｅ６の１番アミノ酸から８５番アミノ酸を暗号化するコドン最適化された核酸配列、ＨＰＶ１８Ｅ７の１番アミノ酸から６５番アミノ酸を暗号化するコドン最適化された核酸配列、ＨＰＶ１８Ｅ６の７１番アミノ酸から１５８番アミノ酸を暗号化するコドン最適化された核酸配列、ＨＰＶ１８Ｅ７の５１番アミノ酸から１０５番アミノ酸を暗号化するコドン最適化された核酸配列を連結された形態で化学的に合成した（以下、１６Ｅ６Ｎ１６Ｅ７Ｎ１６Ｅ６Ｃ１６Ｅ７Ｃ１８Ｅ６Ｎ１８Ｅ７Ｎ１８Ｅ６Ｃ１８Ｅ７Ｃ：配列番号４）。ベクターに挿入することを容易にするために、末端にＮｈｅＩ（５’）、ＸｂａＩ（３’）サイトを添加した。ｐＧＸ１０／ｔＦをＮｈｅＩとＸｂａＩ酵素で処理した後、合成した１６Ｅ６Ｎ１６Ｅ７Ｎ１６Ｅ６Ｃ１６Ｅ７Ｃ１８Ｅ６Ｎ１８Ｅ７Ｎ１８Ｅ６Ｃ１８Ｅ７Ｃをリガーゼで連結し、ｐＧＸ１０／ｔＦ１６Ｅ６Ｎ１６Ｅ７Ｎ１６Ｅ６Ｃ１６Ｅ７Ｃ１８Ｅ６Ｎ１８Ｅ７Ｎ１８Ｅ６Ｃ１８Ｅ７Ｃを製作した。ｐＧＸ１０／ｔＦ１６Ｅ６Ｎ１６Ｅ７Ｎ１６Ｅ６Ｃ１６Ｅ７Ｃ１８Ｅ６Ｎ１８Ｅ７Ｎ１８Ｅ６Ｃ１８Ｅ７ＣをＫｐｎＩとＸｂａＩ酵素（ｅｎｚｙｍｅ）で処理し、ｔＦ１６Ｅ６Ｎ１６Ｅ７Ｎ１６Ｅ６Ｃ１６Ｅ７Ｃ１８Ｅ６Ｎ１８Ｅ７Ｎ１８Ｅ６Ｃ１８Ｅ７Ｃを分離し、ｐＧＸ１０をＫｐｎＩとＸｂａＩ酵素で処理した後、リガーゼで連結し、ｐＧＸ２７／ｔＦ１６Ｅ６Ｎ１６Ｅ７Ｎ１６Ｅ６Ｃ１６Ｅ７Ｃ１８Ｅ６Ｎ１８Ｅ７Ｎ１８Ｅ６Ｃ１８Ｅ７Ｃ（以下、「ＧＸ−１８８Ｅ」という）を製造した。

＜実施例２＞ＧＸ−１８８Ｅの子宮頸癌の治療効果確認
ＧＸ−１８８Ｅの子宮頸癌の治療効果を確認するためにネズミＣ５７ＢＬ／６にＴＣ−１腫瘍細胞５×１０^５ｃｅｌｌｓを皮下注射し、３日目、８日目となる日に、５０μｇ及び１００μｇの量で筋肉注射した後、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を行った。腫瘍細胞を注射した日から２７日目になる日まで腫瘍細胞の体積変化を観察し、３６日目となる日に、ネズミの脾臓を取り出し、５μｇ／ｍＬのａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩＦＮ−γ抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｇｅｎ、Ｓａｎｄｉｅｇｏ、ＣＡ）５０μＬでコーティングされたプレートに１×１０^６ｃｅｌｌｓをＩＬ−２とＨＰＶ１６Ｅ６ＣＤ８Ｔ細胞抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）（Ｅ６_{４８−５７}；ＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬ、Ｐｅｐｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）またはＨＰＶ１８Ｅ７ＣＤ８Ｔ細胞抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）（Ｅ７_{４９−５７}；ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、Ｐｅｐｔｒｏｎ、Ｋｏｒｅａ）またはＨＰＶ１８Ｅ６ペプチドプール（ｐｅｐｔｉｄｅｐｏｏｌ）またはＨＰＶ１８Ｅ７ペプチドプール（ｐｅｐｔｉｄｅｐｏｏｌ）を一緒に入れ、３７℃５％ＣＯ_２培養器（Ｆｒｏｍａ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、ＵＳＡ）で２４時間培養した。プレートをＰＢＳＴで洗浄した後、ビオチンが付いているＩＦＮ−γ探知抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｇｅｎ、Ｓａｎｄｉｅｇｏ、ＣＡ）２μｇ／ｍＬを５０μＬずつ入れ、約３時間程度常温で培養した。その後、ＰＢＳＴで洗浄し、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＫＰ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を１：２０００で希釈し、５０μＬずつ入れ、常温で１時間培養した。ＰＢＳＴで洗浄した後、１０ｍＬのアルカリ性リン酸塩緩衝液（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ）当たり６６μＬのＮＢＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＴ）と３３μＬのＢＣＩＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＴ）を添加し、５０μＬずつ入れて反応させた。反応による色がよく現れるように、３７℃培養器で約３０分間入れた後、滅菌された水（ｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ、Ｄ．Ｗ．）で洗浄し、生成された点の個数をリーダーで読み取った。

ＨＰＶ１６Ｅ６ＣＤ８Ｔ細胞抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）、ＨＰＶ１６Ｅ７ＣＤ８Ｔ細胞抗原決定基（ｅｐｉｔｏｐｅ）、ＨＰＶ１８Ｅ６ペプチドプール、ＨＰＶ１８Ｅ７ペプチドプールを使用してＨＰＶ１６Ｅ６、Ｅ７及びＨＰＶ１８Ｅ６、Ｅ７に対する特異的なＴ細胞免疫反応をＥＬＩＳＰＯＴで測定した結果、ＧＸ−１８８Ｅは、高い抗原特異的免疫反応を誘導し、ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８のＥ６及びＥ７に対する特異的免疫反応を同時に誘導することを確認することができた（図１、図２、図３及び図４参照）。

ＧＸ−１８８ＥでＴＣ−１腫瘍細胞に対する免疫治療をしたネズミでは、対照群であるｐＧＸ２７を注入したネズミに比べて格別の腫瘍体積の減少を確認することができた（図５参照）。

本発明の融合タンパク質は、ＨＰＶによって誘発される腫瘍治療剤として使用することができる。

Claims

ヒトパピローマウイルスタイプ１６及び１８由来の、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する、Ｅ６及びＥ７の３次元構造が変形された融合ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチド。
免疫増強ペプチドをコーディングする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
免疫増強ペプチドが、ＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド（ｆｍｓ−ｌｉｋｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ３ｌｉｇａｎｄ）、及びフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）よりなる群から選択された１つ以上である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
免疫増強ペプチドをコーディングする核酸配列が、配列番号６に記載された核酸配列を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
シグナルペプチドをコーディングする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
シグナルペプチドが、組職プラスミノゲン活性剤（ｔＰａ）シグナルペプチド、ＨＳＶｇＤｓシグナルペプチド及び成長ホルモン分泌シグナルペプチドよりなる群から選択された１つ以上である、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
シグナルペプチドをコーディングする核酸配列が、配列番号５に記載された核酸配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
コドン最適化されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
配列番号４に記載された核酸配列を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＥ６タンパク質のアミノ酸１番から８５番に対応するアミノ酸配列をコーディングする核酸配列、
ＨＰＶタイプ１６のＥ７タンパク質のアミノ酸１番から６５番に対応するアミノ酸配列をコーディングする核酸配列、
ＨＰＶタイプ１６のＥ６タンパク質のアミノ酸７１番から１５８番に対応するアミノ酸配列をコーディングする核酸配列、
ＨＰＶタイプ１６のＥ７タンパク質のアミノ酸５１番から９８番に対応するアミノ酸配列をコーディングする核酸配列、
ＨＰＶタイプ１８のＥ６タンパク質のアミノ酸１番から８５番に対応するアミノ酸配列をコーディングする核酸配列、
ＨＰＶタイプ１８のＥ７タンパク質のアミノ酸１番から６５番に対応するアミノ酸配列をコーディングする核酸配列、
ＨＰＶタイプ１８のＥ６タンパク質のアミノ酸７１番から１５８番に対応するアミノ酸配列をコーディングする核酸配列、及び
ＨＰＶタイプ１８のＥ７タンパク質のアミノ酸５１番から１０５番に対応するアミノ酸配列をコーディングする核酸配列
を含むポリヌクレオチドであって、
前記核酸配列が５’末端から上記記載された順にインフレームで連結されており、かつ
前記ポリヌクレオチドによりコーディングされる融合タンパク質が、ＨＰＶタイプ１６及び１８抗原特異的免疫反応を誘導する活性を有する、ポリヌクレオチド。
免疫増強ペプチドをコーディングする核酸配列をさらに含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
シグナルペプチドをコーディングする核酸配列をさらに含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
シグナルペプチドをコーディングする核酸配列をさらに含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
コドン最適化されている、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
免疫増強ペプチドをコーディングする核酸配列がコドン最適化されている、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
シグナルペプチドをコーディングする核酸配列がコドン最適化されている、請求項１２または１３に記載のポリヌクレオチド。
配列番号４、配列番号５、及び配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
プラスミドである、請求項１８または１９に記載のベクター。
請求項１８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
請求項１９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
ヒトパピローマウイルスタイプ１６及び１８由来の、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有する、Ｅ６及びＥ７の３次元構造が変形された融合ポリペプチドを含む融合タンパク質。
免疫増強ペプチドをさらに含む、請求項２３に記載の融合タンパク質。
免疫増強ペプチドが、ＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド（ｆｍｓ−ｌｉｋｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ３ｌｉｇａｎｄ）、及びフラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）よりなる群から選択された１つ以上である、請求項２４に記載の融合タンパク質。
免疫増強ペプチドが、配列番号３に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の融合タンパク質。
シグナルペプチドをさらに含む、請求項２３に記載の融合タンパク質。
シグナルペプチドが、組職プラスミノゲン活性剤（ｔＰａ）シグナルペプチド、ＨＳＶｇＤｓシグナルペプチド及び成長ホルモン分泌シグナルペプチドよりなる群から選択された１つ以上である、請求項２７に記載の融合タンパク質。
シグナルペプチドが、配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の融合タンパク質。
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のＥ６タンパク質のアミノ酸１番から８５番に対応するアミノ酸配列、
ＨＰＶタイプ１６のＥ７タンパク質のアミノ酸１番から６５番に対応するアミノ酸配列、
ＨＰＶタイプ１６のＥ６タンパク質のアミノ酸７１番から１５８番に対応するアミノ酸配列、
ＨＰＶタイプ１６のＥ７タンパク質のアミノ酸５１番から９８番に対応するアミノ酸配列、
ＨＰＶタイプ１８のＥ６タンパク質のアミノ酸１番から８５番に対応するアミノ酸配列、
ＨＰＶタイプ１８のＥ７タンパク質のアミノ酸１番から６５番に対応するアミノ酸配列、
ＨＰＶタイプ１８のＥ６タンパク質のアミノ酸７１番から１５８番に対応するアミノ酸配列、及び
ＨＰＶタイプ１８のＥ７タンパク質のアミノ酸５１番から１０５番に対応するアミノ酸配列
を含む融合タンパク質であって、
前記アミノ酸配列がアミノ末端から上記記載された順序で連結されており、かつ
ＨＰＶタイプ１６及び１８抗原特異的免疫反応を誘導する活性を有する、融合タンパク質。
免疫増強ペプチドをコーディングするアミノ酸配列をさらに含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
シグナルペプチドをコーディングするアミノ酸配列をさらに含む、請求項３０または３１に記載の融合タンパク質。
請求項１に記載のポリヌクレオチド、請求項１０に記載のポリヌクレオチド、請求項１８に記載のベクター、請求項１９に記載のベクター、請求項２１に記載の宿主細胞、請求項２２に記載の宿主細胞、請求項２３に記載の融合タンパク質、又は請求項３０に記載の融合タンパク質を含む、必要な個体でヒトパピローマウイルスによって惹起される疾患の予防または治療用組成物。
ヒトパピローマウイルスによって惹起される疾患が子宮頸癌である、請求項３３に記載の組成物。
薬剤学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項３３に記載の組成物。
請求項１または１０に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する工程を含む、請求項１または１０に記載のポリヌクレオチドによりコーディングされる融合タンパク質を発現する方法。