ES2340287T3 - Expresion optimizada de hpv 58 l1 en levadura. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HPV58 L1 como se define en SEQ ID Nº:2, comprendiendo la secuencia de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos como se define en SEQ ID Nº:1.
Description
Expresión optimizada de HPV 58 L1 en
levadura.
La presente invención se refiere, en general, a
la prevención y/o el tratamiento de la infección por virus del
papiloma humano (HPV). De modo más específico, la presente invención
se refiere a polinucleótidos sintéticos que codifican la proteína
HPV58 L1 y a vectores y huéspedes recombinantes que comprenden
dichos nucleótidos. Se describen partículas similares a virus (VLP)
del HPV58 producidas expresando el HPV 58 L1 o L1 + L2 recombinante
en células de levadura así como un procedimiento para fabricar
vacunas y composiciones farmacéuticas para prevenir y tratar
infecciones por HPV.
Existen más de 80 tipos del virus del papiloma
humano (HPV), muchos de los cuales han sido asociados con una
amplia variedad de fenotipos biológicos, desde verrugas
proliferativas benignas hasta carcinomas malignos (para revisión,
véase McMurray y col., Int J. Exp. Pathol. 82(1):
15-33 (2001). El HPV6 y el HPV11 son los tipos más
comúnmente asociados con verrugas benignas, condiloma acuminado no
maligno y/o displasia de la mucosa genital o respiratoria de grado
bajo. El HPV16 y el HPV18 son los tipos de riesgo alto más
frecuentemente asociados con carcinomas in situ o invasivos
cervicales, vaginales, de la vulva y del canal anal. Más del 90% de
los carcinamas cervicales están asociados con infecciones por HPV16,
HPV18 o los tipos oncogénicos menos prevalentes HPV31, -33, -45,
-52 y -58, (Sciffman y col., J. Natk. Cancer Inst. 85(12):
958-64 (1993)). La observación de que el ADN del
HPV se detecta en más del 90% de los cánceres cervicales proporciona
fuertes evidencias epidemiológicas de que los HPV causan el
carcinoma cervical.
Los virus del papiloma son virus pequeños
(50-60 nm), sin envoltura, ADN icosaédricos que
codifican hasta ochenta genes tempranos y dos genes tardíos. Los
marcos de lectura abierta (ORF) de los genomas víricos se designan
E1 a E7, y L1 y L2, donde "E" denota temprano y "L"
tardío. L1 y L2 codifican proteínas de la cápside vírica, mientra
que los genes E están asociados con funciones tales como la
replicación vírica y la transformación celular.
La proteína L1 es la proteína principal de la
cápside y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La
proteína L2 es la proteína secundaria de la cápside. Los datos
inmunológicos sugieren que la mayor parte de la proteína L2 está en
posición interna respecto a la proteína L1 en la cápside vírica.
Tanto las proteínas L1 como las L2 se conservan altamente entre
virus del papiloma diferentes.
La expresión de la proteína L1 o de una
combinación de las proteínas L1 y L2 en levadura, células de
insectos, células de mamíferos o bacterias conduce al
autoensamblaje de partículas similares a virus (VLP) (para revisión,
véase Schiller y Roden, en Papillomavirus Reviews: Current Research
on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, Reino Unido: Leeds Medical
Information, páginas 101-12 (1996)). Las VLP son
morfológicamente similares a viriones auténticos y son capaces de
inducir a valoraciones altas de anticuerpos de neutralización tras
administración a animales o seres humanos. Debido a que las VLP no
contienen el genoma vírico potencialmente oncogénico, representan
una alternativa segura de uso de virus vivos en el desarrollo de
vacunas de HPV (para revisión, véase Schiller y Hidesheim, J. Clin.
Virol. 19: 67-74 (2000)). Por este motivo, se han
identificado los genes L1 y L2 como dianas inmunológicas para el
desarrollo de vacunas preventivas y terapéuticas para infecciones y
enfermedades por HPV.
Tobery, T.W. y col. (2003) describen una
comparación entre dos tipos de vacunas para inducir respuestas
inmunológicas humorales específicas del HPV16L1: "...se
inmunizaron macacos con un vector adenovírico (Ad) que codifica
HPV16L1..., un vector de ADN plásmido que codifica HPV16L1...,
HPV16L1 producido en levadura...o HPV16L1 producido en levadura +
partículas quiméricas similares a virus E1/E2/E7..." (pág. 1541,
columna lateral de la derecha, última párrafo). Se encontró que
"el grupo VPL L1 tiene valoraciones de neutralización
significantemente más altas que los grupos VLPc, ADN L1 y adeno
L1..." (página 1542, columna lateral de la derecha, primer
párrafo).
El desarrollo y la comercialización de la vacuna
de HPV se han visto obstaculizados por dificultades asociadas con
la obtención de altos niveles de expresión de las proteínas de la
cápside en organismos huéspedes transformados satisfactoriamente,
limitando la producción de proteína purificada. Por lo tanto, a
pesar de la identificación de secuencias de nucleótidos de tipo
silvestre que codifican proteínas HPV L1 tales como la proteína
HPV58L1, sería muy deseable desarrollar una fuente fácilmente
renovable de proteína HPV L1 bruta que utilice secuencias de
nucleótido de codificación de HPV58 L1 que se optimicen por
expresión en la célula huésped pretendida. Adicionalmente, sería
útil producir grandes cantidades de VLP del HPV58 L1 que tengan la
propiedades que confieren inmunidad de las proteínas nativas para
su uso en el desarrollo de vacunas.
La presente invención se refiere a composiciones
y procedimientos para fabricar una vacuna sobre la base de
productos proteicos expresados por genes HPV58 L1. La presente
invención proporciona polinucleótidos que codifican la proteína
HPV58 L1, habiéndose optimizado los codones de los polinucleótidos
para la expresión a alto nivel en una célula de levadura. La
presente invención proporciona además partículas similares a virus
(VLP) del HPV58, produciéndose dichas VLP por expresión de HPV58 L1
o L1+L2 recombinante en células de levadura, y da a conocer el uso
de VLP del HPV58 en composiciones farmacéuticas y vacunas para la
prevención y/o tratamiento de cáncer asociado a HPV.
La presente invención se refiere a moléculas de
ADN sintéticas que codifican la proteína HPV58 L1. Los codones de
las moléculas sintéticas están diseñados de modo que se usen los
codones preferentes por una célula de levadura. Las moléculas
sintéticas pueden usarse como una fuente de proteína HPV58 L1, la
cual puede autoensamblarse en VLP. Dichas VLP pueden usarse en una
vacuna basada en VLP.
Específicamente, la presente invención comprende
una molécula sintética de ácido nucleico que codifica la proteína
HPV58 L1 como se establece en la SEQ ID Nº:2, comprendiendo dicha
molécula de ácido nucleico unas secuencia de nucleótidos como se
establece en la SEQ ID Nº:1 (denominada en el presente documento
"secuencia 58 L1 R").
También proporciona vectores recombinantes y
células huésped recombinantes, tanto procariotas como eucariotas,
que contienen las moléculas de ácido nucleico reveladas a lo largo
de la presente memoria descriptiva. En una realización preferente
de la presente invención, la célula huésped es una célula de
levadura.
Esta invención también se refiere a
procedimientos para producir VLP del HPV58 y procedimientos para
usar VLP del HPV58.
En una realización preferente de la presente
invención, la levadura se selecciona del grupo constituido por:
Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris,
Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis y
Schizosaccharomyces pombe.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento de fabricación de una vacuna que comprende partículas
similares a virus (VLP) del HPV58, en el que las VLP del HPV58 se
producen en levadura.
En una realización alternativa de este aspecto
de la invención, el procedimiento de fabricación de una vacuna
comprende además la adición de VLP de al menos un tipo de HPV
adicional. El al menos un tipo de HPV adicional puede ser cualquier
tipo de HPV de interés, incluidos cualquier tipo de HPV descrito en
la técnica o aquellos identificados subsecuentemente. En una
realización preferente, el tipo de HPV es un tipo que está asociado
con un fenotipo clínico tal como verrugas o cáncer cervical. En una
realización preferente adicional, el al menos un tipo de HPV
adicional se selecciona del grupo constituido por: HPV6, HPV11,
HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52,
HPV55, HPV56, HPV59 y HPV68.
Tal como se usan a lo largo de la presente
memoria descriptiva y reivindicaciones anexas, las formas singulares
"un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia
plural a menos de que el contexto indique claramente lo
contrario.
Tal como se usan a lo largo de la presente
memoria descriptiva y reivindicaciones anexas, se aplican las
siguientes definiciones y abreviaturas:
El término "promotor" se refiere a un sitio
de reconocimiento de una cadena de ADN a la que se une la ARN
polimerasa. El promotor forma un complejo de iniciación con la ARN
polimerasa para iniciar y controlar actividad transcripcional. El
complejo puede modificarse activando secuencias denominadas
"potenciadores" o "secuencias de activación cadena
arriba" o secuencias de inhibición denominadas
"silenciadores".
El término "vector" se refiere a algunos
medios por los que pueden introducirse fragmentos de ADN en un
organismo huésped o tejido huésped. Existen diversos tipos de
vectores incluidos plásmidos, virus (incluidos adenovirus),
bacteriófagos y cósmidos.
El término "casete" se refiere a una
secuencia nucleótida o génica que tiene que expresarse a partir de
un vector, por ejemplo, la secuencia nucleótida o génica que
codifica la proteína HPV 58 L1. En general, un casete comprende una
secuencia génica insertada en una vector que, en algunas
realizaciones, proporciona secuencias regulares para la expresión
de secuencias nucleótidas o génicas. En otras realizaciones, la
secuencia nucleótida o génica proporciona las secuencias
reguladoras para su expresión. En realizaciones adicionales, el
vector proporciona algunas secuencias reguladoras y la secuencia
nucleótida o génica proporciona otras secuencias reguladoras. Por
ejemplo, el vector puede proporcionar un promotor para transcribir
la secuencia nucleótida o génica y la secuencia nucleótida o génica
proporciona una secuencia de terminación de transcripción. Las
secuencias reguladoras que pueden proporcionarse por parte del
vector incluyen, pero sin limitarse a, potenciadores, secuencias de
terminación de transcripción, secuencias aceptoras y donantes de
ayustes, intrones, secuencias de unión a ribosomas y secuencias de
adición de poli (A).
Las denominaciones "secuencia 58 L1 de tipo
silvestre" y "secuencia 58 L1 wt" se refieren a la secuencia
del HPV58 L1 desvelada en el presente documento como SEQ ID Nº:3.
Aunque la secuencia de HPV 58 L1 de tipo silvestre ha sido descrita
previamente, no es inusual encontrar variaciones de secuencia
secundarias entre los ADN obtenidos por aislamiento clínico. Por
consiguiente, se aisló una secuencia 58 L1 de tipo silvestre
representativa a partir de muestras clínicas que previamente
mostraron que contenían ADN del HPV 58 (véase el Ejemplo 1). La
secuencia 58 L1 de tipo silvestre se usó como una secuencia de
referencia para comparar las secuencias 58 L1 con codones
optimizados desveladas en el presente documento. (véase la Figura
1).
Las denominaciones "HPV58 L1 R" y "58 L1
R" se refieren a una secuencia de nucleótido del HPV58 L1
sintética ejemplar (SEQ ID Nº:1), desvelada en el presente
documento, donde la secuencia se reconstruyó de modo que comprende
codones que son preferentes para la expresión de alto nivel por una
célula de levadura.
El término "cantidad eficaz" significa una
composición de vacuna suficiente que se introduce para producir los
niveles adecuados del polipéptido, de modo que da como resultado una
respuesta inmunológica. Un experto en la técnica reconoce que este
nivel puede variar.
Una "sustituición de aminoácido
conservativa" se refiere al reemplazo de un resto de aminoácido
por otro resto de aminoácido químicamente similar. Ejemplos de
dicha sustituición conservativa son: sustitución de un resto
hidrófobo (isoleucina, leucina, valina o metionina) por otro;
sustitución de un resto polar por otro resto polar de la misma
carga (por ejemplo, arginina por lisina; ácido glutámico por ácido
aspártico).
El término "mamífero" se refiere a
cualquier mamífero, incluido el ser humano.
"VLP" significa partícula similar a virus o
partículas similares a virus.
"Sintético" significa que el gen HPV58 L1
se creó de tal modo que contiene una secuencia de nucleótidos que
no son los mismos que la secuencia de nucleótidos presente en el
denominado gen HPV58 L1 de tipo silvestre natural (58 L1 wt, SEQ ID
Nº:3). Tal como se ha indicado anteriormente, en el presente
documento se proporcionan moléculas sintéticas que comprenden una
secuencia de nucleótidos que comprende codones que son preferentes
para la expresión por células de levadura. Las moléculas sintéticas
proporcionadas en el presente documento codifican las mismas
secuencias de aminoácidos que el gen HPV58 L1 de tipo silvestre.
(SEQ ID Nº:2).
La Figura 1 muestra un alineamiento de secuencia
que compara nucleótidos que han sido modificados en el gen HPV58 L1
sintético de la presente invención (SEQ ID Nº:1 señalada como "58
L1 R") (véase el Ejemplo 2). La secuencia de referencia es la
secuencia 58 L1 de tipo silvestre (SEQ ID Nº:3, señalada como "58
L1 wt"; véase el Ejemplo 1). Los nucleótidos modificados se
indican en su localización correspondiente. El número de nucleótidos
se presenta entre los paréntesis. Los nucleótidos idénticos en la
secuencia reconstruida 58 L1 se indican con puntos.
La Figura 2 muestra los ácidos nucleicos
bicatenarios del HPV58 L1 sintético reconstruido y debajo la
secuencia de aminoácidos con código de una letra. El número de
nucleótidos se indica a la izquierda.
La Figura 3 muestra un análisis Northern de los
tránscritos del HPV58 L1 wt y 58 L1 R (véase el Ejemplo 4). La
mancha se analizó con un cóctel de cantidades iguales de sondas de
ADN de 58 L1 wt y 58 L1 R marcadas con DIG. Se indica la cantidad
de ARN total sometido a electroforesis por carril. La flecha de la
derecha indica el tamaño predicho de un transcrito 58 L1 de
longitud completa.
La Figura 4 muestra un análisis Northern de
proteínas del HPV 58 L wt (58) y 58 L1 R (58R). El HPV 16 L1 se
incluye como referencia (16). Se desnaturalizaron diez, cinco y dos
y medio microorganismos del extracto de proteína de levadura total
y se aplicaron a un 10% de gel SDS-PAGE. Se detecto
la proteína de HPV 58 L1 usando un antisuero policlonal de cabra
anti trpE HPV 31 L1 absorbido por levadura que reacciona de modo
cruzado con 58 L1 y 16 L1. Los marcadores de peso molecular se
indican en kDa en la izquierda.
La Figura 5 representa la cantidad (ng) de VLP
del HPV 58 L1 por microgramo de proteína de levadura total
capturada y detectada en un ELISA (véase el Ejemplo 7). Están
incluidos los resultados de los dos experimentos realizados por
duplicado. La expresión de VLP del HPV 58 L1 wt (rectángulos negro y
gris) fue de 36 ng/\mug de proteína de levadura total. La
expresión de VLP del HPV 58 L1 R (rectángulos blanco y rayado), el
58 L1 reconstruido con codones optimizados de levadura, fue de 2 a
3 veces superior a la expresión del HPV 58 L1 wt, alcanzando 95
ng/\mug de proteína de levadura total en el experimento Nº 2.
La Figura 6 ofrece una muestra representativa de
VLP del HPV 58 compuesta por moléculas proteicas del HPV 58 L1 R,
descritas en el presente documento, como se visualiza por
microscopio electrónico de transmisión (véase el Ejemplo 8). La
barra representa aproximadamente 100 nm.
La mayor parte de los carcinomas cervicales
están asociados con infecciones por tipos oncogénicos específicos
del virus del papiloma humano (HPV). La presente invención se
refiere a composiciones y a un procedimiento para fabricar una
vacuna que comprende los productos proteicos expresados por genes de
tipos oncogénicos de HPV. Específicamente, la presente invención
proporciona polinucleótidos que codifican el HPV58 L1, teniendo los
polinucleótidos codones optimizados por expresión de alto nivel en
levadura. También se describen partículas similares a virus (VLP)
del HPV58, que se producen en levadura. La presente invención da a
conocer el uso de los polinucleótidos y las VLP obtenidas de este
modo en un procedimiento de fabricación de vacunas para la
prevención y/o el tratamiento de cáncer asociado al HPV.
Se ha divulgado una secuencia de nucleótidos del
HPV58 L1 de tipo silvestre (número de acceso de Genbank NC_001443,
véase Kirl y col., Virology 185(1): 424-427
(1991)). La presente invención proporciona moléculas sintéticas de
ADN que codifican la proteína HPV58 L1. Las moléculas sintéticas de
la presente invención comprenden una secuencia de codones en la que
se han alterado al menos algunos de los codones para el uso de los
codones preferentes por una célula de levadura para expresión de
alto nivel. Las moléculas sintéticas pueden usarse como una
secuencia codificante para la expresión de proteína HPV58 L1, que
puede autoensamblarse en VLP. Dichas VLP pueden usarse en una
vacuna basada en VLP para proporcionar una inmunoprofilaxis eficaz
contra la infección por virus del papiloma neutralizando la
inmunidad mediada por anticuerpos y células. Dichas vacunas basadas
en VLP son también útiles para el tratamiento de infecciones por HPV
ya establecidas.
La expresión de VLP del HPV en células de
levadura ofrece las ventajas de ser rentable y fácilmente adaptable
al crecimiento a gran escala en fermentadores. Además, el genoma de
levadura puede alterarse fácilmente para asegurar la selección de
levadura transformada recombinante con crecimiento aumentado y
potencial de expresión. Sin embargo, muchas proteínas HPV L1,
incluidas HPV58 L1, se expresan a niveles en células de levadura que
son inferiores que lo que sería deseable para su desarrollo a
escala comercial.
Consecuentemente, la presente invención se
refiere a secuencias génicas de HPV58 L1 que están
"optimizadas" para la expresión a nivel alto en un ambiente
celular de levadura.
Un codón "triplete" de cuatro posibles
bases nucleótidas puede existir en más de 60 formas variantes.
Debido a que estos codones proporcionan el mensaje para sólo 20
aminoácidos diferentes (también para el inicio y la terminación de
la transcripción), algunos aminoácidos pueden ser codificados por
más de un codón, un fenómeno conocido como redundancia de codones.
Por motivos que no se entienden completamente, los codones
alternativos no están presentes de modo uniforme en el ADN endógeno
de diferentes tipos de células. Efectivamente, parece que existe
una jerarquía natural variable o "preferencia" por determinados
codones en ciertos tipos de células. Como ejemplo, el aminoácido
leucina está especificado por cualquiera de seis codones de ADN
incluidos CTA, CTC, CTG, CTT, TTA y TTG. Un análisis exhaustivo de
frecuencias de uso de codones del genoma para microorganismos ha
revelado que lo más común es que el ADN endógeno de E. coli
contenga el codón de especificación de leucina CTG, mientras que lo
más común es que el ADN de levaduras y mohos mucilaginosos contenga
el codón de especificación de leucina TTA. En vista de esta
jerarquía, se cree generalmente que la probabilidad de obtener
niveles altos de expresión de un polipéptido rico en leucina por un
huésped de E. coli dependerá en alguna medida de la
frecuencia de uso del codón. Por ejemplo, es probable que un gen
rico en codones TTA será expresado pobremente en E. Coli,
mientras que un gen rico en CTG será, de manera probable, altamente
expresado en este huésped. De modo similar, un codón preferente
para la expresión de un polipéptido rico en leucina en células
huésped de levadura sería el TTA.
Las implicaciones de fenómenos de preferencia de
codones en las técnicas de ADN recombinante es manifiesta, y el
fenómeno puede servir para explicar muchos fallos anteriores en la
consecución de niveles altos de expresión de genes exógenos en
organismos huésped transformados de forma exitosa: un codón menos
"preferente" puede están presente repetidamente en el gen
insertado y la maquinaria de expresión de la célula hospedadora
puede no operar de modo eficaz. Este fenómeno sugiere que genes
sintéticos que se han designado para incluir codones preferentes de
una célula huésped proyectada proporcionan una forma óptima de
material genético externo para practicar la expresión de proteína
recombinante. Así, un espectro de la presente invención es un gen
HPV58 L1 con codones optimizados para expresión en nivel alto en
una célula de levadura. En una realización preferente de la
presente invención, se ha encontrado que el uso de codones
alternativos que codifican la misma secuencia de proteínas puede
eliminar la restricción en la expresión de proteínas HPV58 L1 por
células de levadura.
De acuerdo con la presente invención, se
convirtieron segmentos de genes HPV58 L1 en secuencias que tiene
secuencias de traducidas idénticas pero con el uso de codones
alternativos tal como se describe por Sharp y Cowe (Synonymous
Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7:
657-678 (1991)). La metodología consiste,
generalmente, en identificar codones en la secuencia de tipo
silvestre que no están asociados comúnmente con genes de levadura
altamente expresados y en reemplazarlos por codones para la
expresión alta en células de levadura. La nueva secuencia de genes
se analiza después para determinar secuencias no deseadas generadas
por dichos reemplazos de codones (por ejemplo, secuencias
"ATTTA", la creación accidental de sitios de reconocimiento de
ayuste de intrones, sitios enzimáticos de restricción no deseados,
alto contenido CG, presencia de señales de terminación de
transcripción que son reconocidas por la levadura, etc.). Se
eliminan secuencias no deseadas por sustitución de los codones
existentes por codones diferentes que codifican el mismo aminoácido.
Los segmentos de genes sintéticos se analizan después para mejorar
la expresión.
Los procedimientos descritos anteriormente se
usaron para crear segmentos de genes sintéticos para HPV58 L1,
dando como resultado un gen que comprende los codones optimizados
para la expresión de alto nivel. Aunque los procedimientos
anteriores proporcionan un resumen de nuestra metodología para
diseñar genes con codones optimizados para su uso en vacunas de
HPV, un experto en la técnica entiende que la eficacia de vacunas
similares o la expresión aumentada de genes puede lograrse mediante
variaciones secundarias en el procedimiento o por variaciones
secundarias en la secuencia.
La presente invención se refiere a un
polinucleótido sintético que codifica la proteína HPV58 L1 como se
expone en SEQ ID Nº 2, comprendiendo dicha molécula de ácidos
nucleicos una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID Nº
1.
La presente invención se refiere también a
vectores recombinantes y células huésped recombinantes, tanto
procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido
nucleico desveladas en la presente memoria descriptiva. En una
realización preferente de la presente invención, la célula huésped
es una célula huésped de leva-
dura.
dura.
El ADN del HPV58 sintético o fragmentos del
mismo construidos mediante los procedimientos descritos en el
presente documento pueden expresarse recombinantemente por clonación
molecular en un vector de expresión que contiene un promotor
adecuado y otros elementos reguladores de transcripción apropiados,
y transferirse a células células huésped procariotas o eucariotas
para producir HPV58 L1 recombinante. Las técnicas para tales
manipulaciones se describen en su totalidad en Sambrook y col.
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1989); Current
Protocols in Molecular-Biology, Ausubel y col.,
Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, Nueva
York (1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose y
col., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York,
(1990)).
La invención se refiere además a un
procedimiento para expresar una proteína HPV58 L1 en una célula
recombinante que comprende: (a) introducir una vector que comprende
un ácido nucleico como se expone en SEQ ID Nº 1 en una célula
huésped de levadura; y, (b) cultivar la célula huésped de levadura
en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína HPV58
L1.
Los genes sintéticos de la presente invención
pueden ensamblarse en un casete de expresión que comprende
secuencias diseñadas para proporcionar una expresión eficaz de la
proteína HPV58 L1 en la célula huésped. El casete contiene
preferentemente el gen sintético, con secuencias de control
transcripcional y de traducciones relacionadas unidas
operativamente a él, tal como un promotor, y secuencias de
terminación. En una realización preferente, el promotor es el
promotor GAL1 de S. cerevisiae, aunque los expertos en la
técnica reconocen que puede usarse cualquier promotor de una serie
de otros promotores de levadura conocidos, tales como los promotores
GAL10, GAL7, ADH1, TDH3 o PGK, u otros promotores de genes
eucariotas. Un terminador transcripcional preferente es el
terminador ADH1 de S. cerevisiae, aunque también pueden
usarse otros terminadores transcripcionales conocidos. La
combinación de promotor GAL1 y terminador ADH1 es particularmente
preferente.
Se describe también una partícula similar a
virus (VLP) del HPV58 producida expresando recombinantemente el gen
HPV58 L1 o los genes L1 + L2 en una célula de levadura,
procedimientos para producir las VLP del HPV58 y procedimientos
para usar las VLP del HPV58. Las VLP pueden autoensamblarse si L1,
la proteína principal de la cápside del virus del papiloma humano y
animal, se expresa en levadura, células de insectos, células de
mamíferos o bacterias (para revisión, véase Schiller y Roden, en
Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses;
Lacey, ed. Leeds, Reino Unido: Leeds Medical Information, páginas
101-12 (1996)) También pueden producirse VLP del
HPV no definidas morfológicamente expresando una combinación de las
proteínas L1 y L2 de la cápside. Las VLP se componen de 72
pentámeros de L1 en una estructura de icosaedro T=7 (Baker y col.,
Biophys. J. 60(6): 1445-56 (1991)).
Las VLP son morfológicamente similares a
viriones auténticos y son capaces de inducir valoraciones altas de
anticuerpos de neutralización tras administración al animal. La
inmunización de conejos (Breitburd y col., J. Virol. 69 (6):
3959-63 (1995)) y de perros (Suzich y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 92(25): 11553-57
(1995)) con VLP se mostró para inducir anticuerpos de neutralización
y para proteger contra la infección por virus del papiloma
experimental. Sin embargo, debido a que las VLP no contienen el
genoma vírico potencialmente oncogénico y pueden autoensamblarse
cuando son expresadas a partir de un único gen, presentan una
alternativa segura de usar virus vivos en el desarrollo de vacunas
de HPV (para revisión, véase Schiller y Hidesheim, J. Clin. Virol.
19: 67-74 (2000)).
En el presente documento, las partículas
similares a virus comprenden proteína L1 recombinante o proteínas
recombinantes L1 + L2 del HPV58, donde la proteína recombinante se
expresa en una célula de levadura como se ha descrito.
Como se ha establecido anteriormente, en una
realización preferente de la invención, las VLP del HPV58 se
producen en levadura. En una realización preferente adicional, la
levadura se selecciona del grupo constituido por Saccharomyces
cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris,
Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis y
Schizosaccharomyces pombe.
Todavía otro aspecto de la presente invención es
un procedimiento de producción de VLP del HPV 58, que comprende:
(a) transformar levadura con una molécula de ADN recombinante que
codifica la proteína HPV58 L1 o las proteínas HPV58 L1 + L2; (b)
cultivar la levadura transformada en condiciones que permiten la
expresión de la molécula de ADN recombinante para producir la
proteína HPV58 recombinante; y (c) aislar la proteína HPV58
recombinante para producir VLP del HPV58; en el que el gen HPV58 L1
comprende una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID Nº
1.
Las VLP del HPV58 resultantes pueden usarse en
un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un
animal que comprende administrar las partículas similares a virus
del HPV58 al animal, en particular en un procedimiento de
prevención y/o de tratamiento de cáncer cervical asociado a HPV que
comprende administrar al mamífero una vacuna que comprende las VLP
del HPV58.
La invención se refiere también a un
procedimiento para fabricar una vacuna que comprende las partículas
similares a virus (VLP) del HPV58.
En una realización alternativa de este espectro
de la invención, este procedimiento de fabricación de vacunas
comprende además la adición de VLP de al menos un tipo de HPV
adicional. En una realización preferente, el al menos un tipo de
HPV adicional se selecciona del grupo constituido por: HPV6, HPV11,
HPV6, HPV19, HPV13, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52,
HPV55, HPV56, HPV59 y HPV68.
En una realización preferente de este
procedimiento de la invención, se añaden VLP del HPV18.
En otra realización preferente del procedimiento
se añaden VLP del HPV16 y VLP del HPV18.
En todavía otra realización preferente de la
invención, el procedimiento comprende además al adición de VLP del
HPV6, VLP del HPV11, VLP del HPV16 y VLP del HPV18.
Las composiciones de vacunas proporcionadas por
la presente invención pueden usarse solas a dosis apropiadas que
permiten la inhibición óptima de la infección por HPV58 con una
toxicidad potencial mínima. Además, puede ser deseable la
coadministración o la administración secuencial de otros
agentes.
La cantidad de partículas similares a virus a
introducir en el recipiente de la vacuna dependerá de la
inmunogenicidad del producto génico expresado. En general, se
administra directamente al tejido muscular una dosis inmunológica o
profilácticamente eficaz de aproximadamente 10 \mug a 100 \mug,
y preferentemente de aproximadamente 20 \mug a 60 \mug de VLP.
Se contemplan también la inyección subcutánea, la introducción
intradérmica, impresión a través de la piel y otros modos de
administración tales como administración intraperitoneal,
intravenosa o por inhalación. También se contempla que puedan
proporcionarse vacunaciones de refuerzo. La administración
parenteral, tal como intravenosa, intramuscular, subcutánea o de
otros medios de administración con coadyuvantes tales como alumbre
o coadyuvante de aluminio de Merck, simultáneamente o
subsecuentemente a la administración parenteral de la vacuna de la
invención, es también ventajosa.
Habiendo descrito las realizaciones preferentes
de la invención con referencia a los dibujos adjuntos, es de
entender que la invención no se limita a estas realizaciones
precisas, y que un experto en la técnica puede realizar varios
cambios y modificaciones en las mismas.
Los ejemplos siguientes son ilustrativos, pero
no limitan la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
La secuencia de HPV 58 L1 se ha descrito
previamente (número de acceso de Genbank NC_001443). Sin embargo,
no es extraño encontrar variaciones de secuencia secundarias entre
los ADN obtenidos a partir de aislados clínicos. Para determinar
una secuencia de HPV58 L1 de tipo salvaje representativa, se aisló
ADN de muestras de tres clínicas que previamente se demostró que
contenían ADN de HPV58. Las secuencias de HPV 58 L1 se amplificaron
en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando Taq ADN
polimerasa y los cebadores siguientes: HPV 58 L1 F
5'-A T G T C CGTGTGGCGGCCTAGT-3'
(SEQ ID Nº:4) y 583'11 BglII 5'-GAGAT
CTGTGTAAGTACCACAACAAT
TA-3' (SEQ ID Nº:5). Los productos amplificados se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron por marcado con bromuro de etidio. Las bandas L1 de aproximadamente 1500 pb se escindieron y el ADN se purificó usando el kit Geneclean Spin (Q-Bio Gene, Carlsbad, CA, EEUU). El DNA se ligó después al vector de clonación TA, pCR2.1 (Invitrogen). Las E. coli T0P10F' se transformaron con la mezcla de ligación y se plaquearon en agar LB con ampicilina con IPTG y X-gal para la selección de colonias azules/blancas. Las placas se invertieron y se incubaron durante 16 horas a 37ºC. Las colonias blancas se cultivaron en medio LB con ampicilina agitando a 37ºC durante 16 horas. Se realizaron minipreps para extraer el ADN plasmídico.
TA-3' (SEQ ID Nº:5). Los productos amplificados se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se visualizaron por marcado con bromuro de etidio. Las bandas L1 de aproximadamente 1500 pb se escindieron y el ADN se purificó usando el kit Geneclean Spin (Q-Bio Gene, Carlsbad, CA, EEUU). El DNA se ligó después al vector de clonación TA, pCR2.1 (Invitrogen). Las E. coli T0P10F' se transformaron con la mezcla de ligación y se plaquearon en agar LB con ampicilina con IPTG y X-gal para la selección de colonias azules/blancas. Las placas se invertieron y se incubaron durante 16 horas a 37ºC. Las colonias blancas se cultivaron en medio LB con ampicilina agitando a 37ºC durante 16 horas. Se realizaron minipreps para extraer el ADN plasmídico.
Para demostrar la presencia del gen L1 en los
plásmidos, se llevaron a cabo digestiones con endonucleasas de
restricción. Los fragmentos de restricción se visualizaron por
electroforesis en gel de agarosa y marcado con bromuro de etidio.
La secuenciación de ADN se realizó en plásmidos que contenían
insectos de L1 clonados de cada uno de los tres aislados clínicos.
Con el fin de generar una secuencia de referencia para la posterior
optimización, las secuencias de aminoácidos traducidas y de
nucleótidos de cada uno de los clones se compararon con las
secuencias del HPV 58 L1 publicadas. El análisis de secuencias de
los tres aislados clínicos revelaron que ninguna secuencia era
idéntica a la secuencia de Genbank. El pCR2.1 HPV 58 L1 clon Nº 4 se
eligió para ser la secuencia 58 L1 representativa y el presente
documento se refiere a la misma de forma intercambiable como
"secuencia 58 L1 de tipo silvestre" o "secuencia 58 wt"
(SEQ ID Nº3, véase la Figura 1). La secuencia 58 L1 wt contenía
cinco mutaciones puntuales: dos que dan como resultado cambios en
aminoácidos y tres mutaciones puntuales en silencio. Las mutaciones
puntuales que dieron como resultado cambios en aminoácidos con
respecto a la secuencia de Genbank del HPV 58 L1 se localizaron en
el nucleótido 372 (A->T), modificando el aminoácido 124 de
leucina a fenilalanina, y en el nucleótido 897 (A->G),
modificando el aminoácido 299 de isoleucina a metionina. Las tres
mutaciones puntuales en silencio se localizaron en los nucleótidos
774(A->G), 792 (T->C) y 999 (G->A).
La secuencia 58 L1 de tipo silvestre se
amplificó por PCR usando Taq polimerasa y los cebadores siguientes,
los cuales añadieron extensiones BamHI:5'58 BamHI
5'-G G G A T C C C A C
AAAACAAAATGTCCGTGTGGC-3' (SEQmNº:6) y
3'Bam58 5'-G
GGATCCGTGTAAGTACCACAACAATTA-3' (SEQ ID Nº:7). Los
productos de la PCR resultantes se visualizaron por electroforesis
en gel de agarosa, seguida de marcado con bromuro de etidio. La
banda de 1500 pb se escindió y el ADN se purificó usando el kit
Geneclean. El producto de la PCR se ligó después a pCR2.1 y las
células TOP10F' se transformaron con la mezcla de ligación. Se
seleccionaron las colonias blancas y se cultivaron en medio LB con
ampicilina, agitando a 37ºC durante 16 horas. Se realizaron
minipreps para extraer el ADN plasmídico. Para liberar el gen HPV
58 L1 de las secuencias del vector, se realizaron digestiones con
endonucleasas de restricción BamHI. El ADN digerido se sometió a
electroforesis en gel de agarosa y se visualizó por marcado con
bromuro de etidio. La banda L1 se purificó usando el kit Geneclean y
se ligó a pGAL110 desfosforilado digerido con BamHI. Las células
DH5\alpha de E. coli se transformaron con la mezcla de
ligación. Para examinar que el inserto de HPV estuviera en la
orientación correcta, se amplificó por PCR ADN plasmídico procedente
de colonias. Se realizó la secuenciación de ADN para confirmar la
secuencia y la orientación de los insertos. Se seleccionó un clon
único y se designó como pGAL110-HPV 58L1 Nº 10. Se
preparó ADN maxiprep procedente del clon seleccionado. Las células
de Saccharomyces cerevisiae se hicieron competentes por
formación de esferoplastos con glusulasa y se transformaron con
pGAL110-HPV 58L1 Nº 1. La mezcla de transformación
de levadura se plaqueó en agar blando Leu(-) sorbitol en placas de
agar Leu(-) sorbitol y se incubó de forma invertida durante
3-5 días a 30ºC. Las colonias se recogieron y se
estriaron para su aislamiento en placas de agar Leu(-) sorbitol.
Las colonias aisladas se cultivaron subsecuentemente en 5 ml de 5 X
Leu(-) Ade(-) sorbitol con glucosa al 1,6% y galactosa al 4% en
cultivos en tubos rotatorios a 30ºC para inducir la transcripción y
la expresión proteica de 58 L1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se han descrito los codones de levadura
preferentes (Sharp, Paul M y Cowe, Elizabeth. Synonymous Codon
Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7:
657-678 (1991)). La expresión de la proteína HPV 58
L1 wt se pudo detectar, sin embargo, para obtener la expresión
aumentada, el gen HPV 58 L1 se reconstruyó utilizando los codones
de levadura preferentes. La secuencia 58 L1 reconstruida, que
comprende secuencias de codones de levadura optimizados, contiene
404 alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia 58
L1 wt. La secuencia resultante se denomina en el presente documento
"58 L1 R" (R = reconstruida, véase la Figura 1). La secuencia
de aminoácidos traducida de 58 L1 R no se modificó. Las secuencias
de nucleótidos (SEQ ID Nº:1) y aminoácidos (SEQ ID Nº:2) de HPV 58
L1 R se muestran en la Figura 2. Dicha secuencia reconstruida
proporciona la expresión aumentada del HPV 58 L1, lo que representa
un avance significativo sobre el tipo silvestre para su uso en el
desarrollo de la vacuna (véase el Ejemplo 4).
La estrategia empleada para producir el gen
optimizado fue diseñar oligómeros sobrelapantes largos en sentido
normal y en contrasentido que se extendieran por todo el gen,
sustituyendo nucleótidos por secuencias de codones de levadura
preferentes, mientras mantienen la secuencia de aminoácidos. Estos
oligómeros se usaron en lugar de ADN templado en una reacción PCR
con Pfu polimerasa. Se diseñaron cebadores de amplificación
adicional y se usaron para amplificar las secuencias reconstruidas
a partir de oligómeros templados.
Las condiciones óptimas para la amplificación
eran específicas de cada sección, pero se empleó mayoritariamente
un programa que se asemejaba a: 95ºC durante 2 minutos
(desnaturalización) seguido de 35 ciclos de 95ºC durante 1 minuto
(desnaturalización), 55ºC durante 1 minuto (alineamiento), 72ºC
durante 3,5 minutos (extensión), seguido por 72ºC durante 10
minutos de extensión final y mantenimiento a 4ºC. Los productos de
PCR se examinaron por electroforesis en gel de agarosa. Las bandas
de tamaño apropiado se escindieron y el ADN se purificó en gel. Los
fragmentos amplificados se usaron después como plantilla para
ensamblar el gen HPV 58 L1 reconstruido 1497 nt.
Siguiendo a la reconstrucción, la banda 1947 nt
se purificó en gel y se ligó al vector pCR-Blunt
(Invitrogen, Carlsbad, CA, EEUU). Siguiendo a la ligación, las
células T0P10 se transformaron con la mezcla de ligación. Las
colonias se cultivaron en LB con canamicina y se extrajo el ADN
plasmídico de las colonias mediante técnicas miniprep. El ADN
plasmídico se secuenció para confirmar los cambios de reconstrucción
del 58 L1 deseados. Para añadir extensiones BamHI a ambos extremos,
se reamplificó el 58 L1 R (reconstruido) a partir de
pCR-Blunt-58 L1 R con los cebadores
siguientes: 5'Bam 58 reconstruido
5'-GGATCCCACAAAACAAAATGTCTGTCTGGAGACC-3'
(SEQ ID Nº:8) y 3'Barn 58 reconstruido
5'-GGATCCTTACTTCTTGACC T T C-3' (SEQ
ID Nº:9).
El producto L1 amplificado se purificó en gel
usando el kit Geneclean y se clonó en pCR2.1 (Invitrogen). Las
células Top10F se transformaron con el plásmido pCR2.1. Las colonias
blancas se cultivaron en medio LB con ampicilina, agitándose a 37ºC
durante 16 horas. Se realizaron minipreps para extraer el ADN
plasmídico. Para liberar el gen HPV 58 L1 a partir de las
secuencias del vector, se realizaron digestiones con endonucleasas
de restricción. El ADN digerido se sometió a electroforesis en gel
de agarosa y se visualizó por marcado con bromuro de etidio. La
banda L1 se purificó usando el kit Geneclean y se ligó a pGAL110
desfosforilado digerido con BamHI. Las células DH5\alpha de E.
coli se transformaron con la mezcla de ligación.
Las colonias resultantes se examinaron por PCR
para que el inserto de HPV 58 L1 estuviera en la orientación
correcta. Se preparó ADN maxiprep. Se confirmaron la secuencia y la
orientación mediante perfiles de digestión de restricción y
secuenciación de ADN. Se denominó pGAL110-HPV 58L1R
Nº 17 al clon seleccionado. Las células de Saccharomyces
cerevisiae se hicieron competentes mediante formación de
esferoplastos y se transformaron con pGAL110-HPV
58L1 Nº 17. La transformación de levadura se plaqueó en agar blando
Leu(-) sorbitol en placas de agar Leu(-) sorbitol y se incubó de
forma invertida durante 3-5 días a 30ºC. Las
colonias se recogieron y se estriaron para su aislamiento en placas
de agar Leu(-) sorbitol. Las colonias aisladas se cultivaron
subsecuentemente en 5 ml de 5 X Leu(-) Ade(-) sorbitol con glucosa
al 1,6% y galactosa al 4% en cultivos en tubos rotatorios a 30ºC
para inducir la transcripción y la expresión proteica de L1. Después
de 48 horas, un volumen de cultivo equivalente a una cantidad de
células de una DO_{600} = 10 se aglomeró, el sobrenadante se
retiró y las pellas se congelaron y se almacenaron a -70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Las pellas de células de células de levadura
transformada inducidas para expresar HPV 58 L1 o HPV 58 L1 R
mediante inducción con galactosa se descongelaron sobre hielo, se
suspendieron en 0,8 ml de reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco
BRL) y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se
añadió al vial un quinto de volumen de cloroformo. Se agitó
vigorosamente durante 15 segundos para mezclar y se incubó a
temperatura ambiente durante 3 minutos. Después de una
centrifugación de 5 minutos a 13 k rpm, la fase superior se recogió
y se transfirió a un vial nuevo. Se añadieron 0,4 ml y se incubaron
a temperatura ambiente durante 10 minutos. Para aglomerar el ARN,
se realizó una centrifugación a 13 k rpm durante 10 minutos. El
sobrenadante se decantó, la pella de ARN se lavó con EtOH al 75% y
se repitió la centrifugación. El sobrenadante se decantó y la pella
de ARN se dejó secando al aire durante 15 minutos seguido de
suspensión en agua carente de ARNasa. Se realizó una espectroscopía
para determinar la concentración de ARN en la muestra, aceptando la
suposición de que una lectura de A_{260} de 1 = 40 \mug/ml de
ARN cuando la A_{260/280} es 1,7-2,0.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se moldeó gel de
formaldehído-agarosa al 1,1%. Se combinaron cinco y
diez microgramos de ARN con tampón de desnaturalización
(concentraciones finales: formaldehído al 6%, formamida al 50% y 0,1
x MOPS) y se calentó a 65ºC durante 10 minutos. Se añadió un décimo
de volumen de solución tampón de carga de gel y la muestra se cargó
en el gel. La electroforesis se realizó a 75 voltios en tampón 1 x
MOPS durante 3 horas. El gel se lavó durante 60 minutos en 10 x
SSC.
El ARN se transfirió a una membrana de nailon
Hybond-N+ (Amresham Biosciences, Piscataway, NJ) por
acción capilar durante 16 horas en 10 x SSC. El ARN se fijó después
a la membrana de nailon mediante entrecruzamiento usando la función
de entrecruzamiento del Stratalinker UV de Stratagene (Stratagene,
La Jolla, CA, EEUU). Después de la fijación, la membrana de nailon
se dejó secar al aire.
El kit I de detección y marcaje de ADN DIG High
Prime de Roche (Hoffmann-La Roche ltd., Basilea,
Suiza) se usó para etiquetar secuencias de ADN de 58 L1 wt y 58 L1
R con DIG para usarse como un cóctel de sondas para detectar
transcritos de 58 L1 wt y 58 L1 R por análisis de Northern (Northern
blot). La prehibridación, hibridación y desarrollo inmunológico
usando un anticuerpo conjugado con una fosfatasa alcalina
anti-DIG se realizó por recomendación del
fabricante. Brevemente, la mancha (blot) se prehibridiza a 37ºC
durante 30 minutos con agitación vigorosa. El cóctel de sondas se
desnaturalizó por calentando hasta 95ºC durante 5 minutos y
desactivando con hielo. El cóctel de sondas se añadió a la solución
de hibridación y se aplicó a la membrana durante 4 horas a 44,6ºC
con agitación vigorosa. La solución de hibridación se eliminó
después y la mancha se lavó 2 veces durante 5 minutos en 2 x SSC
con SDS al 0,1% a temperatura ambiente, seguido de un lavado
adicional a 65ºC con 0,5 x SSC y SDS al 0,1%. La mancha se bloqueó
después durante 30 minutos y se aplicó el anticuerpo conjugado con
la fosfatasa alcalina anti-DIG a una dilución 1:5000
durante 30 minutos. La mancha se lavó y la presencia de ARN unido a
la sonda se determinó por detección con sustrato NBT/BCIP de
anticuerpos unidos anti-DIG conjugados con la
fosfatasa alcalina.
El análisis inicial de levadura que expresa 58
L1 wt sugirió que había traducción y transcripción de longitud
total de HPV 58 L1 funcional; sin embargo, el nivel de expresión
puede aumentarse si la secuencia se ha reconstruido con secuencias
de codones de levadura preferentes. La secuencia 58 L1 reconstruida
se manipuló para omitir cualquier posible sitio de terminación de
transcripción prematuro asegurando la transcripción completa. El
análisis de Northern del transcrito 58 L1 R reveló que se generaron
cantidades aumentadas de transcritos de longitud total en
comparación con los resultados obtenidos para 58 L1 wt (Figura
3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Pellas de células de levadura congeladas de
cultivos inducidos por galactosa equivalentes a una cantidad de
células de una DO_{600} = 10 se descongelaron sobre hielo y se
suspendieron en 300 \mul de tampón de PC (Na_{2} HPO_{4} 100
mM y NaCl 0,5 M, pH = 7,0) con PMSF 2 mM. Se añadieron perlas de
vidrio de 0,5 mm lavadas con ácido a una concentración de 0,5
g/tubo. Los tubos se agitaron en el vórtex durante 3 ciclos de 5
minutos a 4ºC con una pausa de 1 minuto. Se añadieron 7,5 \mul de
TritonX100 al 20% y se repitió la etapa del vórtex durante 5
minutos a 4ºC. Los tubos se situaron sobre hielo durante 15 minutos
y seguidamente se centrifugaron durante 10 minutos a 4ºC. El
sobrenadante se transfirió a un tubo de microfuga estéril, se
etiquetó como extracto de proteína de levadura total, se puso fecha
y se almacenó a -70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El extracto de proteína de levadura total de
veinte colonias de levadura aisladas para cada construcción 58 L1
se analizó mediante análisis de Western (Western blot) para
confirmar la expresión de la proteína 58 L1 después de la inducción
con galactosa.
Se combinaron diez, cinco y dos y medio
microgramos del extracto de proteína de levadura total de aislados
representativos de 58 L1 y 58 L1 R con tampón de carga de
SDS-PAGE y se calentó hasta 95ºC durante 10 minutos.
La proteína 16 L1, que es aproximadamente de 55 kD, se incluyó como
control positivo, junto con el extracto de proteína de levadura
total carente de HPV L1 como control negativo (no se muestran los
datos).
Las proteínas se cargaron en gel de
SDS-PAGE al 10% y se sometieron a electroforesis en
tampón de tris-glicina. Después de la separación de
las proteínas, las proteínas se transfirieron mediante Western del
gel a nitrocelulosa y la mancha se bloqueó en 1 x tampón diluyente
(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, EEUU) durante
una hora a temperatura ambiente con balanceo. La mancha se lavó tres
veces y se incubó a temperatura ambiente durante 16 horas con suero
de cabra anti-trpE-HPV 31 L1
absorbido con levadura, que reacciona de forma cruzada con las
proteínas HPV 16 y HPV 58 L1. La mancha se lavó después tres veces y
se incubó con una dilución 1:2500 de anticuerpo conjugado
anti-cabra-HRP durante 1 h. La
mancha se lavó de nuevo tres veces y se aplicó el sustrato de
detección (Kirkegaard and Perry Laboratories). Las proteínas
inmunorreactivas se detectaron en forma de bandas púrpura sobre la
mancha.
En todos los casos, la proteína 58 L1 se detectó
en forma de una banda inmunorreactiva bien definida sobre la
nitrocelulosa que correspondía a aproximadamente 55kD (Figura 4). La
intensidad de las bandas 58 L1 R parecía ser mayor que las
observadas para 58 L1 wt, sugiriendo que se logró una mejora en la
expresión de 58 L1 por optimización del codón de levadura.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Para demostrar la expresión del VLP 58 L1, se
analizó por ELISA una porción de extracto de proteína de levadura
total 58 L1 wt y 58 L1 R. Las células de levadura que expresaban HPV
58 L1 y HPV 58 L1 R se cultivaron por medio de una variedad de
procedimientos, incluidos cultivos en tubo rotatorio, recipientes de
agitación y fermentadores. Se lisaron las células de levadura y se
produjeron los extractos de proteína para determinar la cantidad de
partículas similares a virus (VLP) del HPV 58 L1 producidas por
microgramo de proteína total. Se diseñó un ELISA sándwich para
demostrar la expresión de VLP del HPV 58 L1.
Se usó anticuerpo monoclonal (mAb) H582C3.F7
(F7) purificado de proteína G para unirse a las VLP 58 L1 intactas
encontradas en los extractos de proteína de levadura. El F7 reconoce
específicamente un epítope conformacional de VLP del HPV 58 L1. Las
proteínas desligadas se eliminaron mediante lavado y el H586E11.F4
(F4), otro anticuerpo monoclonal específico conformacional de VLP
del HPV 58 L1 se aplicó como un anticuerpo de detección. Las VLP 58
L1 verdaderas, conformacionalmente correctas, se unieron y la
detección se facilitó por el uso de un anticuerpo IgG2b
anti-ratón conjugado con HRP y sustrato TMB.
Específicamente, el F7 se usó para recubrir el
fondo de las placas de 96 pocillos Immulon 4 HBX durante toda la
noche a 4ºC. Las placas se lavaron tres veces con PBS y Tween 20 al
0,05%, seguido por bloqueo con solución de bloqueo (PBS + Tween 20
al 0,05% + BSA al 1%). Las placas se lavaron tres veces y los
antígenos (lisados totales de células de levadura diluidos en
solución de bloqueo a 12,5 \mug/ml) se aplicaron a la fila A por
duplicado. Los patrones de referencia de las VLP del HPV 58 L1
purificado se aplicaron a la fila A columnas 3 y 4 a 206 ng/ml en
12,5 \mug/ml de proteína de levadura total. La referencia y las
muestras de ensayo se diluyeron serialmente dos veces abajo en cada
columna. Después de tres horas a temperatura ambiente, se eliminó
el exceso de antígeno por aspiración y las placas se lavaron tres
veces. El mAb específico conformacional F4 se diluyó en solución de
bloqueo y se aplicó a cada pocillo durante una hora a temperatura
ambiente. Las placas se lavaron tres veces y se diluyó en solución
de bloqueo un anticuerpo IgG2b anti-ratón conjugado
con HRP y se aplicó durante una hora a temperatura ambiente. Las
placas se lavaron y se aplicó TMB (Pierce Biotechnology, Inc.,
Rockford, IL) durante 5 minutos para detectar complejos de
anticuerpos conjugados con HRP. La reacción de detección se detuvo
con la adición de H_{2}SO_{4} 2M. Las placas se leyeron a 450 nm
de longitud de onda y la concentración de VLP del HPV 58 L se
determinó por comparación con los patrones de referencia en ng de
VLP/\mug de proteína totales.
La Figura 5 muestra una comparación de la
cantidad de VLP detectadas/\mug de proteína totales a partir de
la proteína que expresa el HPV 58 L1 wt y el HPV 58 L1 R de dos
experimentos separados. Los niveles de expresión de VLP del HPV 58
L1 aumentaron 2-3 veces con la optimización del
codón de levadura.
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Ejemplo
8
Para demostrar que, de hecho, la proteína 58 L1
se estaba autoensamblando para forma capsómeros pentámeros de L1,
que a su vez se autoensamblan en partículas similares a virus, un
extracto de proteína 58 L1 R parcialmente purificado se sometió al
microscopio electrónico (ME) de transmisión.
Se cultivo levadura por fermentación a pequeña
escala y se aglomeró. Las pellas resultantes se sometieron a
tratamientos de purificación. Las pellas y los extractos de levadura
clarificados se analizaron por inmunotransferencia para demostrar
la expresión de la proteína L1 y la retención a través del
procedimiento de purificación. Los extractos de levadura
clarificados se sometieron después a centrifugación sobre un
colchón de sacarosa al 45% y la pella resultante se suspendió en
tampón para análisis por ME de transmisión.
En la Figura 6 se muestra una imagen
representativa producida de las VLP 58 L1. El diámetro de las
partículas esféricas en esta muestra en bruto es de 30 a 60 nm, con
algunas partículas presentando una serie regular de capsómeros.
<110> Merck & Co., Inc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> EXPRESIÓN OPTIMIZADA DE HPV 58 L1 EN
LEVADURA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21561 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/519,211
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-11-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1497
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV58 L1-R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 498
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del papiloma humano tipo
58
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1497
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus del papiloma humano tipo
58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgtccgtgt ggcggcctag t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagatctgtg taagtaccac aacaatta
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggatcccac aaaacaaaat gtccgtgtgg c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggatccgtg taagtaccac aacaatta
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1497
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HPV 58 L1 antisentido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
Claims (17)
1. Una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HPV58 L1
como se define en SEQ ID Nº:2, comprendiendo la secuencia de ácido
nucleico una secuencia de nucleótidos como se define en SEQ ID
Nº:1.
2. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 1.
3. Una célula huésped que comprende el vector de
la reivindicación 2.
4. La célula huésped de la reivindicación 3,
siendo la célula huésped una célula de levadura.
5. La célula huésped de la reivindicación 4,
seleccionándose la célula de levadura del grupo constituido por
Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis,
Kluyveromyces lactis y Schizosaccharomyces pombe.
6. La célula huésped de la reivindicación 5,
siendo la célula huésped Saccharomyces cerevisiae.
7. Un procedimiento para producir partículas
similares a virus (VLP) del HPV58 L1 que comprende:
- a)
- transformar levadura con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1;
- b)
- cultivar la levadura transformada en condiciones que permitan la expresión de la molécula de ácido nucleico con codones optimizados para producir una proteína del virus del papiloma recombinante; y
- c)
- aislar la proteína del virus del papiloma recombinante para producir VLP del HPV58 L1.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en
el que la levadura se selecciona del grupo constituido por
Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis,
Kluyveromyces lactis y Schizosaccharomyces pombe.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.
10. Un procedimiento para fabricar una vacuna
para el tratamiento o la prevención de infecciones por HPV,
comprendiendo dicho procedimiento la producción de VLP del HPV58 L1
por el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones
7-8.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que la vacuna comprende además VLP de al menos un tipo de HPV
adicional.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que el al menos un tipo de HPV adicional se selecciona del grupo
constituido por HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35,
HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 y HPV68.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que al menos un tipo de HPV comprende HPV 16.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en
el que la vacuna comprende además VLP del HPV 18.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el la vacuna comprende además VLP del HPV 6 y VLP del HPV 11.
16. El procedimiento de la reivindicación 14 ó
15, en el que la vacuna comprende además VLP del HPV 31.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en
el que la vacuna comprende además VLP del HPV 45.
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