CN101200696B - 人乳头瘤病毒的酵母增殖模型及建立方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人乳头瘤病毒的酵母增殖模型及制备方法，是含有酵母营养缺陷筛选标记Ura3的HPV基因组的酿酒酵母细胞Y303ATCC No.96659或酿酒酵母细胞YPH500ATCC No.76626。本发明所述模型可用于研究HPV基因的功能，或者使用酵母RNA干扰技术研究不同基因的功能，或者再次导入酵母表达载体，在细胞中表达感兴趣的外源蛋白，以研究其在病毒生活周期的作用，或者导入病毒主要衣壳蛋白L1表达载体，包装感染性病毒颗粒，用于实验或HPV疫苗研究。

Description

人乳头瘤病毒的酵母增殖模型及建立方法与应用

技术领域

本发明涉及一种人乳头瘤病毒的酵母增殖系统及其建立方法与应用；尤其涉及一种人乳头瘤病毒(HPV58型)的酵母增殖模型及其建立方法与应用。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种直径约50-60nm的无包膜DNA病毒。HPV有100多个型别，其感染可导致人类皮肤粘膜的多种良、恶性增生性疾病，高危型HPV(16、18、45、58型)感染与宫颈癌等恶性肿瘤的发生关系密切，低危型HPV(6、11型)感染引起性病尖锐湿疣。HPV基因组大小约为8kb，分为非编码区(NCR)、早期区(E区)和晚期区(L区)。非编码区含有HPV DNA复制起始点和基因表达所必需的调控元件。早期区编码和病毒复制、转录调控和细胞转化相关的蛋白。晚期区基因编码2个病毒衣壳蛋白，其中L1为主要衣壳蛋白，L2是次要衣壳蛋白。

由于HPV生活周期依赖于宿主表皮细胞的分化，衣壳蛋白(L1和L2)的合成以及病毒颗粒装配只能在上皮终末分化细胞中进行，在体外未分化的哺乳动物细胞中衣壳蛋白(L1和L2)的表达也受限，目前HPV尚不能在组织细胞中培养。这一特性大大限制了对其基因功能及生活周期的研究。Theinwald及Green(1975年)首次试图建立体外HPV培养系统未能成功，Mungal等(1992年)用HPV感染单层角化细胞(KCs)后，只能有短暂的游离型复制，病毒DNA很快自细胞丢失。Kreider等(1987年)建立了筏式(raft)培养系统，但不足之处在于此培养系统的方法很繁琐，操作难度大，病毒产量很低。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种单细胞真核生物，遗传背景清楚，繁殖迅速，操作方便，成本低廉。在现代分子和细胞生物学中常被用作真核模式生物。

现研究发现，酵母和哺乳动物细胞在许多方面有相似性：

1.HPV在人类细胞中复制所需要的复制系统在酵母细胞中有高度类似物。

2.HPV复制所需的其他反式作用因子如细胞核抗原(CNA)，微型染色体维持蛋白(MCM)，复制因子C以及复制蛋白A等在酵母细胞中都能找到高度保守的类似物。

3.酵母细胞的自主复制序列ARS，和哺乳动物细胞具有高度同源性。

4.酵母细胞的复制起始识别复合物(ORC)，TATA-box结合蛋白等在功能上和哺乳动物细胞高度类似。

Zhao KN等(2002年)首先报道了牛乳头瘤病毒BPV-1病毒颗粒能感染酿酒酵母原生质体，病毒DNA能在细胞中稳定复制、表达。Angeletti PC等(2002年)也同时报道了HPV16在酵母细胞中DNA复制的研究。然而上述酵母模型的研究尚有缺陷和需改进之处：

(1)虽然牛乳头瘤病毒(BPV)是乳头瘤病毒研究的一个方便的工具，但牛乳头瘤病毒(BPV)与人乳头瘤病毒(HPV)毕竟在基因组上有所不同。

(2)Angeletti PC是将全长的HPV16基因组连接到酵母质粒pΔYac，将重组质粒导入酵母细胞中进行研究。此研究中HPV基因组中含有大量外源序列，能否真正反映HPV游离型DNA的复制状态值得探讨。

鉴于上述分析，有必要建立一个人乳头瘤病毒的酵母增殖模型，以实现研究病毒生活周期中HPV的不同基因功能的目的。经检索，目前国内外尚未见以高危型HPV58为研究对象，建立人乳头瘤病毒(HPV58型)的酵母增殖模型及其应用的报道。

HPV58型在我国的感染率较高，仅次于HPV16、18型。HPV58型的研究具有明显的中国特色。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种人乳头瘤病毒(HPV58型)的酵母增殖模型及其建立方法与应用。

本发明所述的人乳头瘤病毒的酵母增殖模型，其特征在于：所述酵母增殖模型是含有酵母营养缺陷筛选标记Ura3的HPV基因组的酿酒酵母细胞Y303(MAT alpha，ade2，trp1，his3，ura3，leu2)ATCC No.96659或酿酒酵母细胞YPH500(MAT alpha，ade2，his3，leu2，lys2，trp1，ura3)ATCC No.76626。

其中，所述含有酵母营养缺陷筛选标记Ura3的HPV基因组优选为HPV58-Ura。

上述人乳头瘤病毒的酵母增殖模型的建立方法，步骤包括：设计构建带筛选标记的HPV58基因组，转化酿酒酵母细胞，酿酒酵母细胞的功能鉴定；其特征在于，所述HPV58基因组的构建方法是，将酵母营养缺陷筛选标记Ura3插入质粒pEGFPN1-HPV58的L2基因中构建pEGFPN1-HPV58-Ura；酶切pEGFPN1-HPV58-Ura释放HPV58-Ura；所述转化酿酒酵母细胞的方法是，将释放的HPV58-Ura用连接酶环化，环化反应体系为：T4 DNA连接酶1μl、10x连接缓冲液2μl、线性HPV58-Ura200-500ng、用蒸馏水补足20μl，置于16℃，30-60分钟；之后按常规酵母转化条件转化酿酒酵母细胞Y303 ATCC No.96659或酿酒酵母细胞YPH500 ATCC No.76626。

上述酿酒酵母细胞的功能鉴定的方法中，采用如下方法实施酵母细胞破壁：①在Lyticase酶解消化后加入改良的裂解buffer-I(配方为10mM Tris-HCl，pH 7.5，10mMEDTA，and 0.2％Triton X-100)进行破壁；或②在改良的裂解buffer-II(配方为10mMTris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，1％SDS and 2％Triton X-100)中加入酸洗玻璃珠，再加入实验量酚、氯仿或trizol，振荡10分钟破壁；提取阳性克隆酵母细胞的Hirts DNA、酵母染色体DNA和酵母质粒，用荧光定量PCR和基于RNA探针的Southern blot鉴定HPV58-Ura在酵母细胞中的存在形式；荧光定量PCR鉴定病毒基因组能否在酵母细胞中稳定复制传代；反转录PCR以及实时荧光定量PCR鉴定酵母细胞中HPV58早期和晚期mRNA的表达。

其中涉及的创新性方法包括：重组HPV DNA环化分子的体外制备、改进的酵母细胞破壁方法、Hirts法提取酵母染色体外游离的病毒DNA、荧光定量PCR鉴定酵母细胞中外源DNA存在状态、基于RNA探针的southern blot杂交条件。

经荧光定量PCR和Southern blot验证HPV58-Ura在酵母细胞中以游离体形式存在；荧光定量PCR验证病毒基因组可以在酵母细胞中稳定复制传代。反转录PCR以及实时荧光定量PCR验证在酵母细胞中有HPV58早期基因(E1，E2，E6，E7)和晚期基因(L1，L2)的表达，说明HPV58在酵母中可有功能性mRNA的表达。酵母复制蛋白可识别病毒复制起始点，酵母转录因子可识别病毒启动子。表明HPV58酵母增殖模型构建成功。

实验证实：在上述系统中，不仅使用环化的HPV DNA分子，线性HPV DNA分子也取得成功。

本发明所述人乳头瘤病毒的酵母增殖模型的应用，其特征在于，所述人乳头瘤病毒的酵母增殖模型用于研究含有突变基因的HPV58中兴趣基因的功能，或者使用酵母RNA干扰技术研究不同基因的功能，或者再次导入酵母表达载体，在细胞中表达感兴趣的外源蛋白，以研究其在病毒生活周期的作用，或者导入病毒主要衣壳蛋白L1表达载体，包装感染性病毒颗粒，用于实验或HPV疫苗研究。

本发明的创新以及优良效果如下：

1.本发明首次建立了HPV58酵母增殖系统。设计制备了带酵母筛选标记Ura3的HPV58完整基因组DNA(HPV58-Ura)，将其成功导入酵母细胞。此研究中HPV复制及基因表达所需顺式作用原件来源于HPV本身，能真正反映HPV基因的状态。选择Ura3插入HPV58基因组的最佳位置，尽可能地减少了外源基因对病毒复制和转录的干扰同时不破坏主要衣壳蛋白的ORF。结果表明，病毒基因组可以在酵母细胞中稳定复制传代，表达其早期和晚期基因。

2.本发明建立了HPV58-Ura环化反应的合适反应体系。采用此反应体系可提高DNA环化效率，约70％-80％的线性DNA环化连接为开环DNA，未见到DNA间的相互连接。较好地解决了连接反应中的矛盾。既尽量降低了线性DNA浓度以防止DNA间连接的产生，同时又提高了环化DNA的产量。

3.本发明总结出了二种有效的酵母细胞破壁方法。一种为在Lyticase辅助下通过酶解作用部分或全部消化酵母细胞壁，然后再加入改良的裂解buffer-I进行破壁。此法操作较为温和，对酵母细胞内亚细胞结构不构成破坏，但操作比较繁琐，适用于Hirts法提取酵母染色体外游离的病毒DNA，以及酵母亚细胞结构的提取等。二为玻璃珠法，在改良的裂解buffer-II中加入酸洗玻璃珠，加入适量酚、氯仿或trizol，振荡器上振荡10分钟，镜检可见95％以上酵母细胞壁破裂。此法可用于酵母质粒或总RNA的提取。比液氮研磨、裂解液或trizol中研磨棒研磨破壁率高，操作简便省时。

4.本发明首次应用Hirts法提取酵母染色体外游离的病毒DNA。Hirts法用于提取哺乳动物细胞核内游离于细胞染色体外的DNA。本发明通过制备酵母原生质体巧妙地将此方法应用于提取酵母细胞核内游离DNA。

5.本发明首创了一种通过荧光定量PCR相对定量来鉴定细胞中外源DNA存在状态的方法。具体为Hirts法提取酵母细胞核内游离DNA，并提取其副产物酵母基因组DNA。以酵母18srDNA为内参照，HPV58特异性引物扩增Hirts DNA和酵母基因组DNA。比较两者中HPV58-Ura的相对含量。以确定外源DNA在细胞中的存在状态是游离型、整合型还是两者兼有。此法操作较Southern blot简便，经济。

6.本发明在southern blot中应用RNA探针并摸索出了较为合适的杂交反应条件。mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想的，因为RNA/RNA，RNA/DNA杂交体的稳定较DNA/DNA杂交体稳定性高，单链RNA分子不存在互补双链的竞争结合，其与待测核酸顺序杂交率较高。RNA探针一般用于Northern blot，常规的Southern blot中使用DNA探针。本实验通过分析RNA/DNA结合体的稳定性，通过实验摸索出了Southern blot中RNA探针所需的合适杂交条件。

7.作为本发明的侧支，为确保尽量提高酵母转化反应中病毒DNA的量并简化实验步骤，还首次尝试将线性HPV58-Ura基因成功转入酵母细胞中；荧光定量PCR检测发现病毒基因组可以在酵母细胞中环化并且能够稳定复制传代；其基因组环化的具体机制还有待探讨。

附图说明

图1为HPV58-Ura的构建(此方法可同时用于含有突变基因的重组病毒基因组的构建)PCR扩增质粒PRS316上的Ura基因，将基因插入pE6FPN1-HPV58构建pEGFPN1-HPV58-Ura，酶切释放线性HPV58-Ura，环化后即可用于转化酵母。

图2为HPV58-Ura构建过程各产物酶切鉴定图，其中，M1：DNA标记物(Marker)，DL2,000，1：pMD19-T-Ura3 plasmid，2：pMD19-T-Ura3经SgrAI酶切，3：pEGFPN1-HPV58-Ura plasmid，4：pE6FPN1-HPV58-Ura经SgrAI酶切，5：pEGFPN1-HPV58经SgrAI酶切，6：pEGFPN1-HPV58 plasmid M2：λ-Hind III DNA标记物(Marker)。

图3显微镜下显示酵母细胞和酵母原生质体，其中，A：酵母细胞，B：酵母原生质体。

图4为荧光定量PCR鉴定HPV58-Ura在酵母细胞内的存在状态。

1：Hirts DNA，2：酵母染色体DNA。

对酵母细胞Hirts DNA和酵母染色体DNA中所含有的病毒DNA进行定量。对比HirtsDNA和酵母染色体DNA中病毒DNA含量的差别。图中可见Hirts DNA中病毒DNA的相对含量为酵母染色体DNA中其含量的5.72倍。说明HPV58-Ura可以以游离体的形式存在于酵母细胞中。

图5为Southern blot进一步鉴定酵母细胞中HPV58-Ura的存在状态。图中，

1.为质粒来源的线性HPV58-Ura，作为阳性对照和分子量标准。2.为从酵母细胞中提出的质粒。图片说明酵母细胞中HPV58-Ura全部以游离体的形式存在。

图6为荧光定量PCR法检测HPV58-Ura能否在酵母细胞中稳定复制传代，图中，

A为绝对定量标准曲线，B为PCR产物融解曲线。C为连续5代酵母中提取酵母质粒中HPV基因组含量，P1：2.46×106copies/μl，P2：2.04×107copies/μl，P3：6.86×107copies/μl P4：3.75×107copies/μl，P5：4.88×107copies/μl。说明病毒基因组可以在酵母细胞中稳定复制传代。

图7为酵母总RNA中HPV58-Ura mRNA逆转录PCR产物电泳图，图中，

lane1，3，5，7，9，11：HPV58-Ura转化酵母总RNA经DNaseI酶切后作为模板。所用引物分别扩增E1，E2，E6，E7，L1，L2的特异性片段，未扩出相应条带。表明总RNA中污染的病毒基因组已被完全消化。

Lane2，4，6，8，10，12：经酶切处理后的总RNA反转录PCR产物，所用引物分别扩增E1，E2，E6，E7，L1，L2的特异性片段。说明病毒在酵母细胞中有以上早期和晚期mRNA的表达。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图说明对本发明做进一步的说明。

实施例：

一.含有酵母营养缺陷筛选标记Ura3的HPV基因组(HPV-Ura3)的构建此方法同样适用于将Ura3插入含有突变基因的病毒基因组

1.以含Ura3的pRS316质粒为模板，用含有SgrA I酶切位点的引物对其进行PCR扩增，扩增产物为约1.1Kbp的目的基因(Ura3)。

上游引物：5′-GAT CCA CCG GCG GCA GAT TGT ACT GAG AGT G-3′

下游引物：5′-CTA GGC GGC CAC TAG TAT ACA TGC ATT TAC-3′

2.将上述PCR产物切胶回收。回收的PCR产物连接至pMD19-T simple载体上即为pMD19-T-Ura3，热转化至E.coli Competent Cell DH5α，涂布平板过夜培养菌体。

3.将测序正确的pMD19-T-Ura3使用SgrA I进行单酶切；同时将pEGFPN1-HPV58用SgrAI进行单酶切(切点位于L2基因上)，并进行BAP处理。

4.分别切胶回收约1.1Kbp的DNA片段和载体部分DNA片段。将Ura3和线性化的pEGFPN1-HPV58连接后并热转化至E.coli Competent Cell HB101中，涂布平板过夜培养菌体。

5.从转化平板上挑选单菌落提取质粒DNA后使用SgrA I进行鉴定，所得重组质粒为pEGFPN1-HPV58-Ura.如图1所示。

二.HPV58-Ura连接环化

使用Bgl II对pEGFPN1-HPV58-Ura进行单酶切，释放HPV58-Ura用连接酶环化，环化反应体系为：

T4 DNA连接酶     1μl

10x连接缓冲液    2μl

线性HPV58-Ura    200-500ng

余下用DDW补足20μl，置于16℃，30-60分钟。

连接产物即可用于酵母细胞转化。

三.酵母细胞的培养和转化

1.啤酒酵母(酿酒酵母细胞Y303 ATCC No.96659)接种标准的YPD液体培养基，28-30℃振荡培养12-16小时(OD值为0.15-0.3)，菌体重悬于100ml YPD中，28-30℃孵育3-5小时，至OD值为0.4-0.5。按常规方法制备酵母菌感受态。

2.转化条件：0.1-1μg待转化DNA，5μl担体DNA，加入50μl感受态细胞(酿酒酵母细胞Y303 ATCC No.96659)，按常规酵母转化条件操作。选择平板上长出的阳性菌落即含有转化入的DNA。

四.酵母细胞原生质体的制备

酵母细胞沉淀用无菌水重悬，离心2500rpm，10分钟，弃上清；然后用1M的山梨醇重悬沉淀，离心2500rpm，10分钟，弃上清；沉淀再次重悬于含lyticase和β-巯基乙醇的SCE缓冲液(1M山梨醇，0.1M柠檬酸钠，10mM EDTA，pH 6.8)中。悬浮液28-30℃避光轻微振荡3小时，随时镜检以确定是否充分消化酵母细胞壁。待大部分细胞消化为原生质体(显微镜下变大变圆，如图3所示)后，2800rpm离心15分钟沉淀酵母原生质体，STC缓冲液(1M山梨醇，10mM CaCl₂，10mM Tris-Cl， pH 7.5)重悬沉淀，同样离心后弃上清，洗涤两次，沉淀待用。

五.酵母细胞破壁

1酶解法：通过Lyticase消化酵母细胞壁，然后再加入改良的裂解buffer-I(10mMTris-HCl，pH 7.5，10mM EDTA，and 0.2％ Triton X-100)进行破壁。

2.玻璃珠法：在改良的裂解buffer-II(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，1％SDS and2％ Triton X-100)中加入0.3g酸洗玻璃珠，加入实验量酚、氯仿或trizol，振荡器上最大转速振荡10分钟，镜检可见95％以上酵母细胞壁破裂。

六.酵母细胞Hirts DNA提取

将制备好的酵母原生质体沉淀重悬在溶解缓冲液Buffer I中，室温10分钟，加入200μl 5M NaCl，-70℃放置1小时，37℃融化20分钟。10000rpm离心15分钟，上清中即含有hirts DNA。取上清，加入蛋白酶K 100μg，37℃孵育1小时。将离心沉淀物中加入0.5mlTE，同样加入蛋白酶K 100μg，37℃孵育1小时。酚，氯仿抽提一次，-20℃乙醇沉淀，2小时。12000rpm，10分钟，70％7醇漂洗沉淀，12000rpm 3分钟去上清，晾干30分钟，分别加入50μl TE。即可得到Hirts DNA和副产物酵母染色体DNA。

七.酵母质粒提取

培养酵母菌。离心收集菌体，倾去上清，加入裂解bufferII，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，0.3g酸洗玻璃珠。振荡器上振荡10分钟，12000rpm离心5分钟，取上清置新Ep管中，加入2倍体积无水乙醇，振荡混匀，室温放置2分钟。12000rpm离心10分钟，弃上清加入70％乙醇漂洗沉淀。12000rpm离心5分钟，弃上清，晾干15分钟。加入TE溶解沉淀，所得即为酵母细胞质粒(含有游离的病毒基因组)。

八.荧光定量PCR鉴定HPV58-Ura在酵母细胞内的存在状态

为验证酵母细胞中病毒基因组是在酵母中是以游离体状态还是整合状态，将酵母细胞Hirts DNA和酵母染色体DNA进行荧光定量PCR反应。对比Hirts DNA和副产物酵母染色体DNA中病毒基因组含量的差别。

所用引物为HPV58 E1基因特异性引物，可扩增136bp片段，引物序列如下：

上游：5’CTGCAATGGATGACCCTGAAG 3’

下游：5’CCACTATCGTCTGCTGTTTCGT 3’

内参照为酵母18srDNA，内参照引物扩增产物为152bp，序列如下：

上游：5’TTGTGCTGGCGATGGTTCA 3’

下游：5’TGCTGCCTTCCTTGGATGTG 3’

进行相对定量比较的模板分别是HPV58-Ura转化的Y303的Hirts DNA和酵母染色体DNA。阴性对照为未转化的Y303的Hirts DNA和酵母染色体DNA。

所用试剂为宝生物公司的荧光定量PCR试剂盒。其反应体系如下：

SYBR premix Ex Taq(2X)10μl

E1上游引物(10uM)      0.4μl

E1下游引物(10uM)      0.4μl

ROX reference(50x)    0.4μl

DNA模板               1μl

DDW                   7.8μl

将反应体系加入96孔PCR板中

按如下程序进行荧光定量PCR反应：

95℃ 10s

95℃ 5s，60℃ 40s 40个循环

所得结果如图4所示。

九.基于RNA探针的Southern blot检测HPV58-Ura在酵母细胞中的存在状态

1.电泳，样品分别为：

a：用Bgl II酶切pEGFPN1-HPV58-Ura释放线性HPV58-Ura，作为阳性对照和分子量标准。

b：从HPV58-Ura转化的酵母菌Y303中提取的酵母质粒。c：从未转化的酵母菌Y303中提取的质粒，作为阴性对照。

上述样品经琼脂糖凝胶电泳。

2.凝胶定位后浸于适量变性液中，室温1小时，缓慢摇动。

3.将凝胶用去离子水漂洗一次，然后浸泡于适量中和液中30分钟，缓慢摇动。换新鲜中和液，继续浸泡15分钟。

4.常规毛细管转膜法将凝胶中的DNA片段转移至尼龙膜上。

5.254nm紫外交联5分钟，将DNA片段固定在尼龙膜上，双蒸水冲洗，晾干。

6.将预杂交液预热至50℃，将尼龙膜置于预杂交液中，在杂交袋中封紧，50℃预杂交2-3小时。

7.将Dig Labeled RNA probe置于1ml RNA dilution buffer中，74℃水浴10分钟，置冰上急冷。

8.倾去预杂交液，将适量探针和杂交液混合，加入杂交袋中，50℃杂交过夜。

9.2xSSC，0.1％SDS室温下漂洗2×20分钟；0.1xSSC，0.1％SDS 68℃度漂洗2×30分钟；Washing buffer室温下漂洗1-5分钟100ml Blocking solution室温下漂洗1.5小时。

10.50ml Ab液室温30分钟。

11.100ml washing buffer室温下漂洗2×30分钟。100ml detection buffer室温下平衡2-5分钟。

12.X片暗盒中，将1ml显色液CDP-star滴加在尼龙膜上，将保鲜膜反折覆盖住尼龙膜。暗室内X片曝光，洗片。日光灯下观察杂交曝光情况。

实验结果如图5所示。

十.荧光实时定量PCR鉴定HPV-Ura能否在酵母细胞内稳定传代

所用引物可特异性扩增HPV58 E1基因上136bp片段：

上游：5’CTGCAATGGATGACCCTGAAG3’

下游：5’CCACTATCGTCTGCTGTTTCGT3’

绝对定量标准曲线的制备：以已知拷贝数的pEGFPN1-HPV58-Ura为模板，分别稀释为10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴等五个浓度梯度。

需定量的未知浓度的HPV58-Ura模板来源于连续五代HPV58-Ura转化的酵母中提取的质粒DNA。

阴性对照为从未经转化的Y303中提取的酵母质粒DNA。

所用试剂为宝生物公司的荧光定量PCR试剂盒。其反应体系如下：

SYBR premix Ex Taq(2X) 10μl

E1上游引物(10uM)       0.4μl

E1下游引物(10uM)       0.4μl

ROX reference(50x)     0.4μl

DNA模板                2μl

DDW                    6.8μl

将反应体系加入96孔PCR板中

按如下程序进行荧光定量PCR反应：

95℃ 10s

95℃ 5s，60℃ 40s 40个循环

所得结果如图6所示。

十一.反转录PCR鉴定酵母细胞中HPV58早期和晚期mRNA的表达

1.总RNA反转录反应

常规提取酵母细胞总RNA，酵母总RNA经DNAse I消化后，按如下体系进行第一链cDNA的合成：

随机引物    1μl

总RNA       10μl

DEPC水      1μl

混匀，70℃ 5分钟，立即置冰上急冷

加入5xbuffer 4μl，dNTP混合物2μl，RNase抑制剂1μl混匀，25℃ 5分钟

加入M-Mulv Reverse transcriptase 1μl

25℃ 10分钟

42℃ 60分钟

70℃ 10分钟，立即置冰上。

所得产物即为cDNA

2.PCR反应，所用引物为E1，E2，E6，E7，L1，L2特异性引物

E1引物(扩增产物136bp)：

上游：5’CTGCAATGGATGACCCTGAAG 3’

下游：5’CCACTATCGTCTGCTGTTTCGT 3’

E2引物(扩增产物335bp)：

上游：5’GACAAAGCGACGACGACT 3’

下游：5’TGTTGCCTTTGTGTTGCTG 3’

E6引物(扩增产物128bp)：

上游：5’ACTATGTTCCAGGACGCAGAC 3’

下游：5’ACCTCAGATCGCTGCAAAG 3’

E7引物(扩增产物133bp)：

上游：5’GACGAGGATGAAATAGGCTTG 3’

下游：5’CGTCGGTTGTTGTACTGTTGA 3’

L1引物(扩增产物249bp)：

上游：5’CTTGAAATAGGTAGGGGACAG 3’

下游：5’CAATGGAGGACAATCAGTAGC 3

L2引物(扩增产物153bp)：

上游：5’CATAGTGACATATCGCCTGCTC 3’

下游：5’AGCCCCTATTTGCTTTCCAC 3

所用模板为病毒基因组酵母总RNA经反转录所得cDNA，阴性对照为酵母总RNA经DNAse I酶切产物。

按如下体系进行PCR反应：

Taq           0.3μl

dNTP          1μl

PCR buffer    2.5μl

上游引物      1μl

下游引物      1μl

模板          1.5μl

Dw            17.7μl

94℃ 3分钟；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒(34个循环)；72℃ 5分钟；4℃ 2小时

实验结果表明，在酵母细胞中有HPV58早期mRNA(E1，E2，E6，E7)和晚期mRNA(L1，L2)的表达。如图7所示。

本实施例主要叙述了HPV58酵母增殖系统的建立以及鉴定过程，同样的方法可用于含有突变基因的HPV58酵母增殖系统的构建，以在酵母细胞中研究HPV基因的功能、HPV基因间及HPV基因与宿主细胞蛋白相互作用。本增殖系统同样可以使用酵母RNA干扰技术，以研究不同基因的功能。

本系统可以导入酵母表达载体，在细胞中表达感兴趣的外源蛋白，以研究其在病毒生活周期的作用。本系统亦可导入病毒主要衣壳蛋白L1表达载体，包装感染性病毒颗粒，用于实验或HPV疫苗研究。

本发明中所述质粒和载体均为市售商品，美国Clontech公司可以购得。

Claims (2)

1.一种人乳头瘤病毒的酵母增殖模型的建立方法，步骤包括设计构建带筛选标记的HPV58基因组，转化酿酒酵母细胞，酿酒酵母细胞中HPV58基因组的功能鉴定，其特征在于，

所述HPV58基因组的构建方法是，将酵母营养缺陷筛选标记Ura3插入质粒pEGFPN1-HPV58的L2基因中构建pEGFPN1-HPV58-Ura；酶切pEGFPN1-HPV58-Ura释放HPV58-Ura；所述转化酿酒酵母细胞的方法是，将释放的HPV58-Ura用连接酶环化，环化反应体系为：T4 DNA连接酶1μl、10x连接缓冲液2μl、线性HPV58-Ura 200-500ng、用蒸馏水补足20μl，置于16℃，30-60分钟；之后按常规酵母转化条件转化酿酒酵母细胞Y303 ATCCNo.96659；

所述酿酒酵母细胞中HPV58基因组的功能鉴定的方法是，采用如下方法实施酵母细胞破壁：①在Lyticase酶解消化后加入改良的裂解buffer-I进行破壁；或②在改良的裂解buffer-II中加入酸洗玻璃珠，再加入实验量酚、氯仿或trizol，振荡10分钟破壁；提取阳性克隆酵母细胞的Hirts DNA、酵母染色体DNA和酵母质粒，用荧光定量PCR和基于RNA探针的Southern blot鉴定HPV58-Ura在酵母细胞中的存在形式；荧光定量PCR鉴定HPV58基因组能否在酵母细胞中稳定复制传代；反转录PCR以及实时荧光定量PCR鉴定酵母细胞中HPV58早期和晚期mRNA的表达；

其中：上述buffer-I配方为10mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM EDTA，和0.2％ TritonX-100；buffer-II配方为10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，1％ SDS和2％ Triton X-100。

2.一种人乳头瘤病毒的酵母增殖模型，其特征在于，所述酵母增殖模型由权利要求1所述方法制得。

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