CN102839183A - 重组肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法与应用。本发明提供了一种用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物。本发明所提供用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物，由DNA分子I、DNA分子II、DNA分子III和DNA分子IV组成；所述DNA分子I的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述DNA分子II的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述DNA分子III的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述DNA分子IV的核苷酸序列如序列表中序列4所示。本发明所提供的重组肠道病毒71型病毒样颗粒(VLP)在形态上和真实的病毒类似并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以为抗病毒疫苗的开发提供了理想的备选方案。

Description

重组肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中重组肠道病毒71型病毒样颗粒的制备方法与应用。

背景技术

手足口病(Hand foot moth disease，HFMD)是婴幼儿常见的传染病，由人肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus)A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5型；埃可病毒(ECHO viruses)和肠道病毒71型(EV 71)感染引起，其中以EV 71及Cox A16型最为常见。EV71感染引起的手足口病大部分病例病情较轻，可自愈，但少数患者可出现心肌炎、无菌性脑膜炎和肺水肿等并发症，严重时可危及生命。在我国从上世纪80年代以来，北京、河北、天津、福建、山东、广东等十几个省(市)都曾有发生手足口病的报道。2000年5～8月山东省招远市小儿手足口病暴发，仅市人民医院就接诊患儿1698例。2007年，全国共报告手足口病病例83，344例，死亡17例，仅山东省就报告了手足口病病例39，606例。2008年1月1日至5月12日，北京市累计报告手足口病病例3606例。2009年手足口病流行情况在我国进一步扩大，除西藏外，全国30个省份均有手足口病例发生。全国当年累计报告手足口病例115万余例，重症13810例，死亡353例，高峰期每天新增感染4000例。2010年手足口病再次疯狂来袭，全国就累计感染病例180万例，死亡近900余例。发病率和死亡率均较2009年同期有较大增高。因此，研制EV71预防性疫苗对于控制婴幼儿手足口病的流行具有重要意义。

肠道病毒71型(EV71)属小RNA病毒，病毒基因组为约7kb的单链RNA，病毒颗粒直径约为20-30nm，由VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白组成。研究显示，EV71结构蛋白可自我组装形成病毒样颗粒结构(Virus-Like Particle，VLP)，具有与天然病毒颗粒相似的空间结构。EV71 VLP免疫小鼠可产生具有保护效力的中和抗体，可显著提高攻毒试验中实验动物的存活率(Wu CN，Lin YC，Fann C，Liao NS，Shih SR，Ho MS.Protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by passiveimmunization with inactivated virus and subunit VP1 vaccine.Vaccine 2001；20：895-904.)，是很有前景的预防婴幼儿手足口病候选疫苗。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物。

本发明所提供的用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物，由DNA分子I、DNA分子II、DNA分子III和DNA分子IV组成；所述DNA分子I的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述DNA分子II的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述DNA分子III的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述DNA分子IV的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

含有所述DNA分子组合物的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种制备重组病毒样颗粒的方法。

本发明所提供的制备重组病毒样颗粒的方法，包括以下步骤：

将所述DNA分子组合物导入宿主菌得到重组菌，从所述重组菌中分离纯化得到重组病毒样颗粒。

所述宿主菌为酵母菌；

所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

所述DNA分子组合物是通过重组表达载体导入宿主菌的。

所述重组表达载体为如下1)和2)所示：

1)将所述DNA分子组合物中的DNA分子I插入表达载体pESC-HIS的多克隆位点之间得到中间重组表达载体I；将所述DNA分子组合物中的DNA分子IV插入所述中间重组表达载体I的多克隆位点之间得到的重组表达载体；

2)将所述DNA分子组合物中的DNA分子III插入表达载体pESC-URA的多克隆位点之间得到中间重组表达载体II；将所述DNA分子组合物中的DNA分子II插入所述中间重组表达载体II的多克隆位点之间得到的重组表达载体。

根据所述方法制备得到的重组病毒样颗粒也属于本发明的保护范围。

本发明的又一个目的是提供一种疫苗。

本发明所提供的疫苗，其活性成分为所述重组病毒样颗粒。

所述的重组病毒样颗粒在制备疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

所述疫苗为预防肠道病毒感染的疫苗。

本发明提供了编码EV71 VP1、VP2、VP3和VP4病毒蛋白质的合成DNA分子。设计合成分子的密码子使用酵母细胞优选的密码子予以提高在酵母细胞培养环境中的蛋白质表达水平。在本发明中，将EV71病毒编码的VP1、VP2、VP3和VP4基因序列在不改变氨基酸序列的前提下转变成含有酵母优选密码子的优化序列。最佳密码子的优选和替换对在特定宿主中高水平表达外源基因具有重要意义。在酵母中表达EV71病毒样颗粒的优点在于成本和工艺效能合算，酵母适合于在发酵罐中大规模生长培养。本发明的EV71 VP1、VP2、VP3和VP4基因序列除经过密码子优化改造外还不含有酵母识别的内部转录终止信号。本发明的EV71 VP1、VP2、VP3和VP4的合成基因序列用编码相同氨基酸的酵母高利用率的密码子替换了不适合在酵母表大中应用的EV71 VP1、VP2、VP3和VP4基因的野生型序列，以完成在酵母中的高表达。本发明利用酵母系统共表达EV71基因优化的VP1、VP2、VP3和VP4的合成基因制备EV71病毒样颗粒。本发明所提供的重组肠道病毒71型病毒样颗粒(VLP)在形态上和真实的病毒类似并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以为抗病毒疫苗的开发提供了理想的备选方案。

附图说明

图1为Western Blot鉴定重组EV71衣壳蛋白VP1的表达；其中泳道A为蛋白分子量标准；泳道B为共转化pESC-VP1-VP4和pESC-VP3-VP2酵母蛋白提取物；泳道C为共转化pESC-URA和pESC-HIS酵母蛋白提取物。

图2为显示了通过透射电镜技术显现的本文中描述的EV71病毒样颗粒(VLPs)的代表样品；图中白色横线代表50纳米。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、制备重组肠道病毒71型病毒样颗粒

一、多肽VP1、VP2、VP3和VP4编码基因的优化

1.EV71 VP1、VP2、VP3和VP4编码基因的密码子优化

在不改变蛋白氨基酸序列的前提下将野生型肠道病毒EV71的VP1、VP2、VP3和VP4蛋白编码基因的密码子替换为酵母细胞高频使用的密码子(见表1)，对序列进行修正，突变不需要的酶切位点及影响或终止蛋白表达的位点。

表1酵母中的密码子应用高频表

2.密码子优化型EV71 P1Y基因的全基因合成

使用序列重叠延伸PCR法全基因分别合成EV71 VP1Y，VP2Y、VP3Y和VP4Y基因，具体方法如下：根据优化后的基因序列合成多条100bp的上下游片段，两片段间3’端互补重叠15bp，上述上下游片段互为模板、引物进行PCR扩增，使用凝胶回收试剂盒回收扩增片段，再以此相邻的回收片段互为引物、模板进行下一轮PCR扩增，得到拼接序列，再以相邻拼接序列互为模板、引物进行PCR拼接，回收拼接序列片段，在依此序列互为模板、引物进行PCR拼接，依此类推最终合成四个密码子优化型基因即EV71 VP1Y，VP2Y、VP3Y和VP4Y基因。

3.扩增优化型多肽VP1、VP2、VP3和VP4的编码基因

根据优化后基因序列设计4对上下游引物(表1)，分别与多肽VP1、多肽VP2、多肽VP3和多肽VP4编码基因的起始位置和终止位置重合，并引入限制性酶切位点。多肽VP1编码基因的5’和3’端分别引入BamHI和XhoI酶切位点；多肽VP2编码基因的5’和3’端分别引入EcoRI和SacI酶切位点；多肽VP3编码基因的5’和3’端分别引入BamHI和XhoI酶切位点；多肽VP4编码基因5’和3’端分别引入EcoRI和BglII酶切位点。

表1扩增优化型多肽VP1、VP2、VP3和VP4编码基因的引物

引物名称	引物序列
		VP1-BamHI-(+)：	5’-AAGGATCCATGGGTGACAGAGTCGCCGAT-3’
VP1-XhoI-(-)：	5’-CCGCTCGAGTCATAAAGTAGTGATGGCT-3’
		VP2-EcoRI-(+)：	5’-CGGAATTCATGTCTCCATCTGCCGAAGCA-3’
VP2-SacI-(-)：	5’-AACGAGCTCCTGAGTAACGGCTTGCCT-3’
		VP3-BamHI-(+)：	5’-CGGGATCCATGGGTTTTCCTACAGAATTG-3’
VP3-XhoI-(-)：	5’-CCGCTCGAGTTGTATTATTCCAGTCTG-3’
		VP4-EcoRI-(+)：	5’-CCGGAATTCATGGGATCACAAGTTTCA-3’
VP4-BglII-(-)：	5’-GAAGATCTCTTTAATGGGGCAGCCAT-3’

以上述合成的四个基因片段为模板，分别以上述4对引物进行PCR扩增，使用凝胶回收试剂盒回收扩增片段。对回收的扩增片段进行测序检测，测序结果为：密码子优化型多肽VP1的编码基因如序列表中序列1所示；密码子优化型多肽VP2的编码基因如序列表中序列2所示；密码子优化型多肽VP3的编码基因如序列表中序列3所示；密码子优化型多肽VP4的编码基因如序列表中序列4所示。

二、构建携带密码子优化型多肽VP1、多肽VP2、多肽VP3和多肽VP4编码基因的酵母表达质粒

1、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

从37℃培养16～20h的新鲜平板上挑取大肠杆菌DH5α(购自Takara公司，产品目录号为D9057S)单菌落，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜(12～16h)。次日从上述培养物中吸取0.5ml按体积比为1∶100转入50ml LB培养基中继续培养约3h，至菌液的OD600值为3时，在无菌条件下将大肠杆菌DH5α转移到一个无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。在4℃条件下，4000rpm离心10min，弃上清，将管倒置lmin，使残留培养液流尽，以10ml用冰预冷的100mmol/L CaCl₂溶液重悬大肠杆菌DH5α沉淀，冰浴30min。4℃，4000rpm离心10min，弃上清，每50ml初始培养物(此处的初始培养物是指细菌培养液)用2ml预冷的含15％(体积百分比)甘油的100mmol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，分装成200μl每管，-80℃保存备用。

2、向大肠杆菌DH5α感受态细胞中转化pESC-URA质粒和pESC-HIS质粒

用无菌吸头分别吸取1μg pESC-URA质粒(购自Angilent technologies，产品目录号为217454)和pESC-HIS质粒(购自Angilent technologies，产品目录号为217451)，分别加入200μl上述制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加入800μl不含抗生素的LB培养基，将管转移至37℃摇床上，温育45min(转速＜150rpm)。取50μl转化pESC-URA质粒的感受态细胞，用一无菌的弯头玻棒轻轻涂到含氨苄抗生素的琼脂平板表面；取50μl转化pESC-HIS质粒的感受态细胞，用一无菌的弯头玻棒轻轻涂到含氨苄抗生素的琼脂平板表面；将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养12～16h。

3、pESC-URA质粒和pESC-HIS质粒的小量制备

分别挑取单个pESC-URA质粒和pESC-HIS质粒转化菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。将培养物分别移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm离心30-60s，倒去培养液，倒置离心管，使上清流尽，用100μl预冷的溶液I[50mmol/L Glucose，25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液III(100ml中含5mol/L KAc60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)温和混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA(100μg/ml)的TE(pH 8.0)溶解沉淀，37℃水浴30～60min后置-20℃保存备用。分别得到pESC-URA质粒DNA和pESC-HIS质粒DNA。

4、酵母表达质粒pESC-VP1的构建

使用限制性内切酶BamH I及Xho I消化pESC-HIS质粒，然后将所回收的载体大片段与同样用BamH I及Xho I双酶切回收的多肽VP1编码基因片段按1∶4比例混合，依次加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为10μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按前述质粒的快速小量制备方法提取质粒。并用内切酶BamH I及Xho I对质粒进行酶切鉴定和测序，挑选阳性重组子。测序结果表明，在pESC-HIS质粒的BamH I及Xho I酶切位点间插入了序列表中序列1所示的DNA片段，说明重组质粒构建正确，将构建的重组质粒命名为pESC-VP1。

5、酵母表达质粒pESC-VP1-VP4的构建

使用限制性内切酶EcoR I及Sac I消化pESC-VP1质粒，然后将所回收的载体大片段与同样用EcoR I及Sac I双酶切回收的多肽VP4编码基因片段按1∶4比例混合，依次加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为10μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按前述质粒的快速小量制备方法提取质粒。并用内切酶EcoR I及Sac I对质粒进行酶切鉴定和测序，挑选阳性重组子。测序结果表明，在pESC-VP1质粒的EcoR I和Sac I酶切位点间插入了序列表中序列4所示的DNA片段，说明重组质粒构建正确，将构建的重组质粒命名为pESC-VP1-VP4。

6、酵母表达质粒pESC-VP3的构建

使用限制性内切酶BamH I及Xho I消化pESC-URA质粒，然后将所回收的载体大片段与同样用BamH I及Xho I双酶切回收的多肽VP3编码基因片段按1∶4比例混合，依次加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为10μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按前述质粒的快速小量制备方法提取质粒。并用内切酶BamHI及Xho I对质粒进行酶切鉴定和测序，挑选阳性重组子。测序结果表明，在pESC-URA质粒的BamH I及Xho I酶切位点间插入了序列表中序列3所示的DNA片段，说明重组质粒构建正确，将构建的重组质粒命名为命名为pESC-VP3。

7、酵母表达质粒pESC-VP3-VP2的构建

使用限制性内切酶EcoR I及Bgl II消化pESC-VP3质粒，然后将所回收载体大片段与同样用EcoR I及Bgl II双酶切回收的多肽VP2编码基因片段按1∶4比例混合，依次加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为10μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按前述质粒的快速小量制备方法提取质粒。并用内切酶EcoR I及Bgl II对质粒进行酶切鉴定和测序，挑选阳性重组子。测序结果表明，在pESC-VP3质粒的EcoR I及Bgl II酶切位点间插入了序列表中序列3所示的DNA片段，说明重组质粒构建正确，将构建的重组质粒命名为命名为pESC-VP3-VP2。

三、重组EV71病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化

1、酿酒酵母感受态细胞的制备

酿酒酵母YPH499(Saccharomyces cerevisiae)，(购自Angilent technologies)平板中挑取单克隆菌落接种于10ml YPD培养液中，30℃振摇培养16h，置取合适体积的过夜培养物加入48ml YPD培养液中混匀，终末OD600值为0.5，30℃振摇培养1h后OD600值为0.7，继续培养30min后，将培养物转入50ml无菌的离心管中，室温1500rpm离心5min，弃上清，用10ml Sc EasyComp transformation kit试剂盒(购自Invitrogen)中的溶液I(试剂盒自带)重悬沉淀，室温1500rpm离心5min，小心弃上清，用1mlScEasyComp transformation kit试剂盒中溶液II(试剂盒自带)重悬沉淀，50μl/管分装灭菌的1.5ml离心管中，置-70℃保存。

2、酵母表达质粒pESC-VP1-VP4和pESC-VP3-VP2转化酵母感受态细胞

将质粒pESC-VP1-VP4和pESC-VP3-VP2各4μl加入上述制备的酵母感受态细胞中，加入Sc EasyComp transformation kit试剂盒中500μl溶液III(试剂盒自带)，在涡旋振荡器上剧烈振荡混匀。将DNA/酵母混合物置30℃水浴中孵育1h，每隔15min在涡旋振荡器上剧烈振荡混匀。取100μl涂布URA选择平板，置30℃孵箱中倒置培养。随机挑选5个单克隆划线于HIS选择平板表面，继续置30℃孵箱中倒置培养。随机挑取5个单克隆菌落接种于10ml HIS选择培养液中，30℃振摇培养16h，使用天根生物公司酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，利用表I中列举的引物采用PCR法筛选阳性克隆，筛选得到含有900bp、765bp、714bp和210bp四个扩增片段的阳性克隆。

3、重组EV71病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化

重组EV71病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达：接种单菌落携带质粒pESC-VP1-VP4和pESC-VP3-VP2的酵母细胞于50ml HIS选择培养液中，30℃振摇培养16h，取合适体积的过夜培养液接种200ml HIS选择培养液中，30℃振摇培养4h，取合适体积的培养液接种3L HIS诱导培养液(含有体积百分比浓度为2％的半乳糖)，30℃振摇培养48h，离心收集菌体沉淀，PBS缓冲液重悬，APV高压均质仪破碎3次，4℃，8000g离心15min，收集上清液置-70℃保存。

重组EV71病毒样颗粒的纯化：取酵母破碎上清液置45％蔗糖垫，18℃，100,000g离心4h，PBS缓冲液重悬沉淀，4℃，13000g离心15min，收集上清液置-70℃保存。

四、重组EV71病毒样颗粒的鉴定及电镜观察

Western Blot鉴定重组EV71衣壳蛋白的表达：取20μl纯化的EV71病毒样颗粒悬液进行10％SDS-PAGE电泳。用识别EV71 VP1蛋白的多克隆抗体(购自abcam公司，产品目录号：ab26858)为一抗，荧光标记羊抗鸡抗体(购自Jackson，产品目录号为103-515-155)为二抗进行Western Blot分析，结果如图1所示(图1中泳道A为蛋白分子量标准；泳道B为共转化pESC-VP1-VP4和pESC-VP3-VP2酵母蛋白提取物；泳道C为共转化pESC-URA和pESC-HIS酵母蛋白提取物)，从图中可见，共转化pESC-VP1-VP4和pESC-VP3-VP2酵母蛋白提取物中检测到37KD的EV71特异性条带，而共转化pESC-URA和pESC-HIS酵母蛋白提取物中没有检测到该特异性条带。

重组EV71病毒样颗粒的电镜观察：取20μl纯化的EV71病毒样颗粒悬液用磷钨酸负染，在透射电镜下观察病毒样颗粒的形态。结果显示，电镜下可见直径约30-40nm的病毒样颗粒的存在(图2)。

Claims (10)

1.一种用于制备重组病毒样颗粒的DNA分子组合物，由DNA分子I、DNA分子II、DNA分子III和DNA分子IV组成；所述DNA分子I的核苷酸序列如序列表中序列1所示；所述DNA分子II的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述DNA分子III的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述DNA分子IV的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

2.含有权利要求1所述DNA分子组合物的表达盒、重组载体、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

3.一种制备重组病毒样颗粒的方法，包括以下步骤：

将权利要求1所述的DNA分子组合物导入宿主菌得到重组菌，从所述重组菌中分离纯化得到重组病毒样颗粒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述宿主菌为酵母菌；

所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：

所述DNA分子组合物是通过重组表达载体导入宿主菌的。

6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：

所述重组表达载体为如下1)和2)所示：

1)将所述DNA分子组合物中的DNA分子I插入表达载体pESC-HIS的多克隆位点之间得到中间重组表达载体I；将所述DNA分子组合物中的DNA分子IV插入所述中间重组表达载体I的多克隆位点之间得到的重组表达载体；

2)将所述DNA分子组合物中的DNA分子III插入表达载体pESC-URA的多克隆位点之间得到中间重组表达载体II；将所述DNA分子组合物中的DNA分子II插入所述中间重组表达载体II的多克隆位点之间得到的重组表达载体。

7.根据权利要求3-6中任一所述的方法制备得到的重组病毒样颗粒。

8.一种疫苗，其活性成分为权利要求7所述的重组病毒样颗粒。

9.权利要求7所述的重组病毒样颗粒在制备疫苗中的应用。

10.根据权利要求8所述的疫苗或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述疫苗为预防肠道病毒感染的疫苗。

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