CN101831410A - 重组肠病毒71型病毒样颗粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人肠道病毒EV71型病毒样颗粒的制备方法。本发明通过使用密码子优化后的编码肠道病毒71型P1及3CD蛋白质的合成多核苷酸制备肠道病毒71型病毒颗粒。本发明的方法提高了EV71型病毒样颗粒在异源宿主细胞中的生产效率并具有与天然病毒颗粒相似的空间结构。

Description

重组肠病毒71型病毒样颗粒的制备方法

技术领域

本发明一般涉及人肠道病毒EV71型病毒样颗粒(VLP)的制备方法。更具体地，本发明涉及密码子优化后的编码肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)P1及3CD蛋白质的合成多核苷酸，以及使用优化后的合成多核苷酸制备肠道病毒71型病毒样颗粒的方法。本发明还涉及含有上述多核苷酸的重组载体和宿主。

背景技术

手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)是婴幼儿常见的传染病，由人肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus)A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5型；埃可病毒(ECHO viruses)和肠道病毒71型(EV 71)感染引起，其中以EV 71及Cox A16型最为常见^[1-6]。EV71感染引起的手足口病大部分病例病情较轻，可治愈，但少数患者可出现心肌炎、无菌性脑膜炎和肺水肿等并发症，严重时可危及生命^[7-11]。截止2008年5月9日止，全国感染手足口病近215万例，造成34名患儿死亡，因此，研制EV71预防性疫苗对于控制婴幼儿手足口病的流行具有重要意义。

肠道病毒71型(EV71)属小RNA病毒，病毒基因组为约7kb的单链RNA，病毒颗粒直径约为20-30nm，由VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白组成。研究显示，EV71四种结构蛋白可自我组装形成病毒样颗粒结构(Virus-Like Particle，VLP)，具有与天然病毒颗粒相似的空间结构。EV71VLP免疫小鼠可产生具有保护效力的中和抗体，可显著提高攻毒试验中实验动物的存活率^[12]，是很有前景的预防婴幼儿手足口病候选疫苗。

发明内容

本发明的一个目的是提供肠道病毒71型(EV71)病毒样颗粒(Virus-Like Particle，VLP)制备方法，该方法包括：

(1)优化肠道病毒71病毒样颗粒P1基因及3CD基因序列；

(2)将优化的肠道病毒71病毒样颗粒P1基因及3CD基因序列克隆到质粒中；

(3)用得到的质粒转化酵母细胞；

(4)从裂解的宿主细胞中分离重组肠道病毒71病毒样颗粒。

根据本发明方法的一个优选实施方案，本发明的方法中所述的酵母细胞选自：酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。

本发明的方法中所述的酵母细胞优选为酿酒酵母。

根据本发明方法的一个优选实施方案，本发明的方法中所述的优化是指在不改变EV71 P1及3CD氨基酸序列的前提下，将P1及3CD基因序列的密码子替换为酵母细胞偏好(高频使用)的密码子，酵母偏好(高频使用)的密码子表见表1。本发明的方法中所述的优化还可以包括所述序列的其他改造以适合在酵母细胞中表达，例如突变不需要的酶切位点及影响或终止蛋白表达的位点。本发明中使用的术语偏好的密码子具有本领域公知的含义，也称为密码子的偏好性(CodonPreference)，是指某些生物体更偏爱使用某些同义三联密码子(即编码相同氨基酸的密码子)。

表1酵母中偏好(高频使用)的密码子表：

TTT F 0.59  TCT S 0.26  TAT Y 0.56  TGT C 0.63

TTC F 0.41  TCC S 0.16  TAC Y 0.44  TGC C 0.37

TTA L 0.28  TCA S 0.21  TAA X 0.47  TGA X 0.31

TTG L 0.28  TCG S 0.10  TAG X 0.22  TGG W 1.00

CTT L 0.13  CCT P 0.31  CAT H 0.64  CGT R 0.15

CTC L 0.06  CCC P 0.15  CAC H 0.36  CGC R 0.06

CTA L 0.14  CCA P 0.42  CAA Q 0.69  CGA R 0.07

CTG L 0.11  CCG P 0.12  CAG Q 0.31  CGG R 0.04

ATT I 0.47  ACT T 0.35  AAT N 0.59  AGT S 0.16

ATC I 0.26  ACC T 0.21  AAC N 0.41  AGC S 0.11

ATA I 0.27  ACA T 0.30  AAA K 0.58  AGA R 0.48

ATG M 1.00  ACG T 0.14  AAG K 0.42  AGG R 0.21

GTT V 0.39  GCT A 0.38  GAT D 0.65  GGT G 0.47

GTC V 0.21  GCC A 0.22  GAC D 0.35  GGC G 0.19

GTA V 0.21  GCA A 0.29  GAA E 0.71  GGA G 0.22

GTG V 0.19  GCG A 0.11  GAG E 0.29  GGG G 0.12

根据本发明方法的一个优选实施方案，本发明的方法中所述的密码子优化的肠道病毒71型病毒样颗粒P1基因序列和3CD基因序列优选地分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列。所使用的序列还包括根据本发明描述的优化方法对P1及3CD基因序列进行优化后所得的其他序列。

根据本发明方法的一个优选实施方案，本发明的方法中所述的质粒为pESC-URA。

根据本发明方法的一个优选实施方案，本发明的方法中所述的质粒为pESC-P1Y-3CDY。

本发明的再一个目的是提供密码子优化后的编码肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)P1及3CD蛋白质的P1基因和3CD基因序列，其分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列。为适合在酵母中表达，根据本发明描述的方法对P1基因和3CD基因进行改造获得的其他序列也属于本发明的范围。

本发明还提供含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列的载体，该载体优选为pESC-URA或pESC-P1Y-3CDY。

本发明还提供含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列的酵母细胞。所述的酵母细胞优选自：酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。所述的酵母细胞更优选为酿酒酵母。

本发明的又一个目的是提供病毒样颗粒(VLP)，而且所得的VLP可以用于基于VLP的婴幼儿手足口病预防性疫苗。

本发明提供了编码EV71 P1和3CD蛋白质的合成DNA分子。设计合成分子的密码子使用酵母细胞优选的密码子予以提高表达水平。合成分子可以用作VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白的来源，所述的蛋白质可以自行装配成VLP。所述的VLP可以用于基于VLP的疫苗制备并提供针对EV71病毒感染的预防。

本发明还涉及并提供了在重组宿主细胞中同时表达EV71P1和3CD蛋白质的方法，该方法包括：(1)将含有编码EV71P1和3CD蛋白质的核酸的载体导入酵母宿主细胞。(2)在允许所述的EV71P1和3CD蛋白质同时表达的条件下培养酵母宿主细胞。

本发明的合成基因可以装配到表达盒中，该表达盒含有经设计以提供在宿主细胞中有效表达EV71P1和3CD蛋白质的序列，如启动子和终止序列。在优选实施方案中，启动子为酿酒酵母GAL1和GAL10启动子，也可以使用其他公知的酵母启动子的任何一种，如GAL7、ADH1、ADH3和PGK启动子，或者其他真核基因启动子。转录的终止子是ADH1和CYC1终止子。

VLP在形态上和真实的病毒类似并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以为抗病毒疫苗的开发提供了理想的备选方案。本发明涉及VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白组成的病毒样颗粒。VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白来源于EV71 P1和3CD蛋白质在酵母中的同时表达以及EV71 3CD蛋白对于EV71 P1的酶切。在本发明的优选方案中，在酵母中产生EV71 VLP。酵母选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、胞壁克鲁维氏酵母(Kluyvermyces fragilis)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。

本发明还涉及EV71病毒样颗粒在预防EV71和婴幼儿手足口病的疫苗中的用途。

附图说明

图1：Western Blot鉴定重组EV71衣壳蛋白的表达。(A)蛋白分子量对照(B)转染pESC-P1Y-3CDY酵母蛋白提取物。(C)酵母蛋白提取物。(D)转染pESC-P1W-3CDW酵母蛋白提取物。

图2：显示了通过透射电镜技术显现的本文中描述的EV71病毒样颗粒(VLP)的代表样品。条形代表100nm。

具体实施方式

实施例1：EV71 P1及3CD基因的密码子优化及全基因合成

以下按分步骤详细描述EV71 P1及3CD基因的密码子优化及全基因合成的流程。

1、EV71 P1及3CD基因的密码子优化：

在本发明中，设计合成分子的密码子使用酵母细胞优选的密码子予以提高在酵母细胞培养环境中的蛋白质表达水平(如图1示)。将EV71病毒编码的P1和3CD基因序列在不改变氨基酸序列的前提下转变成含有如Sharpang Cowe(Synonymous Codon Usage inSaccharomyces cerevisiae.Yeast 7：657-678，(1991))所描述的酵母优选密码子的优化序列。最佳密码子的优选和替换对在特定宿主中高水平表达外源基因具有重要意义。在酵母中表达EV71病毒样颗粒的优点在于成本和工艺效能合算，酵母适合于在发酵罐中大规模生长培养。本发明的EV71 P1和3CD基因序列除经过密码子优化改造外，还需要突变不需要的酶切位点及影响或终止蛋白表达的位点，本发明优化后的序列不含有酵母识别的内部转录终止信号。酵母转录终止信号的序列在大量的科学研究中得到了研究和揭示，例如：Zaret et al.J.Mol.Biol.176：107-135(1984)；Guo和Sherman，Trends Biochem.Sci.21.477-481(1986)；Heidmann et al.Mol.Cell Biol.14：4633-4642(1984)。根据上述方法，最终获得按酵母密码子偏好设计的优化型EV71 P1及3CD基因，分别命名为EV71 P1Y及3CDY，其序列分别为SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示的序列。野生型EV71 P1及3CD基因分别命名为EV71P1W及EV71 3CDW，其序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列。EV71 P1及3CD基因编码的氨基酸序列分别为SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示的序列。

2、密码子优化型及野生型EV71 P1及3CD基因的全基因合成：

使用序列重叠延伸PCR法全基因合成EV71 P1Y及EV71 3CDY、EV71 P1W及EV71 3CDW基因，具体方法如下：根据优化EV71 P1Y及EV71 3CDY基因序列及EV71 P1W和EV71 3CDW基因序列合成多条100bp的上下游片段，两片段间3’端互补重叠15bp，上述上下游片段互为模板、引物进行PCR扩增，使用凝胶回收试剂盒回收扩增片段，再以此相邻的回收片段互为引物、模板进行下一轮PCR扩增，得到拼接序列，再以相邻拼接序列互为模板、引物进行PCR拼接，回收拼接序列片段，再依此序列互为模板、引物进行PCR拼接，依此类推最终合成全长的密码子优化型EV71 P1Y和EV71 3CDY和EV71 P1W和EV71 3CDW，经测序鉴定序列无误后在EV71 P1Y和EV71 P1W基因5’、3’端分别引入不同载体的BamH I及Xho I酶切位点，在EV71 3CDY和EV71 3CDW基因5’、3’端分别引入不同载体的EcoR I及Bgl II酶切位点。

实施例2：携带密码子优化型EV71 P1及3CD的DNA编码序列的酵母表达质粒的构建

1.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

从37℃培养16～20h的新鲜平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜(12～16h)。次日从上述培养物中吸取0.5ml按1∶100转入50ml LB培养基中继续培养约3h，至菌液的OD600值为3时，在无菌条件下将细菌转移到一无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。在4℃条件下，4000rpm离心10min，弃上清，将管倒置lmin，使残留培养液流尽，以10ml用冰预冷的100mmol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。4℃，4000rpm离心10min，弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15％甘油的100mmol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，分装成200μl每管，-80℃保存备用。

2.pESC-URA质粒的转化：

用无菌吸头分别吸取1μg pESC-URA质粒加入200μlDH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加入800μl不含抗生素的LB培养基，将管转移至37℃摇床上，温育45min(转速＜150rpm)。取50μl已转化的感受态细胞，用一无菌的弯头玻棒轻轻涂到含相应抗生素的琼脂平板表面，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养12～16h。

3.pESC-URA质粒的小量制备

分别挑取单个pESC-URA质粒转化菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。将培养物移入1.5mlEppendorf管中，12000rpm离心30-60s，倒去培养液，倒置离心管，使上清流尽，用100μl预冷的溶液Ⅰ[50mmol/L Glucose，25mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液Ⅲ(100ml中含5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)温和混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70％乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA(100μg/ml)的TE(pH 8.0)溶解沉淀，37℃水浴30～60min后置-20℃保存备用。

4.酵母表达质粒pESC-P1Y的构建：

使用限制性内切酶BamH I及Xho I消化pESC-URA质粒，然后将所回收片段与同样用BamH I及Xho I双酶切回收的EV71 P1Y和EV71P1W基因片段分别与酶切消化的载体按1∶4比例混合，依次加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为10μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按前述质粒的快速小量制备方法提取质粒。并用内切酶BamH I及Xho I对质粒进行酶切鉴定，挑选阳性重组子。命名为pESC-P1Y和pESC-P1W。

5.酵母表达质粒pESC-P1Y-3CDY和pESC-P1W-3CDW的构建：

使用限制性内切酶EcoR I及Bgl II消化pESC-URA质粒，然后将所回收片段分别与同样用EcoR I及Bgl II双酶切回收的EV713CDY和EV713CDW基因片段按1∶4比例混合，依次加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为10μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按前述质粒的快速小量制备方法提取质粒。并用内切酶EcoR I及Bgl II对质粒进行酶切鉴定，挑选阳性重组子。命名为pESC-P1Y-3CDY和pESC-P1W-3CDW。

实施例3：重组EV71病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化

1.酿酒酵母感受态细胞的制备：

酿酒酵母平板中挑取单克隆菌落接种于10ml YPD培养液中，30℃振摇培养16h，置取合适体积的过夜培养物加入48ml YPD培养液中混匀，终末OD600值为0.5，30℃振摇培养1h后OD600值为0.7，继续培养30min后，将培养物转入50ml无菌的离心管中，室温1500rpm离心5min，弃上清，用10ml Sc EasyComp transformation kit(Invitrogen)中的溶液I重悬沉淀，室温1500rpm离心5min，小心弃上清，用1ml溶液II重悬沉淀，50μl/管分装灭菌的1.5ml离心管中，置-70℃保存。

2.酵母表达质粒pESC-P1Y-3CDY和pESC-P1W-3CDW转化酵母感受态细胞：

将4μl pESC-P1Y-3CDY和pESC-P1W-3CDW质粒分别加入酵母感受态细胞中，加入500μl溶液III，在涡旋振荡器上剧烈振荡混匀。将DNA/酵母混合物置30℃水浴中孵育1h，每隔15min在涡旋振荡器上剧烈振荡混匀。取100μl涂布URA选择平板，置30℃孵箱中倒置培养。随机挑取5个单克隆菌落接种于10ml URA选择培养液中，30℃振摇培养16h，使用天根生物公司酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，PCR法筛选阳性克隆。

3.重组EV71病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化

(1)重组EV71病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达：接种单菌落携带pESC-P1Y-3CDY和pESC-P1W-3CDW质粒的酵母细胞于50mlURA选择培养液中，30℃振摇培养16h，取合适体积的过夜培养液接种200ml URA选择培养液中，30℃振摇培养4h，取合适体积的培养液接种3L URA诱导培养液(2％半乳糖)，30℃振摇培养48h，离心收集菌体沉淀，PBS缓冲液重悬，APV高压均质仪破碎3次，4℃8000g离心15min，收集上清置-70℃保存。

(2)重组EV71病毒样颗粒的纯化：取酵母破碎上清液置45％蔗糖垫，18℃100000g离心4h，PBS缓冲液重悬沉淀，4℃13000g离心15min，收集上清液置-70℃保存。

实施例4：重组EV71病毒样颗粒的鉴定及电镜观察

1.Western Blot鉴定重组EV71衣壳蛋白的表达：取20μl纯化的EV71病毒样颗粒悬液进行10％SDS-PAGE电泳。用识别EV71VP1蛋白的多克隆抗体(abcam公司，产品号：ab26858)为一抗，荧光标记羊抗鸡抗体为二抗进行Western Blot分析，结果显示，检测到EV71特异性条带。

2.重组EV71病毒样颗粒的电镜观察：取20μl纯化的EV71病毒样颗粒悬液用磷钨酸负染，在透射电镜下观察病毒样颗粒的形态。结果显示，电镜下可见直径约30-40nm的病毒样颗粒的存在。

参考文献

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序列表

<110>北京工业大学

<120>重组肠病毒71型病毒样颗粒的制备方法

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>2589

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgggatcac aagtttcaac ccagaggtct ggttcacacg aaaactcaaa ctcagccact     60

gagggatcta ctattaacta tacaacaatc aactactata aggactcata tgcagcaact    120

gctggaaaac agtctttgaa gcaagatcca gacaagttcg ccaaccctgt caaggacatt    180

tttaccgaaa tggctgcccc attaaagtct ccatctgccg aagcatgtgg atattcagat    240

agggtcgcac aattgacaat tggtaactca accataacaa cccaagaggc agctaacatc    300

attgtcggtt acggagaatg gccttcttat tgctctgatt cagacgccac tgctgtagac    360

aaacctacaa gacctgacgt atcagtcaat aggttttaca ccttggacac taagttgtgg    420

gaaaaatctt ctaagggatg gtactggaag tttcctgatg ttttaaccga aacaggagta    480

ttcggacaga atgcccagtt ccattatttg tacagatcag gattttgcat ccacgtacaa    540

tgcaatgcct caaaatttca ccagggtgca ttattggtag cagtcttgcc agaatacgtt    600

atcggtactg tagcaggtgg aacaggtaca gaagatacac acccaccata caagcaaaca    660

cagccaggtg ccgacggatt tgaattacaa catccatacg tcttagatgc tggtatccct    720

atatctcagt tgaccgtctg tcctcaccaa tggattaact tgaggactaa caactgcgcc    780

acaataattg tcccttacat caacgcttta ccatttgatt ctgccttgaa tcactgtaac    840

ttcggattat tggtcgtacc aatctcacct ttagactacg atcagggagc cacccctgtt    900

atcccaataa ccatcacatt agcaccaatg tgctcagaat ttgcaggatt aaggcaagcc    960

gttactcagg gttttcctac agaattgaaa cctggtacta accaattctt gaccaccgat   1020

gatggtgtct cagccccaat tttacctaat tttcacccta caccatgcat tcacattcca   1080

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tctaccttgt tgggacagtt gtgcggttac tacactcaat ggtcaggatc attggaagta   1320

actttcatgt ttaccggatc tttcatggct accggaaaga tgttgatcgc atatacacca    1380

ccaggaggtc cattaccaaa ggatagagct actgccatgt taggaactca cgtaatctgg    1440

gactttggtt tacagtcatc agttaccttg gtaatccctt ggatctcaaa cacccattat    1500

agagcacacg ctagagacgg tgtatttgac tattatacca caggtttggt ttctatatgg    1560

tatcaaacta actacgtcgt cccaatcggt gcccctaaca ctgcttacat tatcgcattg    1620

gcagccgccc agaaaaactt cacaatgaaa ttatgcaagg acgcctcaga tattttgcag    1680

actggaataa tacaaggtga cagagtcgcc gatgtaatcg agtcttcaat cggagactca    1740

gtatcaagag cattaacaca cgcattgcca gcaccaacag gacaaaacac acaggtatca    1800

tctcatagat tagatacagg aaaagtacct gcattacaag ctgctgaaat aggagcctca    1860

tctaatgctt ctgatgaatc aatgatagag actagatgcg tcttaaattc tcactcaaca    1920

gctgaaacaa ctttggattc ttttttctca agggctggat tggttggaga gatcgatttg    1980

ccattggagg gtactacaaa cccaaacgga tatgcaaact gggacatcga cattactggt    2040

tatgcacaaa tgaggaggaa ggtcgaatta ttcacttata tgaggtttga tgcagagttc    2100

actttcgtcg catgtactcc taccggtgaa gttgtcccac agttattaca gtacatgttt    2160

gttcctccag gtgctcctaa gccagattca agagaatctt tagcttggca aacagctaca    2220

aatccttctg tcttcgttaa gttatcagac cctcctgccc aggtctcagt ccctttcatg    2280

tcaccagcct cagcatacca gtggttctat gacggttacc caaccttcgg tgaacataag    2340

caagaaaagg acttggagta cggtgcttgt ccaaacaaca tgatgggtac attttcagta    2400

agaacagtcg gaacttctaa atcaaaatac cctttggtca taaggatata catgaggatg    2460

aagcacgtta gagcatggat acctaggcca atgagaaatc agaactactt gttcaaagcc    2520

aatcctaact atgccggaaa ttcaattaag cctactggtg cctctaggac agccatcact    2580

actttatga                                                            2589

<210>2

<211>1941

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgggacctt ctttggactt tgctttatct ttgttgagaa ggaacatcag gcaggtccag     60

actgatcaag gacattttac aatgttgggt gtcagggata gattggcagt tttaccaaga    120

cactctcagc ctggaaagac catttggatc gaacacaaat tggtcaacgt cttagacgcc    180

gtcgaattgg ttgatgagca aggtgtaaac ttggagttga cattgataac cttggatact    240

aacgaaaaat tcagggacat cacaaagttt atcccagaga atatttctac agcttcagat    300

gccactttgg ttattaacac cgaacatatg ccatcaatgt ttgtaccagt aggtgacgtc     360

gttcagtatg gattcttgaa cttgtctgga aaacctacac acagaaccat gatgtataac     420

tttcctacca aggctggaca gtgcggaggt gttgttactt ctgttggaaa agtcgtaggt     480

attcatatag gaggtaatgg tagacagggt ttctgcgccg gtttgaagag atcatacttc     540

gcctcagaac agggtgagat ccagtgggta aagcctaaca aggagacagg aaggttgaat     600

atcaacggtc ctacaagaac aaaattggaa ccatctgtct tccatgatat tttcgagggt     660

tcaaaagagc ctgctgtctt acactcaaaa gatccaagat tagaggttga cttcgaacaa     720

gcattgtttt caaagtacgt tggtaacact ttacatgaac ctgatgagta cattaaggag     780

gccgctttac actatgctaa ccagttaaaa cagttggaga taaatacctc tcaaatgtct     840

atggaggaag catgctatgg aactgaaaac ttagaggcaa ttgacttaca cacttcagct     900

ggttacccat actctgcttt gggtataaag aaaagagaca tattagatcc tactactagg     960

gacgtttcaa ggatgaagtt ctatatggac aaatacggat tagacttacc ttactctact    1020

tacgtcaaag acgaattaag gtcaatcgat aaaatcaaaa agggaaaatc taggttaatc    1080

gaagcatcat ctttgaacga ttcagtctat ttgaggatgg ctttcggtca tttgtacgag    1140

gcatttcatg ccaacccagg tacaatcacc ggttcagccg ttggttgtaa cccagataca    1200

ttttggtcta aattacctat attgttgcct ggatcattat tcgcatttga ttactcagga    1260

tacgacgctt cattgtcacc tgtctggttc agggcattag agttggtttt gagggaaata    1320

ggatactcag aagaggctat atcattaatt gagggtataa atcatacaca tcacgtttat    1380

aggaacaaga cctattgtgt attgggagga atgccttctg gatgttcagg aacctctatc    1440

ttcaattcta tgatcaacaa catcataatt agggccttat tgattaagac attcaaaggt    1500

atcgacttgg atgagttgaa catggtcgca tatggagacg acgtattagc atcttatcca    1560

tttccaatcg actgcttaga attagccaag actggtaagg aatatggttt gaccatgaca    1620

cctgccgaca aatctccatg ctttaatgag gtcaactggg gaaacgctac attcttaaaa    1680

agaggtttct tacctgacga gcaatttcct ttcttgatac accctaccat gcctatgaga    1740

gaaatccatg aatcaattag atggaccaag gacgcaagaa acacccagga tcatgttaga    1800

tcattgtgtt tattagcttg gcataacggt aaacaagaat atgaaaagtt tgtatctact    1860

attaggtctg tcccagtcgg tagagcctta gcaataccta actacgagaa cttgaggaga    1920

aattggttgg aattgttcta a                                              1941

<210>3

<211>2589

<212>DNA

<213>EV71病毒

<400>3

atgggttcgc aagtgtctac acagcgctcc ggttctcacg aaaactcaaa ctcagccact      60

gagggttcta ccataaacta caccaccatt aattactaca aagactccta tgctgccaca     120

gcaggcaaac agagtctcaa gcaggatcca gacaagtttg caaatcctgt taaagacatc     180

ttcactgaaa tggcagcgcc actgaagtcc ccatccgctg aggcatgtgg gtacagtgat     240

cgagtggcgc aattaactat tggcaactcc accatcacca cgcaagaagc ggctaacatc     300

atagtcggtt atggtgagtg gccttcctac tgctcagatt ctgacgctac agcagtggat     360

aaaccaacgc gcccggatgt ttcagtgaac aggttttaca cattggacac taaattgtgg     420

gagaaatcgt ccaagggatg gtactggaag ttcccggatg tgttaactga aactggggtt     480

tttgggcaaa atgcacaatt ccactacctc taccgatcag ggttctgcat ccacgtgcag     540

tgcaatgcca gtaaattcca ccaaggagca ctcctagtcg ctgtcctacc agagtatgtc     600

attgggacag tggcaggcgg tacagggacg gaagataccc acccccctta caagcagact     660

caacccggcg ccgatggctt cgagttgcaa cacccgtacg tgcttgatgc tggcatccca     720

atatcacagt taacagtgtg cccacaccag tggattaatt tgaggaccaa caattgtgct     780

acaataatag tgccatacat taacgcactg ccttttgatt ctgccttgaa ccattgcaat     840

tttggcctgt tagttgtgcc tattagccca ctagactacg accaaggagc gacgccagta     900

atccctataa ctatcacatt ggccccaatg tgttctgaat tcgcaggtct taggcaggca     960

gtcacgcaag gattccccac cgagctaaaa cctggcacaa atcaattttt aaccaccgat    1020

gatggcgttt cagcacctat tctaccaaac ttccacccca ccccgtgtat ccacatacct    1080

ggtgaagtta ggaacttgct agagttatgc caggtggaga ccattctgga ggttaacaat    1140

gtgcccacga atgccactag cttaatggag agactgcgct tcccggtctc agcacaagca    1200

gggaaaggtg agctgtgtgc ggtgtttaga gccgatcctg ggcgaaatgg accatggcaa    1260

tccaccttac tgggtcagtt gtgcgggtac tacacccaat ggtcaggatc attggaagtc    1320

accttcatgt ttactggatc cttcatggct accggcaaga tgctcatagc ctatacaccg    1380

ccaggaggtc ctctgcccaa ggaccgggcg accgccatgt tgggcacgca cgtcatctgg    1440

gattttgggc tgcaatcgtc tgtcaccctt gtaataccat ggatcagcaa cactcattat    1500

agagcacatg cccgagatgg agtgtttgac tactacacca cagggttagt cagtatatgg    1560

tatcagacaa attacgtggt tccaatcggt gcgcccaaca cagcctatat aatagcacta    1620

gcggcagccc aaaagaactt cactatgaaa ttgtgcaagg atgctagtga tatcctgcag    1680

acgggcatca tccagggaga tagggtggca gatgtaattg aaagttccat aggagatagc    1740

gtgagcagag ccctcactca cgctctacca gcacccacag gccagaacac acaggtgagc    1800

agtcatcgac tggatacagg caaggttcca gcactccaag ctgctgaaat tggagcatca    1860

tcaaatgcta gtgacgagag catgattgag acacgctgtg ttcttaactc gcacagtaca    1920

gctgagacca ctcttgatag tttcttcagc agggcgggat tagttggaga gatagatctc    1980

cctcttgagg gcacaactaa cccaaatggt tatgccaact gggacataga tataacaggt    2040

tacgcgcaaa tgcgtagaaa ggtagagcta ttcacctaca tgcgctttga tgcagagttc    2100

acttttgttg cgtgcacacc caccggggaa gttgtcccac aattgctcca atatatgttt    2160

gtgccacctg gagcccctaa gccagattct agggaatccc ttgcatggca aaccgccact    2220

aacccctcag tttttgtcaa gctgtcagac cctccagcgc aggtttcagt gccattcatg    2280

tcacctgcga gtgcttacca atggttttat gacggatatc ccacattcgg agaacacaaa    2340

caggagaaag atcttgaata cggggcatgt cctaataaca tgatgggcac gttctcagtg    2400

cggactgtgg ggacctccaa gtccaagtac cctttagtgg ttaggattta catgagaatg    2460

aagcacgtca gggcgtggat acctcgcccg atgcgtaacc agaactacct attcaaagcc    2520

aacccaaatt atgctggcaa ctccattaag ccaactggtg ccagtcgcac agcgatcacc    2580

actctttga                                                            2589

<210>4

<211>1941

<212>DNA

<213>EV71病毒

<400>4

atgggcccga gccttgactt tgctctctcc ctactgagaa ggaacatcag gcaagtccaa     60

acagaccagg ggcatttcac catgttgggt gttagggatc gcttagcagt cctcccacgc    120

cactcacaac ctggcaaaac tatttggatt gagcacaaac tcgtgaacgt ccttgatgca    180

gttgaactgg tggatgagca aggagtcaac ctggaattaa ccctcatcac tcttgacacc    240

aacgaaaagt ttagggatat caccaaattc atcccagaaa atattagcac tgctagtgat    300

gccaccctag tgatcaacac ggagcacatg ccatcaatgt ttgtcccggt gggtgacgtt    360

gtgcagtatg gctttttgaa tctcagtggt aagcctaccc atcgcaccat gatgtacaac    420

tttcctacta aagcaggaca gtgtggagga gtggtgacat ctgttgggaa ggttgtcggt    480

attcacattg gtggcaatgg cagacaaggt ttttgcgcag gcctcaaaag gagttacttt    540

gctagtgaac aaggagagat ccagtgggtt aagcccaata aagaaactgg aagactcaac    600

atcaatggac caacccgcac caagttagaa cctagtgtat tccatgacat cttcgaggga    660

agtaaagaac cagctgtctt gcacagtaaa gacccccgac ttgaggtaga ttttgaacag    720

gccctgttct ctaagtatgt gggaaacaca ctacatgagc ctgacgagta cattaaagag     780

gcagctcttc attatgcaaa ccaattaaag caactagaaa ttaatacctc tcaaatgagc     840

atggaggagg cctgctacgg tactgagaat cttgaggcta ttgatcttca cactagtgca     900

ggttacccct atagtgccct ggggataaag aaaagagaca tcttagaccc taccaccagg     960

gacgtgagta gaatgaagtt ctacatggac aagtatggtc ttgatcttcc ttactccact    1020

tatgtcaagg acgagctgcg ctcgattgat aaaatcaaga aagggaagtc ccgcctgatc    1080

gaggccagta gtctaaatga ttcagtgtac ctcagaatgg ctttcggaca tttgtatgag    1140

gctttccacg caaatcctgg gacgataact ggatcagccg tggggtgtaa ccctgacaca    1200

ttctggagca agctgccaat tttgctccct ggttcactct ttgcctttga ctactcaggt    1260

tatgatgcca gtcttagccc tgtctggttc agagcattag aattggttct tagggagata    1320

gggtatagtg aagaggcaat ctcactcatt gagggaatca accacacaca tcatgtgtat    1380

cgtaataaga cctattgtgt gcttggtggg atgccctcag gctgttcggg aacatccatt    1440

ttcaactcaa tgatcaacaa cattattatc agagcactgc tcataaaaac atttaagggc    1500

attgatttgg atgaactcaa catggtcgct tatggagacg atgtgctcgc tagctatccc    1560

ttcccaattg attgcttgga actagcaaag actggtaagg agtatggtct gaccatgact    1620

cctgctgata aatctccttg ctttaatgag gtcaattggg gtaatgcgac cttcctcaaa    1680

aggggctttt tgcccgatga acagtttcca tttttgattc accctactat gccaatgagg    1740

gagatccatg agtccattcg atggaccaag gacgcacgaa acactcaaga tcatgtgcgg    1800

tccttgtgcc tcctagcatg gcataatggt aagcaagaat atgagaagtt tgtgagcaca    1860

attaggtctg tcccagtagg aagagcgttg gctatcccaa attatgaaaa tcttagacgc    1920

aattggctcg agttatttta a                                              1941

<210>5

<211>862

<212>PRT

<213>EV71病毒

<400>5

Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

1               5                   10                  15

Asn Ser Ala Thr Glu Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr

            20                  25                  30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Thr Ala Gly Lys Gln Ser Leu Lys Gln

        35                  40                  45

Asp Pro Asp Lys  Phe Ala Asn Pro Val Lys Asp Ile Phe Thr Glu Met

    50                  55                  60

Ala Ala Pro Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65                  70                  75                  80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

                85                  90                  95

Ala Ala Asn Ile Ile Val Gly Tyr Gly Glu Trp Pro Ser Tyr Cys Ser

            100                 105                 110

Asp Ser Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

        115                 120                 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Thr Lys Leu Trp Glu Lys Ser Ser

    130                 135                 140

Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Thr Gly Val

145                 150                 155                 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

                165                 170                 175

Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

            180                 185                 190

Val Ala Val Leu Pro Glu Tyr Val Ile Gly Thr Val Ala Gly Gly Thr

        195                 200                 205

Gly Thr Glu Asp Thr His Pro Pro Tyr Lys Gln Thr Gln Pro Gly Ala

    210                 215                 220

Asp Gly Phe Glu Leu Gln His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro

225                 230                 235                 240

Ile Ser Gln Leu Thr Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr

                245                 250                 255

Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Leu Pro Phe

            260                 265                 270

Asp Ser Ala Leu Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Val Pro Ile

        275                 280                 285

Ser Pro Leu Asp Tyr Asp Gln Gly Ala Thr Pro Val Ile Pro Ile Thr

    290                 295                 300

Ile Thr Leu Ala Pro Met Cys  Ser Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala

305                 310                 315                 320

Val Thr Gln Gly Phe Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe

                325                 330                 335

Leu Thr Thr Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro Ile Leu Pro Asn Phe His

            340                 345                 350

Pro Thr Pro Cys Ile His Ile Pro Gly Glu Val Arg Asn Leu Leu Glu

        355                 360                 365

Leu Cys Gln Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Val Pro Thr Asn

    370                 375                 380

Ala Thr Ser Leu Met Glu Arg Leu Arg Phe Pro Val Ser Ala Gln Ala

385                 390                 395                 400

Gly Lys Gly Glu Leu Cys Ala Val Phe Arg Ala Asp Pro Gly Arg Asn

                405                 410                 415

Gly Pro Trp Gln Ser Thr Leu Leu Gly Gln Leu Cys Gly Tyr Tyr Thr

            420                 425                 430

Gln Trp Ser Gly Ser Leu Glu Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe

        435                 440                 445

Met Ala Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro

    450                 455                 460

Leu Pro Lys Asp Arg Ala Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp

465                 470                 475                 480

Asp Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser

                485                 490                 495

Asn Thr His Tyr Arg Ala His Ala Arg Asp Gly Val Phe Asp Tyr Tyr

            500                 505                 510

Thr Thr Gly Leu Val Ser Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro

        515                 520                 525

Ile Gly Ala Pro Asn Thr Ala Tyr Ile Ile Ala Leu Ala Ala Ala Gln

    530                 535                 540

Lys Asn Phe Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Ala Ser Asp Ile Leu Gln

545                 550                 555                 560

Thr Gly Ile Ile Gln Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser

                565                 570                 575

Ile Gly Asp Ser Val Ser Arg Ala Leu Thr His Ala Leu Pro Ala Pro

            580                 585                 590

Thr Gly Gln Asn Thr Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys

        595                 600                 605

Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser

    610                 615                 620

Asp Glu Ser Met Ile Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr

625                 630                 635                 640

Ala Glu Thr Thr Leu Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly

                645                 650                 655

Glu Ile Asp Leu Pro Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala

            660                 665                 670

Asn Trp Asp Ile Asp Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val

        675                 680                 685

Glu Leu Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala

    690                 695                 700

Cys Thr Pro Thr Gly Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe

705                 710                 715                 720

Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp

                725                 730                 735

Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Ser Asp Pro Pro

            740                 745                 750

Ala Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp

        755                 760                 765

Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp

    770                 775                 780

Leu Glu Tyr Gly Ala Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val

785                 790                 795                 800

Arg Thr Val Gly Thr Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile

                805                 810                 815

Tyr Met Arg Met Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg

            820                 825                 830

Asn Gln Asn Tyr Leu Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser

        835                 840                 845

Ile Lys Pro Thr Gly Ala Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu

    850                 855                 860

<210>6

<211>646

<212>PRT

<213>EV71病毒

<400>6

Met Gly Pro Ser Leu Asp Phe Ala Leu Ser Leu Leu Arg Arg Asn Ile

1               5                   10                  15

Arg Gln Val Gln Thr Asp Gln Gly His Phe Thr Met Leu Gly Val Arg

            20                  25                  30

Asp Arg Leu Ala Val Leu Pro Arg His Ser Gln Pro Gly Lys Thr Ile

        35                  40                  45

Trp Ile Glu His Lys Leu Val Asn Val Leu Asp Ala Val Glu Leu Val

    50                  55                  60

Asp Glu Gln Gly Val Asn Leu Glu Leu Thr Leu Ile Thr Leu Asp Thr

65                  70                  75                  80

Asn Glu Lys Phe Arg Asp Ile Thr Lys Phe Ile Pro Glu Asn Ile Ser

                85                  90                  95

Thr Ala Ser Asp Ala Thr Leu Val Ile Asn Thr Glu His Met Pro Ser

            100                 105                 110

Met Phe Val Pro Val Gly Asp Val Val Gln Tyr Gly Phe Leu Asn Leu

        115                 120                 125

Ser Gly Lys Pro Thr His Arg Thr Met Met Tyr Asn Phe Pro Thr Lys

    130                 135                 140

Ala Gly Gln Cys Gly Gly Val Val Thr Ser Val Gly Lys Val Val Gly

145                 150                 155                 160

Ile His Ile Gly Gly Asn Gly Arg Gln Gly Phe Cys Ala Gly Leu Lys

                165                 170                 175

Arg Ser Tyr Phe Ala Ser Glu Gln Gly Glu Ile Gln Trp Val Lys Pro

            180                 185                 190

Asn Lys Glu Thr Gly Arg Leu Asn Ile Asn Gly Pro Thr Arg Thr Lys

        195                 200                 205

Leu Glu Pro Ser Val Phe His Asp Ile Phe Glu Gly Ser Lys Glu Pro

    210                 215                 220

Ala Val Leu His Ser Lys Asp Pro Arg Leu Glu Val Asp Phe Glu Gln

225                 230                 235                 240

Ala Leu Phe Ser Lys Tyr Val Gly Asn Thr Leu His Glu Pro Asp Glu

                245                 250                 255

Tyr Ile Lys Glu Ala Ala Leu His Tyr Ala Asn Gln Leu Lys Gln Leu

            260                 265                 270

Glu Ile Asn Thr Ser Gln Met Ser Met Glu Glu Ala Cys Tyr Gly Thr

        275                 280                 285

Glu Asn Leu Glu Ala Ile Asp Leu His Thr Ser Ala Gly Tyr Pro Tyr

    290                 295                 300

Ser Ala Leu Gly Ile Lys Lys Arg Asp Ile Leu Asp Pro Thr Thr Arg

305                 310                 315                 320

Asp Val Ser Arg Met Lys Phe Tyr Met Asp Lys Tyr Gly Leu Asp Leu

                325                 330                 335

Pro Tyr Ser Thr Tyr Val Lys Asp Glu Leu Arg Ser Ile Asp Lys Ile

            340                 345                 350

Lys Lys Gly Lys Ser Arg Leu Ile Glu Ala Ser Ser Leu Asn Asp Ser

        355                 360                 365

Val Tyr Leu Arg Met Ala Phe Gly His Leu Tyr Glu Ala Phe His Ala

    370                 375                 380

Asn Pro Gly Thr Ile Thr Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Thr

385                 390                 395                 400

Phe Trp Ser Lys Leu Pro Ile Leu Leu Pro Gly Ser Leu Phe Ala Phe

                405                 410                 415

Asp Tyr Ser Gly Tyr Asp Ala Ser Leu Ser Pro Val Trp Phe Arg Ala

            420                 425                 430

Leu Glu Leu Val Leu Arg Glu Ile Gly Tyr Ser Glu Glu Ala Ile Ser

        435                 440                 445

Leu Ile Glu Gly Ile Asn His Thr His His Val Tyr Arg Asn Lys Thr

    450                 455                 460

Tyr Cys Val Leu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Gly Thr Ser Ile

465                 470                 475                 480

Phe Asn Ser Met Ile Asn Asn Ile Ile Ile Arg Ala Leu Leu Ile Lys

                485                 490                 495

Thr Phe Lys Gly Ile Asp Leu Asp Glu Leu Asn Met Val Ala Tyr Gly

            500                 505                 510

Asp Asp Val Leu Ala Ser Tyr Pro Phe Pro Ile Asp Cys Leu Glu Leu

        515                 520                 525

Ala Lys Thr Gly Lys Glu Tyr Gly Leu Thr Met Thr Pro Ala Asp Lys

    530                 535                 540

Ser Pro Cys Phe Asn Glu Val Asn Trp Gly Asn Ala Thr Phe Leu Lys

545                 550                 555                 560

Arg Gly Phe Leu Pro Asp Glu Gln Phe Pro Phe Leu Ile His Pro Thr

                565                 570                 575

Met Pro Met Arg Glu Ile His Glu Ser Ile Arg Trp Thr Lys Asp Ala

            580                 585                 590

Arg Asn Thr Gln Asp His Val Arg Ser Leu Cys Leu Leu Ala Trp His

        595                 600                 605

Asn Gly Lys Gln Glu Tyr Glu Lys Phe Val Ser Thr Ile Arg Ser Val

    610                 615                 620

Pro Val Gly Arg Ala Leu Ala Ile Pro Asn Tyr Glu Asn Leu Arg Arg

625                 630                 635                 640

Asn Trp Leu Glu Leu Phe

                645

Claims (13)

1.一种肠道病毒71型病毒样颗粒制备方法，该方法包括：

(1)优化肠道病毒71型病毒样颗粒P1基因及3CD基因序列；

(2)将优化的肠道病毒71型病毒样颗粒P1基因及3CD基因序列克隆到质粒中；

(3)用得到的质粒转化酵母细胞；

(4)从裂解的宿主细胞中分离重组肠道病毒71型病毒样颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酵母细胞选自：酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述酵母细胞为酿酒酵母。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的优化是指在不改变EV71 P1及3CD氨基酸序列的前提下，将P1及3CD基因序列的密码子替换为酵母细胞偏好的密码子。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的密码子优化的肠道病毒71型病毒样颗粒P1基因序列和3CD基因序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的质粒为pESC-URA。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的质粒为pESC-P1Y-3CDY。

8.一种如SEQ ID NO：1所示的肠道病毒71型病毒样颗粒P1基因序列。

9.一种如SEQ ID NO：2所示的3CD基因序列。

10.一种含有如权利要求8或9所述的基因序列的载体。

11.根据权利要求10所述的载体，其中所述的载体为pESC-URA。

12.一种含有如权利要求8或9所述的基因序列的酵母细胞。

13.根据权利要求12所述的酵母细胞，其中所述的酵母细胞选自：酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。

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