CN102899336B - 柯萨奇病毒b3型病毒样颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法。本发明所提供的方法包括如下步骤：1）将柯萨奇病毒B3型的VP1基因和VP4基因克隆到目的质粒1中，得到重组表达载体1，将VP2基因和VP3基因克隆到目的质粒2中，得到重组表达载体2；2）用步骤1）得到的重组表达载体1和重组表达载体2共转化目的酵母细胞，得到表达所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因的重组酵母细胞；3）裂解步骤2）得到的重组酵母细胞，分离得到柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒。实验证明，利用本发明所提供的方法，在酵母表达系统中成功的制备了柯萨奇病毒B3型的病毒样颗粒，可将其进一步用于病毒性心肌炎与I型糖尿病候选预防性疫苗和药物组合物。

Description

柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法，特别涉及利用经过密码子优化的柯萨奇病毒B3型P1（VP1、VP2、VP3和VP4）基因，通过酵母表达系统制备柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的方法及其应用。

背景技术

病毒性心肌炎（vital myocarditis，VMC）是由多种病毒引起心肌的非特异性炎症病变，病程较长，数月可康复，其中少数病人会转变成慢性。能引起病毒性心肌炎的病毒中，最普遍的是肠道病毒与腺病毒（Yajima T，Knowlton KU.Viral myocarditis:fromthe perspective of the virus.Circulation.2009,119(19):2615-2624.），而肠道病毒中的柯萨奇病毒B3（Coxsackievirus B3，CVB3）是其主要病原体（Yuan J,Yu M,Lin QW et al.Th17 cells contribute to viral replication in coxsackievirus B3-induced acute viralmyocarditis.J Immunol.2010,185(7):4004-4010.）。在心肌炎与其晚期即扩张型心肌病病例中，有5-50%是由CVB3感染引起的（Maisch B,Ristic AD,Hufnagel G，PankuweitS.Pathophysiology of viral myocarditis:the role of humoral immune response.CardiovascPathol.2002；11:112-22.）。

另外，柯萨奇病毒B3型与很多人类其它疾病相关，无菌性脑炎与胰腺炎，并且调查显示CVB或许与胰岛素依赖型糖尿病的发病相关（Andreas Henke,Nadine Jaraschand Peter Wutzler.Coxsackievirus B3 vaccines:use as an expression vector for preventionof myocarditis.Expert Rev.Vaccines.2008,7(10),1557-1567.）。

柯萨奇病毒B3型属小RNA病毒，其毒粒为二十面体形，立体对称，呈球形状，是裸露的核衣壳，直径约为23-30nm，无包膜。病毒基因组为约7kb的单链RNA，其组成从5’端到3’端的方向依次为5’端非编码区，P1区、P2区、P3区和一段3’端非编码区。P1区编码病毒的主要结构蛋白，即衣壳蛋白（capsule protein），其转录及翻译产物经蛋白酶水解后，最终得到4个蛋白产物，分别为VP4（1A），VP2（1B），VP3（1C）及VP1（1D）。主要的中和抗原位点就在P1区的VP1上，VP2和VP3上也含有一些中和型的抗原决定簇，但它们存在的区域是在非保守序列中。VP4序列呈高度保守，不暴露在衣壳的外表面，所以不具有中和性抗原决定簇。P2区呈现P2A、P2B和P2C三个部分。P2A蛋白的这一区域是起抑制宿主细胞mRNA转录作用的。P2B的功能与转膜作用有关，而P2C蛋白据推测其参与病毒RNA基因组的复制。P3区中，VPg（P3A）前体通过加工成为成熟的VPg。P3C是一个蛋白酶，可以自动催化自我剪切释放。3D是一个RNA合成酶，是在RNA复制过程中的依赖RNA的RNA多聚酶，它可以复制合成病毒的RNA。

研究人员已采用多种方法研究相关疫苗，并且利用动物模型证明了其预防急性感染或心肌炎的潜能，其中包括亚单位疫苗，灭活病毒疫苗，减毒活疫苗或DNA疫苗。然而，这些方法存在危险性，甚至存在不能刺激机体产生理想的免疫反应的可能。例如，减毒或灭活病毒疫苗存在逆转成有毒力的形式的危险或者不完全灭活，将导致接种者患病。目前，还没有预防感染CVB3的特效药或疫苗上市，因此，研制CVB3预防性疫苗对于控制病毒性心肌炎的流行具有重要意义。而病毒样颗粒在形态上和真实的病毒类似，并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以病毒样颗粒为抗病毒预防性疫苗的开发提供了理想的备选方案。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种柯萨奇病毒B3病毒样颗粒的制备方法。并且本方法可应用于柯萨奇B型病毒（B1-B6）的病毒样颗粒制备。

本发明所提供的柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法具体可包括如下步骤：

1）将柯萨奇病毒B3型的VP1基因和VP4基因克隆到目的质粒1中，得到重组表达载体1，将VP2基因和VP3基因克隆到目的质粒2中，得到重组表达载体2；

2）用步骤1）得到的重组表达载体1和重组表达载体2共转化目的酵母细胞，得到表达所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因的重组酵母细胞；

3）裂解步骤2）得到的重组酵母细胞，分离得到柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒。

上述步骤1）中，所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因均为经过密码子优化的基因；所述优化为在不改变野生型柯萨奇病毒B3型VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白和VP4蛋白的前提下，将野生型柯萨奇病毒B3型VP1基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因的密码子替换为酵母细胞偏好（高频使用）的密码子。所述优化还包括对VP1基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因序列的其他改造，以适合在酵母细胞中表达。本发明中使用的术语“偏好的密码子”具有本领域公知的含义，也称为密码子的偏好性（CodonPreference），是指某些生物体更偏爱使用某些同义三联密码子（即编码相同氨基酸的密码子）。

在本发明的一个实施例中，上述步骤1）中所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因（经过密码子优化的基因，命名为CVB3VP1Y、CVB3VP2Y、CVB3VP3Y和CVB3VP4Y）的核苷酸序列为序列表中序列2、序列3、序列4和序列5所示。为适合在酵母细胞中表达，根据本发明描述的方法对柯萨奇病毒B3型的VP1基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因进行改造获得的其他基因序列也属于本发明的保护范围。

上述步骤2）中，所述目的酵母细胞可为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本发明的一个实施例中，所述目的酵母细胞具体为酿酒酵母INVSC1。

所述VP1基因和所述VP4基因在所述重组表达载体1中各由一个启动子驱动转录，驱动所述VP1基因的启动子方向和驱动所述VP4基因的启动子方向相反。所述VP2基因和所述VP3基因在所述重组表达载体2中各由一个启动子驱动转录，驱动所述VP2基因的启动子方向和驱动所述VP3基因的启动子方向相反。

在本发明中，所述VP1基因在所述重组表达载体1中由GAL10启动子驱动转录，所述VP4基因在所述重组表达载体1中由GAL1驱动转录。所述VP2基因在所述重组表达载体2中由GAL10启动子驱动转录，所述VP3基因在所述重组表达载体2中由GAL1启动子驱动转录。

在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体1为将所述VP1基因和所述VP4基因分别插入到pESC-URA的两个多克隆位点处，得到的所述VP1基因和所述VP4基因各由一个启动子驱动转录的重组质粒；所述重组表达载体2为将所述VP2基因和所述VP3基因分别插入到pESC-HIS的两个多克隆位点处，得到的所述VP2基因和所述VP3基因各由一个启动子驱动转录的重组质粒。具体地，将所述VP1基因插入到所述pESC-URA的多克隆位点1（MCS1/FLAG）的Spe I和Pac I之间，得到中间质粒1，再将所述VP4基因插入到所述中间质粒1的多克隆位点2（MCS2/myc）的BamH I和Kpn I之间，即得到所述重组表达载体1。将所述VP2基因插入到所述pESC-HIS的多克隆位点1（MCS1/FLAG）的Spe I和Pac I之间，得到中间质粒2，再将所述VP3基因插入到所述中间质粒2的多克隆位点2（MCS2/myc）的BamH I和Xho I之间，即得到所述重组表达载体2。

利用本发明所提供的方法制备得到的柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的VP1基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因中的至少一种。

本发明所提供的密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的VP1基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因（CVB3VP1Y、CVB3VP2Y、CVB3VP3Y和CVB3VP4Y）的核苷酸序列依次为序列表中序列2-序列5所示。这四个基因均来自于密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的P1基因（CVB3P1Y基因，其核苷酸序列为序列表中序列1所示）。为适合在酵母细胞中表达，根据本发明描述的方法对柯萨奇病毒B3型的VP1基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因中的至少一种进行改造获得的其他基因序列也属于本发明的保护范围。

其中，序列1由2565个核苷酸组成，为优化后柯萨奇病毒B3型P1基因的编码序列，其编码所得的蛋白为序列表中序列7所示的蛋白，序列7由854个氨基酸组成；序列2由858个核苷酸组成，为优化后柯萨奇病毒B3型VP1基因的编码序列，其编码所得的蛋白为Met（起始密码子ATG编码）+序列表中序列7的第571-854位所示的蛋白，由285个氨基酸组成；序列3由795个核苷酸组成，为优化后的柯萨奇病毒B3型VP2基因的编码序列，其编码所得的蛋白为Met（起始密码子ATG编码）+序列表中序列7的第70-332位所示的蛋白，由264个氨基酸组成；序列4由720个核苷酸组成，为优化后的柯萨奇病毒B3型VP3基因的编码序列，其编码所得的蛋白为Met（起始密码子ATG编码）+序列表中序列7的第333-570位所示的蛋白，由239个氨基酸组成；序列5由210个核苷酸组成，为优化后的柯萨奇病毒B3型VP4基因的编码序列，其编码所得的蛋白为序列表中序列7的第1-69位所示的蛋白，由69个氨基酸组成。

含有上述密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中的至少一种的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

在本发明中，所述重组表达载体具体为将所述VP1基因和所述VP4基因分别插入到pESC-URA质粒的两个多克隆位点处得到的重组质粒；以及将所述VP2基因和所述VP3基因分别插入到pESC-HIS质粒的两个多克隆位点处，得到的重组质粒。

所述重组菌可为携带有上述密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中的至少一种的重组酵母细胞。所述酵母细胞可为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本发明的一个实施例中，所述酵母细胞具体为酿酒酵母INVSC1。

所述表达盒由能够启动所述密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中的至少一种表达的启动子，所述密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中的至少一种，以及转录终止子组成。在本发明的一个实施例中，所述启动子具体为酿酒酵母GAL1和GAL10启动子，当然也可以使用其他公知的酵母启动子的任何一种，如GAL7、ADH1、ADH3和PGK启动子，或者其他真核基因启动子。在本发明的一个实施例中，所述转录终止子具体为ADH1和CYC1终止子。

上述密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因中的至少一种在制备下述a）或b）中的应用也属于本发明的保护范围：

a）柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒；

b）以柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗。

本发明还涉及并提供了在重组宿主细胞中同时分别表达CVB3VP1蛋白、CVB3VP2蛋白、CVB3VP3蛋白和CVB3VP4蛋白的方法，该方法包括：（1）将含有所述CVB3VP1蛋白、所述CVB3VP2蛋白、所述CVB3VP3蛋白和所述CVB3VP4蛋白的编码基因的重组表达载体导入重组宿主细胞，如重组的酵母细胞（酿酒酵母INVSC1）。（2）在允许所述CVB3VP1蛋白、CVB3VP2蛋白、CVB3VP3蛋白和CVB3VP4蛋白同时表达的条件下培养重组宿主细胞，如重组的酵母细胞（酿酒酵母INVSC1）。

本发明对野生型的柯萨奇病毒B3型（Coxsackievirus B3，CVB3）的P1基因进行了酵母细胞偏好型密码子优化，并以此为模板扩增出CVB3VP1、CVB3VP2、CVB3VP3和CVB3VP4四种基因，从而提高CVB3VP1蛋白、CVB3VP2蛋白、CVB3VP3蛋白和CVB3VP4蛋白在酵母细胞中的表达水平。在本发明中，CVB3VP1蛋白、CVB3VP2蛋白、CVB3VP3蛋白和CVB3VP4蛋白四种结构蛋白在酵母细胞中同时分别表达。这四种结构蛋白进而自行组装成柯萨奇病毒B3型的病毒样颗粒（CVB3 VLPs）。

实验证明，利用本发明所提供的方法，在酵母表达系统（酿酒酵母INVSC1）中成功的制备了CVB3 VLPs。所述CVB3 VLPs可以用于制备基于VLP的CVB3预防性疫苗。

附图说明

图1为CVB3VP1Y基因和CVB3VP2Y基因PCR扩增回收产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，用泳道A为15000bp DNA Marker；泳道B为CVB3VP1Y基因PCR产物；泳道C为CVB3VP2Y基因PCR产物。

图2为pESC-URA-VP1Y质粒的Spe I及Pac I酶切鉴定结果。其中，用泳道A为15000bp DNA Marker；泳道B为pESC-URA-VP1Y质粒的Spe I及Pac I酶切鉴定结果；泳道C为pESC-URA-VP1Y质粒对照。

图3为pESC-HIS-VP2Y质粒的Spe I及Pac I酶切鉴定结果。其中，用泳道A为15000bp DNA Marker；泳道B和泳道C为pESC-HIS-VP2Y质粒的Spe I及Pac I酶切鉴定结果。

图4为CVB3VP3Y基因和CVB3VP4Y基因PCR扩增回收产物的琼脂糖凝胶电泳图。其中，用泳道A为100-6000bp DNA Marker；泳道B为CVB3VP3Y基因PCR产物；泳道C为CVB3VP4Y基因PCR产物。

图5为pESC-URA-VP1Y-VP4Y质粒的琼脂糖凝胶电泳图。其中，用泳道A为15000bp DNA Marker；泳道B为pESC-URA-VP1Y质粒对照；泳道C为pESC-URA-VP1Y-VP4Y质粒。

图6为pESC-HIS-VP2Y-VP3Y质粒的琼脂糖凝胶电泳图。其中，用泳道A为15000bp DNA Marker；泳道B和泳道C为pESC-HIS-VP2Y-VP3Y质粒；泳道D为pESC-HIS-VP2Y质粒对照。

图7为pESC-URA-VP1Y-VP4Y质粒的BamH I及Kpn I酶切鉴定结果。其中，泳道A为2000bp DNA Marker；泳道B为pESC-URA-VP1Y-VP4Y质粒的BamH I及KpnI酶切鉴定结果。

图8为pESC-HIS-VP2Y-VP3Y质粒的BamH I及Xho I酶切鉴定结果。其中，泳道A为15000bp DNA Marker；泳道B为pESC-HIS-VP2Y-VP3Y质粒的BamH I及XhoI酶切鉴定结果。

图9为Western Blot鉴定重组CVB3衣壳蛋白的表达。其中，泳道A为蛋白分子量对照；泳道B为INVSC1/pESC-4VP蛋白提取物；泳道C为INVSC1/pESC酵母蛋白提取物。

图10为通过透射电镜技术显现的CVB3病毒样颗粒（VLPs）的代表样品。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、CVB3 P1基因的密码子优化及全基因合成

以下按分步骤详细描述CVB3 P1基因的密码子优化及全基因合成的流程。

1、CVB3 P1基因的密码子优化

根据野生型CVB3 P1基因序列（命名为CVB3P1W基因，如序列表中序列6所示），经过设计和反复验证得到适合于在酵母细胞中表达的优化型CVB3 P1基因序列（命名为CVB3P1Y基因，如序列表中序列1所示），即将CVB3病毒的P1基因序列在不改变氨基酸序列的前提下转变成含有如Sharp PM等（Sharp PM,Cowe E.SynonymousCodon Usage inSaccharomyces cerevisiae.Yeast,1991,7(7):657-678.）所描述的酵母优选密码子的优化序列，从而提高CVB3 VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白在酵母细胞培养环境中的表达水平。

根据上述方法，最终获得按酵母密码子偏好设计的优化型CVB3 P1基因（CVB3P1Y基因），其基因序列为序列表中序列1。CVB3P1Y基因（序列1）编码的蛋白与序列6所示野生型CVB3P1W基因编码的蛋白一致，均为序列表中序列7所示氨基酸序列组成的蛋白。

2、密码子优化型CVB3 P1基因的全基因合成

使用序列重叠延伸PCR法全基因合成CVB3P1Y基因，具体方法如下：根据优化CVB3 P1Y基因序列合成多条100bp的上下游片段，两片段间3’端互补重叠15bp，所述上下游片段互为模板、引物进行PCR扩增，使用凝胶回收试剂盒回收扩增片段，再以此相邻的回收片段互为引物、模板进行下一轮PCR扩增，得到拼接序列，再以相邻拼接序列互为模板、引物进行PCR拼接，回收拼接序列片段，在依此序列互为模板、引物进行PCR拼接，依此类推最终合成全长的密码子优化型CVB3 P1基因，即CVB3P1Y基因。

本实验中CVB3 P1Y基因由公司（北京博迈德科技发展有限公司）进行全基因合成并构建到pGH质粒载体上交付保存使用。

实施例2、携带CVB3 VP1、VP2、VP3和VP4基因的酵母重组表达载体的构建

1、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

从37℃培养16~20h的新鲜平板上挑取DH5α单菌落（Takara公司，产品目录号为D9057S），接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜（12~16h）。次日从上述培养物中吸取0.5ml按体积比1:100转入50ml LB培养基中继续培养约3h，至菌液的OD600值为3时，在无菌条件下将细菌转移到一无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。在4℃条件下，4000rpm离心10min，弃上清，将管倒置1min，使残留培养液流尽，以10ml用冰预冷的100mM的CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。4℃，4000rpm离心10min，弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15％甘油的100mM的CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，分装成200μl每管，-80℃保存备用。

2、pESC-URA与pESC-HIS质粒的转化

用无菌吸头分别吸取1μg pESC-URA质粒或pESC-HIS质粒（具有双向启动子的酵母表达质粒，均购自Angilent technologies，pESC-URA质粒的产品目录号为217454，pESC-HIS质粒的产品目录号为217451）加入200μl上述步骤1制备的DH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加入800μl不含抗生素的LB培养基（蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素购自北京欣经科公司，NaCl购自国药化学试剂有限公司），将管转移至37℃摇床上，温育45min（转速＜150rpm）。取50μl已转化的感受态细胞，用一无菌的弯头玻棒轻轻涂到含相应抗生素的LB平板表面，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养12～16h。

3、pESC-URA质粒或pESC-HIS质粒的小量制备

挑取经上述步骤2转化培养所得的单菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。将培养物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm离心30-60s，倒去培养液，倒置离心管，使上清流尽，用100μl预冷的溶液I（终浓度为50mmol/L的葡萄糖，终浓度为25mmol/L的Tris-HCl，终浓度为10mmol/L的EDTA，pH8.0）重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液II（终浓度为0.2mol/L的NaOH，终浓度为质量百分含量1%的SDS），温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液III（配制100ml溶液III：5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml）温和混匀，冰浴10min,12000rpm离心10min,小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA（100μg/ml）的TE（pH 8.0）溶解沉淀，37℃水浴30~60min后置-20℃保存备用。

4、酵母重组表达载体pESC-URA-VP1Y质粒与pESC-HIS-VP2Y质粒的构建

根据实施例1得到的CVB3P1Y基因序列（序列1）设计两对引物，并利用实施例1得到的CVB3P1Y基因为模板分别扩增出CVB3 VP1Y基因和CVB3VP2Y基因。再将所述CVB3VP1Y基因克隆到pESC-URA质粒的多克隆位点1（MCS1/FLAG）的Spe I和Pac I之间，得到酵母重组表达载体ESC-URA-VP1Y；将所述CVB3VP2Y基因克隆到pESC-HIS质粒的多克隆位点1（MCS1/FLAG）的Spe I和Pac I之间，得到酵母重组表达载体pESC-HIS-VP2Y。具体按照如下步骤进行：

1）根据实施例1得到的CVB3P1Y基因序列（序列1）设计扩增CVB3VP1Y基因和CVB3VP2Y基因的两对引物，将所述CVB3 VP1Y基因和所述CVB3VP2Y基因在5’端均引入限制性内切酶SpeI的识别位点，3’端均引入限制性内切酶Pac I的识别位点（限制性内切酶Spe I及Pac I购自大连宝生物工程有限公司）。

具体操作如下：（1）以实施例1得到的CVB3P1Y基因（如序列表中序列1所示）为模板，用引物VP1-UP和VP1-DOWN进行PCR扩增得到5’端和3’端分别引入限制性内切酶Spe I和Pac I酶切位点的CVB3VP1Y基因片段（图1）。（2）以实施例1得到的CVB3P1Y基因（如序列表中序列1所示）为模板，用引物VP2-UP和VP2-DOWN进行PCR扩增得到5’端和3’端分别引入限制性内切酶Spe I和Pac I酶切位点的CVB3VP2Y基因片段（图1）。

VP1-UP：5’-GGACTAGTACCATGGGTCCAGTTGAAGATGCTG-3’（下划线处为限制性内切酶Spe I酶切位点的序列，该序列的第15-33位为序列1的第1711-1729位）

VP1-DOWN：5’-CCTTAATTAATTAGAAAGCACCAGTATTAGT-3’（下划线处为限制性内切酶Pac I酶切位点的序列，其后的序列为序列1的第2545-2565位的反向互补序列）

VP2-UP：5’-GGACTAGTACCATGTCTCCAACTGTTGAAGAATG-3’（下划线处为限制性内切酶Spe I酶切位点的序列，该序列的第15-34位为序列1的第208-227位）

VP2-DOWN：5’-CCTTAATTAATTATTGATGACCAGCCAATCTCA-3’（下划线处为限制性内切酶Pac I酶切位点的序列，该序列的第14-33位为序列1的第977-996位的反向互补序列）

2）使用限制性内切酶Spe I和Pac I酶切上述步骤3制备的pESC-URA质粒和pESC-HIS质粒，回收骨架载体（大片段，由于小片段大小仅约为45bp，琼脂糖凝胶电泳时经常无法显示），与经同样酶切的CVB3VP1Y基因（或CVB3VP2Y基因）片段按摩尔比1：4比例混合，依次加入10×T4 DNA连接酶缓冲液和T4 DNA连接酶（T4DNA连接酶及10×T4 DNA连接酶缓冲液购自大连宝生物工程有限公司），反应体积为20μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按步骤3所述质粒的快速小量制备方法提取重组质粒。并用内切酶Spe I及Pac I对重组质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图2和图3所示，图2中分别得到大小约为6600bp和860bp（CVB3VP1Y基因）的两个条带，图3中分别得到大小约为6700bp和800bp（CVB3VP2Y基因）的两个条带，与预期结果相符，进一步经酶切鉴定后的重组质粒送公司测序，将测序证实含有CVB3VP1Y基因（序列2）的重组质粒命名为pESC-URA-VP1Y，含有CVB3VP2Y基因（序列3）的重组质粒命名为pESC-HIS-VP2Y。其中，序列2编码Met（起始密码子ATG编码）+序列表中序列7的第571-854位所示的由285个氨基酸组成的蛋白；序列3编码Met（起始密码子ATG编码）+序列表中序列7的第70-332位所示的由264个氨基酸组成的蛋白。

5、酵母重组表达载体pESC-URA-VP1Y-VP4Y与pESC-HIS-VP2Y-VP3Y的构建

根据实施例1得到的CVB3P1Y基因序列（序列1）设计两对引物，并利用实施例1得到的CVB3P1Y基因为模板分别扩增出CVB3 VP3Y基因和CVB3VP4Y基因。再将所述CVB3VP4Y基因克隆到上述步骤4制备的酵母重组表达载体pESC-URA-VP1Y的多克隆位点2（即为pESC-URA质粒的多克隆位点2，MCS2/myc）的BamH I和Kpn I之间，得到酵母重组表达载体pESC-URA-VP1Y-VP4Y。将所述CVB3VP3Y基因克隆到上述步骤4制备的酵母重组表达载体pESC-HIS-VP2Y的多克隆位点2（即为pESC-HIS质粒的多克隆位点2，MCS2/myc）的BamH I和Xho I之间，得到酵母重组表达载体pESC-HIS-VP2Y-VP3Y。具体按照如下步骤进行：

1）根据实施例1得到的CVB3P1Y基因序列（序列1）设计扩增CVB3VP3Y基因和CVB3VP4Y基因的两对引物，将所述CVB3VP3Y基因在5’端引入限制性内切酶BamH I的识别位点，3’端引入限制性内切酶Xho I的识别位点（限制性内切酶BamHI及Xho I购自大连宝生物工程有限公司），所述CVB3VP4Y基因在5’端引入限制性内切酶BamH I的识别位点，3’端引入限制性内切酶Kpn I的识别位点（限制性内切酶BamH I及Kpn I购自大连宝生物工程有限公司）。

具体操作如下：（1）以实施例1得到的CVB3P1Y基因（如序列表中序列1所示）为模板，用引物VP3-UP和VP3-DOWN进行PCR扩增得到5’端和3’端分别引入限制性内切酶BamH I及Xho I酶切位点的CVB3VP3Y基因片段（图4）。（2）以实施例1得到的CVB3P1Y基因（如序列表中序列1所示）为模板，用引物VP4-UP和VP4-DOWN进行PCR扩增得到5’端和3’端分别引入限制性内切酶BamH I及Kpn I酶切位点的CVB3VP4Y基因片段（图4）。

VP3-UP：5’-CGGGATCCACCATGGGTTTGCCAACTATGAATAC-3’（下划线处为限制性内切酶BamH I酶切位点的序列，该序列的第15-34位为序列1的第997-1016位）

VP3-DOWN：5’-CCGCTCGAGTTATTGAAAAAAATTAACTTGAGAA-3’（下划线处为限制性内切酶Xho I酶切位点的序列，该序列的第13-34位为序列1的第1689-1710位的反向互补序列）

VP4-UP：5’-CGGGATCCACCATGGGTGCTCAAGTTTCTAC-3’（下划线处为限制性内切酶BamH I酶切位点的序列，该序列的第12-31位为序列1的第1-20位）

VP4-DOWN：5’-GGGGTACCTTAATTCAAAGCTGGCAAAGATTT-3’（下划线处为限制性内切酶Kpn I酶切位点的序列，该序列的第12-32位为序列1的第187-207位的反向互补序列）。

2）使用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切上述步骤4制备的酵母重组表达载体pESC-HIS-VP2Y，限制性内切酶BamH I和Kpn I酶切上述步骤4制备的酵母重组表达载体pESC-URA-VP1Y。pESC-HIS-VP2Y的回收骨架载体（大片段）与经同样酶切的CVB3VP3Y基因（BamH I和Xho I酶切）按摩尔比1：4比例混合（DNA Marker和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司）；pESC-URA-VP1Y的回收骨架载体（大片段）与经同样酶切的CVB3VP4Y基因（BamH I和Kpn I）按摩尔比1：4比例混合（DNA Marker和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司）；在上述两个混合体系中再分别依次加入10×T4 DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为20μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按步骤3所述质粒的快速小量制备方法提取重组质粒（图5、图6）。并用内切酶BamH I及Kpn I对图5所示重组质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图7所示，得到大小约为7500bp和210bp（CVB3VP4Y基因）的两个条带；内切酶BamH I及Xho I对图6所示重组质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图8所示，得到大小约为7500bp和720bp（CVB3VP3Y基因）的两个条带；两个重组质粒的鉴定结果均与预期结果相符，进一步经酶切鉴定后的重组质粒送公司测序，将测序证实含有CVB3VP3Y基因（序列4）的重组质粒命名为pESC-HIS-VP2Y-VP3Y，含有CVB3VP4Y基因（序列5）的重组质粒命名为pESC-URA-VP1Y-VP4Y。其中，序列4编码Met（起始密码子ATG编码）+序列表中序列7的第333-570位所示的由239个氨基酸组成的蛋白；序列5编码序列表中序列7的第1-69位所示的由69个氨基酸组成的蛋白。酵母重组表达载体中，启动所述CVB3VP1Y基因和CVB3VP2Y基因转录的启动子为酿酒酵母GAL10启动子，转录终止子为ADH1终止子；启动所述CVB3VP3Y基因和CVB3VP4Y基因转录的启动子为酿酒酵母GAL1启动子，转录终止子为CYC1终止子。

实施例3、重组CVB3病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化

1、酿酒酵母感受态细胞的制备

在酿酒酵母平板中挑取单克隆菌落INVSc1（Saccharomyces cerevisiae，产品目录号：C81000，购自Invitrogen）接种于10ml YPD培养液（购自北京欣经科公司）中，30℃振摇培养16h，取合适体积的培养物加入48ml YPD培养液中混匀，使其OD600值为0.5，30℃振摇培养1h后OD600值为0.7，继续培养30min后，将培养物转入50ml无菌的离心管中，室温1500rpm离心5min，弃上清，用10ml Sc EasyComp transformationkit（购自Invitrogen）中的溶液I（试剂盒自带）重悬沉淀，室温1500rpm离心5min，小心弃上清，用1ml溶液II（试剂盒自带）重悬沉淀，50μl/管分装灭菌的1.5ml离心管中，置-70℃保存。

2、酵母重组表达载体pESC-URA-VP1Y-VP4Y与pESC-HIS-VP2Y-VP3Y共转化酵母感受态细胞

将实施例2制备的酵母重组表达载体pESC-URA-VP1Y-VP4Y与pESC-HIS-VP2Y-VP3Y各3μl共同加入到上述步骤1制备的酵母INVSC1感受态细胞中，加入500μl Sc EasyComp transformation kit（购自Invitrogen）中的溶液III，在涡旋振荡器上剧烈振荡混匀，得到DNA/酵母混合物。将DNA/酵母混合物置30℃水浴中孵育1h，每隔15min在涡旋振荡器上剧烈振荡混匀。取100μl涂布HIS选择平板（选择性培养液(His-)：YNB 6.7g，酵母His营养缺陷培养基粉末(Sigma公司，Y1501)1.92g，如制平板加入20g琼脂粉，溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50℃，加入100ml无菌的20％葡萄糖。），置30℃孵箱中倒置培养2-4天。随机挑取5个单克隆菌落接种于10ml HIS选择培养液中，30℃振摇培养16h。取上述适量菌液涂布URA选择平板（选择性培养液(Ura-)：YNB 6.7g，酵母Ura营养缺陷培养基粉末（Sigma公司，Y1501）1.92g，如制平板加入20g琼脂粉，溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50℃，加入100ml无菌的20％葡萄糖。），置30℃孵箱中倒置培养2-4天。随机挑取5个单克隆菌落接种于10ml URA选择培养液中，30℃振摇培养16h。将经过鉴定表明成功转入重组表达载体pESC-URA-VP1Y-VP4Y与pESC-HIS-VP2Y-VP3Y的酵母INVSC1细胞命名为INVSC1/pESC-4VP。同时设置转入pESC-URA和pESC-HIS空载体的酵母INVSC1细胞的对照，将该酵母细胞命名为INVSC1/pESC。

3、重组CVB3病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化

1）重组CVB3病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达：将经过上述步骤2获得的INVSC1/pESC-4VP（实验组）和INVSC1/pESC（阴性对照组）的培养液取适量，分别接种于100ml URA选择培养液（选择性培养液（Ura-）：YNB 6.7g，酵母Ura营养缺陷培养基粉末(Sigma公司，Y1501)1.92g，溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50℃，加入100ml无菌的20％(20g/100ml)葡萄糖。）中，30℃振摇培养8h，取合适体积的培养液接种于500ml URA选择培养液中，使OD600值为0.4，30℃振摇培养4h，取合适体积的培养液接种3L URA诱导培养液（YNB 6.7g，酵母Ura营养缺陷培养基粉末(Sigma公司，Y1501)1.92g，溶于800ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50℃，加入100ml无菌的20％(20g/100ml)半乳糖），使OD600值为0.4，30℃振摇培养48h，8000g离心15min收集菌体沉淀，用PBS缓冲液重悬，APV高压均质仪以1500bar循环破碎3次，4℃12000g离心30min，收集上清（破碎菌液上清），置-70℃保存。将1倍体积的50%PEG溶液（50%PEG溶液：50g PEG6000(Ameresco公司)溶于100ml ddH₂O）缓慢加入到4倍体积的上述破碎菌液上清中，4℃搅拌过夜。第二日，4℃12000rpm，30min离心，去除上清，收集沉淀。用无菌PBS重悬沉淀，浓缩至样品原体积的1/10，得到浓缩样品（实验组浓缩样品和阴性对照组浓缩样品）。

2）重组CVB3病毒样颗粒的纯化：在离心管中由下至上依次小心加入1.4g/ml、1.34g/ml、1.29g/ml和1.25g/ml的CsCl溶液各7ml，取酵母破碎上清液（上述步骤1）中得到的浓缩样品）置CsCl不连续密度梯度（CsCl购自北京欣经科公司），4℃用Beckman SW32Ti转头100000g离心21h，PBS缓冲液重悬沉淀，4℃13000g离心15min，收集上清液置-70℃保存，得到待测样品（实验组待测样品和阴性对照组待测样品）。

实施例4、重组CVB3病毒样颗粒的鉴定及电镜观察

对实施例3制备的待测样品（实验组待测样品和阴性对照组待测样品）进行Western Blot鉴定和电镜观察。

1、Western Blot鉴定重组CVB3衣壳蛋白的表达：利用碧云天公司的BCA蛋白定量试剂盒（增强型）（P0010S），按照说明书操作步骤，对实施例3得到的纯化后的待测样品（实验组待测样品和阴性对照）进行蛋白定量。根据定量结果，对两种待测样品各取适量的悬液（保证两种样品的上样蛋白总量相等）进行12%SDS-PAGE电泳。用识别CVB5 VP1的鼠单克隆抗体为一抗（一抗购自Dako公司，产品编号为M7064），（由于CVB病毒的VP1蛋白具有高度的保守性，故此处使用CVB5 VP1单抗验证，参见CVB5 VP1的鼠单克隆抗体说明书）荧光标记羊抗鼠抗体为二抗（二抗购自KPL，产品目录号为072-07-18-06）进行Western Blot分析（蛋白Marker购自Fermentas公司）。

结果如图9所示，实验组待测样品检测到大小约为34KD（VP1）的CVB3特异性条带；而阴性对照组待测样品未检测到CVB3的特异性条带。

2、重组CVB3病毒样颗粒的电镜观察：将实施例3得到的纯化后的两个待测样品（实验组待测样品和阴性对照）调整蛋白浓度一致，各取10μl悬液滴加在覆盖镀碳支持膜上静止1min，吸干镀碳支持膜（购自中镜科仪，编号：BZ110223）表面残余液体，用2%磷钨酸（购自中镜科仪，编号：GZ02536）染色1min，吸干镀碳支持膜表面残液，室温放置干燥后用透射电子显微镜观察其形态结构。

结果显示，实验组待测样品（图10）在电镜下均可见直径约30nm左右的病毒样颗粒的存在而阴性对照组（空载体）测样品则没有在电镜下观察到病毒样颗粒的存在。

本实施例的结果表明，携带有密码子优化后的CVB3 VP1、VP2、VP3和VP4基因的重组表达载体在酵母系统中，成功的包装出CVB3的病毒样颗粒。

Claims (2)

1.柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

1)将柯萨奇病毒B3型的VP1基因和VP4基因克隆到目的质粒1中，得到重组表达载体1，将VP2基因和VP3基因克隆到目的质粒2中，得到重组表达载体2；

2)用步骤1)得到的重组表达载体1和重组表达载体2共转化目的酵母细胞，得到表达所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因的重组酵母细胞；

3)裂解步骤2)得到的重组酵母细胞，分离得到柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒；所述VP1基因、所述VP2基因、所述VP3基因和所述VP4基因的核苷酸序列分别为序列表中序列2、序列3、序列4和序列5所示；

所述目的酵母细胞为酿酒酵母；

所述重组表达载体1为将所述VP1基因和所述VP4基因分别插入到pESC-URA的两个多克隆位点处，得到的所述VP1基因和所述VP4基因各由一个启动子驱动转录的重组质粒；所述重组表达载体2为将所述VP2基因和所述VP3基因分别插入到pESC-HIS的两个多克隆位点处，得到的所述VP2基因和所述VP3基因各由一个启动子驱动转录的重组质粒。

2.VP1基因、VP2基因、VP3基因和VP4基因在制备下述a)或b)产品中的应用：

a)柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒；

b)以柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗；

所述VP1基因的核苷酸序列为序列表中序列2所示；所述VP2基因的核苷酸序列为序列表中序列3所示；所述VP3基因的核苷酸序列为序列表中序列4所示；所述VP4基因的核苷酸序列为序列表中序列5所示。