WO2024117783A1 - 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 수족구 바이러스 유사입자 구조단백질의 생산 방법 - Google Patents

외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 수족구 바이러스 유사입자 구조단백질의 생산 방법 Download PDF

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WO2024117783A1
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WO
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recombinant vector
seq
virus
foot
represented
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PCT/KR2023/019477
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Inventor
우수동
김현수
최재방
이지훈
박상미
오종민
오미경
윤빛나래
한범구
김현일
Original Assignee
충북대학교 산학협력단
주식회사 옵티팜
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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant vector for expressing foreign proteins and a method for producing a hand, foot, and mouth virus-like particle structural protein using the same.
  • This invention was carried out with the support of the Korea Health Industry Development Institute with financial resources from the government (Ministry of Health and Welfare) [R&D project number: HV23C013200, R&D project group name: Vaccine commercialization technology development project group, project name: Infectious disease prevention and treatment technology development (vaccine commercialization) Technology Development Business Group), R&D project name: Development of a multivalent vaccine candidate for hand, foot, and mouth disease using the baculovirus high-expression system virus-like particle platform].
  • Virus-like particles are very similar in shape to viruses, but do not cause infection because they contain no genetic material.
  • VLPs are repeatedly labeled with high density of viral surface proteins that present structural viral epitopes that can induce a strong immune response. Therefore, folding and assembly of recombinant proteins are essential, and eukaryotic expression systems have advantages over common prokaryotic expression systems.
  • baculovirus-based insect cell expression systems are frequently used to create VLP vaccines. Protein production and modification processes in insect cells are often similar to those in humans and can produce a variety of VLPs.
  • VLP-type hepatitis B vaccines and HPV vaccines which are highly safe and immunogenic to the human body, are commercially available, and various vaccines have recently been approved.
  • EVA71 is a non-membrane particle with a size of 30-32 nm and is composed of an icosahedral capsid.
  • the viral genome is approximately 7,500 nucleotides long and is in the +ssRNA form with only one ORF. Flanking are highly structured 5'UTR and 3'UTR with poly A tails.
  • ORF encodes a large protein consisting of 2,100 amino acids. This polyprotein is further hydrolyzed to form three precursor proteins, P1, P2, and P3.
  • the P1 precursor protein is split into four parts: VP1, VP2, VP3, and VP4. Four proteins come together to form a protomer, five protomers come together to form a pentamer, and 12 pentamers come together to form the final virion.
  • VP1, VP2, and VP3 are exposed on the capsid surface, and VP4 is inside the capsid.
  • P2 and P3 encode seven nonstructural proteins (P2-2A, 2B, 3C; P3-3A, 3B, 3C, 3D).
  • the 3CD protease of P3 is known to act between VP0 and VP3
  • the 3CD protease is known to act between VP3 and VP1.
  • the mechanism of VP0 cleavage is not well understood. Therefore, HFMD-VLP requires protein expression control of both P1 and 3CD expression, and various expression strategies have been attempted accordingly.
  • Recently, research has been actively conducted to increase the yield of VLP, and as it has been reported that 3CD exhibits cytotoxicity, research is in progress to control the expression level.
  • the present inventors conducted research to efficiently produce HFMD-VLP using burst sequences and junk sequences, and completed the present invention by identifying the optimal promoter combination for foreign protein production.
  • the object of the present invention is the 3CD sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or 7, the P1 gene represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 3, 5, and 6, and SEQ ID NO: 13
  • the P1 gene represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 3, 5, and 6, and SEQ ID NO: 13
  • SEQ ID NO: 13 To provide a recombinant vector for expression of a foreign protein comprising an OplE-2 promoter represented by the nucleotide sequence and a junk sequence represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 14, 19 to 26. .
  • Another object of the present invention is the 3CD sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or 7, the P1 gene represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 3, 5, and 6, SEQ ID NO: 11
  • the aim is to provide a recombinant vector for expression of a foreign protein containing a P10 promoter represented by the nucleotide sequence and a burst sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • Another object of the present invention is to provide a transformant into which a recombinant vector for expressing a foreign protein according to the present invention has been introduced.
  • Another object of the present invention is to provide hand, foot and mouth virus-like particles produced by the transformant according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a vaccine composition for preventing hand, foot, and mouth disease comprising the hand, foot, and mouth virus-like particles according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating hand, foot, and mouth disease, comprising administering to a subject a vaccine composition for preventing hand, foot, and mouth disease containing the hand, foot, and mouth virus-like particles according to the present invention.
  • the present invention provides a 3CD sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or 7, a P1 gene represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 3, 5, and 6,
  • the present invention provides a 3CD sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or 7, a P1 gene represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 3, 5, and 6, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11
  • a recombinant vector for expressing foreign proteins containing a P10 promoter represented by and a burst sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • a vaccine composition for preventing hand, foot, and mouth disease comprising the hand, foot, and mouth virus-like particles according to the present invention.
  • a method for preventing or treating hand, foot, and mouth disease comprising administering to a subject a vaccine composition for preventing hand, foot, and mouth disease containing the hand, foot, and mouth virus-like particles according to the present invention.
  • the recombinant vector for expressing foreign proteins according to the present invention is capable of producing hand, foot, and mouth disease virus-like particles in high yield by controlling the 3CD expression level for mass production of structural proteins and cleavage of the P1 precursor, and antigen proteins with accurate structures. It has the advantage of being able to be produced at low cost. Therefore, the recombinant vector for expressing foreign proteins according to the present invention and the hand, foot, and mouth virus-like particles produced using the same can be used in various fields in the field of prevention and treatment of hand, foot, and mouth disease.
  • Figure 1 is a diagram showing a cleavage map of a virus-induced transient expression vector for determining promoter strength.
  • Figure 2 is a diagram showing the results of evaluating the transient expression efficiency according to the addition of the OpIE2 promoter sequence and the transient expression efficiency according to the addition of the p10 promoter sequence.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the control and experimental recombinant viruses expressing EV71 and CVA16 P1-His-3CD.
  • Figure 4a is a diagram showing the results of confirming the expression of EV71 and CVA16 P1-His according to the 3CD expression promoter in Hi5 cells using an anti-His antibody.
  • Figure 4b is a diagram showing the results of confirming the expression of EV71 and CVA16 P1-His according to the 3CD expression promoter in Hi5 cells using antiserum.
  • Figure 5A shows recombinant viruses expressing p10-BS5 from EV71 and CVA16 3CD; and EV71 and CVA16 ⁇ VP4-P1 expressing recombinant virus;
  • Figure 5b is a diagram showing the results of confirming the expression of EV71 and CVA16 recombinant proteins through SDS-PAGE and Western blot.
  • Figure 5c is a diagram showing the results of transmission electron microscopy for each virus with differences in P1 form and expression vector.
  • Figure 6 is a diagram showing the results of cell-specific expression comparison of EV71 and CVA16 viruses.
  • Figure 7 is a diagram showing a schematic diagram of the purification process of hand, foot, and mouth VLP.
  • Figure 8 shows the results of separation and purification (A-D) and TEM analysis results (E) of two types of VLP antigens, EV71 and CVA16, according to the presence or absence of VP4.
  • the 3CD sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or 7 the P1 gene represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 3, 5, and 6,
  • the recombinant vector is composed of enhanced green fluorescent protein (EGFP), enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), enhanced blue fluorescent protein (EBFP), enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), and red fluorescent protein (RFP). It may further include a gene encoding one or more fluorescent proteins selected from the group consisting of.
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • ECFP enhanced cyan fluorescent protein
  • EBFP enhanced blue fluorescent protein
  • EYFP enhanced yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • It may further include a gene encoding one or more fluorescent proteins selected from the group consisting of.
  • vector refers to a gene construct containing the base sequence of a gene operably linked to a suitable regulatory sequence to enable expression of the target gene in a suitable host, wherein the regulatory sequence initiates transcription. It may include a promoter, an optional operator sequence to regulate such transcription, and sequences to control termination of transcription and translation.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate within cells, and any vector known in the art can be used, for example, plasmid, cosmid, phage particle, or viral vector.
  • a "recombinant vector” is an expression vector for a polypeptide of interest that can express the polypeptide of interest with high efficiency in an appropriate host cell when the gene encoding the polypeptide of interest to be expressed is operably linked.
  • the host cell may preferably be a eukaryotic cell, and expression control sequences such as promoters, terminators, enhancers, etc., and sequences for membrane targeting or secretion are appropriately selected depending on the type of host cell. and can be combined in various ways depending on the purpose.
  • the present invention provides a 3CD sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or 7, a P1 gene represented by one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, 3, 5, and 6. , provides a recombinant vector for expressing foreign proteins containing a P10 promoter represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 and a burst sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the recombinant vector preferably contains the burst sequence represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 1 to 10 times consecutively, and more preferably 5 times consecutively.
  • the recombinant vector preferably includes homologous region 3 (hr3) represented by the base sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the recombinant vector preferably further includes the IE-1 promoter represented by the base sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the recombinant vector is composed of enhanced green fluorescent protein (EGFP), enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), enhanced blue fluorescent protein (EBFP), enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), and red fluorescent protein (RFP). It may further include a gene encoding one or more fluorescent proteins selected from the group consisting of.
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • ECFP enhanced cyan fluorescent protein
  • EBFP enhanced blue fluorescent protein
  • EYFP enhanced yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • It may further include a gene encoding one or more fluorescent proteins selected from the group consisting of.
  • a transformant into which a recombinant vector for expressing a foreign protein according to the present invention has been introduced is provided.
  • transformation refers to a change in the genetic properties of an organism by DNA given from outside, that is, when DNA, a type of nucleic acid extracted from a cell of a certain lineage of an organism, is given to a living cell of another lineage, the DNA is changed.
  • a phenomenon in which a cell enters the cell and changes its genetic characteristics is also called transformation, transformation, or type conversion.
  • the transformant is preferably a recombinant virus, more preferably baculovirus, Adeno virus, Adeno-associated virus (AAV), It may be one or more types selected from the group consisting of Retrovirus, Lentivirus, Herpes Simplex virus, and Vaccinia virus, but the scope of the present invention is not limited thereto.
  • AAV Adeno-associated virus
  • hand, foot and mouth virus-like particles produced by the transformant according to the present invention are provided.
  • a “virus-like particle” includes a protein coat or capsid assembled to form a viral envelope, and the virus-like particle maintains the shape of the viral envelope (capsid) and has a similar effect to a live virus.
  • a vaccine composition for preventing hand, foot, and mouth disease comprising the hand, foot, and mouth virus-like particles according to the present invention.
  • vaccine is a veterinary vaccine containing an antigenic substance and is administered for the purpose of inducing specific, active or passive immunity to the hand, foot, and mouth virus.
  • the vaccine composition according to the present invention may include one or more immune enhancers, excipients, or carriers suitable for composing the vaccine composition in addition to the hand, foot, and mouth virus-like particles that are the active ingredients.
  • an adjuvant that may be included in the vaccine composition of the present invention refers to a substance that enhances the immune response of the injected animal, and a number of different adjuvants are known to those skilled in the art.
  • the adjuvants include, but are limited to, Freund's complete and incomplete adjuvants, vitamin E, non-ionic blocking polymer, muramyl dipeptide, Quil A, mineral oil and non-mineral oil, Carbopol, water-in-oil emulsion adjuvants, etc. It doesn't work.
  • Carriers that may be included in the vaccine composition of the present invention are known to those skilled in the art and include, but are not limited to, proteins, sugars, etc.
  • the carrier may be an aqueous or non-aqueous solution, suspension, and emulsion.
  • non-aqueous carriers include propylene glycol, polyethylene glycol, edible oils such as olive oil, and injectable organic esters such as ethyl oleate.
  • Aqueous carriers include water, alcohol/aqueous solutions, emulsions or suspensions, including saline solutions and buffered media.
  • Parenteral carriers include sodium chloride solution, Ringer's dextrose, dextrose and sodium chloride, lactated Ringer's or fixed oils.
  • Carriers for intravenous injection include electrolyte supplements, liquid and nutritional supplements, such as those based on Ringer's dextrose.
  • the vaccine composition of the present invention may further include preservatives and other additives such as antimicrobial agents, antioxidants, chelating agents, inert gases, etc.
  • the preservatives include formalin, thimerosal, neomycin, polymyxin B, and amphotericin B.
  • the vaccine composition of the invention may comprise one or more suitable emulsifiers, such as Span or Tween.
  • the vaccine composition of the present invention may include a protective agent, and protective agents known in the art may be used without limitation, which may include lactose (LPGG) or trehalose (TPGG). It is not limited to this.
  • the vaccine composition according to the present invention can be administered in an immunologically effective amount.
  • the “immunologically effective amount” refers to an amount sufficient to show a preventive effect against diseases related to hand, foot, and mouth virus and an amount that does not cause side effects or serious or excessive immune responses.
  • the exact administration concentration depends on the specific immunogen to be administered. It varies and can be easily determined by a person skilled in the art depending on factors well known in the medical field, such as the age, weight, health, gender, sensitivity of the individual to the drug, administration route, and administration method of the vaccination target, and can be administered once to several times. can do.
  • the present invention provides a method for preventing or treating hand, foot, and mouth disease, comprising administering to a subject a vaccine composition for preventing hand, foot, and mouth disease containing the hand, foot, and mouth virus-like particles of the present invention described above.
  • Redundant content is omitted in consideration of the complexity of the present specification, and terms not otherwise defined in this specification have meanings commonly used in the technical field to which the present invention pertains.
  • Example 1 Construction of virus-induced transient expression vector to determine promoter strength
  • a virus-induced transient expression vector containing the EGFP sequence was constructed to evaluate the expression intensity of the promoter.
  • a transient expression vector was constructed using the promoter of the gene encoding the OpNPV-derived IE2 protein and the marker protein gene EGFP sequence.
  • the junk sequence (SEQ ID NO: 14, 19-26) was obtained by PCR using ⁇ DNA as a template, and then inserted between the promoter and the target gene to create 9 vectors for evaluating OpIE2 promoter weakening (Figure 1A).
  • a virus-induced transient expression vector constructed from BmNPV is an expression efficiency enhancing factor and includes the hr3 sequence, ie-1 gene promoter, p10 gene promoter, P10 Burst sequence, and marker protein gene EGFP sequence. Ten types of vectors were used ( Figure 1B).
  • DNA was transduced into Sf9 cells to produce 3 ⁇ g/1X10 6 cells of recombinant plasmid. 16 hours after transduction, baculovirus was inoculated at an MOI of 0.2 and collected on the 7th day of infection. Remaining medium components were washed twice using PBS, and cells were lysed on ice for 30 minutes using 0.1% PBS-T. Afterwards, cell extract was obtained by refrigerated centrifugation at 10,000 xg for 15 minutes. The obtained cell extract was dispensed at least 100 ⁇ L into a 96 well plate, and the fluorescence intensity was measured through a 488 nm filtration filter and a 510 nm emission filter. The results of measuring the fluorescence intensity are shown in Figure 2.
  • the His-tag gene (SEQ ID NO: 1), which is easy to detect the protein, was combined with the EV71 P1 precursor gene (SEQ ID NO: 2) and the CVA16 P1 precursor gene ( SEQ ID NO: 5) were fused to both ends, respectively.
  • the His-fused P1 precursor was cloned into a bidirectional vector containing the overexpression vector and the vector selected for 3CD expression to construct 18 vectors including the control promoters CMV-ie1 (SEQ ID NO: 15) and gp41 (SEQ ID NO: 16).
  • the bidirectional vector was used to transform AcMNPV into DH10Bac competent cells containing Bacmid form and to LB treated with kanamycin (40 ug/mL), tetracycline (10 ug/mL), gentamicin (10 ug/mL), X-gal, and IPTG. After culturing in the dark at 37°C for more than 24 hours using solid media, white colonies were selected, cultured, and extracted using PureLink ® HiPure Plasmid Miniprep Kit (ThermoFisher, USA).
  • M13F(-40) primer (5'-GTT TTC CCA GTC ACG) was used using AccuPower ® ProFi aq PCR Premix (Bioneer Co., Daejion, Korea). PCR was performed using AC- 3') (SEQ ID NO: 17) and M13R(-40) primer (5' -CAG GAA ACA GCT ATG AC- 3') (SEQ ID NO: 18). As a result of PCR, it was confirmed that 9 types of EV71 recombinant baculoviruses and 9 types of CVA6 recombinant baculoviruses were produced (Figure 3).
  • insect cells infected with each recombinant baculovirus for 96 hours were collected and subjected to protein electrophoresis and Western blot analysis using a His-tag specific antibody. Specifically, a 12% SDS-PAGE gel was transferred to a nitrocellulose membrane (Pall Corp, New York, USA) at a voltage of 25 V for 30 minutes, and TBS-T (20mM Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween) for blocking. 20, pH 7.4) was treated with 5% skim milk dissolved in water for 30 minutes.
  • TBS-T 20mM Tris, 150mM NaCl, 0.1% Tween
  • Anti-His antibody specific for the His-tag (Applied Biological Materials Inc., Richmond, Canada) was diluted in TBS-T and washed three times for 15 minutes each. Secondary antibody (anti-mouse IgG) was also diluted in TBS-T and washed three times for 15 minutes each. Finally, the membrane was treated with Western HRP substrate (Merck Millipore, Burlington, USA) and images were taken with the Azure c300 Western Blot Chemiluminescent Blot Imaging System (Azure biosystem, Dublin, USA) to observe specific bands. Western blotting results are shown in Figures 4a and b.
  • the expression and cleavage of the target protein could be reconfirmed in Western blot analysis using antiserum, and it was confirmed that the vector containing P10-BS5 showed very high expression efficiency.
  • Example 5 Evaluation of recombinant virus according to P1 form and expression level
  • virus-like particles were formed for both the standard expression vector and the overexpression vector, but the ⁇ VP4-P1 form showed a low formation rate.
  • structures presumed to be virus-like particles were observed for both the standard expression vector and the overexpression vector.
  • high VLP formation was observed in the ⁇ VP4-P1 standard expression vector.
  • viruses rAcHy-EV-BS5 and rAcHy-CV-BS5 containing the P1 full form overexpression vector were infected with Sf9 and Hi5 cell lines at 1 M.O.I., collected on the 3rd day, and purified by sucrose cushion ultracentrifugation in the same manner to form virus-like particles. was observed. The results of observing the shape of virus-like particles are shown in Figure 6.
  • VLP antigens As shown in Figure 7, two types of VLP antigens, EV71 and CVA16, were separated and purified depending on the presence or absence of VP4.
  • CaptoCore400 purification conditions The fraction purified from CaptoQ was purified a second time with CaptoCore400 resin and confirmed using SDS-PAGE and Western blot. The collected proteins were concentrated through TFF (100 kDa cut off), and the purity of the proteins was confirmed using GPC and SDS-PAGE.
  • VLP formation was confirmed through TEM analysis of the purified antigen.
  • the results of separating and purifying two types of VLP antigens, EV71 and CVA16, according to the presence or absence of VP4 are shown in Figures 8A to D, and the TEM analysis results are shown in Figure 8E.

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 수족구 바이러스 유사입자 구조 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터는 구조단백질의 대량 생산과 P1 전구체의 절단을 위한 3CD 발현량을 조절함으로써 높은 수율로 수족구병 바이러스 유사입자 생산이 가능함을 확인하였으며, 정확한 구조의 항원 단백질을 저비용으로 생산할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 본 발명에 다른 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용하여 생산된 수족구 바이러스 유사입자는 수족구병의 예방 및 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.

Description

외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 수족구 바이러스 유사입자 구조단백질의 생산 방법
본 발명은 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 수족구 바이러스 유사입자 구조 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 정부(보건복지부)의 재원으로 한국보건산업진흥원의 지원을 받아 수행되었다[연구개발과제번호: HV23C013200, 연구개발사업단명: 백신 실용화 기술개발 사업단, 사업명: 감염병 예방 치료 기술개발(백신 실용화 기술개발 사업단), 연구개발과제명: 배큘로바이러스 고발현 시스템 바이러스 유사입자 플랫폼을 활용한 수족구병 다가백신 후보물질 개발].
바이러스 유사 입자는 바이러스와 모양이 매우 유사하지만 유전 물질이 없기 때문에 감염을 일으키지 않는다. VLP는 강력한 면역 반응을 유도할 수 있는 구조적 바이러스 에피토프를 제시하는 바이러스 표면 단백질이 반복적으로 고밀도로 표시되어 있다. 따라서 재조합 단백질의 접힘과 조립이 필수적이며, 진핵생물 발현 시스템은 일반적인 원핵생물 발현 시스템에 비해 이점이 있다. 실제로 배큘로바이러스 기반 곤충 세포 발현 시스템은 VLP 백신을 만드는 데 자주 사용된다. 곤충 세포에서 단백질 생산 및 변형 과정은 종종 인간과 유사하며 다양한 VLP를 생산할 수 있다. 인체에 대한 안전성과 면역원성이 높은 VLP형 B형 간염백신, HPV백신 등이 상용화되어 있으며, 최근 다양한 백신이 허가되고 있다. EVA71은 30~32nm 크기의 비막형 입자이며, 이코사헤드랄 캡시드로 구성되어 있다. 바이러스 게놈의 길이는 약 7,500개의 뉴클레오타이드이며, 하나의 ORF만 있는 +ssRNA 형태다. 측면은 폴리 A 꼬리가 있는 고도로 구조화된 5'UTR 및 3'UTR이다. ORF는 2,100개의 아미노산으로 구성된 하나의 대형 단백질을 암호화한다. 이 다단백질은 추가로 가수분해되어 3개의 전구체 단백질인 P1, P2, P3를 형성한다. P1 전구체 단백질은 네 부분으로 쪼개져 VP1, VP2, VP3, VP4로 분해된다. 4개의 단백질이 모여서 프로토머를 형성하고, 5개의 프로토머가 모여서 펜타머를 구성하며, 12개의 펜타머가 모여서 최종 비리온을 형성한다. VP1, VP2, VP3는 캡시드 표면에 노출되어 있고 VP4는 캡시드 내부에 있다. P2와 P3는 7개의 비구조 단백질(P2-2A, 2B, 3C; P3-3A, 3B, 3C, 3D)을 인코딩한다. 특히, P1 절단에서는 P3의 3CD 프로테아제는 VP0와 VP3 사이에서, 3CD 프로테아제는 VP3와 VP1 사이에서 작용하는 것으로 알려져 있다. VP0 절단 메커니즘은 잘 알려져 있지 않다. 따라서 HFMD-VLP는 P1과 3CD 발현 모두의 단백질 발현 조절이 필요하며, 이에 따라 다양한 발현 전략이 시도되어 왔다. 최근에는 VLP의 수율을 높이기 위한 연구가 활발히 진행되었고, 3CD가 세포독성을 보인다는 보고가 있어 발현 수준을 조절하기 위한 연구가 진행 중이다.
이에 본 발명자들은 burst 서열 및 junk 서열을 이용해 HFMD-VLP를 효율적으로 생산하기 위하여 연구한 결과, 외부 단백질 생산을 위한 최적 프로모터 조합을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 4 또는 7의 염기서열로 표시되는 3CD 서열, 서열번호 2, 3, 5, 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 P1 유전자, 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 OplE-2 프로모터 및 서열번호 14, 19 내지 26의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 정크 서열을 포함하는 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 서열번호 4 또는 7의 염기서열로 표시되는 3CD 서열, 서열번호 2, 3, 5, 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 P1 유전자, 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 P10 프로모터 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 버스트 서열을 포함하는 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 상기 형질전환체에 의해 생산된 수족구 바이러스 유사입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 상기 수족구 바이러스 유사입자를 포함하는 수족구병 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 상기 수족구 바이러스 유사입자를 포함하는 수족구병 예방용 백신 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 수족구병 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4 또는 7의 염기서열로 표시되는 3CD 서열, 서열번호 2, 3, 5, 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 P1 유전자, 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 OplE-2 프로모터 및 서열번호 14, 19 내지 26의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 정크 서열을 포함하는 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 4 또는 7의 염기서열로 표시되는 3CD 서열, 서열번호 2, 3, 5, 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 P1 유전자, 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 P10 프로모터 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 버스트 서열을 포함하는 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명에 따른 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명에 따른 상기 형질전환체에 의해 생산된 수족구 바이러스 유사입자를 제공한다.
또한 본 발명에 따른 상기 수족구 바이러스 유사입자를 포함하는 수족구병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한 본 발명에 따른 상기 수족구 바이러스 유사입자를 포함하는 수족구병 예방용 백신 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 수족구병 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터는 구조단백질의 대량 생산과 P1 전구체의 절단을 위한 3CD 발현량을 조절함으로써 높은 수율로 수족구병 바이러스 유사입자 생산이 가능함을 확인하였으며, 정확한 구조의 항원 단백질을 저비용으로 생산할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 본 발명에 다른 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터 및 이를 이용하여 생산된 수족구 바이러스 유사입자는 수족구병의 예방 및 치료 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 프로모터 세기 결정을 위한 바이러스 유도 일시발현 벡터의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 2는 OpIE2 promoter의 서열 추가에 따른 일시발현 효율 및 p10 promoter의 서열 추가에 따른 일시발현 효율을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 EV71 및 CVA16 P1-His-3CD 발현 대조구 및 실험구 재조합 바이러스들의 모식도를 나타낸 도이다.
도 4a는 Anti-His 항체를 이용한 Hi5 세포에서 EV71 및 CVA16 P1-His의 3CD 발현 promoter에 따른 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4b는 항혈청을 이용한 Hi5 세포에서 EV71 및 CVA16 P1-His의 3CD 발현 promoter에 따른 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5a는 EV71 및 CVA16 3CD의 p10-BS5 발현 재조합 바이러스; 및 EV71 및 CVA16 △VP4-P1 발현 재조합 바이러스;의 모식도를 나타낸 도이다.
도 5b는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 통해 EV71 및 CVA16 재조합 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5c는 P1 형태와 발현 벡터 차이가 있는 바이러스 별 투과전자현미경 관찰 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 EV71 및 CVA16 바이러스의 세포 별 발현 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 수족구 VLP의 정제 공정 모식도를 나타낸 도이다.
도 8은 EV71과 CVA16형 2종의 VLP항원을 VP4의 유무에 따라 분리 및 정제한 결과(A-D) 및 TEM 분석 결과(E)를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4 또는 7의 염기서열로 표시되는 3CD 서열, 서열번호 2, 3, 5, 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 P1 유전자, 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 OplE-2 프로모터 및 서열번호 14, 19 내지 26의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 정크 서열을 포함하는 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 EGFP(enhanced green fluorescent protein), ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein) 및 RFP(red fluorescent protein)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 제작물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4 또는 7의 염기서열로 표시되는 3CD 서열, 서열번호 2, 3, 5, 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 P1 유전자, 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 P10 프로모터 및 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 버스트 서열을 포함하는 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 상기 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 버스트 서열을 1 내지 10회 연속적으로 포함하는 것이 바람직하고, 5회 연속적으로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 상동지역 3(homologous region 3, hr3)을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 IE-1 프로모터를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 벡터는 EGFP(enhanced green fluorescent protein), ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein) 및 RFP(red fluorescent protein)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 명세서에 있어서, "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포의 주었을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환, 형전환 또는 형변환 등이라고도 한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 형질전환체는 재조합 바이러스인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 베큘로바이러스(baculovirus), 아데노바이러스(Adeno viruses), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses, AAV), 트로바이러스(Retrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex virus) 및 백시니아 바이러스(vaccinia virus)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 상기 형질전환체에 의해 생산된 수족구 바이러스 유사입자를 제공한다.
본 발명에 있어서, "바이러스 유사 입자"는 바이러스 외피를 구성하도록 조립된 단백질 코트 또는 캡시드를 포함하는 것으로, 상기 바이러스 유사 입자는 바이러스의 외피(capsid) 형태를 유지하여 살아있는 바이러스와 유사한 효과를 가진다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 상기 수족구 바이러스 유사입자를 포함하는 수족구병 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "백신"은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신으로, 수족구 바이러스에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 유효 성분인 수족구 바이러스 유사 입자 이외에도 백신 조성물을 구성하는 데 적절한 하나 이상의 면역 증강제 또는 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 면역증강제는 주사한 동물의 면역 반응을 증대시키는 물질을 의미하는 것으로, 다수의 상이한 면역증강제가 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 상기 면역증강제는 프로인트 완전 및 불완전 면역 증강제, 비타민 E, 비이온성 차단 폴리머, 뮤라밀디펩티드, Quil A, 광유 및 무광물유 및 카보폴(Carbopol), 유중수형 유제 면역증강제 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물에 포함될 수 있는 담체는 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 설탕 등을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전 일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트를 들 수 있다. 수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 담체는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양 보충제 등을 포함한다.
본 발명의 백신 조성물은 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 예를 들면 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B 등을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 적절한 유화제, 예로서 스판(Span) 또는 트윈(Tween)을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 백신 조성물은 보호제를 포함할 수 있으며, 당업계에 공지된 보호제를 제한 없이 사용할 수 있고, 이는 락토오스(Lactose; LPGG) 또는 트레할로오스(Trehalose; TPGG)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 백신 조성물의 투여는 면역학적 유효량으로 투여할 수 있다. 상기 "면역학적 유효량"이란 수족구 바이러스와 관련된 질병의 예방 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 수족구 바이러스 유사입자를 포함하는 수족구병 예방용 백신 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 수족구병 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 프로모터 세기 결정을 위한 바이러스 유도 일시발현 벡터 제작
3CD 발현 평가에 앞서 프로모터의 발현 세기를 평가하기 위하여 EGFP 서열이 포함된 바이러스 유도 일시발현 벡터를 제작하였다. OpNPV 유래 IE2 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터와 표지단백질 유전자 EGFP 서열을 이용하여 일시발현 벡터를 제작하였다. 이후 λ DNA를 주형으로 PCR하여 Junk 서열(서열번호 14, 19-26)을 얻어낸 뒤 프로모터와 목적 유전자 사이에 삽입하여 OpIE2 프로모터 약화 평가를 위한 9종의 벡터를 제작하였다(도 1A).
P10 단백질을 코딩하는 유전자 프로모터 약화 평가를 위해 BmNPV에서 구축된 바이러스 유도 일시발현 벡터인 발현효율 증대 인자로써 hr3 서열, ie-1 유전자 프로모터, p10 유전자 프로모터, P10 Burst 서열과 표지단백질 유전자 EGFP 서열이 포함된 벡터 10종을 이용하였다(도 1B).
실시예 2. 바이러스 유도 일시발현 벡터의 활성 평가
Sf9 세포에 재조합 플라스미드 3 μg/1X106 세포가 되도록 DNA를 형질도입했다. 형질도입 16시간 후 배큘로바이러스를 0.2 MOI가 되도록 접종하여 감염 7일차에 수거하였다. PBS를 이용하여 2회 잔여 배지 성분을 세척하고 0.1% PBS-T를 이용하여 30분간 얼음에서 세포를 용해시켰다. 이후 10,000 xg로 15분간 냉장원심분리하여 세포 추출물을 얻었다. 수득된 세포 추출물을 96 well plate에 최소 100 μL씩 분주하였고, 488 nm 여과 필터와 510 nm 방출 필터에서 형광 강도를 측정하였다. 형광 강도를 측정한 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, OpIE2 프로모터에 Junk 서열이 증가할수록 발현량이 감소하였다. 그리고 P10 프로모터에 burst 서열이 증가할수록 발현량이 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 3. His-P1 전구체의 발현과 보조 프로모터별 3CD 발현 재조합 바이러스 제작
3CD 발현을 위한 프로모터의 종류에 따른 P1 구조단백질의 절단 활성을 비교하기 위하여, 단백질 검출이 용이한 His-tag 유전자(서열번호 1)를 EV71 P1 전구체 유전자(서열번호 2) 및 CVA16 P1 전구체 유전자(서열번호 5) 양말단에 각각 융합하였다. 과발현 벡터와 3CD 발현에 선발된 벡터가 포함된 양방향 벡터에 His 융합 P1 전구체를 클로닝하여 대조구 프로모터 CMV-ie1(서열번호 15) 및 gp41(서열번호 16)를 포함한 18종의 벡터를 구축하였다.
양방향 벡터는 AcMNPV를 Bacmid 형태가 포함된 DH10Bac competent 세포 내로 형질전환시키고 kanamycin (40 ug/mL), tetracycline (10 ug/mL), gentamicin (10 ug/mL), X-gal 및 IPTG가 처리된 LB 고체배지를 이용하여 24시간 이상 37℃에서 암배양 후 하얀색 콜로니를 선별하여 배양하고 PureLink® HiPure Plasmid Miniprep Kit (ThermoFisher, USA)를 이용하여 추출하였다. LacZ 유잔자 내 att-Tn7으로 목적 유전자의 전이를 확인하기 위하여, AccuPower® ProFi aq PCR Premix (Bioneer Co., Daejion, Korea)를 이용하여 M13F(-40) primer (5' -GTT TTC CCA GTC ACG AC- 3')(서열번호 17)와 M13R(-40) primer (5' -CAG GAA ACA GCT ATG AC- 3')(서열번호 18)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행 결과, EV71 9종의 재조합 배큘로바이러스 및 CVA6 9종의 재조합 배큘로바이러스가 제작됨을 확인하였다(도 3).
실시예 4. His-P1 전구체의 발현과 보조 프로모터 별 3CD에 의한 절단 확인
목적 구조 단백질의 발현 및 절단 여부를 검정하기 위해 각각의 재조합 배큘로바이러스에 96 시간 동안 감염된 곤충세포를 수거하여 단백질 전기영동 및 His-tag 특이적 항체를 이용한 웨스턴블랏 분석을 실시하였다. 구체적으로, 12% SDS-PAGE gel을 nitrocellulose membrane (Pall Corp, New York, USA)에 25 V의 전압으로 30분 동안 transfer하였고, blocking을 위하여 TBS-T (20mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.4)에 녹인 5% skim milk를 30분 처리하였다. His-tag에 특이적인 anti-His항체(Applied Biological Materials Inc., Richmond, Canada)는 TBS-T에 희석하여 처리한 후, 15분씩 3번 세척하였다. 2차 항체(anti-mouse IgG) 또한 TBS-T에 희석하여 처리한 후, 15분씩 3번 세척하였다. 최종적으로 membrane에 Western HRP substrate (Merck Millipore, Burlington, USA)를 처리하고 Azure c300 Western Blot Chemiluminescent Blot Imaging System (Azure biosystem, Dublin, USA)으로 이미지를 촬영하여 특이적인 밴드를 관찰하였다. 웨스턴 블롯팅 결과는 도 4a 및 b에 나타냈다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, EV71의 경우 P10-BS3, P10-BS5와 OpIE2-200, OpIE2-400을 포함하는 벡터에서 검출되었으며 절단이 확인되어 VP0 고유 분자량인 36kDa와 VP1 고유 분자량인 33kDa 부근에서 특이적인 밴드가 확인되었다. CVA16의 경우 P10-BS5를 포함하는 벡터에서만 VP1 특이적인 밴드를 확인하였다.
도 4b에 나타낸 바와 같이, 항혈청을 이용한 웨스턴블랏 분석에서 목적 단백질의 발현 및 절단을 재확인할 수 있었으며, P10-BS5를 가지는 벡터가 매우 높은 발현 효율을 나타냄을 확인하였다
실시예 5. P1 형태와 발현정도 따른 재조합 바이러스 평가
최종 결정된 재조합 바이러스들에 대하여 His-tag가 제거된 재조합 바이러스와 VP4가 결여된 ΔVP4-P1 형태에 대한 표준발현벡터와 과발현벡터를 이용한 바이러스를 제작하여 총 8종의 바이러스를 제작하였다(도 5a).
각각의 재조합 배큘로바이러스에 의한 발현 효율을 비교하기 위하여 0.5 M.O.I. (multiplicity of infection)로 감염된 Hi5 세포를 접종 7일차에 수거하여 SDS-PAGE 및 웨스턴블랏 분석하였으며, 그 결과는 도 5b에 나타내었다.
도 5b에 나타낸 바와 같이, EV71의 경우 P1 과발현에 의해 발현정도가 매우 높게 증대됨을 확인하였다. 그리고 ΔVP4-P1은 표준발현에서 높은 발현정도가 관찰되었고 과발현에서는 특이적인 밴드를 관찰할 수 없었다. CVA16의 경우 ΔVP4-P1 표준발현에서만 특이적인 밴드가 확인되었다
또한 재조합 바이러스에 감염된 세포를 수거한 뒤, Freeze & Thaw 방법으로 세포추출물을 준비하고 10%, 20%, 30%, 40%, 50% sucrose cushion에 올리고 100,000 × g, 4℃에서 2시간 30분 동안 초원심분리를 수행하였다. 단백질 전기영동에서 발현이 확인된 rAcHy-EV-BS5를 이용하여 전체 분획을 단백질 분석하여 20~30%에 다량의 구조단백질이 존재함을 확인하였다. 그리고 모든 바이러스에 대하여 20~30% 분획에 대하여 투과전자현미경으로 관찰하여 P1 형태 및 발현 정도에 따른 수족구병 바이러스유사입자 형성 유무를 확인하였다. 투과전자현미경 이미지는 도 5c에 나타내었다.
도 5c에 나타낸 바와 같이, EV71의 경우 표준발현 벡터와 과발현 벡터 모두 바이러스 유사 입자가 형성되었으나, ΔVP4-P1 형태는 낮은 형성율을 보였다. CVA16의 경우 표준발현 벡터와 과발현 벡터 모두 바이러스 유사 입자로 추정되는 구조가 관찰되었다. 특히, ΔVP4-P1 형태 표준발현 벡터에서는 높은 VLP 형성이 관찰되었다.
실시예 6. 세포 환경에 따른 VLP 생산 조건 수립
P1 전체 형태 과발현 벡터를 포함하는 바이러스 rAcHy-EV-BS5, rAcHy-CV-BS5를 Sf9, Hi5 세포주에 1 M.O.I.로 감염하여 3일차에 수거하여 동일한 방법으로 Sucrose cushion 초원심분리 정제하여 바이러스 유사입자 형태를 관찰하였다. 바이러스 유사입자 형태를 관찰한 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, EV71의 경우 Sf9 세포에서는 바이러스 유사입자가 관찰되지 않았고 Hi5 세포에서는 높은 형성율을 보였다. CVA16의 경우 Sf9, Hi5 세포주 모두 바이러스 유사입자가 관찰되지 않았다.
실시예 7. 수족구 VLP 분리-정제
도 7과 같이 EV71과 CVA16형 2종의 VLP 항원을 VP4의 유무에 따라 분리 및 정제를 진행했다.
- CaptoQ 정제 조건 : 20mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer로 충진 후 농축시료 40mL을 loading한 뒤 1M NaCl이 포함된 20mM Tris-HCl(pH 7.5)를 이용 농도구배 방식으로 정제를 진행하였다. 이때 300mM NaCl 농도의 위치에서 목적 단백질을 정제한 뒤 SDS-PAGE와 Western blot을 이용하여 확인하였다.(도 8)
- CaptoCore400 정제 조건 : CaptoQ에서 정제된 fraction을 CaptoCore400 resin으로 2차 정제 후 SDS-PAGE와 Western blot을 이용하여 확인하였다. 수거한 단백질을 TFF(100kDa cut off)를 통해 농축한 뒤 GPC와 SDS-PAGE를 이용 단백질의 순도를 확인하였다.
또한 정제 항원을 TEM 분석을 통해 VLP 형성을 확인하였다. EV71과 CVA16형 2종의 VLP항원을 VP4의 유무에 따라 분리 및 정제한 결과는 도 8A 내지 D에 나타내었고, TEM 분석 결과는 도 8E에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, EV71과 CVA16형 2종의 VLP 항원은 성공적으로 분리 및 정제된 것을 확인했다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. 서열번호 4 또는 7의 염기서열로 표시되는 3CD 서열,
    서열번호 2, 3, 5, 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 P1 유전자,
    서열번호 13의 염기서열로 표시되는 OplE-2 프로모터 및
    서열번호 14, 19 내지 26의 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 정크 서열을 포함하는 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 EGFP(enhanced green fluorescent protein), ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein) 및 RFP(red fluorescent protein)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함하는, 재조합 벡터.
  3. 서열번호 4 또는 7의 염기서열로 표시되는 3CD 서열,
    서열번호 2, 3, 5, 및 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염기서열로 표시되는 P1 유전자,
    서열번호 11의 염기서열로 표시되는 P10 프로모터 및
    서열번호 12의 염기서열로 표시되는 버스트 서열을 포함하는 외래 단백질 발현을 위한 재조합 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 버스트 서열을 1 내지 10회 연속적으로 포함하는 것인, 재조합 벡터.
  5. 제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 상동지역 3(homologous region 3, hr3)을 포함하는, 재조합 벡터.
  6. 제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 IE-1 프로모터를 더 포함하는, 재조합 벡터.
  7. 제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 EGFP(enhanced green fluorescent protein), ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EYFP(enhanced yellow fluorescent protein) 및 RFP(red fluorescent protein)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형광 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함하는, 재조합 벡터.
  8. 제1항 또는 제3항에 따른 재조합 벡터가 도입된 형질전환체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 형질전환체는 재조합 바이러스인, 형질전환체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 바이러스는 베큘로바이러스(baculovirus), 아데노바이러스(Adeno viruses), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses, AAV), 트로바이러스(Retrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes Simplex virus) 및 배시니아 바이러스(vaccinia virus)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 형질전환체.
  11. 제8항에 따른 형질전환체에 의해 생산된 수족구 바이러스 유사입자(Virus-like particle, VLP).
  12. 제11항에 따른 수족구 바이러스 유사입자를 포함하는 수족구병 예방용 백신 조성물.
  13. 제12항에 따른 수족구 바이러스 유사입자를 포함하는 수족구병 예방용 백신 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 수족구병 예방 또는 치료 방법.
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