CN102311972B - 利用叶绿体制备猪圆环病毒ⅱ型抗原的方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用叶绿体制备猪圆环病毒Ⅱ型抗原的方法及其产品，其制备方法包括：（1）构建猪圆环病毒Ⅱ型抗原基因衣藻叶绿体表达载体；（2）将该衣藻叶绿体表达载体转化衣藻，筛选得到转基因衣藻；(3)培养转基因衣藻，收集所表达的重组蛋白，即得。本发明方法采用衣藻叶绿体表达系统在衣藻生物反应器中生产猪圆环病毒Ⅱ型抗原，所表达的重组蛋白特异性高、具有良好的免疫效果且不会产生非目的性的免疫反应。本发明制备方法可以大幅降低猪圆环病毒Ⅱ型抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。

Description

利用叶绿体制备猪圆环病毒Ⅱ型抗原的方法及其产品

技术领域

本发明涉及一种抗原的制备方法，尤其涉及一种利用衣藻叶绿体制备猪圆环病毒II型抗原的方法，属于猪圆环病毒II型抗原的制备领域。 

背景技术

猪圆环病毒II型(Porcine circovirus type 2(PCV2))是断乳仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)等相关疾病的主要病原，是一种无包膜的、二十四面体、单链环状DNA病毒，其基因组全长为1,767bp或1,768bp，包含11个阅读框架。但是，基因组有明确的编码产物的只有其中的两个，即：rep(复制相关蛋白)和cap(核衣壳蛋白)。PCV有两种类型：PCV1和PCV2；PCV1尚无明显的致病证据，现在研究的主要还是PCV2。 

PCV2流行广泛，能够给养猪业带来巨大损失。目前，防治PCV2的疫苗主要有以下几种：(1)以PCV1为骨架，PCV1的ORF2部分用PCV2的ORF2置换，形成一个重组活的疫苗。(2)灭活的PCV2。(3)表达PCV2的ORF2的亚单位疫苗。实验证明，ORF1在PCV1和PCV2之间具有交叉反应性，而ORF2却是特异的[MahéD，etal.J Gen Virol.2000，81(Pt7)：1815-1824]，所以，亚单位疫苗一般都选择ORF2。随着分子生物学和基因工程的发展，利用植物生物反应器生产动物疫苗，受到越来越多的青睐，尤其是利用叶绿体表达系统。植物叶绿体表达系统能够高效表达目的基因、环境安全性高，已成为目前植物生物反应器研究的热点之一。 

1999年，张中林等(丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定点整合入衣藻叶绿体基因组的研究，遗传，1999，21(6)：1-6)将丙型肝炎病毒(HCV)两段DNA片段，即HCV基因组非结构NS 3区抗原基因(约0.7kb)和核心抗原C区抗原基因(约0.6kb)的cDNA片段，中间加入连接肽Ser-Pro-Gly-Ser的密码子序列，构建成融合抗原基因NS3-C，再将该表达盒与选择标记基因aadA表达盒和衣藻叶绿体基因组同源片段连接，构建成衣藻叶绿体转化载体pSS6。基因枪法转化衣藻叶绿体，经PCR和Southern杂交分析表明，融合抗原基因NS3-C已整合到衣藻叶绿体基因组中。 

2003年，Sun M等(Foot-and-mouth disease virus VP1 protein fused cholera toxin B subnit expressed in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast.Biotechnology Letters，2003，25：1087-1092)人成功的在衣藻叶绿体中进行了口蹄疫病毒(FMDV)VP1与霍乱毒素B亚基(CTB)融合基因的重组和表达。经过Western blot和ELISA免疫杂交分析表明CTBVP1融合蛋白表达量占可溶性总蛋白量的3-4％(1mg可溶性总蛋白含有30-40μg的重组蛋白)；G_M-ELISA结合分析证明衣藻叶绿体所表达的CTBVP1融合蛋白能够正确地折叠形成寡聚体，从而具有一定的生物学活性。 

2008年3月Dong-Mei He等人(Recombination and expression of classical swine fever virus(CSFV)structural protein E2 gene in Chlamydomonas reinhardtii chroloplasts，Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2007，55：26-30)成功的在衣藻叶绿体中进行了典型的猪瘟病毒(CSFV)的结构蛋白E2的重组和表达。经过Westernblot和ELISA免疫杂交分析表明，CSFV的结构蛋白E2的表达量占衣藻细胞可溶性总蛋白的2％。 

猪圆环病毒II型危害巨大，防治猪圆环病毒II型最有效的措施就是注射疫苗。如何制备高效、低成本的疫苗十分迫切。德国勃林格殷格翰动物保健公司的PCV2疫苗 

荷兰英特威，先灵葆雅动物保健公司的PCV2疫苗 

等用杆状病毒表达的PCV2的Capsid作为疫苗。但是，现有的这些疫苗均利用昆虫培养细胞来生产，其成本高，市场售价昂贵，在一定程度上限制了其应用和推广。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有的PCV2疫苗的制备方法所存在的产量低、生产成本高、存在一定的安全风险(有产生交叉反应、产生非特异性免疫的可能性)等缺陷，提供一种新的PCV2疫苗的制备方法，该方法利用植物叶绿体作为生物反应器表达猪圆环病毒II型抗原，具有产量高、成本低、安全性好等诸多优点。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的： 

一种利用叶绿体制备猪圆环病毒II型抗原的方法，包括：(1)构建猪圆环病毒II型抗原基因的衣藻叶绿体表达载体；(2)将所构建的衣藻叶绿体表达载体转化衣藻，筛选得到转化有猪圆环病毒II型抗原基因的转基因衣藻；(3)培养转基因衣藻，收集所表达的重组猪圆环病毒II型抗原蛋白，即得。 

上述方法中，步骤(1)中所述猪圆环病毒II型抗原基因优选为猪圆环病毒II型抗原蛋白去核定位信号的ORF2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示； 

步骤(1)中所述的猪圆环病毒II型抗原基因衣藻叶绿体表达载体可参考以下方法构建得到： 

将猪圆环病毒II型抗原基因置于衣藻叶绿体特异启动子和终止子的调控之下，组合得到猪圆环病毒II型抗原基因表达盒；将所组合的猪圆环病毒II型抗原基因表达盒与衣藻叶绿体基因组中的同源片段进行同源重组，构建得到猪圆环病毒II型抗原基因衣藻叶绿体表达载体。 

所述的叶绿体特异启动子包括但不限于：prrn、atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL等启动子；优选的，所述的启动子为prrn启动子(该启动子进行了优化，加上了SD序列以增强目的基因的转录)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。 

所述的终止子优选为16SrRNA终止子，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。 

所述的衣藻叶绿体基因组中的同源片段优选为atpA-rbcL，其核苷酸序列为SEQID NO.4所示。 

为了达到更好的效果，所述的猪圆环病毒II型抗原基因衣藻叶绿体特异表达载体 还含有选择标记基因，该选择标记基因优选为细菌来源的抗菌素抗性基因，更优选为aadA基因。 

为了更有利于叶绿体转化，步骤(2)中所述的衣藻优选为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，其品系为CW-15，其为无细胞壁的突变体；更优选为处于生长对数期后期的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CW-15。 

步骤(2)中所述的转化方法优选为基因枪法。 

本发明的一个特别优选的整体技术方案如下： 

将猪圆环病毒II型抗原蛋白ORF2基因(其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)克隆到pSK-prrn-T-psbA5’-aadA-rbcl3’载体的SalI和SphI之间，使PCV-ORF2基因片段置于衣藻叶绿体基因特异启动子Prrn和16SrRNA终止子调控之下得到质粒pSK-prrn-pcv-T-psbA5’-aadA-rbcl3’；再将其克隆入含有同源重组片段atpA-rbcL的pAR质粒BamH I位点，构建得到猪圆环病毒II型衣藻叶绿体表达载体pAR-aadA-pcv。本发明将所构建的猪圆环病毒II型衣藻叶绿体表达载体pAR-aadA-pcv提交到专利程序认可的机构进行保藏，其微生物保藏号是：CGMCC No.5170；分类命名是：Chlamydomonas reinhardtii；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。 

本发明采用基因枪将pAR-aadA-pcv转化莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，筛选得到转化有猪圆环病毒II型抗原蛋白ORF2基因的转基因衣藻。 

本发明采用基因同源重组技术将来源于猪圆环病毒II型的ORF2基因构建到由衣藻叶绿体特异启动子Prrn和16SrRNA终止子组合所驱动的表达盒，利用衣藻叶绿体基因组中的atpA-rbcL作为同源片段，发生同源重组，构建得到猪圆环病毒II型抗原基因衣藻叶绿体表达载体；通过基因枪转化法将其导入衣藻叶绿体中，通过PCR、Westernblot、ELISA等分子生物学手段检测，最终获得转基因衣藻，使猪圆环病毒II型的抗原基因在衣藻叶绿体中得到成功表达，经试验证实，所表达的重组抗原蛋白具有良好的免疫效果，可用其制备得到预防或治疗II型猪圆环病的疫苗。 

本发明方法利用衣藻叶绿体表达系统表达猪圆环病毒II型抗原，不仅弥补了其它生物反应器的不足，而且还有以下独特的优点： 

第一，衣藻叶绿体能够正确的折叠和组装复杂的哺乳动物的蛋白；第二，在衣藻中，从最初的转化到合成一定量的蛋白质需要的时间相当短。第三，外源基因能定点整合在衣藻叶绿体基因组上。第四，外源基因在后代中可稳定表达。第五，衣藻叶绿 体基因组具有分子量小、结构简单、不结合组蛋白等特点有利于实现分子操作。第六，安全性高：动物和低等植物的衣藻两者之间蛋白质结构完全不同，作为抗原不会产生交叉反应，同样也不会产生非特异性免疫，且衣藻作为饲料，表达的抗原可以直接加入饲料中。本发明方法所生产的重组蛋白不需纯化，可直接作为动物添加饲料就可起到治疗的效果，方便安全。 

本发明方法采用衣藻叶绿体表达系统在衣藻生物反应器中安全、高效的生产猪圆环病毒II型抗原，所表达的蛋白特异性较高，具有良好的免疫效果而且不会产生非目的性的免疫反应。本发明抗原制备方法的成本显著低于传统的猪圆环病毒II型抗原制备方法(例如通过昆虫细胞繁殖病毒制备猪圆环病毒II型抗原)，无需投资建厂，无三废，电力和水资源等能源消耗极少。由于衣藻是无毒的，可以食用，所以本发明方法所制备的抗原，安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。 

总体而言，本发明方法可以大幅度降低猪圆环病毒II型抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。 

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

实验材料 

1.E.coli TOP10购自Promega公司；猪圆环病毒II型购自中国兽药药品监察所；野生型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtti)CW-15自南开大学生命科学院引进，由中国农业科学院生物技术研究所保存，具体培养方法和特性可以参考相关的文献(Hyams，J.and D.R.Davies，The induction and characterisation of cell wall mutants of Chlamydomonas reinhardtii.Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，1972.14(4)：p.381-389)；检测用的猪圆环病毒II型多克隆抗体(一抗)和大肠杆菌表达的PCV II型抗原可参考有关的文献制备得到(韦永龙，张志芳，Bm-bacmid的构建和II型猪圆环病毒核衣壳蛋白的原核表达，中国农业科学院研究生学位论文，2010，中国期刊网)。 

2.酶与试剂：各种限制性内切酶、T₄ DNA连接酶、Klenow酶及其配套缓冲液购自Promega公司；检测所用的所有二抗抗体均购自Sigma公司； 

3.生化试剂：IPTG、X-Gal为Promega公司产品；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；Tris、dNTPs购自Sigma公司；蛋白胨、酵母抽提物、胰蛋白胨均购自OXOID公司；溴化乙锭(EB)购自Fluka公司；TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)购自瑞典 LKB BROMMA公司；SDS为BDH公司产品；β-巯基乙醇，Tris购自Sigma公司；考马斯亮兰R-250、N，N′-甲叉双丙烯酰胺购自瑞士Fluka Chemie AG公司；丙烯酰胺为Aldrich化学有限公司产品；硝酸纤维素膜Hybond-N和尼龙膜Hybond-C均为Amersham产品； 

4.培养基：大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；衣藻培养基为TAP培养基； 

5.试验所用的健康小白鼠购自北京生物制品研究所，为6-8周龄雌性BALB/c小白鼠。 

实施例1猪圆环病毒II型ORF2基因衣藻叶绿体表达载体的构建和转化以及转基因衣藻的鉴定 

1.猪圆环病毒II型抗原蛋白ORF2基因的克隆 

1.1目的基因的获得 

猪圆环病毒DNA的提取：从典型的发病猪样品中，按照用PCV2检测试剂盒(世纪元亨公司)说明书，处理样品，抽提出DNA，作为模版。 

根据已知的猪圆环病毒II型ORF2基因的序列，分别设计引物，并且分别引入SalI位点和SphI位点，两对引物如下： 

PCVFP：GGTCGACATGAATGGCATCTTCAACACCC Sal I 

PCVRP：GGCATGCTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC  SphI 

在0.5mL eppendorf管中加入以下组分： 

反应程序： 

1.2产物的回收 

用普通凝胶进行电泳，切下所需DNA条带，称重后放入Eppendorf管中，加入3倍体积(v/w)的6mol/L NaI溶液，37℃下使凝胶充分溶解，再加入10μL玻璃奶吸附DNA，室温下放置5min，稍离心5s，去上清，沉淀用New Wash洗液洗涤一次，重复离心、洗涤三次，晾干后用30μL 0.1×TE Buffer溶解DNA，离心后取上清，将DNA保存于-20℃备用。 

1.3T载体的连接反应 

回收的PCR产物2.5μL、pMD18-T 0.5μL和soul I 3μL混匀后，16℃反应2h。 

1.4质粒DNA或连接产物的转化 

取-70℃冻存的感受态细胞，用双手搓至大部分融化后迅速置冰上。感受态细胞完全融化后加入质粒DNA20～100ng或连接混合物5μL，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90sec，迅速置冰上1～2min。加入1mL LB培养基，37℃振荡(≤150rpm)培养1h。4,000g离心5min，去部分上清后(留150～200μL)涂布于含适当抗生素的LB平板上。37℃倒置培养过夜。 

1.5碱裂解法提取质粒DNA 

(1)用无菌牙签从LB平板上挑取单菌落，接种于4mL含100μg/mL氨卡青霉素的LB液体培养基中，37℃，230r/min，振荡培养过夜； 

(2)取1.5mL过夜培养物于Eppendorf管内，5,000rpm离心5min收集菌体，弃上清； 

(3)用150μL Sol I悬浮沉淀，冰浴10min； 

(4)加300μL Sol II和150μL氯仿，轻轻倒转混匀后冰浴5min； 

(5)加450μL Sol III，倒转混匀后冰浴10min； 

(6)12,000rpm离心10min，取上清，加0.6倍体积异丙醇，混匀后于4℃放置20min； 

(7)12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于250μL TER(含20μg/mL RNaseA的1×TE)中，37℃消化20min，加入300μL PPt沉淀Buffer，混匀后置4℃ 20min； 

(8)12,000rpm离心10min，弃上清，70％乙醇洗一次，真空干燥沉淀，用80μL 0.1×TE(pH8.0)溶解，-20℃保存备用。 

1.6重组子的鉴定 

酶切鉴定：首先小量抽提质粒DNA，然后利用salI和sphI进行酶切反应，电泳后出现约0.6kb的DNA条带的质粒为重组质粒T-pcv，将重组质粒T-pcv进行测序，测序结果与预期结果一致。 

衣藻叶绿体表达载体的构建 

2.衣藻叶绿体同源载体pAR的构建 

2.1同源片段的获得 

根据已知的衣藻叶绿体基因组序列分别设计引物如下： 

引物设计： 

RbcLFP：CGTCGACTTAAAGTTTGTCAATAGTA  Sal I 

RbcLRP：CGGATCCCCGACAGGAATATACATGG  BamH I 

AtpAFP：CGGATCCGGATAAGCGAGGCCACTGT  BamH I 

AtpARP：GTCTAGAGATATAAGCAGATACGTCAC Xba I 

在0.5mL eppendorf管中加入以下组分： 

反应程序： 

回收大小正确的PCR扩增片段，将上述两个基因片段atpA，rbcL分别连接到T载体进行测序鉴定，结果与预期完全一致。 

2.2载体的构建 

用Sal I和BamH I酶切克隆的rbcL基因片段的T载体，回收1.66kb的片段，将该片段克隆到载体pBluescript SK的Sal I和BamH I位点之间，构建载体pSK-rbcL，然后用BamH I和Xba I酶切克隆的aptA基因片段的T载体，回收1.6kb的DNA片段，将该片段克隆到载体pSK-rbcL的BamH I和Xbaa I位点之间，获得含有衣藻叶绿体同源片段atpA-rbcL基因片段的载体pAR。 

2.3衣藻叶绿体16srRNA启动子和终止子的克隆 

本实验将一段含有SD序列的碱基序列(GTACGGAGGGAATC)引入到16SrRNA启动子的3’端，提高16SrRNA启动子与核糖体的结合能力，从而提高下游基因的翻译水平。 

根据衣藻叶绿体基因序列，设计引物如下： 

PrrnFP：GCTCGAGCGTCCTAATATAAATATTG xho I 

PrrnRP：CGAATTCGTCGAC

GGATACTCTTTAAAGTTTAAAT 

                    EcoR I    SalI 

T16srRNAFP：CGAGCTCGGATCCCTAGGCAGTTGGCAGGACG Sac I  BamH I 

T16srRNARP：GTCTAGAGCATGCATTTTTAACCCTTATGGGTATAT Xba I 

sph I 

在0.5mL eppendorf管中加入以下组分： 

反应程序： 

回收大小正确的PCR扩增片段，将PCR扩增的prrn、T16SrRAN分别连接到T载体进行测序鉴定，结果与预期完全一致；用Xho I和EcoR I酶切克隆的prrn基因片段的T载体，回收0.56kb的片段，将该片段克隆到载体pBluescript SK的Xho I和EcoRI位点之间，构建载体pSK-prrn。然后用Xba I和Sac I酶切克隆的T16SrRNA基因片段的T载体，回收0.46kb的DNA片段，将该片段克隆到载体pSK-prrn的Xba I和Sac I位点之间，获得含有衣藻叶绿体16srRNA启动子和终止子的载体pSK-prrn-T，在启动子与终止之间有一段克隆位点，分别为：Sal I、EcoR I、Pst I、Sma I、Spe I、Xba I、Sph I。 

2.4目的基因表达盒的构建 

2.4.1衣藻叶绿体壮观霉素表达盒的克隆 

根据实验室保存的含有衣藻叶绿体壮观霉素表达盒的载体(杨宗岐等，科学通报2006，51(12)：1400-1405)设计引物如下： 

PSKAARFP：GCTCGAGCGTCCTATTTTAATACTCCGAAG Xho I 

PSkAARRP：CGGTACCGGATCCTACATCCGCTTTAGTATGTTAC Kpn I BamH I 

PCR扩增出约1.47kb的片段，回收目的片段，连接到pMD18-T载体上，将鉴定阳性的质粒进行测序，结果与原表达盒完全一致，仅将原表达盒两侧的酶切位点替换为Xho I、BamH I、Kpn I。用Xho I、Kpn I酶切克隆到T载体的壮观霉素表达盒，回收1.47kb的片段，连接到pSK的Xho I、Kpn I位点上，成功构建了pSK-psbA5’-aadA-rbcL3’载体。用Xho I、Sac I酶切pSK-prrn-T，回收约0.9kb的片段，连接到pSK-psbA5’-aadA-rbcL3’的Xho I、Sac I位点。构建了pSK-prrn-T-psbA5’-aadA-rbcL3’载体。 

2.4.2目的基因的插入 

用Sal I、Sph I酶切测序正确的阳性重组质粒T-PCV，回收约0.58kb的片段，连接到启动子prrn和终止子T16SrRNA之间的Sal I、Sph I位点之间，使PCV的ORF2基因置于衣藻叶绿体基因特异启动子prrn和终止子T16SrRNA调控之下，得到质粒pSK-prrn-pcv-T-psbA5’-aadA-rbcL3’；再用BamHI进行酶切，回收含有PCV的ORF2基因编码区表达盒的3.0kbDNA片段，将其克隆入具有同源重组片段aptA-rbcL的pAR质粒BamH I位点，构建得到编码猪圆环病毒II型ORF2基因的衣藻叶绿体表达载体pAR-aadA-PCV，其微生物保藏号是：CGMCC No.5170。 

3基因枪转化 

3.1衣藻的培养及衣藻受体细胞的准备 

野生型衣藻生长在含有1/1000体积的10％(质量比)精氨酸的TAP液体培养基中，20～25℃，160rpm，光周期12hr/12hr，参阅文献(Harris E.The Chlamydomonas source book，A comprehensive guide to biology and laboratory use.San Diego：Academic Press，1989)。取1.5mL生长至对数后期(5～6×10⁶ cells/mL)的衣藻于离心管中浓缩(5,000rpm，20℃，5min)，去上清，留200μL涂于TAP固体平板上，3000 Lux的光照条件下培养1～2天，用无菌铲子挖出均匀地长有一层衣藻的直径为2～3cm的培养基块，放入9cm无菌平皿中央，以备轰击。 

3.2微粒子弹(DNA coated microprojectiles)的制备 

称60mg 1.0μm的金粉(Bio-Rad)于1.5mL Eppendorf管中；加入1mL无水乙醇，充分涡旋(vortex)，然后静置10min，10,000rpm离心10sec；小心去除上清液，加入1mL无菌水，充分涡旋，10,000rpm离心10sec，弃上清液；重复用无菌水洗涤2次；用1mL无菌的50％(v/v)甘油重悬金粉颗粒。处理后的金粉可在-20℃长期保存；取50μL上述制备好并已涡旋的金粉颗粒，转入一无菌的1.5mL eppendorf管中，按顺序加入5μL DNA(1μg/μL)、50μL 2.5mol/L CaCl₂和20μL 0.1mol/L亚精胺(Free base，现配现用)；将混合物涡旋1min，置于冰上1min；重复10次；置于冰上30min以上；15,000rpm离心5sec，去除上清液；用250μL无水乙醇洗涤包被好的金粉颗粒2次，10,000rpm离心10sec，去除上清液；60μL无水乙醇重悬金粉颗粒。 

3.3装备基因枪 

(1)基因枪的准备 

将基因枪放置于一个较大型号的超净工作台上，打开超净台紫外灯灭菌30min以上；用70％酒精擦净基因枪真空室及各种元件；用浸泡消毒法将可裂膜(Rupture disk 1,100psi)、载体膜(Macrocarrier)、阻挡网(Stopping screen)及Macrocarrier holders于无水乙醇中消毒15min，然后将Rupture disk和Macrocarrier置于无菌滤纸上，在超净台中吹干；用镊子夹住Macrocarrier holder，在酒精灯火焰上稍事灼烧后置于无菌滤纸上；待Macrocarrier holder冷却后，用镊子将Macrocarrier置于其中并展平。取10μL包被DNA的金粉颗粒无水乙醇悬浮液，点于Macrocarrier中心位置，于超净工作台中吹干；打开电源开关、真空泵及氦气瓶阀门；取出Macrocarrier launch assembly，拧开盖子，将Stopping screen在酒精灯火焰上灼烧后置于凹槽内，把Macrocarrier holder倒扣于凹槽上，旋紧盖子；将Rupture disk装于固定盖中并旋紧；将组装好的Macrocarrier launch assembly置于基因枪真空室的上数第二个格子中；将装有衣藻培养基的培养皿置于Target shelf中心，并将Target shelf置于真空室的上数第四个格子中，使轰击距离为9cm；关紧真空室小门。 

(2)轰击 

抽真空：按VAC键，当真空度达到25～28inches Hg时，将VAC键直接锁定在HOLD 位置；轰击：按住FIRE键，直至Rupture disk爆裂；再按VENT键，使真空表指针回零。打开真空室小门，取出样品。通常每个样品轰击2次。 

4.转基因衣藻的筛选 

4.1转化后衣藻的过度培养 

轰击后的衣藻置于3000Lux的光照条件下培养8h(20～25℃)，再用1mL无菌水把琼脂块上的衣藻洗下，涂于5皿含100μg/mL壮观霉素的抗性选择培养基(TAP+Spc 100μg/mL)上培养。 

4.2转化衣藻的筛选培养 

将涂于抗性选择培养基上的衣藻在3000Lux的连续光照条件下培养约10天左右，挑取单藻落，于50mL液体选择培养基(TAP+Spc 100μg/mL)中培养。 

4.3衣藻转化子的同质化培养 

尽管衣藻细胞内只有一个叶绿体，但是叶绿体内却含有80-100个叶绿体基因组拷贝，最初转化的衣藻叶绿体内既含有转基因的基因组也含有野生型基因组拷贝，因此它的叶绿体基因组是异质的，需要进一步的同质化筛选。 

将TAP液体选择培养基(TAP+Spc 100μg/mL)中培养7天左右的转化子，重新涂布于固体抗性选择培养基(TAP+Spc 100μg/mL)上培养，而后再挑取单藻落转到液体培养基中培养，如此重复多轮进行继代培养，以达到提高外源基因在叶绿体基因组中的同质化程度。 

5.转基因衣藻的检测 

5.1衣藻DNA的提取 

(1)取10mL处于对数生长后期的衣藻培养液，5,000rpm，4℃离心5min； 

(2)衣藻细胞沉淀用350μL NET溶液(0.1mol/L NaCl，50mM EDTA，20mM Tris-HCl，pH 8.0)悬浮后，加入25μL Proteinase K(10mg/mL)，25μL 20％SDS，混匀，55℃水浴2h。 

(3)置于冰上冷却，加入200μL 5M乙酸钾(KAc)，冰上静置30min。 

(4)12,000rpm，4℃离心5min，上清液加入等体积的酚/氯仿(1∶1)抽提两次，再用等体积的氯仿抽提一次。水相加入2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置20min。 

(5)12,000rpm，4℃离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤，真空干燥后溶于30μL超纯水中。 

5.2转基因衣藻PCR检测 

(1)衣藻转化子PCV的ORF2基因的PCR检测 

PCR体系： 

反应程序为： 

取4μL PCR产物上样于1％琼脂糖凝胶上电泳，在衣藻转化子中分别扩增获得与预期大小完全一致的片段，而在野生型衣藻中则没有相应的条带出现。 

(2)叶绿体转基因衣藻同质化程度的PCR检测 

FP：GCCTTTAGGTATATGTCGGTCGTC 

RP：C GTCCACAGGCGTCGTAAGCAAC 

以转基因衣藻DNA为模板，用LA Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。 

PCR体系： 

反应程序为： 

扩增结果，经过5轮抗性加压筛选后获得转PCV-ORF2基因的衣藻叶绿体转化子，只扩增出了一条3.4kb的条带，大小与预期结果相符，说明猪圆环病毒II型的ORF2基因连同aadA基因定点插入到衣藻叶绿体基因组中。 

5.3衣藻总蛋白的提取 

(1)将生长期为对数后期的10mL衣藻培养液，离心收集； 

(2)沉淀用200μL裂解液(2％SDS，50mM Tris-Cl pH 7.5，5％β-巯基乙醇)重悬后煮沸5min； 

(3)12000rpm，离心5min，上清加入三氯乙酸至终浓度为10％，混匀； 

(4)12000rpm，离心10min，沉淀用90％丙酮洗涤，将大部分叶绿素抽提掉； 

(5)待丙酮挥发掉后，沉淀重悬于加样缓冲液，以备蛋白分析。 

5.4Western blot检测 

(1)取总蛋白进行电泳； 

(2)剪下所需大小的NC膜，然后将膜转入转移缓冲液中至少5min；同时也将凝胶浸入转移缓冲液中； 

(3)在电转仪上依次铺上滤纸、NC膜、凝胶、滤纸，用玻璃棒赶去气泡，以1.5mA/cm²凝胶面积的恒定电流转印1.5h； 

(4)取出转印好的膜，放入PBS中轻轻摇动洗膜10min； 

(5)倾去PBS，加封闭液室温轻摇1h； 

(6)将膜浸入含一抗(1∶1500)的封闭液中，4℃轻摇过夜； 

(7)将膜放入洗涤液中轻轻摇动洗膜3次，每次10min； 

(8)将膜转入含HRP标记的羊抗兔二抗(1∶1000)的PBS中，室温轻摇1h； 

(9)将膜放入洗涤液中轻轻摇动洗膜3次，每次10min； 

(10)将膜转入PBS中，轻摇洗膜2次，每次5min； 

(11)将膜转入新配的DAB显色液中，室温下暗处显色5-10min，待有明显的显色条带时，用去离子水漂洗终止反应。 

结果在约22kDa位置处都出现特异杂交信号条带，而未转基因的野生型衣藻则没有出现可见的信号条带。这说明PCV-ORF2基因在三株衣藻转化子的叶绿体中得到了表达，并分别具有抗原性。 

5.5ELISA检测 

(1)样品蛋白的提取：取10mL衣藻10,000rpm离心5min，吸取上清；同时野生型衣藻提取物分别作为阴性对照； 

(2)取100μL加入至96孔酶标板中(同时作1个平行对照)，4℃冰箱包被过夜； 

(3)第二天用洗涤液快速洗板5-6次。加入封闭缓冲液100μL，在一个湿度大的盒子中，室温下保温1h； 

(4)用洗涤液洗板3次，加入第一抗体100μL(1∶1000稀释)，室温反应2h； 

(5)用洗涤液快速洗板5-6次。加入HRP标记的羊抗兔二抗(二抗稀释500倍)，室温下反应2h； 

(6)用洗涤液快速洗板5-6次，加入底物显色溶液100μL。室温下闭光反应3-15min。 

经过试验检测，在衣藻叶绿体中所表达的重组猪圆环病毒II型ORF2蛋白占总的可溶蛋白的3％以上，结果见表1。 

表1 ELISA检测衣藻表达的PCV-ORF2基因 

样品稀释到800倍时ELISA检测仍为阳性。 

5.6动物免疫试验 

5.6.1以洛阳普莱柯生物有限公司生产的灭活猪圆环病毒疫苗作为对照，参照猪圆环病毒2型灭活疫苗效力检验中方法[彭伍平等，中国兽药杂志，2011，45(2)：9-12]进行衣藻叶绿体生产的猪圆环病毒II型抗原的动物实验。 

将上述重组的表达了PCV-ORF2的衣藻经超声波破碎，离心去细胞碎片，将收集纯化的10μg无菌抗原与0.5mL ISA 206佐剂(购自法国SEPPIC公司)进行乳化试制成注射疫苗，具体乳化方法参照ISA 206佐剂乳化说明书。 

将5-6周健康的雌性BALB/c小白鼠30只随机分成3组。第一组注射洛阳普莱柯生物有限公司生产的灭活猪圆环病毒疫苗，第二组注射本发明采用衣藻生产的猪圆环病毒II型抗原，第三组为阴性对照，每只经皮下注射，分四个免疫点，每个点注射0.05ml，14d后再按照相同的免疫途径和剂量加强免疫一次，同时设立不免疫的空白对照组。首免后5周采集血清，用大肠杆菌表达的PCV II型抗原测定血清中PCV2的ELISA抗体。对照组全部为阴性，参考疫苗组抗体平均效价为1∶1280，衣藻生产的猪圆环病毒II型抗原抗体平均效价为1∶1600。 

5.6.2衣藻生产的猪圆环病毒II型抗原的口服疫苗实验 

猪圆环病毒II型抗原的口服疫苗的制备：将初步纯化的含PCV表达产物的衣藻抗原用占衣藻抗原体积50％的含20-40％脂肪酸(最佳浓度为31％的脂肪酸；脂肪酸组成为棕榈酸7％、油酸20.5％、其它脂肪酸3％)混合，再用占衣藻抗原体积50％的8％-12％的蜂胶混合(最佳浓度为蜂胶10％)，经超声波乳化后制备成口服疫苗。 

将5-6周健康的雌性BALB/c小白鼠20只随机分成2组进行动物试验，一组口服所本发明所制备的猪圆环病毒II型抗原口服疫苗；另一组为阴性对照，口服亲本衣藻和相应的佐剂。0.5mL/只经灌注途径各免疫小白鼠，14d后再按照相同的免疫途径和剂量加强免疫一次，2免第四周后采血所分离的血清用大肠杆菌表达的PCV II型抗原测小鼠的IgA抗体，口服免疫组产生的平均抗体效价为1∶800，而对照组全部为阴性。 

综上所述，本发明利用衣藻叶绿体表达的PCV-ORF2抗原无转基因生物安全隐患，同时，用该抗原制备的疫苗具有良好的免疫效果，可以应用于免疫后的抗体检测、注射疫苗。 

<110>  中国农业科学院生物技术研究所

 

<120>  利用叶绿体制备猪圆环病毒Ⅱ型抗原的方法及其产品

 

<130>  dqxl009

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  579

<212>  DNA

<213>  Porcine circovirus type 2

 

<400>  1

aatggcatct tcaacacccg cctctcccgc accttcggat atactgtcaa gcgtaccaca       60

 

gtcacaacgc cctcctgggc ggtggacata atcagattta aaattgacga ctttgttccc      120

 

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cagctttggc tgaggctaca aacctctgga aatgtggacc acgtaggcct cggcactgcg      480

 

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agagaattta atcttaaaga ccccccactt aaaccctaa                             579

 

 

<210>  2

<211>  560

<212>  DNA

<213>  启动子prrn

 

<400>  2

cgacagtgca gttgcctgcc aactgcctat atttatatac tgcgataaac tttagtcccg       60

 

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tatcgcagta ttaacatcct agtatataaa tatcggcagt tggcaggcaa caaatttatt      360

 

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aaatttaaac tttaaagagt                                                  560

 

 

<210>  3

<211>  464

<212>  DNA

<213>  16SrRNA终止子

 

<400>  3

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gcagtggcgg taccactgcc actggcgtcc tgccaactgc ctag                       464

 

 

<210>  4

<211>  3275

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  4

ttaaagtttg tcaatagtat caaattcgaa tttaatttct ttccaaactt cacatgcagc       60

 

agcaagttct ggagaccatt tacaagctga acgaattacg tcgccacctt cacgagcaag      120

 

gtcacgacct tcgttacgag cttgagtaca agcttcaaga gctacacggt tagctgcagc      180

 

acctggagcg ttaccccaag ggtgacctag agtaccacca ccgaactgaa gacatgcgtc      240

 

atcaccgaag atttcaacta aagctggcat gtgccatacg tgaataccgc ctgaagcaac      300

 

tggcataaca cctggcattg aacaccagtc ttgagtgaag taaataccac ggctacggtc      360

 

tttttcaacg tagtcatcac gcattaagtc tacgaaacct agagtaactt cacgttcacc      420

 

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tttaacttca cctgtttctg cttgagcttt gtaaatagct tcagcaacga aaaggaaacg      780

 

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ttcaagacgt agagcacgta aagctttgaa accgaatacg ttacctacaa tagaagtgaa     1080

 

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ttggttgtct tcacccggaa ctggttcgat atcgtaacaa cgacctttgt aacggtcaag     1200

 

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cactgttcac tcctctccaa tatagtagac tttattagag gcagtgttta tatacctaaa     1740

 

cgtcaaaagt catttttata actggtctca aaatacctat aaacccattg ttcttctctt     1800

 

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gtgctgttca aacaaaagat agccgtgcta ttgaatcacc agctcctggt atcgttgcac     2700

 

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attatacaat tatcgtaatg gctaacgcta acgaaccagc tacattacaa tatttagcac     3000

 

catatacagg tgctacgtta gctgagtact tcatgtacac aggtcgtcca actttaacaa     3060

 

tttacgatga cttatctaaa caagcacaag cttaccgtga aatgtctcta ttacttcgtc     3120

 

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ttgaaacaca agaaggtgac gtatctgctt atatc                                3275

Claims (7)

1.一种利用叶绿体制备猪圆环病毒Ⅱ型抗原的方法，包括：（1）构建猪圆环病毒Ⅱ型抗原基因的衣藻叶绿体表达载体：将SEQ ID NO.1所示的猪圆环病毒Ⅱ型抗原基因置于衣藻叶绿体特异启动子和终止子的调控之下组合得到猪圆环病毒Ⅱ型抗原基因表达盒；将所组合的猪圆环病毒Ⅱ型抗原基因表达盒与衣藻叶绿体基因组中的同源片段进行同源重组，构建得到猪圆环病毒Ⅱ型抗原基因衣藻叶绿体表达载体；所述的衣藻叶绿体特异启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述终止子的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；所述的衣藻叶绿体基因组中同源片段的核苷酸序列为SEQ IDNO.4所示；（2）将所构建的衣藻叶绿体表达载体转化衣藻，筛选得到转基因衣藻；(3)培养转基因衣藻，收集所表达的重组蛋白，即得。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的猪圆环病毒Ⅱ型抗原基因衣藻叶绿体表达载体的微生物保藏号是：CGMCC No.5170。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的猪圆环病毒Ⅱ型抗原基因衣藻叶绿体特异表达载体还含有选择标记基因。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述选择标记基因为细菌来源的抗菌素抗性基因。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：所述细菌来源的抗菌素抗性基因为aadA基因。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的衣藻为莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）；步骤（2）中所述的转化方法为基因枪法。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的衣藻为处于生长对数期后期的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CW-15。