CN101812468A - 利用叶绿体制备狂犬病毒抗原的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用叶绿体制备狂犬病毒抗原的方法，包括：(1)构建狂犬病毒抗原基因衣藻叶绿体表达载体；(2)将所构建的表达载体转化衣藻，筛选得到转基因衣藻；(3)培养转基因衣藻，使狂犬病毒抗原基因在衣藻中表达，即得。本发明方法采用衣藻叶绿体表达系统在衣藻生物反应器中安全、高效的生产狂犬病毒抗原，所表达的蛋白特异性高，具有良好的免疫效果且不会产生非目的性的免疫反应。本发明方法的成本显著低于传统的制备狂犬病毒抗原方法，无需投资建厂，无三废，电力和水资源等能源消耗极少。本发明方法所制备的抗原，安全性极高，不需纯化，可直接作为动物添加饲料就可起到治疗的效果。

Description

利用叶绿体制备狂犬病毒抗原的方法

技术领域

本发明涉及一种抗原的制备方法，尤其涉及一种利用衣藻叶绿体制备狂犬病毒抗原的方法，属于狂犬病毒抗原的制备领域。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus，RV)侵犯中枢神经系统引起的人兽共患致死性脑脊髓炎，一旦发病，死亡率几乎为100％，对人类生命安全构成严重威胁。该病呈全球性分布，亚洲尤其是我国流行较为严重，对人类生命安全构成严重威胁。疫苗免疫仍是预防和控制狂犬病的最可靠的手段，因此对狗、猫和野生动物的大面积的预防免疫是控制和消灭狂犬病的根本措施。目前我国兽用的狂犬病疫苗主要有灭活苗和弱毒苗。尽管传统疫苗在狂犬病预防控制中仍占主导地位，但生产成本昂贵，免疫期短，疫苗制备过程中病毒逃逸等危险因素很难避免。因此，研究和开发免疫效果好、成本低廉的新型狂犬病疫苗已成为研究热点。

随着分子生物学、基因工程等高新技术的发展，利用植物生物反应器生产动物疫苗是廉价高效疫苗的可靠来源之一，受到了科学家的普遍关注，特别是植物叶绿体表达系统由于具有外源基因表达量高、环境安全性好等优点，已成为目前植物生物反应器的研究热点。本发明就是利用衣藻叶绿体作为生物反应器来生产狂犬病疫苗。

利用衣藻叶绿体作为表达系统表达动物疫苗是九十年代建立的，并在之后的时间里不断有动物疫苗成功表达的报道。

范国昌等(1999)(衣藻叶绿体表达体系的建立，科学通报，1999，44(12)：1301-1306)构建了甲型肝炎病毒VP 3P1区和丙型肝炎病毒C区融合抗原基因的衣藻叶绿体转化载体，基因枪法转化衣藻叶绿体。该基因在衣藻叶绿体双启动5’chlL-5’atpA调控下，得到具有双价抗原活性的融合抗原蛋白表达产物。

1999年，张中林等(丙肝病毒融合抗原基因NS3-C定点整合入衣藻叶绿体基因组的研究，遗传，1999，21(6)：1-6)将丙型肝炎病毒(HCV)两段DNA片段，即HCV基因组非结构NS3区抗原基因(约0.7kb)和核心抗原C区抗原基因(约0.6kb)的cDNA片段，中间加入连接肽Ser-Pro-Gly-Ser的密码子序列，构建成融合抗原基因NS3-C，再将该表达盒与选择标记基因aadA表达盒和衣藻叶绿体基因组同源片段连接，构建成衣藻叶绿体转化载体pSS6。基因枪法转化衣藻叶绿体，经PCR和Southern杂交分析表明，融合抗原基因NS3-C已整合到衣藻叶绿体基因组中。

2003年，Sun M等(Foot-and-mouth disease virus VPl protein fusedcholera toxin B subnit expressed in Chlamydomonas reinhardtiichloroplast.Biotechnology Letters，2003，25：1087-1092)人成功的在衣藻叶绿体中进行了口蹄疫病毒(FMDV)VPl与霍乱毒素B亚基(CTB)融合基因的重组和表达。经过Western blot和ELISA免疫杂交分析表明CTBVPl融合蛋白表达量占可溶性总蛋白量的3-4％(1mg可溶性总蛋白含有30-40μg的重组蛋白)；G_M-ELISA结合分析证明衣藻叶绿体所表达的CTBVPl融合蛋白能够正确地折叠形成寡聚体，从而具有一定的生物学活性。

2008年3月Dong-Mei He等人(Reeombination and expression ofclassical swine fever virus(CSFV)structural protein E2 gene inChlamydomonas reinhardtii chroloplasts，Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2007，55：26-30)成功的在衣藻叶绿体中进行了典型的猪瘟病毒(CSFV)的结构蛋白E2的重组和表达。经过Western blot和ELISA免疫杂交分析表明，CSFV的结构蛋白E2的表达量占衣藻细胞可溶性总蛋白的2％。

迄今为止，狂犬病毒的G基因和N基因分别已经在不同的生物反应器中进行过表达，例如大肠杆菌、家蚕等。但这些生物反应器都存在各自的不足，例如利用大肠杆菌表达的蛋白免疫，由于动物体内自身存在大肠杆菌，因此可能对有益的正常的大肠杆菌产生抑制作用，另外利用家蚕表达的蛋白进行免疫，由于家蚕体内与被免疫的动物之间存在着一些同源性较高的蛋白，因此可能产生一些非目的性的免疫反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用衣藻叶绿体表达系统安全、高效的表达多种狂犬病毒抗原的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

利用有利于制备狂犬病毒抗原的方法，包括：(1)构建狂犬病毒抗原基因衣藻叶绿体表达载体；(2)将所构建的狂犬病毒抗原基因衣藻叶绿体表达载体转化衣藻，筛选得到转化有狂犬病毒抗原基因的转基因衣藻；(3)培养转基因衣藻，使狂犬病毒抗原基因在衣藻中表达，即得。

上述方法中，所述狂犬病毒抗原基因包括狂犬病病毒抗原蛋白G基因(其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示；)或狂犬病病毒抗原蛋白N基因(其核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示)；

所述的狂犬病毒抗原基因衣藻叶绿体表达载体可参考以下方法构建得到：将狂犬病毒抗原基因与衣藻叶绿体特异启动子和终止子组合成狂犬病毒抗原基因表达盒；将狂犬病毒抗原基因表达盒与衣藻叶绿体基因组中的同源片段连接，构建得到狂犬病毒抗原基因衣藻叶绿体表达载体；

所述的叶绿体特异启动子包括但不限于：atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL，优选的，所述的启动子为atpA启动子，所述的终止子优选为rbcL终止子。

所述的同源片段优选为衣藻叶绿体基因组中的下述序列：clpP-trnL-petB-chlL-rp123-rp12(其核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示)。

优选的，所述的狂犬病毒抗原基因衣藻叶绿体特异表达载体还含有选择标记基因，该选择标记基因优选为细菌来源的抗菌素抗性基因，更优选为aadA基因。

步骤(2)中所述的衣藻优选自(Chlamydomonas reinhardtii)，其品系为137cc；更优选的，所述的衣藻为处于生长对数期后期的衣藻。

步骤(2)中所述的转化方法优选为基因枪法。

本发明一个优选的整体技术方案：

将狂犬病病毒抗原蛋白G基因连入patpY载体BamHI和Hind III之间，使G基因片段置于衣藻叶绿体基因特异启动子5’atpA和终止子3’rbcL调控之下得到质粒patpY-G；再将其克隆入含有aadA表达盒和同源重组片段clpP-trnL-petB-chlL-rp123-rp12的p64D质粒EcoRV位点，构建得到狂犬病毒G衣藻叶绿体表达载体p64D-G；将p64D-G基因枪转化莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，筛选得到转化有狂犬病病毒抗原蛋白G基因的转基因衣藻，其微生物保藏号是：CGMCC No.3424，其分类命名是：莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)；保藏时间是：2009年11月9日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明另一个优选的整体技术方案：

将狂犬病病毒抗原蛋白N基因连入patpY载体BamHI和Hind III之间，使N基因片段置于衣藻叶绿体基因特异启动子5’atpA和终止子3’rbcL调控之下得到质粒patpY-N；再将其克隆入含有aadA表达盒和同源重组片段clpP-trnL-petB-chlL-rp123-rp12的p64D质粒EcoRV位点，构建得到狂犬病毒G衣藻叶绿体表达载体p64D-N；将p64D-N用基因枪法转化莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，筛选得到转化有狂犬病病毒抗原蛋白N基因的转基因衣藻，其微生物保藏号是：CGMCC No.3423，其分类命名是：莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)；保藏时间是：2009年11月9日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明采用基因同源重组技术，将来源于狂犬病病毒的不同基因(包括狂犬病毒的糖蛋白G或核蛋白N)构建到由衣藻叶绿体特异启动子atpA和终止子rbcL组合所驱动的表达盒，利用衣藻叶绿体基因组中的clpP-trnL-petB-chlL-rp123-rp12作为同源片段，发生同源重组，通过基因枪转化法导入衣藻叶绿体中，通过PCR、Western blot、ELISA等分子生物学手段检测，最终获得转基因衣藻，狂犬病毒的抗原基因在衣藻叶绿体中得到成功表达，所表达的狂犬病毒的抗原蛋白占总的可溶蛋白的2％以上；经试验证实，所表达的重组抗原蛋白具有良好的免疫效果，可以用于制备成狂犬病疫苗。

本发明方法利用衣藻叶绿体表达系统表达狂犬病毒抗原，不仅弥补了其他生物反应器的不足，而且还有其自身的优点：第一，衣藻叶绿体能够正确的折叠和组装复杂的哺乳动物的蛋白；第二，在衣藻中，从最初的转化到合成一定量的蛋白质需要的时间相当短。第三，外源基因能定点整合在衣藻叶绿体基因组上。第四，外源基因在后代中可稳定表达。第五，衣藻叶绿体基因组具有分子量小、结构简单、不结合组蛋白等特点有利于实现分子操作，生产的药用蛋白不需纯化，可直接作为动物添加饲料就可起到治疗的效果，方便安全。

本发明方法采用衣藻叶绿体表达系统在衣藻生物反应器中安全、高效的生产狂犬病毒抗原，所表达的蛋白特异性较高，具有良好的免疫效果而且不会产生非目的性的免疫反应。本发明抗原的制备方法的成本显著低于传统的制备狂犬病毒抗原方法(例如通过细胞繁殖病毒制备狂犬病毒抗原)，无需投资建厂，无三废，电力和水资源等能源消耗极少。由于衣藻是无毒的，可以食用，所以本发明方法所制备的抗原，安全性极高，可直接制作疫苗免疫动物。

总体而言，本发明方法可以大幅度降低狂犬病毒抗原的生产成本，具有安全、高效、能耗少、成本低等诸多优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验材料

1.E.coli TOP10购自Promega公司；狂犬病毒的糖蛋白和核蛋白的基因由兰州兽医研究所惠赠；野生型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtti)，137CC和paptY(patpY的构建方法见参考文献：杨宗岐等，人可溶性TRAIL蛋白在衣藻叶绿体中的表达，科学通报，2006，51(12)：1400-1405)、p64D(p64D的构建方法见参考文件：范国昌等，衣藻叶绿体表达体系的建立，科学通报，1999，44(12)：1301-1306)由中国农业科学院生物技术研究所保存；

2.酶与试剂：各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、Klenow酶及其配套缓冲液购自Promega公司；抗原检测试剂盒购自武汉生物制品研究所基因工程室

3.生化试剂：IPTG、X-Gal为Promega公司产品；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；Tris、dNTPs购自Sigma公司；蛋白胨、酵母抽提物、胰蛋白胨均购自OXOID公司；溴化乙锭(EB)购自Fluka公司；HRP标记的羊抗兔IgG抗体；TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)购自瑞典LKB BROMMA公司；SDS为BDH公司产品；β-巯基乙醇，Tris购自Sigma公司；考马斯亮兰R-250、N，N′-甲叉双丙烯酰胺购自瑞士Fluka Chemie AG公司；丙烯酰胺为Aldrich化学有限公司产品；硝酸纤维素膜Hybond-N和尼龙膜Hybond-C均为Amersham产品；

4.培养基：大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；衣藻培养基为TAP培养基；

5.试验所用的健康小白鼠购自北京生物制品研究所，为6-8周龄雌性BALB/c小白鼠。

实施例1狂犬病毒抗原G基因的获得、表达载体的构建和转化、转基因衣藻鉴定

1、狂犬病病毒抗原蛋白G基因的克隆和表达载体的构建

1.1目的基因的获得

根据已知的的狂犬病毒的G的序列，分别设计引物，并且分别引BamHI位点和XbaI位点，两对引物如下：

F G1：5′-AGGATCCAACATGGTTCCTCAGGTTCTT-3′

BamHI酶切位点

R G2：5′-ATCTAGACTACTTTCCCCAGTTCGGGAG-3′

XbaI酶切位点

在0.5mL eppendorf管中加入

                    ddH20              41μL

                    10×PCR buffer     5μL

                    10mM dNTP          1μL

                    上游引物G1/N1      0.5μL

                    下游引物G2/N2      0.5μL

                    LA Taq DNA聚合酶   1μL

                    狂犬病病毒DNA      1μL

                    总计               50μL

反应程序：

1.2产物的回收

用普通凝胶进行电泳，切下所需DNA条带，称重后放入Eppendorf管中，加入3倍体积(v/w)的6mol/L NaI溶液，37℃下使凝胶充分溶解，再加入10μL玻璃奶吸附DNA，室温下放置5min，稍离心5s，去上清，沉淀用New Wash洗液洗涤一次，重复离心、洗涤三次，晾干后用30μL 0.1×TE Buffer溶解DNA，离心后取上清，将DNA保存于20℃备用。

1.3酶切和连接反应

参照试剂盒说明书中各种酶的最适反应条件进行。反应体系一般包含质粒DNA 1～2μg，1/10体积的10×酶反应缓冲液，酶量为2-4M/μg DNA，总体积一般为15～20μL。最适温度(一般为37℃)下反应1～2h，用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切是否完全。

1.4质粒DNA或连接产物的转化

取-70℃冻存的感受态细胞，用双手搓至大部分融化后迅速置冰上。感受态细胞完全融化后加入质粒DNA20～100ng或连接混合物5μL，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90sec，迅速置冰上1～2min。加入1mL已温育至37℃的LB培养基，37℃振荡(≤150rpm)培养1h。4,000g离心5min，去部分上清后(留150～200μL)涂布于含适当抗生素的LB平板上。37℃倒置培养过夜。

1.5碱裂解法提取质粒DNA

(1)用无菌牙签从LB平板上挑取单菌落，接种于4mL含100μg/mL氨卡青霉素的LB液体培养基中，37℃，230r/min，振荡培养过夜；

(2)取1.5mL过夜培养物于Eppendorf管内，5,000rpm离心5min收集菌体，弃上清；

(3)用150μL Sol I悬浮沉淀，冰浴10min；

(4)加300μL Sol II和150μL氯仿，轻轻倒转混匀后冰浴5min；

(5)加450μL Sol III，倒转混匀后冰浴10min；

(6)12,000rpm离心10min，取上清，加0.6倍体积异丙醇，混匀后于4℃放置20min；

(7)12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于250μL TER(含20μg/mL RNaseA的1×TE)中，37℃消化20min，加入300μL PPt沉淀Buffer，混匀后置4℃ 20min；

(8)12,000rpm离心10min，弃上清，70％乙醇洗一次，真空干燥沉淀，用80μL 0.1×TE(pH8.0)溶解，-20℃保存备用。

1.6重组子的鉴定

酶切鉴定：首先小量抽提质粒DNA，然后利用BamHI和XbaI进行酶切反应，电泳后出现约1.37kb的DNA条带的质粒为重组质粒pEASY-T3-G。将重组质粒pEASY-T3-G进行双向测序。测序结果与预期结果一致。

2衣藻叶绿体表达载体的构建

质粒patpY含有衣藻叶绿体基因组特异启动子5’atpA和终止子3’rbcL及由BamHI起始的一组多克隆位点。将测序正确的阳性重组质粒pEASY-T3-G，用BamHI和HindIII双酶切，将回收的目的片段，连入patpY载体BamHI和Hind III之间，使G片段置于衣藻叶绿体基因特异启动子5’atpA和终止子3’rbcL调控之下，得到质粒patpY-G；再用EcoRV和Not I双酶切，并补平NotI位点，回收含有G编码区表达盒的2.5kbDNA片段，将其克隆入含有aadA表达盒和同源重组片段clpP-trnL-petB-chlL-rp123-rp12的p64D质粒EcoRV位点，构建成编码狂犬病毒G衣藻叶绿体表达载体p64D-G。

3基因枪转化

3.1衣藻的培养及衣藻受体细胞的准备

野生型衣藻生长在TAP液体培养基中，20～25℃，160rpm，光周期12hr/12hr，参阅Harris(Harris E.The Chlamydomonas source book，Acomprehensive guide to biology and laboratory use.San Diego：Academic Press，1989)。

取1.5mL生长至对数后期(5～6×10⁶ cells/mL)的衣藻于离心管中浓缩(5,000rpm，20℃，5min)，去上清，留200μL，涂于TAP固体平板上，3000Lux的光照条件下培养1～2天，用无菌铲子挖出均匀地长有一层衣藻的直径为2～3cm的培养基块，放入9cm无菌平皿中央，以备轰击。

3.2微粒子弹(DNA coated microprojectiles)的制备

称60mg 1.0μm的金粉(Bio-Rad)于1.5mL Eppendorf管中；加入1mL无水乙醇，充分涡旋(vortex)，然后静置10min，10,000rpm离心10sec；小心去除上清液，加入1mL无菌水，充分涡旋，10,000rpm离心10sec，弃上清液；重复用无菌水洗涤2次；用1mL无菌的50％(v/v)甘油重悬金粉颗粒。处理后的金粉可在-20℃长期保存；

取50μl上述制备好并已涡旋的金粉颗粒，转入一无菌的1.5mLeppendorf管中，按顺序加入5μL DNA(1μg/μL)、50μl 2.5mol/L CaCl₂和20μL 0.1mol/L亚精胺(Free base，现配现用)；将混合物涡旋1min，置于冰上1min；重复10次；置于冰上30min以上；15,000rpm离心5sec，去除上清液；用250μL无水乙醇洗涤包被好的金粉颗粒2次，10,000rpm离心10sec，去除上清液；60μL无水乙醇重悬金粉颗粒。

3.3装备基因枪

(1)基因枪的准备

将基因枪放置于一个较大型号的超净工作台上，打开超净台紫外灯灭菌30min以上；用70％酒精擦净基因枪真空室及各种元件；用浸泡消毒法将可裂膜(Ruptμre disk 1,100ps i)、载体膜(Macrocarrier)、阻挡网(Stoppingscreen)及Macrocarrier holders于无水乙醇中消毒15min，然后将Rupturedisk和Macrocarrier置于无菌滤纸上，在超净台中吹干；用镊子夹住Macrocarrier holder，在酒精灯火焰上稍事灼烧后置于无菌滤纸上；待Macrocarrier holder冷却后，用镊子将Macrocarrier置于其中并展平。取10μL包被DNA的金粉颗粒无水乙醇悬浮液，点于Macrocarrier中心位置，于超净工作台中吹干；打开电源开关、真空泵及氦气瓶阀门；取出Macrocarrier launch assembly，拧开盖子，将Stopping screen在酒精灯火焰上灼烧后置于凹槽内，把Macrocarrier holder倒扣于凹槽上，旋紧盖子；将Rupture disk装于固定盖中并旋紧；将组装好的Macrocarrier launchassembly置于基因枪真空室的上数第二个格子中；将装有衣藻培养基的培养皿置于Target shelf中心，并将Target shelf置于真空室的上数第四个格子中，使轰击距离为9cm；关紧真空室小门。

(2)轰击

抽真空：按VAC键，当真空度达到25～28 inches Hg时，将VAC键直接锁定在HOLD位置；轰击：按住FIRE键，直至Rupture disk爆裂；再按VENT键，使真空表指针回零。打开真空室小门，取出样品。通常每个样品轰击2次。

4转基因衣藻的筛选

4.1转化后衣藻的过度培养

轰击后的衣藻置于3000Lux的光照条件下培养8h(20～25℃)，再用1mL无菌水把琼脂块上的衣藻洗下，涂于5皿含100μg/mL壮观霉素的抗性选择培养基(TAP+Spc 100μg/mL)上培养。

4.2转化衣藻的筛选培养

将涂于抗性选择培养基上的衣藻在3000Lux的连续光照条件下培养约10天左右，挑取单藻落，于50mL液体选择培养基(TAP+Spc 100μg/mL)中培养。

4.3衣藻转化子的同质化培养

尽管衣藻细胞内只有一个叶绿体，但是叶绿体内却含有80-100个叶绿体基因组拷贝，最初转化的衣藻叶绿体内既含有转基因的基因组，也含有野生型基因组拷贝，因此它的叶绿体基因组是异质的，需要进一步的同质化筛选。

将TAP液体选择培养基(TAP+Spc 100μg/mL)中培养7天左右的转化

子，重新涂布于固体抗性选择培养基(TAP+Spc 100μg/mL)上培养，而后再挑取单藻落转到液体培养基中培养，如此重复多轮进行继代培养，以达到提高外源基因在叶绿体基因组中的同质化程度。

5转基因衣藻的检测

5.1衣藻DNA的提取

(1)取10mL处于对数生长后期的衣藻培养液，5,000rpm，4℃离心5min；

(2)衣藻细胞沉淀用350μL NET溶液(0.1mol/L NaCl，50mM EDTA，20mM Tris-HCl，pH 8.0)悬浮后，加入25μL Proteinase K(10mg/mL)，25μL 20％SDS，混匀，55℃水浴2h。

(3)置于冰上冷却，加入200μL 5M乙酸钾(KAc)，冰上静置30min。

(4)12,000rpm，4℃离心5min，上清液加入等体积的酚/氯仿(1∶1)抽提两次，再用等体积的氯仿抽提一次。水相加入2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置20min。

(5)12,000rpm，4℃离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤，真空干燥后溶于30μL超纯水中。

5.2转基因衣藻PCR检测

(1)衣藻转化子G编码区DNA的PCR检测

PCR体系：

                 ddH₂O             15μL

                 10×PCR buffer    2μL

                 10mM dNTP         0.5μL

                 上游引物          0.5μL

                 下游引物          0.5μL

                 TaqDNA聚合酶      0.5μL

                 衣藻总DNA         1μL

                 Total             20μL

反应程序为：

取4μL PCR产物上样于1％琼脂糖凝胶上电泳，在衣藻转化子中分别扩增获得与预期大小完全一致的片段，而在野生型衣藻中则没有相应的条带出现。

(2)叶绿体转基因衣藻同质化程度的PCR检测

P5：GGTTTGCCGAACAATGTTTTTATTCCTG

P6：AGAGGAAAGTATTTAAAGCTGCTTATTC

以转基因衣藻DNA为模板，用LA Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。

PCR体系：

                  ddH₂O            11.5μL

                  10×PCRbuffer    2μL

                  10mM dNTP        4μL

                  上游引物(P5)     0.5μL

                  下游引物(P6)     0.5μL

                  LATaqDNA聚合酶   0.5μL

                  衣藻总DNA        1μL

                  Total            20μL

反应程序为：

扩增结果，经过10轮抗性加压筛选后的获得转G基因的衣藻叶绿体转化子，只扩增出了一条4.37kb的条带，大小与预期结果相符，说明狂犬病毒的G基因连同aadA基因定点插入到衣藻叶绿体基因组中，并达到完全同质化。

5.3衣藻总蛋白的提取

(1)将生长期为对数后期的10mL衣藻培养液，离心收集；

(2)沉淀用200μL裂解液(2％SDS，50mM Tris-C1 pH 7.5，5％ β-巯基乙醇)重悬后煮沸5min；

(3)12000rpm，离心5min，上清加入三氯乙酸至终浓度为10％，混匀；

(4)12000rpm，离心10min，沉淀用90％丙酮洗涤，将大部分叶绿素抽提掉；

(5)待丙酮挥发掉后，沉淀重悬于加样缓冲液，以备蛋白分析。5.4 Western blot检测

(1)取总蛋白进行电泳；

(2)剪下所需大小的NC膜，然后将膜转入转移缓冲液中至少5min；同时也将凝胶浸入转移缓冲液中；

(3)在电转仪上依次铺上滤纸、NC膜、凝胶、滤纸，用玻璃棒赶去气泡，以1.5mA/Gm²凝胶面积的恒定电流转印1.5h；

(4)取出转印好的膜，放入PBS中轻轻摇动洗膜10min；

(5)倾去PBS，加封闭液室温轻摇1h；

(6)将膜浸入含第一抗体(1∶1500)的封闭液中，4℃轻摇过夜；

(7)将膜放入洗涤液中轻轻摇动洗膜3次，每次10min；

(8)将膜转入含HRP标记的羊抗兔二抗(1∶1000)的PBS中，室温轻摇1h；

(9)将膜放入洗涤液中轻轻摇动洗膜3次，每次10min；

(10)将膜转入PBS中，轻摇洗膜2次，每次5min；

(11)将膜转入新配的DAB显色液中，室温下暗处显色5-10min，待有明显的显色条带时，用去离子水漂洗终止反应。

结果在52kDa位置处都出现特异杂交信号条带，而未转基因的野生型衣藻则没有出现可见的信号条带。这说明狂犬病病毒抗原G蛋白在三株衣藻转化子的叶绿体中得到了表达，并分别具有抗原性。

5.5ELISA检测

(1)样品蛋白的提取：取10mL衣藻10,000rpm离心5min，吸取上清；同时野生性衣藻提取物分别作为阴性对照；

(2)取100μL加入至96孔酶标板中(同时作1个平行对照)，4℃冰箱包被过夜；

(3)第二天用洗涤液快速洗板5-6次。加入封闭缓冲液100μL，在一个湿度大的盒子中，室温下保温1h；

(4)用洗涤液洗板3次，加入第一抗体100μL(1∶1000稀释)，室温反应2h；

(5)用洗涤液快速洗板5-6次。加入HRP标记的羊抗兔二抗(二抗稀释500倍)，室温下反应2h；

(6)用洗涤液快速洗板5-6次，加入底物显色溶液100μL。室温下闭光反应3-15min。

经过试验检测，在衣藻叶绿体中所表达的重组狂犬病毒G蛋白占总的可溶蛋白的2％以上。

5.6动物免疫试验

(1)小白鼠免疫分组：将上述重组的表达了G蛋白的衣藻经超声波破碎，离心去细胞碎片，浓缩后制备为抗原，将收集纯化的无菌抗原与等体积油佐剂混合试制成注射疫苗；将初步纯化的狂犬病毒G抗原用等体积的浓度为31％脂肪酸(该脂肪酸由以下体积百分比的各组分组成：棕榈酸7.5％、油酸20.0％、3.5％硬脂酸、余量为水)混合，经超声波乳化后制备成口服疫苗，经口灌注，在小白鼠上进行动物试验。0.5mL/只经肌肉或口服途径各免疫小白鼠。将48只BALB/c小白鼠随机分成4组，即G抗原口服组、G疫苗肌肉注射组、G抗原肌肉注射组和阴性对照组，每组12只小白鼠。

(2)免疫反应观察：于免疫注射后24h、48h和72h内，分别观察记录小白鼠免疫反应症状。

(3)小白鼠抗体测定：对第一次免疫后1周的小白鼠和第二次免疫后第二周、第三周、第四周的小白鼠每组随机取3只剪尾采血，分离血清，混合后用宁波天润生物药业有限公司生产的动物狂犬病病毒IgG抗体测定试剂盒测定抗体。

通过抗原口服途径免疫的小白鼠，在免疫后24h、48h和72h进行临床反应观察，每组均未见小白鼠出现精神沉郁、呼吸急促、采食减退以及死亡等现象。在试验的整个过程中，小白鼠均健康存活，表现与对照组一样。

将G抗原口服、G疫苗肌肉注射、G抗原肌肉注射1免第1周、2免第2周、2免第三周、2免第四周采血所分离的血清用狂犬病液相阻断ELISA检测试剂盒检测抗体水平，分析抗体消长规律。结果显示，用3种不同的方式进行免疫，在免疫后第7天未产生抗狂犬病毒G抗原的IgG抗体，在2免后第二周，G疫苗肌肉注射和G抗原肌肉注射均产生了较高的抗狂犬病毒G抗原的IgG抗体，其OD值分别达到0.56和0.61，超过了0.5IU/ml，表明所产生的抗体能抵抗狂犬病毒的攻击。而G抗原口服组未能产生抗狂犬病毒G抗原的IgG抗体，由于抗原通过口服免疫，主要刺激粘膜免疫反应，因此其诱导产生的主要是IgA抗体，经检测其IgA抗体的OD值可达0.29，较1免后1周的IgA抗体有较大的提升。在2免后第3周和第4周，G疫苗肌肉注射和G抗原肌肉注射的抗体水平略有下降，但仍然维持在较高水平；而G抗原口服组的I gA抗体仍然保持在2免后第2周的水平。

注：阴性对照为样品稀释液，阳性对照为试剂盒中提供的狂犬病阳性血清，其效价达0.5IU/ml。

综上所述，利用衣藻叶绿体表达的狂犬病毒G抗原无转基因生物安全隐患，同时，用该抗原制备的疫苗具有良好的免疫效果，可以应用于免疫后的抗体检测、注射和口服疫苗。

实施例2狂犬病毒抗原N基因的获得、表达载体的构建和转化、转基因衣藻鉴定

1、狂犬病病毒抗原蛋白N基因的克隆和表达载体的构建

1.1目的基因的获得

根据已知的的狂犬病毒的N的序列，分别设计引物，并且分别引BamHI位点和XbaI位点，两对引物如下：

F N1：5′-AGGATCCATGGATGCCGACAAGAT-3′

          BamHI酶切位点

R N2：5′-ATCTAGATTTATGAGTCATTCGAATACGT-3′

         XbaI酶切位点

在0.5mL eppendorf管中加入

                 ddH2O                41μL

                 10×PCRbuffer        5μL

                 10mM dNTP            1μL

                 上游引物Gl/N1        0.5μL

                 下游引物G2/N2        0.5μL

                  LA Taq DNA聚合酶    1μL

                  狂犬病病毒DNA       1μL

                  总计                50μL

反应程序：

经过PCR产物的回收，连接，转化，碱裂解法提取质粒DNA，然后利用BamHI和XbaI进行酶切反应，电泳后出现约1.37kb的DNA条带的质粒为重组质粒pEASY-T3-G。将重组质粒pEASY-T3-G进行双向测序。测序结果与预期结果一致。

2衣藻叶绿体表达载体的构建

质粒patpY含有衣藻叶绿体基因组特异启动子5’atpA和终止子3’rbcL及由BamHI起始的一组多克隆位点。将测序正确的阳性重组质粒pEASY-T3-N，用BamHI和Hind III双酶切，将回收的目的片段，连入patpY载体BamHI和HindIII之间，使N片段置于衣藻叶绿体基因特异启动子5’atpA和终止子3’rbcL调控之下，得到质粒patpY-N；再用EcoRV和Not I双酶切，并补平NotI位点，回收含有N编码区表达盒的2.35kbDNA片段，将其克隆入含有aadA表达盒和同源重组片段clpP-trnL-petB-chlL-rp123-rp12的p64D质粒EcoRV位点，构建成编码狂犬病毒N衣藻叶绿体表达载体p64D-N。

3基因枪转化

4转基因衣藻的筛选

5转基因衣藻的检测

5.1衣藻DNA的提取

5.2转基因衣藻PCR检测

(1)衣藻转化子N编码区DNA的PCR检测

PCR体系：

              ddH₂O             15μL

              10×PCR buffer    2μL

              10mM dNTP         0.5μL

              上游引物          0.5μL

              下游引物          0.5μL

              TaqDNA聚合酶      0.5μL

              衣藻总DNA         1μL

              总计              20μL

反应程序为：

取4μL PCR产物上样于1％琼脂糖凝胶上电泳，在衣藻转化子中分别扩增获得与预期大小完全一致的片段，而在野生型衣藻中则没有相应的条带出现

(2)叶绿体转基因衣藻同质化程度的PCR检测

P5：GGTTTGCCGAACAATGTTTTTATTCCTG

P6：AGAGGAAAGTATTTAAAGCTGCTTATTC

以转基因衣藻DNA为模板，用LA Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。

PCR体系：

                 ddH₂O            11.5μL

                 10×PCR buffer   2μL

                10mM dNTP        4μL

                上游引物(P5)     0.5μL

                下游引物(P6)     0.5μL

                LATaqDNA聚合酶   0.5μL

                衣藻总DNA        1μL

                总计             20μL

反应程序为：

扩增结果，经过10轮抗性加压筛选后的获得转N基因的衣藻叶绿体转化子，只扩增出了一条4.35kb的条带，大小与预期结果相符，说明狂犬病毒的N基因连同aadA基因已定点插入到衣藻叶绿体基因组中，并达到完全同质化。

5.3衣藻总蛋白的提取

5.4 Western blot检测

结果在52kDa位置处都出现特异杂交信号条带，而未转基因的野生型衣藻则没有出现可见的信号条带。这说明蛋白在三株衣藻转化子的叶绿体中得到了表达，并分别具有抗原性。

5.5 ELISA检测

经过试验检测，狂犬病毒的N蛋白占总的可溶蛋白的1.8％左右。

5.6动物免疫试验

(1)小白鼠免疫分组：将上述重组的表达了N蛋白的衣藻经超声波破碎，离心去细胞碎片，浓缩后制备为抗原，将收集纯化的无菌抗原与等体积油佐剂混合试制注射疫苗；将初步纯化的狂犬病毒N抗原用等体积的浓度为31％脂肪酸(该脂肪酸由以下体积百分比的各组分组成：棕榈酸7.5％、油酸20.0％、3.5％硬脂酸、余量为水)混合，经超声波乳化后制备成口服疫苗，经口灌注，在小白鼠上进行动物试验。0.5mL/只经肌肉或口服途径各免疫小白鼠。将60只BALB/c小白鼠随机分成4组，即N抗原口服组、N疫苗肌肉注射组、N抗原肌肉注射组和阴性对照组，每组15只小白鼠。

(2)免疫反应观察

(3)小白鼠抗体测定

通过抗原口服途径免疫的小白鼠，在免疫后24h、48h和72h进行临床反应观察，每组均未见小白鼠出现精神沉郁、呼吸急促、采食减退以及死亡等现象。在试验的整个过程中，小白鼠均健康存活，而对照组全部发病。

将N抗原口服、N疫苗肌肉注射、N抗原肌肉注射1免第1周、2免第2周、2免第三周、2免第四周采血所分离的血清用宁波天润生物药业有限公司生产的动物狂犬病病毒IgG抗体测定试剂盒检测抗体水平，分析抗体消长规律。结果显示，用3种不同的方式进行免疫，在免疫后第7天未产生抗狂犬病毒N抗原的IgG抗体。N疫苗肌肉注射组，在2免后第二周的抗体水平有所上升，其OD值可达0.346，在2免后第3周和第4周，抗体基本维持在同一水平，其OD值在0.30左右。而N抗原注射组在2免后第2周、第3周、第4周时，抗体水平仍然很低，其OD值基本0.24左右。N抗原口服组在2免后的第2周，产生的I gA抗体达到0.27，在之后的2周，IgA抗体基本维持在0.2左右。(注：阴性对照为样品稀释液，阳性对照为试剂盒中提供的狂犬病阳性血清，其效价达0.5IU/ml。)

综上所述，利用衣藻叶绿体表达的狂犬病毒N抗原无转基因生物安全隐患，同时，用该抗原制备的疫苗具有良好的免疫效果，可以应用于免疫后的抗体检测、注射和口服疫苗。

KLPI090967_2

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>利用叶绿体制备狂犬病毒抗原的方法

<130>00890

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1377

<212>DNA

<213>Rabies Virus

<400>1

atggttcctc aggttctttt gtttgtactc cttctgggtt tttcgttgtg tttcgggaag  60

ttccccattt acacgatacc agacgaactt ggtccctgga gccctattga catacaccat  120

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<210>2

<211>1353

<212>DNA

<213>Rabies Virus

<400>2

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<210>3

<211>4312

<212>DNA

<213>Chlamydomonas reinhardtii

<400>3

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Claims (10)

1.利用叶绿体制备狂犬病毒抗原的方法，包括(1)构建狂犬病毒抗原基因衣藻叶绿体表达载体；(2)将所构建的狂犬病毒抗原基因衣藻叶绿体表达载体转化衣藻，筛选得到转化有狂犬病毒抗原基因的转基因衣藻；(3)培养转基因衣藻，使狂犬病毒抗原基因在衣藻中表达，即得。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述狂犬病毒抗原基因包括狂犬病病毒抗原蛋白G基因或狂犬病病毒抗原蛋白N基因。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的狂犬病毒抗原基因衣藻叶绿体表达载体主要按照以下方法构建得到：将狂犬病毒抗原基因与衣藻叶绿体特异启动子和终止子组合成狂犬病毒抗原基因表达盒；将狂犬病毒抗原基因表达盒与衣藻叶绿体基因组中的同源片段进行连接，构建得到狂犬病毒抗原基因衣藻叶绿体特异表达载体。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的叶绿体特异启动子包括但不限于：atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL；所述的终止子为rbcL终止子。

5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的同源片段为SEQ IDNo：3所示。

6.按照权利要求1、3、4或5所述的方法，其特征在于：所述的狂犬病毒抗原基因衣藻叶绿体表达载体还含有选择标记基因；所述的选择标记基因优选为细菌来源的抗菌素抗性基因，更优选为aadA基因。

7.权利要求1-5任何一项方法所制备得到的狂犬病毒抗原。

8.权利要求7所述的狂犬病毒抗原在制备预防或检测狂犬病中的用途。

9.一种转化有狂犬病毒抗原N基因的转基因衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)，其微生物保藏号是：CGMCC No.3423。

10.一种转化有狂犬病毒抗原G基因的转基因衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)，其微生物保藏号是：CGMCC No.3424。