CN101172157A - 副溶血弧菌外膜蛋白ompK亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

副溶血弧菌外膜蛋白ompK亚单位疫苗及其制备方法 Download PDF

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CN101172157A CNA2007100713672A CN200710071367A CN101172157A CN 101172157 A CN101172157 A CN 101172157A CN A2007100713672 A CNA2007100713672 A CN A2007100713672A CN 200710071367 A CN200710071367 A CN 200710071367A CN 101172157 A CN101172157 A CN 101172157A
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于涟
毛芝娟
由振强
张祟文
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Abstract

本发明公开了一种副溶血弧菌外膜蛋白ompK亚单位疫苗及其制备方法。疫苗为转化了重组原核表达质粒pET30a－ompK的大肠杆菌经诱导表达的重组蛋白ompK经纯化后的PBS溶液，其浓度为0.25－0.5mg/ml。方法的步骤为：1)副溶血弧菌全基因组的抽提、外膜蛋白ompK DNA全长和成熟肽编码序列的克隆；2)包含ompK成熟肽编码序列的原核表达质粒的构建；3)重组ompK蛋白的获得方式；4)重组ompK蛋白对大黄鱼的免疫途径和免疫效果的检测。本发明提供了一种副溶血弧菌ompK蛋白亚单位疫苗的制备方法，同时提供了ompK蛋白免疫大黄鱼后免疫效果的检测方法，该方法制备简单、使用方便。

Description

副溶血弧菌外膜蛋白ompK亚单位疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种副溶血弧菌外膜蛋白ompK亚单位疫苗及其制备方法。
背景技术
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)最初引起人们的重视是因为该菌是一种重要的人类肠道病原，常由食入未经烹煮的海产品而导致感染，出现呕吐、腹泻等症状。近年来，国内养殖的多种海水经济动物受到该菌的危害，包括大黄鱼、牙鲆、对虾、蟹类和养殖贝类等，导致严重的损失。目前普遍认为该菌为海水环境中的常在菌，是养殖动物的条件性病原。早期的研究中已经观察到了该菌主要外膜蛋白的免疫原性，但因为人类可以通过避免吃入不洁的水产品有效地预防该菌的传染，因此，与霍乱弧菌不同，并未开展针对该菌的免疫预防研究。近几年，国内对水产动物的弧菌病原及弧菌病的免疫预防研究已成为一个热点，部分学者对该菌外膜蛋白的组成及免疫反应性开展了初步研究，测试了对该菌脂多糖及全菌疫苗的免疫保护性，但有关该菌保护性抗原方面的系统研究尚未开展，该菌外膜蛋白对鱼类的免疫原性也尚未明确。
在1995年的时候，Inoue等研究者在弧菌中发现一种分子量约28kDa的外膜蛋白，该蛋白自然突变缺失的副溶血弧菌菌株对噬菌体KVP-40变得不敏感，从而确认该蛋白为此噬菌体的受体蛋白，所以命名为ompK。该蛋白在弧菌中广泛存在，针对该蛋白的免疫血清可以识别来源于多种弧菌的分子量相近的蛋白条带，而与对噬菌体KVP-40是否敏感并无关系。Inoue等在1995年已克隆到副溶血弧菌ompK的基因，其ORF全长792bp，编码的蛋白分子量约为28kDa，序列分析表明该蛋白是弧菌种类中独有的一种外膜蛋白。在肠杆菌科种类中，与ompK最接近的蛋白为Tsx孔蛋白，为核苷酸转运蛋白，也可能作为肠杆菌素或部分噬菌体的受体蛋白。本实验室对哈维氏弧菌(V.harveyi)的ompK已开展了部分研究，该蛋白的基因序列与副溶血弧菌同源蛋白高度相似，为一种热修饰性的孔蛋白，可能在物质运输方面具有重要的生物功能；已验证了该蛋白在大黄鱼中具有良好的免疫原性。
弧菌病是危害养殖海水鱼类的重要感染性疾病，尤其在高温季节，由副溶血弧菌导致的弧菌病常造成严重的死亡。养殖生产上，目前由于对出口水产品中抗生素残留的严格检测及农业部渔业司对多数抗生素类药物的禁用规定，老百姓基本无药可用，发病了往往只好听之任之，损失惨重。以主动免疫的方法针对性地预防疾病的发生，为海水养殖业受弧菌病严重侵害的窘境提供了一条解决措施，已成为目前迫切需要解决的难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种副溶血弧菌外膜蛋白ompK亚单位疫苗及其制备方法。
副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗为转化了重组原核表达质粒pET30a-ompK的大肠杆菌表达的重组蛋白ompK经纯化后的PBS溶液，其浓度为0.25-0.5mg/ml。
所述的原核表达质粒pET30a-ompK为以pET30a作为原核表达载体，含有以下编码序列的ompK基因的重组载体，该重组载体的保存号为CGMCC No.2153；
GCAGATTACTCTGACGGCGATATCCACAAAAACGATTACA   40
AGTGGATGCAATTTAACCTAATGGGTGCATTCAACGAGAA   80
AGGTTATGCTGAATCTTCTCATGATTACCTAGAGATGGAA  120
TTCGGCGGTCGCTCTGGTATTTTCGATCTTTACGGTTACG  160
TTGACGTATTCAACCTAGCTTCTGACCCAGGCAGCGACAA  200
AGCTGGCGGCGAGAAAATCTTCATGAAATTCGCACCACGT  240
ATGTCTCTAGACGCGCTAACTGGTAAAGACCTATCTTTCG  280
GTCCTGTTCAAGAGCTATACGTTTCTACTCTAATGGAGTG  320
GGGCGGTAACTCTGACGTTAACTCTCAAAAAATCGGTCTA  360
GGTTCTGACGTGATGGTACCTTGGTTAGGCAAAATCGGCC  400
TAAACCTATACGGTACTTACGATGGCAACAAGAAAGATTG  440
GAACGGTTTCCAAGTTTCTACTAACTGGTTCAAACCATTC  480
TTCTTCTTCGAGAACGGTTCATTCATTTCTTACCAAGGTT  520
ACATCGATTACCAATTCGGTATGGATGACGACAAAGGTAA  560
CAAGTTCAACACTACAGCGTCTAACGGCGGTGCAATGTTC  600
AACGGTATCTACTGGCACTCTGACCGCTTTGCAGTTGGTT  640
ACGGTCTAAAACTTTACAAAGACGTGTACGGTTTCAAAGA  680
CGGCGAAGCTCTACCATGGGGTCACAAACCAGAATCTTCT  720
GGTGCAGGTCACTACATCGCAGTAACTTACAAGTTCTAA   759
长度为759个核苷酸，类型为核苷酸，拓扑结构为线型，链性为单链，全长为ompK蛋白成熟肽编码区。
所述的以pET30a作为原核表达载体，含有权利要求1所述的原核表达质粒pET30a-ompK的水溶液浓度为1-20μg/μl。
所述的原核表达质粒pET30a-ompK在大肠杆菌中表达的副溶血弧菌ompK外膜蛋白，重组ompK外膜蛋白所占重量比为0.25-0.5‰。
副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗的制备方法包括如下步骤：
1)首先提取副溶血弧菌基因组DNA，设计引物P1即5’-GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3’和P2即5’-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3’，PCR扩增ompK全基因，然后将ompK全基因序列接连接于pGEM-T easyVector；
2)重新设计引物P3(5’-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3’)和P4(5’-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3’)，PCR扩增ompK成熟肽编码序列DNA，将ompK成熟肽编码序列克隆入pET30a，构建成pET30a-ompK原核表达质粒；
3)重组质粒pET30a-ompK转化大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达目标蛋白。表达蛋白经尿素法初步纯化后再经镍柱亲和层析法进一步纯化得到重组蛋白。
所述的首先提取副溶血弧菌基因组DNA，设计引物P1即5’-GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3’和P2即5’-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3’，PCR扩增ompK全基因，然后将ompK全基因序列接连接于pGEM-T easyVector：(1)取超低温冻存的副溶血弧菌甘油菌一支，室温融化后接种于Zobell2216E培养基，28℃振荡培养12 h以上；取1.5mL菌液于Ependoff离心管中，5000r/min，离心1min，弃上清；灭菌ddH2O悬浮细菌，6000r/min，离心4min，洗涤两次；加入35μL ddH2O和35μL TZ溶液，-20℃放置30-40min；沸水浴10min；冰浴10min；5000r/min，离心5min，收集上清作为PCR模板；(2)设计引物P1即5’-GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3’和P2即5’-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3’，PCR扩增ompK全基因条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52.7℃退火30s，72℃延伸60s，72℃延伸10min，共30个循环。扩增出大约950bp的特异性片段，PCR产物回收后，直接克隆于pGEM-Teasy Vector，将重组质粒命名为T-ompK。
所述的：重新设计引物P3即5’-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3’，P4即5’-CCCAAGCTTITAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3’，PCR扩增ompK成熟肽编码序列DNA，将ompK成熟肽编码序列克隆入pET30a，构建成pET30a-ompK原核表达质粒：(1)以在线软件SingalP预测ompK蛋白的信号肽切割位点为N端第20个和第21个氨基酸残基之间，则成熟肽编码序列为自起始密码子后第61个核苷酸序列开始至终止密码子，在此两端重新设计引物
P3即5’-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3’
P4即5’CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3’
引物两端分别引入酶切位点BamHI和HindIII，以T-ompK为模版，P3和P4为引物，按以下PCR循环程序扩增ompK成熟肽编码序列DNA：94℃预变性5min，94℃变性30s，51.9℃退火30s，72℃延伸60s，72℃延伸10min，共30个循环；(2)低熔点胶回收ompK成熟肽编码基因，BamHI和HindIII双酶切后，直接克隆入pET30a的BamHI和HindIII多克隆位点处，构建成pET30a-ompK原核表达质粒。
所述的重组质粒pET30a-ompK转化大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达。表达蛋白经初步纯化后再经镍柱亲和层析法进一步纯化得到重组蛋白：(1)重组质粒pET30a-ompK转化CaCl2法制备的大肠杆菌BL21，经鉴定的阳性克隆pET30a-ompK在含有50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD值达0.5-0.6，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃诱导表达3-4小时，离心收集菌细胞，部分在冰浴条件下超声波裂解菌体，功率300W，直至溶液变为半透明菌，1500×g离心30min，收集上清液和沉淀，蛋白以不溶的包涵体形式存在；(2)包涵体的纯化以尿素法进行，经初步纯化的包涵体再经镍柱亲和层析法进一步纯化得到重组蛋白。
所述的经初步纯化的包涵体再经镍柱亲和层析法进一步纯化得到重组蛋白为：收集经IPTG诱导的培养物，用适量PBS重悬沉淀，冰浴条件下超声波裂解细菌，功率300W，直至溶液变为半透明，1500×g离心30min，收集包涵体沉淀，将包涵体沉淀用缓冲液I、II、III分别超声洗涤一次，缓冲液I：50Mm Tris-HCl，pH8.0；2mM EDTA，100mM NaCl，0.5％Triton X-100(V/V)，4M尿素；缓冲液II：50Mm Tris-HCl，pH8.0；2mM EDTA，100mM NaCl，3％Triton X-100(V/V)；缓冲液III：100Mm Tris-HCl，pH8.0；100mM巯基乙醇，2mM EDTA及脱氧胆酸钠，1500×g离心30min，收集包涵体沉淀，然后用含高浓度尿素的缓冲液III悬浮沉淀，室温放置30min，1500×g离心30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，以pH7.4的PBS低温透析48h，中途勤换透析液，因重组蛋白N端存在6个连续的组氨酸His序列，用镍螯合的琼脂糖柱Ni-IDA进行亲合纯化，首先将初步纯化的包涵体蛋白溶液以0.45μm孔径的滤器过滤，加到平衡好的Ni-IDA上，以含50mM PB，200mM NaCl，pH7.8的缓冲液A洗3-5个柱体积；然后以含有50mM PB，200mM NaCl，10-400mM咪唑，pH7.8的缓冲液B各洗3个柱体积，释放重组蛋白，重组蛋白的纯化率通过SDS-PAGE测定，包涵体蛋白上样到镍柱后，挂柱率较高，PBS和低浓度的咪唑洗脱液中仅有少量目的蛋白洗出；在咪唑浓度300mmol/L以上时从柱上洗脱下来，浓缩后得到单一的蛋白，纯化率在95％以上。
本发明提供的副溶血弧菌外膜蛋白ompK亚单位疫苗作为鱼类弧菌病疫苗的优势表现在：(1)原核表达系统生产的重组ompK蛋白，不仅保留了天然蛋白的免疫原性，而且制备成本相对低廉；(2)ompK蛋白在不同血清型的同种菌株及不同弧菌种类中较为保守，能够抵抗多种血清型副溶血弧菌及多种弧菌致病菌的侵袭，达到使用一种疫苗抵抗多种病原的目的；(3)重组ompK蛋白组成单一，作为疫苗使用不存在对鱼类具有毒副作用的成份，使用过程安全简单。
附图说明
图1是本发明使用PCR扩增出包含819bp的副溶血弧菌zj2003株ompK全基因的条带图；
图2是本发明提供的副溶血弧菌zj2003株ompK pGEM-T载体重组质粒T-ompK的酶切鉴定图；
图3是本发明提供的副溶血弧菌zj2003株ompK pGEM-T载体重组质粒T-ompK的构建图；
图4是本发明提供的副溶血弧菌zj2003株ompK全基因的核苷酸序列；
图5是本发明使用PCR扩增出759bp的副溶血弧菌zj2003株ompK蛋白成熟肽编码序列的条带图；
图6是本发明提供的副溶血弧菌zj2003株ompK重组质粒pET30a-ompK的酶切鉴定图；
图7是本发明提供的副溶血弧菌zj2003株ompK重组质粒pET30a-ompK的构建图；
图8是本发明提供的的副溶血弧菌zj2003株ompK表达产物的SDS-PAGE检测图；
图9是本发明提供的的副溶血弧菌zj2003株ompK包涵体重组蛋白经镍柱纯化过程产物的SDS-PAGE检测图；
图10是本发明采用ELISA法对重组ompK蛋白免疫后大黄鱼的血清抗体水平检测图；
图11是本发明提供的的重组ompK蛋白免疫4周后采用4株不同来源的副溶血弧菌攻击对大黄鱼的免疫保护率数据图。
具体实施方式
本发明所要解决的技术问题是提供一种副溶血弧菌亚单位疫苗的制备方法，其成本经济，便于推广应用。为此，本发明采用以下方案：它为以下重组蛋白(副溶血弧菌ompK)的水溶液，其浓度为250-500μg/ml，由一含原核表达质粒(pET30a-ompK)的大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)菌株表达获得。
该原核表达质粒为以pET30a作为表达载体，含有以图1的副溶血弧菌zj2003株ompK成熟肽编码序列的重组载体，该重组载体的保存号为CGMCC No.2153，保存日期为2007年9月4日，该序列全长759个核苷酸，类型为核苷酸，拓扑结构为线型，链性为单链，全长为去除信号肽后的成熟肽编码区。
虽然副溶血弧菌ompK的基因早在1995年已被克隆到，但对该蛋白生物功能和免疫原性的研究比较滞后。本发明对副溶血弧菌zj2003株ompK基因的分子生物学进行了研究，克隆出zj2003株ompK基因、构建了该基因的原核表达质粒，在此基础上，大量表达和纯化重组蛋白，进一步对其在大黄鱼中的免疫原性进行了较深入的研究，不仅有助于了解该蛋白的生物学功能，而且对亚单位疫苗、复合疫苗等鱼用新型疫苗的研制等都具有十分重要的理论和应用价值。
本发明中原核表达质粒以pET30a作为表达载体，表达的重组蛋白N端携带6个His标签，在重组标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点(凝血酶和肠激酶)，可以在纯化后选择性去除重组标签，便于下游纯化；带有由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶驱动的T7早期启动子系统，插入基因的表达效率很高，经IPTG诱导后数小时内重组蛋白的表达量可达总蛋白含量的50％以上。
本发明提供的副溶血弧菌外膜蛋白ompK亚单位疫苗可应用于预防包括副溶血弧菌引起的鱼类弧菌病，也有可能预防溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈维氏弧菌等数种同源性较高的致病弧菌引起的鱼类弧菌病。
本发明提供的原核表达质粒(pET30a-ompK)保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2153。
实施例1
本实施例描述了本发明提供的副溶血弧菌zj2003株ompK基因的获得方法，包括以下步骤：
(1)副溶血弧菌基因组DNA的制备
取超低温冻存的副溶血弧菌甘油菌一支，室温融化后接种于Zobell 2216E培养基，28℃振荡培养12h以上；取1.5mL菌液于Ependoff离心管中，5000r/min，离心1min，弃上清；灭菌ddH2O悬浮细菌，6000r/min，离心4min，洗涤两次；加入35μLddH2O和35μL TZ溶液，-20℃放置30-40min；沸水浴10min；冰浴10min；5000r/min，离心5min，收集上清作为PCR模板。TZ溶液的配方：4％Triton X-100，5.0g/L NaN3，25mmol/L Tris-HCl，pH8.0。
(2)PCR扩增ompK全基因：已发表的副溶血弧菌标准菌株RIMD2210633基因组中ompK读码框(ORF)两侧序列设计一对引物：
P1(5’-GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3’)
P2(5’-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3’)
引物由上海英骏生物技术公司合成。经优化的循环条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52.7℃退火30s，72℃延伸60s，72℃延伸10min，共30个循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结果表明：副溶血弧菌zj2003株基因组DNA经PCR后，即可扩增出大约950bp的特异性片段(见附图1，附图1中1表示阴性对照，2，3表示950bp大小的包含ompK全基因的条带；M表示DNAMarker DL2000)，PCR产物回收后，直接克隆于pGEM-T easy Vector(可购自Promega公司)，将重组质粒命名为T-ompK(见附图2，附图2中1表示Not I单酶切重组质粒T-ompK结果，2表示空载体酶切对照，M表示DNA Marker)。用Not I分别进行单酶切，可见大小分别为3.0kb和950bp左右的条带(见附图2)。
(3)OmpK全基因序列的亚克隆和序列获得
低熔点胶回收目的片段，利用T-A克隆策略直接连接于pGEM-T easyVector(见附图3)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，培养于含有Amp、IPTG和X-gal(均可购自Gibco公司)的LB平板，挑取白色菌落进行PCR鉴定和酶切鉴定。序列鉴定由上海英骏生物技术公司进行。
序列测定结果表明：克隆的ompK基因开放阅读框ORF全长共819个核苷酸，编码273个氨基酸，其氨基酸序列如附图4所示。
实施例2
本实施例描述了ompK成熟肽编码序列原核表达质粒pET30a-ompK的获得方法，其步骤包括：
(1)OmpK成熟肽编码序列的扩增
以在线软件SingalP预测ompK蛋白的信号肽切割位点为N端第20个和第21个氨基酸残基之间，则成熟肽编码序列为自起始密码子后第61个核苷酸序列开始至终止密码子，在此两端重新设计引物(全长共759bp，编码253个氨基酸)
P3(5’-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3’)
P4(5’-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3’)
引物两端分别引入酶切位点BamHI(P3划线处)和HindIII(P4划线处)，引物在上海英骏生物技术公司合成。以T-ompK为模版，P3和P4为引物，按以下PCR循环程序扩增ompK成熟肽编码序列DNA：94℃预变性5min，94℃变性30s，51.9℃退火30s，72℃延伸60s，72℃延伸10min，共30个循环。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(2)OmpK成熟肽编码序列原核表达质粒pET30a-ompK的构建
低熔点胶回收759bp的ompK成熟肽编码基因，BamH I和HindIII双酶切后，直接克隆入pET30a的BamHI和HindIII多克隆位点处。
结果表明：将包括759bp的ompK成熟肽编码基因(见附图5，附图5中1表示阴性对照、2表示759bp的目的条带，3表示DNA Marker)克隆入pET30a，构建成pET30a-ompK原核表达质粒(见附图7)，BamHI和HindIII双酶切能切出5.4kb和760bp左右的条带，PCR能扩增出约760bp的条带(见附图6，附图6中1表示空载体对照，2显示BamHI和HindIII双酶切的目的片段，M表示DNA Marker)
实施例3
本实施例描述了ompK蛋白的获得方法。包括以下步骤：
(1)OmpK成熟肽编码序列原核表达质粒pET30a-ompK在大肠杆菌中的表达
重组质粒pET30a-ompK转化CaCl2法制备的大肠杆菌BL21(DE3)，经鉴定的阳性克隆pET 30a-ompK在含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基中培养至OD值达0.5-0.6，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃诱导表达3-4小时，离心收集菌细胞，部分在冰浴条件下超声波裂解菌体，功率300W，直至溶液变为半透明菌，1500×g离心30min，收集上清液和沉淀；取菌细胞、菌细胞超声破碎后的沉淀与上清，加入5×上样缓冲液，100℃煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳鉴定。
结果如图8所示，转化了pET30a-ompK的大肠杆菌BL21总蛋白中，在预期分子量33kDa位置处出现了特别浓的新增条带，而仅转化了原始pET30a的对照菌株没有此种现象，表明了重组蛋白得到表达；目的蛋白条带在菌细胞和超声波破碎沉淀中均观察到，而上清液中没有，表明了该蛋白以不溶的包涵体形式表达(见附图8，M表示蛋白marker；泳道1是pET30a-ompK转染的BL21总蛋白；泳道2是pET30a转染的对照菌细胞；泳道3是重组蛋白经镍柱纯化后的产物；泳道4和5分别为pET30a-ompK转染的BL21菌体超声波破碎沉淀物和上清)
(2)重组蛋白的纯化
包涵体的纯化以尿素法进行，经初步纯化的包涵体再经镍柱亲和层析法进一步纯化得到重组蛋白。主要步骤如下：收集经IPTG诱导的培养物，用适量PBS重悬沉淀。冰浴条件下超声波裂解细菌，功率300W，直至溶液变为半透明。1500×g离心30min，收集包涵体沉淀。将包涵体沉淀用缓冲液I、II、III分别超声洗涤一次。缓冲液I：50Mm Tris-HCl(pH8.0)，2mM EDTA，100mM NaCl，0.5％Triton X-100(V/V)，4M尿素；缓冲液II：50Mm Tris-HCl(pH8.0)，2mM EDTA，100mM NaCl，3％Triton X-100(V/V)；缓冲液III：100Mm Tris-HCl(pH8.0)，100mM巯基乙醇，2mM EDTA及脱氧胆酸钠。1500×g离心30min，收集包涵体沉淀，然后用含高浓度尿素的缓冲液III悬浮沉淀，室温放置30min，1500×g离心30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，以PBS(pH7.4)低温透析48h，中途勤换透析液。因重组蛋白N端存在6个连续的组氨酸His序列，用镍螯合的琼脂糖柱Ni-IDA(卓冠生物技术公司，北京)进行亲合纯化，纯化步骤依照产品说明书进行。首先将初步纯化的包涵体蛋白溶液以0.45μm孔径的滤器过滤，加到平衡好的Ni-IDA上，以缓冲液A(50mM PB，200mM NaCl，pH7.8)洗3-5个柱体积；然后以含有梯度浓度咪唑的缓冲液B(50mM PB，200mM NaCl，10-400mM咪唑，pH7.8)各洗3个柱体积，释放重组蛋白。重组蛋白的纯化率通过SDS-PAGE测定。
结果如附图9，图中1表示经尿素法得到的包涵体蛋白，2表示穿透液，3表示PBS洗脱产物，4为50mmol/L咪唑浓度缓冲液洗脱产物，5为300mmol/L咪唑浓度缓冲液洗脱产物，M表示蛋白分子量标准。包涵体蛋白上样到镍柱后，挂柱率较高，PBS和低浓度的咪唑洗脱液中仅有少量目的蛋白洗出；在咪唑浓度300mmol/L以上时从柱上洗脱下来。浓缩后得到单一的蛋白，纯化率在95％以上。
实施例4
本实施例描述了本发明提供的ompK蛋白对大黄鱼的免疫原性，免疫接种该蛋白赋予了试验鱼对副溶血弧菌不同来源株攻击的有效保护。
(1)ompK免疫激发试验鱼的血清抗体水平逐渐升高
实验用1+龄大黄鱼，购自象山港养殖网箱，平均体重为120±10g。选择游动活泼，体表无损伤的健康鱼，在3m×2m×2m的水泥池中充气暂养，一周后开始试验。每组鱼40尾。纯化的重组蛋白以0.01M PBS(pH 7.4)调整浓度至0.5mg/ml，每尾腹腔注射0.2ml。试验期间投喂海水鱼类湿颗粒饵料，投饵率5％，每日换水清污一次。在免疫后4-8周，从每组中随机取5尾试验鱼，采取血清，4℃保存，检测抗体效价。
ELISA检测按照常规方法进行。在预备试验中以方阵法分别测定重组ompK的合适包被浓度为5ug/ml，包被到96孔酶标板。大黄鱼抗血清以2倍系列稀释度加到各孔中，初始稀释度为1∶8，每个稀释度加并排的两孔作为重复；第12孔加100uL PBS作为空白对照。以兔抗大黄鱼免疫球蛋白血清(稀释度1∶500)和HRP标记的羊抗兔IgG(稀释度1∶1000，鼎国生物，北京)检测结合到抗原上的特异性抗体。以邻苯二胺OPD显色缓冲液显色30min后，加2M H2SO4中止反应。在酶标仪(Thermo labsystems)492nm波长处读取OD值。试验血清吸光度值(P)＝待检血清OD值-空白OD值，阴性对照血清吸光度值(N)＝阴性血清OD值-空白OD值，当两者比值P/N＞2.1时，则判断为阳性；阳性孔的最大稀释度即为抗体效价。以Student试验在置信度水平P＜0.05计算显著性差异。
免疫后4-8周，重组蛋白ompK免疫组产生了显著的特异性抗体效价(图10)。试验鱼中ompK特异性的抗体效价在测试期间持续上升，在第8周试验结束时，抗体效价达到log228.0以上。而阴性对照组PBS注射组在同期内抗体效价始终未超过log222.0。按方差分析法对抗体效价水平数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。结果提示了ompK注射免疫大黄鱼能够引起显著的体液免疫应答。
(2)OmpK免疫提供了对不同来源的副溶血弧菌人工攻击的有效保护
在免疫后第4周(28d)，从上述试验鱼中每组随机取10尾，每尾腹腔注射0.2mL1×108 cells/mL的副溶血弧菌zj2003、VP1、VP2、VP3株活菌悬液(试验菌株zj2003株自象山港养殖大黄鱼分离，菌株VP1-3购自中科院微生物所菌种保藏中心)；另从未免疫组中取10尾鱼注射相同剂量的灭菌PBS作为健康对照组，观察14d，记录试验鱼的发病与死亡情况，对濒死鱼进行无菌解剖，分离病原菌。按卡方分析法对死亡率数据进行统计学处理，显著水平为P＜0.05。免疫保护率(relativepercent survival，RPS)的计算参照Amend(1981)，即
RPS＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100
表1  经不同来源副溶血弧菌菌株人工攻击后14天内试验大黄鱼的总死亡率和免疫保护率(RPS)
试验鱼组别     攻击菌株    总死亡率(死亡数/样本数)     RPS(％)
OmpK Zj2003    10(1/10)*     90
对照组    100(10/10)     -
OmpK VP1    10(1/10)*     88.89
对照组    90(9/10)     -
OmpK VP2    20(2/10)*     77.78
对照组    90(9/10)     -
OmpK VP3    20(2/10)*     75
对照组    80(8/10)     -
*表示与对照组相比存在显著性差异，P＜0.05。
结果见表1所示，ompK重组蛋白免疫组经不同来源的副溶血弧菌人工攻击后，在14天内出现了一定的死亡，死亡率达10-20％，同期对照组死亡率则高达80-100％，显著高于免疫组。重组蛋白免疫组免疫保护率(RPS)达75-90％，获得了有效保护。部分发病鱼出现体表充血发红的症状，从濒死鱼肝、肾中重新分离到了副溶血弧菌，确认死于攻击引起的感染。
(3)人工感染存活鱼的血清在免疫印迹中识别重组的ompK蛋白
以亚致死浓度的副溶血弧菌zj003人工感染健康的未免疫大黄鱼，2周后采取存活鱼血清作为一抗识别重组的外膜蛋白，如图11所示，重组ompK蛋白与抗血清产生了反应，在NC膜上呈现出清晰的着色条带，表明感染副溶血弧菌的大黄鱼能够产生针对ompK的抗体。
综合上述研究结果表明，以副溶血弧菌重组外膜蛋白ompK免疫大黄鱼，鱼体产生了较强的免疫应答，激发了保护性免疫。并且，免疫印迹进一步表明，感染副溶血弧菌的鱼体产生了ompK蛋白的抗体，即在自然免疫中ompK也是暴露于菌体表面的，并为鱼体免疫系统识别，因此是副溶血弧菌的重要保护性抗原。同时，研究结果业已表明，虽然上述4株不同来源的副溶血弧菌菌株主要外膜蛋白条带的组成存在差异，但均拥有分子量约为28kDa(对应于ompK)的主要条带。因此，OmpK是4菌株的共同保护性抗原。本研究结果证实，该外膜蛋白可作为亚单位疫苗免疫大黄鱼对抗副溶血弧菌的感染；同时，由于该蛋白在弧菌属种类中广泛分布，氨基酸序列较为保守，也可能作为亚单位疫苗对抗多种弧菌感染，具有良好的开发前景。

Claims (9)

1.一种副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗，其特征在于其为转化了重组原核表达质粒pET30a-ompK的大肠杆菌表达的重组蛋白ompK经纯化后的PBS溶液，其浓度为0.25-0.5mg/ml。
2.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗，其特征在于所述的原核表达质粒pET30a-ompK为以pET30a作为原核表达载体，含有以下编码序列的ompK基因的重组载体，该重组载体的保存号为CGMCCNo.2153；
GCAGATTACTCTGACGGCGATATCCACAAAAACGATTACA   40
AGTGGATGCAATTTAACCTAATGGGTGCATTCAACGAGAA   80
AGGTTATGCTGAATCTTCTCATGATTACCTAGAGATGGAA  120
TTCGGCGGTCGCTCTGGTATTTTCGATCTTTACGGTTACG  160
TTGACGTATTCAACCTAGCTTCTGACCCAGGCAGCGACAA  200
AGCTGGCGGCGAGAAAATCTTCATGAAATTCGCACCACGT  240
ATGTCTCTAGACGCGCTAACTGGTAAAGACCTATCTTTCG  280
GTCCTGTTCAAGAGCTATACGTTTCTACTCTAATGGAGTG  320
GGGCGGTAACTCTGACGTTAACTCTCAAAAAATCGGTCTA  360
GGTTCTGACGTGATGGTACCTTGGTTAGGCAAAATCGGCC  400
TAAACCTATACGGTACTTACGATGGCAACAAGAAAGATTG  440
GAACGGTTTCCAAGTTTCTACTAACTGGTTCAAACCATTC  480
TTCTTCTTCGAGAACGGTTCATTCATTTCTTACCAAGGTT  520
ACATCGATTACCAATTCGGTATGGATGACGACAAAGGTAA  560
CAAGTTCAACACTACAGCGTCTAACGGCGGTGCAATGTTC  600
AACGGTATCTACTGGCACTCTGACCGCTTTGCAGTTGGTT  640
ACGGTCTAAAACTTTACAAAGACGTGTACGGTTTCAAAGA  680
CGGCGAAGCTCTACCATGGGGTCACAAACCAGAATCTTCT  720
GGTGCAGGTCACTACATCGCAGTAACTTACAAGTTCTAA   759
长度为759个核苷酸，类型为核苷酸，拓扑结构为线型，链性为单链，全长为ompK蛋白成熟肽编码区。
3.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗，其特征在于所述的以pET30a作为原核表达载体，含有权利要求1所述的原核表达质粒pET30a-ompK的水溶液浓度为1-20μg/μl。
4.如权利要求1所述的一种副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗，其特征在于所述的原核表达质粒pET30a-ompK在大肠杆菌中表达的副溶血弧菌ompK外膜蛋白，重组ompK外膜蛋白所占重量比为0.25-0.5‰。
5.一种如权利要求1所述的副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)首先提取副溶血弧菌基因组DNA，设计引物P1即5’-GCAGCACAGATT-GCG TGTTC-3’和P2即5’-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3’，PCR扩增ompK全基因，然后将ompK全基因序列接连接于pGEM-T easy Vector；
2)重新设计引物P3即5’-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3’和P4即5’-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3’，PCR扩增ompK成熟肽编码序列DNA，将ompK成熟肽编码序列克隆入pET30a，构建成pET30a-ompK原核表达质粒；
3)重组质粒pET30a-ompK转化大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达目标蛋白。表达蛋白经尿素法初步纯化后再经镍柱亲和层析法进一步纯化得到重组蛋白。
6.如权利要求5所述的一种副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述的首先提取副溶血弧菌基因组DNA，设计引物P1即5’-GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3’和P2即5’-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3’，PCR扩增ompK全基因，然后将ompK全基因序列接连接于pGEM-T easyVector：(1)取超低温冻存的副溶血弧菌甘油菌一支，室温融化后接种于Zobell2216E培养基，28℃振荡培养12h以上；取1.5mL菌液于Ependoff离心管中，5000r/min，离心1min，弃上清；灭菌ddH2O悬浮细菌，6000r/min，离心4min，洗涤两次；加入35μL ddH2O和35μLTZ溶液，-20℃放置30-40min；沸水浴10min；冰浴10min；5000r/min，离心5min，收集上清作为PCR模板；(2)设计引物P1即5’-GCAGCACAGATTGCGTGTTC-3’和P2即5’-GCAAGGATAATGAGGGGAGA-3’，PCR扩增ompK全基因条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52.7℃退火30s，72℃延伸60s，72℃延伸10min，共30个循环。扩增出大约950bp的特异性片段，PCR产物回收后，直接克隆于pGEM-Teasy Vector，将重组质粒命名为T-ompK。
7.如权利要求5所述的一种副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述的：重新设计一对引物P3即
5’-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3’，P4即5’-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3’，PCR扩增ompK成熟肽编码序列DNA，将ompK成熟肽编码序列克隆入pET30a，构建成pET30a-ompK原核表达质粒：(1)以在线软件SingalP预测ompK蛋白的信号肽切割位点为N端第20个和第21个氨基酸残基之间，则成熟肽编码序列为自起始密码子后第61个核苷酸序列开始至终止密码子，在此两端重新设计引物
P3即5’-CGGGATCCGCAGATTACTCTGACGGCGATAT-3’
P4即5’-CCCAAGCTTTTAGAACTTGTAAGTTACTGCGA-3’
引物两端分别引入酶切位点BamHI和HindIII，以T-ompK为模版，P3和P4为引物，按以下PCR循环程序扩增ompK成熟肽编码序列DNA：94℃预变性5min，94℃变性30s，51.9℃退火30s，72℃延伸60s，72℃延伸10min，共30个循环；(2)低熔点胶回收ompK成熟肽编码基因，BamHI和HindIII双酶切后，直接克隆入pET30a的BamHI和HindIII多克隆位点处，构建成pET30a-ompK原核表达质粒。
8.如权利要求5所述的一种副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述的重组质粒pET30a-ompK转化大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达。表达蛋白经尿素法初步纯化后再经镍柱亲和层析法进一步纯化得到重组蛋白：(1)重组质粒pET30a-ompK转化CaCl2法制备的大肠杆菌BL21，经鉴定的阳性克隆pET30a-ompK在含有50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养至OD值达0.5-0.6，加入IPTG至终浓度为1.0mmol/L，37℃诱导表达3-4小时，离心收集菌细胞，部分在冰浴条件下超声波裂解菌体，功率300W，直至溶液变为半透明菌，1500×g离心30min，收集上清液和沉淀，蛋白以不溶的包涵体形式存在；(2)包涵体的纯化以尿素法进行，经初步纯化的包涵体再经镍柱亲和层析法进一步纯化得到重组蛋白。
9.如权利要求8所述的一种副溶血弧菌重组ompK蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于所述的经初步纯化的包涵体再经镍柱亲和层析法进一步纯化得到重组蛋白为：收集经IPTG诱导的培养物，用适量PBS重悬沉淀，冰浴条件下超声波裂解细菌，功率300W，直至溶液变为半透明，1500×g离心30min，收集包涵体沉淀，将包涵体沉淀用缓冲液I、II、III分别超声洗涤一次，缓冲液I：50MmTris-HCl，pH8.0；2mM EDTA，100mM NaCl，0.5％Triton X-100(V/V)，4M尿素；缓冲液II：50Mm Tris-HCl，pH8.0；2mM EDTA，100mM NaCl，3％TritonX-100(V/V)；缓冲液III：100Mm Tris-HCl，pH8.0；100mM巯基乙醇，2mM EDTA及脱氧胆酸钠，1500×g离心30min，收集包涵体沉淀，然后用含高浓度尿素的缓冲液III悬浮沉淀，室温放置30min，1500×g离心30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，以pH7.4的PBS低温透析48h，中途勤换透析液，因重组蛋白N端存在6个连续的组氨酸His序列，用镍螯合的琼脂糖柱Ni-IDA进行亲合纯化，首先将初步纯化的包涵体蛋白溶液以0.45μm孔径的滤器过滤，加到平衡好的Ni-IDA上，以含50mM PB，200mM NaCl，pH7.8的缓冲液A洗3-5个柱体积；然后以含有50mM PB，200mM NaCl，10-400mM咪唑，pH7.8的缓冲液B各洗3个柱体积，释放重组蛋白，重组蛋白的纯化率通过SDS-PAGE测定，包涵体蛋白上样到镍柱后，挂柱率较高，PBS和低浓度的咪唑洗脱液中仅有少量目的蛋白洗出；在咪唑浓度300mmol/L以上时从柱上洗脱下来，浓缩后得到单一的蛋白，纯化率在95％以上。
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