NO340633B1 - Nukleinsyremolekyl som omfatter en sekvens av nukleotider som koder for et HPV58-L1-protein, vektorer og vertsceller, fremgangsmåte for fremstilling av HPV58 L1 virusliknende partikler (VLP-er), samt fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for behandling eller forebygging av HPV infeksjoner. - Google Patents
Nukleinsyremolekyl som omfatter en sekvens av nukleotider som koder for et HPV58-L1-protein, vektorer og vertsceller, fremgangsmåte for fremstilling av HPV58 L1 virusliknende partikler (VLP-er), samt fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for behandling eller forebygging av HPV infeksjoner. Download PDFInfo
- Publication number
- NO340633B1 NO340633B1 NO20062674A NO20062674A NO340633B1 NO 340633 B1 NO340633 B1 NO 340633B1 NO 20062674 A NO20062674 A NO 20062674A NO 20062674 A NO20062674 A NO 20062674A NO 340633 B1 NO340633 B1 NO 340633B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hpv58
- vlps
- yeast
- sequence
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 101
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 63
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims description 29
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 19
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 10
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 title claims description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 47
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 45
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 33
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 9
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 claims description 4
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 claims description 4
- 241000235650 Kluyveromyces marxianus Species 0.000 claims description 4
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 4
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims description 4
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 53
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 35
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 27
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 8
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 7
- 238000012552 review Methods 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 5
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-M leucinate Chemical compound CC(C)CC(N)C([O-])=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 101100351811 Caenorhabditis elegans pgal-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150039863 Rich gene Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-benzamido-3-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100480861 Caldanaerobacter subterraneus subsp. tengcongensis (strain DSM 15242 / JCM 11007 / NBRC 100824 / MB4) tdh gene Proteins 0.000 description 1
- 101100447466 Candida albicans (strain WO-1) TDH1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 description 1
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150034230 LI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001467460 Myxogastria Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 101000832889 Scheffersomyces stipitis (strain ATCC 58785 / CBS 6054 / NBRC 10063 / NRRL Y-11545) Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002255 anal canal Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010087005 glusulase Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 208000024312 invasive carcinoma Diseases 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 101150088047 tdh3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt forebyggingen og/eller terapien av humant papillomvirus (HPV)-infeksjon. Mer spesifikt vedrører foreliggende oppfinnelse syntetiske polynukleotider som koder for HPV58-LI-protein, og rekombinante vektorer og verter som omfatter nevnte polynukleotider. HPV58-viruslignende partikler (VLP-er), der VLP-ene er fremstilt ved å uttrykke rekombinant HPV58-L1 eller -LI + L2 i gjærcellerer beskrevet, så vel som en fremgangsmåte for fremstilling av vaksiner og farmasøytiske preparater til forebygging og behandling av HP V-infeksj oner.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Det finnes mer enn 80 typer av humant papillomvirus (HPV), der mange av disse har blitt assosiert med et vidt utvalg av biologiske fenotyper, fra godartede proliferative vorter til maligne karsinomer (for gjennomgang, se McMurray et al., Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001)). HPV6 og HPV11 er de typene som vanligst er assosiert med godartede vorter, ikke-malign condyloma acuminata og/eller laveregradsdysplasi i den genitale slimhinnen eller luftveisslimhinne. HPV16 og HPV18 er høyrisikotypene som oftest er assosiert med in s/ft/-karsinomer og invaderende karsinomer i cervix, vagina, vulva og analkanalen. Mer enn 90 % av cervixkarsinomer er assosiert med infeksjoner av HPV16, HPV18 eller de mindre forekommende onkogene typene HPV31, -33, -45, -52 og -58 (Schiffman et al., J. Nati. Cancer Inst. 85(12): 958-64 (1993)). Observasjonen av at HPV-DNA er påvist i mer enn 90 % av cervix krefttilfeller, tilveiebringer sterkt epidemiologisk bevis på at HPV-er forårsaker cervixkarsinom.
Papillomvirus er små (50-60 nm), nakne, ikosahedriske DNA-virus som koder for opptil åtte tidlig- og to sene gener. De åpne leserammene (ORF-ene) i virus-genomene er betegnet El til E7, og LI og L2, der "E" betegner tidlig og "L" betegner sent. LI og L2 koder for viruskapsidproteinet, mens E-gener er assosiert med funksjoner, slik som virusreplikasjon og cellulær transformasjon.
Ll-proteinet er hovedkapsidproteinet og har en molekylvekt på 55-60 kDa. L2-proteinet er det mindre forekommende kapsidproteinet. Immunologiske data tyder på at det meste av L2-proteinet er internt i forhold til Ll-proteinet i viruskapsidet. Både Ll-og L2-proteinet er svært konserverte mellom ulike papillomvirus.
Ekspresjon av Ll-proteinet eller en kombinasjon av LI- og L2-proteinene i gjær, insektceller, pattedyrceller eller bakterier fører til selvbygging av viruslignende partikler (VLP-er) (for gjennomgang, se Schiller og Roden, i Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomavirus, Lacey, utg. Leeds, UK: Leeds Medical Information, s. 101-12 (1996)). VLP-er er morfologisk like autentiske virioner og er i stand til å indusere høye titre av nøytraliserende antistoffer ved adrninistrering til dyr eller mennesker. Fordi VLP-er ikke inneholder det potensielt onkogene virusgenomet, tilveiebringer de et trygt alternativ til anvendelsen av levende virus i HPV-vaksineutvikling (for gjennomgang se Schiller og Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)). Av denne grunn har LI- og L2-genet blitt identifisert som immunologiske mål for utviklingen av profylaktiske og terapeutiske vaksiner for HPV-infeksjon og sykdom.
Tobery, T.W. et al. (2003) beskriver en sammenligning mellom to typer vaksiner for å indusere HPV16L 1-spesifikke humorale immunresponser: «... makaker immunisert med enten en adenovirus (Ad) -vektor som koder for HPV16L 1 ..., en plasmid-DNA-vektor som koder for en HPV16L gjærprodusert HPV16 L 1 ... eller gjærprodusert HPV16 L 1 + E1/E2/E7 kimære virus-liknende partikler ..». (s. 1541, høyre side kolonne, siste avsnitt). Det ble funnet at «L 1 VLP-gruppen hadde signifikant høyere nøytraliserende titrer enn cVLP, L-l DNA, og Adeno-L 1 grupper.
.» (s. 1542, høyre side kolonne, første avsnitt).
HPV-vaksineutvikling og kommersialisering har blitt hindret av vanskeligheter assosiert med å oppnå høye ekspresjonsnivåer av kapsid-proteiner i vellykte transformerte vertsorganismer, noe som begrenser produksjonen av renset protein. På tross av identifiseringen av villtypenukleotidsekvenser som koder for HPV-L1-proteiner, slik som HPV58-L1 -protein, er det derfor svært ønskelig å utvikle en hurtig fornybar kilde for HPV-Ll-råprotein som benytter HPV58-L1-kodende nukleotid-sekvenser som er optimalisert for ekspresjon i den påtenkte vertscellen. I tillegg vil det være nyttig å fremstille store mengder av HPV58-L1-VLP-er som har de immunitets-overførende egenskapene til de native proteinene til anvendelse ved vaksmeutvikling.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse vedrører preparater og fremgangsmåter for å fremstille en vaksine basert på proteinprodukter som er uttrykt av HPV58-L1-gener. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer polynukleotider som koder for HPV58-L1-protein, hvor polynukleotidene har blitt kodon-optimalisert for høynivåekspresjon i en gjærcelle. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer ytterligere HPV58-viruslignende partikler (VLP-er) der nevnte VLP-er er fremstilt ved å uttrykke rekombinant HPV58-Ll eller -LI + -L2 i gjærceller, og tilkjennegir anvendelsen av HPV58-VLP-er i farmasøytiske preparater og vaksiner til forebyggingen og/eller behandlingen av HPV-assosiert kreft.
Foreliggende oppfinnelse vedrører syntetiske DNA-molekyler som koder for HPV58-L1-proteinet. Kodon for de syntetiske molekylene er designet slik at det blir benyttet de kodon som er foretrukket av en gjærcelle. De syntetiske molekylene kan benyttes som en kilde av HPV58-LI-protein, som kan selvbygges til VLP-er. Nevnte VLP-er kan benyttes i en VLP-basert vaksine.
Nærmere bestemt omfatter foreliggende oppfinnelse et syntetisk nukleinsyremolekyl som koder for HPV58-L1-proteinet ifølge SEKV. ID. NR.: 2, hvor nevnte nukleinsyremolekyl omfatter en sekvens av nukleotider ifølge SEKV. ID. NR.: 1 (her betegnet "58-Ll-R-sekvens").
Også tilveiebrakt er rekombinante vektorer og rekombinante vertsceller, både prokaryote og eukaryote, som inneholder nukleinsyremolekylene som er beskrevet i hele denne beskrivelsen. I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er vertscellen en gjærcelle.
Denne oppfinnelsen vedrører også fremgangsmåter for å fremstille HPV58-VLP-er, og fremgangsmåter for å anvende HPV5 8-VLP-er.
I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er gjæren valgt fra gruppen som består av: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis og Schizosaccharomyces pombe.
Denne oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine som omfatter HPV58-viruslignende partikler (VLP), der HPV58-VLP-ene er fremstilt i gjær.
I en alternativ utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen omfatter fremgangsmåten for fremstilling av vaksinen tilsetning av ytterligere VLP-er av minst én ytterligere HPV-type. Den minst én ytterligere HPV-typen kan være enhver HPV-type av interesse, inkludert enhver HPV-type som er beskrevet på fagområdet eller de som er oppdaget etter dette. I en foretrukket utførelsesform er HPV-typen en type som er assosiert med en klinisk fenotype, slik som vorter eller cervixkreft. I en ytterligere foretrukket utførelsesform er den minst én ytterligere HPV-typen valgt fra gruppen som består av: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 og HPV68.
Som benyttet gjennom hele beskrivelsen og i de tilhørende kravene, inkluderer de singulære formene "en", "ei" og "ett" flertallsreferansen hvis ikke konteksten klart dikterer noe annet.
Som benyttet gjennom beskrivelsen og i de tilhørende kravene gjelder de følgende definisjonene og forkortelsene: Uttrykket "promotor" refererer til et gjenkjenningssete på en DNA-tråd på hvilket RNA-polymerasen binder. Promotoren danner et initieringskompleks med RNA-polymerase for å initiere og drive transkripsjonsaktivitet. Komplekset kan modifiseres ved aktiverende sekvenser betegnet "enhancere" eller "oppstrøms-aktiverende sekvenser", eller inhiberende sekvenser betegnet "silencere".
Uttrykket "vektor" refererer til noen måter ved hvilke DNA-fragmenter kan introduseres inn i en vertsorganisme eller et vertsvev. Det foreligger ulike typer av vektorer inkludert plasmider, virus (inkludert adenovirus), bakteriofager og cosmider.
Uttrykket "kassett" refererer til en nukleotidsekvens eller gensekvens som skal uttrykkes fra en vektor, for eksempel nukleotidsekvensen eller gensekvensen som koder for HPV58-L1-proteinet. Generelt omfatter en kassett en gensekvens innsatt i en vektor som i noen utførelsesformer tilveiebringer regulatoriske sekvenser for å uttrykke nukleotidsekvensene eller gensekvensene. I andre utførelsesformer tilveiebringer nukleotidsekvensen eller gensekvensen den regulatoriske sekvensen for sin ekspresjon. I ytterligere utførelsesformer tilveiebringer vektoren noen regulatoriske sekvenser og nukleotidsekvensen eller gensekvensen tilveiebringer andre regulatoriske sekvenser. For eksempel kan vektoren tilveiebringe en promotor til å transkribere nukleotid- eller gensekvensen og nukleotid- eller gensekvensen tilveiebringer en transkripsjons-termineringssekvens. De regulatoriske sekvensene som kan tilveiebringes av vektoren inkluderer enhancere, transkripsjonstermineringssekvenser, spleiseakseptor- og donorsekvenser, intron, ribosombindingssekvenser og poly(A)-addisjonssekvenser.
Betegnelsene "58-Ll-villtypesekvens" og "58-Ll-wt-sekvens" refererer til HPV58-L1-sekvensen som er tilkjennegitt her som SEKV. ID. NR.: 3. Selv om HPV58-Ll-villtypesekvensen har blitt beskrevet tidligere, er det ikke uvanlig å finne mindre sekvensvariasjoner mellom DNA fremskaffet fra kliniske isolater. Derfor ble en representativ 58-Ll-villtypesekvens isolert fra kliniske prøver som tidligere var vist å inneholde HPV58-DNA (se eksempel 1). 58-Ll-villtypesekvensenble benyttet som en referansesekvens for å sammenligne de kodonoptimaliserte 5 8-L1-sekvensene som er tilkjennegitt her (se figur 1).
Betegnelsene "HPV58-L1-R" og "58-L1-R" refererer til en syntetisk HPV58-Ll-eksempelnukleotidsekvens (SEKV. ID. NR.: 1) som er tilkjennegitt her, der sekvensen ble ombygd, slik at den omfatter kodon som er foretrukket for høynivå-ekspresjon av en gjærcelle.
Uttrykket "en effektiv mengde" betyr at tilstrekkelig vaksinepreparat er introdusert for å frembringe de adekvate nivåene av polypeptidet, slik at en immunrespons blir resultatet. Fagfolk på området vil være på det rene med at dette nivået kan variere.
En "konservativ aminosyresubstitusjon" refererer til erstatningen av en aminosyrerest med en annen kjemisk tilsvarende aminosyrerest. Eksempler på slike konservative substitusjoner er: substitusjon av én hydrofob rest (isoleucin, leucin, valin eller metionin) med en annen, substitusjon av en polar rest med en annen rest med samme ladning (f.eks. arginin for lysin, glutaminsyre for asparaginsyre).
Uttrykket "pattedyr" refererer til ethvert pattedyr, inkludert et menneske.
"VLP" eller "VLP-er" betyr viruslignende partikkel eller viruslignende partikler.
"Syntetisk" betyr at HPV58-L1-genet ble fremstilt slik at det inneholder en sekvens av nukleotider som ikke er den samme som sekvensen av nukleotider som foreligger i det betegnede naturlig forekommende villtype-HPV58-Ll-genet (58-Ll-wt, SEKV. ID. NR.: 3). Som påpekt ovenfor blir syntetiske molekyler her tilveiebrakt som omfatter en sekvens av nukleotider som omfatter kodon, som er foretrukket for ekspresjon av gjærceller. De syntetiske molekylene som tilveiebringes her, koder for de samme aminosyresekvensene som villtype-HPV58-Ll-genet (SEKV. ID. NR.: 2).
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser en sekvenssammenstilling som sammenligner nukleotider som endres i det syntetiske HPV58-L1-genet ifølge foreliggende oppfinnelse (SEKV. ID. NR.: 1, indikert som "58-L1-R", se eksempel 2). Referansesekvensen er 58-Ll-villtypesekvens (SEKV. ID. NR.: 3, indikert som "58-Ll-wt", se eksempel 1). Endrede nukleotider er indikert på deres tilsvarende lokalisering. Nukleotidnummer er inneholdt i parentesene. Identiske nukleotider i den ombygde 58-Ll-sekvensen er indikert med prikker. Figur 2 viser den ombygde, syntetiske HPV58-Ll-dobbeltrådnukleinsyre- og enkeltkodeaminosyre-sekvensen ovenfor. Nukleotidnummer er indikert på venstre side. Figur 3 viser et Northern blot av HPV58-Ll-wt- og -58-L 1-R-transkripter (se eksempel 4). Blottet ble probet med en blanding av like mengder med DIG-merkede 58-Ll-wt- og 58-Ll-R-DNA-probe. Mengden av totalt RNA som ble elektroforesekjørt per spor, er indikert. Pilen på høyre spor indikerer den beregnede størrelsen for et fullengde-5 8-L1 -transkript. Figur 4 viser et Western blot av HPV58-Ll-wt-(58) og 58-L1-R (58R)-proteiner. HPV16-L1 ble inkludert som en referanse (16). Ti, fem og to og et halvt mikrogram med total gjærproteinekstrakt ble denaturert og påsatt på en 10 % SDS-PAGE-gel. HPV58-Ll-protein ble påvist ved å benytte gjærabsorbert anti-trpE-HPV31-Ll-geit-polyklonalt antiserum som kryssreagerer med 58-L1 og 16-L1. Molekylvektmarkører er indikert i kDa på venstre side. Figur 5 avbilder mengden (ng) av intakt HPV58-Ll-VLP-er per mikrogram totalt gjærprotein som er fanget og påvist i en ELISA (se eksempel 7). Resultatene av to eksperimenter som ble utført i duplikat, er inkludert. VLP-ekspresjon av HPV58-L1-wt (svarte og grå bokser) var 36 ng/u.g totalt gjærprotein. VLP-ekspresjon av HPV58-Ll-R (hvite og rutete bokser), den ombygde gjærkodonoptimaliserte 58-L1, var -2-3 ganger høyere enn HPV58-Ll-wt-ekspresjon og nådde 95 ng/u.g totalt gjærprotein i eksperiment #2. Figur 6 viser en representativ prøve av HPV58-VLP-er som sammensatt av HPV58-Ll-R-proteinmolekyler, som er beskrevet her, slik de er visualisert ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (se eksempel 8). Stolpen representerer omtrent 100 nm.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Hoveddelen av cervixkarsinomer er assosiert med infeksjoner av spesifikke onkogene typer av humant papillomvirus (HPV). Foreliggende oppfinnelse vedrører preparater og en fremgangsmåte for å fremstille en vaksine som omfatter protein-produktene som uttrykkes fra gener fra onkogene HPV-typer. Spesifikt tilveiebringes polynukleotider som koder for HPV58-L1, der polynukleotidene er kodonoptimaliserte for høynivåekspresjon i gjær. Også beskrevet er HPV58-viruslignende partikler (VLP-er) som produseres i gjær. Oppfinnelsen beskriver anvendelsen av polynukleotidene og de dermed tilveiebragte VLP-er i en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine til forebyggingen og/eller behandlingen av HPV-assosiert kreft.
En villtype-HPV58-Ll-nukleotidsekvens har blitt rapportert (Genbank-aksesjonsnr. NC_001443, se Kirii et al. Virology 185(1): 424-427 (1991)). Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer syntetiske DNA-molekyler som koder for HPV58-L1-proteinet. De syntetiske molekylene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en sekvens av kodon, der minst noen av disse kodon har blitt endret for å anvende kodon som er foretrukket av en gjærcelle for høynivåekspresjon. De syntetiske molekylene kan benyttes som en kodende sekvens for ekspresjon av HPV58-L1-protein, som kan selvbygges til VLP-er. Nevnte VLP-er kan benyttes i en VLP-basert vaksine for å tilveiebringe effektiv immunprofylakse mot papillomvirusinfeksjon via nøytraliserende antistoff og cellemediert immunitet. Slike VLP-baserte vaksiner er også nyttige til behandling av allerede etablerte HPV-infeksjoner.
Ekspresjon av HPV-VLP-er i gjærceller gir fordelen av å være kostnads-effektiv og enkelt tilpasset til storskaladyrking i fermentorer. I tillegg kan gjærgenomet enkelt endres for å sikre seleksjon av rekombinant, transformert gjær med økt dyrkings- og ekspresjonspotensial. Likevel blir mange HPV-L1-proteiner, inkludert HPV58-L1, uttrykt ved nivåer i gjærceller som er lavere enn det som er ønskelig for kommersiell oppskalering.
I overensstemmelse med dette vedrører foreliggende oppfinnelse HPV58-L1-gensekvenser som er "optimaliserte" for høynivåekspresjon i et gjærcellemiljø.
Et "triplettkodon" av fire mulige nukleotidbaser kan foreligge i over 60 variantformer. Fordi disse kodon tilveiebringer koden for kun 20 ulike aminosyrer (i tillegg til transloipsjonsmitiering og -terminering) kan noen aminosyrer kodes for av mer enn ett kodon, ett fenomen som er kjent som kodonoverskudd. Av grunner som ikke er fullstendig forstått, er ikke alternative kodon jevnt til stede i det endogene DNA i ulike typer av celler. Faktisk ser det ut til å eksistere et variabelt naturlig hierarki eller en "preferanse" for disse kodon i visse typer av celler. Som et eksempel er aminosyren leucin spesifisert av ethvert av seks DNA-kodon, inkludert CTA, CTC, CTG, CTT, TTA og TTG. Uttømmende analyse av genomkodons anvendelsesfrekvenser for mikroorganismer, har avslørt at endogen DNA fra E. coli, vanligst inneholder det CTG-leucinspesifiserende kodon, mens DNA fra gjær og slimsopper vanligst inkluderer et TTA-leucinspesifiserende kodon. I lys av dette hierarkiet er det generelt antatt at sannsynligheten for å oppnå høye nivåer av ekspresjon av et leucinrikt polypeptid fra en E. co//-vert, vil være avhengig i noen grad av frekvensen av kodonanvendelse. For eksempel er det sannsynlig at et gen som er rikt på TTA-kodon, vil bli dårlig uttrykt i E. coli, mens et CTG-rikt gen sannsynligvis vil bli høyt uttrykt i denne verten. Tilsvarende vil et foretrukket kodon for ekspresjon av et leucinrikt polypeptid i en gjærvert, være TTA.
Implikasjonene av kodonpreferansefenomener på rekombinante DNA-teknikker er manifesterte, og fenomenet kan benyttes til å forklare mange tidligere mislykkede forsøk på å oppnå høye ekspresjonsnivåer av eksogene gener i vellykket transformerte vertsorganismer, der et mindre "foretrukket" kodon repetert kan foreligge i det innsatte genet og vertscellemaskineriet for ekspresjon kan dermed ikke virke like effektivt. Dette fenomenet tyder på at syntetiske gener som er blitt designet slik at de inkluderer en prosjektert vertscelles foretrukne kodon, tilveiebringer en optimal form for fremmed genetisk materiale for utøvelse av rekombinant proteinekspresjon. Slik er et aspekt av denne oppfinnelsen et HPV58-Ll-gen som er kodonoptimalisert for høynivåekspresjon i en gjærcelle. I en foretrukket utførelsesform av denne oppfinnelsen har det blitt funnet at anvendelsen av alternative kodon som koder for den samme proteinsekvensen, kan fjerne begrensningene når det gjelder ekspresjon av HPV58-L1-proteiner ved hjelp av gjærceller.
I overensstemmelse med denne oppfinnelsen ble HPV58-Ll-gensegmenter konvertert til sekvenser som har identiske translaterte sekvenser, men med alternativ kodonanvendelse som beskrevet av Sharp and Cowe (Synanymous Codon Usage i Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 657-678 (1991)). Metodikken består generelt av å identifisere kodon i villtypesekvensen som vanligvis ikke er assosiert med høyt uttrykte gjærgener, og erstatte den med optimale kodon for høy ekspresjon i gjærceller. Den nye gensekvensen ble deretter inspisert for uønskede sekvenser som har blitt generert ved disse kodonerstatningene (f.eks. "ATTTA"-sekvenser, utilsiktet danning av intronspleisegjenkjenningsseter, utilsiktede restriksjonsenzymseter, høyt GC-innhold, tilstedeværelse av transloipsjonstermineringssignaler som ble gjenkjent av gjær, osv.). Uønskede sekvenser blir eliminert ved substitusjon av de eksisterende kodon med ulike kodon som koder for den samme aminosyren. De syntetiske gensegmentene blir deretter testet for forbedret ekspresjon.
Fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, ble benyttet til å fremstille syntetiske gensegmenter for HPV58-L1, noe som førte til et gen som omfatter kodon som er optimalisert for høynivåekspresjon. Mens prosedyren ovenfor tilveiebringer en oppsummering av vår metodikk for å designe kodonoptimaliserte gener til anvendelse i HPV-vaksiner, vil det være på det rene for en fagperson på området at tilsvarende vaksineeffektivitet eller økt ekspresjon av gener kan oppnås ved mindre variasjoner i prosedyren eller med mindre variasjoner i sekvensen.
Foreliggende oppfinnelse vedrører et syntetisk polynukleotid som koder for HPV58-L1-proteinet som fremlagt ifølge SEKV. ID. NR.: 2, der nevnte nukleinsyremolekyl omfatter en sekvens av nukleotider som fremlagt ifølge SEKV. ID. NR.: 1.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også rekombinante vektorer og rekombinante vertsceller, både prokaryote og eukaryote, som inneholder nukleinsyremolekylene som er tilkjennegjort gjennom hele denne beskrivelsen. I en foretrukket utførelsesform av denne oppfinnelsen er vertscellen en gjærvertscelle.
Det syntetiske HPV58-DNA eller fragmenter derav som er fremstilt via fremgangsmåtene som er beskrevet her, kan bli rekombinant uttrykt ved hjelp av molekylær kloning inn i en ekspresjonsvektor som inneholder en passende promotor og andre passende transkripsjonsregulatoriske elementer, og overført inn i prokaryote eller eukaryote vertsceller for å produsere rekombinant HPV58-L1. Teknikker for slike manipuleringer er fullt ut beskrevet av Sambrook et al. ( Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,
(1989) , Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York (1988), Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,
(1990) ).
Denne oppfinnelsen vedrører ytterligere en fremgangsmåte for å uttrykke et HPV58-L1 -protein i en rekombinant vertscelle, som omfatter å: (a) introdusere en vektor som omfatter en nukleinsyre som fremlagt ifølge SEKV. ID. NR.: 1 inn i en gjærvertscelle og (b) dyrke gjærvertscellen ved betingelser som tillater ekspresjon av nevnte HPV58-L1 -protein.
De syntetiske genene ifølge foreliggende oppfinnelse kan settes sammen til en ekspresjonskassett som omfatter sekvenser som er designet for å tilveiebringe effektive ekspresjon av HPV58-L1-proteinet i vertscellen. Kassetten inneholder fortrinnsvis det syntetiske genet, sammen med tilhørende transkripsjons- og
translasjonskontrollsekvenser operativt bundet til det, slik som en promotorsekvens og terminatorsekvens. I en foretrukket utførelsesform er promotoren S. cerevisiae- GALl-
promotoren, selv om fagfolk på området vil være på det rene med at enhver av et antall andre kjente gjærpromotorer, slik som GAL10-, GAL7-, ADH1-, TDH3- qWqtPGK-promotoren - eller andre eukaryote genpromotorer kan benyttes. En foretrukket transloipsjonsterminator er S. cerevisiae- ADH 1- terramatoren, selv om andre transloipsjonsterminatorer også kan benyttes. Kombinasjonen av GAL 1 -promotor - ylZ)//7-terminator er spesielt foretrukket.
Også beskrevet er en HPV58-viruslignende partikkel (VLP) som er fremstilt ved rekombinant å uttrykke HPV58-L1- + L2-genene i en gjærcelle, fremgangsmåter for å fremstille HPV58-VLP-er og fremgangsmåter for anvendelse av HPV58-L1-VLP-er. VLP-er kan selvbygges når LI, som er hovedkapsidproteinet til humane papillomvirus og dyrepapillomvirus, uttrykkes i gjærceller, insektceller, pattedyrceller eller bakterier (for gjennomgang, se Schiller and Roden, in Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses, Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, s. 101-12 (1996)). Morfologisk uensartede HPV-VLP-er kan også bli fremstilt ved å uttrykke en kombinasjon av LI- og L2-kapsidproteiner. VLP-er sammensatt av 72-pentamerer av LI i en T=7 icosahederstruktur (Baker et al., Biophys. J. 60(6): 1445-56(1991)).
VLP-er morfologisk like autentiske virioner og er i stand til å indusere høye titra og nøytraliserende antistoffer ved admimstrering til et dyr. Immunisering av kaniner (Breitburd et al., J. Virol. 69(6): 3959-63 (1995)) med VLP-er ble vist både å indusere nøytraliserende antistoffer og beskytte mot eksperimentell papillomvirusinfeksjon. På grunn av at VLP-ene ikke inneholder det potensielt onkogene virusgenomet og ikke kan selvbygges når det blir uttrykt fra et enkelt gen, innebærer de likevel et trygt alternativ i forhold til anvendelse av levende virus i HPV-vaksineutvikling (for en gjennomgang, se Schiller and Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)).
Her beskrives også viruslignende partikler som er sammensatt av rekombinante LI-proteiner eller rekombinante LI- + L2-proteiner fra HPV58, der det rekombinante proteinet ble uttrykt i en gjærcelle.
Som påpekt ovenfor, i en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, blir HPV58-VLP-ene fremstilt i gjær. I en ytterligere foretrukket utførelsesform er gjæren valgt fra gruppen som består av: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichiapastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis og Schizosaccharomyces pombe.
Nok et annet aspekt av denne oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av HPV58-VLP-er som omfatter å: (a) transformere gjær med et rekombinant DNA-molekyl som koder for HPV58-LI-protein eller HPV58-L1- + L2-proteiner, (b) dyrke den transformerte gjæren under betingelser som tillater ekspresjon av det rekombinante DNA-molekylet for å produsere det rekombinante HPV58-LI-proteinet og (c) isolere det rekombinante HPV58-L1-proteinet for å fremstille HPV58-VLP-er; hvor HPV58-Ll-genet omfatter en sekvens av nukleotider som fremlagt ifølge SEKV.
ID. NR.: 1.
De resulterende HPV58-VLPene kan anvendes i en fremgangsmåte for å indusere en immunrespons hos et dyr som omfatter å administrere HPV58-viruslignende partikler til dyret, spesielt i en fremgangsmåte for å forebygge og/eller behandle HPV-assosiert cervixkreft som omfatter å administrere en vaksine som omfatter HPV58-VLP-ene.
Denne oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine som omfatter HPV58-viruslignende partikler (VLP-er).
I en alternativ utførelsesform av dette aspektet av oppfinnelsen omfatter denne metoden for fremstilling av en vaksine ytterligere tilsetning av VLP-er av minst en ytterligere HPV-type. I en foretrukket utførelsesform blir den minst én ytterligere HPV-typen valgt fra gruppen som består av: HPV6, HPV11, HPV 16, HPV 18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 og HPV68.
I en foretrukket utførelsesform av denne fremgangsmåten av oppfinnelsen blir HPV16-VLP-er tilsatt.
I en annen foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten blir HPV 16-VLP-er og HPV18-VLP-er tilsatt.
I nok en annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen omfatter fremgangsmåten ytterligere tilsetting av HPV6-VLP-er, HPVll-VLP-er, HPV 16-VLP-er og HPV18-VLP-er.
Vaksinepreparater tilveiebragt ifølge foreliggende oppfinnelse kan benyttes alene ved passende doseringer som tillater optimal inhibering av HPV58-infeksjon med minimal potensiell toksisitet. I tillegg kan samtidig admmistrering eller sekvensiell admmistrering med andre midler være ønskelig.
Mengden av viruslignende partikler som skal introduseres inn i en vaksinemottaker, vil være avhengig av immunogenisiteten til det uttrykte genproduktet. Generelt blir en immunologisk eller profylaktisk effektiv dose på omtrent 10 u.g til 100 ug, og fortrinnsvis omtrent 20 ug til 60 u.g av VLP-ene administrert direkte inn i muskelvev. Subkutan injeksjon, intradermal introduksjon, impregnering gjennom huden og andre acmiimstrermgsmåter, slik som intraperitonealt, intravenøst eller levering via inhalering er også omfattet. Det er også omfattet at boostervaksineringer kan tilveiebringes. Parenteral admimstrering, slik som intravenøs, intramuskulær, subkutan eller annen admimstreringsmåte med adjuvanser, slik som alum eller Merck- aluminiumadjuvans, samtidig med eller etter parenteral introduksjon av vaksinen, er også fordelaktig.
Når foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er beskrevet med referanse til de tilhørende tegningene, skal det forstås slik at oppfinnelsen ikke er begrenset til disse presise utførelsesformene, og at ulike endringer av modifikasjonene kan utøves på dette av en fagperson på området.
De følgende eksemplene illustrerer oppfinnelsen.
Eksempel 1
Bestemmelse av en representativ HPV58- Ll- sekvens
HPV58-L1-sekvensen har tidligere blitt beskrevet (Genbank-aksesjonsnr. NC 001443). Det er likevel ikke uvanlig å finne mindre sekvensvariasjoner mellom DNA som er fremskaffet fra kliniske isolater. For å bestemme en representativ HPV58-Ll-villtypesekvens ble DNA isolert fra tre kliniske prøver som tidligere var vist å inneholde HPV58-DNA. HPV58-Ll-sekvenser ble amplifisert i en polymerasekjede-reaksjon (PCR) ved å benytte 7ag-DNA-polymerase og de følgende primerne: HPV58-Ll-F 5' - ATGTCCGTGGCGGCCTAGT-3' (SEKV. ID. NR.: 4) og 58-3'
HBglII5'-GAGATC TGTGTAAGTACCACAACAATTA-3'
(SEKV. ID. NR.: 5). De amplifiserte produktene ble elektroforesekjørt på agarosegeler og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. Båndene av LI på ca 1500 bp ble skåret ut og DNA ble renset ved å benytte Geneclean Spin Kit (Q-Bio Gene, Carlsbad, CA). DNA ble deretter ligert til TA-kloningsvektoren pCR2.1 (Invitrogen). TOP10F-E. Coli ble transformert med ligeringsblandingen og platet ut på LB-agar med ampicillin pluss IPTG og X-gal for blå/hvit koloniseleksjon. Platene ble snudd på hode og innkubert i 16 timer ved 37 °C. Hvite kolonier ble dyrket i LB-medium med ampicillin med risting ved 37 °C i 16 timer. Miniprep ble utført for å ekstrahere plasmid-DNA.
For å vise tilstedeværelsen av LI-genet i plasmidene ble restriksjons-endonukleasefordøyinger utført. Restriksjonsfragmenter ble synliggjort ved hjelp av agarosegelelektroforese og etidiumbromidfarging. DNA-sekvensering ble utført på plasmider som inneholdt klonede LI-innskudd fra hver av de tre kliniske isolatene. For å generere en referansesekvens for senere optimalisering ble nukleotidsekvensene og de translaterte aminosyresekvensene fra hver av klonene sammenlignet med de publiserte HPV58-Ll-sekvensene. Sekvensanalyse av de tre kliniske isolatene avslørte at ingen sekvens var identisk med Genbank-sekvensen. pCR2. l-HPV58-Ll-klon-4 ble valgt til å være den representative 58-Ll-sekvensen og er her om hverandre referert til som "58-Ll-villtypesekvens" eller "58-wt-sekvens" (SEKV. ID. NR.: 3, se figur 1). 58-Ll-wt-sekvensen inneholdt fem punktmutasjoner: to som førte til aminosyreendringer og tre sovende punktmutasjoner. Punktmutasjonene som førte til aminosyreendringer med hensyn på Genbank-HPV58-Ll-sekvensen ble lokalisert på nukleotid 372 (A—>-T), som endrer aminosyre 124 fra leucin til fenylalanin, og nukleotid 897 (A—►G), som endrer aminosyre 299 fra isoleucin til metionin. De tre sovende punktmutasjonene ble lokalisert på nukleotid 774 (A->G), 792 (T->C) og 999 (G->A).
58-Ll-villtypesekvensen ble PCR-amplifisert ved å benytte 7ag-polymerase og de følgende primerne, som tilsetter ÆamHI-forlengninger: 5' 58 BamHI 5' - G G G A T
CCCACAAAACAAAATGTCCGTGTGGC-3' (SEKV. ID. NR.: 6)
og 3' Barn 58 5'-GGGATCC GTGTGTAAGTACCACAACAATT A - 3' (SEKV. ID. NR.: 7). De resulterende PCR-produktene ble visualisert ved hjelp av agarosegelelektroforese, etterfulgt av etidiumbromidfarging. Båndet på ca 1500 bp ble skåret ut og DNA-renset ved å benytte Geneclean kit. PCR-produktet ble deretter ligert inn i pCR2.1 og TOP10F'-celler ble transformert med ligeringsblandingen. Hvite kolonier ble valgt og dyrket i LB-medium med ampicillin og risting ved 37 °C i 16 timer. Miniprep ble utført for å ekstrahere plasmid-DNA. For å frigjøre HPV58-L1-genet fra vektorsekvensene ble 5amHI-restriksjonsendonukleasefordøyinger utført. Det fordøyde DNA ble utsatt for agarosegelelektroforese og synliggjort ved hjelp av etidiumbromidfarging. Ll-båndet ble renset ved å benytte Geneclean kit og ligert til defosforylert, ÆamHI-fordøyd pGALl 10. DH5a E. cø//-celler ble transformert med ligeringsblandingen. For å screene for HPV58-LI-innskuddet i den korrekte orienteringen, ble plasmid-DNA fra kolonier PCR-amplifisert. DNA-sekvensering ble utført for å bekrefte sekvens og orientering av innskuddene. En enkelt klon ble valgt og betegnet pGALl 10-HPV-58-L1-10. Maksiprep-DNA fra den valgte klonen ble klargjort. Saccharomyces cerevisiae- ceUer ble gjort kompetente ved hjelp av sferoplasting med glusulase og transformert med pGALl 10-HPV58-L1-1. Gjærtransformermgsblandingen ble platet på Leu(-)sorbitol toppagar på Leu(-)-sorbitolagarplater og innkubert opp ned i 3-5 dager ved 30 °C. Kolonier ble plukket og strøket ut for isolering på Leu(-)-sorbitolagarplater. Isolerte kolonier ble deretter dyrket i 5 ml i 5 X Leu(-) Ade(-)-sorbitol med 1,6 % glukose og 4 % galaktose i roterende rørkulturer ved 30 °C for å indusere 58-Ll-transkripsjon og proteinekspresjon.
Eksempel 2
Giærkodonoptimalisering
Gjærforetrukne kodon har blitt beskrevet (Sharp, Paul M og Cowe, Elizabeth. Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7: 657-678 (1991)). Ekspresjon av HPV58-Ll-wt-proteinet var påvisbar, men likevel ble HPV58-Ll-genet ombygd ved å benytte de foretrukne gjærkodon for å oppnå økt ekspresjon. Den ombygde 5 8-L1-sekvensen, som omfatter gjæroptimaliserte kodonsekvenser, inneholdt 404 nukleotidendringer sammenlignet med 5 8-L1 -sekvensen. Den resulterende sekvensen blir her referert til som "58-L1-R" (R = ombygd, se figur 1). Den translaterte aminosyresekvensen til 58-L1-R ble ikke endret. Nukleotidsekvensen (SEKV. ID. NR.: 1) og aminosyresekvensen (SEKV. ID. NR.: 2) for HPV58-L1-R er vist i figur 2. Nevnte ombygde sekvens tilveiebringer økt HPV58-Ll-ekspresjon, som er en vesentlig forbedring i forhold til villtypen for anvendelse i vaksmeutvikling (se eksempel 4).
Strategien som ble benyttet for å fremstille det optimaliserte genet, var å designe lange overlappende sens- og antisensoligomerer som dekket genet ved å substituere nukleotider med gjærforetrukne kodonsekvenser, mens aminosyresekvensen ble opprettholdt. Disse oligomerene ble benyttet i stedet for templat-DNA i en PCR-reaksjon med Pfu-polymerase. Ytterligere amplifiseringsprimere ble designet og benyttet til å amplifisere de ombygde sekvensene fra templatoligomerer.
De optimale betingelsene for amplifisering var seksjonsspesifikke, men de fleste benyttet et program som lignet 95 °C i 2 minutter (denaturering), etterfulgt av 35 sykluser med 95 °C i 1 minutt (denaturering), 55 °C i 1 minutt (annealing), 72 °C i 3,5 minutt (forlengning), etterfulgt av en siste forlengning med 72 °C i 10 minutter og holding på 4 °C. PCR-produkter ble undersøkt ved hjelp av agarosegelelektroforese. Bånd av passende størrelse ble skåret ut og DNA gelrenset. De amplifiserte fragmentene ble deretter benyttet som templater for å sette sammen det ombygde HPV58-Ll-genet på 1497 nt.
Etter ombygning ble båndet på 1497 nt gelrenset og ligert til pCR-blunt-vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter ligering ble TOPlO-celler transformert med ligeringsblanding. Kolonier ble dyrket i LB med kanamycin og plasmid-DNA ble ekstrahert fra koloniene ved hjelp av mim<p>re<p>teloiikker. Plasmid-DNA ble sekvensert for å bekrefte de ønskede endringene i det ombygde 58-L1. For å innføre BamRl-forlengninger i begge ender ble 58-L1-R (ombygd) amplifisert på nytt fra pCR-Blunt-58-L1-R med de følgende primerne: 5' Bam 58- ombygd 5' - GGATCCCACAA
AACAAAATGTCTGTCTGGAGACC-3' (SEKV. ID. NR.: 8) og
3' Bam- 58- ombygd 5' - GGATCCTTACTTCTTGACCTTC-3' (SEKV.
ID. NR.: 9).
Det amplifiserte LI-produktet ble gelrenset ved å benytte Geneclean kit og klonet inn i pCR2.1 (Invitrogen). ToplOF'-celler ble transformert med pCR2.1-plasmidet. Hvite kolonier ble dyrket i LB-medium med ampicillin, risting ved 37 °C i 16 timer. Miniprep ble utført for å ekstrahere plasmid-DNA. For å frigjøre HPV58-L1-genet fra vektorsekvensen, ble 5amHI-restriksjonsendonukleasefordøyinger utført. Det fordøyde DNA ble utsatt for agarosegelelektroforese og synliggjort ved hjelp av etidiumbromidfarging. Ll-båndet ble renset ved å bruke Geneclean kit og ligert til defosforylert ÆamHI-fordøyd pGALl 10. DH5a E. cø//-celler ble transformert med ligeringsblandingen.
De resulterende koloniene ble screenet ved hjelp av PCR for HPV58-L1-innskuddet i den korrekte orienteringen. Maksiprep-DNA ble utført. Sekvens og orientering ble bekreftet ved hjelp av restriksjonsfordøyingsprofiler og DNA-sekvensering. Den valgte klonen ble betegnet pGALl 10-HPV58-L1R-17. Saccharomyces cerevisiae- ceUer ble gjort kompetente ved hjelp av sferoplasting og transformert med pGALl 10-HPV58-L1R-17. Gjærtransformasjonen ble platet i Leu(-)-sorbitoltoppagar på Leu(-)-sorbitolagarplater og innkubert opp ned i 3-5 dager ved 30 °C. Kolonier ble plukket og streket ut for klonisolering på Leu(-)-sorbitol agarplater. Isolerte kolonier ble deretter dyrket i 5 ml 5 X Leu(-) Ade(-)-sorbitol med 1,6 % glukose og 4 % galaktose i roterende rørkultur ved 30 °C for å indusere Ll-transkripsjon og proteinekspresjon. Etter 48 timer ble et kulturvolum ekvivalent til en OD6oo= 10 mengde av celler spunnet til en pellet, supernatanten ble fjernet og pelletene frosset og lagret ved -70 °C.
Eksempel 3
RNA- klargjøring
Cellepelleter fra transformerte gjærceller som er indusert slik at de trykte HPV58-L1 eller HPV58-L1-R ved galaktoseinduksjon ble tint på is, suspendert i 0,8 ml Trizolreagens (Life Technologies, Gibco BRL) og innkubert ved romtemperatur i 5 minutter. En femtedels volum kloroform ble tilsatt til røret. Det ble deretter ristet kraftig i 15 sekunder for å blande innholdet og innkubert ved romtemperatur i 3 minutter. Etter 5 minutters sentrifugering ved 13 k rpm ble den øvre fasen samlet og overført til et nytt rør. 0,4 ml isopropanol ble tilsatt og innkubert ved romtemperatur i 10 minutter. For å bringe RNA til en pellet ble sentrifugering utført ved 13 k rpm i 10 minutter. Supernatanten ble dekantert, RNA-pelleten ble vasket med 75 % EtOH og sentrifugert gjentatte ganger. Supernatanten ble dekantert og RNA-pelleten tillått å lufttørke etterfulgt av suspensjon i RNasefritt vann. Spektrofotometri ble utført for å bestemme konsentrasjonen av RNA i prøven ved å benytte antagelsen av at en A26o-avlesning på 1 = 40 ug/ml RNA når A26o/28oer 1,7 - 2,0.
Eksempel 4
Northern- blot- analyse
En 1,1 % agaroseformaldehydgel ble støpt. Fem og ti mikrogram RNA ble kombinert med denaturerende buffer (sluttkonsentrasjoner: 6 % formaldehyd, 50 % formamid og 0,1 x MOPS) og varmet til 65 °C i 10 minutter. En tiendedel volum med gelpåsetningsbuffer ble tilsatt og prøven ble påsatt gelen. Elektroforese ble utført ved 75 volt i 1 x MOPS-buffer i ca 3 timer. Gelen ble vasket i 60 minutter i 10 x SSC.
RNA ble overført til en Hybond-N+nylon-membran (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ved hjelp av kapillærkrefter i løpet av 16 timer 10 x SSC. RNA ble deretter fiksert til nylonmembranen ved hjelp av kryssbinding ved å benytte UV-stratalinkerautoloyssbindmgsfunksjonen (Stratagene, La Jolla, CA). Etter fiksering ble nylonmembranen tillått å lufttørke.
DIG High Prime DNA Labeling og Detection Kit I fra Roche Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Sveits) ble benyttet til å merke 58-Ll-wt- og 58-L1-R-DNA-sekvenser med DIG for å benyttes som en probeblanding for å påvise 58-Ll-wt- og 58-Ll-R-transkripter på Northern blottet. Prehybrichseringsutviklingen, hybridiserings-utviklingen og den immunologiske utviklingen ved å benytte et anti-DIG-alkalisk fosfatasekonjugert antistoff ble utført i overensstemmelse med produsentens anbefalinger. Kort fortalt ble blottet prehybridisert ved 37 °C i 30 minutter med forsiktig risting. Probeblandingen ble denaturert ved å varmes til 95 °C i 5 minutter og stoppes på is. Probeblandingen ble tilsatt til hybridiseringsløsmngen og påsatt membranen i 4 timer ved 44,6 °C med forsiktig risting. Hybridiseringsløsningen ble deretter fjernet og blottet ble vasket 2x5 minutter i 2 x SSC med 0,1 % SDS ved romtemperatur, etterfulgt av en ytterligere vask ved 65 °C med 0,5 x SSC og 0,1 % SDS. Blottet ble deretter blokkert i 30 minutter og anti-DIG-alkalisk fosfatasekonjugert antistoff ble påsatt ved en 1:5000 fortynninger i 30 minutter. Blottet ble vasket og tilstedeværelsen av probebundet RNA ble bestemt ved hjelp av NBT/BCIP-substratpåvisning ved det alkalisk fosfatasekonjugerte anti-DIG-bundne antistoffet.
En første analyse av gjær som uttrykker 58-Ll-wt, tydet på at det var funksjonell HPV58-Ll-fullengdetranskripsjon og translasjon, men nivået av ekspresjon kan likevel økes hvis sekvensen ombygges med gjærforetrukne kodonsekvenser. Den ombygde 5 8-L1-sekvensen ble laget for å omgå alle mulig for tidlige translaipsjonstermineringsseter for å sikre robust transkripsjon. Northern blot-analyse av 58-Ll-R-transkriptet avslørte at økte mengder av fullengdetranskripter ble generert sammenlignet med resultatene som ble sett for 58-Ll-wt (figur 3).
Eksempel 5
HPV58- L 1- proteinekspresjon
Frosne gjærcellepelleter av galaktoseinduserte kulturer ekvivalent med en OD6oo=10 kvantitet av celler ble tint på is og suspendert i 300 ul PC-buffer (100 mM Na2HP04 og 0,5 M NaCl, pH 7,0) med 2 mM PMSF. Syrevaskede 0,5 mm glasskuler ble tilsatt i en konsentrasjon på ca 0,5 g/rør. Rørene ble vortekset i 3 sykluser av 5 minutter ved 4 °C med et opphold 1 minutt. 7,5 ul 20 % TritonXlOO ble tilsatt og vortekstrinnene ble gjentatt i 5 minutter ved 4 °C. Rørene ble plassert på is i 15 minutter, etterfulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten ble oppført til et sterilt mikrofugerør, merket som totalgjærproteinekstrakt, datert og lagret ved -70
°C.
Eksempel 6
Western- blot- analyse
Totalt gjærproteinekstrakt fra tjue isolerte gjærkolonier for hver 58-L1-konstruksjon ble analysert ved Western-blotting for å bekrefte ekspresjon av 58-L1-protein etter galaktoseinduksjon.
Ti, fem og to og et halvt mikrogram med totalt gjærproteinekstrakt fra representative 58-Ll-wt- og 58-Ll-R-isolator ble kombinert med SDS-PAGE-påsetningsbuffer og varmet til 95 °C i 10 minutter. 16-L1-proteinet, som har en størrelse på 55 kD, ble inkludert som en positiv kontroll, sammen med HPV58-Ll-fritt totalt gjærproteinekstrakt som en negativ kontroll (data ikke vist).
Proteinene ble påsatt på en 10 % SDS-PAGE-gel og elektroforesekjørt i Tris-glysinbuffer. Etter proteinseparasjon ble proteinene Western-overført fra gelen til nitrocellulose og blottet ble blokkert i 1 x fortynningsbuffer (Kirkegaard og Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) 1 time ved romtemperatur med risting. Blottet ble vasket tre ganger og innkubert ved romtemperatur i 16 timer med gjærabsorbert geit-anti-trpE-HPV31 -LI-serum, som kryssreagerer med HPV 16- og HPV58-L1-proteiner. Blottet ble deretter vasket tre ganger og innkubert med en l:2500-fortynning av anti-geit-HRP-konjugert antistoff i 1 time. Blottet ble igjen vasket tre ganger og NBT/BCIP-deteksjonssubstrat ble påsatt (Kirkegaard and Perry Laboratories). Immunreaktive proteiner ble påvist som rosa bånd på blottet.
I alle tilfeller ble 58-Ll-proteinet påvist som et distinkt immunreaktivt bånd på nitrocellulosen tilsvarende omtrent 55 kD (figur 4). Intensiteten til 58-Ll-R-båndet så ut til å være høyere enn den som ble sett for 58-Ll-wt, noe som tyder på at forbedret 58-Ll-ekspresjon ble oppnådd ved gjærkodonoptimahsering.
Eksempel 7
ELISA- analyse
For å vise 58-Ll-VLP-ekspresjon ble en del av 58-Ll-wt- og 58-L1-R-totalgjærproteinekstraktet analysert ved hjelp av ELISA. Gjærcellene som uttrykker HPV58-L1 og HPV58-L1-R, ble dyrket ved hjelp av en mengde fremgangsmåter, inkludert roterende rørkulturer, risteflaske og fermentorer. Gjærcellene ble lysert og proteinekstrakter ble fremstilt for å bestemme mengden av HPV58-Ll-viruslignende partikler (VLP-er) som ble fremstilt per mikrogram totalprotein. En sandwich-ELISA ble designet for å vise HPV58-Ll-VLP-ekspresjon.
Protein-G-renset monoklonalt H582C3.F7 (F7)-antistoff (mAb) ble benyttet for å binde intakte 58-Ll-VLP-er som ble funnet i gjærproteinekstraktene. F7 gjenkjenner spesifikt en HPV58-Ll-VLP-konformasjonell epitop. De ubundne proteinene ble vasket vekk og H586E11.F4 (F4), som er en annen HPV58-Ll-VLP-konformasjonell spesifikk mAb, ble tilsatt som et påvisningsantistoff. Sanne, konformasjonelt korrekte, 58-Ll-VLP-er ble bundet og påvisning ble fremmet ved anvendelsen av et anti-muse-IgG2b-HRP-konjugert antistoff og TMB-substrat.
Spesifikt ble F7 benyttet til å belegge bunnen av Immulon 4 HBX 96-brønn-plater over natten ved 4 °C. Platene ble vasket tre ganger med PBS og 0,05 % tween-20, etterfulgt av blokkering med blokkeringsløsning (PBS + 0,05 % tween-20 + 1 % BSA). Platene ble vasket tre ganger og antigener (totale gjærcellelysater fortynnet i blokkeringsløsning til 12,5 ug/ml) ble påsatt i rad A i duplikat. Referansestandarder av rensede HPV58-L1-VLP-er ble påsatt i rad A i kolonne 3 og 4 ved 206 ng/ml i 12,5 ug/ml totalt gjærprotein. Referanse- og testprøvene ble deretter seriefortynnet to ganger ned hver kolonne. Etter tre timer ved romtemperatur ble overskuddet av antigen fjernet ved aspirering og platen ble vasket tre ganger. F4-konformasjonelt spesifikt mAb ble fortynnet i blokkeringsløsning og tilsatt i hver brønn i én time ved romtemperatur. Platene ble vasket tre ganger og et anti-muse-IgG2b-HRP-konjugert antistoff ble fortynnet i blokkeringsløsning og påsatt 1 time ved romtemperatur. Platene ble vasket og TMB (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) ble påsatt i 5 minutter for å påvise HRP-konjugerte antistoffkomplekser. Påvisningsreaksjonen ble stoppet med tilsetningen av 2M H2S04. Plater ble avlest ved 450 nm bølgelengde og konsentrasjonen av HPV58-L1-VLP ble bestemt ved sammenligning med referanse-standardene i ng VLP/u.g totalprotein.
Figur 5 viser en sammenligning av mengden av VLP-er påvist/ug total protein fra gjær som uttrykker HPV58-Ll-wt og HPV58-L1-R fra to separate eksperimenter. HPV58-Ll-VLP-ekspresjonsnivåer økte cirka 2-3 ganger med gjærkodonoptimahsering.
Eksempel 8
Transmisionselektronmikroskopi
For å vise at 58-Ll-proteinet faktisk var selvsammensettende for å danne pentamere Ll-kapsomerer, som i sin tur selvbygges til viruslignende partikler, ble et delvis renset 58-Ll-R-proteinekstrakt utsatt for transmisjonselektronmikroskopi (EM).
Gjær ble dyrket ved småskalafermentering og spunnet til pellet. De resulterende pelletene ble utsatt for rensingsbehandlinger. Pellet og klarede gjær ekstrakter ble analysert ved hjelp av immunoblott for å vise Ll-proteinekspresjon og tilbakeholdelse via renseprosedyren. Klarede gjærekstrakter ble deretter utsatt for sentrifugering over en 45 %-sukrosefase og den resulterende pelleten ble suspendert i buffer for analyse ved hjelp av transmisjons-EM.
Et representativt bilde av 58-Ll-R-VLP-er som ble produsert, er vist i figur 6.
Diameteren til de sfæriske partiklene i denne råprøven lå innenfor 30 til 60 nm, der noen partikler oppviste en regulær sammensetning som kapsomerer.
Claims (17)
1. Nukleinsyremolekyl,
karakterisert vedat det omfatter en sekvens av nukleotider som koder for et HPV58-L1-protein som fremlagt ifølge SEKV. ID. NR.: 2, der nukleinsyresekvensen omfatter en sekvens av nukleotider ifølge SEKV. ID. NR.: 1.
2. Vektor,
karakterisert vedat den omfatter nukleinsyremolekylet ifølge krav 1.
3. Vertscelle,
karakterisert vedat den omfatter vektoren ifølge krav 2.
4. Vertscelle ifølge krav 3, hvor vertscellen er en gjærcelle.
5. Vertscelle ifølge krav 4, hvor gjærcellen er valgt fra gruppen som består av: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis og Schizosaccharomyces pombe.
6. Vertscelle ifølge krav 5, hvor vertscellen er Saccharomyces cerevisiae.
7. Fremgangsmåte for fremstilling av HPV58 LI virusliknende partikler (VLP-er),
karakterisert vedat den omfatter å: (a) transformere gjær med et DNA-molekyl ifølge krav 1, (b) dyrke den transformerte gjæren ved betingelser som tillater ekspresjon av det kodon-optimaliserte DNA-molekylet for å produsere et rekombinant papillomvirusprotein, og (c) isolere det rekombinante papillomvirusproteinet for å fremstille HPV58 LI VLP-ene.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, hvor gjæren er valgt fra gruppen som består av: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis og Schizo saccharomyces pombe
9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvor gjæren er Saccharomyces cerevisiae
10. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for behandling eller forebygging av HPV infeksjoner,
karakterisert vedat nevnte metoder omfatter produksjon av HPV58 L1 VLP-er med fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av kravene 7-8.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, hvor vaksinen ytterligere omfatter VLP-er av minst én ytterligere HPV-type.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, hvor den minst én ytterligere HPV-typen er valgt fra gruppen som består av: HPV6, HPV11, HPV 16, HPV 18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 og HPV68.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, hvor den minst ene HPV-typen omfatter HPV16.
14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, hvor vaksinen ytterligere omfatter HPV18-VLP-er.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, hvor vaksinen ytterligere omfatter HPV6-VLP-er og HP VI 1-VLP-er.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 14 eller 15, hvor vaksinen ytterligere omfatter HPV31-VLP-er.
17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, hvor vaksinen ytterligere omfatter HPV45-VLP-er.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51921103P | 2003-11-12 | 2003-11-12 | |
| PCT/US2004/037372 WO2005047315A2 (en) | 2003-11-12 | 2004-11-10 | Optimized expression of hpv 58 l1 in yeast |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20062674L NO20062674L (no) | 2006-06-09 |
| NO340633B1 true NO340633B1 (no) | 2017-05-15 |
Family
ID=34590374
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20062674A NO340633B1 (no) | 2003-11-12 | 2006-06-09 | Nukleinsyremolekyl som omfatter en sekvens av nukleotider som koder for et HPV58-L1-protein, vektorer og vertsceller, fremgangsmåte for fremstilling av HPV58 L1 virusliknende partikler (VLP-er), samt fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine for behandling eller forebygging av HPV infeksjoner. |
| NO2017058C NO2017058I1 (no) | 2003-11-12 | 2017-11-10 | HPV 58 L1 protein |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO2017058C NO2017058I1 (no) | 2003-11-12 | 2017-11-10 | HPV 58 L1 protein |
Country Status (32)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7498036B2 (no) |
| EP (1) | EP1687329B8 (no) |
| JP (2) | JP4912885B2 (no) |
| KR (1) | KR101170654B1 (no) |
| CN (1) | CN1942583B (no) |
| AR (1) | AR046835A1 (no) |
| AT (1) | ATE452977T1 (no) |
| AU (1) | AU2004290032B2 (no) |
| BE (1) | BE2015C070I2 (no) |
| BR (1) | BRPI0416393B1 (no) |
| CA (1) | CA2543928C (no) |
| CY (2) | CY1113875T1 (no) |
| DE (1) | DE602004024821D1 (no) |
| DK (1) | DK1687329T3 (no) |
| ES (1) | ES2340287T3 (no) |
| FR (1) | FR15C0081I2 (no) |
| HU (1) | HUS1500064I1 (no) |
| IL (1) | IL175353A (no) |
| IS (1) | IS2741B (no) |
| LT (1) | LTC1687329I2 (no) |
| LU (1) | LU92901I2 (no) |
| MY (1) | MY139500A (no) |
| NL (1) | NL300775I2 (no) |
| NO (2) | NO340633B1 (no) |
| NZ (1) | NZ546697A (no) |
| PL (1) | PL1687329T3 (no) |
| PT (1) | PT1687329E (no) |
| RU (1) | RU2370538C2 (no) |
| SI (1) | SI1687329T1 (no) |
| TW (1) | TWI332988B (no) |
| WO (1) | WO2005047315A2 (no) |
| ZA (1) | ZA200603106B (no) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7858098B2 (en) * | 2002-12-20 | 2010-12-28 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Vaccine |
| US8206950B2 (en) * | 2003-06-09 | 2012-06-26 | Animal Technology Institute Taiwan | Fusion antigen used as vaccine and method of making them |
| KR101203403B1 (ko) * | 2004-03-24 | 2012-11-21 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | 효모에서 ｈｐｖ 52 ｌ1의 최적화된 발현 |
| US20070243587A1 (en) * | 2006-04-14 | 2007-10-18 | Healthbanks Biotech Co., Ltd. | Using a reverse genetic engineering platform to produce protein vaccines and protein vaccine of avian influenza virus |
| CN101148661B (zh) * | 2006-09-18 | 2013-01-02 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 人乳头瘤病毒16型外壳蛋白病毒样颗粒及其制备方法和用途 |
| US7709010B2 (en) * | 2007-03-09 | 2010-05-04 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Papillomavirus vaccine compositions |
| BRPI0815818A2 (pt) | 2007-04-29 | 2016-08-02 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Entpr Co Ltd | proteína l1 truncada do papiloma vírus humano tipo 18 |
| WO2008134934A1 (en) | 2007-04-29 | 2008-11-13 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | A truncated l1 protein of human papillomavirus 16 |
| BRPI0810951B8 (pt) * | 2007-05-29 | 2021-05-25 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Entpr Co Ltd | proteína l1 do hpv6, polinucleotídeo, vetor, célula, partícula semelhante ao vírus (vlp) hpv6, método para produzir a proteína hpv6 l1 truncada, vacina para prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por hpv, uso da proteína hpv6 l1 truncada, método para prevenção de condiloma acuminado ou infecções por hpv, método para obter uma vlp de uma proteína l1 do hpv6 e método para produzir uma vacina para a prevenção de condiloma acuminado ou de infecções por hpv |
| CN101113417B (zh) * | 2007-06-22 | 2011-04-27 | 山东大学 | Hpv基因酵母体外翻译系统的建立 |
| CN101200696B (zh) * | 2007-11-14 | 2011-07-20 | 山东大学 | 人乳头瘤病毒的酵母增殖模型及建立方法与应用 |
| CN101835797A (zh) | 2007-11-23 | 2010-09-15 | 上海泽润生物科技有限公司 | 人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白l1基因及其用途 |
| KR20090073987A (ko) * | 2007-12-31 | 2009-07-03 | 정운원 | 인간유두종바이러스 유전자형 검사를 위한 프라이머, 프로브 및 이를 포함하는 ｄｎａ칩, 이의 검사 방법 및 검사 키트 |
| JP5726727B2 (ja) * | 2008-05-26 | 2015-06-03 | カディラ・ヘルスケア・リミテッド | 麻疹−ヒトパピローマ混合ワクチン |
| US9335868B2 (en) * | 2008-07-31 | 2016-05-10 | Apple Inc. | Capacitive sensor behind black mask |
| US9376727B2 (en) | 2010-05-25 | 2016-06-28 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically truncated probes |
| CN101857870B (zh) * | 2010-06-12 | 2012-09-05 | 上海泽润生物科技有限公司 | Hpv58 l1基因及载体、菌株和表达方法 |
| US9382296B2 (en) | 2010-07-16 | 2016-07-05 | Xiamen University | Truncated L1 protein of human papillomavirus type 58 |
| CN102154325B (zh) * | 2011-01-01 | 2013-08-21 | 上海生物制品研究所有限责任公司 | 针对人乳头瘤状病毒的疫苗及其制法和用途 |
| EP2722389B1 (en) * | 2011-06-15 | 2018-03-07 | Hong Jin Kim | Method for enhancing the production yield of human papillomavirus l1 protein |
| CN108624614A (zh) * | 2012-03-28 | 2018-10-09 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv11 l1蛋白的方法 |
| AU2013272283B2 (en) | 2012-06-07 | 2018-02-15 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Controlled gene expression methods |
| CN103992395B (zh) * | 2013-02-18 | 2018-07-27 | 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 | 重组hpv-58型l1的vlp疫苗及其制备方法 |
| CN110423774A (zh) * | 2013-04-26 | 2019-11-08 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv58 l1蛋白的方法 |
| CN104164373B (zh) * | 2013-05-17 | 2019-04-02 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv68l1蛋白的方法 |
| CN104164374B (zh) * | 2013-05-17 | 2019-10-22 | 北京安百胜生物科技有限公司 | 用汉逊酵母表达系统产生hpv31 l1蛋白的方法 |
| CA2927434C (en) | 2013-10-16 | 2022-07-19 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Method of obtaining thermostable dried vaccine formulations |
| CA2958222A1 (en) * | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Cadila Healthcare Limited | Superior human papilloma virus antigens with superior immunological properties and vaccine containing it |
| CN106148359A (zh) * | 2015-03-30 | 2016-11-23 | 上海泽润生物科技有限公司 | 重组人乳头瘤病毒33亚型蛋白表达 |
| CN104878022A (zh) * | 2015-04-27 | 2015-09-02 | 段青姣 | 编码hpv58l1、hpv52l1蛋白的核苷酸序列及其应用 |
| CN106831961B (zh) * | 2015-12-04 | 2019-11-05 | 厦门大学 | 一种人乳头瘤病毒58型l1蛋白的突变体 |
| IL295234A (en) | 2020-02-14 | 2022-10-01 | Merck Sharp & Dohme Llc | HPV vaccine |
| CN113073105B (zh) * | 2021-03-23 | 2023-06-13 | 重庆博唯佰泰生物制药有限公司 | 一种表达hpv 56l1的多核苷酸序列及其表达载体、宿主细胞和应用 |
| CN113549634B (zh) * | 2021-06-07 | 2023-03-31 | 郑州大学 | 编码可溶性hpv58 l1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用 |
| AR126708A1 (es) | 2021-08-06 | 2023-11-08 | Merck Sharp & Dohme Llc | Vacuna para el vph |
| WO2023023152A1 (en) | 2021-08-19 | 2023-02-23 | Merck Sharp & Dohme Llc | Thermostable lipid nanoparticle and methods of use thereof |
| CN117054647A (zh) * | 2023-07-17 | 2023-11-14 | 广东省一鼎生物技术有限公司 | 一种检测HPV IgG抗体试剂盒及其制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001014416A2 (en) * | 1999-08-25 | 2001-03-01 | Merck & Co., Inc. | Synthetic papillomavirus genes optimized for expression in human cells |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL117591A0 (en) * | 1995-03-30 | 1996-07-23 | Merck & Co Inc | Synthetic DNA encoding human papillomavirus type 11 L1 protein |
| US5821087A (en) * | 1995-03-30 | 1998-10-13 | Merck & Co., Inc. | Production of recombinant human papillomavirus type II protein utilizing papillomavirus 6/11 hybrid DNA |
| PL335050A1 (en) | 1997-02-07 | 2000-03-27 | Merck & Co Inc | Synthetic genes gag hiv |
| JP4434479B2 (ja) | 1997-07-09 | 2010-03-17 | ザ・ユニバーシティ・オブ・クイーンズランド | 標的の細胞および組織においてタンパク質を選択的に発現するための核酸配列および方法 |
| ES2275350T3 (es) | 1998-08-14 | 2007-06-01 | MERCK & CO., INC. | Sistema de administracion de proteinas usando particulas de tipo virus de papilomavirus humano. |
| EA200100236A1 (ru) * | 1998-08-14 | 2001-08-27 | Мерк Энд Ко., Инк. | Способ очистки вирусных частиц, подобных вирусу папилломы человека |
| SE514982C2 (sv) * | 1999-09-30 | 2001-05-28 | Active Biotech Ab | Bärare innehållande ett huvudkapsidprotein L1 från humant papillomavirus samt dess användning |
| US6436402B1 (en) | 1999-10-15 | 2002-08-20 | Merck & Co., Inc. | Process for making human papillomavirus virus-like particles with improved properties |
| US7026443B1 (en) * | 1999-12-10 | 2006-04-11 | Epimmune Inc. | Inducing cellular immune responses to human Papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions |
| PL365385A1 (en) | 2000-07-21 | 2005-01-10 | Glaxo Group Limited | Codon-optimized papilloma virus sequences |
| AU2003217413A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-09-04 | Novavax, Inc. | Method for isolation and purification of expressed gene products in vitro |
| ES2381964T3 (es) * | 2003-03-24 | 2012-06-04 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Expresión optimizada de L1 de VPH 31 en levadura |
| MY140664A (en) * | 2003-09-29 | 2010-01-15 | Merck Sharp & Dohme | Optimized expression of hpv 45 l1 in yeast |
-
2004
- 2004-11-09 MY MYPI20044678A patent/MY139500A/en unknown
- 2004-11-10 NZ NZ546697A patent/NZ546697A/en unknown
- 2004-11-10 PT PT04810619T patent/PT1687329E/pt unknown
- 2004-11-10 WO PCT/US2004/037372 patent/WO2005047315A2/en active Application Filing
- 2004-11-10 BR BRPI0416393-1A patent/BRPI0416393B1/pt active IP Right Grant
- 2004-11-10 AU AU2004290032A patent/AU2004290032B2/en active Active
- 2004-11-10 PL PL04810619T patent/PL1687329T3/pl unknown
- 2004-11-10 DK DK04810619.9T patent/DK1687329T3/da active
- 2004-11-10 JP JP2006539751A patent/JP4912885B2/ja active Active
- 2004-11-10 KR KR1020067009199A patent/KR101170654B1/ko active Protection Beyond IP Right Term
- 2004-11-10 AT AT04810619T patent/ATE452977T1/de active
- 2004-11-10 CA CA2543928A patent/CA2543928C/en active Active
- 2004-11-10 SI SI200431328T patent/SI1687329T1/sl unknown
- 2004-11-10 US US10/579,111 patent/US7498036B2/en active Active
- 2004-11-10 AR ARP040104141A patent/AR046835A1/es active IP Right Grant
- 2004-11-10 EP EP04810619A patent/EP1687329B8/en active Active
- 2004-11-10 RU RU2006120402/13A patent/RU2370538C2/ru active
- 2004-11-10 DE DE602004024821T patent/DE602004024821D1/de active Active
- 2004-11-10 ES ES04810619T patent/ES2340287T3/es active Active
- 2004-11-10 CN CN2004800332355A patent/CN1942583B/zh active Active
- 2004-11-11 TW TW093134524A patent/TWI332988B/zh active
-
2006
- 2006-04-19 ZA ZA200603106A patent/ZA200603106B/en unknown
- 2006-04-21 IS IS8425A patent/IS2741B/is unknown
- 2006-05-01 IL IL175353A patent/IL175353A/en active IP Right Grant
- 2006-06-09 NO NO20062674A patent/NO340633B1/no active Protection Beyond IP Right Term
-
2009
- 2009-01-26 US US12/321,797 patent/US7976848B2/en active Active
-
2010
- 2010-03-19 CY CY20101100258T patent/CY1113875T1/el unknown
-
2011
- 2011-12-08 JP JP2011268598A patent/JP5616879B2/ja active Active
-
2015
- 2015-11-30 NL NL300775C patent/NL300775I2/nl unknown
- 2015-12-02 HU HUS1500064C patent/HUS1500064I1/hu unknown
- 2015-12-04 FR FR15C0081C patent/FR15C0081I2/fr active Active
- 2015-12-07 CY CY2015051C patent/CY2015051I2/el unknown
- 2015-12-08 LT LTPA2015048C patent/LTC1687329I2/lt unknown
- 2015-12-08 LU LU92901C patent/LU92901I2/xx unknown
- 2015-12-09 BE BE2015C070C patent/BE2015C070I2/nl unknown
-
2017
- 2017-11-10 NO NO2017058C patent/NO2017058I1/no unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001014416A2 (en) * | 1999-08-25 | 2001-03-01 | Merck & Co., Inc. | Synthetic papillomavirus genes optimized for expression in human cells |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TOBERY T.W. et al., Effect of vaccine delivery system on the induction of HPV16L1 specific humoral and cell-mediated immune responses in immunized rhesus macacaques, Vaccine, 2003, vol. 21 (13-14), side 1539-1546, Dated: 01.01.0001 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1687329B1 (en) | Optimized expression of hpv 58 l1 in yeast | |
| EP1730175B1 (en) | Optimized expression of hpv 52 l1 in yeast | |
| US7482015B2 (en) | Optimized expression of HPV 45 L1 in yeast | |
| MXPA06005306A (en) | Optimized expression of hpv 58 l1 in yeast | |
| MXPA06010983A (en) | Optimized expression of hpv 52 l1 in yeast |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| SPCF | Filing of supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: HPV 58 L1 PROTEIN; NAT. REG. NO/DATE: EU/1/15/1007/001-3NO 20150618; FIRST REG. NO/DATE: EU/1/15/1007/1001-3 20150612 Spc suppl protection certif: 2017058 Filing date: 20171110 |
|
| SPCG | Granted supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: HPV 58 L1 PROTEIN; NAT. REG. NO/DATE: EU/1/15/1007/001-3NO 20150618; FIRST REG. NO/DATE: EU/1/15/1007/1001-3 20150612 Spc suppl protection certif: 2017058 Filing date: 20171110 Extension date: 20291110 |
|
| CHAD | Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften) |
Owner name: MERCK SHARP & DOHME LLC, US |
|
| SPCF | Filing of supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: HPV 58L1 PROTEIN - FORLENGET SPC; REG. NO/DATE: EU/1/15/1007/001-3NO 20150618 Spc suppl protection certif: 2022052 Filing date: 20221130 |