KR101170654B1 - 효모에서의 ｈｐｖ 58 ｌ1의 최적화된 발현 - Google Patents

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Abstract

HPV58 L1 단백질을 암호화하는 합성 DNA 분자가 제공된다. 구체적으로, 본 발명은 효모 세포에서의 고수준 발현을 위해 코돈-최적화된, HPV58 L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 당해 합성 분자를 사용하여 HPV58 바이러스-유사 입자(VLP)를 생산하고, HPV58 VLP를 포함하는 백신 및 약제학적 조성물을 생산할 수 있다. 본 발명의 백신은 중화 항체 및 세포 매개성 면역을 통해서 파필로마바이러스 감염에 대한 효과적 면역예방을 제공하고, 또한 기존의 HPV 감염 치료에도 유용하다.
HPV58 L1 단백질, 바이러스-유사 입자, 코돈-최적화

Description

효모에서의 ＨＰＶ 58 Ｌ1의 최적화된 발현{Optimized expression of HPV58 L1 in yeast}
본 발명은 일반적으로 사람 파필로마바이러스(HPV) 감염의 예방 및/또는 치료요법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오타이드 및 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터 및 숙주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 HPV58 L1 또는 L1 + L2를 효모 세포에서 발현시켜 생산되는 HPV58 바이러스-유사 입자(VLP) 및 HPV 감염을 예방 및 치료하기 위한 백신 및 약제학적 조성물에서의 이의 용도에 관한 것이다.
80가지를 초과하는 유형의 사람 파필로마바이러스(HPV)가 있으며, 이중 대다수는 양성 증식성 사마귀부터 악성 암종에 이르는 광범위한 생물학적 표현형과 연루되었다[참조: McMurray et al., Int. J. Exp. Pathol. 82(1):15-33(2001)]. HPV6 및 HPV11은 생식기 또는 호흡기 점막의 양성 사마귀, 비악성 첨형콘딜로마 및/또는 저등급 이형증과 가장 흔하게 연루되는 유형이다. HPV16 및 HPV18은 자궁경부, 질, 외음 및 항문관의 원위치(in situ) 및 침습성 암종과 가장 빈번하게 연루되는 고위험 유형이다. 90%를 초과하는 자궁경부 암종은 HPV16, HPV18 또는 덜 우세한 발암성 유형 HPV31, -33, -45, -52 및 -58의 감염과 연루된다[참조: Schiffman et al., J. Natl. Cancer Inst. 85 (12): 958-64 (1993)]. HPV DNA가 90%를 초과하는 자궁경부 암에서 검출된다는 관찰결과는, HPV가 자궁경부 암종을 유발한다는 강력한 역학적 증거를 제공한다.
파필로마바이러스는 8개 이하의 초기 유전자(early gene)와 2개의 후기 유전자(late gene)를 암호화하는 소형의(50 내지 60nm) 비외피 20면체 DNA 바이러스이다. 바이러스 게놈의 오픈 리딩 프레임(open reading frame; ORF)은 E1 내지 E7, 및 L1 및 L2로 지정되어 있으며, 이때 "E"는 초기를 나타내고 "L"은 후기를 나타낸다. L1 및 L2는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하는 반면, E 유전자는 바이러스 복제 및 세포 형질전환과 같은 기능과 관련된다.
L1 단백질은 주요 캡시드 단백질로서 분자량이 55 내지 60kDa이다. L2 단백질은 부수적 캡시드 단백질이다. 면역학적 데이타는, 대부분의 L2 단백질이 바이러스 캡시드내에서 L1 단백질보다 내부에 있음을 제시한다. L1 및 L2 단백질은 둘다 상이한 파필로마바이러스들 간에 고도로 보존되어 있다.
효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 세균 세포내에서 L1 단백질 또는 L1과 L2 단백질의 배합물의 발현은 바이러스-유사 입자(VLP)의 자가-어셈블리를 유도한다[참조: Schiller and Roden, in Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)]. VLP는 형태학적으로 진성 비리온(authentic virion)과 유사하며 동물 또는 사람에게 투여시 고역가의 중화 항체를 유도할 수 있다. VLP가 잠재적 발암성 바이러스 게놈을 함유하지 않기 때문에, VLP는 HPV 백신 개발에 있어 생 바이러스의 사용에 대한 안전한 대안책으로서 제시되고 있다[참조: Schiller and Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)]. 이러한 이유로, L1 및 L2 유전자는 HPV 감염 및 질병의 예방 및 치료 백신의 개발을 위한 면역학적 표적으로서 동정되었다.
HPV 백신 개발 및 상품화는 성공적으로 형질전환된 숙주 유기체에서 캡시드 단백질의 고발현 수준을 수득하는 것과 연관된 곤란함에 의해 방해되었는데, 이러한 곤란함은 정제된 단백질의 생산을 제한한다. 따라서, HPV58 L1 단백질과 같은 HPV L1 단백질을 암호화하는 야생형 뉴클레오타이드 서열의 동정에도 불구하고, 의도하는 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 HPV58 L1-암호화 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 용이하게 재생가능한 조(粗) HPV L1 단백질 공급원을 개발하는 것이 매우 요망된다. 또한, 백신 개발시 사용하기 위한 천연 단백질의 면역-부여 특성을 갖는 HPV58 L1 VLP를 대량으로 제조하는 것이 유용할 것이다.
발명의 개요
본 발명은 HPV58 L1 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성물에 대한 면역을 유도하거나 증진시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 효모 세포에서의 고수준 발현을 위해 코돈-최적화된(codon-optimized), HPV58 L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 추가로 효모 세포 에서 재조합 HPV58 L1 또는 L1 + L2를 발현시킴으로써 생산되는 HPV58 바이러스-유사 입자(VLP)를 제공하며, HPV-관련 암의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물 및 백신에서의 HPV58 VLP의 용도를 개시한다.
본 발명은 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 합성 DNA 분자에 관한 것이다. 상기 합성 분자의 코돈은, 효모 세포가 선호하는 코돈을 사용하도록 고안된다. 상기 합성 분자는 VLP로 자가-어셈블리될 수 있는 HPV58 L1 단백질 공급원으로서 사용될 수 있다. 이러한 VLP는 VLP-기본 백신에서 사용될 수 있다.
본 발명의 예시적 양태는 서열번호 2에 제시한 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 합성 핵산 분자를 포함하며, 상기 핵산 분자는 효모 세포에서 높은 수준의 발현을 위해 최적화된 코돈인 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 핵산 분자는 서열번호 1에 제시한 뉴클레오타이드 서열(본원에서 "58 L1 R 서열"로 명칭됨)을 포함한다.
본 명세서 전반에 걸쳐서 기술되는 핵산 분자를 함유하는 원핵성 및 진핵성 재조합 벡터 및 재조합 숙주 세포가 또한 제공된다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 효모 세포이다.
본 발명은 또한 (a) HPV58 L1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) 상기 효모 숙주 세포를 상기 HPV58 L1 단백질이 발현되도록 하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하여, 재조합 숙주 세포에서 HPV58 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, (a) 핵산 분자가 효모 숙주 세포에서의 최적 발현을 위해 코돈-최적화된, HPV58 L1 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) 상기 효모 숙주 세포를 상기 HPV58 L1 단백질이 발현되도록 하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하여, 재조합 숙주 세포에서 HPV58 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면의 바람직한 양태에서, 당해 핵산은 서열번호 1에 제시한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 효모 세포에서 생산되는 HPV58 바이러스-유사 입자(VLP), HPV58 VLP의 제조 방법 및 HPV58 VLP의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면은 효모 세포에서 HPV58 L1 또는 HPV58 L1 + L2의 재조합 발현에 의해 생산되는 HPV58 VLP이다.
본 발명의 또 다른 측면은 코돈-최적화된 HPV58 L1 유전자에 의해 제조되는 HPV58 L1 단백질을 포함하는 HPV58 VLP이다. 본 발명의 상기 측면의 예시적 양태에서, 코돈 최적화된 HPV58 L1 유전자는 서열번호 1에 제시한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 HPV58 바이러스-유사 입자를 동물에게 투여함을 포함하여, 동물에서 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, HPV58 VLP는 코돈-최적화된 유전자에 의해 생산된다.
본 발명의 또 다른 측면은 HPV58 VLP를 포함하는 백신을 포유동물에게 투여함을 포함하는, HPV-관련 자궁경부 암의 예방 또는 치료 방법이다. 본 발명의 상기 측면의 바람직한 양태에서, HPV58 VLP는 효모에서 생산된다.
본 발명은 또한 효모에서 생산되는 HPV58 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하는 백신에 관한 것이다.
본 발명의 상기 측면의 대안적 양태에서, 당해 백신은 하나 이상의 추가 HPV 유형의 VLP를 또한 포함한다. 하나 이상의 추가 HPV 유형은 당해 분야에 기술되어 있는 임의의 HPV 유형 또는 후속적으로 동정될 유형을 포함하여 관심대상의 임의의 HPV 유형일 수 있다. 바람직한 양태에서, HPV 유형은 사마귀 또는 자궁경부 암과 같은 임상 표현형과 연루된 유형이다. 추가의 바람직한 양태에서, 하나 이상의 추가 HPV 유형은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 효모에서 생산되는 HPV58 바이러스-유사 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HPV58 VLP 및 하나 이상의 추가 HPV 유형의 VLP를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 추가 HPV 유형은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용된 가산명사의 단수 형태가 문맥상 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다.
본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 바와 같이, 다음 정의 및 약어가 적용된다:
"프로모터"란 용어는 RNA 폴리머라제가 결합되는 DNA 쇄상의 인식 부위를 의미한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제와 개시 복합체를 형성하여 전사 활성을 개시하고 구동시킨다. 상기 복합체는 "인핸서(enhancer)" 또는 "상류 활성화(upstream activating) 서열"이라 명명된 활성화 서열 또는 "사일런서(silencer)"라 명명된 억제 서열에 의해 변형될 수 있다.
"벡터"란 용어는 DNA 단편을 숙주 유기체 또는 숙주 조직으로 도입시킬 수 있는 몇가지 수단을 의미한다. 플라스미드, 바이러스(아데노바이러스 포함), 박테리오파아지 및 코스미드를 포함하는 다양한 종류의 벡터가 있다.
"카세트"란 용어는 벡터로부터 발현될 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열, 예를 들어 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열을 나타낸다. 일반적으로, 카세트는 벡터내로 삽입된 유전자 서열을 포함하고, 이는, 몇몇 양태에서 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열을 발현하기 위한 조절 서열을 제공한다. 다른 양태에서, 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열은 이의 발현을 위해 조절 서열을 제공한다. 추가의 양태에서, 벡터는 몇몇 조절 서열을 제공하고, 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열은 다른 조절 서열을 제공한다. 예를 들면, 벡터는 뉴클레오타이드 또는 유전자 서열을 전사하기 위한 프로모터를 제공할 수 있고, 뉴클레 오타이드 또는 유전자 서열은 전사 종결 서열을 제공한다. 벡터에 의해 제공될 수 있는 조절 서열은 인핸서, 전사 종결 서열, 스플라이싱 수용체 및 공여체 서열, 인트론, 리보솜 결합 서열 및 폴리(A) 부가 서열을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
"58 L1 야생형 서열" 및 "58 L1 wt 서열"이란 명칭은 본원에서 서열번호 3으로서 개시된 HPV58 L1 서열을 의미한다. HPV58 L1 야생형 서열이 이전에 기술되었으나, 임상적 분리체로부터 수득된 DNA들 간에 근소한 서열 변이가 발견되는 것은 통상적이다. 따라서, 대표적 58 L1 야생형 서열은 이미 HPV58 DNA를 함유하는 것으로 보여진 임상 샘플로부터 분리되었다(실시예 1 참조). 본원에서 기술하는 코돈-최적화된 58 L1 서열들을 비교하기 위해 58 L1 야생형 서열을 참조 서열로서 사용하였다(도 1 참조).
"HPV58 L1 R" 또는 "58 L1 R"이란 명칭은 본원에 기술된 예시적 합성 HPV58 L1 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1)을 의미하며, 이때 당해 서열은 고수준 발현을 위해 효모 세포가 선호하는 코돈을 포함하도록 재구성되었다.
"유효량"이란 용어는 충분한 백신 조성물이 도입되어 면역반응이 야기되기에 적절한 수준의 폴리펩타이드를 생산함을 의미한다. 당해 분야의 숙련가는 상기 수준이 달라질 수 있음을 인지하고 있다.
"보존적 아미노산 치환"이란 1개의 아미노산 잔기의 또 다른 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로의 대체를 의미한다. 이러한 보존적 치환의 예로는 1개의 소수성 잔기(이소류신, 류신, 발린 또는 메티오닌)의 다른 잔기로의 치환; 1개의 극 성 잔기의 동일한 전하의 다른 극성 잔기로의 치환(예를 들어, 아르기닌의 라이신으로의 치환; 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환)이 있다.
"포유동물"이란 용어는 사람을 포함하는 모든 포유동물을 의미한다.
"VLP" 또는 "VLP들"은 바이러스-유사 입자 또는 바이러스-유사 입자들을 의미한다.
"합성"은, HPV58 L1 유전자가 지정된 천연 야생형 HPV58 L1 유전자(58 L1 wt, 서열번호 3)에 존재하는 뉴클레오타이드 서열과 동일하지 않은 뉴클레오타이드 서열을 함유하도록 생성되었음을 의미한다. 상기 언급한 바와 같이, 발현을 위해 효모 세포가 선호하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 합성 분자가 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 합성 분자는 야생형 HPV58 L1 유전자와 동일한 아미노산 서열(서열번호 2)을 암호화한다.
도 1은 본 발명의 합성 HPV58 L1 유전자(서열번호 1, "58 L1 R"로 나타냄)에서 변경된 뉴클레오타이드를 포함하는 서열 배열이다(실시예 2 참조). 참조 서열은 58 L1 야생형 서열(서열번호 3, "58 L1 wt"로 나타냄; 실시예 1 참조)이다. 변경된 뉴클레오타이드는 이의 해당 위치에 나타낸다. 뉴클레오타이드 번호는 괄호안에 포함된다. 58 L1 재구성 서열내의 동일한 뉴클레오타이드는 점(.)으로 나타낸다.
도 2는 재구성 합성 HPV58 L1 이본쇄 핵산 및 상기 단일-코드 아미노산 서열 을 도시한 것이다. 뉴클레오타이드 번호는 좌측에 나타낸다.
도 3은 HPV58 L1 wt 및 58 L1 R 전사체의 노던 블롯을 나타낸다(실시예 4 참조). 블롯을 동량의 DIG-표지된 58L1 wt 및 58 L1 R DNA 프로브의 칵테일로 프로브하였다. 레인당 전기영동된 전체 RNA의 양을 제시하고 있다. 우측의 화살표는 전체길이 58 L1 전사체의 예측되는 크기를 나타낸다.
도 4는 HPV58 Ll wt(58) 및 58 L1 R(58 R) 단백질의 웨스턴 블롯을 나타낸다. HPV 16 L1은 참조(16)로서 포함되었다. 10㎍, 5㎍ 및 2.5㎍의 전체 효모 단백질 추출물을 변성시키고, 10% SDS-PAGE 겔에 적용시켰다. 58L1 및 16 L1과 교차-반응하는, 효모-흡착된 항-trpE-HPV 31 L1 염소 폴리클로날 항-혈청을 사용하여 HPV58 L1 단백질을 검출하였다. 분자량 표시는 좌측상에 kDa으로 제시된다.
도 5는 ELISA에서 포획되고 검출된 전체 효모 단백질의 ㎍당 완전(intact) HPV58L1 VLP의 양(ng)을 도시한 것이다(실시예 7 참조). 이중으로 수행된 2회의 실험 결과가 포함된다. HPV58 L1 wt의 VLP 발현량(검정색 및 회색 박스)은 전체 효모 단백질 ㎍당 36ng이었다. 재구성 효모-코돈 최적화된 58L1인 HPV58 L1 R의 VLP 발현량(백색 및 평행선으로 그려진 박스)은 HPV58 L1 wt 발현량보다 약 2 내지 3배 높았으며, 2번째 실험에서 전체 효모 단백질 ㎍당 95ng에 이르렀다.
도 6은 투과 전자현미경으로 가시화된, 본원에서 기술하는 HPV58 L1 R 단백질 분자로 이루어진 HPV58 VLP의 대표적 샘플을 나타낸다(실시예 8 참조). 막대는 약 100nm을 나타낸다.
대다수의 자궁경부 암종은 특정한 발암성 사람 파필로마바이러스(HPV)의 감염과 연루된다. 본 발명은 발암성 HPV 유형의 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성물에 대한 면역을 유도하거나 증진시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 HPV58 L1을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 이때, 폴리뉴클레오타이드는 효모에서 고수준 발현을 위해 코돈-최적화된다. 또한, 본 발명은 효모에서 생산된 HPV58 바이러스-유사 입자(VLP)를 제공하고, HPV-관련 암의 예방 및/또는 치료용 약제학적 조성물 및 백신에서 상기 폴리뉴클레오타이드 및 VLP의 용도를 개시한다.
야생형 HPV58 L1 뉴클레오타이드 서열은 보고된 바 있다[진뱅크(Genbank) 승인 번호 NC_001443; 참조: Kirii et al. Virology 185(1): 424-427 (1991)]. 본 발명은 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 합성 DNA 분자를 제공한다. 본 발명의 합성 분자는 적어도 코돈의 일부분이 고수준 발현을 위해 효모 세포가 선호하는 코돈을 사용하도록 변경된 코돈의 서열을 포함한다. 당해 합성 분자는 VLP로 자가-어셈블리될 수 있는 HPV58 L1 단백질의 발현을 위한 암호화 서열로서 사용될 수 있다. 상기 VLP는 VLP-기본 백신에서 사용되어, 중화 항체 및 세포 매개성 면역을 통해서 파필로마바이러스 감염에 대한 효과적 면역예방을 제공할 수 있다.
효모 세포에서의 HPV VLP의 발현은 비용 효율적이며 발효조내에서의 대규모 성장에 쉽게 적합화시킬 수 있다는 이점을 제공한다. 또한, 효모 게놈을 용이하게 변형시켜 성장 및 발현능이 증가된 재조합의 형질전환된 효모를 확실하게 선별할 수 있다. 그러나, HPV58 L1을 포함하는 많은 HPV L1 단백질은 상업적 규모 확대를 위해 바람직한 수준보다 낮은 수준으로 효모 세포에서 발현된다.
따라서, 본 발명은 효모 세포 환경에서 고수준 발현을 위해 "최적화된" HPV58 L1 유전자 서열에 관한 것이다.
4개의 가능한 뉴클레오타이드 염기의 "트리플렛(triplet)" 코돈은 60개 이상의 변이체 형태로 존재할 수 있다. 이러한 코돈들이 단지 20개의 상이한 아미노산(뿐만 아니라 전사 개시 및 종결)에 대한 메세지만을 제공하기 때문에, 일부 아미노산은 1개 이상의 코돈에 의해 암호될 수 있으며, 이러한 현상은 코돈 과잉(codon redundancy)으로서 공지되어 있다. 그 이유가 완전히 이해되지 않았지만, 대안적 코돈은 상이한 유형의 세포의 내인성 DNA내에 균일하게 존재하지 않는다. 게다가, 특정 유형의 세포에는 특정 코돈에 대한 가변적 천연의 계층제(hierarchy) 또는 "선호도"가 존재하는 것으로 보인다. 한 예로서, 아미노산 류신은 CTA, CTC, CTG, CTT, TTA 및 TTG를 포함하는 6개의 DNA 코돈 중 어느 하나에 의해 규정된다. 미생물에 대한 게놈 코돈 사용 빈도의 총체적 분석으로, 이. 콜라이의 내인성 DNA는 가장 통상적으로 CTG 류신-규정 코돈을 함유하는 반면에, 효모 및 점균류의 DNA는 가장 통상적으로 TTA 류신-규정 코돈을 포함한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 계층제의 견지에서, 이. 콜라이 숙주에 의한 류신-풍부 폴리펩타이드의 고수준 발현을 수득할 가능성은 코돈 사용의 빈도에 어느 정도 의존할 것으로 일반적으로 사료되고 있다. 예를 들어, TTA 코돈이 풍부한 유전자는 이. 콜라이에서 불충분하게 발현되는 반면에, CTG 풍부 유전자는 상기 숙주에서 고도로 발현될 수 있다. 마찬가지로, 효모 숙주 세포에서의 류신-풍부 폴리펩타이드의 발현을 위해 선호되는 코돈은 TTA일 것이다.
재조합 DNA 기법에 미치는 코돈 선호 현상의 영향은 명백하며, 이 현상은 성공적으로 형질전환된 숙주 유기체에서 외인성 유전자의 고수준 발현을 성취하지 못한 많은 이전의 실패를 설명할 수 있다 - 삽입된 유전자내에 덜 "선호되는" 코돈이 반복적으로 존재할 수 있어 발현을 위한 숙주 세포 기구가 효과적으로 작동할 수 없다. 이러한 현상은 예측된 숙주 세포의 선호되는 코돈을 포함하도록 고안된 합성 유전자가 재조합 단백질 발현을 위한 최적 형태의 외래 유전자 물질을 제공함을 제시한다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 효모 세포에서의 고수준 발현을 위해 코돈-최적화된 HPV58 L1 유전자이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 동일한 단백질 서열을 암호화하는 대안적 코돈의 사용은 효모 세포에 의한 HPV58 L1 단백질의 발현에 대한 제약을 해소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따라서, HPV58 L1 유전자 절편을, 문헌[참조; Sharp and Cowe, Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 657-678 (1991); 이는 본원에서 참조로 인용된다]에 기술된 바와 같은, 대안적 코돈 용법을 제외하고는 동일한 해독된 서열을 갖는 서열로 전환시켰다. 당해 방법은 일반적으로 고도로 발현되는 효모 유전자와 통상적으로 관련되지 않는 야생형 서열의 코돈을 확인하고, 이 코돈을 효모 세포에서의 고 발현을 위한 최적의 코돈으로 치환시키는 것으로 이루어진다. 이어서, 신규 유전자 서열은 이러한 코돈 치환에 의해 생성된 목적하지 않는 서열(예를 들어, "ATTTA"서열, 인트론 스플라이싱 인식 부위의 우연한 생성, 원치않는 제한 효소 부위, 높은 GC 함량, 효모에 의해 인식되는 전사 종결 시그날의 존재 등)이 있는지에 대해 조사한다. 목적하지 않는 서열은 기존의 코돈을 동일한 아미노산을 암호화하는 다른 코돈으로 치환시켜 제거한다. 이어서, 합성 유전자 절편을 개선된 발현에 대해 시험한다.
상기한 방법을 사용하여 HPV58 L1에 대한 합성 유전자 절편을 생성하여 고수준 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 유전자를 수득하였다. 상기한 방법이 HPV 백신에서 사용하기 위해 코돈-최적화된 유전자를 고안하는 본 발명의 방법론의 개요를 제공하지만, 당해 분야의 숙련가는 당해 방법의 약간의 변화 또는 당해 순서의 약간의 변화에 의해서 유사한 백신 효능 또는 유전자의 증가된 발현이 성취될 수 있음을 이해하고 있다.
따라서, 본 발명은 HPV58 L1 단백질 또는 HPV58 L1 단백질의 생물학적 활성 단편 또는 돌연변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 합성 폴리뉴클레오타이드에 관한 것으로, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 효모 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함한다. 상기 HPV58 L1 단백질의 돌연변이체 형태는 보존적 아미노산 치환, 아미노-말단 절두(truncation), 카복시-말단 절두, 결실 또는 첨가를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 어떠한 생물학적 활성 단편 및/또는 돌연변이체라도 서열번호 2에 제시한 HPV58 L1 단백질의 면역학적 특성을 적어도 실질적으로 모사하는 단백질 또는 단백질 단편을 암호화할 것이다. 본 발명의 합성 폴리뉴클레오타이드는 치료용 또는 예방용 HPV 백신의 개발시 유용하도록 기능적 HPV58 L1 단백질을 발현하는 mRNA 분자를 암호화한다.
본 발명의 한 측면은 서열번호 2에 제시한 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 핵산 분자이며, 당해 핵산 분자는 서열번호 1에 제시한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서 전반에 걸쳐서 개시되는 핵산 분자를 함유하는 재조합 벡터 및 원핵성 및 진핵성 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다.
본원에서 기술하는 방법을 통해서 작제된 합성 HPV58 DNA 또는 이의 단편은 적합한 프로모터와 기타 적절한 전사 조절 요소를 함유하는 발현 벡터로의 분자적 클로닝에 의해 재조합적으로 발현되고 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포로 전달되어 재조합 HPV58 L1을 생산할 수 있다. 이러한 조작 기법은 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York (1988); Yeast Genetics : A Laboratory Course Manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1990); 이는 전문이 본원에서 참조로 인용된다]에 충분히 기술되어 있다.
따라서, 본 발명은 (a) HPV58 L1 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) 상기 효모 숙주 세포를 상기 HPV58 L1 단백질이 발현되도록 하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 재조합 숙주 세포에서 HPV58 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 (a) 효모 숙주 세포에서의 최적 발현을 위해 코돈-최적화된, HPV58 L1 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) 상기 효모 숙주 세포를 상기 HPV58 L1 단백질이 발현되도록 하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하여, HPV58 L1 단백질을 재조합 숙주 세포에서 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 (a) 서열번호 1에 제시한 핵산을 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포로 도입시키는 단계; 및 (b) 상기 효모 숙주 세포를 상기 HPV58 L1 단백질이 발현되도록 하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하여, HPV58 L1 단백질을 재조합 숙주 세포에서 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 합성 유전자는 숙주 세포에서 HPV58 L1 단백질의 효과적 발현을 제공하도록 고안된 서열을 포함하는 발현 카세트로 어셈블리될 수 있다. 당해 카세트는 바람직하게는 프로모터 및 종결 서열과 같은 관련 전사 및 해독 조절 서열이 작동적으로 연결된 합성 유전자를 함유한다. 당해 분야의 숙련가가 GAL10, GAL7, ADH1, TDH3 또는 PGK 프로모터와 같은 수많은 다른 공지된 효모 프로모터 중 어느 하나 또는 다른 진핵성 유전자 프로모터가 사용될 수 있음을 인지하겠지만, 바람직한 양태에서 프로모터는 에스. 세레비지애 GAL1 프로모터이다. 다른 공지된 전사 종결자가 또한 사용될 수 있지만, 바람직한 전사 종결자는 에스. 세레비지애 ADHI 종결자이다. GAL1 프로모터-ADH1 종결자의 조합이 특히 바람직하다.
또한, 본 발명은 서열번호 2에 제시한 아미노산 서열을 포함하는, 분리되고 정제된 HPV58L1 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 HPV58 L1 또는 L1 + L2 유전자를 효모 세포에서 재조합적으로 발현시켜 생산되는 HPV58 바이러스-유사 입자(VLP), HPV58 VLP의 생산방법 및 HPV58 VLP의 사용 방법이다. VLP는 사람 및 동물 파필로마바이러스의 주요 캡시드 단백질인 L1이 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 세균에서 발현되는 경우 자가-어셈블리될 수 있다[참조: Schiller and Roden, in Papillomavirus Reviews : Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK : Leeds Medical Information, pp 101-12(1996)]. 형태학적으로 구별할 수 없는 HPV VLP도 L1 및 L2 캡시드 단백질의 배합물을 발현시켜 생산할 수 있다. VLP는 T=7 20면체 구조의 72개의 L1 5량체로 이루어진다[참조: Baker et al., Bioplzys. J. 60 (6): 1445-56 (1991)].
VLP는 형태학적으로 진성 비리온과 유사하며 동물에게 투여시 고 역가의 중화 항체를 유도할 수 있다. 래빗[참조: Breitburd et al., J. Virol. 69 (6): 3959-63(1995)] 및 개[참조: Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (25): 11553- 57 (1995)]를 VLP로 면역화시키는 것은 중화 항체를 유도할 뿐 아니라 실험적 파필로마바이러스 감염으로부터 보호하는 것으로 나타났다. 그러나, VLP가 잠재적 발암성 바이러스 게놈을 함유하지 않고, 단일 유전자로부터 발현되는 경우에 자가-어셈블리될 수 있기 때문에, VLP는 HPV 백신 개발시 생 바이러스의 사용에 대한 안전한 대안책으로서 제시되고 있다[참조: Schiller and Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)].
따라서, 본 발명은 HPV58의 재조합 L1 단백질 또는 재조합 L1 + L2 단백질로 이루어진 바이러스-유사 입자에 관한 것으로, 이러한 재조합 단백질은 효모 세포에서 발현된다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 바람직한 양태에서 HPV58 VLP는 효모에서 생산된다. 본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지애, 한세눌라 폴리모르파, 피치아 파스토리스, 클루이베로마이세스 프라길리스, 클루이베로마이세스 락티스 및 쉬조사카로마이세스 폼베로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 측면은 코돈-최적화된 HPV58 L1 유전자에 의해 생산된 HPV58 L1 단백질을 포함하는 HPV58 VLP이다. 본 발명의 상기 측면의 바람직한 양태에서, 코돈-최적화된 HPV58 L1 유전자는 서열번호 1에 제시한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 효모 세포를 HPV58 L1 단백질 또는 HPV58 L1 + L2 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자로 형질전환시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 효모를 재조합 DNA 분자가 발현되도록 하는 조건하에 배양하여 재조합 HPV58 단백질을 생산하는 단계; 및 (c) 재조합 HPV58 단백질을 분리시켜 HPV58 VLP를 생산하는 단계를 포함하는, HPV58 VLP의 생산 방법이다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 양태에서, 효모는 HPV58 VLP를 생산하기 위해 코돈-최적화된 HPV58L1 유전자로 형질전환된다. 특히 바람직한 양태에서, 코돈-최적화된 HPV58 L1 유전자는 서열번호 1에 제시한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 HPV58 바이러스-유사 입자를 동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 동물에서 면역반응을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, HPV58 VLP는 코돈-최적화된 유전자에 의해 생산된다.
본 발명의 또 다른 측면은 HPV58 VLP를 포함하는 백신을 포유동물에게 투여함을 포함하는, HPV-관련 자궁경부 암의 치료 또는 예방 방법이다. 본 발명의 상기 측면의 바람직한 양태에서, HPV58 VLP는 효모에서 생산된다.
본 발명은 또한 HPV58 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하는 백신에 관한 것이다.
본 발명의 상기 측면의 대안적 양태에서, 백신은 하나 이상의 추가 HPV 유형의 VLP를 추가로 포함한다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 추가 HPV 유형은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 상기 측면의 바람직한 양태에서, 백신은 HPV16 VLP를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 백신은 HPV16 VLP 및 HPV18 VLP를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에서, 백신은 HPV6 VLP, HPV11 VLP, HPV16 VLP 및 HPV18 VLP를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 HPV58 바이러스-유사 입자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HPV58 VLP와 하나 이상의 추가 HPV 유형의 VLP를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 추가 HPV 유형은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 백신 조성물은 잠재적인 독성을 최소화하면서 최적의 HPV58 감염 억제를 달성하는 적절한 투여량에서 단독으로 사용될 수 있다. 또한, 다른 제제와의 공동 투여 또는 순차적 투여가 바람직할 수 있다.
백신 수용자에게 도입될 바이러스-유사 입자의 양은 발현되는 유전자 산물의 면역원성에 따라 좌우될 것이다 일반적으로, 면역학적 또는 예방학적 유효량 약 10㎍ 내지 100㎍, 바람직하게는 약 20㎍ 내지 60㎍의 VLP가 근육 조직내로 직접 투여된다. 피하 주사, 피내 도입, 피부를 통한 압흔(impression) 및 다른 투여 방식, 예를 들어, 복강내, 정맥내 또는 흡입 전달이 또한 고려된다. 또한, 부스터 백신접종이 제공될 수 있을 것으로 여겨진다. 본 발명의 백신의 비경구 도입과 동시에 또는 본 발명의 백신의 비경구 도입 후에, 백반(alum) 또는 머크 알루미늄 보조제와 같은 보조제와의 비경구 투여, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하 또는 다른 투여 수단도 또한 유리하다.
본원에서 언급되는 모든 간행물은 본 발명과 연관하여 사용되는 방법론 및 재료들을 기술하고 개시하기 위한 목적으로 참조로 인용된다. 본 발명이 종래 발명에 의한 상기한 공개내용을 선행하는 것으로 인정되지 않아야할 어떠한 것도 없다.
본 발명의 바람직한 양태를 첨부된 도면을 참조로 하여 설명하는 경우, 본 발명은 이러한 정확한 양태로 한정되는 것은 아니며, 첨부된 청구의 범위에 정의된 본 발명의 범주 또는 취지에서 벗어남이 없이 당해 분야의 숙련가에 의해 각종 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
다음 실시예는 본 발명을 예시하며 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1
대표적 HPV58 L1 서열의 결정
HPV58 L1 서열은 이미 기술되었다[진뱅크 승인 번호 NC_001443]. 그러나, 임상적 분리체로부터 수득된 DNA들 간에 근소한 서열 변이가 발견되는 것은 통상적이다. 대표적 HPV58 L1 야생형 서열을 결정하기 위해, DNA를 이미 HPV58 DNA를 함유하는 것으로 보여진 3개의 임상적 샘플로부터 분리하였다. HPV58 L1 서열을 Taq DNA 폴리머라제 및 다음 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시켰다: HPV58 L1 F 5'-ATGTCCGTGTGGCGGCCTAGT-3'(서열번호 4) 및 58 3'll BglII 5'-GAGATCTGTGTAAGTACCACAACAATTA-3'(서열번호 5). 증폭된 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고 브롬화에티듐 염색으로 가시화시켰다. 약 1500bp L1 밴드를 절단해내고 Geneclean Spin 키트(제조원: Q-Bio Gene, Carlsbad, CA)를 사용하여 DNA를 정제하였다. 이어서, DNA를 TA 클로닝 벡터인 pCR2.1(제조원: Invitrogen)에 연결시켰다. TOP10F' 이. 콜라이를 연결 혼합물로 형질전환시키고 청색/백색 콜로니 선별을 위해 암피실린과 IPTG 및 X-gal을 함유한 LB 한천에 플레이팅하였다. 플레이트를 뒤집어서 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 백색 콜로니를 암피실린을 함유한 LB 배지에서 37℃에서 16시간 동안 진탕함으로써 배양하였다. 미니프렙(Miniprep)을 수행하여 플라스미드 DNA를 추출하였다.
플라스미드내 L1 유전자의 존재를 증명하기 위해서, 제한 엔도뉴클레아제 분해를 수행하였다. 제한 단편을 아가로스 겔 전기영동 및 브롬화에티듐 염색으로 관찰하였다. DNA 서열화를 3개의 임상적 분리체 각각으로부터 클로닝된 L1 삽입체를 함유하는 플라스미드에서 수행하였다. 이후 최적화를 위한 참조 서열을 생성시키기 위해, 뉴클레오타이드 및 각각의 클론으로부터 해독된 아미노산 서열을 공개된 HPV58 L1 서열과 비교하였다. 3개의 임상적 분리체의 서열 분석으로 진뱅크 서열과 동일한 서열이 없다는 것이 밝혀졌다. pCR2.1 HPV58L1 클론 4번을 대표적인 58 L1 서열인 것으로 선택하였고, 이를 본원에서 "58 L1 야생형 서열" 또는 "58 wt 서열"로 교대로 지칭한다(서열번호 3, 도 1 참조). 당해 58 L1 wt 서열은 5개의 점 돌연변이를 함유하였고, 이중 2개는 아미노산 변화를 야기하였고, 3개는 사일런트 점 돌연변이였다. 진뱅크 HPV58 L1 서열에 있어서 아미노산 변화를 야기하는 점 돌연변이는 아미노산 124번을 류신에서 페닐알라닌으로 변화시키는 뉴클레오타이드 372(A→T)에 위치하였고, 아미노산 299번에서 이소류신을 메티오닌으로 변화시키는 뉴클레오타이드 897(A→G)에 위치하였다. 3개의 사일런트 점 돌연변이는 뉴클레오타이드 774(A→G), 792(T→C) 및 999(G→A)에 위치하였다.
58 L1 야생형 서열을 Taq 폴리머라제 및 BamHI 신장부가 부가된 5'58 BamHI 5'-GGGATCCCACAAAACAAAATGTCCGTGTGGC-3'(서열번호 6) 및 3' Bam 58 5'-GGGATCCGTGTAAGTACCACAACAATTA-3'(서열번호 7) 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시켰다. 수득한 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동후, 브롬화에티듐 염색으로 가시화시켰다. 약 1500bp 밴드를 절단해내고 Geneclean 키트를 사용하여 DNA를 정제하였다. 이어서, PCR 산물을 pCR2.1과 연결하고, TOP10F' 세포를 연결 혼합물로 형질전환시켰다. 백색 콜로니를 선택하고, 암피실린을 함유한 LB 배지에서 37℃에서 16시간 동안 진탕함으로써 배양하였다. 미니프렙을 수행하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 벡터 서열로부터 HPV58 L1 유전자를 방출시키기 위해서, BamHI 제한 엔도뉴클레아제 분해를 수행하였다. 분해된 DNA를 아가로스 겔 전기영동하고 브롬화에티듐 염색으로 가시화하였다. L1 밴드를 Geneclean 키트를 사용하여 정제하고, 탈인산화된 BamHI 분해된 pGAL110과 연결시켰다. DH5α이. 콜라이 세포를 연결 혼합물로 형질전환시켰다. HPV58 L1 삽입체를 올바른 배향으로 스크리닝하기 위해, 콜로니로부터의 플라스미드 DNA를 PCR-증폭시켰다. 삽입체의 서열 및 배향을 DNA 서열화로 확인하였다. 단일 클론을 선별하고, pGAL110-HPV58 L1 #10으로 명명하였다. 선별된 클론으로부터 맥시프렙(Maxiprep) DNA를 제조하였다. 사카로마이세스 세레비지애 세포를 글루술라제(Glusulase)로 세포벽불완전제거(spheroplasting)하여 적격성으로 만들고 pGAL110-HPV58 L1 #1로 형질전환시켰다. 효모 형질전환 혼합물을 Leu(-) 소르비톨 한천 플레이트 위에 Leu(-) 소르비톨 탑-한천에서 플레이팅하고 30℃에서 3 내지 5일 동안 뒤집어서 배양하였다. 콜로니를 채취하고, 분리를 위해 Leu(-) 소르비톨 한천 플레이트에 도말하였다. 그 다음, 분리된 콜로니를 30℃에서 회전 튜브 배양물 중의 1.6% 글루코즈 및 4% 갈락토즈를 함유한 5ml의 5 X Leu(-) Ade(-) 소르비톨에서 성장시켜, 58 L1 전사 및 단백질 발현을 유도하였다.
실시예 2
효모 코돈 최적화
효모-선호 코돈은 기술되었다[참조: Sharp, Paul M and Cowe, Elizabeth. Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7: 657-678(1991)]. HPV58 L1 wt 단백질의 발현은 검출될 수 있었지만, 증가된 발현을 수득하기 위해서 HPV58 L1 유전자를 효모-선호 코돈을 사용하여 재구성하였다. 효모-최적화된 코돈 서열을 포함하는 상기 재구성 58 L1 서열은 58 L1 wt 서열과 비교하여 404번 뉴클레오타이드 변화를 함유하였다. 수득한 서열은 본원에서 "58 L1 R"(R은 재구성체이다. 도 1 참조)로서 나타낸다. 58 L1 R의 해독된 아미노산 서열은 변경되지 않았다. HPV58 L1 R의 뉴클레오타이드(서열번호 1) 및 아미노산(서열번호 2) 서열은 도 2에 제시되어 있다. 상기 재구성 서열은 증가된 HPV58 L1 발현을 제공하고, 이는 백신 개발에 사용하기에 야생형보다 상당히 진보된 것이다(실시예 4 참조).
최적화된 유전자를 생산하기 위해 사용된 전략은, 본래 아미노산 서열을 유지하는 한편, 뉴클레오타이드를 효모-선호 코돈 서열로 치환시키면서 당해 유전자에 걸쳐있는 긴 중복 센스 및 안티센스 올리고머를 고안하는 것이었다. 이들 올리고머는 Pfu 폴리머라제를 사용한 PCR 반응에서 주형 DNA 대신에 사용되었다. 추가의 증폭 프라이머를 고안하여 주형 올리고머로부터 재구성 서열을 증폭시키는데 사 용하였다.
증폭을 위한 최적의 조건은 절편-특이적이지만, 가장 많이 사용되는 프로그램은 95℃에서 2분 동안(변성), 이어서 95℃에서 1분(변성), 55℃에서 1분(어닐링) 및 72℃에서 3.5분(신장)의 35회의 사이클, 이어서 72℃에서 10분간 최종 신장 및 4℃에서의 유지와 유사하다. PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 검사하였다. 적절한 크기의 밴드를 절단해내고 DNA 겔을 정제하였다. 이어서, 증폭된 단편을 주형으로서 사용하여 1497 nt 재구성 HPV58L1 유전자를 어셈블리하였다.
재구성 후, 1497 nt 밴드를 겔 정제하고, pCR-Blunt 벡터(제조원: Invitrogen, Carlsbad, CA)에 연결시켰다. 연결시킨 후, TOP10 세포를 연결 혼합물로 형질전환시켰다. 콜로니를 카나마이신을 함유하는 LB에서 성장시키고 플라스미드 DNA를 콜로니로부터 미니프렙 기법으로 추출하였다. 목적하는 58 L1 재구성 변화를 확인하기 위해 플라스미드 DNA를 서열화하였다. 양쪽 말단에 BamHI 신장부를 부가하기 위해, 5'Bam 58 재구성 5'-GGATCCCACAAAACAAAATGTCTGTCTGGAGACC-3'(서열번호 8) 및 3'Bam 58 재구성 5'-GGATCCTTACTTCTTGACCTTC-3'(서열번호 9)의 프라이머를 사용하여 58 L1 R(재구성)을 pCR-Blunt-58 L1 R로부터 재증폭시켰다.
증폭된 L1 산물을 Geneclean 키트를 사용하여 겔-정제하고, pCR2.1(Invitrogen)내로 클로닝하였다. Top10F' 세포를 pCR2.1 플라스미드로 형질전환시켰다. 백색 콜로니를 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 37℃에서 16시간 동안 진탕하면서 배양하였다. 미니프렙을 수행하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 벡터 서열로부터 HPV58 L1 유전자를 방출시키기 위해서, BamHI 제한 엔도뉴클레아 제 분해를 수행하였다. 분해된 DNA를 아가로스 겔 전기영동시키고, 브롬화에티듐 염색으로 가시화하였다. L1 밴드를 Geneclean 키트를 사용하여 정제하고 탈인산화된 BamHI-분해된 pGAL110과 연결시켰다. DH5α 이. 콜라이를 연결 혼합물로 형질전환시켰다.
수득한 콜로니를 올바른 배향의 HPV58 L1 R 삽입체에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 맥시프렙 DNA를 제조하였다. 서열 및 배향은 제한 분해 프로필 및 DNA 서열화로 확인하였다. 선택된 클론을 pGAL110-HPV58L1R #17로 명명하였다. 사카로마이세스 세레비지애 세포를 세포벽불완전제거하여 적격성으로 만들고 pGAL110-HPV58L1R #17로 형질전환시켰다. 효모 형질전환 혼합물을 Leu(-) 소르비톨 한천 플레이트 위에 Leu(-) 소르비톨 탑-한천에서 플레이팅하고 30℃에서 3 내지 5일 동안 뒤집어서 배양하였다. 콜로니를 채취하고, 클론 분리를 위해 Leu(-) 소르비톨 한천 플레이트에 도말하였다. 그 다음, 분리된 콜로니를 30℃에서 회전 튜브 배양물 중의 1.6% 글루코즈 및 4% 갈락토즈를 함유한 5ml의 5 X Leu(-) Ade(-) 소르비톨에서 성장시켜, L1 전사 및 단백질 발현을 유도하였다. 48시간 후, OD600 = 10양에 해당하는 배양 용적의 세포를 펠렛화시키고, 상청액을 제거하고, 펠렛을 동결시키고 -70℃에서 저장하였다.
실시예 3
RNA 제조
갈락토즈 유도에 의해 HPV58 L1 또는 HPV58 L1 R을 발현하도록 유도된, 형질 전환된 효모의 세포 펠렛을 빙상에서 해동시키고, 트리졸 시약(제조원: Life Technologies, Gibco BRL) 0.8ml에 현탁시키고, 실온에서 5분 동안 항온처리하였다. 1/5 용적의 클로로포름을 바이알에 첨가하였다. 이어서, 15초 동안 격렬하게 진탕시켜 혼합하고 3분 동안 실온에서 항온처리하였다. 13k rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상단 층을 수거하고 새로운 바이알로 옮겼다. 이소프로판올 0.4ml을 첨가하고 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 13 k rpm에서 10분 동안 원심분리하여 RNA를 펠렛이 되도록 하였다. 상청액을 경사 분리하고, RNA 펠렛을 75% EtOH로 세척하고 원심분리를 반복하였다. 상청액을 경사분리하고, RNA 펠렛을 15분 동안 공기 건조시킨 후, RNase 비함유 물에 현탁시켰다. A260/280가 1.7 내지 2.0일때에 A260 판독치 1=40㎍/ml RNA라는 가정을 사용하여 분광광도측정법을 수행하여 샘플 중의 RNA의 농도를 측정하였다.
실시예 4
노던 블롯 분석
1.1% 아가로스 포름알데히드 겔을 주조하였다. RNA 5㎍ 및 10㎍를 변성 완충액(최종 농도: 6% 포름알데히드, 50% 포름아미드 및 0.1 x MOPS)과 합하고 10분 동안 65℃까지 가열하였다. 1/10 용적의 겔 전개 완충액(gel loading buffer)을 부가하고 샘플을 겔에 전개시켰다. 전기영동을 75볼트에서 1×MOPS 완충액 중에서 약 3시간 동안 수행하였다. 겔을 10×SSC로 60분 동안 세척하였다.
RNA를 10×SSC에서 16시간에 걸쳐 모세관 작용에 의해 Hybond-N+ 나일론 막(제조원; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)으로 전달시켰다. 이어서, RNA를 Stratagene UV Stratalinker(제조원: Stratagene, La Jolla, CA) 자동-가교결합 기능을 사용한 가교결합에 의해 상기 나일론 막에 고정시켰다. 고정 후, 나일론 막을 공기 건조시켰다.
Roche DIG High Prime DNA 표지화 및 검출 키트 I(제조원: Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Switzerland)를 사용하여, 58 L1 wt 및 58 L1 R DNA 서열을 프로브 칵테일로서 사용될 DIG로 표지하여 노던 블롯 상에서 58 L1 wt 및 58 L1 R 전사체를 검출하였다. 항-DIG 알칼리성 포스파타제 접합된 항체를 사용한 예비-하이브리드화, 하이브리드화 및 면역학적 전개(immunological development)를 제조업자의 권장사항에 따라 수행하였다. 간략하게 언급하면, 블롯을 가볍게 진탕시키면서 37℃에서 30분 동안 예비하이브리드화시켰다. 프로브 칵테일을 95℃에서 5분 동안 가열하고 빙상에서 급냉시켜 변성시켰다. 프로브 칵테일을 하이브리드화 용액에 부가하고, 가볍게 진탕시키면서 44.6℃에서 4시간 동안 막에 적용하였다. 이어서, 하이브리드화 용액을 제거하고, 블롯을 실온에서 0.1% SDS과 함께 2×SSC로 5분 동안 2회 세척한 다음, 65℃에서 0.5×SSC 및 0.1% SDS로 추가 세척하였다. 이어서, 블롯을 30분 동안 차단시키고, 항-DIG 알칼리성 포스파타제 접합된 항체를 1:5000 희석율로 30분 동안 적용하였다. 블롯을 세척하고, 프로브 결합된 RNA의 존재를 알칼리성 포스파타제 접합된 항-DIG 결합된 항체의 NBT/BCIP 기질 검출로 결정하였다.
58 L1 wt를 발현하는 효모의 초기 분석은 기능적 HPV58 L1 전체길이 전사 및 해독이 있었음을 제시하지만, 당해 서열이 효모-선호 코돈 서열로 재구성되는 경우 발현 수준은 증가될 수 있다. 활발한 전사를 보장하기 위해 재구성 58 L1 서열을 모든 가능한 조기 전사 종결 부위가 없도록 조작하였다. 58 L1 R 전사체의 노던 블롯 분석으로 58 L1 wt에 대하여 관찰된 결과와 비교하여 전체길이 전사체의 증가된 양이 생성되었음이 밝혀졌다(도 3).
실시예 5
HPV58 L1 단백질 발현
OD600= 10의 세포 양에 해당하는 갈락토즈-유도된 배양물의 동결된 효모 세포 펠렛을 빙상에서 해동시키고 2mM PMSF를 함유한 PC 완충액(100mM Na2HP04 및 0.5M NaCl, pH 7.0) 300㎕에 현탁시켰다. 산-세척된 0.5mm 유리 비이드를 약 0.5g/튜브농도로 부가하였다. 튜브를 1분간 중단시키면서 4℃에서의 5분간의 3회 사이클 동안 와동(voltexing)하였다. 7.5㎕의 20% TritonX100을 부가하고 4℃에서 5분 동안 와동 단계를 반복하였다. 튜브를 15분 동안 빙상에 놓은 다음, 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 멸균 미세원심관으로 옮기고, 전체 효모 단백질 추출물이라 표지하고, 날짜를 기록하고, -70℃에서 저장하였다.
실시예 6
웨스턴 블롯 분석
각각의 58 L1 작제물에 대한 20개의 분리된 효모 콜로니로부터의 전체 효모 단백질 추출물을 웨스턴 블롯으로 분석하여, 갈락토즈 유도 후의 58 L1 단백질의 발현을 확인하였다.
대표적인 58L1 wt 및 58 L1 R 분리체의 전체 효모 단백질 추출물 10㎍, 5㎍ 및 2.5㎍을 SDS-PAGE 전개 완충액과 합하여 10분 동안 95℃까지 가열하였다. 대략 55kD의 16 L1 단백질을 포지티브 대조군으로서 포함시키고, HPV L1 비함유 전체 효모 단백질 추출물을 네거티브 대조군으로서 포함시켰다(데이타는 제시되지 않음).
단백질을 10% SDS-PAGE 겔에 전개시키고 트리스-글리신(Tris-Glycine) 완충액에 전기영동시켰다. 단백질 분리 후, 단백질을 겔로부터 니트로셀룰로즈로 웨스턴 전달시키고, 블롯을 진동시키면서 실온에서 1×희석 완충액(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)으로 1시간 동안 차단하였다. 블롯을 3회 세척한 다음, 실온에서, HPV 16 및 HPV 58 L1 단백질과 가교-반응하는, 효모-흡착된 염소 항-trpE-HPV31 L1 혈청으로 16시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 블롯을 3회 세척하고 항-염소-HRP 접합된 항체의 1:2500 희석액과 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 블롯을 다시 3회 세척하고 NBT/BCIP 검출 기질(Kirkegaard and Perry Laboratories)을 적용하였다. 면역반응성 단백질이 블롯상에서 자주색 밴드로서 검출되었다.
모든 경우에 58 L1 단백질이 약 55kDa에 상응하는 니트로셀룰로즈상의 명백한 면역반응성 밴드로서 검출되었다(도 4). 58 L1 R 밴드의 강도는 58 L1 wt에서 관찰된 것 보다 큰 것으로 나타났으며, 이는 58L1 발현의 향상은 효모-코돈 최적화에 의해 달성된 것임을 제시하는 것이다.
실시예 7
ELISA 검정
58 L1 VLP 발현을 확인하기 위해서, 58 L1 wt 및 58 L1 R 전체 효모 단백질 추출물의 분획물을 ELISA로 분석하였다. HPV58 L1 및 HPV58L1 R을 발현하는 효모 세포를 회전 튜브 배양, 진탕 플라스크 및 발효조를 포함하는 각종 방법으로 성장시켰다. 효모 세포를 용해시키고, 단백질 추출물에서 전체 단백질 ㎍당 생산된 HPV58 L1 바이러스-유사 입자(VLP)의 양을 측정하였다. 샌드위치 ELISA를 HPV58 L1 VLP 발현량을 제시하도록 설계하였다.
단백질 G 정제된 H582C3.F7(F7) 모노클로날 항체(mAb)를 효모 단백질 추출물 중에서 확인된 온전한 58 L1 VLP에 결합시키는데 사용하였다. F7은 HPV58 L1 VLP 입체형태 에피토프를 특이적으로 인식한다. 미결합된 단백질을 세척 제거하고 H586E11.F4(F4), 또다른 HPV58 L1 VLP 입체형태 특이적 mAb를 검출 항체로서 적용시켰다. 진정한, 입체형태적으로 올바른 58 L1 VLP가 결합되었으며, 항-마우스 IgG2b HRP-접합된 항체 및 TMB 기질을 사용하여 검출을 용이하게 하였다.
구체적으로는, F7을 사용하여 4℃에서 Immulon 4 HBX 96 웰 플레이트의 바닥을 밤새 피복시켰다. 상기 플레이트를 PBS 및 0.05% Tween 20으로 3회 세척한 다음, 차단 용액(PBS + 0.05% Tween 20 + 1% BSA)을 사용하여 차단시켰다. 플레이트를 3회 세척하고, 항원(차단 용액에서 12.5㎍/ml로 희석된 전체 효모 세포 용해물)을 A열에 이중으로 적용하였다. 정제된 HPV58 L1 VLP의 참조 표준물을 A열 3행 및 4행에 12.5㎍/ml 전체 효모 단백질 중의 206ng/ml로 적용시켰다. 이어서, 참조 및 시험 샘플을 각 행마다 2배씩 저농도로 연속적으로 희석시켰다. 실온에서 3시간 후, 과량의 항원을 흡인하여 제거하고 플레이트를 3회 세척하였다. F4 입체형태 특이적 mAb를 차단 용액 중에 희석시키고, 실온에서 1시간 동안 각 웰에 적용하였다. 플레이트를 3회 세척하고, 항-마우스 IgG2b HRP-접합된 항체를 차단 용액 중에 희석시키고, 실온에서 1시간 동안 적용하였다. 플레이트를 세척하고, TMB(Pierce, Biotechnology, Inc., Rockford, IL)를 5분 동안 적용하여 HRP-접합된 항체 복합체를 검출하였다. 검출 반응을 2M H2SO4를 부가하여 종결시켰다. 플레이트를 450nm 파장에서 판독하고, HPV58 L1 VLP의 농도를 참조 표준물과 비교하여 ng VLP/㎍ 전체 단백질 단위로 측정하였다.
도 5는, 2개의 개별적 실험으로부터의 HPV58 L1 wt 및 HPV58 L1 R을 발현하는 효모로부터 수득한 전체 단백질 ㎍당 검출된 VLP의 양의 비교를 제시하고 있다. HPV58 L1 VLP 발현 수준은 효모-코돈 최적화한 경우 약 2 내지 3배 증가하였다.
실시예 8
투과 전자현미경
58 L1 단백질이 실제로 자가-어셈블리하여, 후속적으로 바이러스-유사 입자로 자가-어셈블리되는 5량체성-L1 캡소머(capsomer)를 형성하는지를 입증하기 위 해, 부분 정제된 58 L1 R 단백질 추출물을 투과 전자현미경(EM)으로 분석하였다.
효모를 소규모 발효 조건하에 성장시키고 펠렛화시켰다. 수득한 펠렛을 정제 처리하였다. 펠렛 및 청정화된 효모 추출물을 면역블롯으로 분석하여 정제 과정 전반에 걸친 L1 단백질 발현 및 보유를 입증하였다. 이어서, 청정화된 효모 추출물을 45%-슈크로즈 쿠션상에서 원심분리하고, 생성된 펠렛을 투과 전자현미경(EM)으로 분석하기 위해 완충액에 현탁시켰다.
당해 58 L1 R VLP의 대표적 이미지를 도 6에 도시한다. 당해 조 샘플 중의 구형 입자의 직경은 30 내지 60nm의 범위였으며, 일부 입자는 캡소머의 규칙적 배열을 나타냈다.
<110> Merck & Co., Inc. <120> OPTIMIZED EXPRESSION OF HPV 58 L1 In YEAST <130> 21561 PCT <150> 60/519,211 <151> 2003-11-12 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV58 L1-R <400> 1 atgtccgtct ggagaccatc cgaagctacc gtctacttgc caccagttcc agtctccaag 60 gtcgtctcca ctgacgaata cgtctctaga acctctatct actactacgc tggttcctct 120 agattgttgg ctgttggtaa cccatacttc tccatcaagt ctccaaacaa caacaagaag 180 gtcttggttc caaaggtctc tggtttgcaa tacagagtct tcagagtcag attgccagac 240 ccaaacaagt tcggtttccc agacacttcc ttctacaacc cagacactca aagattggtc 300 tgggcttgtg tcggtttgga aatcggtaga ggtcaaccat tgggtgttgg tgtctctggt 360 cacccatact tcaacaagtt cgacgacacc gaaacctcca acagataccc agctcaacca 420 ggttctgaca acagagaatg tttgtccatg gactacaagc aaacccaatt gtgtttgatc 480 ggttgtaagc caccaactgg tgaacactgg ggtaagggtg ttgcttgtaa caacaacgct 540 gctgctaccg actgtccacc attggaattg ttcaactcca tcatcgaaga cggtgacatg 600 gtcgacactg gtttcggttg tatggacttc ggtaccttgc aagctaacaa 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<210> 2 <211> 498 <212> PRT <213> Human Papillomavirus Type 58 <400> 2 Met Ser Val Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser 20 25 30 Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly Asn Pro 35 40 45 Tyr Phe Ser Ile Lys Ser Pro Asn Asn Asn Lys Lys Val Leu Val Pro 50 55 60 Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Arg Leu Pro Asp 65 70 75 80 Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr 85 90 95 Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Leu Glu Ile Gly Arg Gly Gln 100 105 110 Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly His Pro Tyr Phe Asn Lys Phe Asp 115 120 125 Asp Thr Glu Thr Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Gln Pro Gly Ser Asp Asn 130 135 140 Arg Glu Cys Leu Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile 145 150 155 160 Gly Cys Lys Pro Pro Thr Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Val Ala Cys 165 170 175 Asn Asn Asn Ala Ala Ala Thr Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Phe Asn 180 185 190 Ser Ile Ile Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Cys Met 195 200 205 Asp Phe Gly Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile 210 215 220 Cys Asn Ser Thr Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ala Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe 245 250 255 Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ala Gly Lys Leu Gly Glu Ala Val Pro 260 265 270 Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Asn Thr Ala Val Ile Gln Ser 275 280 285 Ser Ala Phe Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Glu Ser 290 295 300 Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu Cys Thr Glu Val Thr Lys Glu Gly 340 345 350 Thr Tyr Lys Asn Asp Asn Phe Lys Glu Tyr Val Arg His Val Glu Glu 355 360 365 Tyr Asp Leu Gln Phe Val Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala 370 375 380 Glu Ile Met Thr Tyr Ile His Thr Met Asp Ser Asn Ile Leu Glu Asp 385 390 395 400 Trp Gln Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Gln Asp Thr 405 410 415 Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Thr Ala Pro 420 425 430 Pro Lys Glu Lys Glu Asp Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val 435 440 445 Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly 450 455 460 Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly Leu Lys Ala Lys Pro Arg Leu Lys 465 470 475 480 Arg Ser Ala Pro Thr Thr Arg Ala Pro Ser Thr Lys Arg Lys Lys Val 485 490 495 Lys Lys <210> 3 <211> 1497 <212> DNA <213> Human Papillomairus Type 58 <400> 3 atgtccgtgt ggcggcctag tgaggccact gtgtacctgc ctcctgtgcc tgtgtctaag 60 gttgtaagca ctgatgaata tgtgtcacgc acaagcattt attattatgc tggcagttcc 120 agacttttgg ctgttggcaa tccatatttt tccatcaaaa gtcccaataa caataaaaaa 180 gtattagttc ccaaggtatc aggcttacag tatagggtct ttagggtgcg tttacctgat 240 cccaataaat ttggttttcc tgatacatct ttttataacc ctgatacaca acgtttggtc 300 tgggcatgtg taggccttga aataggtagg ggacagccat tgggtgttgg cgtaagtggt 360 catccttatt tcaataaatt tgatgacact gaaaccagta acagatatcc cgcacagcca 420 gggtctgata acagggaatg cttatctatg gattataaac aaacacaatt atgtttaatt 480 ggctgtaaac ctcccactgg tgagcattgg ggtaaaggtg ttgcctgtaa caataatgca 540 gctgctactg attgtcctcc attggaactt tttaattcta ttattgagga tggtgacatg 600 gtagatacag ggtttggatg catggacttt ggtacattgc aggctaataa aagtgatgtg 660 cctattgata tttgtaacag tacatgcaaa tatccagatt atttaaaaat ggccagtgaa 720 ccttatgggg atagtttgtt cttttttctt agacgtgagc agatgtttgt taggcacttt 780 tttaataggg ccggaaaact tggcgaggct gtcccggatg acctttatat taaagggtcc 840 ggtaatactg cagttatcca aagtagtgca ttttttccaa ctcctagtgg ctctatggtt 900 acctcagaat cacaattatt taataagcct tattggctac agcgtgcaca aggtcataac 960 aatggcattt gctggggcaa tcagttattt gttaccgtag ttgataccac tcgtagcact 1020 aatatgacat tatgcactga agtaactaag gaaggtacat ataaaaatga taattttaag 1080 gaatatgtac gtcatgttga agaatatgac ttacagtttg tttttcagct ttgcaaaatt 1140 acactaactg cagagataat gacatatata catactatgg attccaatat tttggaggac 1200 tggcaatttg gtttaacacc tcctccgtct gccagtttac aggacacata tagatttgtt 1260 acctcccagg ctattacttg ccaaaaaaca gcacccccta aagaaaagga agatccatta 1320 aataaatata ctttttggga ggttaactta aaggaaaagt tttctgcaga tctagatcag 1380 tttcctttgg gacgaaagtt tttattacaa tcaggcctta aagcaaagcc cagactaaaa 1440 cgttcggccc ctactacccg tgcaccatcc accaaacgca aaaaggttaa aaaataa 1497 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 4 atgtccgtgt ggcggcctag t 21 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 5 gagatctgtg taagtaccac aacaatta 28 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 6 gggatcccac aaaacaaaat gtccgtgtgg c 31 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 7 gggatccgtg taagtaccac aacaatta 28 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 8 ggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc 34 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 9 ggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc 34 <210> 10 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 58 L1 antisense <400> 10 tacaggcaga cctctggtag gcttcgatgg cagatgaacg gtggtcaagg tcagaggttc 60 cagcagaggt gactgcttat gcagagatct tggagataga tgatgatgcg accaaggaga 120 tctaacaacc gacaaccatt gggtatgaag aggtagttca gaggtttgtt gttgttcttc 180 cagaaccaag gtttccagag accaaacgtt atgtctcaga agtctcagtc taacggtctg 240 ggtttgttca agccaaaggg tctgtgaagg aagatgttgg gtctgtgagt ttctaaccag 300 acccgaacac agccaaacct ttagccatct ccagttggta acccacaacc acagagacca 360 gtgggtatga agttgttcaa gctgctgtgg ctttggaggt tgtctatggg tcgagttggt 420 ccaagactgt tgtctcttac aaacaggtac ctgatgttcg tttgggttaa cacaaactag 480 ccaacattcg gtggttgacc acttgtgacc ccattcccac aacgaacatt gttgttgcga 540 cgacgatggc tgacaggtgg taaccttaac aagttgaggt agtagcttct gccactgtac 600 cagctgtgac caaagccaac atacctgaag ccatggaacg ttcgattgtt caggctgcaa 660 ggttagctgt agacattgag gtggacattc atgggtctga tgaacttcta ccgaagactt 720 ggtatgccac tgaggaacaa gaagaagaac tcttctcttg tttacaagca gtctgtgaag 780 aagttgtctc gaccattcaa cccacttcga caaggtctgc tgaacatgta gttcccaaga 840 ccattgtggc gacagtaggt taggagacga aagaagggtt gaggtagacc aaggtaccag 900 tggagactta gagttaacaa gttgttcggt atgaccaacg tttctcgagt tccagtgttg 960 ttgccataga caaccccatt ggttaacaag cagtgacagc agctgtggtg atctaggtga 1020 ttgtactgga acacatggct tcagtggttc cttccatgga tgttcttgct gttgaagttc 1080 cttatgcagt ctgtgcagct ccttatgctg aacgttaagc agaaggttaa cacattctag 1140 tggaactgac gactttagta ctggatgtag gtgtggtacc tgagattgta gaaccttctg 1200 accgttaagc caaactgagg tggtggtaga cgaaggaacg ttctgtggat gtctaagcag 1260 tggagagttc gatagtggac agttttctga cgaggtggtt tccttttcct tctgggtaac 1320 ttgttcatgt ggaagaccct tcagttgaac ttccttttca agagacgact gaacctggtt 1380 aagggtaacc catctttcaa gaacaacgtt agaccaaact tccgattcgg ttctaacttc 1440 tctagacgag gttggtgatc tcgaggtagg tggttctctt tcttccagtt cttcatt 1497

Claims (29)

  1. 서열번호 2의 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 핵산 서열이 효모 세포에서의 고수준 발현을 위해 코돈-최적화된 핵산 분자.
  2. 제1항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  3. 제2항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  4. 제3항에 있어서, 효모 세포인 숙주 세포.
  5. 제4항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애인 숙주 세포.
  7. 제1항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 을 포함하는 핵산 분자.
  8. 제7항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  9. 제8항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  10. HPV58의 재조합 L1 단백질을 포함하는 것으로서, 상기 재조합 L1 단백질은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하고 효모에서 생산됨을 특징으로 하는, 바이러스-유사 입자(virus-like particle)(VLP).
  11. 제10항에 있어서, 재조합 L1 단백질이 코돈-최적화된 HPV58 L1 핵산 분자에 의해 암호화되는 VLP.
  12. 제11항에 있어서, 코돈-최적화된 핵산 분자가 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 VLP.
  13. (a) 효모를 제1항에 따른 코돈-최적화된 핵산 분자로 형질전환시키는 단계;
    (b) 형질전환된 효모를 당해 코돈-최적화된 핵산 분자가 발현되도록 하는 조건하에 배양하여 재조합 파필로마바이러스 단백질을 생산하는 단계; 및
    (c) 재조합 파필로마바이러스 단백질을 분리하여 HPV 58 VLP를 생산하는 단계를 포함하는, HPV 58 VLP의 생산 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제13항에 있어서, 효모가 사카로마이세스 세레비지애, 한세눌라 폴리모르파, 피치아 파스토리스, 클루이베로마이세스 프라길리스, 클루이베로마이세스 락티스 및 쉬조사카로마이세스 폼베로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는, HPV 58 VLP의 생산 방법.
  19. 제18항에 있어서, 효모가 사카로마이세스 세레비지애임을 특징으로 하는, HPV 58 VLP의 생산 방법.
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