PT1687329E - Expressão optimizada da proteína l1 do hpv 58 em leveduras - Google Patents

Description

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Descrição "Expressão optimizada da proteína Ll do HFV 58 em leveduras"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito, de uma forma geral, à prevenção e/ou terapêutica da infecção pelo papilomavírus humano (HPV). Mais especificamente, a presente invenção diz respeito a polinucleótidos sintéticos que codificam a proteína Ll do HPV 58, e a vectores recombinantes e a hospedeiros que contêm os referidos polinucleótidos. São descritas partículas tipo vírus (VLP's) do HPV 58, produzidas por meio da expressão de Ll ou Ll + L2 de HPV58 recombinantes em células de leveduras, bem como um método de produção de vacinas e composições farmacêuticas destinadas à prevenção e tratamento de infecções por HPV.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Existem mais de 80 tipos de papilomavírus humano (HPV), muitos dos quais foram associados a uma ampla variedade de -2- fenótipos biológicos, desde as verrugas proliferativas benignas aos carcinomas malignos (para um artigo de revisão, veja-se McMurray et al., Int. J. Pathol. 82(1):15-33 (2001)) . O HPV 6 e o HPV 11 são os tipos mais frequentemente associados às verrugas benignas, ao condiloma acuminado benigno e/ou displasia de baixo grau da mucosa genital ou respiratória. O HPV 16 e o HPV 18 são os tipos de alto risco mais frequentemente associados aos carcinomas in situ e invasivos do colo do útero, vagina, vulva e canal anal. Mais de 90% dos carcinomas do colo do útero são associados a infecções por HPV 16, HPV 18 ou pelos tipos oncogénicos menos prevalentes HPV 31, -33, -45, -52 e -58 (Schiffman et al., J. Natl. Câncer Inst. 85(12): 958-64 (1993)). A observação de que é detectado ADN do HPV em mais de 90% dos cancros do colo do útero é uma forte evidência epidemiológica de que os HPV's são a causa do carcinoma cervical.

Os papilomavirus são virus pequenos (50-60 mm) sem envelope e icosaédricos de ADN que codificam até oito genes iniciais (early genes) e dois genes tardios (late genes) . As grelhas de leitura aberta (ORF's) dos genomas virais são designados de EI a E7, e LI e L2, em que "E" significa "early" e "L" significa "late". O LI e L2 codificam proteínas da cápside -3- viral, enquanto que os qenes E são associados a funções como a replicaçao virai e a transformação celular. A proteína LI é a maior proteína da cápside e possui um peso molecular de entre 55 e 60 kDa. A proteína L2 é a proteína menor da cápside. Dados imunológicos sugerem que grande parte da proteína L2 é interna em relação à proteína LI na cápside virai. Ambas as proteínas (LI e L2) são altamente conservadas entre os diferentes papilomavírus. A expressão da proteína LI ou combinação das proteínas LI e L2 em leveduras, células de insectos, células de mamíferos ou bactérias para a auto-montagem das partículas tipo vírus (VLP's) (para um artigo de revisão, veja-se Schiller e Roden, in Papíllomavírus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medicai Information, pp. 101-12 (1996)). As VLP's são morfologicamente semelhantes a viriões e são capazes de induzir elevados títulos de anticorpos neutralizantes após a administração a animais ou seres humanos. Já que as VLP's não contêm o genoma virai potencialmente oncogénico, estas apresentam uma alternativa segura para a utilização de vírus no desenvolvimento de vacinas contra o HPV (para um artigo de revisão, veja-se Schiller e Hidesheim, J. Clin. Virol. 19:67-74 (2000)). Por esta razão, os genes LI e L2 -4- foram identificados como alvos imunológicos para o desenvolvimento de vacinas profiláticas e terapêuticas para a infecção e doença induzidas pelo HPV.

Tobery, T. W. et ai. (2003) descrevem uma comparação entre dois tipos de vacinas para induzir respostas imunes humorais especificas da LI do HPV 16: "...macacos foram imunizados com um vector adenoviral (Ad) que codifica a proteína LI do HPV 16..., um vector de ADN plasmídico que codifica a proteína LI do HPV 16..., levedura produziu LI do HPV 16... ou levedura produziu partículas tipo vírus quiméricas com LI + E1/E2/E7 do HPV 16..." (p. 1541, coluna do lado direito, último parágrafo) . Concluiu-se que "o grupo de VLP de LI apresentou títulos de neutralização significativamente mais elevados do que os grupos de cVLP, ADN da LI e adeno-Ll..." (p. 1542, coluna do lado direito, primeiro parágrafo). O desenvolvimento e comercialização da vacina contra o HPV foram adiados pelas dificuldades associadas à obtenção de elevados níveis de expressão de proteínas da cápside em organismos hospedeiros transformados, limitando a produção de proteína purificada. Assim, apesar da identificação de sequências do tipo selvagem que codificam proteínas LI do HPV, como a proteína LI do HPV 58, seria altamente -5- desejável desenvolver uma fonte prontamente renovável de proteína LI bruta do HPV, que utilize sequências de nucleótidos que codificam LI do HPV 58, optimizadas para expressão na desejada célula hospedeira. Além disso, seria útil produzir grandes quantidades de VLP's de LI do HPV 58 com propriedades atributivas de imunidade das proteínas nativas para uso no desenvolvimento de vacinas.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a composições e métodos de produção de uma vacina com base nos produtos proteicos expressos pelos genes da LI do HPV 58. A presente invenção proporciona polinucleótidos que codificam a proteína LI do HPV 58, em que os polinucleótidos foram optimizados ao nível dos codões para um elevado nível de expressão numa célula de levedura. A presente invenção também proporciona partículas tipo vírus (VLP's) do HPV 58, em que as referidas VLP's são produzidas através da expressão de LI recombinante do ou LI + L2 do HPV 58 em células de levedura, e descreve o uso de VLP' s do HPV 58 em composições farmacêuticas e vacinas destinadas à prevenção e/ou tratamento do cancro associado ao HPV. -6- A presente invenção diz respeito a moléculas sintéticas de ADN que codificam a proteína LI do HPV 58. As moléculas sintéticas podem ser usadas como fonte de proteína LI do HPV 58, que se podem auto-montar sob a forma de VLP's. As referidas VLP podem ser usadas numa vacina à base de VLP's. Mais especificamente, a presente invenção inclui uma molécula de ácido nucleico sintética que codifica a proteína LI do HPV 58, conforme apresentado na SEQ ID NO:2, sendo que a referida molécula de ácido nucleico inclui uma sequência de nucleótidos conforme apresentado na SEQ ID N0:1 (adiante designada por "sequência R da LI do 58"). Também são proporcionados vectores recombinantes e células hospedeiras recombinantes, procariotas e eucariotas, que contêm as moléculas de ácido nucleico descritas na presente invenção. Numa variante preferida da presente invenção, a célula hospedeira é uma célula de levedura. A presente invenção também diz respeito a métodos de produção de VLP's do HPV 58, e a métodos de uso destas VLP's.

Numa variante preferida da invenção, a levedura é seleccionada entre um grupo constituído por Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, -7-

Kluyveromyces fragi lis, Kluyveromyces frágil is, Kluyveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe. A presente invenção também diz respeito a um método de produção de uma vacina que inclui partículas tipo vírus (VLP's) do HPV 58, em que estas VLP's são produzidas em leveduras.

Numa variante alternativa deste aspecto da invenção, o método de produção da vacina inclui também a adição de VLP's de, pelo menos, um tipo adicional de HPV. Este tipo adicional de HPV pode ser qualquer tipo de HPV, incluindo qualquer tipo descrito na literatura ou aqueles subsequentemente identificados. Numa variante preferida, o tipo de HPV é um tipo associado a um fenótipo clínico, como as verrugas ou o cancro do colo do útero. Numa variante preferida, o tipo de HPV adicional é seleccionado entre um grupo constituído por HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 55, HPV 56, HPV 59 e HPV 68.

Conforme usados ao longo da especificação e nas revindicações, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem a referência no plural, excepto se o contexto claramente indicar em contrário. -8-

Conforme usados ao longo da especificação e nas revindicações, são aplicáveis as seguintes definições e abreviaturas: 0 termo "promotor" refere-se a um local de reconhecimento de cadeias de ADN ao qual se liga a ARN polimerase. 0 promotor forma um complexo de iniciação com a ARN polimerase para iniciar e conduzir a actividade transcricional. 0 complexo pode ser modificado através da activação de sequências denominadas por "intensificadores" ("enhancers") ou "sequências de activação a montante" ("upstream activating sequences") ou sequências de inibição designados de "silenciadores" ("silencers") . 0 termo "vector" diz respeito a alguns métodos pelos quais os fragmentos de ADN podem ser introduzidos num organismo hospedeiro ou tecido hospedeiro. Existem vários tipos de vectores, incluindo plasmídeos, vírus (incluindo adenovírus), bacteriófagos e cosmídeos. 0 termo "cassete" refere-se a uma sequência de nucleótido ou de genes que irá ser expressa por um vector, por exemplo, a sequência de nucleótido ou gene que codifica a proteína LI do HPV 58. Em geral, uma cassete inclui uma sequência de genes inserida num vector que, nalgumas variantes, proporciona sequências regulatórias para a -9- expressão da sequência do nucleótido ou gene. Em outras variantes, a sequência do nucleótido ou gene proporciona as sequências regulatórias para a sua expressão. Em outras variantes, o vector proporciona algumas sequências regulatórias e a sequência do nucleótido ou gene proporciona outras sequências regulatórias. Por exemplo, o vector pode proporcionar um promotor para a transcrição da sequência do nucleótido ou gene e a sequência do nucleótido ou gene proporciona uma sequência de terminação da transcrição. As sequências regulatórias que podem ser proporcionadas pelo vector incluem, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação, os intensificadores ("enhancers"), sequências de terminação da transcrição, sequências aceitadoras de splicing ou sequências dadoras, intrões, sequências de ligação a ribossomas e sequências de adição poli(A).

As designações "sequência de tipo selvagem" e "sequência wt LI 58" referem-se à sequência da LI do HPV 58 aqui descrita como SEQ ID NO:3. Embora a sequência de tipo selvagem da LI do HPV 58 já tenha sido descrita anteriormente, não é invulgar encontrar variações sequenciais menores entre os ADN's obtidos em isolados clínicos. Assim, isolou-se uma sequência de tipo selvagem representativa da LI 58 a partir - 10- de amostras clínicas que anteriormente mostraram conter ADN de HPV 58 (veja-se EXEMPLO 1). A sequência de tipo selvagem da LI 58 foi usada como sequência de referência para comparar as sequências de LI 58 optimizadas por codões supra descritas (veja-se FIGURA 1).

As designações "HPV 58 LI R" e "58 LI R" referem-se a uma sequência exemplificativa de nucleótido LI do HPV 58 (SEQ ID NO:l), supra descrita, em que a sequência foi reconstruída de forma a incluir codões preferíveis para um elevado nível de expressão por uma célula de levedura. 0 termo "quantidade eficaz" significa que é introduzida uma composição suficiente de vacina para produzir os níveis adequados de polipéptidos, de forma s resultar numa resposta imune. Os conhecedores da arte reconhecerão que este nível poderá variar. 0 termo "substituição conservativa de aminoácidos" refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido por um outro, quimicamente idêntico. Exemplos de tais substituições conservativas são a substituição de um resíduo hidrófobo (isoleucina, leucina, valina ou metionina) por um outro, a substituição de um resíduo polar por um outro resíduo polar com a mesma carga (por exemplo, arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico). - 11 - 0 termo "mamífero" refere-se a qualquer mamífero, incluindo um ser humano. "VLP" ou "VLP's" significam partícula tipo vírus ou partículas tipo vírus. "Sintético" significa que o gene da LI do HPV 58 foi criado de forma a conter uma sequência de nucleótidos que não é a mesma que a sequência de nucleótidos presente no designado gene da LI do HPV 58 de tipo selvagem de ocorrência natural (58 LI wt, SEQ ID N0:3). Conforme supra referido, as moléculas sintéticas proporcionadas incluem uma sequência de nucleótidos que inclui codões que são preferidos para a expressão pelas células de levedura. As moléculas sintéticas proporcionadas codificam as mesmas sequências de aminoácidos que o gene da LI do HPV 58 de tipo selvagem (SEQ ID NO:2).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A FIGURA 1 mostra um alinhamento de sequência que compara nucleótidos que foram alterados no gene LI do HPV 58 da presente invenção (SEQ ID N0:1, indicada como "58 LI R") (Veja-se EXEMPLO 2) . A sequência de referência é a sequência de tipo selvagem 58 LI (SEQ ID - 12- N0:3, indicada como "58 LI wt", veja-se EXEMPLO 1). Os nucleótidos alterados são indicados na sua localização correspondente. 0 número de nucleótido é apresentado entre parêntesis. Os nucleótidos na sequência reconstruída do LI 58 são indicados com pontos. A FIGURA 2 mostra a sequência sintética reconstruída da LI do HPV 58 bicatenária de ácido nucleico e aminoácido de codificação única. 0 número de nucleótidos é indicado à esquerda. A FIGURA 3 apresenta uma análise por Northern Blot de transcrições de HPV 58 LI wt e 58 LI R (veja-se EXEMPLO 4). A mancha foi sondada com um cocktail de quantidades equivalentes de sondas de ADN de 58 LI wt marcada por DIG e 58 LI R. É indicada a quantidade total de ARN sujeita a electroforese por linha. A seta à direita indica o tamanho previsível de uma transcrição de 58 LI full length. A FIGURA 4 apresenta uma análise por Western Blot de proteínas LI wt do HPV 58 (58) e do LI R 58 (58R) . A LI do HPV 16 foi incluída como referência (16) . 10, 5 e 2,5 microgramas de extractos de proteína de levedura foram desnaturadas e aplicadas em electroforese de proteínas em 10% de gel de SDS-poliacrilamida (SDS- - 13- PAGE). A proteína LI do HPV 58 foi detectada usando um antisoro policlonal caprino de LI anti-trpE-HPV 31 absorvido por levedura que reage de forma cruzada com a LI 58 e a LI 16. Os marcadores de peso molecular são indicados em kDa à esquerda. A FIGURA 5 apresenta a quantidade (ng) de VLP's intactas da LI do HPV 58 por micrograma do total de proteína de levedura total capturados e detectados através de análise ELISA (veja-se EXEMPLO 7). São incluídos os resultados de duas experiências realizadas em duplicado. A expressão da VLP de LI do HPV 58 wt (caixas pretas e cinzentas) foi de 36 ng/pg de proteínas de levedura totais. A expressão de VLP de HPV 58 LI R (caixas brancas e com listas), a 58 LI reconstruída optimizada por levedura e codão, foi 2 a 3 vezes superior do que a expressão da LI do HPV 58 wt, atingindo os 95 ng/pg de proteínas de levedura totais na experiência n.° 2. A FIGURA 6 apresenta uma amostra de VLP' s do HPV 58 composta de moléculas de proteína LI R do HPV 58, descrita supra, conforme visualizada através de microscopia electrónica de transmissão (veja-se EXEMPLO 8). A barra representa aproximadamente 100 nm. - 14-

DESCRIÇÃO MINUCIOSA DA INVENÇÃO A maioria dos carcinomas cervicais é associada a infecções por determinados tipos oncogénicos de papilomavírus humano (HPV). A presente invenção diz respeito a composições e a um método de produção de uma vacina que inclui os produtos proteicos expressos pelos genes de tipos oncogénicos do HPV. Mais especificamente, a presente invenção proporciona polinucleótidos que codificam a LI do HPV 58, em que os polinucleótidos são optimizados por codões para um elevado nivel de expressão numa célula de levedura. Também se descrevem partículas tipo vírus (VLP's) do HPV 58, produzidas pela levedura. A invenção descreve o uso de polinucleótidos e das VLP's desta forma obtidas num método de produção de vacinas destinadas à prevenção e/ou tratamento de cancro associado ao HPV.

Foi citada uma sequência de nucleótidos de tipo selvagem da LI do HPV 58 (Genbank Accession # NC_001443, veja-se Kirii et al. Virology 185(1):424-427 (1991)). A presente invenção proporciona moléculas sintéticas de ADN que codificam a proteína LI do HPV 58. As moléculas sintéticas da presente invenção incluem uma sequência de codões, em que pelo menos - 15- alguns deles foram alterados para serem usados os codões preferidos por uma célula de levedura com vista a um elevado nível de expressão. As moléculas sintéticas podem ser usadas como uma sequência para expressão da proteína LI do HPV 58, que pode ser auto-montada sob a forma de VLP's. As referidas VLP's podem ser usadas numa vacina com base numa VLP para proporcionar uma imunoprofilaxia eficaz contra a infecção pelo papilomavírus através da neutralização da imunidade humoral ou celular. Tais vacinas com base em VLP também são úteis no tratamento de infecções por HPV já estabelecidas. A expressão de VLP's do HPV em células oferece as vantagens de ser rentável e facilmente adaptável a um crescimento a larga escala em fermentadores. Além disso, o genoma da levedura pode ser rapidamente alterado de forma a assegurar uma selecção de levedura recombinante transformada com maior potencial de crescimento e expressão. No entanto, muitas proteínas LI do HPV, incluindo a LI do HPV 58, são expressas em níveis nas células de levedura inferiores ao desejável para uma escala comercial.

Assim, a presente invenção diz respeito a sequências de gene da LI do HPV 58, "optimizadas" para um elevado nível de expressão num ambiente celular de levedura. -16-

Um codão "tripleto" de quatro bases de nucleótidos possíveis podem existir em mais de 60 formas variantes. Como estes codões proporcionam a mensagem de apenas 20 aminoácidos (bem como iniciação e terminação da transcrição), alguns aminoácidos podem ser codificados por mais do que um codão, fenómeno conhecido por redundância de codões. Por razões não totalmente conhecidas, codões alternativos não se encontram uniformemente presentes no ADN endógeno de diferentes tipos de células. Na verdade, parece existir uma hierarquia natural variável ou "preferência" por determinados codões em determinados tipos de células. Como exemplo, o aminoácido leucina é especificado por seis codões de ADN, incluindo o CT, CTC, CTG, CTT, TTA e TTG. Uma análise exaustiva de codões de genoma usando frequências para microrganismos revelou a presença de ADN endógeno de E. coli geralmente contém o codão CTG específico da leucina, enquanto que o ADN de leveduras e fungos geralmente inclui um codão de TTA específico da leucina. Tendo em vista esta hierarquia, crê-se que a probabilidade de se obterem níveis elevados de expressão de um polipéptido rico em leucina por um hospedeiro E. coli dependerá, em certa medida, da frequência da utilização de codões. Por exemplo, é provável - 17- que um gene rico em codões TTA seja fracamente expresso em E. coli, enquanto que um gene rico em CTG provavelmente será altamente expresso neste hospedeiro. Da mesma forma, um codão preferido para expressão de um polipéptido rico em leucina em células hospedeiras de levedura será o TTA.

As implicações dos fenómenos de preferência de codões em técnicas de ADN recombinante são visíveis, e o fenómeno pode servir para explicar anteriores falhanços na obtenção de elevados níveis de expressão de genes exógenos em organismos hospedeiros transformados com sucesso - um codão menos "preferido" pode estar repetidamente presente no gene inserido e os mecanismos de expressão da célula hospedeira podem não funcionar de forma tão eficaz. Este fenómeno sugere que os genes sintéticos que foram concebidos para incluir os codões preferidos de uma célula hospedeira proporcionam uma forma óptima de material genético estranho para prática da expressão de proteínas recombinantes. Assim, um aspecto desta invenção é um gene HPV 58 LI que é optimizado por codões para um elevado nível de expressão numa célula de levedura. Numa variante preferida desta invenção, concluiu-se que o uso de codões alternativos que codificam a mesma sequência de proteína podem anular os - 18- constrangimentos da expressão de proteínas LI do HPV 58 por células de levedura.

De acordo com a presente invenção, os segmentos do gene LI do HPV 58 foram convertidos em sequências com sequências traduzidas idênticas, mas com uma utilização alternativa dos codões, conforme descrito por Sharp e Cowe (Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae Yeast 7:657-678 (1991) ) . A metodologia geralmente consiste na identificação de codões na sequência de tipo selvagem que não são vulgarmente associados a genes de levedura com elevados níveis de expressão, e na substituição dos mesmos por codões óptimos para elevados níveis de expressão em células de levedura. A sequência do novo gene é, depois, inspeccionada quanto a sequências indesejadas geradas por estas substituições de codões (por exemplos sequências "ATTTA", criação involuntária de locais de reconhecimento da região de excisão dos intrões ("íntron splice recognition sites"), locais indesejáveis de enzimas de restrição, elevado conteúdo de GC, presença de sinais de terminação da transcrição reconhecidos pela levedura, etc.). As sequências indesejadas são eliminadas através da substituição dos codões existentes por codões diferentes que codificam o mesmo aminoácido. Os segmentos de gene - 19- sintético são, depois, testados para uma expressão optimizada.

Os métodos supra descritos foram usados para criar segmentos de genes sintéticos para a LI do HPV 58, resultando num gene que inclui codões optimizados para um elevado nível de expressão. Enquanto que o procedimento supra proporciona um resumo da nossa metodologia para a concepção de genes optimizados por codões para utilização em vacinas contra o HPV, será óbvio aos conhecedores da arte que poderão obter-se vacinas de eficácia semelhante ou uma maior expressão de genes através de variações menores no procedimento ou através de pequenas variações na sequência. A presente invenção diz respeito a um polinucleótido sintético que codifica a proteína LI do HPV 58, conforme apresentado na SEQ ID NO:2, sendo que a molécula de ácido nucleico inclui uma sequência de nucleótidos conforme apresentado na SEQ ID N0:1. A presente invenção também diz respeito a vectores recombinantes e a células hospedeiras recombinantes, procariotas e eucariotas, que contêm as moléculas de ácido nucleico descritas na presente especificação. Numa variante -20- preferida da invenção, a célula hospedeira é uma célula hospedeira de levedura. O ADN sintético de HPV 58 ou fragmentos do mesmo, construídos através dos métodos descritos, podem ser expressos de forma recombinante através de clonagem molecular num vector de expressão que contém um promotor adequado e outros elementos reguladores da transcrição, e transferidos para células hospedeiras procariotas ou eucariotas para produzirem LI do HPV 58 recombinante. As técnicas para tais manipulações são descritas integralmente por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, Nova Iorque (1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1990)). A presente invenção diz também respeito a um processo para a expressão de proteína LI do HPV 58 numa célula hospedeira recombinante, que inclui (a) a introdução de um vector que inclui um ácido nucleico conforme apresentado na SEQ ID NO:l numa célula hospedeira de levedura, e (b) proceder à -21 - cultura de uma célula hospedeira de levedura sob condições que permitem a expressão da referida proteína LI do HPV 58. Os genes sintéticos da presente invenção podem ser montados sob a forma de uma cassete de expressão que inclui sequências concebidas para proporcionar uma expressão eficaz da proteína LI do HPV 58 na célula hospedeira. Preferivelmente, a cassete contém o gene sintético, com as sequências de controlo transcricional e traduções operativamente ligadas a este, por exemplo sob a forma de promotor, e sequências de terminação. Numa variante preferida, o promotor é o promotor GAL1 da S. cerevisiae, embora os conhecedores da arte reconheçam que poderão ser usados quaisquer outros promotores de levedura, como os promotores GAL 10, GAL 7, ADH 1, TDH 3 ou PGK, ou outros promotores de genes eucariotas. Um terminador transcricional preferido é o terminador ADH 1 da S. cerevisiae, embora também possam ser usados outros terminadores transcricionais conhecidos. A combinação de promotor GAL 1 - promotor ADH 1 é particularmente preferida.

Também é descrita uma partícula tipo vírus (VLP) do HPV 58 produzida através da expressão recombinante de LI do HPV 58 ou dos genes LI + L2 numa célula de levedura, e os métodos -22- de utilização de VLP's do HPV 58. As VLP's podem-se auto-montar quando a Ll, a maior proteína da cápside dos papilomavirus humano e animal, é expressa em levedura, células de insecto, células de mamifero ou bactérias (para análise, veja-se Schiller e Roden, in Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medicai Information, pp. 101-12 (1996)).

As VLP's de HPV morfologicamente indistintas também podem ser produzidas através da expressão de uma combinação das proteínas da cápside Ll e L2. As VLP's são compostas por 72 pentâmeros de Ll numa estrutura icosaédrica T=7 (Baker et al., Biophys. J. 60(6): 1445-56 (1991)).

As VLP's são morfologicamente semelhantes a autênticos viriões e são capazes de induzir elevados títulos de anticorpos neutralizantes mediante a administração num animal. A imunização de coelhos (Breitburd et al., J. Virol. 69(6): 3959-63 (1995)) e cães (Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92(25): 11553-57 (1995)) com VLP's provou induzir e neutralizar anticorpos e proteger os animais contra a infecção experimental por papilomavirus. No entanto, visto as VLP's não conterem o genoma virai potencialmente oncogénico e possuírem a capacidade de se auto-montarem quando expressas num só gene, apresentam uma -23- alternativa segura ao uso de vírus vivos no desenvolvimento de vacinas contra o HPV (para análise, veja-se Schiller e Hidesheim, J. Clin. Virol. 19:67-74 (2000)).

Aqui, são descritas partículas tipo vírus compostas por uma proteína LI recombinante ou por proteínas LI + L2 do HPV 58, em que a proteína recombinante é expressa numa célula de levedura.

Conforme supra referido, numa variante preferida da invenção, as VLP's do HPV 58 são produzidas em levedura. Numa outra variante preferida, a levedura é seleccionada entre um grupo constituído por Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe.

Um outro aspecto da presente invenção consiste num método de produção de VLP's do HPV 58, que inclui (a) a transformação da levedura com uma molécula de ADN recombinante que codifica a proteína Ll do HPV 58 ou as proteínas Ll + L2 do HPV 58, (b) proceder à cultura da levedura transformada sob condições que permitam a expressão da molécula de ADN recombinante para produzir a proteína recombinante do HPV 58, e (c) isolar a proteína recombinante do HPV 58 para produzir VLP' s do HPV 58; em -24- que o gene LI do HPV 58 inclui uma sequência de nucleótidos conforme apresentado na SEQ ID N0:1.

As VLP's de HPV 58 resultantes podem ser usadas num método para a indução de uma resposta imune num animal, que inclui a administração de partículas tipo vírus do HPV 58 ao animal, em particular num método de prevenção e/ou tratamento do cancro do colo do útero, que inclui a administração de uma vacina que inclui VLP's do HPV 58 a um mamífero. A presente invenção também diz respeito a um método de produção de uma vacina que inclui partículas tipo vírus (VLP's) do HPV 58.

Numa variante alternativa deste aspecto da invenção, este método de produção de vacinas inclui também a adição de VLP's de pelo menos um tipo de HPV adicional. Numa variante preferida, o tipo de HPV adicional é seleccionado entre o grupo constituído por HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 55, HPV 56, HPV 59 e HPV 68.

Numa variante preferida deste método da invenção, são adicionadas VLP's do HPV 16.

Numa outra variante preferida deste método, são adicionadas VLP's do HPV 16 e do HPV 18. -25-

Numa outra variante preferida da invenção, o método inclui também a adição de VLP' s do HPV 6, VLP's do HPV 11, VLP's do HPV 16 e VLP's do HPV 18.

As composições de vacinas proporcionadas pela presente invenção podem ser usadas por si só em dosagens adequadas que permitam uma inibição óptima da infecção por HPV 58 com a minima toxicidade potencial. Além disso, pode ser desejável a co-administração ou administração sequencial de outros agentes. A quantidade de partículas tipo vírus a introduzir no recipiente da vacina dependerá da imunogenicidade do produto génico expresso. No geral, uma dose imunológica ou profilaticamente eficaz de cerca de 10 pg a 100 pg, e preferivelmente de cerca de 20 pg a 60 pg de VLP's é administrada directamente no tecido muscular. A injecção subcutânea, a introdução intradérmica, a impressão através da pele e outros modos de administração, como a administração intraperitoneal, intravenosa ou por inalação também são contemplados. Também é contemplada a possibilidade de administração de doses de reforço. A administração parentérica, como a administração intravenosa, intramuscular, subcutânea ou outras vias de administração com adjuvantes como o alúmen ou o adjuvante -26- de alumínio da Merck, em simultâneo ou subsequentemente à introdução parentérica da vacina da presente invenção também é vantajosa.

Tendo sido descritas as variantes preferidas da invenção com referência as figuras que a acompanham, deverá ter-se em conta que a invenção não é limitada a tais variantes, e que poderão ser realizadas várias alterações e modificações pelos conhecedores da arte.

Os seguintes exemplos ilustram a invenção, sem que tal constitua qualquer tipo de limitação. EXEMPLO 1

Determinação de uma sequência representativa da LI do HPV 58 A sequência da LI do HPV 58 já foi descrita anteriormente (Genbank Accession # NC_001443). No entanto, não é invulgar encontrar variações menores das sequências entre ADN's obtidos a partir de isolados clínicos. Para determinar uma sequência de tipo selvagem representativa da LI do HPV 58, isolou-se o ADN de três amostras clínicas que previamente demonstraram conter ADN de HPV 58. As sequências da LI do -27- HPV 58 foram amplificadas numa reacção em cadeia por polimerase ("polymerase Chain reaction”, PCR) usando ADN polimerase termo-estável (Taq) e os seguintes iniciadores ("primers") : HPV 58 LI F 5' - A T G T C CGTGTGGCGGCCTAGT-3' (SEQ ID NO: 4) e 583' 11_BglII 5'- GAGATCTGTGTAAGTACCACAACAATTA-3' (SEQ ID NO:5). Os produtos amplificados foram sujeitos a electroforese em géis de agarose e visualizados por marcação com brometo de etídio. As bandas de LI -1500 bp foram cortadas e purificou-se o ADN usando o Geneclean Spin Kit (Q-Bio Gene, Carlsbad, CA). O ADN foi, depois, ligado ao vector de clonagem TA, pCR2.1 (Invitrogen). E. coli TOPIOF' foram transformadas com a mistura de ligação e colocadas em placas com ágar LB com ampicilina mais IPTG e X-gal para selecção de colónias azuis/brancas. As placas foram invertidas e incubadas durante 16 horas a 37°C. Foram realizadas mini-preps para extrair o ADN plasmidico.

Para demonstrar a presença do gene LI nos plasmideos, realizaram-se reacções de digestão com endonucleases de restrição. Os fragmentos da restrição foram visualizados através de electroforese em gel de agarose e marcação com brometo de etidio. Procedeu-se à sequenciação de ADN em plasmideos com insertos de LI clonados de cada um dos três -28- isolados clínicos. Para gerar a sequência de referência para uma optimização posterior, o nucleótido e as sequências de aminoácidos traduzidas de cada um dos clones foram comparados com as sequências publicadas de LI do HPV 58. As análises de sequências dos três isolados clínicos revelaram que nenhuma sequência era idêntica à sequência do Genbank. 0 clone # 4 do pCR2.1 da LI do HPV 58 foi escolhido como representativo da sequência da LI 58 e é adiante referida como "sequência Ll 58 de tipo selvagem" ou "sequência Ll 58 wt" (SEQ ID N0:3, veja-se FIGURA 1). A sequência Ll 58 wt continha cinco mutações pontuais: duas resultaram em alterações nos aminoácidos e três mutações pontuais silenciosas. As mutações pontuais que resultaram em alterações nos aminoácidos, no que respeita à sequência Ll do HPV 58 do Genbank, ocorreram ao nível do nucleótido 372 (A->T), alterando o aminoácido 124 de leucina para fenilalanina, e o nucleótido 897 (A->G), alterando o aminoácido 299 de isoleucina para metionina. As três mutações pontuais silenciosas ocorreram ao nível dos nucleótidos 774 (A->G), 792 (T->C) e 999 (G->A). A sequência Ll wild type do HPV 58 foi amplificada por PCR usando polimerase Taq e os seguintes primers, que

G G G A T C adicionaram extensões de BamHl: 5'58 BamHl 5' -29- C C A C AAAACAAAATGTCCGTGTGGC-3' (SEQmN0:6) e 3'Bam58 5' -G GGATCCGTGTAAGTACCACAACAATTA-3' (SEQ ID N0:7). Os produtos resultantes do PCR foram visualizados através de electroforese em gel de agarose. A banda de - 1500 bp foi cortada e o ADN purificado usando o kit Geneclean. O produto do PCR foi depois ligado a células pCR2.1 e células TOPIOF' foram transformadas com a mistura de ligação. Seleccionaram-se as colónias brancas e procedeu-se a cultura em meio LB com ampicilina, agitando a 37°C durante 16 horas. Foram realizadas mini-preps para extrair o ADN plasmídico. Para libertar o gene LI do HPV 58 das sequências vectoriais, realizaram-se reacções de digestão com endonucleases de restrição de BamHl. O ADN digerido foi sujeito a electroforese em gel de agarose e visualizado por marcação com brometo de etidio. A banda da LI foi purificada usando o kit Geneclean e ligou-se a pGALHO desfosforilado e digerido de BamHl. Células DH5a de E. coli foram transformadas com a mistura de ligação. Para procurar o inserto LI do HPV 58 na direcção correcta, o ADN plasmidico de colónias foi amplificado por PCR. Procedeu-se à sequenciação de ADN para confirmar a sequência e orientação dos insertos. Seleccionou-se um só clone e nomeou-se de pGALHO-HPV 58L1 #10. Preparou-se um maxiprep -30- de ADN do clone seleccionado. Células de Saccharomyces cerevisiae foram activadas com esferoplastos com glusulase e transformadas com pGALHO-HPV 58L1 #1. A mistura da transformação da levedura foi colocada em placas com Leu(-) top-agar sorbitol sobre placas de Leu(-) agar-sorbitol e incubadas invertidas durante 3 a 5 dias a 30°C. Foram seleccionadas e marcadas para isolamento em placas de Leu(-) agar-sorbitol. As colónias isoladas foram subsequentemente cultivadas em 5 ml de 5 X sorbitol Leu(-) Ade(-) com 1,6% de glucose e 4% de galactose em tubos de cultura rotativos a 30 °C para induzir a transcrição e expressão de proteínas da LI 58. EXEMPLO 2

Optimização de codões em levedura

Os codões preferidos da levedura foram já descritos (Sharp, Paul M. e Cowe, Elizabeth. Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae YEAST 7:657-678 (1991)). A expressão da proteína LI wt do HPV 58 foi detectável, no entanto, para se obter uma expressão optimizada, o gene LI do HPV 58 foi reconstruído utilizando os codões de levedura -31 - preferidos. A sequência reconstruída da LI do HPV 58, que inclui sequências de codões optimizadas por leveduras, continha 404 alterações de nucleótidos se comparada com a sequência da LI wt do HPV 58. A sequência resultante é adiante referida por "58 LI R" (R= rebuíld, em português "reconstruída", veja-se FIGURA 1) . A sequência de aminoácido traduzida da 58 LI R não foi alterada. As sequências de nucleótidos (SEQ ID NO:l) e aminoácidos (SEQ ID NO:2) da LI do HPV 58 R são apresentadas na FIGURA 2. A referida sequência reconstruída proporciona uma maior expressão da LI do HPV 58, que consiste num avanço significativo relativamente ao tipo selvagem para utilização no desenvolvimento de vacinas (veja-se EXEMPLO 4) . A estratégia usada para produzir o gene optimizado consistiu na concepção de oligómeros longos e sobrepostos sense e antisense que cobrem o gene, substituindo os nucleótidos com sequências de codões preferidas pela levedura, ao mesmo tempo que se mantinha a sequência de aminoácido. Estes oligómeros foram usados em vez do molde de ADN numa reacção PCR com polimerase de Pfu. Foram concebidos e usados primers de amplificação adicionais para -32- amplificar as sequências reconstruídas a partir de moldes de oligómeros.

As condições óptimas para amplificação foram específicas por secção, no entanto, a maioria utilizou um programa semelhante a 95 °C durante 2 minutos (desnaturação) seguido de 35 ciclos de 95°C durante 1 minuto (desnaturação), 55°C durante 1 minuto (hibridação), 72°C durante 3,5 minutos (extensão), seguida por uma extensão final a 72 °C durante 10 minutos e retenção a 4°C. Os produtos da reacção PCR foram examinados através de electroforese em gel de agarose. Bandas de dimensões adequadas foram cortadas e purificou-se o ADN com gel. Os fragmentos foram depois usados como moldes para montar o gene 1497 nt reconstruído da LI do HPV 58.

Após a reconstrução, a banda de 1497 nt foi purificada com gel e ligada a um vector pCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA). Após a ligação, células TOPIO foram transformadas com a mistura de ligação. As colónias foram cultivadas em LB com canamicina e extraiu-se ADN plasmídico das colónias através de técnicas de miniprep. O ADN plasmídico foi sujeito a sequenciação para confirmar as desejadas alterações ao LI reconstruído do HPV 58. Para adicionar extensões de BamHl em ambas as extremidades, o 58 LI R -33- (reconstruído) foi re-amplificado a partir de pCR-Blunt-58 LI R com os seguintes primers: 5'Bam 58 reconstruído 5'-GGATCCCACAAAACAAAATGTCTGTCTGGAGACC-3' (SEQ ID NO:8) e 3'Bam 58 reconstruído 5'-GGATCCTTACTTCTTGACC T T C-3' (SEQ ID NO:9) . 0 produto da LI amplificada foi purificado com gel, usando o kit Geneclean e clonada em pCR2.1 (Invitrogen). As células ToplOF foram com o plasmídeo pCR2.1. As colónias brancas foram cultivadas em meio LB com ampicilina, agitando-se a 37°C durante 16 horas. Foram realizadas mini-preps para extrair o ADN plasmídico. Para libertar o gene Ll do HPV 58 das sequências vectoriais, realizaram-se reacções de digestão com endonucleases de restrição de BamHl. 0 ADN digerido foi sujeito a electroforese em gel de agarose e visualizado por marcação com brometo de etídio. A banda da Ll foi purificada usando o kit Geneclean e ligou-se a pGALHO desfosforilado e digerido de BamHl. Células DH5a de E. coli foram transformadas com a mistura de ligação.

As colónias resultantes foram analisadas por PCR quanto à correcta orientação do inserto da Ll do HPV 58. Preparou-se maxiprep do ADN. A sequência e orientação foram confirmadas por perfis de digestão de restrição e sequenciação de ADN. -34- 0 clone seleccionado foi nomeado de pGALHO-HPV 58L1R#17. Células de Saccharomyces cerevisiae foram activadas com esferoplastos com glusulase e transformadas com pGALHO-HPV 58L1 #17. A mistura da transformação da levedura foi colocada em placas com Leu(-) top-agar sorbitol sobre placas de Leu(-) agar-sorbitol e incubadas invertidas durante 3 a 5 dias a 30°C. As colónias foram seleccionadas e marcadas para isolamento em placas de Leu(-) agar-sorbitol. As colónias isoladas foram subsequentemente cultivadas em 5 ml de 5 X sorbitol Leu(-) Ade(-) com 1,6% de glucose e 4% de galactose em tubos de cultura rotativos a 30°C para induzir a transcrição e expressão de proteínas da Ll. 48 horas depois, um volume de cultura equivalente a uma quantidade de OD6oo=10 de células foi convertido em pellets, removeu-se o sobrenadante e os pellets foram congelados e armazenados a -70°C.

EXEMPLO 3 Preparação de ARN

Os pellets celulares de células de levedura transformadas induzidas para expressar Ll do HPV 58 ou Ll R do HPV 58 por indução de galactose foram congelados em gelo, suspensos em -35- 0,8 ml de reagente Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) e incubados à temperatura ambiente durante 5 minutos. Adicionou-se 1/5 do volume de clorofórmio ao frasco. Este foi vigorosamente agitado durante 15 segundos para sua mistura e incubou-se à temperatura ambiente durante 3 minutos. Após 5 minutos de centrifugação a 13 k rpm, recolheu-se a fase superior e transferiu-se para um novo frasco. Adicionou-se 0,4 ml e incubou-se à temperatura ambiente durante 10 minutos. Para converter o ARN em pellets, procedeu-se à centrifugação a 13 k rpm durante 10 minutos. Decantou-se o sobrenadante, lavaram-se os pellets de ARN com 75% de EtOH e repetiu-se a centrifugação. Decantou-se o sobrenadante e permitiu-se que os pellets de ARN secassem ao ar durante 15 minutos, seguindo-se uma suspensão em água isenta de RNase. Procedeu-se a uma espectrometria para determinar a concentração de ARN na amostra, usando a assumpção de que uma leitura A26o de 1=40 pg/ml de ARN, sendo que A26o/28o é 1,7-2,0. EXEMPLO 4

Análise por Northern Blot -36-

Formou-se um gel de 1,1% de agarose-formaldeído. Combinou-se cinco e dez microgramas de ARN com tampão de desnaturação (concentrações finais: 6% de formaldeído, 50% de formamida e 0,1 x MOPS) e aqueceu-se a 65°C durante 10 minutos. Adicionou-se 1/10 do volume de gel do tampão de aplicação e aplicou-se a amostra sobre o gel. Procedeu-se à electroforese a 75 volts em 1 x tampão MOPS durante - 3 horas. Lavou-se o gel durante 60 minutos em 10 x SSC. Transferiu-se o ARN para uma membrana de nylon Hybond-N+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) por acção capilar ao longo de 16 horas em 10 x SSC. Fixou-se, de seguida, o ARN na membrana de nylon por cross-linking usando a função auto cross-link do UV Stratalinker da Stratagene (Stratagene, La Jolla, CA) . Após a fixação, permitiu-se que a membrana de nylon secasse ao ar.

Usou-se o kit Roche DIG High Prime DNA Labelling and Detection Kit I (Hoffmann-La Roche Ltd., Basileia, Suíça) para marcar as sequências de ADN 58 LI wt e 58 LI R com DIG, a serem usadas como cocktail de sondas para detectar as transcrições da 58 LI wt e 58 LI R no Northern blot. Procedeu-se à pré-hibridação, hibridação e desenvolvimento imunológico usando um anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina de acordo com as recomendações do -37- fabricante. Resumidamente, o blot foi pré-hibridado a 37"C durante 30 minutos com agitação suave. Desnaturou-se o cocktail de sondas aquecendo-o a 95"C durante 5 minutos e embebeu-se em gelo. Adicionou-se o cocktail de sondas à solução de hibridação e aplicou-se na membrana durante 4 horas a 44,6°C com agitação suave. Removeu-se a solução de hibridação e lavou-se o blot 2 x durante 5 minutos em 2 x SSC com 0,1% de SDS à temperatura ambiente, seguindo-se uma lavagem adicional a 65 "C com 0,5 x SSC e 0,1% de SDS. Bloqueou-se o blot durante 30 minutos e aplicou-se o anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina numa diluição de 1:5000 durante 30 minutos. Lavou-se o blot e determinou-se a presença de ARN ligado à sonda por detecção de substrato NBT/BCIP do anticorpo anti-DIG conjugado com fosfatase alcalina. A análise inicial da levedura que expressava 58 LI wt sugeriu que existia uma transcrição e tradução funcional full length da LI do HPV 58; contudo, o nivel de expressão poderá ser aumentado se a sequência for reconstruída com codões preferidos pelas leveduras. A sequência reconstruída da LI do HPV 58 foi concebida para omitir quaisquer locais de terminação prematura da transcrição possíveis, de forma a assegurar uma transcrição robusta. A análise por Northern -38- blot da transcrição 58 LI R revelou a criação de maiores quantidades de transcrições full length comparativamente com os resultados verificados na 58 LI wt (FIGURA 3). EXEMPLO 5

Expressão da proteína LI do HPV 58

Pellets congelados de células de levedura de culturas induzidas por galactose equivalentes a uma quantidade de células OD6oo=10 foram congeladas em gelo e suspensos em 300 μΐ de tampão PC (100 mm de Na2HP04 e 0,5 M de NaCl, pH 7.0) com 2 mm de PMSF. Adicionaram-se contas de vidro de 0,5 mm lavadas com ácido, a uma concentração de - 0,5 g/tubo. Os tubos foram agitados vigorosamente em 3 ciclos de 5 minutos a 4°C com uma pausa de 1 minuto. Adicionou-se 7,5 μΐ de 20% de TritonXlOO e repetiu-se o passo de agitação durante 5 minutos a 4°C. Colocaram-se os tubos em gelo durante 15 minutos, seguida de centrifugação durante 10 minutos a 4°C. Transferiu-se o sobrenadante para um tubo esterilizado de microcentrifugadora, etiquetou-se como extracto total de proteína da levedura, datou-se e armazenou-se a -70°C. -39- EXEMPLO 6

Análise por Western Blot

Analisou-se por Western blot o extracto total de proteínas da levedura de vinte colónias isoladas de levedura para cada elemento 58 LI a fim de confirmar a expressão da proteína LI 58 após indução de galactose. 10, 5 e 2,5 microgramas de extractos totais de proteínas de levedura de isolados representativos da 58 LI wt e 58 LI R foram combinados com tampão de aplicação em SDS-PAGE e aqueceram-se a 95°C durante 10 minutos. Incluiu-se a proteína LI 16, com aproximadamente 55 kD, como controlo positivo, juntamente com extracto total de proteína de levedura isenta de HPV LI como controlo negativo (dados não apresentados).

As proteínas foram colocadas sobre 10% de gel de SDS-PAGE e sujeitas a electroforese em tampão tris-glicina. Após separação das proteínas, estas foram transferidas do gel para nitrocelulose e o blot foi bloqueado em 1 x tampão diluente (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) durante 1 hora à temperatura ambiente com oscilação. Lavou-se o blot três vezes e incubou-se à temperatura -40- ambiente durante 16 horas com soro caprino absorvido por levedura anti-trpE-HPV 31 Ll, que reage com as proteínas LI do HPV 16 e do HPV 58. Lavou-se o blot três vezes e incubou-se com uma diluição a 1:2500 de anticorpo "anti-cabra" conjugado com HRP durante 1 hora. Lavou-se novamente o blot por três vezes e aplicou-se substrato de detecção NBT/BCIP (Kirkegaard and Perry Laboratories). Detectaram-se as proteínas imunoreactivas sob a forma de bandas púrpuras no blot.

Em todos os casos, a proteína Ll 58 foi detectada sob a forma de uma banda imunoreactiva distinta na nitrocelulose, correspondendo a aproximadamente 55 kD (FIGURA 4). A intensidade das bandas da 58 Ll R parecia ser maior do que aquele verificada na 58 Ll wt, sugerindo uma expressão optimizada da Ll 58 obtida através da optimização dos codões de levedura. EXEMPLO 7

Ensaio ELISA

Para demonstrar a expressão de VLP da Ll 58, analisou-se por ensaio ELISA uma parte de extracto total de proteína da -41 - levedura da 58 LI wt e da 58 LI R. Cultivaram-se células de levedura que expressavam a LI do HPV 58 e a LI R do HPV 58, através de uma variedade de métodos, incluindo culturas em tubo rotativo, balões de agitação e fermentadores. As células de levedura foram lisadas e retiraram-se extractos de proteínas para determinar a quantidade de partículas tipo vírus (VLP's) da LI do HPV 58 produzidas por micrograma de proteína total. Realizou-se um ensaio ELISA tipo sandwich para demonstrar a expressão de VLP's da LI do HPV 58.

Usou-se um anticorpo monoclonal (mAb) H582C3.F7 (F7) de proteína G purificada para ligar VLP's intactas da LI do HPV 58 presentes nos extractos de proteínas da levedura. 0 F7 reconhece especificamente um epitopo conformacional da VLP da LI do HPV 58. As proteínas não ligadas foram removidas com lavagem e aplicou-se H586E11.F4 (F4), um outro mAb específico conformacional da VLP da LI do HPV 58, como anticorpo de detecção. VLP's da LI do HPV 58 verdadeiras e conformacionalmente correctas foram ligadas e a detecção facilitada pelo uso de um anticorpo lgG2b anti-rato conjugado com HRP e substrato TMB.

Mais especificamente, o F7 foi usado para revestir o fundo de placas Immulon 4 HBX de 96 poços durante a noite a 4°C. -42-

Lavaram-se as placas três vezes com PBS e 0,05% de Tween 20, seguido de bloqueio com solução de bloqueio (PBS + Tween 20 a 0,05% + BSA a 1%). Lavaram-se as placas três vezes e aplicaram-se antigénios (total de lisatos da célula de levedura diluídos na solução de bloqueio em 12,5 pg/ml) na fila A em duplicado. Aplicaram-se padrões de referência de VLP's purificadas da LI do HPV 58 na fila A, colunas 3 e 4, em 206 ng/ml num total de proteína de levedura de 12,5 pg/ml. As amostras de referência e teste foram, depois, diluídas em série por duas vezes em cada coluna. Após três horas à temperatura ambiente, removeu-se o excesso de antigénio por aspiração e lavaram-se as placas 3 vezes. Diluiu-se o mAb específico conformacional do F4 em solução de bloqueio e aplicou-se em cada poço durante uma hora à temperatura ambiente. Lavaram-se as placas três vezes, diluiu-se um anticorpo lgG2b anti-rato conjugado com HRP em solução de bloqueio e aplicou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavaram-se as placas e aplicou-se TMB (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) durante 5 minutos para se detectar complexos de anticorpos conjugados com HRP. Deteve-se a reacção de detecção com a adição de 2 M de H2SO4. Procedeu-se à leitura das placas a comprimentos de onda de 450 nm e determinou-se a concentração de VLP's -43- da LI do HPV 58 comparativamente com os padrões de referência em ng de VLP/pg de proteínas totais. A FIGURA 5 mostra uma comparação da quantidade de VLP's detectada/pg de proteínas totais da levedura expressando Ll wt do HPV 58 e Ll R do HPV 58 de duas experiências distintas. Os níveis de expressão das VLP's da Ll do HPV 58 aumentaram 2 a 3 vezes com a optimização de codões de levedura. EXEMPLO 8

Microscopia electrónica de transmissão

Para demonstrar que a proteína Ll do HPV 58 é, efectivamente, auto-montável para formar capsómeros pentaméricos da Ll que, por sua vez, se auto-montam em partículas tipo vírus, sujeitou-se um extracto de proteína Ll R do HPV 58 parcialmente purificado a microscopia electrónica de transmissão (TEM).

As leveduras foram desenvolvidas sob fermentação a pequena escala e convertidos em pellets. Sujeitaram-se os pellets resultantes a tratamentos de purificação. Os pellets e extractos de levedura clarificados foram analisados por -44- método de immunoblot para demonstrar a expressão e retenção da proteína LI através de procedimentos de purificação. Depois, sujeitaram-se os extractos de levedura clarificados a centrifugação sob um leito de 45% de sacarose e suspenderam-se os pellets resultantes em tampão para análise por microscopia electrónica de transmissão.

Uma imagem representativa das VLP' s de LI R do HPV 58 produzidas é apresentada na FIGURA 6. 0 diâmetro das partículas esféricas nesta amostra bruta variava entre os 30 e os 60 nm, sendo que algumas partículas apresentavam uma série de capsómeros regulares. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Merck & Co., Inc. <120> EXPRESSÃO OPTIMIZADA DE LI DO HPV 58 EM LEVEDURA <130> 21561 PCT <150> 60/519,211 <151> 2003-11-12 -45- <16 0> 10 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 1497 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> HPV58 Ll-R < 4 0 0 > 1 -46- atgtccgtct ggagaccatc cgaagctacc gtctacttgc caccagttcc agtctccaag 60 gtcgtctcca ctgacgaata cgtctctaga acctctatct actactacgc tggttcctct 120 agattgttgg ctgttggtaa cccatacttc tccatcaagt ctccaaacaa caacaagaag 180 gtcttggttc caaaggtctc tggtttgcaa tacagagtct tcagagtcag attgccagac 240 ccaaacaagt tcggtttccc agacacttcc ttctacaacc cagacactca aagattggtc 300 tgggcttgtg tcggtttgga aatcggtaga ggtcaaccat tgggtgttgg tgtctctggt 360 cacccatact tcaacaagtt cgacgacacc gaaacctcca acagataccc agctcaacca 420 ggttctgaca acagagaatg tttgtccatg gactacaagc aaacccaatt gtgtttgatc 480 ggttgtaagc caccaactgg tgaacactgg ggtaagggtg ttgcttgtaa caacaacgct 540 gctgctaccg actgtccacc attggaattg ttcaactcca tcatcgaaga cggtgacatg 600 gtcgacactg gtttcggttg tatggacttc ggtaccttgc aagctaacaa gtccgacgtt 660 ccaatcgaca tctgtaactc cacctgtaag tacccagact acttgaagat ggcttctgaa 720 ccatacggtg actccttgtt cttcttcttg agaagagaac aaatgttcgt cagacacttc 780 ttcaacagag ctggtaagtt gggtgaagct gttccagacg acttgtacat caagggttct 840 ggtaacaccg ctgtcatcca atcctctgct ttcttcccaa ctccatctgg ttccatggtc 900 acctctgaat ctcaattgtt caacaagcca tactggttgc aaagagctca aggtcacaac 960 aacggtatct gttggggtaa ccaattgttc gtcactgtcg tcgacaccac tagatccact 1020 aacatgacct tgtgtaccga agtcaccaag gaaggtacct acaagaacga caacttcaag 1080 gaatacgtca gacacgtcga ggaatacgac ttgcaattcg tcttccaatt gtgtaagatc 1140 accttgactg ctgaaatcat gacctacatc cacaccatgg actctaacat cttggaagac 1200 tggcaattcg gtttgactcc accaccatct gcttccttgc aagacaccta cagattcgtc 1260 acctctcaag ctatcacctg tcaaaagact gctccaccaa aggaaaagga agacccattg 1320 aacaagtaca ccttctggga agtcaacttg aaggaaaagt tctctgctga cttggaccaa 1380 ttcccattgg gtagaaagtt cttgttgcaa tctggtttga aggctaagcc aagattgaag 1440 agatctgctc caaccactag agctccatcc accaagagaa agaaggtcaa gaagtaa 1497

<210> 2 <211> 498 <212> PRT <213> Papilomavírus humano tipo 58 < 4 0 0 > 2

Met Ser Vai Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Vai Tyr Leu Pro Pro Vai 15 10 15

Pro Vai Ser Lys Vai Vai Ser Thr Asp Glu Tyr Vai Ser Arg Thr Ser 20 25 30 -47-

Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Ala Vai Gly Asn Pro 35 40 45 Tyr Phe Ser Ile Lys Ser Pro Asn Asn Asn Lys Lys Vai Leu Vai Pro 50 55 60 Lys Vai Ser Gly Leu Gin Tyr Arg Vai Phe Arg Vai Arg Leu Pro Asp 65 70 75 80 Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr 85 90 95 Gin Arg Leu Vai Trp Ala Cys Vai Gly Leu Glu Ile Gly Arg Gly Gin 100 105 110 Pro Leu Gly Vai Gly Vai Ser Gly His Pro Tyr Phe Asn Lys Phe Asp 115 120 125 Asp Thr Glu Thr Ser Asn Arg Tyr Pro Ala Gin Pro Gly Ser Asp Asn 130 135 140 Arg Glu Cys Leu Ser Met Asp Tyr Lys Gin Thr Gin Leu Cys Leu Ile 145 150 155 160 Gly Çys Lys Pro Pro Thr Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Vai Ala Cys 165 170 175 Asn Asn Asn Ala Ala Ala Thr Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Phe Asn 180 185 190 Ser lie Ile Glu Asp Gly Asp Met Vai Asp Thr Gly Phe Gly Cys Met 195 200 205 Asp Phe Gly Thr Leu Gin Ala Asn Lys Ser Asp Vai Pro Ile Asp Ile 210 215 220 Cys Asn Ser Thr Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ala Ser Glu 225 230 235 240 Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gin Met Phe 245 250 255 Vai Arg His Phe Phe Asn Arg Ala Gly Lys Leu Gly Glu Ala Vai Pro 260 265 270 Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Asn Thr Ala Vai Ile Gin Ser 275 280 285 Ser Ala Phe Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Vai Thr Ser Glu Ser .290 295 300 Gin Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gin Arg Ala Gin Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gin Leu Phe Vai Thr Vai Vai Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu Cys Thr Glu Vai Thr Lys Glu Gly 340 345 350 Thr Tyr Lys Asn Asp Asn Phe Lys Glu Tyr Vai Arg His Vai Glu Glu 355 360 365 Tyr Asp Leu Gin Phe Vai Phe Gin Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala 370 375 380 Glu Ile Met Thr Tyr Ile His Thr Met Asp Ser Asn Ile Leu Glu Asp 385 390 395 400 Trp Gin Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Gin Asp Thr 405 410 415 Tyr Arg Phe Vai Thr Ser Gin Ala Ile Thr Cys Gin Lys Thr Ala Pro 420 425 430 Pro Lys Glu Lys Glu Asp Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Vai 435 440 445 Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gin Phe Pro Leu Gly 450 455 460 Arg Lys Phe Leu Leu Gin Ser Gly Leu Lys Ala Lys Pro Arg Leu Lys 465 470 475 480 Arg Ser Ala Pro Thr Thr Arg Ala Pro Ser Thr Lys Arg Lys Lys Vai 485 490 495

Lys Lys -48-

<210> 3 <211> 1497 <212> ADN <213> Papilomavírus humano tipo 58 <400> 3 atgtccgtgt ggcggcctag tgaggccact gttgtaagca ctgatgaata tgtgtcacgc agacttttgg ctgttggcaa tccatatttt gtattagttc ccaaggtatc aggcttacag cccaataaat ttggttttcc tgatacatct tgggcatgtg taggccttga aataggtagg catccttatt tcaataaatt tgatgacact gggtctgata acagggaatg cttatctatg ggctgtaaac ctcccactgg tgagcattgg gctgctactg attgtcctcc attggaactt gtagatacag ggtttggatg catggacttt cctattgata tttgtaacag tacatgcaaa ccttatgggg atagtttgtt cttttttctt tttaataggg ccggaaaact tggcgaggct •ggtaatactg .cagttatcca aagtagtgca acctcagaat cacaattatt taataagcct aatggcattt gctggggcaa tcagttattt aatatgacat tatgcactga agtaactaag gaatatgtac gtcatgttga agaatatgac acactaactg cagagataat gacatatata tggcaatttg gtttaacacc tcctccgtct acctcccagg ctattacttg ccaaaaaaca aatáaatata ctttttggga ggttaactta tttcctttgg gacgaaagtt tttattacaa cgttcggccc ctactacccg tgcaccaécc gtgtacctgc ctcctgtgcc tgtgtctaag 60 acaagcattt attattatgc tggcagttcc 120 tccatcaaaa gtcccaataa caataaaaaa 180 tatagggtct ttagggtgcg tttacctgat 240 ttttataacc ctgatacaca acgtttggtc 300 ggacagccat tgggtgttgg cgtaagtggt 360 gaaaccagta acagatatcc cgcacagcca 420 gattataaac aaacacaatt atgtttaatt 480 ggtaaaggtg ttgcctgtaa caataatgca 540 tttaattcta ttattgagga tggtgacatg 600 ggtacattgc aggctaataa aagtgatgtg 660 tatccagatt atttaaaaat ggccagtgaa 720 agacgtgagc agatgtttgt taggcacttt 780 gtcccggatg acctttatat taaagggtcc 840 ttttttccaa ctcctagtgg ctctatggtt 900 tattggctac agcgtgcaca aggtcataac 960 gttaccgtag ttgataccac tcgtagcact 1020 gaaggtacat ataaaaatga taattttaag 1080 ttacagtttg tttttcagct ttgcaaaatt 1140 catactatgg attccaatat tttggaggac 1200 gccagtttac aggacacata tagatttgtt 1260 gcacccccta aagaaaagga agatccatta 1320 aaggaaaagt tttctgcaga tctagatcag 1380 tcaggcctta aagcaaagcc cagactaaaa 1440 accaaacgca aaaaggttaa aaaataa 1497

<210> 4 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial -49- <2 2 Ο >

<22 3> Primer PCR < 4 Ο Ο > 4 atgtccgtgt ggcggcctag t 21

<210> 5 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> Primer PCR < 4 O O > 5 gagatctgtg taagtaccac aacaatta 28

<210> 6 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> -50- <22 3> Primer PCR <400> 6 gggatcccac aaaacaaaat gtccgtgtgg c 31

<210> 7 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer PCR < 4 0 0 > 7 gggatccgtg taagtaccac aacaatta 28

<210> 8 <211> 34 <212> ADN

<213> Sequência artificial <220> <223> Primer PCR -51 - < 4 Ο Ο > 8 ggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc 34

<210> 9 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Primer PCR <400> 9 ggatcccaca aaacaaaatg tctgtctgga gacc 34

<210> 10 <211> 1497 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> HPV 58 LI antisense -52- <400> 10 tacaggcaga cctctggtag gcttcgatgg cagatgaacg gtggtcaagg tcagaggttc 60 cagcagaggt gactgcttat gcagagatct tggagataga tgatgatgcg accaaggaga 120 tetaacaacc gacaaccatt gggtatgaag aggtagttca gaggtttgtt gttgttcttc 180 cagaaccaag gtttccagag accaaacgtt atgtctcaga agtctcagtc taacggtctg 240 ggtttgttca agccaaaggg tctgtgaagg aagatgttgg gtctgtgagt ttctaaccag 300 acccgaacac agccaaacct ttagccatct ccagttggta acccacaacc acagagacca 360 gtgggtatga agttgttcaa gctgctgtgg ctttggaggt tgtctatggg tcgagttggt 420 ccaagactgt tgtctcttac aaacaggtac ctgatgttcg tttgggttaa cacaaactag 480 ccaacattcg gtggttgacc acttgtgacc ccattcccac aacgaacatt gttgttgcga 540 cgacgatggc tgacaggtgg taaccttaac aagttgaggt agtagcttct gccactgtac 600 cagctgtgac caaagccaac atacctgaag ccatggaacg ttcgattgtt caggctgcaa 660 ggttagctgt agacattgag gtggacattc atgggtctga tgaacttcta ccgaagactt 720 ggtatgccac tgaggaacaa gaagaagaac tcttctcttg tttacaagca gtctgtgaag 780 aagttgtctc gaccattcaa cccacttcga caaggtctgc tgaacatgta gttcccaaga 840 ccattgtggc gacagtaggt taggagacga aagaagggtt gaggtagacc aaggtaccag 900 tggagactta gagttaacaa gttgttcggt atgaccaacg tttctcgagt tccagtgttg 960 ttgccataga caaccccatt ggttaacaag cagtgacagc agctgtggtg atctaggtga 1020 ttgtactgga acacatggct tcagtggttc cttccatgga tgttcttgct gttgaagttc 1080 cttatgcagt ctgtgcagct ccttatgctg aacgttaagc agaaggttaa cacattctag 1140 tggaactgac gactttagta ctggatgtag gtgtggtacc tgagattgta gaaccttctg 1200 accgttaagc caaactgagg tggtggtaga cgaaggaacg ttctgtggat gtctaagcag 1260 tggagagttc gatagtggac agttttctga cgaggtggtt tccttttcct tctgggtaac 1320 ttgttcatgt ggaagaccct tcagttgaac ttccttttca agagacgact gaacctggtt 1380 aagggtaacc catctttcaa gaacaacgtt agaccaaact tccgattcgg ttctaacttc 1440 tctagacgag gttggtgatc tcgaggtagg tggttctctt tcttccagtt cttcatt 1497 -53-

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • US 60519211 B [0083]

Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição • McMurray et al. Int. J. Exp. Pathol., 2001, vol. 82(1), 15-33 [0002] • Schiffman et al., J. Natl. Câncer Inst., 1993, vol. 85(12), 958-64 [0002] • Schiller; Roden. Papilomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses. Leeds Medicai Information, 1996, 101-12 [0005][0042] • Schiller; Hidesheim. J. Clin. Virol., 2000, vol. 19, 67-74 [0005][0043] • Kirii et al. Virology. 1991, vol. 185 (1), 424-427 [0030] • Sharp; Cowen. Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 1991, vol. 7, 657-678 [0035] • Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 [0039] -54- • Ausubel et al. Current Protocols in Molecular-Biology. Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, 1989 [0039] • Rose et al. Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1990 [0039] • Baker et al. Biophys. J. 1991, vol. 60(6), 1445-56 [0042] • Breitburd et al. J. Virol., 1995, vol. 69(6), 3959-63 [0043] • Suzich et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1995, vol. 92 (25), 11553-57 [0043] • Sharp, Paul M.; Cowe, Elizabeth. Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. YEAST, 1991, vol. 7, 667-678 [0060]

Lisboa, 18/02/2010

Claims (17)

1. Reivindicações 1. Molécula de ácido nucleico que inclui uma sequência de nucleótidos que codifica uma proteína LI do HPV 58, conforme apresentado na SEQ ID NO:2, sendo que a sequência do ácido nucleico inclui uma sequência de nucleótidos conforme apresentado na SEQ ID N0:1.
2. 2. Vector que inclui a molécula de ácido nucleico da reivindicação 1.
3. 3. Célula hospedeira que inclui o vector da reivindicação 2.
4. 4. Célula hospedeira da reivindicação 3, em que a célula hospedeira é uma célula de levedura.
5. 5. Célula de levedura da reivindicação 4, em que a célula de levedura é seleccionada entre um grupo constituído por Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces frágil is, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe. -2-
6. 6. Célula hospedeira da reivindicação 5, em que a célula hospedeira é Saccharomyces cerevisiae.
7. 7. Método de produção de partículas tipo vírus (VLP's) da LI do HPV 58, que inclui: (a) transformar leveduras com uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1; (b) cultivar a levedura transformada sob condições que permitam a expressão da molécula de ácido nucleico optimizada ao nível dos codões, para produzir uma proteína recombinante de papilomavírus; e (c) isolar a proteína recombinante de papilomavírus para produzir as VLP's da LI do HPV 58.
8. 8. Método da reivindicação 7, em que a levedura é seleccionada entre um grupo constituído por Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces frágil is, Kluyveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe.
9. 9. Método de reivindicação 8, em que a levedura é Saccharomyces cerevisiae. -3-
10. 10. Método de produção de vacina destinada ao tratamento ou prevenção de infecções por HPV, sendo que o referido método inclui a produção de VLP's de LI de HVP 58 pelo método de qualquer uma das reivindicações 7 e 8.
11. 11. Método da revindicação 10, em que a vacina inclui também VLP' s de pelo menos um tipo de HPV adicional.
12. 12. Método da revindicação 11, em que o tipo de HPV adicional é seleccionado entre um grupo constituído por HPV 6, HPV 11, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 55, HPV 56, HPV 59 e HPV 68.
13. 13. Método da revindicação 12, em que o tipo de HPV adicional inclui HPV 16.
14. 14. Método da revindicação 13, em que a vacina inclui também VLP's do HPV 18.
15. 15. Método da revindicação 14, em que a vacina inclui também VLP's do HPV 6 e VLP's do HPV 11.
16. 16. Método da revindicação 14 ou 15, em que a vacina inclui -4- -4- também VLP'
17. 17. Método também VLP' do HPV 31. da revindicação 16, em que a vacina inclui do HPV 45. Lisboa, 18/02/2010