KR102092981B1 - 조절된 유전자 발현 방법 - Google Patents

Abstract

유전자 발현을 조절하는 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 본 발명에 따라, 관심있는 유전자의 발현을 조절하는 조성물 및 방법이 제공된다. 구체적으로, DNA 결합 도메인 및 루핑(looping) 인자를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 제공된다. DNA 결합 도메인과 루핑 인자는 공유결합 또는 아미노산 링커를 통해 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 징크 핑거(zinc finger) 폴리펩티드 또는 전사 활성화제-유사 이펙터(effector) 폴리펩티드를 포함한다. DNA 결합 도메인은 관심있는 유전자의 프로모터 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하여 그의 발현을 조절하도록 디자인될 수 있다.

Description

조절된 유전자 발현 방법{CONTROLLED GENE EXPRESSION METHODS}

본원은 2012년 6월 7일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/656,961호에 대한 우선권을 미국 특허법 제119조 제e항(35 U.S.C. §119(e)) 하에서 주장한다. 상기 출원은 본원에 참고로 도입된다.

본 발명은 국립보건원에 의해 부여된 승인 번호 제5R37DK058044호 및 제2RO1DK054937호 하에서 정부 지원으로 완성되었다. 정부는 본 발명에서 일부 권리를 갖는다.

본 발명은 유전자 발현의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 염색질 루핑(looping)을 통해 유전자 발현을 조절하는 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명이 속하는 기술분야의 상태를 기재하기 위해 본 명세서 전체에서 여러 공개문헌들 및 특허 문헌들이 인용되어 있다. 이들 인용들 각각은 전체적으로 기재된 것처럼 본원에 참고로 도입된다.

유전자 활성은 최대 수백 킬로염기에 의해 분리될 수 있는 근거리 조절 요소와 원거리 조절 요소의 조합에 의해 조절된다. 오랜 의문은 이들 요소들이 어떻게 기능적으로 상호작용하여 유전자 발현을 조절하는지, 유전자 특이성이 어떻게 달성되는지, 및 근처 무관한 유전자에 대한 원치 않는 효과가 어떻게 방지되는지였다. 염색체 입체구조 포착(3C) 및 그의 유도체의 사용은 원거리 염색체 요소들이 병치되어 염색질 루프를 형성함으로써 원거리 인핸서 기능의 한 기작을 제공할 수 있다는 것을 보여주었다(Cullen et al. (1993) Science 261:203-206; Dekker et al. (2002) Science 295:1306-1311). 염색질 루핑은 다수의 유전자 좌위들에서 발견되었고 염색질 섬유의 광범위한 조직화 원리를 반영한다(Dean, A. (2011) Brief Funct. Genomics 10:3-10; Kadauke et al. (2009) Biochim. Biophys. Acta, 1789:17-25; Miele et al. (2008) Mol. Biosyst., 4:1046-1057; Schoenfelder et al. (2010) Curr. Opin. Genet. Dev., 20:127-133; Sexton et al. (2009) Semin. Cell Dev. Biol., 20:849-855). 루핑이 유전자의 전체 활성화 전에 유전자에서 일어날 수 있지만, 전사의 시작은 추가 루핑된 상호작용과 밀접히 관련되어 있다(Palstra et al. (2003) Nat. Genet., 35:190-194; Spilianakis et al. (2004) Nat. Immunol., 5:1017-1027; Vernimmen et al. (2007) EMBO J., 26:2041-2051). 그러나, 전사 연장의 약리학적 억제제를 사용한 연구에 기초할 때, 계속되는 전사가 미리 형성된 염색질 루프를 유지하는 데에 불필요하다는 것이 명확해졌다(Mitchell et al. (2008) Genes Dev., 22:20-25; Palstra et al. (2008) PLoS ONE 3:e1661). 더욱이, 염색질 루핑은 활성 유전자로 한정되지 않는다. 예를 들면, Kit 유전자의 억제 시, 인핸서-프로모터 루프의 상실은 유전자 본체 내에서의 새로운 루프 형성을 동반한다(Jing et al. (2008) Mol. Cell., 29:232-242). 이들 연구들은 염색질 루프가 매우 동적이고 활성 유전자 및 억제된 유전자에서 일어난다는 것을 시사하지만, 이들 원거리 상호작용이 전사 개시에서의 동적 변화의 원인인지 아니면 결과인지에 대한 의문을 미해결된 상태로 남겨둔다.

본 발명에 따라, 관심있는 유전자의 발현을 조절하는 조성물 및 방법이 제공된다. 구체적으로, DNA 결합 도메인 및 루핑 인자를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 제공된다. DNA 결합 도메인 및 루핑 인자는 공유결합 또는 아미노산 링커를 통해 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 징크 핑거(zinc finger) 폴리펩티드 또는 전사 활성화제-유사 이펙터(effector) 폴리펩티드를 포함한다. DNA 결합 도메인은 관심있는 유전자의 프로모터 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하여 그의 발현을 조절하도록 디자인될 수 있다. 특정 실시양태에서, 루핑 인자는 LIM 도메인 결합 1(Ldb1) 또는 이의 단편이다. 특정 실시양태에서, Ldb1의 단편은 Ldb1의 자가-회합 도메인(예를 들면, Ldb1의 아미노산 1부터 약 200까지)을 포함한다. 상기 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드도 본 발명에 포함된다. 하나 이상의 상기 핵산 분자를 포함하는 조성물 및 벡터도 본원에서 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 세포에서 관심있는 유전자의 발현을 조절하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 세포에서 하나 이상의 본 발명의 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함한다. 상기 핵산 분자는 임의의 수단(예를 들면, (예를 들면, 바이러스 벡터를 통한) 형질감염 또는 감염)에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 방법은 세포에서 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자를 발현시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자는 DNA 결합 도메인 및 루핑 인자를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 코딩하고, 제1 폴리펩티드의 DNA 결합 도메인은 관심있는 유전자의 프로모터 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하고, 제2 폴리펩티드의 DNA 결합 도메인은 관심있는 유전자의 좌위 조절 영역(locus control region) 내의 표적 서열에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 비정상적인 단백질 발현과 관련된 질환 또는 장애를 억제하고/하거나, 치료하고/하거나 예방하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 본 발명의 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

도 1은 β-글로빈 좌위의 ZF 표적화를 보여준다. 도 1a는 모 G1E 세포(중간) 및 유도된 GATA1-ER을 발현하는 G1E 세포(상부, 하부)로부터의 β-글로빈 좌위를 포괄하는 항-GATA1(상부) 및 항-TAL1(중간 및 하부) ChIP-seq 트랙을 보여준다. TAL1은 그들의 점유 패턴이 사실상 동일하기 때문에 Ldb1의 존재에 대한 신뢰할만한 표시자이다(Tripic et al. (2009) Blood 113:2191-2201). GATA1의 부재 하에서, TAL1은 β-메이저(major) 글로빈 프로모터로부터 완전히 상실되지만, LCR은 그러하지 않는다. 도 1b는 각각 LCR(서열번호 81) 및 β-메이저 프로모터(서열번호 82)의 L-ZF 및 P-ZF 표적 HS2를 보여준다. ZF 결합 부위의 18개 뉴클레오티드(대문자) 및 플랭킹 뉴클레오티드(소문자)를 포함하는, ELISA 실험을 위해 사용된 DNA 서열이 제시되어 있다. G1E 세포에서 HA 태그부착된 P-ZF(도 1c) 및 L-ZF(도 1d)의 항-HA ChIP 프로파일이 제시되었다. N = 3; 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.
도 2는 β-글로빈 좌위로의 Ldb1의 ZF 매개 표적화를 보여준다. 도 2a(상부)는 GATA1 및 TAL1 복합체가 Ldb1을 동원하여 염색질 루핑을 촉진한다는 야생형 시나리오의 개략도를 보여준다. 도 2a(중간)는 GATA1의 결여가 프로모터에서의 Ldb1의 상실, 손상된 루핑 및 감소된 전사 활성화를 초래한다는 것을 보여준다. 도 2a(하부)는 β-글로빈 프로모터에 부착하는 ZF 매개 Ldb1, 및 루핑 및 전사 활성화를 회복시키는 그의 능력을 보여준다. 도 2b는 P-ZF 및 L-ZF가 각각 β-메이저 프로모터 및 LCR의 HS2를 표적화한다는 것을 보여준다. 도 2b 내지 2d는 P-Ldb1(도 2b), L-Ldb1(도 2c) 및 L-Ldb1+P-Ldb1(도 2d)을 발현하는 세포에서 항-HA ChIP를 보여준다. L-Ldb1은 LCR의 HS2에 선택적으로 결합한다. P-Ldb1은 상기 프로모터에 결합하지만 LCR의 HS1, HS2 및 HS3과도 회합하되, εy, βH1 및 βmin 유전자를 포함하는 다른 영역, 개재 영역(IVR16) 또는 불활성 유전자(CD4)에는 결합하지 않는다. N ≥ 3; 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.
도 3은 3C 질 조절을 보여준다. 도 3a는 BAC DNA의 대표적인 겔 전기영동을 제공한다. BAC DNA를 정제하고(레인 2), BglII로 분해하고(레인 3), T4 연결효소(ligase)로 연결시켜(레인 4) 3C 분석을 위한 표준 DNA로서 작용하는 BglII 단편의 무작위 연결 생성물을 발생시켰다. 도 3b는 순차적으로 희석된 BAC DNA를 주형으로서 사용하여 대표적인 3C 프라이머들의 선형성을 시험하였다는 것을 보여준다. 도 3c는 대표적인 3C 프라이머들의 증폭 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여 프라이머 특이성을 입증하였다는 것을 보여준다. 도 3d는 대표적인 3C 실험의 HS2 부위에서의 분해 효율을 제공한다.
도 4는 부착된 Ldb1 또는 그의 SA 도메인에 의한 GATA1 전무(null) 세포에서의 β-글로빈 전사의 활성화를 보여준다. 도 4a는 G1E 세포, 및 표시된 ZF 및 ZF-Ldb1 구축물을 발현하는 유도체에서 엑손 2에 대한 프라이머 쌍을 사용한 RT-qPCR에 의해 측정된 β-메이저 mRNA를 보여준다. 도 4b는 유도된 G1E-ER4 세포(G1E+GATA1)로부터 수득된 데이터 옆에 재작도된 도 4a의 데이터를 보여준다. P-Ldb1 또는 L-Ldb1+PLdb1에 의해 달성된 β-메이저 발현이 GATA1에 의해 유도된 β-메이저 발현의 대략 20%에 해당한다는 것을 주목한다. 도 4c는 RT-qPCR에 의해 측정되었을 때 표시된 적혈구 유전자의 상대적인 발현을 제공한다. 도 4d는 Ldb1의 SA 도메인에 융합된 표시된 ZF를 발현하는 G1E 세포에서의 Ldb1(SA, 자가-회합 도메인, LID, LIM 상호작용 도메인) 및 β-메이저 mRNA 수준의 개략도를 제공한다. 전사체 수준은 β-액틴으로 표준화되었다. N ≥ 3; 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.
도 5a는 엑손 2/3 연접부, 5UTR 및 3UTR에 대한 프라이머 쌍들을 사용한 RT-qPCR에 의해 측정되었을 때 ZF-Ldb1 발현 세포에서의 β-메이저 mRNA 수준을 보여준다. 도 5b는 L-SA(상부), P-SA(중간) 및 L-SA+PSA(하부)를 발현하는 G1E 세포에서의 항-HA ChIP 프로파일을 보여준다. L-SA는 LCR의 HS2에 선택적으로 결합한다. P-SA는 상기 프로모터에 결합하고 LCR의 HS1, HS2 및 HS3과도 회합하되, εy, βH1 및 βmin 유전자를 포함하는 다른 영역, 개재 영역(IVR16) 또는 불활성 유전자(mCD4)에는 결합하지 않는다. 도 5c는 G1E 세포, 및 표시된 ZF 및 ZF-SA 구축물을 발현하는 유도체에서 RT-qPCR에 의해 측정되었을 때 표시된 유전자의 mRNA 수준을 보여준다. β-메이저는 P-SA 또는 P-SA/L-SA 세포에서 현저히 활성화되지만, GATA1-억제된 유전자(Gata2, Kit) 및 GATA1-활성화된 유전자(Eraf)의 mRNA 수준은 ZF-융합 단백질 발현에 의해 거의 변화되지 않았다. N = 3; 오차 막대는 표준편차를 나타낸다. mRNA 수준은 β-액틴으로 표준화되었다.
도 6은 부착된 Ldb1 자가-회합 도메인에 의한 염색질 루핑을 보여준다. 도 6a 내지 6d는 GATA1을 발현하는 G1E 세포 또는 유도된 G1E-ER4 세포, 또는 P-SA, L-SA 또는 L-SA+P-SA를 함유하는 G1E 세포에서 좌위 광범위 교차연결 빈도를 측정하는 3C 분석을 제공한다. 뮤린 β-글로빈 좌위는 각각의 그래프의 상부에 표시되어 있다. X-축은 0을 나타내는, εy 유전자로부터의 거리(kb)를 표시한다. 흑색 막대는 고착제로서 작용하는 HS2 함유 BglII 단편을 나타낸다. 회색 막대는 분석된 BglII 단편을 나타낸다. N = 3(도 6a, 6b 및 6d) 및 N = 2(도 6c). 오차 막대는 평균의 표준오차를 표시한다.
도 7은 ZF-SA에 의한 중합효소 II 동원 및 세린 5 인산화의 회복을 보여준다. 도 7a는 앰플리콘의 위치(흑색 막대)를 보여준다. Prom, 프로모터; 숫자는 엑손을 표시한다. 도 7b 및 7c는 총 중합효소(도 7b) 및 ser5ph(도 7c)에 대한 항체와 함께 G1E 세포, 또는 GATA1 또는 P-SA를 발현하는 G1E 세포를 사용한 ChIP 분석을 제공한다. 프로모터에 결합하는 총 중합효소 II는 GATA1에 의해 유도된 것과 일치하였으나, 유전자의 본체에서의 중합효소 II 수준은 P-SA 세포에서 부분적으로만 회복되었는데, 이것은 전사 연장의 불완전한 복구와 일치한다(도 4b와 비교). N = 3; 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.
도 8은 CDK9(도 8a) 및 H3K4me3(도 8b)에 대한 항체와 함께 G1E 세포, 또는 GATA1 또는 P-SA를 발현하는 유도체를 사용한 ChIP 프로파일을 보여준다.
도 9는 ZF-SA가 일차 초기 원시세포에서 β-글로빈 발현을 향상시킨다는 것을 보여준다. 도 9a는 Ter119 및 CD71 프로파일링에 의한 E13.5 태아 간 적혈구 세포의 단계분류를 보여준다. 도 9b는 ZF 구축물로 형질도입된 FASC 정제된 R1 세포로부터의 mRNA를 표시된 유전자들에 대한 프라이머들을 사용한 RT-qPCR로 조사하였다는 것을 보여준다. 음성 대조군(Neg Ctrl), 빈 벡터를 발현하는 세포. 결과는 GAPDH로 표준화되었다. N = 3; 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 qPCR에 의해 측정되었을 때 태아 간 세포의 R1 내지 R4 집단에서의 표시된 유전자의 mRNA 수준을 보여준다. N = 3; 오차 막대는 표준편차를 나타낸다. 도 10c는 Ter119 및 CD71 표면 마커들을 사용한 유동세포측정(flow cytometry)에 의해 측정되었을 때 표시된 구축물들을 발현하는 R1 세포의 분화 프로파일을 제공한다.
도 11은 ZF-SA 단백질에 의한 β-글로빈 유도의 LCR 의존성을 보여준다. 도 11a는 LCR 결실 대립형질이 β-메이저 D 일배체형의 배경 상에 존재하지만, 야생형 대립형질은 β-메이저 S 일배체형의 배경 상에 존재한다는 것을 보여준다. 도 11b는 표시된 ZF-SA 단백질을 발현하는 WT/△LCR 또는 △LCR/ΔLCR 태아 간으로부터의 R1 세포에서 대립형질 특이적 RT-qPCR에 의해 측정되었을 때 β-메이저 전사체 수준을 보여준다. 전사체 수준은 GAPDH로 표준화되었다. N = 3; 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.
도 12는 대립형질 특이적 qPCR을 보여준다. 도 12a는 각각 대립형질 특이적 프라이머 βmaj-D 및 βmaj-S를 사용한 qPCR에 의해 측정되었을 때 D 일배체형 및 S 일배체형의 β-메이저 mRNA 수준을 보여준다. D 일배체형 또는 S 일배체형으로부터의 cDNA를 각각 129 또는 BL6 마우스 품종으로부터 준비하였다. βmaj-S 프라이머는 BL6 cDNA를 특이적으로 증폭하였지만 129 cDNA를 증폭하지는 못하였다. 대조적으로, βmaj-D 프라이머는 βmaj-S 프라이머의 약 10% 효율로 BL6 cDNA를 교차증폭하였다. D-cDNA 주형과 S-cDNA 주형을 혼합하여 대립형질 특이성을 더 조사하였다. 관찰된 qPCR 신호(도 12c)는 대립형질 특이적 qPCR에 대한 예상(도 12b)과 거의 일치하였다. βmaj-S 신호는 D-cDNA의 양이 증가함에 따라 변화되지 않은 상태로 유지되었는데, 이것은 그의 증폭 특이성을 입증한다. 그러나, S-cDNA의 증가하는 비율은 증강된 신호를 초래하였는데, 이때 D 특이적 프라이머는 최대 약 10%의 교차반응성을 나타낸다.
도 13a는 표시된 ZF-SA 단백질을 발현하는 WT/△LCR 태아 간으로부터의 R1 세포에서 표시된 유전자들의 mRNA 수준을 보여준다. R1 세포를 ZF-SA 발현 구축물로 형질도입한 후 에리쓰로포이에틴(Epo)으로 6시간 동안 처리하였다. N = 3; 오차 막대는 표준편차를 나타낸다. 도 13b 및 13c는 Epo로 처리되지 않은, 표시된 ZF-SA 단백질을 발현하는 WT/△LCR 태아 간으로부터의 R1 세포에서 β-메이저 글로빈(도 13b) 또는 표시된 대조군 유전자(도 13c)의 mRNA 수준을 측정하는 RT-qPCR을 보여준다. mRNA 수준은 GAPDH로 표준화되었다. N = 3; 오차 막대는 표준편차를 나타낸다.
도 14는 염색질 루핑 및 전사 활성화를 기능적으로 도입하는 개략적인 모델을 제공한다. ZF 단백질 또는 GATA1에 의한 β-글로빈 프로모터로의 Ldb1의 동원은 LCR-프로모터 루핑을 촉진한다. ZFLdb1에 의한 강요된 염색질 루핑은 PIC 조립, 중합효소 II 동원, 중합효소 II 세린 5 인산화(YSPTSPS - 서열번호 83) 및 전사 개시를 효율적으로 회복시킨다. GATA1의 부재 하에서, P-TEFb 및 아마도 추가 GATA1 보조인자의 감소된 동원은 비효율적인 전사 연장의 원인이다. 따라서, 염색질 루핑은 전사 개시를 유발할 수 있고 전체 전사 연장과 무관하게 일어날 수 있다.
도 15는 인간 Ldb 단백질의 아미노산 서열을 제공한다. 도 15a는 서열번호 1을 제공하고, 도 15b는 서열번호 2를 제공한다.
도 16a는 성체 세포에서의 배아 β-글로빈의 재활성화를 위한 실험 디자인의 개략도를 보여준다. ZF 단백질은 배아 β-글로빈인 βh1의 프로모터를 표적화하도록 디자인되었다. GATA1 발현 G1E 세포에서의 ZF-SA 융합 단백질의 발현은 SA 도메인을 βh1 프로모터에 부착시키고 LCR이 침묵된 βh1 유전자로 향하게 하여 βh1 전사를 활성화시킬 것으로 예상된다. 도 16b는 빈 벡터 또는 P-SA 구축물을 발현하는 G1E 세포 또는 G1E+GATA1 세포에서 RT-qPCR에 의해 측정된 mRNA 수준의 그래프를 제공한다. 데이터는 β-액틴으로 표준화되었다.
도 17은 ZF-Ld1 융합 단백질(GFP+)을 발현하는 일차 인간 적혈구 세포에서 상승된 감마 글로빈 생성을 보여주는 그래프를 제공한다.

염색질 루프는 원거리 인핸서를 활성 프로모터와 병치하지만, 그들의 분자 구조 및 전사와의 관계는 불명확한 상태로 남아있다. 적혈구 세포에서, 좌위 조절 영역(LCR) 및 β-글로빈 프로모터는 전사 인자 GATA1 및 관련된 분자 Ldb1을 요구하는 염색질 루프를 형성한다. β-글로빈 좌위가 이완되어 있고 불활성 상태인 GATA1 전무 적아세포에서 Ldb1을 β-글로빈 프로모터에 부착시키기 위해 인공 징크 핑거(ZF)를 사용하였다. 놀랍게도, β-글로빈 프로모터로의 Ldb1 또는 그의 자가-회합 도메인만의 표적화는 GATA1의 부재 하에서 β-글로빈 전사를 실질적으로 활성화시켰다. 프로모터에 부착된 Ldb1은 LCR에서 내생성 Ldb1 복합체와 상호작용하여 RNA 중합효소 II의 동원 및 인산화를 야기하는 염색질 루프를 형성하였다. ZF-Ldb1 단백질은 LCR을 결여하는 대립형질에서 불활성 상태이었는데, 이것은 그들의 활성이 원거리 상호작용에 의존한다는 것을 입증한다. 상기 발견은 Ldb1을 GATA1 매개 루프 형성의 중요한 이펙터로서 확립하고 염색질 루핑이 원인 면에서 유전자 조절의 기초가 된다는 것을 시사한다.

본원에서 ZF 표적화 방법을 이용하여 염색질 섬유의 고차 조직화에 관한 중요한 의문을 해결하였다. 내재성 β-글로빈 좌위로의 Ldb1의 SA 도메인의 표적화는 GATA1의 상실을 상당한 정도까지 보상하였는데, 이것은 Ldb1이 염색질 루프 형성 동안 GATA1의 이펙터로서 작용한다는 것을 강력히 암시한다. 천연 유전자 좌위에서 ZF-SA 단백질에 의한 강요된 염색질 루핑은 강한 전사 활성화를 야기하였는데, 이것은 인핸서와 프로모터의 병치가 원인 면에서 유전자 유도의 기초가 된다는 것을 시사한다.

P-SA의 발현은 그 자체가 P-SA 및 L-SA 동시발현의 효과와 매우 유사한 효과를 생성하였다. 여러 독립적인 연구 라인들은 P-SA 발현 세포에서 강요된 루프 형성이 β-글로빈 활성화의 원인이 된다는 것을 입증한다. 첫째, 3C 실험은 β-글로빈 프로모터에의 SA 도메인의 부착이 그들의 공간적 입체구조 및 효율 면에서 GATA1에 의해 유도된 게놈 접촉과 매우 유사한 게놈 접촉을 조성하였다는 것을 명확히 보여주었다. 둘째, SA 도메인 동원은 β-글로빈 프로모터에서 중합효소 II 동원, 중합효소 II의 세린 5 인산화 및 H3K4 메틸화를 포함하는 여러 LCR 의존적 기능을 완전히 회복시켰다. 셋째, LCR의 표적화된 결실은 프로모터에 결합된 Ldb1의 양을 감소시키지 않으면서 β-글로빈 전사를 현저히 감소시켰다(Song et al. (2010) Blood 116:2356-64). 따라서, 상기 프로모터에의 Ldb1 또는 그의 SA 도메인의 부착은 LCR의 관여 없이 그러한 현저한 효과를 생성할 것으로 예상되지 않는다. 넷째, β-글로빈 발현의 P-SA 및 P-SA/L-SA 유도는 LCR에 전적으로 의존하였는데, 이것은 근원적인 루핑 기작을 확인시켜준다. 루프 형성을 강력히 유도하는 P-SA의 능력은 GATA1의 부재 하에서조차도 LCR에 존재하는 내재성 Ldb1 함유 복합체와 상호작용하는 그의 능력에 의해 가장 잘 설명될 것이다(도 1a; Tripic et al. (2009) Blood 113:2191-2201). 대조적으로, Ldb1과 β-글로빈 프로모터의 회합은 전적으로 GATA1에 의존하므로, 염색질 루핑 및 고수준 전사 동안 임계적인 속도 제한 단계를 대표할 것이다.

SA 도메인이 원거리 염색질 상호작용을 유도하기에 충분하다는 관찰결과는 Ldb1의 자가-회합이 고착된 염색질 영역들을 함께 묶는 주요 분자적 힘이라는 것을 내포한다. 중요하게는, SA 도메인은 원거리 염색질 단편들 사이의 상호작용을 안정화시키는 작용을 할 고차 복합체의 형성을 가능하게 하는 다량체를 형성할 수 있다(Cross et al. (2010) J. Mol. Biol., 399:133-144). 그러나, Ldb1의 SA 결실된 형태도 활성을 나타내었는데, 이것은 LID 도메인도 비록 보다 낮은 효율일지라도 내생성 Ldb1 복합체를 동원하여 원거리 상호작용을 촉진할 수 있다는 것을 암시한다.

DNA에 결합된 인자들 사이의 다수의 접촉은 염색질 루프를 유도하는 데에 필요한 특이성 및 친화성을 제공하기 위해 요구될 것이다. 더욱이, 염색질 섬유의 폴딩(folding)은 염색질 허브로서 지칭되는 것을 형성하기 위해 다수의 절편들 사이의 동시적인 상호작용을 수반하는 복잡한 패턴으로 일어날 수 있다. 단순한 단백질 이량체는 이러한 복잡한 상호작용 패턴을 수용하기에 불충분할 것이다. 종합하건대, 다량체를 형성할 수 있는 다양한 이량체화 도메인(lexA, p65NFkB, 아전트(Argent)™ 이량체화 시스템) 또는 단백질 모듈, 예컨대, GAGA 인자의 POZ 도메인과 ZF의 융합은 β-글로빈 발현을 효율적으로 활성화시키지 못하였다. 따라서, Ldb1은 동종다량체를 형성함으로써 및 LMO2/TAL1/E2A 복합체 및 GATA1을 포함하는 다수의 유전자 특이적 전사 인자를 연루시킴으로써 이러한 상호작용을 촉진하도록 진화되었을 것이다. 실제로, Ldb1에 대한 광범위하게 사용되고 진화적으로 보존된 루핑 기능이 다양한 유기체들 및 세포 계통들에서의 연구에 의해 암시된다(Matthews et al. (2003) EMBO Rep., 4:1132-1137; Morcillo et al. (1997) Genes Dev., 11:2729-2740; Thaler et al. (2002) Cell 110:237-249).

염색질 루핑과 유전자 조절 사이의 원인-효과 관계는 불명확하다. 천연 유전자 좌위에서 염색질 입체구조를 조작함으로써 인핸서와 그의 표적 유전자의 병치가 전사 활성화를 초래한다는 것을 발견하였는데, 이것은 루핑이 전사 활성화를 위한 전제조건이라는 것을 시사한다. 특히, LCR과 β-글로빈 유전자 사이의 강요된 회합은 LCR에 기인하는 2가지 기능, 즉 프로모터에서의 개시 전 복합체의 형성 및 세린 5 인산화에 반영된 초기 연장 중합효소 II의 발생을 발휘하기에 충분하였다(Sawado et al. (2003) Genes Dev., 17:1009-1018; Song et al. (2010) Blood 116:2356-64). 다른 한편으로, ZF-Ldb1 단백질이 염색질 루핑을 완전히 복구하였으나 전사 연장을 부분적으로만 회복시켰다는 본 관찰결과는 완전한 전사가 루프 형성을 위한 요구되지 않는다는 개념(Jing et al. (2008) Mol. Cell., 29:232-242; Mitchell et al. (2008) Genes Dev., 22:20-25; Palstra et al. (2008) PLoS ONE 3:e1661)과 일치한다. LCR과 β-글로빈 프로모터의 병치는 상기 프로모터에서의 핵 조절제의 농도를 개시 전 복합체 형성 및 초기 전사 연장을 위한 임계 역치를 초과하는 수준으로 증가시킬 것이다(도 14).

GATA1 전무 세포에서의 Ldb1 동원은 염색질 루핑 및 전사 개시를 완전히 복구하였지만, 전사 연장을 부분적으로만 회복시켰는데, 이것은 GATA1이 Ldb1 및 염색질 루핑과 무관하게 추가 기능을 부여한다는 것을 시사한다. 실제로, P-TEFb 복합체의 동원 및 유전자를 따라 존재하는 그의 분포 둘다가 GATA1의 부재 하에서 손상되었는데, 이것은 GATA1이 아마도 직접적인 상호작용을 통해(Bottardi et al. (2011) Nucleic Acids Res., 39:3505-3519; Elagib et al. (2008) Blood 112:4884-4894) 또는 간접적으로 BET 패밀리의 단백질을 통해(Lamonica et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci., 108:E159-168) 다수의 수준으로 P-TEFb 조절에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 또한, GATA1은 많은 다른 전사 인자들 및 히스톤 변경제들과 상호작용하고, 이의 결여는 비효율적인 전사 연장의 원인이 될 것이다.

종합하건대, 이들 결과들은 Ldb1이 병렬 경로보다는 오히려 GATA1의 다운스트림에서 작용한다는 것을 시사하고 전사 주기에서 상이한 단계 동안 단백질 기능에 대한 정보를 얻는 데에 있어서 이 시스템의 유용성을 강조한다. 보다 일반적인 관점에서, 이 연구는 전사 인자 기능의 계층적 순서를 확립하는 신규 방법을 보여준다. 전사 인자 결핍의 배경에서, 선택된 유전자에의 잠재적인 보조인자의 강요된 부착을 이용하여 전사 주기에서 정의된 단계들, 예컨대, 루프 형성, 중합효소 II 동원, 중합효소 II 인산화 및 생산적 전사 연장에의 그의 기여를 측정할 수 있다. 이 방법은 넉다운될 수 있거나 넉아웃될 수 있는 임의의 핵 인자에 널리 적용될 수 있다.

본 연구의 한 일반적인 발견은 β-글로빈 프로모터에 표적화된 단일 ZF-Ldb1 단백질이 내생성 LCR-결합된 인자와 상호작용함으로써 염색질 루프를 유도할 수 있다는 것이다. 종래에, ZF는 유전자 발현을 성공적으로 활성화시키기 위해 활성화 도메인에 연결되었다(Klug, A. (2010) Annu. Rev. Biochem., 79:213-231). 그러나, 강력한 인핸서 또는 LCR과의 상호작용을 촉진하기 위한 ZF의 사용은 보다 현저한 전사 효과를 생성할 것으로 예상된다. 실제로, 유전자 전사를 1000배 초과의 배수만큼 활성화시킬 수 있는 공지된 단일 ZF 단백질은 없다. 특히 치료 적용 면에서 단일 ZF 구축물에 의한 강요된 루핑 방법의 또 다른 장점은 단일 분자의 효율적인 발현이 2개의 인자들을 일치하는 수준으로 동시발현시키는 것보다 더 용이하다는 점이다.

마지막으로, 특정 염색질 루프가 억제된 유전자에서 발생할 수 있고(Jing et al. (2008) Mol. Cell., 29:232-242), 인핸서와 프로모터를 별개의 루프들 상에 배치하는 것은 인핸서를 고립시켜 그를 불활성 상태로 만들 수 있다(Ameres et al. (2005) EMBO J., 24:358-367; Hou et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci., 105:20398-20403). 따라서, 강요된 염색질 루핑은 전사의 활성화 이외에 과학적 또는 치료적 목적으로 유전자 발현을 침묵시키는 데에 사용될 수 있다.

본 발명은 관심있는 유전자(및 코딩된 단백질)의 발현을 조절하는 조성물 및 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 관심있는 유전자의 발현을 조절하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩티드는 DNA 결합 도메인 및 루핑 인자를 포함한다. DNA 결합 인자는 루핑 인자의 N-말단에 위치할 수 있다. DNA 결합 도메인과 루핑 인자는 서로 직접적으로 연결될 수 있거나 링커를 통해 연결될 수 있다. 일반적으로, 링커는 공유결합을 포함하는 화학적 모이어티(moiety), 또는 2개의 도메인들 또는 폴리펩티드들을 공유적으로 부착시키는 원자 쇄이다. 특정 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드(예를 들면, 약 1개 내지 약 50개 아미노산, 약 1개 내지 약 20개 아미노산, 약 1개 내지 약 10개 아미노산, 또는 약 1개 내지 약 5개 아미노산)일 수 있다. 융합 폴리펩티드는 하나 이상의 친화성 태그 및/또는 하나 이상의 핵 국소화 서열(예를 들면, SV40 큰 T-항원 NLS 또는 뉴클레오플라스민 NLS)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 친화성 태그 및/또는 NLS는 융합 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다.

DNA 결합 도메인은 독특한 또는 드문 예정된 표적 게놈 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. DNA 결합 도메인은 임의의 합성 또는 기존 천연 DNA 결합 도메인일 수 있다. DNA 결합 도메인의 예로는 펩티드 핵산(PNA), 징크 핑거 단백질(ZFP) 및 전사 활성화제-유사 이펙터(TALE) 단백질이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 징크 핑거 단백질이다.

징크 핑거 단백질은 선택된 임의의 핵산 서열을 인식하고 이러한 핵산 서열에 결합하도록 조작될 수 있다(예를 들면, 문헌(Bartsevich et al. (2003) Stem Cells 21:632-637); 문헌(Klug, A. (2010) Annu. Rev. Biochem., 79:213-231); 문헌(Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol., 20:135-141); 문헌(Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem., 70:313-340); 문헌(Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol., 19:656-660); 문헌(Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol., 12:632-637); 문헌(Sera et al. (2002) Biochemistry 41:7074-7081); 문헌(Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol., 10:411-416); 문헌(Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem., 275(43):33850-33860); 문헌(Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol., 26:702-708); 문헌(Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci., 105:5809-5814); 미국 특허 제6,453,242호, 제6,607,882호 및 제6,534,261호; www.zincfingertools.org; bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiT/; 문헌(Mandell et al. (2006) Nuc. Acid Res., 34:W516-W523); 및 문헌(Sander et al. (2007) Nuc. Acid Res., 35:W599-W605) 참조). 징크 핑거 결합 도메인은 1개, 2개, 3개 또는 4개 이상의 징크 핑거 인식 영역(즉, 징크 핑거)을 포함할 수 있다. 징크 핑거 인식 영역 및/또는 다중-핑거드(multi-fingered) 징크 핑거 단백질은 적합한 링커 서열(예를 들면, 링커는 길이에 있어서 1개 이상의 아미노산, 특히 약 5개 이상의 아미노산을 포함할 수 있음)을 사용함으로써 함께 연결될 수 있다.

징크 핑거 단백질과 마찬가지로, TALE 단백질은 원하는 표적 서열에 함께 결합하는 다수의 DNA 결합 영역들을 함유한다(Gu et al. (2005) Nature 435:1122; Yang et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci., 103:10503; Kay et al. (2007) Science 318:648; Sugio et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci., 104:10720; Romer et al. (2007) Science 318:645; Schornack et al. (2006) J. Plant Physiol. 163:256). TALE 단백질은 공지된 방법에 의해 원하는 서열에 결합하도록 조작될 수 있다(예를 들면, 미국 특허출원 공보 제2011/0145940호 및 국제 특허출원 공보 제WO 2010/079430호 참조).

특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 관심있는 유전자의 프로모터 내의 표적 서열을 특이적으로 인식하여 이 표적 서열에 결합한다. 표적 서열은 길이에 있어서 약 10개 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 특히 길이에 있어서 약 15개 내지 약 21개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 글로빈 프로모터, 예컨대, β-메이저 프로모터 또는 태아 (감마) 유전자 프로모터이다. 마우스 β-메이저 글로빈 유전자(Hbb-b1)의 서열은 유전자 ID: 15129(진뱅크 등록번호 NM_008220.4)에 제공되어 있고, 인간 β-메이저 글로빈 유전자(HBB)는 유전자 ID: 3043(진뱅크 등록번호 NM_000518.4)에 제공되어 있고, 인간 태아 감마 글로빈 유전자(HBG1 및 HBG2)는 유전자 ID: 3047 및 3048(진뱅크 등록번호 NM_000559.2 및 NM_000184.2)에 제공되어 있다. 표적 서열은 도 1b에 제공된 서열 또는 다른 종에서의 상응하는 서열을 포함하나 이들로 한정되지 않는 프로모터 영역 내에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인에 의해 특이적으로 결합되는 표적 서열은 공지된 전사 결합 부위가 아니고 전사 인자와 공지된 전사 결합 부위의 결합을 방해하지 않는다.

본 발명의 융합 폴리펩티드의 루핑 인자는 염색질 루프의 형성에 있어서 보조인자일 수 있고 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 루핑 인자는 LIM 도메인 결합 단백질(Ldb 또는 NLI 또는 CLIM; 인간 Ldb1 단백질의 경우: 유전자 ID: 8861; 진뱅크 등록번호 NP_001106878(도 15b; 서열번호 2), NP_003884.1(도 15a; 서열번호 1)) 또는 이의 단편이다. Ldb는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, Ldb 단백질은 인간 Ldb1 또는 Ldb2, 특히 Ldb1이다. 특정 실시양태에서, 루핑 인자는 자가-회합 도메인(진뱅크 등록번호 NP_001106878의 아미노산 37부터 237까지 해당하는 진뱅크 등록번호 NP_003884.1의 아미노산 1부터 200까지)을 포함하는 Ldb1의 N-말단 단편(즉, 전체 길이보다 더 짧음)이다. Ldb1의 N-말단 단편은 Ldb1(예를 들면, 진뱅크 등록번호 NP_003884.1)의 아미노산 1부터 약 150까지, 1부터 약 175까지, 1부터 약 200까지, 1부터 약 225까지, 1부터 약 250까지, 1부터 약 275까지, 1부터 약 300까지, 1부터 약 325까지, 또는 1부터 약 350까지 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 루핑 인자는 자가-회합 도메인을 결여하는 Ldb1의 C-말단 단편(전체 길이보다 더 짧음)이다. Ldb1의 C-말단 단편은 Ldb1(예를 들면, 진뱅크 등록번호 NP_003884.1)의 1부터 약 150까지, 1부터 약 175까지, 1부터 약 200까지, 1부터 약 225까지, 1부터 약 250까지, 1부터 약 275까지, 1부터 약 300까지, 1부터 약 325까지, 또는 1부터 약 350까지 결여할 수 있다. 본 발명의 융합 폴리펩티드에서 Ldb1의 아미노산 서열은 상기 확인된 서열들과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 85%, 97%, 99% 또는 100% 이상의 상동성을 가질 수 있다.

상기 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자도 본 발명에 포함된다. DNA 결합 도메인 및 루핑 인자를 코딩하는 핵산 서열들은 바람직하게는 (예를 들면, 직접적으로 또는 링커를 통해) 인-프레임(in-frame)으로 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 당분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 핵산 분자는 임의의 편리한 벡터, 특히 발현 벡터 내에서 유지될 수 있다. 핵산 서열이 발현될 세포를 기초로 상이한 프로모터를 사용하여 상기 핵산 서열의 발현을 유도할 수 있다. 항생제 내성 마커도 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 하기 위해 이들 벡터들 내에 포함된다. 본 발명의 융합 폴리펩티드 코딩 핵산 분자는 단일 또는 이중 가닥일 수 있는 cDNA, DNA, RNA 및 이들의 단편을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 방법은 루핑 인자 및 DNA 결합 도메인을 포함하는 제2 융합 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2 융합 폴리펩티드의 루핑 인자는 제1 융합 폴리펩티드의 루핑 인자와 동일하다. 제2 융합 폴리펩티드의 DNA 결합 도메인은 LCR 내의 표적 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 표적 서열은 길이에 있어서 약 10개 내지 약 30개의 뉴클레오티드, 특히 길이에 있어서 약 15개 내지 약 21개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2 융합 폴리펩티드의 DNA 결합 도메인은 LCR의 과민감성 부위 2(HS2)에 결합한다. 유전자 ID: 15128은 Hbb-ar 헤모글로빈 활성화 영역(머스 머스큘러스(Mus musculus))의 서열을 제공하고, 유전자 ID: 387281은 LCRB 좌위 조절 영역 베타(호모 사피엔스(Homo sapiens))의 서열을 제공한다. 표적화된 서열은 도 1b에 제공된 HS2 서열 또는 다른 종에서의 상응하는 서열을 포함하나 이들로 한정되지 않는 LCR 영역 내에 존재할 수 있다. 제1 융합 폴리펩티드 및 제2 융합 폴리펩티드(또는 이들을 코딩하는 핵산들)는 동시적으로 및/또는 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 융합 폴리펩티드 및 제2 융합 폴리펩티드는 동일한 벡터 내의 별개의 핵산 분자들에 의해 코딩된다. 대안적으로, 제1 융합 폴리펩티드 및 제2 융합 폴리펩티드는 별개의 벡터들 내의 별개의 핵산 분자들에 의해 코딩된다. 제1 융합 폴리펩티드 및 제2 융합 폴리펩티드를 코딩하는 단일 핵산 분자, 또는 제1 융합 폴리펩티드 및 제2 융합 폴리펩티드를 코딩하는 별개의 핵산 분자; 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 본 발명에 포함된다.

관심있는 단백질의 발현의 증가가 본원 전체에 기재되어 있지만, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 관심있는 단백질의 발현을 억제하는 데에도 사용될 수 있다. 예를 들면, Kit 사이토카인의 유전자 좌위는 세포 성숙 동안 그의 억제 시 멀리 배치되어 있다. 따라서, Kit 사이토카인 유전자 좌위에 대해 특이적인 DNA 결합 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드는 루핑된 염색질 조직화를 재생성하여 발현을 억제할 수 있다. 예를 들면, DNA 결합 도메인의 표적 서열은 3개의 특징규명된 조절 요소들 중 하나 이상의 조절 요소에 존재할 수 있다(Jing et al. (2008) Molecular Cell 29:232-42). 본 발명의 융합 폴리펩티드는 염색질 루프가 유전자들의 기능성 조절 요소들을 부적절하게 이용하게 하여 그들의 발현을 조절하는 데에 사용될 수도 있다. 상기 융합 폴리펩티드는 다수의 조절 서열들이 서로 기능적으로 또는 물리적으로 상호작용하는 다른 DNA 수반 과정(예를 들면, DNA 복제, DNA 복구 및 재조합)을 조절하는 데에 사용될 수도 있다.

특히, 일부 복잡한 조절 요소들, 예컨대, 좌위 조절 영역은 고도의 조직 및/또는 발생 단계 특이성을 제공한다. 따라서, 이 내용에서 염색질 루프의 발생을 이용하여 일시적으로 정확한 조직 특이적 유전자 조절을 달성함으로써 원하는 수준 및/또는 특이성을 결여하는 통상의 유전자 치료보다 더 우수한 유전자 조절을 제공할 수 있다.

본 발명에 따라, 대상체에서 질환 또는 장애를 억제하고/하거나(예를 들면, 감소시키거나 늦추고/거나), 치료하고/하거나 예방하는 조성물 및 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 본 발명의 융합 폴리펩티드(들)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 이러한 억제, 치료 및/또는 예방이 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 질환은 유전자 조절 기작이 교란된(예를 들면, 증가되거나 감소된) 임의의 질환일 수 있다. 상기 융합 폴리펩티드는 발현을 조절하기 위해 관심있는 유전자의 프로모터로 향할 수 있다. 상기 질환 또는 장애는 선천성 장애일 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 베타-지중해빈혈, 겸상세포빈혈(sickle cell anemia) 및 다른 용혈성 빈혈이다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 글로빈 프로모터, 예컨대, 태아 (감마) 유전자 또는 배아 β-글로빈 프로모터에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 질환은 암이고, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 염색질 루프의 형성을 통해 발암유전자의 발현을 억제한다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 융합 폴리펩티드를 코딩하는 벡터는 대상체에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 바이러스 벡터를 통해 대상체에게 전달된다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 및 레트로바이러스 벡터(예를 들면, 렌티바이러스 벡터, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 및 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV))를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 임의의 프로모터의 조절 하에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 세포 유형(예를 들면, 조혈 줄기/원시세포) 특이적 프로모터이다.

하나 이상의 융합 폴리펩티드, 또는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자; 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 본 발명에 포함된다. 상기 설명된 바와 같이, 이러한 조성물은 질환 또는 장애의 치료를 위해 이러한 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량으로 투여될 수 있다.

본 발명의 물질(agents) 및 조성물은 임의의 적합한 경로, 예를 들면, 주사(예를 들면, 국부(직접적) 또는 전신 투여용), 경구, 폐, 국소, 코 또는 다른 투여 모드에 의해 투여될 수 있다. 상기 조성물은 비경구, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 국소, 흡입, 경피, 폐내, 동맥내, 직장내, 근육내 및 코내 투여를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 정맥내로 투여된다. 일반적으로, 조성물의 약학적으로 허용가능한 담체는 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보강제 및/또는 담체로 구성된 군으로부터 선택된다. 조성물은 다양한 완충제 함량(예를 들면, 트리스 HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도의 희석제; 및 첨가제, 예컨대, 세제 및 가용화제(예를 들면, 트윈 80, 폴리소르베이트 80), 항산화제(예를 들면, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 보존제(예를 들면, 티메로졸, 벤질 알코올) 및 증량 물질(예를 들면, 락토스, 만니톨)을 포함할 수 있다. 조성물은 중합체 화합물, 예컨대, 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로겔, 폴리락타이드/글리콜라이드 공중합체, 에틸렌비닐아세테이트 공중합체, 폴리락트산, 폴리글리콜산 등의 미립자 제제, 또는 리포좀 내로 도입될 수도 있다. 이러한 조성물은 본 발명의 약학 조성물의 성분의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 문헌(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins)을 참조한다. 본 발명의 약학 조성물은 예를 들면, 액체 형태로 제조될 수 있거나 건조된(예를 들면, 추후 재구성을 위해 동결건조된) 분말 형태로 존재할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체"는 이전 단락에 예시된 바와 같이 약학 제제의 원하는 투여 경로에 적합할 수 있는 임의의 모든 용매, 분산 매질 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질의 사용은 당분야에서 공지되어 있다. 임의의 통상의 매질 또는 물질이 투여되는 분자와 상용불가능한 경우를 제외하고, 약학 제제에서의 그의 사용이 고려된다.

적합한 약학 제제의 선택은 선택된 투여 방법에 의존한다. 예를 들면, 본 발명의 분자는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 이 경우, 약학 제제는 혈액과 상용가능한 매질에 분산된 분자를 포함한다. 정맥내 주사용 약학 제제는 당분야에서 공지되어 있다. 충분한 양의 분자들이 그들의 표적 세포에 도달하여 생물학적 효과를 발휘하는 것을 보장하는 단계가 취해져야 한다.

약학 담체와 친밀히 혼합된 활성 성분으로서 본 발명의 분자를 함유하는 약학 조성물은 통상의 약학 배합 기법에 따라 제조될 수 있다. 상기 담체는 투여, 예를 들면, 정맥내 투여에 바람직한 제제의 형태에 따라 매우 다양한 형태를 취할 수 있다. 주사가능한 현탁액이 제조될 수 있고, 이 경우 적절한 액체 담체, 현탁제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 제제는 투여의 용이성 및 용량의 균일성을 위해 용량 유닛 제형으로 제제화될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용량 유닛 제형은 치료를 받는 환자에 적절한 약학 제제의 물리적으로 분리된 유닛을 지칭한다. 각각의 용량은 선택된 약학 담체와 함께 원하는 효과를 생성하도록 계산된 양의 활성 성분을 함유해야 한다. 적절한 용량 유닛을 결정하는 절차는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 환자의 체중을 기초로 용량 유닛을 비례적으로 증가시킬 수 있거나 감소시킬 수 있다. 특정 병리학적 상태의 완화에 적절한 농도는 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 용량 농도 곡선 계산에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 분자의 투여에 적절한 용량 유닛은 동물 모델에서 상기 분자의 독성을 평가함으로써 결정될 수 있다. 다양한 농도의 약학 제제를 이식된 인간 종양을 갖는 마우스에게 투여할 수 있고, 치료의 결과로서 종양 크기 및 부작용의 상당한 감소의 결과를 기초로 최소 용량 및 최대 용량을 결정할 수 있다. 적절한 용량 유닛은 다른 표준 치료와 함께 치료의 효능을 평가함으로써 결정될 수도 있다.

본 발명의 분자를 포함하는 약학 제제는 병리학적 증상이 감소되거나 완화될 때까지 적절한 간격으로, 예를 들면, 1일 2회 이상 또는 이보다 긴 간격으로 투여될 수 있고, 그 후 용량이 유지 수준으로 감소될 수 있다. 구체적인 경우에서의 적절한 간격은 통상적으로 환자의 상태에 의존할 것이다.

정의

문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형 용어는 복수형 지시대상을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 전사 시작 부위의 업스트림 또는 5'에 위치하고 전사를 개시하기 위한 RNA 중합효소 II 및 트랜스-작용 전사 인자의 인식 및 결합에 관여하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 전형적으로, 프로모터는 그에 작동가능하게 회합되거나 연결된 특정 유전자 또는 유전자들의 전사 및 발현을 조절하기 위한 5' 조절 요소이다.

"좌위 조절 영역"은 연결된 유전자의 고도 발현을 부여하는 원거리 시스-작용 조절 요소이다. 좌위 조절 영역은 부분적으로 염색질 구조를 조절함으로써 유전자 클러스터의 전사를 조절하는 DNA의 절편이다.

용어 "특이적으로 결합한다"는 생물학적 분자들의 혼합된 집단을 함유하는 샘플에서 다른 분자를 실질적으로 인식하고 이러한 다른 분자에 실질적으로 결합하지 않으면서 관심있는 폴리펩티드 또는 화합물이 표적(예를 들면, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 화합물)에 결합하는 것을 지칭한다. 예를 들면, 본 발명의 DNA 결합 도메인은 게놈 내의 다른 뉴클레오티드 서열들을 일반적으로 배제하면서 특정 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.

어구 "친화성 태그"는 관심있는 단백질의 검출 및/또는 정제를 수행하는 데에 사용될 수 있는 태그를 지칭할 수 있다. 친화성 태그(정제 태그 및 에피토프 태그를 포함함)는 당분야에서 잘 공지되어 있고(예를 들면, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory) 참조), 하기 태그들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 폴리히스티딘 태그(예를 들면, 6xHis), 폴리아르기닌 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, 인플루엔자 바이러스 HA 태그, 티오레독신, 스타필로코커스 단백질 A 태그, FLAG™ 에피토프, 아비태그(AviTag)™ 에피토프(후속 바이오티닐화용), 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR), 항체 에피토프(예를 들면, 항체에 의해 인식되고 결합되는 아미노산 서열), c-myc 에피토프 및 헴(heme) 결합 펩티드.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵 국소화 서열"은 부착된 폴리펩티드가 세포 핵에 위치하거나 세포 핵으로 수송되게 하는 아미노산 서열을 지칭한다.

"벡터"는 또 다른 유전 서열 또는 요소(DNA 또는 RNA)가 이 서열 또는 요소의 복제 및/또는 발현을 일으키도록 부착/삽입될 수 있는 핵산 분자, 예컨대, 플라스미드, 코스미드, 백미드, 파지 또는 바이러스이다.

본원에서 사용된 바와 같이, "핵산" 또는 "핵산 분자"는 단일 또는 이중 가닥의 임의의 DNA 또는 RNA 분자, 및 단일 가닥인 경우 그의 선형 또는 원형 상보적 서열의 분자를 지칭한다. 핵산 분자의 논의에 있어서, 특정 핵산 분자의 서열 또는 구조는 서열을 5'에서 3' 방향으로 제공하는 표준 약정에 따라 본원에 기재될 수 있다. 본 발명의 핵산을 언급할 때, 용어 "단리된 핵산"이 종종 사용된다. 이 용어는 DNA에 적용될 때 그 자신의 기원이 되는 유기체의 천연 발생 게놈에서 바로 인접하는 서열로부터 분리되어 있는 DNA 분자를 지칭한다. 예를 들면, "단리된 핵산"은 벡터, 예컨대, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로 삽입된, 또는 원핵 또는 진핵 세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA 내로 삽입된 DNA 분자를 포함할 수 있다. 추가로, 단리된 핵산(DNA 또는 RNA)은 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접적으로 생성되었고 그의 생성 동안 존재하는 다른 성분들로부터 분리된 분자를 나타낼 수 있다.

"약학적으로 허용가능한"은 동물, 보다 구체적으로 인간에서의 사용에 대해 주정부 또는 연방정부의 규제 관청에 의해 승인되어 있거나 미국 약전 또는 일반적으로 인정된 다른 약전에 나열되어 있다는 것을 표시한다.

"담체"는 예를 들면, 본 발명의 활성 물질과 함께 투여되는, 희석제, 보강제, 보존제(예를 들면, 티메로졸, 벤질 알코올), 항산화제(예를 들면, 아스코르브산, 메타중아황산나트륨), 가용화제(예를 들면, 트윈 80, 폴리소르베이트 80), 유화제, 완충제(예를 들면, 트리스 HCl, 아세테이트, 포스페이트), 항균제, 증량 물질(예를 들면, 락토스, 만니톨), 부형제, 보조제 또는 비히클을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 액체, 예컨대, 물 및 오일(석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일을 포함함)일 수 있다. 특히 주사가능한 용액을 위한 물 또는 수성 식염수 용액, 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 바람직하게는 담체로서 사용된다. 적합한 약학 담체는 문헌(The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott, Williams and Wilkins)); 문헌(Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y.); 및 문헌(Rowe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Pr)에 기재되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "예방한다"는 대상체가 병태를 발생시킬 확률을 감소시키는, 병태를 발생시킬 위험에 있는 대상체의 예방적 치료를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료한다"는 환자의 병태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 병태의 진행의 지연 등을 포함하는 이익을 질환으로 고통받는 환자에게 부여하는 임의의 유형의 치료를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주", "대상체" 및 "환자"는 인간을 포함하는 임의의 동물을 지칭한다.

하기 실시예들은 본 발명의 다양한 실시양태들을 예증하기 위해 제공된다. 이들은 어떠한 방식으로든 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니다.

실시예 1

염색질 루프를 확립하고 유지하는 분자 기작은 불완전하게 이해된 상태로 남아있다. 이들 사안에 대한 근본적인 통찰은 강력한 원거리 인핸서, 좌위 조절 영역(LCR) 및 표적 β-글로빈 프로모터 사이의 원거리 염색체 상호작용이 기재된 첫 번째 유전자 클러스터들에 속하는 포유동물 β-글로빈 좌위의 연구로부터 발생되었다(Carter et al. (2002) Nat. Genet., 32:623-626; Tolhuis et al. (2002) Mol. Cell., 10:1453-1465). 기작 연구는 조혈-제한된 인자 GATA1 및 이의 보조인자 FOG1(Vakoc et al. (2005) Mol. Cell., 17:453-462), KLF1(EKLF로서도 공지되어 있음)(Drissen et al. (2004) Genes Dev., 18:2485-2490) 및 보다 광범위하게 발현되는 단백질 Ldb1(Song et al. (2007) Mol. Cell., 28:810-822)을 포함하는, LCR-β-글로빈 상호작용을 확립하는 유전자 특이적 전사 인자들을 정의하였다. 이들 인자들 중 임의의 인자의 기능성 파괴는 감소된 LCR-β-글로빈 상호작용 및 감소된 β-글로빈 전사와 관련되어 있었다. 그러나, 모든 이들 단백질들 사이의 물리적 상호작용이 보고되어 있어(Cantor et al. (2002) Oncogene 21:3368-3376), 이들이 연속 경로에서 작용하는지 아니면 병렬 경로에서 작용하는지를 구별하는 것을 어렵게 한다. 더욱이, 루핑의 상실이 전사의 상실의 기초가 되는지 아니면 역으로 전사의 상실이 루핑의 상실의 기초가 되는지는 이들 연구들에서 미해결된 의문으로 남아있다.

GATA1은 정상 적혈구 분화 및 β-글로빈 유전자 발현에 필수적인 징크 핑거 DNA 결합 단백질이다(Evans et al. (1989) Cell 58:877-885; Pevny et al. (1991) Nature 349:257-260; Tsai et al. (1989) Nature 339:446-451). GATA 요소는 β-글로빈 프로모터 및 LCR에 존재하는데, 이것은 GATA1 및 이의 보조인자가 이들 부위들의 병치에 관여한다는 것을 암시한다. GATA1 기능의 기작의 이해는 GATA1 전무 전구적아세포주 G1E의 사용에 의해 크게 도움을 받았다. 이들 세포(G1E-ER4) 내로의 GATA1의 에스트라디올-유도성 버전(GATA1-ER)의 도입은 LCR-β-글로빈 루핑을 수반하면서 β-글로빈 유전자 전사의 에스트라디올 의존적 활성화를 초래한다(Vakoc et al. (2005) Mol. Cell., 17:453-462). 전사 보조인자 Ldb1(NLI로서도 지칭됨)은 DNA에 직접적으로 결합하지 않으나, TAL1, LMO2, E2A 및 GATA1을 포함하는 다성분 복합체를 통해 E-박스 요소 또는 GATA 요소로 동원된다. GATA1 및 Ldb1은 고도로 중첩되는 게놈 점유 패턴을 나타내지만, 특히 Ldb1 회합은 GATA1이 전사 활성화제로서 작용하는 부위, 예컨대, β-글로빈 좌위에서 매우 유리하다(Cheng et al. (2009) Genome Res., 19:2172-2184; Kassouf et al. (2010) Genome Res., 20:1064-1083; Soler et al. (2010) Genes Dev., 24:277-289; Tripic et al. (2009) Blood 113:2191-2201; Wu et al. (2011) Genome Res., 21:1659-1671). 여러 관찰결과는 Ldb1이 GATA1의 루핑 기능의 중요한 이펙터일 것임을 암시한다. 첫째, Ldb1의 넉다운은 LCR-β-글로빈 루핑을 손상시킨다(Song et al. (2007) Mol. Cell., 28:810-822). 둘째, Ldb1의 초파리 상동체인 Chip는 원거리 인핸서 작용을 위해 요구된다(Morcillo et al. (1997) Genes Dev., 11:2729-2740). 셋째, GATA1처럼 Ldb1은 β-글로빈 프로모터 및 LCR을 동시에 점유하므로 이들을 물리적으로 연결함으로써 작용할 것이다(Song et al. (2007) Mol. Cell., 28:810-822; Tripic et al. (2009) Blood 113:2191-2201). 넷째, Ldb1은 동종이량체 및 심지어 고차 올리고머를 형성할 수 있고(Cross et al. (2010) J. Mol. Biol., 399:133-144; Jurata et al. (1997) Mol. Cell. Biol., 17:5688-5698), 이것은 루프 형성에 있어서 그의 역할의 기초가 될 것이다.

플라스미드 구축물을 사용한 원핵생물 및 진핵세포에서의 종래 연구들은 조절 요소들 사이의 강요된 루핑을 통해 유전자 발현에 영향을 미치는 데에 성공하였다(Marenduzzo et al. (2007) Trends Genet., 23:126-133; Ameres et al. (2005) EMBO J., 24:358-367; Mahmoudi et al. (2002) EMBO J., 21:1775-1781; Nolis et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci., 106:20222-20227; Petrascheck et al. (2005) Nucleic Acids Res., 33:3743-3750). 그러나, 변경된 염색질 입체구조 및 상대적으로 짧은 게놈 거리를 갖는 플라스미드의 사용은 천연 유전자 죄위에서의 원거리 염색질 상호작용에 대한 추론을 한정할 것이다. 본원에서, 그의 천연 환경에서 내생성 좌위에서의 염색질 루핑을 조절하는 방법이 개발되었다. 이것은 강요된 염색질 루핑이 전사를 활성화시킬 수 있는지에 대한 확인, 염색질 루핑에서 전사 조절제들의 계층의 조사, 및 뒤따르는 분자적 및 기능적 결과의 정의를 가능하게 하였다. 본 연구를 위해, G1E 적혈구 세포가 전사 인자 GATA1을 결여하여 LCR-β-글로빈 루프를 확립하지 못하고 β-글로빈을 전사하지 못하므로 이들 세포를 사용하였다. β-글로빈 프로모터로의 Ldb1 동원은 전적으로 GATA1에 의존하는 반면, 상당한 양의 Tal1/Ldb1 복합체가 GATA1의 부재 하에서 LCR과 회합된 상태로 남아있다(도 1; Tripic et al. (2009) Blood 113:2191-2201). 따라서, GATA1에 의한 프로모터로의 Ldb1 동원은 LCR을 프로모터와 병치하여 전사 개시를 위해 요구되는 루프를 형성하는 데에 있어서 임계 속도 제한 단계를 대표할 것이다(도 2a). 이 가설은 징크 핑거(ZF) 표적화 방법을 이용하여 G1E 세포에서 Ldb1을 β-글로빈 프로모터에 부착시킴으로써 시험되었다(도 2a). 특히, 프로모터에 결합된 ZF-Ldb1은 GATA1 회복에 의해 달성되는 정도와 유사한 정도로 G1E 세포에서 염색질 루프를 유도할 수 있었다. ZF-Ldb1 구축물은 RNA 중합효소 II(Pol II) 동원 및 중합효소 II 세린 5 인산화(Ser5ph)를 완전히 회복시켰고, β-글로빈 전사를 부분적으로 복구하였다. LCR의 결실에 대한 이형접합성을 나타내는 적혈구 세포에서의 유전적 실험은 ZF-Ldb1 단백질이 원거리 루핑 기작을 통해 작용하였다는 것을 확인시켜주었다. 이들 결과들은 조절 영역들의 강요된 병치가 전사를 활성화시킬 수 있고 Ldb1을 염색질 루핑 동안 GATA1의 임계 속도 제한 이펙터로서 확립할 수 있다는 것을 보여준다.

실험 절차

인공 징크 핑거 디자인

β-메이저 프로모터 또는 마우스 LCR의 DNase1 과민성 부위 2 내에 6개의 Cys2-His2 징크 핑거 도메인 및 18 또는 19 bp의 표적화 부위를 각각 함유하는 ZF들을 디자인하고 이전에 기재된 바와 같이(Bartsevich et al. (2003) Stem Cells 21:632-637) 2개의 핑거 유닛들로부터 조립하였다.

세포 배양

G1E 및 G1E-ER4 세포를 기재된 바와 같이(Weiss et al. (1997) Mol. Cell. Biol., 17:1642-1651) 배양하였다. 표시된 경우, G1E-ER4 세포를 21시간(3C 분석) 또는 24시간(RT-qPCR 및 ChIP 분석) 동안 100 nM 에스트라디올(E2)로 처리하여 GATA1-ER(도면에서 G1E+GATA1로서 표시됨)을 활성화시켰다.

일차 적아세포의 단리

야생형 태아 간 적혈구 세포를 CD1 마우스(찰스 리버 라보라토리스(Charles River Laboratories))로부터 수득하였다. ΔLCR/ΔLCR 마우스(129 품종)는 기재되어 있다(Bender et al. (2000) Mol. Cell 5:387-393). ΔLCR/야생형 마우스를 발생시키기 위해, ΔLCR/ΔLCR 수컷 동물을 야생형 암컷 마우스(BL6 품종)와 교배시켰다. E13.5 태아 간 세포를 채취하고 PE-접합된 항-CD71 및 APC-접합된 항-Ter119 항체로 염색하고 FACS로 분류하였다. R1(Ter119-, CD71-/낮음) 집단을 단리하고, 원하는 레트로바이러스로 감염시키고, 15% 태아 소 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 글루타민, 10 ng/㎖ mIL3, 20 ng/㎖ m/h IL6, 50 ng/㎖ mSCF 및 10 ng/㎖ m/h FLT3L(펩프로텍(Peprotech))로 보충된 이스코브 DMDM을 함유하는 증식 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 표시된 바와 같이, 세포를 15% 태아 소 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 글루타민, 50 ㎍/㎖ 아스코르브산, 200 ㎍/㎖ 홀로트랜스페린(시그마(Sigma)) 및 2 U/㎖ 에리쓰로포이에틴 ALFA(에포겐(Epogen))로 보충된 이스코브 DMDM에서 배양함으로써 분화하도록 유도하였다.

3C 분석

3C 분석을 기재된 바와 같이(Jing et al. (2008) Mol. Cell., 29:232-242; Vakoc et al. (2005) Mol. Cell., 17:453-462) 수행하되, 다음과 같이 변경하였다. 1x10⁷개의 세포를 실온에서 10분 동안 1.5% 포름알데하이드로 교차연결한 후, 글리신 켄칭, 세포 용해, BglII 분해 및 T4 연결을 수행하였다. 3C 연결 생성물을 정량 택만(TaqMan)^® 실시간 PCR로 3회 반복하여 정량하였다. 프라이머 익스프레스(Primer Express)^® 2.0 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))를 이용하여 프로브 및 프라이머를 디자인하고, 특이적 및 연속적 증폭을 보장하도록 순차적 희석 및 겔 전기영동으로 시험하였다(도 3b 및 3c). BglII 분해 부위를 함유하거나 결여하는 게놈 영역을 증폭하는 프라이머 쌍을 사용하여 Sybr^®Green qPCR로 분해 효율을 모니터링하였다(도 3d). 129 유래의 전체 뮤린 β-글로빈 좌위(소스바이오사이언스(SourceBioscience), 클론 # BMQ433I10)를 함유하는 BAC 클론을 BglII로 분해하고 재연결하여 BglII 단편의 무작위 연결 생성물을 발생시켰다(도 3a). DNA를 순차적으로 희석하고 사용하여 모든 3C 생성물들이 표준화되어 있는 표준 곡선을 발생시켰다. β-글로빈 좌위에서의 3C 신호를 4개의 개재 영역들로부터의 3C 신호, 또는 대안적으로 대조군 좌위 ERCC3의 3C 신호(둘다 유사한 결과를 생성함)로 더 표준화하였다.

염색질 면역침전

ChIP를 기재된 바와 같이 수행하였다(Tripic et al. (2009) Blood 113:2191-2201). 하기 항체들을 사용하였다: 범-중합효소 II(sc-899, 산타 크루즈(Santa Cruz)), CDK9(sc-484, 산타 크루즈), Ser5ph(MS-134R, 코반스(Covance)), H3K4me3 (07-473, 밀리포어(Millipore)), 및 항-HA 단일클론 항체(이 항체는 클론 12CA5이었다). ChIP qPCR 프라이머 서열은 추가로 나열되어 있다.

RT-qPCR

트리졸(Trizol)(인비트로겐(Invitrogen))을 사용하여 10⁵개 내지 10⁶개의 세포로부터 RNA를 추출하였다. RNase 무함유 글리코겐(인비트로겐)을 첨가하여 RNA 침전을 보조하였다. 수퍼스크립트(Superscript)^® II(인비트로겐)를 사용하여 역전사 반응을 무작위 육량체로 수행하였다. cDNA 샘플을 Sybr^®Green qPCR로 정량하였다. 대립형질 특이적 qPCR을 어닐링 온도 62℃(디폴트 셋팅으로서 통상의 qPCR의 경우 60℃)에서 수행하였다. 데이터를 β-액틴 또는 GAPDH(둘다 유사한 결과를 생성함)로 표준화하였다.

레트로바이러스 감염

G1E 세포의 레트로바이러스 감염을 기재된 바와 같이(Tripic et al. (2009) Blood 113:2191-2201) 수행하였다. 단리된 일차 태아 간 세포의 경우, 회전 감염 조건을 실온에서 1시간 동안 2,000 rpm으로 변경하고, 세포를 감염 직후 새로운 배지로 옮겼다.

플라스미드

개별 징크 핑거 단백질 코딩 서열을 그의 N-말단에서 3개의 HA 태그 및 핵 국소화 신호(NLS)를 갖는 MigR1 레트로바이러스 벡터 내로 클로닝하였다. 전체 길이 Ldb1, 또는 Ldb1의 아미노산 1부터 200까지 함유하는 SA 도메인을 ZF의 C-말단에 인-프레임으로 클로닝하였다. Ldb1의 처음 256개 아미노산들을 결실시켜 P-ΔSA를 발생시켰다.

ChIP qPCR 프라이머

HS3

정방향 5'-CTAGGGACTGAGAGAGGCTGCTT-3'(서열번호 3)

역방향 5'-ATGGGACCTCTGATAGACACATCTT-3'(서열번호 4)

HS2

정방향 5'-GGGTGTGTGGCCAGATGTTT-3'(서열번호 5)

역방향 5'-CACCTTCCCTGTGGACTTCCT-3'(서열번호 6)

HS1

정방향 5'-CAGATCCTCAAACACTCTCCCATAA-3'(서열번호 7)

역방향 5'-TGCCTTCTTTGTCCCATCATT-3'(서열번호 8)

ε y 프로모터

정방향 5'-ATGACCTGGCTCCACCCAT-3'(서열번호 9)

역방향 5'-TCTTTGAAGCCATTGGTCAGC-3'(서열번호 10)

β h1 프로모터

정방향 5'-AGGTCCAGGGTGAAGAATAAAAGG-3'(서열번호 11)

역방향 5'-ATCTCAAGTGTGCAAAAGCCAGA-3'(서열번호 12)

β maj 프로모터

정방향 5'-CAGGGAGAAATATGCTTGTCATCA-3'(서열번호 13)

역방향 5'-GTGAGCAGATTGGCCCTTACC-3'(서열번호 14)

β maj 엑손 2

정방향 5'-AACGATGGCCTGAATCACTTG-3'(서열번호 15)

역방향 5'-AGCCTGAAGTTCTCAGGATCC-3'(서열번호 16)

β maj 인트론 2

정방향 5'-CTTCTCTCTCTCCTCTCTCTTTCTCTAATC-3'(서열번호 17)

역방향 5'-AATGAACTGAGGGAAAGGAAAGG-3'(서열번호 18)

β maj 3UTR

정방향 5'-GCCCTGGCTCACAAGTACCA-3'(서열번호 19)

역방향 5'-TTCACAGGCAAGAGCAGGAA-3'(서열번호 20)

β maj -1kb

정방향 5'-GTATGCTCAATTCAAATGTACCTTATT-3'(서열번호 21)

역방향 5'-TTACCTCTTTATTTCACTTTTACACAT-3'(서열번호 22)

β min 프로모터

정방향 5'-GAGCCAGCATTGGGTATATAAAGC-3'(서열번호 23)

역방향 5'-ACAGACTCAGAAGCAAACGTAAGAAG-3'(서열번호 24)

IVR16

정방향 5'-TGGCCATTTTTACTATGTTAATTTTGC-3'(서열번호 25)

역방향 5'-TAGACTTGTCATGGTTATGGATTGG-3'(서열번호 26)

mCD4

정방향 5'-CCAGAACATTCCGGCACATT-3'(서열번호 27)

역방향 5'-GGTAAGAGGGACGTGTTCAACTTT-3'(서열번호 28)

전사체 qPCR 프라이머

β maj 5 UTR

정방향 5'-CAACCCCAGAAACAGACATC-3'(서열번호 29)

역방향 5'-CAACTTCATCGGCGTTCA-3'(서열번호 30)

β maj 엑손 2

정방향 5'-AACGATGGCCTGAATCACTTG-3'(서열번호 15)

역방향 5'-AGCCTGAAGTTCTCAGGATCC-3'(서열번호 16)

β maj -D

정방향 5'-GCCTGTGGGGAAAGGTGAACT-3'(서열번호 31)

역방향 5'-CCATCGTTAAAGGCAGTTATCACC-3'(서열번호 32)

β maj -S

정방향 5'-GCCTGTGGGGAAAGGTGAACG-3'(서열번호 33)

역방향 5'-GCCATCGTTAAAGGCAGTTATCACT-3'(서열번호 34)

β maj 인트론 2

정방향 5'-CTTCTCTCTCTCCTCTCTCTTTCTCTAATC-3'(서열번호 17)

역방향 5'-AATGAACTGAGGGAAAGGAAAGG-3'(서열번호 18)

β maj 엑손 2/3

정방향 5'-AGCTCCACTGTGACAAGCTG-3'(서열번호 35)

역방향 5'-CCAGCACAATCACGATCATA-3'(서열번호 36)

β maj 3UTR

정방향 5'-GCCCTGGCTCACAAGTACCA-3'(서열번호 19)

역방향 5'-TTCACAGGCAAGAGCAGGAA-3'(서열번호 20)

β h1

정방향 5'-AGGCAGCTATCACAAGCATCTG-3'(서열번호 37)

역방향 5'-AACTTGTCAAAGAATCTCTGAGTCCA-3'(서열번호 38)

Hba

정방향 5'-GTGGATCCCGTCAACTTCAAG-3'(서열번호 39)

역방향 5'-CAAGGTCACCAGCAGGCAGT-3'(서열번호 40)

Slc4a1

정방향 5'-TGGAGGCCTGATCCGTGATA-3'(서열번호 41)

역방향 5'-AGCGCATCGGTGATGTCA-3'(서열번호 42)

Alas2

정방향 5'-CCATCTTAAGGCAACCAAGGC-3'(서열번호 43)

역방향 5'-ACAGCATGAAAGGACAATGGC-3'(서열번호 44)

Klf1

정방향 5'-TTCCGGAGAGGACGATGAGA-3'(서열번호 45)

역방향 5'-AACCTGGAAAGTTTGTAAGGAAAAGA-3'(서열번호 46)

Gata1

정방향 5'-GCCCAAGAAGCGAATGATTG-3'(서열번호 47)

역방향 5'-GTGGTCGTTTGACAGTTAGTGCAT-3'(서열번호 48)

Gata2

정방향 5'-CACCCCTAAGCAGAGAAGCAA-3'(서열번호 49)

역방향 5'-TGGCACCACAGTTGACACACT-3'(서열번호 50)

Kit

정방향 5'-AGCAGATCTCGGACAGCACC-3'(서열번호 51)

역방향 5'-TGCAGTTTGCCAAGTTGGAG-3'(서열번호 52)

Gapdh

정방향 5'-GATGCCCCCATGTTTGTGAT-3'(서열번호 53)

역방향 5'-GGTCATGAGCCCTTCCACAAT-3'(서열번호 54)

β- 액틴

정방향 5'-ACACCCGCCACCAGTTC-3'(서열번호 55)

역방향 5'-TACAGCCCGGGGAGCAT-3'(서열번호 56)

3C 프로브 및 프라이머

β-글로빈 좌위(서열번호는 위부터 아래로 서열번호 57 내지 69이다.)

LCR-HS2 프로브 5'-FAM/TCT GCC TGT CCC TGC CTC GTG A/3'-TAMSp

고착제(rHS2) 5'-CAGCGTTTTAGTTGGATATAGAGTGAA-3'

I(rHS1) 5'-GAACTTGTCAGGGAATTACCTAGTACAG-3'

II(rβh1εy) 5'-GATCCCTATTGTCTACTTTTGCCAG-3'

III(rβh1) 5'-CCCATGTTACACCCCATTACAAG-3'

IV(rβmaj) 5'-GGCTGGAACATCACTGGAATAAAT-3'

V(rβmaj-frag2) 5'-CAGTCGAGGAATGCAACTGTGA-3'

VI(rIVR3) 5'-AAGACTAAAAATCCCAGATTGATTCC-3'

VII(rβmin) 5'-GCCAAATCAGGACCCTAACATT-3'

VIII(rIVR2) 5'-CCAAGTCTCTCAAGAAAGAAATCGA-3'

X(rIVR1) 5'-CAAACATAAGACCATAAGCAACAGAAA-3'

XI(r3HS1) 5'-ACTACCTAACTCTCAAAAATCTGTGTGA-3'

XII(r3OR) 5'-GAAAAAATGTGTACGCATCATTAGTTATG-3'

ERCC3 좌위(서열번호는 위부터 아래로 서열번호 70 내지 72이다.)

ERCC3 프로브 5'-FAM/TCTAGAGCCAAACTCTCCAGCCACCACTTC/3'-TAMSp

rERCC3_3 5'-GCAGTGAAAACACAACACAGTTAATATG-3'

rERCC3_5 5'-GCAGCCACCGACTTGGAT-3'

3C 분해 효율을 위한 프라이머

HS2 BglII 절단 #1

정방향 5'-TGTAGATCAGGATTGACTGGTAC-3'(서열번호 73)

역방향 5'-CAGCGTTTTAGTTGGATATAGAGTGAA-3'(서열번호 74)

HS2 BglII 비절단 #1

정방향 5'-GGGTGTGTGGCCAGATGTTT-3'(서열번호 75)

역방향 5'-CACCTTCCCTGTGGACTTCCT-3'(서열번호 76)

HS2 BglII 절단 #2

정방향 5'-GCGTTTTAGTTGGATATAGAGTGAAGG-3'(서열번호 77)

역방향 5'-TGCTATCATGGAACATACTATGTAGATCA-3'(서열번호 78)

HS2 BglII 비절단 #2

정방향 5'-AGGAACAGGCAAGGCAGCTT-3'(서열번호 79)

역방향 5'-TCACTGGTACCCTGTTTCCTTATCT-3'(서열번호 80)

결과

내생성 β-글로빈 좌위로의 Ldb1의 징크 핑거 매개 표적화

잠재적 루핑 인자를 내생성 β-글로빈 좌위에 부착시키는 방법으로서, 인공 징크 핑거 단백질(ZF)이 생체내에서 미리 선택된 게놈 부위를 표적화하는 데에 성공적으로 사용되었기 때문에 상기 인공 징크 핑거 단백질을 선택하였다(Klug, A. (2010) Annu. Rev. Biochem., 79:213-231). β-메이저 프로모터(P-ZF) 및 LCR의 DNase1 과민성 부위 2(HS2)(도 2b)를 표적화하도록 ZF를 합성하였는데, 이는 이들 부위들이 물리적으로 가까이 인접하는 것으로 이미 발견되었기 때문이다(Carter et al. (2002) Nat. Genet., 32:623-626.; Tolhuis et al. (2002) Mol. Cell., 10:1453-1465). 6개의 징크 핑거들을 직렬로 연결하여 게놈 서열의 18개의 염기쌍을 표적화하였다(Klug, A. (2010) Annu. Rev. Biochem., 79:213-231). ZF에의 접근을 용이하게 하되 공지된 전사 인자 결합 부위를 방해하지 않도록 DNase I 과민성 영역 내에서 표적 서열을 선택하였다(도 1b). 이전에 기재된 ELISA-기초 분석(Bartsevich et al. (2003) Stem Cells 21:632-637)을 이용하여 ZF와 그의 지정된 DNA 서열의 결합을 특징규명하였다. ZF를 HA 태그 및 핵 국소화 서열(NLS)에 융합시키고 G1E 세포 내로 도입한 후, 그의 염색질 결합 프로파일을 염색질 면역침전(ChIP)으로 조사하였다(도 1c 및 1d). 적합한 결합 성질을 갖는 ZF를 Ldb1에 융합시키고, IRES-GFP 또는 IRESYFP 카세트를 함유하는 레트로바이러스 벡터 내로 도입하였다. G1E 세포의 감염 시, GFP/YFP 양성 세포의 집단을 형광 활성화된 세포 분류(FACS)로 정제하고 항-HA ChIP를 수행하였다. G1E 세포에서 β-글로빈 프로모터에 강하게 결합된 P-ZF를 확인하였다(도 1c). Ldb1과 P-ZF의 융합체(P-Ldb1)는 β-글로빈 프로모터에의 강한 결합을 보유하였지만, LCR의 다수의 HS들에서도 낮은 수준으로 검출될 수 있었다(도 2b). Ldb1 모이어티의 부재 하에서, 이 ZF는 보다 낮은 효율로 이들 LCR 부위들에 결합하였는데(도 1c), 이것은 P-Ldb1과 LCR의 회합이 주로 LCR에서의 내생성 Ldb1 복합체와 그의 상호작용에 기인한다는 것을 시사한다(Tripic et al. (2009) Blood 113:2191-2201). 또한, L-Ldb1(Ldb1에 융합된 L-ZF)은 HS2에 결합하지만 β-글로빈 프로모터에는 결합하지 않는 것으로 발견되었는데(도 2c), 이것은 GATA1의 부재 하에서의 내생성 Ldb1 복합체의 결여와 일치한다(도 1a). 마지막으로, L-Ldb1 및 P-Ldb1을 동시발현하는 세포는 LCR 및 β-메이저 프로모터에서 필적할만한 ChIP 신호를 생성하였다(도 2d). 적아세포 및 섬유모세포에서 여러 ZF 단백질들을 비교하는 ChIP 결과는 시험관내에서 노출된(naked) DNA 서열에 대한 ZF의 결합 성질이 생체내에서의 그의 결합 효율을 완전히 예측하지는 못한다는 것을 보여주었다는 것이 주목할만하다. 그럼에도 불구하고, Ldb1을 β-글로빈 좌위로 표적화할 수 있는 ZF 쌍을 확인하였다.

β-글로빈 좌위에의 Ldb1의 부착은 GATA1의 부재 하에서 전사를 활성화시킨다.

LCR-프로모터 루핑은 적혈구 발생 전체에 걸쳐 고수준 글로빈 유전자 발현을 위해 요구된다. 따라서, 프로모터-부착된 및/또는 LCR-부착된 Ldb1이 G1E 세포에서 β-글로빈 전사를 유도하는지를 조사하였다. G1E 세포가 GATA1을 결여하기 때문에, β-글로빈 프로모터는 Ldb1을 결여하는 반면, LCR은 E-박스 요소에 결합된 TAL1 복합체에 의해 매개된 상당한 양의 Ldb1을 보유한다(도 1a 및 2a). 특히, P-Ldb1의 발현은 GATA1(G1E-ER4 세포)의 회복 시 달성된 수준(도 4b)의 대략 20%에 해당하는 1000배 수준(도 4a) 이상으로 β-글로빈 전사를 활성화시켰다. L-Ldb1 단독 또는 Ldb1 모이어티를 갖지 않는 ZF는 거의 활성을 나타내지 않았다(도 4a). P-Ldb1 및 L-Ldb1의 동시발현은 P-Ldb1 자체에 비해 β-글로빈 발현을 더 활성화시키지 못하였다(도 4a). 고수준 β-글로빈 발현이 LCR을 요구하기 때문에(Bender et al. (2000) Mol. Cell., 5:387-393), 이들 결과들은 프로모터에 결합된 Ldb1이 아마도 내생성 Ldb1을 통해 LCR에서 원거리 접촉을 촉진하여 전사를 활성화시키기에 충분하다는 것을 시사한다. β-글로빈 발현의 측정을 β-글로빈 전사체에 대해 유도된 다수의 프라이머 쌍들로 확인하였다(도 5a). 더욱이, 여러 추가 GATA1-활성화된 유전자(Klf1, Eraf, βH1) 및 GATA-억제된 유전자(Gata2, Kit)의 발현이 변화되지 않았기 때문에, ZF-Ldb1 발현의 효과는 유전자 특이적이었고 단순히 일반적인 분화 유도의 결과가 아니었다(도 4c). ZF-Ldb1 융합 단백질에 의한 β-글로빈 전사의 강력한 활성화는 β-글로빈 전사에 필수적인 GATA1의 부재 하에서 일어났기 때문에 특히 주목할만하다.

LCR이 결실되어 있을 때 β-글로빈 전사가 정상 수준의 약 1%까지 감소되기 때문에, ZF-Ldb1에 의한 상당한 β-글로빈 전사 활성화는 LCR 루핑 기작을 강력히 함축한다(Bender et al. (2000) Mol. Cell., 5:387-393). 더욱이, β-글로빈 프로모터에서의 Ldb1 점유는 LCR의 부재 하에서 정상인데(Song et al. (2010) Blood 116:2356-64), 이것은 프로모터에 결합된 Ldb1 단독이 LCR 없이 β-글로빈 전사에 불충분하다는 것을 시사한다. ZF-Ldb1 융합 단백질에 의한 β-글로빈 활성화가 상당하였다 하더라도, 그들의 효과는 GATA1의 효과와 대등하지 않았는데, 이것은 GATA1이 염색체 루핑 이외의 기능을 발휘한다는 것과 일치한다.

Ldb1 자가-회합 도메인의 부착이 β-글로빈 활성화에 충분하다.

Ldb1은 고차 분자 복합체의 조립을 매개하고 그의 루핑 기능을 책임질 N-말단 자가-회합(SA) 도메인(Xu et al. (2003) Mol. Cell. Biol., 23:7585-7599; Cross et al. (2010) J. Mol. Biol., 399:133-144), 및 LMO2 및 이의 관련된 GATA1/TAL1/E2A 다중단백질 복합체에의 결합을 부여하는 C-말단 LIM 상호작용 도메인(LID)을 함유한다. SA 도메인이 전사 활성화에 충분한지를 조사하기 위해, 상기 도메인을 L-ZF 및 P-ZF와 융합시키고 G1E 세포 내로 도입하였다. P-SA 및 L-SA는 L-SA가 HS2를 점유한 반면 P-SA가 β-글로빈 프로모터 및 추가로 LCR에 결합하였을 정도로 전체 길이 Ldb1 융합 구축물과 매우 유사한 게놈 결합 프로파일을 보였다(도 5b). 특히, P-SA 단독의 발현 또는 L-SA 및 P-SA의 동시발현은 전체 길이 Ldb1 융합 단백질과 사실상 동일한 수준으로 β-글로빈 유전자 전사를 활성화시켰다(도 4d 및 5c). 또한, ZF-SA의 효과는 유전자 특이적이었고 전반적으로 적혈구 유전자 발현을 변경시키지 않았다(도 5c). 이들 결과들은 Ldb1 자가-회합 도메인이 β-글로빈 전사를 유도하기에 충분하다는 것을 시사하는데, 이것은 LCR과 β-글로빈 프로모터 사이의 강요된 병치가 전사 활성화의 기초가 된다는 개념을 더 뒷받침한다.

Ldb1의 남은 부분이 고차 단백질 복합체를 응집시켜 염색질 루핑에 참여할 가능성도 고려되었다. 이를 위해, SA 도메인을 결여하되(P-ΔSA) 핵 국소화 서열 및 LID 도메인이 온전하게 남아있는 ZF-Ldb1 융합 단백질을 발생시켰다. P-ΔSA는 P-SA보다 상당히 더 낮은 정도일지라도 β-글로빈 전사를 유도할 수 있었다(도 5d). 활성화는 가장 최적 조건 및 발현 수준 하에서조차도 P-SA에서 관찰된 활성화의 50%를 결코 초과하지 못하였다(도 5d). 이것은 SA 도메인이 루핑을 위해 요구된 고차 복합체를 응집시키는 데에 있어서 가장 효율적이라는 것을 입증한다. 그럼에도 불구하고, 이들 결과들은 Ldb1이 상이한 도메인들을 통해 그의 파트너 단백질과 맞물려 염색질 루프를 생성할 수 있다는 가능성과도 일치한다.

Ldb1 자가-회합 도메인의 부착은 LCR-프로모터 루핑을 유도한다.

LCR의 부재 하에서 β-글로빈 전사가 매우 낮기 때문에, ZF-Ldb1 또는 ZF-SA에 의한 β-글로빈 전사의 강한 유도는 LCR의 관여 및 이로써 염색질 루핑을 함축한다(Bender et al. (2000) Mol. Cell., 5:387-393). 따라서, ZF-SA 구축물의 발현이 LCR을 β-글로빈 유전자와 병치시켜 염색질 루프를 형성하였는지를 3C 분석으로 조사하였다(도 3). HS2를 고착제 영역으로서 사용하여 모 G1E 세포에서 3C 신호가 거리의 증가에 따라 일반적으로 감소하였다는 것을 발견하였다(도 6a; Vakoc et al. (2005) Mol. Cell., 17:453-462). 특히, HS2와 β-글로빈 사이의 상호작용은 없었다. GATA1 회복 시, HS2와 β-메이저 글로빈 유전자를 포함하는 2개의 인접 단편들의 상대적인 근접성은 상당히 증가되었다(도 6a). HS2와 개재 또는 다운스트림 절편의 상호작용은 낮은 상태로 유지되었는데, 이것은 GATA1 의존적 HS2-β-글로빈 염색질 루프를 시사한다(Vakoc et al. (2005) Mol. Cell., 17:453-462). 그 다음, ZF-SA 단백질을 발현하는 G1E 세포에서 β-글로빈 좌위의 염색질 입체구조를 확인하였다. 놀랍게도, P-SA 단독의 발현은 GATA1에 의해 유도된 염색질 입체구조를 재현하는 강한 HS2-β-글로빈 염색질 루프를 생성하였으나 L-SA는 그러하지 못하였다(도 6b 및 6c). 따라서, β-글로빈 프로모터로의 SA 도메인의 동원은 아마도 내생성 LCR-결합된 Ldb1과의 상호작용을 통해 LCR과의 병치에 충분하다(도 1a, 2a 및 5b). P-SA 및 L-SA의 동시발현은 P-SA 단독과 유사한 효율로 HS2와 β-글로빈 유전자의 병치를 유발하였다(도 6d). HS2에서의 P-SA의 점유 수준이 L-SA에 비해 더 낮다는 점을 고려할 때, P-SA가 L-SA + P-SA 또는 GATA1의 조합만큼 활성적이었다는 것을 발견한 것은 놀라웠다. DNA와 간접적으로 회합된 단백질이 효율적으로 가교연결되지 않기 때문에, LCR에서 P-SA에 대한 ChIP 신호가 P-SA의 양을 실제보다 적게 표시할 가능성이 있다. 더욱이, 내생성 Ldb1을 통한 P-SA와 LCR 내의 다수의 영역들의 회합은 루프 형성을 촉진하는 그의 능력을 증가시킬 것이다. 그럼에도 불구하고, 강요된 LCR-β-글로빈 염색질 루핑은 β-글로빈 전사의 활성화와 높은 상관관계를 가졌다. 종합하건대, 이들 결과들은 β-글로빈 프로모터에의 Ldb1의 SA 도메인의 부착이 GATA1에 의해 발생된 염색질 루프와 동일하지 않지만 유사한 LCR-β-글로빈 염색질 루프를 생성하기에 충분하다는 것을 보여준다. 이것은 Ldb1이 염색질 루핑 동안 GATA1의 필수 속도 제한 이펙터라는 것을 시사한다. 보다 일반적으로, LCR과 프로모터의 병치는 강한 유전자 활성화를 야기한다.

ZF-SA 발현은 LCR 의존적 기능을 생성한다.

β-글로빈 LCR 기능의 핵심 기능들 중 2가지 기능은 β-글로빈 프로모터로의 중합효소 II의 동원, 및 그의 C-말단 도메인의 세린 5에서의 중합효소 II 인산화(초기 전사 연장과 관련된 변경)의 자극이다(Sawado et al. (2003) Genes Dev., 17:1009-1018). 따라서, ZF-SA 단백질이 LCR-β-글로빈 접촉을 촉진함으로써 β-글로빈 전사를 활성화시키는 경우, 이 단백질은 중합효소 II 동원 및 세린 5 인산화(Ser5ph)를 자극할 것으로 예상된다. ZF-SA 융합 단백질이 LCR 의존적 기능을 회복시키는 정도를 조사하기 위해, Ser5ph 중합효소 II에 대한 항체, 또는 그의 인산화 상태와 관계없이 중합효소 II와 반응하는 항체를 사용한 ChIP를 수행하였다. 특히, P-SA의 발현은 GATA1 발현에 의해 달성된 효율과 유사한 효율로 β-글로빈 프로모터로의 중합효소 II 동원을 유발하였다(도 7a 및 7b). 대조적으로, 유전자의 본체에서의 중합효소 II 수준은 β-글로빈 mRNA 생성의 수준에 잘 상응하는, GATA1 발현 세포에서 발견된 수준의 대략 25% 내지 30%에 해당하였다(도 4b). 이것은 GATA1 발현 세포와 비교되었을 때 β-글로빈 프로모터 및 유전자의 본체로의 연장 복합체 P-TEFb의 감소된 동원과 일치한다(항-CDK9 ChIP에 의해 측정되었을 때, 도 8a). P-SA 발현 세포에서 β-글로빈 유전자에서 발견된 Ser5ph 중합효소 II의 양은 GATA1 발현 세포에서 관찰된 양과 구별될 수 없었다(도 7c). 전사 개시의 추가 척도로서 히스톤 H3 라이신 4 트리메틸화(H3K4me3)의 수준을 측정하였고, P-SA가 이 마크를 GATA1에 의해 생성된 수준과 동등한 수준까지 회복시켰다는 것을 발견하였다(도 8b). P-SA 및 LSA를 동시발현하는 세포에서 유사한 결과를 수득하였다. 이들 결과들은 LCR의 2가지 기능, 즉 β-글로빈 프로모터로의 중합효소 II 동원 및 중합효소 II 세린 5 인산화가 P-SA의 발현에 의해 완전히 회복되었다는 것을 입증하는데, 이것은 LCR과 β-글로빈 프로모터의 병치가 P-SA의 활성의 기초가 된다는 개념에 대한 추가 뒷받침을 제공한다. 전사 연장을 완전히 회복시키는 것의 실패는 아마도 P-TEFb 복합체의 동원 및 활성화를 포함하는 추가 루핑 비의존적 기능을 발휘하는 GATA1 및 이의 보조인자의 결여에 의해 설명될 수 있다(Bottardi et al. (2011) Nucleic Acids Res., 39:3505-3519; Elagib et al. (2008) Blood 112:4884-4894).

일차 적아세포에서 ZF-SA 융합 단백질에 의한 β-글로빈 전사의 이른 유도

ZF 융합 단백질이 일차 적혈구 원시세포에서 β-글로빈 발현을 활성화시키도록 작용하는지를 조사하였다. E13.5 야생형 태아 간으로부터의 일차 적혈구 전구체 세포의 성숙 단계를, 세포 표면 마커 Ter119 및 CD71의 발현을 측정하는 유동세포측정으로 모니터링하였다(Zhang et al. (2003) Blood 102:3938-3946). 세포는 성숙의 R1, R2, R3 및 R4 단계를 통해 진행하여(도 9a) 궁극적으로 풍부한 양의 β-글로빈을 생성한다(도 10a). ZF-SA 단백질의 발현을 위해, 초기 전구체 세포를 대표하는 Ter119^-, CD71^-/낮은 세포(도 9a에서 R1 집단)를 정제하였다. 이 단계에서, β-글로빈 유전자는 아직 높은 활성을 나타내지 않지만, 세포는 GATA1 및 KLF1을 포함하는 낮은 수준의 필수 조절 인자를 발현한다(도 10b). ZF-SA 융합 단백질을 발현하는 레트로바이러스로 감염시킨 후, 사이토카인 IL-3, IL-6 및 SCF를 함유하는 정의된 배지에서 세포를 배양하여 상기 세포를 전구체 상태로 보존하였다. 특히, P-SA 단독 또는 P-SA/L-SA의 발현은 β-글로빈 전사를 일찍 활성화시켰지만 L-SA 단독은 그러하지 못하였다(도 9b). 대조군에 비해 배수 활성화가 G1E 시스템에서 관찰된 것만큼 현저하지 않았다는 것을 주목해야 하는데, 이는 후자와 대조적으로 일차 적아세포가 전사 인자로 충만하고 심지어 완전한 성숙 전에 보다 높은 수준의 β-글로빈을 생성하기 때문이다. 그럼에도 불구하고, ZF 융합 단백질들의 동일한 조합물이 β-글로빈 발현을 활성화시킬 수 있었다는 점에서 이들 결과들은 본질적으로 G1E 세포로부터의 결과를 반영하였다. 조사된 다른 적혈구 유전자들이 그들의 활성에서 변경되지 않았기 때문에, 상기 효과는 β-글로빈 좌위에 대해 특이적이었다(도 9b). 더욱이, ZF-SA 발현은 CD71 및 Ter119 표면 마커를 사용한 유동세포측정에 의해 확인되었을 때 적혈구 성숙을 비특이적으로 촉진하지 않았다(도 10c). 더불어, 이들 결과들은 ZF-SA 융합 구축물이 일차 적혈구 세포에서 β-글로빈 전사를 활성화시킬 수 있다는 것을 보여준다.

β-글로빈 전사의 ZF-SA 융합 단백질 유도는 LCR 의존적이다.

β-글로빈 좌위로의 SA 도메인의 표적화는 HS2와 β-글로빈 유전자의 병치, 중합효소 II 동원 및 중합효소 II 세린 5 인산화를 회복시키는데, 이것은 전사 활성화가 LCR-β-글로빈 루핑에 기인한다는 것을 강력히 암시한다. 이들 관찰결과로부터의 예측은 LCR을 결여하는 대립형질이 ZF-SA 융합 단백질에 반응하지 않을 것이라는 것이다(도 11a). 대안적으로, β-글로빈 전사가 단순히 β-글로빈 프로모터에서 SA에 의해 유도된 전사 인자 조립으로부터 비롯된 경우, ZF-SA는 LCR과 무관하게 전사를 활성화시켜야 한다. 이 차이는 P-SA 단독의 발현에 의해 발휘된 β-글로빈 전사에 대한 긍정적인 효과에 비추어 볼 때 특히 중요하다. 이들 가능성들을 명확히 구별하기 위해, LCR의 결실에 대한 이형접합성을 나타내는 마우스(ΔLCR/+)로부터 유래된 E13.5 태아 간 적아세포에서 ZF-SA의 기능을 조사하였다(Bender et al. (2000) Mol. Cell., 5:387-393). ΔLCR 대립형질 상의 β-메이저 유전자는 D 일배체형인데 반해, 야생형 대립형질 상의 β-메이저 유전자는 S 일배체형이다. 이들 대립형질들의 전사체들 사이에 단일 뉴클레오티드 다형성을 구별하는 대립형질 특이적 qPCR 분석을 개발하였고(도 12), 이것은 이상적인 내부적으로 조절된 실험 셋업을 제공한다. 다음으로, ΔLCR/+ R1 세포를 ZF-SA 단백질을 발현하는 바이러스 벡터로 형질도입하고 이들을 6시간 동안 에리쓰로포이에틴에 노출시켜 적혈구 성숙을 촉진하였다. 대립형질 특이적 RT-qPCR은 야생형 대립형질(βmaj-S)이 P-SA와 함께 L-SA를 발현하거나 P-SA만을 발현하는 세포에서 활성화되었다는 것을 입증하였다(도 11b, 좌측 패널). L-SA는 음성 대조군으로서 작용하는 SA 결여 ZF와 유사하게 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않았다. 현저히 대조적으로, ΔLCR 대립형질 상의 β-메이저 유전자(βmaj-D)는 낮은 수준으로 발현되었고 P-SA/L-SA 또는 P-SA 단백질에 대한 매우 작은 반응을 보였다(도 11b, 중간 패널). ZF 융합 단백질 발현의 효과는 에리쓰로포이에틴의 존재 또는 부재 하에서 본질적으로 동일하였고, 다른 조사된 적혈구 유전자들이 그들의 활성에서 변경되지 않았기 때문에 β-글로빈 좌위에 대해 특이적이었다(도 13). D-대립형질 특이적 프라이머에 의해 생성된 잔류 신호는 D-대립형질로부터의 전사에 기인하는 것이 아니라 S-대립형질 cDNA와의 교차혼성화의 결과에 기인하였다. 이것은 D-대립형질 특이적 프라이머에 의해 생성된 신호의 대략 10%가 S-대립형질 cDNA와의 교차반응성으로부터 유래되었다는 것을 보여주는 주형 혼합 실험에 의해 입증되었다(도 12). 실제로, 동형접합성(ΔLCR/ΔLCR) R1 세포가 PSA로 형질도입되었을 때, β-글로빈 활성화는 배경 수준에 가까웠는데, 이것은 ΔLCR/야생형 세포에서 D 특이적 프라이머에 의해 수득된 낮은 신호가 사실상 교차혼성화에 기인하였다는 것을 확립한다(도 12b, 우측 패널). 종합하건대, 상기 결과들은 ZF-SA 단백질의 활성이 LCR의 존재에 전적으로 의존하므로 원거리 염색질 루핑에 의존한다는 것을 명확히 입증한다.

실시예 2

본 발명의 방법이 β-글로빈 좌위의 발생 재프로그래밍에 적합하다는 것을 보여주는 데이터가 여기에 제시되어 있다. 구체적으로, 성체 마우스 적혈구 세포에서 배아 글로빈(bH1) 유전자로의 "루핑" 인자의 표적화는 배아 글로빈 유전자 발현의 상당한 활성화를 유발한다. 실제로, 도 16은 LCR-βh1 염색질 루프의 형성이 성체 세포에서 침묵된 βh1 유전자를 재활성화시켰다는 것을 보여준다. 달성된 수준은 총 글로빈 합성의 약 24%이다. 이 발현 수준은 치료적으로 적절하므로, 이러한 방법이 β-지중해빈혈 및 겸상세포질환의 치료에 유용할 것임을 시사한다.

도 17도 루핑 인자(Ldb1)에 융합된 인공 징크 핑거가 인간 태아 (감마) 글로빈 프로모터로 표적화되었다는 실험 결과를 보여준다. ZF-Ldb1 융합 단백질을 발현하는 일차 인간 적혈구 세포(GFP+)는 총 글로빈 합성의 약 65%까지 도달하는 상승된 감마 글로빈 생성을 나타낸다.

본 발명의 일부 바람직한 실시양태들이 전술되어 있고 구체적으로 상기 예시되어 있지만, 본 발명을 이러한 실시양태들로 한정하기 위한 것은 아니다. 하기 특허청구범위에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 상기 실시양태들을 다양하게 변경시킬 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Blobel, Gerd Deng, Wulan <120> Controlled Gene Expression Methods <130> 3460-P05555WO00 <140> PCT/US2013/030650 <141> 2013-03-13 <150> 61/656,961 <151> 2012-06-07 <160> 83 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Asp Arg Asp Val Gly Pro Thr Pro Met Tyr Pro Pro Thr Tyr 1 5 10 15 Leu Glu Pro Gly Ile Gly Arg His Thr Pro Tyr Gly Asn Gln Thr Asp 20 25 30 Tyr Arg Ile Phe Glu Leu Asn Lys Arg Leu Gln Asn Trp Thr Glu Glu 35 40 45 Cys Asp Asn Leu Trp Trp Asp Ala Phe Thr Thr Glu Phe Phe Glu Asp 50 55 60 Asp Ala Met Leu Thr Ile Thr Phe Cys Leu Glu Asp Gly Pro Lys Arg 65 70 75 80 Tyr Thr Ile Gly Arg Thr Leu Ile Pro Arg Tyr Phe Arg Ser Ile Phe 85 90 95 Glu Gly Gly Ala Thr Glu Leu Tyr Tyr Val Leu Lys His Pro Lys Glu 100 105 110 Ala Phe His Ser Asn Phe Val Ser Leu Asp Cys Asp Gln Gly Ser Met 115 120 125 Val Thr Gln His Gly Lys Pro Met Phe Thr Gln Val Cys Val Glu Gly 130 135 140 Arg Leu Tyr Leu Glu Phe Met Phe Asp Asp 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Artificial Sequence <220> <223> pol II peptide <400> 83 Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser 1 5

Claims (17)

1. DNA 결합 도메인 및 루핑 인자를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, 상기 루핑 인자가 LIM 도메인 결합 1(Ldb1)의 단편이고, 상기 Ldb1의 단편은 서열번호 1의 아미노산 1 ~ 200을 포함하는 것인 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 상기 DNA 결합 도메인 및 상기 루핑 인자가 공유결합 또는 아미노산 링커를 통해 연결되는 것인 핵산 분자.
3. 제1항에 있어서, 상기 Ldb1이 인간 Ldb1인 핵산 분자.
4. 제1항에 있어서, 상기 DNA 결합 도메인이 징크 핑거 단백질을 포함하는 것인 핵산 분자.
5. 제1항에 있어서, 상기 DNA 결합 도메인이 관심있는 유전자의 프로모터 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하는 것인 핵산 분자.
6. 제5항에 있어서, 상기 프로모터가 글로빈 프로모터인 핵산 분자.
7. 제6항에 있어서, 상기 글로빈 프로모터가 태아 (감마) 글로빈 유전자 프로모터인 핵산 분자.
8. 제1항의 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드.
9. 제1항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
10. 제8항의 하나 이상의 폴리펩티드 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 겸상세포빈혈 또는 베타-지중해빈혈의 치료를 위한 약학적 조성물로서, 상기 DNA 결합 도메인이 글로빈 프로모터 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하는 것인 약학적 조성물.
11. 제1항의 하나 이상의 핵산 분자 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 겸상세포빈혈 또는 베타-지중해빈혈의 치료를 위한 약학적 조성물로서, 상기 DNA 결합 도메인이 글로빈 프로모터 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하는 것인 약학적 조성물.
12. 세포에서 제1항의 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함하는, 세포에서 관심있는 유전자의 발현을 조절하는 시험관 내 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 시험관 내 방법은 세포에서 제1 핵산 분자 및 제2 핵산 분자를 발현시키는 단계를 포함하고,
    상기 제1 핵산 분자는 제1 DNA 결합 도메인 및 제1 루핑 인자를 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 제1 루핑 인자는 LIM 도메인 결합 1(Ldb1)의 단편이며, 상기 Ldb1의 단편은 서열번호 1의 아미노산 1 ~ 200을 포함하고, 상기 제1 DNA 결합 도메인은 상기 관심있는 유전자의 프로모터 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하고,
    상기 제2 핵산 분자는 제2 DNA 결합 도메인 및 제2 루핑 인자를 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 제2 루핑 인자는 LIM 도메인 결합 1(Ldb1)의 단편이며, 상기 제2 DNA 결합 도메인은 상기 관심있는 유전자의 좌위 조절 영역 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하는 것인 시험관 내 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 제2 루핑 인자는 서열번호 1의 아미노산 1 ~ 200을 포함하는 Ldb1의 단편인 것인 시험관 내 방법.
15. 제10항에 있어서, 상기 DNA 결합 도메인이 태아 (감마) 글로빈 유전자 프로모터 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하는 것인 약학적 조성물.
16. 제11항에 있어서, 상기 DNA 결합 도메인이 태아 (감마) 글로빈 유전자 프로모터 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하는 것인 약학적 조성물.
17. 삭제

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