JP2021513847A

JP2021513847A - 相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリングテクノロジーを用いた遺伝子編集

Info

Publication number: JP2021513847A
Application number: JP2020543480A
Authority: JP
Inventors: ユードンガオ; スコットソダーリング
Original assignee: Duke University
Current assignee: Duke University
Priority date: 2018-02-15
Filing date: 2019-02-15
Publication date: 2021-06-03
Also published as: US20210047643A1; EP3752179A1; EP3752179A4; WO2019161304A1

Abstract

相同性非依存的ユニバーサルゲノム編集（ＨｉＵＧＥ）システムのための遺伝的構築物およびゲノム編集のために前記ＨｉＵＧＥシステムを用いる方法が本明細書に開示されている。本発明は、ｇＲＮＡポリヌクレオチド、挿入断片ポリヌクレオチド、およびＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組成物に関する。

Description

関連出願の相互参照
この出願は、全体が参照により本明細書に組み入れられている、２０１８年２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／６３１，３６０号の恩恵を主張する。
政府所有権の言明
この発明は、ＮＩＨにより授与された連邦助成金番号Ｒ０１ＭＨ１０３３７４およびＲ０１ＮＳ１０２４５６による政府支援でなされた。米国政府は、この発明の一定の権利を有する。

配列表
配列表は、本出願と共に電子形式でのみ提出されており、本明細書に参照により組み入れられている。配列表テキストファイル「０２８１９３−９２７６−ＷＯ０１＿Ａｓ＿Ｆｉｌｅｄ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」は、２０１９年２月１５日に作成され、サイズは５０９，７５１バイトである。
本開示は、相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔＵｎｉｖｅｒｓａｌＧｅｎｏｍｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）（ＨｉＵＧＥ）テクノロジーおよびウイルス送達系を用いた遺伝子編集の分野に関する。本開示はまた、インビトロでの細胞培養系とインビボでのモデル実験生物の両方における、タンパク質標識によるハイスループットスクリーニング、発現マーキング、およびタンパク質発現の破壊の分野に関する。

内因性タンパク質の操作および選択的標識は、細胞および生物体の生物学の分子機構を描写するために不可欠である。これらのストラテジーを可能にするための技術は、生物医学研究の基本的土台であるが、それらは、非効率的、労働集約的、または不正確である場合が多い。例えば、ＲＮＡｉを用いたタンパク質除去ストラテジーは、濃度依存的様式でオフターゲット効果の影響を受けやすく、遺伝子ノックアウトアプローチは、時間および資源の相当な投資を必要とする。内因性タンパク質を標識するための一般的な抗体方法もまた問題がある。利用可能な抗体の大部分は、他のタンパク質との予想外の交差反応性、品質のロット間変動、およびそれらが用いられる一連の適用に渡る抗体の不正確な検証が原因で、有用性が制限されていると推定される。問題のある抗体は、研究室間で全く異なりかつ再現不可能な知見の原因の、鍵となる試薬である可能性が高く、現在市場に氾濫している多数の疑わしい抗体に対する解決策を求める声が上がっている。さらに、タンパク質局在化および動態を可視化するための、またはドミナントネガティブ表現型を作製するための組換えタンパク質の過剰発現は、発現したタンパク質の濃度、利用可能な細胞ドッキング部位、および予期せぬ人為的細胞効果への感受性が非常に高い。

Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９に基づいたストラテジーは、非常に正確なゲノム編集を可能にして、上記の制限の多くに対処するものとして大いに有望である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）特定化ゲノム部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入する。Ｃａｓ９媒介性二本鎖切断のｇＲＮＡによって方向づけられるターゲティングのための必要条件は、２０〜２１ｂｐヌクレオチド遺伝子特異的配列の末端における「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）配列に基づいている。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（使われている最も一般的なバリアント）についてのＰＡＭ配列は、５’−ＮＧＧ−３’であり、式中、Ｎは任意のヌクレオチドを表す。この配列は、平均約１０ヌクレオチド（＋鎖と−鎖が組み合わされている）ごとに見出され、本質的にあらゆる遺伝子をターゲティングする可能性を切り開くものと推定される。二本鎖ゲノム切断は、細胞において２つの経路を介して修復される。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、好ましい経路であり、それは、修復過程中、ナンセンス変異を導入する挿入または欠失（インデル）を導入することができる。あるいは、ＤＳＢは、それより頻度が低い経路である相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復され得る。

どちらの経路（ＮＨＥＪおよびＨＤＲ）も現在、関心対象となる遺伝子（ＧＯＩ）へ外来配列（ペイロード）を挿入するようにドナーベクターによって細胞または組織において内因性タンパク質を操作するのに利用されている。内因性タンパク質の単一細胞での標識（ＳＬＥＮＤＲおよびウイルス（ｖ）ＳＬＥＮＤＲ）は、ＧＯＩへ配列を送達するためにＤＳＢ切断部位にフランキングする数百個の塩基対の相同性遺伝子特異的配列を含有するオリゴまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ドナーを用いる、ＨＤＲに基づいている（Mikuni et al., Cell 165:1803-1817 (2016); Nishiyama et al., Neuron 96:755-768 e755 (2017)）。あるいは、ＣＲＩＳＰａｉｎｔは、線状化されて、関心対象となる遺伝子へ組み込まれる一般化ドナーベクターとＮＨＥＪを組み合わせる（Schmid-Burgk et al., Nat Commun 7:12338 (2016)）。しかしながら、それは、多くのインビボでの適用にとって重要なウイルス送達方法と適合しない、特別に調製された小環状ベクターを必要とし、または細菌ベクターバックボーンが、必ず、ゲノムへ同時挿入され、それは、長期間、導入遺伝子発現に干渉し得る（Chen et al., Mol Ther 8:495-500 (2003); Chen et al., Mol Ther 3:403-410 (2001)）。これらの問題は、それの潜在的適用性を、特にインビボ適用について、制限する。

相同性非依存的導入遺伝子挿入（ＨＩＴＩ）もまたＧＯＩへ外来配列を挿入するのにＮＨＥＪを活用し、ベクターエレメントはキャリーオーバーされない（Suzuki et al., Nature 540: 144-149 (2016)）。ＨＩＴＩは、ＤＳＢ切断を遺伝子およびベクターへ同時に方向づけるように、ペイロードにフランキングする２３ｂｐ遺伝子特異的ガイドＲＮＡ認識配列を含有するドナーベクターを利用し、ＮＨＥＪ中のペイロード挿入を促進する。ＳＬＥＮＤＲおよびＨＩＴＩは、両末端においてタンパク質を改変するそれらの能力において柔軟であるが、重要な制限となるのは、ＧＯＩおよびペイロードに特異的なブティックベクターの必要性である。この共有の必要条件は、各ＧＯＩにおいて各ＤＳＢ切断部位のためのカスタムドナーベクターの作製を必要とすることにより、拡張性およびスループットを制限する。例えば、抗体エピトープタグを用いて、ヒトゲノム内の各タンパク質をターゲティングすることは、およそ１９，０００〜２０，０００個の遺伝子特異的ＳＬＥＮＤＲまたはＨＩＴＩドナーベクターを必要とする。タンパク質の最適な標識および検出のための共通したステップである、異なるリンカーアミノ酸配列、異なる抗体エピトープ、または蛍光タンパク質融合を試験することは、これらのストラテジーのより幅広い採用の障害へと加算的に増大する。同様に、各ドナーベクターはＧＯＩ配列特異的であるため、それらは、必然的に種特異的であり、さらに、現アプローチの普遍性を制限する。加えて、細胞局在化、発現分析、および相互作用パートナーの精製のためにタンパク質をターゲティングする現能力は、タンパク質特異的抗体テクノロジーに依存する。これらのテクノロジーは、利用可能な抗体の相対的選択性に依存してかなり非特異的である場合が多くあり得る。したがって、ハイスループットのゲノムワイド編集、スクリーニング、およびタンパク質標識のための正確かつ効率的な遺伝子編集ツールの必要性がなお依然として存在する。

本開示は、対象ゲノムを遺伝子編集するための相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）システムを対象とし、ＨｉＵＧＥシステムが、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼまたは（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）（ｉ）少なくとも１つの挿入断片をコードする第１のポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）第１のポリヌクレオチド配列の各側にフランキングする少なくとも１つのドナー認識配列（ＤＲＳ）であって、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの切断部位を含むＤＲＳ；および（ｉｉｉ）ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列であって、ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをＤＲＳへターゲティングし、かつ対象ゲノム内の特異的配列をターゲティングしない、第２のポリヌクレオチド配列を含む相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）ベクター；ならびに（ｃ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列にターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡまたは（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列へターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡをコードする第３のポリヌクレオチドを含む標的遺伝子ベクターを含む。

本開示は、対象ゲノムを遺伝子編集するための相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）システムを対象とし、ＨｉＵＧＥシステムが、（ａ）（ｉ）少なくとも１つの挿入断片をコードする第１のポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）第１のポリヌクレオチド配列の各側にフランキングする少なくとも１つのドナー認識配列（ＤＲＳ）であって、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの切断部位を含むＤＲＳ；（ｉｉｉ）ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列であって、ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをＤＲＳへターゲティングし、かつ対象ゲノム内の特異的配列をターゲティングしない、第２のポリヌクレオチド配列；（ｉｖ）第１のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分をコードする第３のポリヌクレオチド配列を含む相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）ベクター；ならびに（ｂ）（ｉ）第１のスプリットインテインと補完的な第２のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分をコードする第４のポリヌクレオチド配列であって、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分およびＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分が一緒に連結して、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを形成する、第４のポリヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列へターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡをコードする第５のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子特異的ベクターを含む。
本開示は、対象ゲノムにおける標的遺伝子の相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）の方法を対象とし、方法が、細胞を上記のＨｉＵＧＥシステムと接触させるステップを含む。
本開示は、上記のＨｉＵＧＥシステムを含むキットを対象とする。

遺伝子特異的ｇＲＮＡが遺伝子特異的ベクターまたはプラスミドから発現し、かつＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡを発現するＨｉＵＧＥベクターとペアになっている、ＨｉＵＧＥシステムの概略図である。相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）システムの概略図である。所定のゲノム座位へ挿入されるべきペイロードの交換可能性の概略図である。（ツールキット１）抗体エピトープタグの例を用いた、ＨｉＵＧＥベクターツールキットを示す図である。（ツールキット２）酵素の例を用いた、ＨｉＵＧＥベクターツールキットを示す図である。（ツールキット３）蛍光タンパク質の例を用いた、ＨｉＵＧＥベクターツールキットを示す図である。（ツールキット４）細胞輸送タグ（ＮＬＳ＝核局在化シグナル、ＮＥＳ＝核外移行配列、ｍｉｔｏ＝ミトコンドリアターゲティング配列）の例を用いた、ＨｉＵＧＥベクターツールキットを示す図である。（ツールキット５）特定適用のための他のペイロードの例を用いた、ＨｉＵＧＥベクターツールキットを示す図である。両方の鎖：ｔａｇｃｔａｇｃｔａｇｃｔａｇ（配列番号２９）およびｃｔａｇｃｔａｇｃｔａｇｃｔａ（配列番号３０）上の３つ全ての可能なオープンリーディングフレームにおける終止コドンカセットを示す図である。ドナー認識配列（ＤＲＳ）使用シナリオおよびその対応する、ＤＲＳ配列を支配するルールの適用性の例を示す図である。図３Ａについての凡例を示す図である。５つの例示的なＤＲＳ配列（上から下へ、配列番号２２〜２６）示すリストである。Ｃａｓ９発現マウスに由来した培養海馬ニューロンにおけるマウスＴｕｂｂ３遺伝子へのＨｉＵＧＥ媒介性赤血球凝集素（ＨＡ）抗体エピトープノックインのための５つの例示的なＤＲＳのＨＡ抗体免疫染色によるインビトロ試験を示す代表的な画像である。図３Ｄおよび３Ｅは、ＨＡ抗体免疫染色を示し、一方、図３Ｆおよび３Ｇは、図３Ｄおよび３Ｅ、それぞれにおける各対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（３’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示し、各パネルにおいて類似した細胞密度を実証している。スケールバーは各パネルに示されている。Ｃａｓ９発現マウスに由来した培養海馬ニューロンにおけるマウスＴｕｂｂ３遺伝子へのＨｉＵＧＥ媒介性赤血球凝集素（ＨＡ）抗体エピトープノックインのための５つの例示的なＤＲＳのＨＡ抗体免疫染色によるインビトロ試験を示す代表的な画像である。図３Ｄおよび３Ｅは、ＨＡ抗体免疫染色を示し、一方、図３Ｆおよび３Ｇは、図３Ｄおよび３Ｅ、それぞれにおける各対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（３’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示し、各パネルにおいて類似した細胞密度を実証している。スケールバーは各パネルに示されている。Ｃａｓ９発現マウスに由来した培養海馬ニューロンにおけるマウスＴｕｂｂ３遺伝子へのＨｉＵＧＥ媒介性赤血球凝集素（ＨＡ）抗体エピトープノックインのための５つの例示的なＤＲＳのＨＡ抗体免疫染色によるインビトロ試験を示す代表的な画像である。図３Ｄおよび３Ｅは、ＨＡ抗体免疫染色を示し、一方、図３Ｆおよび３Ｇは、図３Ｄおよび３Ｅ、それぞれにおける各対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（３’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示し、各パネルにおいて類似した細胞密度を実証している。スケールバーは各パネルに示されている。Ｃａｓ９発現マウスに由来した培養海馬ニューロンにおけるマウスＴｕｂｂ３遺伝子へのＨｉＵＧＥ媒介性赤血球凝集素（ＨＡ）抗体エピトープノックインのための５つの例示的なＤＲＳのＨＡ抗体免疫染色によるインビトロ試験を示す代表的な画像である。図３Ｄおよび３Ｅは、ＨＡ抗体免疫染色を示し、一方、図３Ｆおよび３Ｇは、図３Ｄおよび３Ｅ、それぞれにおける各対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（３’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示し、各パネルにおいて類似した細胞密度を実証している。スケールバーは各パネルに示されている。インビトロでの二方向性ＨＡエピトープノックイン（ＫＩ）のためのＨｉＵＧＥ適用の概略図である。微小管標識を示す、β−チューブリンをコードするマウスＴｕｂｂ３（ｍＴｕｂｂ３）遺伝子へのＨＡエピトープＫＩを示す免疫染色の代表的な画像である。スケールバーはパネルに示されている。（空のＧＳ−ｇＲＮＡバックボーンおよびＨｉＵＧＥドナーＡＡＶを形質導入された）陰性対照と比較した、ＨｉＵＧＥ編集された試料のＨＡエピトープについてのウェスタンブロットを示す図であり、βＩＩＩ−チューブリンについての予想分子量（約５１ｋＤ）におけるＨＡエピトープ標識タンパク質の単一バンドを示している。フォワード配向またはリバース配向のどちらにおいても正しいＨＡエピトープ組込みを示す、代表的なシーケンシング結果（配列番号３２（上）および３３（下））を示す図である。ｇＲＮＡベクターが、アウトオブフレームドナー（ＯＲＦ＋０またはＯＲＦ＋２）に対して、正しいＯＲＦドナーベクター（ＯＲＦ＋１）とペアになった時の高効率標識を示すために、ベクターの異なる組合せを形質導入された初代ニューロンのＨＡ免疫染色の代表的な画像である。スケールバーは各パネルに示されている。図４Ｅにおける各対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示す図であり、各パネルにおいて類似した細胞密度を示している。スケールバーは各パネルに示されている。追加の定性的および定量的データ実験を示す図である。図４Ｇは、実験群に渡る標準化平均蛍光強度（任意単位、ａ．ｕ．）を示す。誤差バーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。ｍＴｕｂｂ３ＧＳ−ｇＲＮＡとＨｉＵＧＥドナーの正しいＯＲＦペア形成が、ＯＲＦミスマッチ対照および陰性対照に対して、有意により高いＨＡエピトープ蛍光強度を示した（ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後、Ｔｕｋｅｙ−ＫｒａｍｅｒＨＳＤ事後検定）。追加の定性的および定量的データ実験を示す図である。図４Ｈは、タンパク質改変を促進するための３つ全てのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の、ＧＳ−ｇＲＮＡ選択の柔軟性およびＨｉＵＧＥドナーベクターの能力を実証する。各ＯＲＦ（ＯＲＦ＋０、ＯＲＦ＋１、ＯＲＦ＋２）について１つの、３つの異なるＧＳ−ｇＲＮＡを、マウスＭａｐ２（ｍＭａｐ２）遺伝子をターゲティングするようにデザインした。網掛けのＤＮＡトリプレットは、各ＧＳ−ｇＲＮＡについての標的配列のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を表示する。下線が引かれたＤＮＡトリプレットは、各ＧＳ−ｇＲＮＡについてのＣａｓ９切断部位の前の最後のコドンを表示する。追加の定性的および定量的データ実験を示す図である。図４Ｉは、各ＯＲＦのＧＳ−ｇＲＮＡが、対応するＯＲＦのＨｉＵＧＥドナーとペアになった時のＨＡエピトープＫＩの同等の検出を示す代表的な画像を示す。スケールバーは各パネルに示されている。図５Ｂ〜５Ｍに示された、１２個の異なるタンパク質へのカルボキシ末端二方向性ＨＡエピトープノックイン（ＫＩ）へのＨｉＵＧＥのスケールアップされた適用の概略図である。インビトロでの培養日数（ＤＩＶ）４〜６に、遺伝子特異的（ＧＳ）−ｇＲＮＡＡＡＶベクターおよびＨｉＵＧＥドナーＡＡＶベクターの組合せを形質導入されたＣａｓ９発現マウス由来の初代海馬細胞の代表的な画像である。マウスＴｕｂｂ３遺伝子（図５Ｂ）、マウスＭａｐ２遺伝子（図５Ｃ）、マウスＭｅｃＰ２遺伝子（図５Ｄ；挿入図は、枠で囲まれた領域のより高い倍率表示である）、マウスＮｒｃａｍ遺伝子（図５Ｅ）、マウスＡｃｔｒ２遺伝子（図５Ｆ；挿入図は、枠で囲まれた領域のより高い倍率表示である）、マウスＣｌｔａ遺伝子（図５Ｇ；挿入図は、枠で囲まれた領域のより高い倍率表示である）、のＨＡエピトープＫＩを示す。スケールバーは、各パネルに示されている。挿入図内のスケールバーは２μｍを表す。矢じり形は、樹状突起棘、ミトコンドリア、または神経突起の遠位端などの、関心対象となる遺伝子に関連した細胞内フィーチャーを示す。インビトロでの培養日数（ＤＩＶ）４〜６に、遺伝子特異的（ＧＳ）−ｇＲＮＡＡＡＶベクターおよびＨｉＵＧＥドナーＡＡＶベクターの組合せを形質導入されたＣａｓ９発現マウス由来の初代海馬細胞の代表的な画像である。マウスＡｎｋ３遺伝子（図５Ｈ）、マウスＳｐｔｂｎ４遺伝子（図５Ｉ）、およびマウスＳｃｎ２ａ遺伝子（図５Ｊ）、マウスＧＦＡＰ遺伝子（図５Ｋ）、マウスＰｄｈａ１遺伝子（図５Ｌ；挿入図は、枠で囲まれた領域のより高い倍率表示である）、およびマウスＤｃｘ遺伝子（図５Ｍ；挿入図は、枠で囲まれた領域のより高い倍率表示である）のＨＡエピトープＫＩを示す。スケールバーは、各パネルに示されている。挿入図内のスケールバーは２μｍを表す。矢じり形は、樹状突起棘、ミトコンドリア、または神経突起の遠位端などの、関心対象となる遺伝子に関連した細胞内フィーチャーを示す。インビボでのカルボキシ末端二方向性ＨＡエピトープノックイン（ＫＩ）へのＨｉＵＧＥ適用の概略図である。図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、および６Ｈは、マウスＳｐｔｂｎ４遺伝子（図６Ｂ）、マウスＳｃｎ２ａ遺伝子（図６Ｄ）、マウスＴｕｂｂ３遺伝子（図６Ｆ）、およびマウスＭｅｃｐ２遺伝子（図６Ｈ）のＨＡエピトープ免疫染色の代表的な画像である。図６Ｃ、６Ｅ、６Ｇ、および６Ｉは、図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、および６Ｈにおけるそれぞれの対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示す。スケールバーは各パネルに示されている。右パネルにおけるより高い倍率画像は、左パネルにおける枠で囲まれた領域に対応する。図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、および６Ｈは、マウスＳｐｔｂｎ４遺伝子（図６Ｂ）、マウスＳｃｎ２ａ遺伝子（図６Ｄ）、マウスＴｕｂｂ３遺伝子（図６Ｆ）、およびマウスＭｅｃｐ２遺伝子（図６Ｈ）のＨＡエピトープ免疫染色の代表的な画像である。図６Ｃ、６Ｅ、６Ｇ、および６Ｉは、図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、および６Ｈにおけるそれぞれの対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示す。スケールバーは各パネルに示されている。右パネルにおけるより高い倍率画像は、左パネルにおける枠で囲まれた領域に対応する。図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、および６Ｈは、マウスＳｐｔｂｎ４遺伝子（図６Ｂ）、マウスＳｃｎ２ａ遺伝子（図６Ｄ）、マウスＴｕｂｂ３遺伝子（図６Ｆ）、およびマウスＭｅｃｐ２遺伝子（図６Ｈ）のＨＡエピトープ免疫染色の代表的な画像である。図６Ｃ、６Ｅ、６Ｇ、および６Ｉは、図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、および６Ｈにおけるそれぞれの対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示す。スケールバーは各パネルに示されている。右パネルにおけるより高い倍率画像は、左パネルにおける枠で囲まれた領域に対応する。図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、および６Ｈは、マウスＳｐｔｂｎ４遺伝子（図６Ｂ）、マウスＳｃｎ２ａ遺伝子（図６Ｄ）、マウスＴｕｂｂ３遺伝子（図６Ｆ）、およびマウスＭｅｃｐ２遺伝子（図６Ｈ）のＨＡエピトープ免疫染色の代表的な画像である。図６Ｃ、６Ｅ、６Ｇ、および６Ｉは、図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、および６Ｈにおけるそれぞれの対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示す。スケールバーは各パネルに示されている。右パネルにおけるより高い倍率画像は、左パネルにおける枠で囲まれた領域に対応する。ＨｉＵＧＥモザイクエピトープノックイン（ＫＩ）適用の概略図である。初代海馬ニューロンにおけるマウスＭａｐ２遺伝子へのモザイクエピトープＫＩの免疫染色の代表的な画像である（太い矢じり形、ｍｙｃエピトープ染色；矢印、ＨＡエピトープ染色；細い矢じり形、Ｖ５エピトープ染色）。スケールバーはパネルに示されている。ＨＡエピトープとｍｙｃエピトープの両方についてインビボで染色されたマウスＴｕｂｂ３遺伝子のモザイクエピトープＫＩからの冠状脳切片の免疫染色の代表的な画像である。スケールバーは各パネルに示されている。図７Ｃの皮質、海馬、視床、視床皮質投射、淡蒼球、および脳梁を示す拡大画像である。スケールバーは各パネルに示されている。図７Ｃの皮質、海馬、視床、視床皮質投射、淡蒼球、および脳梁を示す拡大画像である。スケールバーは各パネルに示されている。近位ビオチン化実験へのＨｉＵＧＥＢｉｏＩＤ２酵素ＫＩ適用の概略図である。マウスＧＦＡＰ遺伝子によりコードされたグリア酸性線維性タンパク質のカルボキシ末端へのＢｉｏＩＤ２−ＨＡＫＩを示す免疫染色、および対応する、蛍光ストレプトアビジンを用いたビオチン化タンパク質の検出（右パネル）の代表的な画像である。マウスＭａｐ２遺伝子によりコードされたＭａｐ２タンパク質のカルボキシ末端へのＢｉｏＩＤ２−ＨＡＫＩを示す免疫染色、および対応する、蛍光ストレプトアビジンを用いたビオチン化タンパク質の陽性検出（右パネル）の代表的な画像である。構造機能関係の研究を行うために内因性タンパク質を切り詰めるためのＨｉＵＧＥＨＡ−３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）ＫＩの概略図である。 βＩＶ−スペクトリンから、プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインまたはより上流のスペクトリンリピートを切り詰めるためのＨＡ−３’ＵＴＲＫＩストラテジーを用いた例を示す図である。マウスＳｐｔｂｎ４遺伝子のエクソン３１（ｅ．３１）をターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡを用いたβＩＶ−スペクトリンからのＰＨドメインの切り詰め（図９Ｄ）を示す免疫染色の、エクソン３６（ｅ．３６）をターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡを用いたカルボキシ末端ＫＩ（図９Ｃ）と比較した、代表的な画像である。マウスＳｐｔｂｎ４遺伝子のエクソン３１（ｅ．３１）をターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡを用いたβＩＶ−スペクトリンからのＰＨドメインの切り詰め（図９Ｄ）を示す免疫染色の、エクソン３６（ｅ．３６）をターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡを用いたカルボキシ末端ＫＩ（図９Ｃ）と比較した、代表的な画像である。エクソン２６（ｅ．２６）をターゲティングすることにより、スペクトリンリピート１４の破壊および下流配列の切り詰めを示す図であり、それは、ＡＩＳ局在化を完全に破壊した。 βＩＶ−スペクトリンタンパク質の段階的切り詰めを示すウェスタンブロットを示す図である。ＨｉＵＧＥ蛍光タンパク質（ＦＰ）ＫＩの概略図である。異なるゲノム標的（ＧＦＡＰ（図１０Ｂ）、Ｐｄｈａ１（図１０Ｃ）、およびＴｕｂｂ３（図１０Ｄ））へのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質（ｍＣｈ）ＫＩを示す図である。ＨｉＵＧＥアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒｍ）ＫＩ構築物の概略図である。Ｍａｐ２へのＭｙｃエピトープのＮ−ｔｅｒｍＫＩ（ＭＡＰ２、矢印）、およびタンパク質βＩＶ−スペクトリンをコードするＳｐｔｂｎ４へのＨＡエピトープのＣ−ｔｅｒｍＫＩ（矢じり形）による、Ｍａｐ２およびＳｐｔｂｎ４コード化タンパク質の二重標識の代表的な免疫染色画像である。破線円形は、二重標識ニューロンの神経細胞体を表す。ＨｉＵＧＥ細胞内再局在化構築物の概略図である。ｃ末端においてＨＡでタグ付けされたＭａｐ２の免疫染色（左パネル）および核局在化シグナル（ＨＡ−ＮＬＳ）でタグ付けされたＭａｐ２の免疫染色（右パネル）の代表的な画像である。両方のパネルにおける矢じり形は、核の部位を示す。スケールバーは各パネルに示されている。アクチン細胞骨格タンパク質Ａｒｐ２を核へ別ルートで送達し、隔離するために、ＨＡエピトープおよび核局在化シグナル（ＨＡ−ＮＬＳ）を有するＨｉＵＧＥペイロードを用いる例を示す図である。核へ再方向づけされたＨＡ−ＮＬＳタグ付きＡｒｐ２（赤色）を示す、マウスＡｃｔｒ２遺伝子へのＣ−ｔｅｒｍＨＡ−ＮＬＳＫＩ後の免疫染色の代表的な画像である。同時に、Ｍｙｃエピトープ（ＮＬＳなし）タグ付きＡｒｐ２（緑色）は、Ａｒｐ２の正常な局在化と一致した、樹状突起棘に濃縮された。ビルトイン式Ｃａｓ９コード配列を有する第２世代ＨｉＵＧＥシステムの概略図である。マウスＴｕｂｂ３遺伝子（図１３Ｂ）へのＨＡエピトープＫＩの代表的な画像である。スケールバーは各パネルに示されている。野生型（ＷＴ）初代マウスニューロンがＡＡＶ形質導入された。マウスＰｄｈａ１遺伝子（図１３Ｃ）へのＨＡエピトープＫＩの代表的な画像である。スケールバーは各パネルに示されている。野生型（ＷＴ）初代マウスニューロンがＡＡＶ形質導入された。マウスＴｕｂｂ３遺伝子（図１３Ｄ）のＧＦＰＫＩの代表的な画像である。スケールバーは各パネルに示されている。野生型（ＷＴ）初代マウスニューロンがＡＡＶ形質導入された。マウスＰｄｈａ１遺伝子（図１３Ｅ）のＧＦＰＫＩの代表的な画像である。スケールバーは各パネルに示されている。野生型（ＷＴ）初代マウスニューロンがＡＡＶ形質導入された。図１３Ｆ〜１３Ｋは、ＧＳ−ｇＲＮＡとＨｉＵＧＥドナーの組合せでプラスミドトランスフェクションされ、その後、ペイロードＫＩを検出するためにＨＡエピトープまたはＧＦＰについての免疫染色された、一般的なヒトまたはマウス細胞株を示す図である。図１３Ｆ、１３Ｈ、および１３Ｊは、ヒトＴＵＢＢまたはマウスＴｕｂｂ５遺伝子へのＨＡエピトープＫＩの代表的な画像であり、（図１３Ｆ）ＨｅＬａ細胞、（図１３Ｈ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、および（図１３Ｊ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるタグ付きタンパク質の特有の微小管局在化を示している。図１３Ｇ、１３Ｉ、および１３Ｋは、ヒトＴＵＢＢまたはマウスＴｕｂｂ５遺伝子へのＧＦＰＫＩの代表的な画像であり、（図１３Ｇ）ＨｅＬａ細胞、（図１３Ｉ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、および（図１３Ｋ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるタグ付きタンパク質の特有の微小管局在化を示している。図１３Ｆ〜１３Ｋは、ＧＳ−ｇＲＮＡとＨｉＵＧＥドナーの組合せでプラスミドトランスフェクションされ、その後、ペイロードＫＩを検出するためにＨＡエピトープまたはＧＦＰについての免疫染色された、一般的なヒトまたはマウス細胞株を示す図である。図１３Ｆ、１３Ｈ、および１３Ｊは、ヒトＴＵＢＢまたはマウスＴｕｂｂ５遺伝子へのＨＡエピトープＫＩの代表的な画像であり、（図１３Ｆ）ＨｅＬａ細胞、（図１３Ｈ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、および（図１３Ｊ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるタグ付きタンパク質の特有の微小管局在化を示している。図１３Ｆ〜１３Ｋは、ＧＳ−ｇＲＮＡとＨｉＵＧＥドナーの組合せでプラスミドトランスフェクションされ、その後、ペイロードＫＩを検出するためにＨＡエピトープまたはＧＦＰについての免疫染色された、一般的なヒトまたはマウス細胞株を示す図である。図１３Ｇ、１３Ｉ、および１３Ｋは、ヒトＴＵＢＢまたはマウスＴｕｂｂ５遺伝子へのＧＦＰＫＩの代表的な画像であり、（図１３Ｇ）ＨｅＬａ細胞、（図１３Ｉ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、および（図１３Ｋ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるタグ付きタンパク質の特有の微小管局在化を示している。図１３Ｍは、成体ＷＴマウスの背側海馬における局所的ＡＡＶ注射後のマウスＭａｐ２遺伝子へのＨＡエピトープＫＩの代表的な画像であり、反対側での陰性標識と比較して、注射部位におけるニューロンの効率的標識を示している。枠で囲まれたエリアの拡大表示は図１３Ｌに示されている。スケールバーは各パネルに示されている。図１３Ｍは、成体ＷＴマウスの背側海馬における局所的ＡＡＶ注射後のマウスＭａｐ２遺伝子へのＨＡエピトープＫＩの代表的な画像であり、反対側での陰性標識と比較して、注射部位におけるニューロンの効率的標識を示している。枠で囲まれたエリアの拡大表示は図１３Ｌに示されている。スケールバーは各パネルに示されている。インテインスプリットＣａｓ９を有するＨｉＵＧＥベクターについての対照実験を示す図である。スケールバーは各パネルに示されている。インテインスプリットＣａｓ９を有するＨｉＵＧＥベクターについての対照実験を示す図である。スケールバーは各パネルに示されている。インビトロでのＨｉＵＧＥを用いた、多様なゲノムおよびタンパク質標的に渡る迅速なタンパク質改変を示す図である。図１５Ａは、インビトロでのＣ−ｔｅｒｍまたはＮ−ｔｅｒｍタンパク質標識へのＨｉＵＧＥＫＩ適用の概略図を示す。インビトロでのＨｉＵＧＥを用いた、多様なゲノムおよびタンパク質標的に渡る迅速なタンパク質改変を示す図である。図１５Ｂ〜１５Ｄは、抑制性シナプス後肥厚（ｉＰＳＤ）タンパク質である抑制性シナプスタンパク質１、２、およびＲｈｏＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質３２をコードする、マウス（図１５Ｂ）Ｉｎｓｙｎ１、（図１５Ｃ）Ｉｎｓｙｎ２、および（図１５Ｄ）Ａｒｈｇａｐ３２遺伝子へのＣ−ｔｅｒｍｓｍＦＰ−ＨＡＫＩを示す。隣接している抑制性シナプス前マーカー、小胞ＧＡＢＡ輸送体（ＶＧＡＴ）免疫シグナルとのＨＡ免疫反応性の共局在が挿入図に示されている。スケールバーは各パネル、または挿入図（２μｍ）内に示されている。Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰのＧＦＰ蛍光およびＤＡＰＩでの核標識もまた示されている。矢じり形は、樹状突起棘、ＡＩＳ、ミトコンドリア、神経突起の遠位端、抑制性シナプス、およびニューロフィラメントなどの、標的遺伝子に関連した細胞内フィーチャーを示す。インビトロでのＨｉＵＧＥを用いた、多様なゲノムおよびタンパク質標的に渡る迅速なタンパク質改変を示す図である。図１５Ｂ〜１５Ｄは、抑制性シナプス後肥厚（ｉＰＳＤ）タンパク質である抑制性シナプスタンパク質１、２、およびＲｈｏＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質３２をコードする、マウス（図１５Ｂ）Ｉｎｓｙｎ１、（図１５Ｃ）Ｉｎｓｙｎ２、および（図１５Ｄ）Ａｒｈｇａｐ３２遺伝子へのＣ−ｔｅｒｍｓｍＦＰ−ＨＡＫＩを示す。隣接している抑制性シナプス前マーカー、小胞ＧＡＢＡ輸送体（ＶＧＡＴ）免疫シグナルとのＨＡ免疫反応性の共局在が挿入図に示されている。スケールバーは各パネル、または挿入図（２μｍ）内に示されている。Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰのＧＦＰ蛍光およびＤＡＰＩでの核標識もまた示されている。矢じり形は、樹状突起棘、ＡＩＳ、ミトコンドリア、神経突起の遠位端、抑制性シナプス、およびニューロフィラメントなどの、標的遺伝子に関連した細胞内フィーチャーを示す。インビトロでのＨｉＵＧＥを用いた、多様なゲノムおよびタンパク質標的に渡る迅速なタンパク質改変を示す図である。図１５Ｂ〜１５Ｄは、抑制性シナプス後肥厚（ｉＰＳＤ）タンパク質である抑制性シナプスタンパク質１、２、およびＲｈｏＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質３２をコードする、マウス（図１５Ｂ）Ｉｎｓｙｎ１、（図１５Ｃ）Ｉｎｓｙｎ２、および（図１５Ｄ）Ａｒｈｇａｐ３２遺伝子へのＣ−ｔｅｒｍｓｍＦＰ−ＨＡＫＩを示す。隣接している抑制性シナプス前マーカー、小胞ＧＡＢＡ輸送体（ＶＧＡＴ）免疫シグナルとのＨＡ免疫反応性の共局在が挿入図に示されている。スケールバーは各パネル、または挿入図（２μｍ）内に示されている。Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰのＧＦＰ蛍光およびＤＡＰＩでの核標識もまた示されている。矢じり形は、樹状突起棘、ＡＩＳ、ミトコンドリア、神経突起の遠位端、抑制性シナプス、およびニューロフィラメントなどの、標的遺伝子に関連した細胞内フィーチャーを示す。インビトロでのＨｉＵＧＥを用いた、多様なゲノムおよびタンパク質標的に渡る迅速なタンパク質改変を示す図である。図１５Ｅ〜１５Ｇは、（図１５Ｅ）Ａｃｔｂ（β−アクチン）、（図１５Ｆ）Ｌｍｎｂ１（ラミンＢ１）、および（図１５Ｇ）Ｎｅｆｍ（ニューロフィラメントミディアム（ＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔＭｅｄｉｕｍ））へのＮ−ｔｅｒｍＭｙｃエピトープＫＩを示し、樹状突起棘、核エンベロープ、およびニューロフィラメントにおける特徴的な発現パターンを示す。スケールバーは各パネル、または挿入図（２μｍ）内に示されている。Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰのＧＦＰ蛍光およびＤＡＰＩでの核標識もまた示されている。矢じり形は、樹状突起棘、ＡＩＳ、ミトコンドリア、神経突起の遠位端、抑制性シナプス、およびニューロフィラメントなどの、標的遺伝子に関連した細胞内フィーチャーを示す。インビトロでのＨｉＵＧＥを用いた、多様なゲノムおよびタンパク質標的に渡る迅速なタンパク質改変を示す図である。図１５Ｅ〜１５Ｇは、（図１５Ｅ）Ａｃｔｂ（β−アクチン）、（図１５Ｆ）Ｌｍｎｂ１（ラミンＢ１）、および（図１５Ｇ）Ｎｅｆｍ（ニューロフィラメントミディアム（ＮｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔＭｅｄｉｕｍ））へのＮ−ｔｅｒｍＭｙｃエピトープＫＩを示し、樹状突起棘、核エンベロープ、およびニューロフィラメントにおける特徴的な発現パターンを示す。スケールバーは各パネル、または挿入図（２μｍ）内に示されている。Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰのＧＦＰ蛍光およびＤＡＰＩでの核標識もまた示されている。矢じり形は、樹状突起棘、ＡＩＳ、ミトコンドリア、神経突起の遠位端、抑制性シナプス、およびニューロフィラメントなどの、標的遺伝子に関連した細胞内フィーチャーを示す。ペイロード組込みおよび推定インデル率を確認するためのゲノムＰＣＲおよびディープシーケンシングを示す図である。図１６Ａは、様々なゲノム座位への二重配向ＨＡエピトープペイロード組込みを検出するためのゲノムＰＣＲの概略設計を示す。ペイロード組込みおよび推定インデル率を確認するためのゲノムＰＣＲおよびディープシーケンシングを示す図である。図１６Ｂは、フォワードペイロード組込みとリバースペイロード組込みの両方についての挿入断片特異的ＰＣＲが、陰性対照（編集なし）におけるバンドなしと比較して、編集された試料において陽性バンド（約１５０〜２００ｂｐ）を示したことを示している。ペイロード組込みおよび推定インデル率を確認するためのゲノムＰＣＲおよびディープシーケンシングを示す図である。図１６Ｃ〜１６Ｄは、フォワードペイロード組込みかまたはリバースペイロード組込みのいずれかのＰＣＲ産物をディープシーケンシングすることによるインデル頻度の分析を示す。ペイロード組込みおよび推定インデル率を確認するためのゲノムＰＣＲおよびディープシーケンシングを示す図である。図１６Ｃ〜１６Ｄは、フォワードペイロード組込みかまたはリバースペイロード組込みのいずれかのＰＣＲ産物をディープシーケンシングすることによるインデル頻度の分析を示す。ＨｉＵＧＥを用いた局在化マッピング適用の追加データを示す図である。図１７Ａは、３つの異なるＧＳ−ｇＲＮＡによって方向づけられた、マウスＩｎｓｙｎ１へのＨｉＵＧＥＣ−ｔｅｒｍｓｍＦＰ−ＨＡＫＩの概略図を示す。網掛けのＤＮＡトリプレットは、各ＧＳ−ｇＲＮＡについての標的配列のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を表す。矢じり形は、Ｃａｓ９切断部位を示す。ＨｉＵＧＥを用いた局在化マッピング適用の追加データを示す図である。図１７Ｂ〜１７Ｄは、抑制性シナプスにおける成功した同等の点状標識が３つ全てのＧＳ−ｇＲＮＡに渡って観察されたことを示す。隣接している抑制性シナプス前マーカー、小胞ＧＡＢＡ輸送体（ＶＧＡＴ）免疫シグナルとのＨＡ免疫反応性の共局在が挿入図に示されている（矢じり形）。スケールバーは各パネル、または挿入図（２μｍ）に示されている。ＨｉＵＧＥを用いた局在化マッピング適用の追加データを示す図である。図１７Ｂ〜１７Ｄは、抑制性シナプスにおける成功した同等の点状標識が３つ全てのＧＳ−ｇＲＮＡに渡って観察されたことを示す。隣接している抑制性シナプス前マーカー、小胞ＧＡＢＡ輸送体（ＶＧＡＴ）免疫シグナルとのＨＡ免疫反応性の共局在が挿入図に示されている（矢じり形）。スケールバーは各パネル、または挿入図（２μｍ）に示されている。ＨｉＵＧＥを用いた局在化マッピング適用の追加データを示す図である。図１７Ｂ〜１７Ｄは、抑制性シナプスにおける成功した同等の点状標識が３つ全てのＧＳ−ｇＲＮＡに渡って観察されたことを示す。隣接している抑制性シナプス前マーカー、小胞ＧＡＢＡ輸送体（ＶＧＡＴ）免疫シグナルとのＨＡ免疫反応性の共局在が挿入図に示されている（矢じり形）。スケールバーは各パネル、または挿入図（２μｍ）に示されている。ＨｉＵＧＥを用いた細胞標識効率の定量化を示す図である。図１８Ａは、初代ニューロンにおける高ＡＡＶ濃度（ウイルスごとに２．５×１０¹¹ＧＣ／ｍＬ）下での、マウスＳｐｔｂｎ４およびＳｃｎ２ａへのＣ−ｔｅｒｍＨＡエピトープＫＩによるＡＩＳタンパク質、βＩＶ−スペクトリン、およびＮａＶ１．２のＨｉＵＧＥ標識の代表的な画像を示す。ＨｉＵＧＥを用いた細胞標識効率の定量化を示す図である。図１８Ｂは、１：１のウイルス比（ＧＳ−ｇＲＮＡ：ドナー）下でのいくつかのＡＡＶ濃度に渡る細胞標識の推定効率を示す定量化結果を示す。ＨｉＵＧＥを用いた細胞標識効率の定量化を示す図である。図１８Ｃは、１×１０¹¹ＧＣ／ｍＬの組み合わせたウイルス濃度下でのＡＡＶのいくつかの比（ＧＳ−ｇＲＮＡ：ドナー）に渡る細胞標識の推定効率を示す定量化結果を示す。ＨｉＵＧＥのオフターゲット効果の評価を示す図である。図１９Ａは、ＨＤ−ｇＲＮＡとｍＳｃｎ２ａＧＳ−ｇＲＮＡの両方についての上位にランク付けられたＣＲＩＳＰＯＲ予測オフターゲット座位を示す（上から下へ配列番号１５５〜１６２は、オフターゲットパターンを示す）。ＨｉＵＧＥのオフターゲット効果の評価を示す図である。図１９Ｂは、ペイロード特異的プライマーとペアになった遺伝子特異的プライマーを用いるゲノムＰＣＲ反応が、オンターゲット組込みの検出に成功し、一方、ペイロードのオフターゲットゲノム組込みは、予測された部位（ＰｒｅＯｆｆ＿１〜８）について検出されなかったことを示す。ＨｉＵＧＥのオフターゲット効果の評価を示す図である。図１９Ｃは、ゲノムＷａｌｋｅｒ実験が、オンターゲット組込み（バンド４）、および非コードゲノム領域への３つの潜在的オフターゲット組込み（バンド５〜７）を検出したことを示す。ＨｉＵＧＥのオフターゲット効果の評価を示す図である。図１９Ｄは、ペイロード特異的プライマーとペアになった遺伝子特異的プライマーを用いるゲノムＰＣＲ反応が、オンターゲット組込みの検出に成功し、一方、ペイロードのゲノム組込みは、実験的に同定された潜在的オフターゲット部位（ＥｘｐＯｆｆ＿１〜３）について検出されなかったことを示す。ＨｉＵＧＥのオフターゲット効果の評価を示す図である。図１９Ｅは、オンターゲット組込み（緑色）対オフターゲット組込み（赤色）についての反応のリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。ＨｉＵＧＥのオフターゲット効果の評価を示す図である。図１９Ｆは、相対量の半定量的推定が、オフターゲット組込みがオンターゲット組込みと比較してまれであることを示したことを示す。神経回路に基づいたＨｉＵＧＥ標識を示す図である。図２０Ａは、線条体へのＡＡＶ２−ｒｅｔｒｏｍＴｕｂｂ３ＧＳ−ｇＲＮＡの注射、ならびに運動皮質におけるＡＡＶ２／９ＨＡおよびＭｙｃエピトープドナーの２回の側方注射による、βＩＩＩ−チューブリンの皮質線条体回路選択的Ｃ−ｔｅｒｍＨｉＵＧＥ標識の図を示す。図２０Ｂは、運動皮質におけるＧＦＰ標識を示す代表的な画像を示し、皮質投射ニューロンにおける、逆行性にアクセスされたＣｒｅ依存性Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰ発現を示している。図２０Ｃは、図２０Ｂにおける枠で囲まれたエリアから画像化された、ＨＡエピトープ（矢印）およびＭｙｃエピトープ（矢じり形）タグ付きβＩＩＩ−チューブリンの免疫標識を示す。スケールバーは各パネルに示されている。神経回路に基づいたＨｉＵＧＥ標識を示す図である。図２０Ｄは、図２０Ｃにおける枠で囲まれたエリアからの拡大画像を示し、（ｉ）ＨＡエピトープまたは（ｉｉ）Ｍｙｃエピトープが陽性である細胞を示している。図２０Ｅは、ＡＡＶ２−ｒｅｔｒｏを注射された線条体からのＧＦＰシグナルを示す。図２０Ｆは、図２０Ｅにおける枠で囲まれたエリアの拡大画像を示し、ＨＡまたはＭｙｃエピトープ陽性の線維を含有するＧＦＰ陽性軸索束を示している。図２０Ｇ〜２０Ｈは、図２０Ｆにおける枠で囲まれたエリアからのＧＦＰ陽性軸索束内の（ｉ）ＨＡエピトープまたは（ｉｉ）Ｍｙｃエピトープが陽性である線維を示す拡大画像を示す。スケールバーは各パネルに示されている。神経回路に基づいたＨｉＵＧＥ標識を示す図である。図２０Ｇ〜２０Ｈは、図２０Ｆにおける枠で囲まれたエリアからのＧＦＰ陽性軸索束内の（ｉ）ＨＡエピトープまたは（ｉｉ）Ｍｙｃエピトープが陽性である線維を示す拡大画像を示す。スケールバーは各パネルに示されている。神経回路に基づいたＨｉＵＧＥ標識を示す図である。図２０Ｉは、体性感覚皮質におけるＡＡＶ２−ｒｅｔｒｏｍＴｕｂｂ３ＧＳ−ｇＲＮＡの注射および視床におけるＡＡＶ２／９ＨＡエピトープドナーの注射による、βＩＩＩ−チューブリンの視床皮質回路選択的Ｃ−ｔｅｒｍＨｉＵＧＥ標識の図を示す。神経回路に基づいたＨｉＵＧＥ標識を示す図である。図２０Ｊは、視床（枠で囲まれたエリア）および局所的皮質ネットワーク（ほとんど、層ＩＩ／ＩＩＩおよび層ＶＩ内の細胞）内の逆行性活性化Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰ発現を示す代表的な画像を示す。スケールバーは各パネルに示されている。神経回路に基づいたＨｉＵＧＥ標識を示す図である。図２０Ｋは、図２０Ｊにおける枠で囲まれたエリアの拡大画像を示し、ＨＡエピトープ（矢印）およびＣａｓ９−２Ａ−ＧＦＰが陽性である、逆行性アクセスされ、かつＨｉＵＧＥ編集された視床ニューロンを示している。スケールバーは各パネルに示されている。「万華鏡（Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ）」ペイロードがＨｉＵＧＥ標識タンパク質の免疫検出の向上を促進することを示す図である。図２１Ａは、剛性リンカー（ＲＬ）および可動性リンカー（ＦＬ）によって間隔が開けられた散在エピトープタグを含有する「万華鏡」ペイロードの概略図を示す。「万華鏡（Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ）」ペイロードがＨｉＵＧＥ標識タンパク質の免疫検出の向上を促進することを示す図である。図２１Ｂは、ｍＴｕｂｂ３のＨｉＵＧＥ標識について、単一のＨＡエピトープタグまたはスパゲティモンスターＨＡ（ｓｍＦＰ−ＨＡ）と比較した、万華鏡を用いた細胞からの免疫蛍光シグナルの定量化をグラフ表示している。「万華鏡（Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ）」ペイロードがＨｉＵＧＥ標識タンパク質の免疫検出の向上を促進することを示す図である。図２１Ｃは、抑制性シナプスタンパク質１（ＩｎＳｙｎ１）などの少量タンパク質を標識および検出するために用いられた万華鏡の代表的な画像を示す。

ハイスループットのゲノムワイド編集、スクリーニング、タンパク質標識、発現マーキング、またはタンパク質発現の破壊に有用である、相同性非依存的ユニバーサル遺伝子編集（ＨｉＵＧＥ）システムおよび前記ＨｉＵＧＥシステムを用いる方法が本明細書に記載されている。ＨｉＵＧＥシステムは、ユニバーサルペイロード含有ドナーベクター（ＨｉＵＧＥベクター）を含むＣＲＩＳＰＲに基づくシステムである。開示されたＨｉＵＧＥベクターは、広範な分子生物学専門知識を必要とする個々の遺伝子特異的ペイロードドナーベクターを作製する必要なしに、ゲノム内の任意の遺伝子を編集するために用いることができる。ＨｉＵＧＥベクターは、ＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子編集システム内で機能し、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼおよび標的遺伝子特異的ｇＲＮＡを含む。開示された遺伝子編集システムにおいて、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼは、遺伝子特異的ｇＲＮＡと複合体形成して、ゲノムＤＮＡを切断し、かつＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡと複合体形成して、挿入断片（ペイロード）ポリヌクレオチド配列のいずれかの側でＨｉＵＧＥベクターを切断する。その後、挿入断片ペイロードは、図１に示されているように、ＮＨＥＪによって標的遺伝子へ選択的に組み込まれ得る。

開示されたＨｉＵＧＥシステムおよび方法は、現在の最先端に関する制約事項の多くを取り除く。ＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子編集システムの１つの独特な能力は、単一のＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを２つ以上のｇＲＮＡと共に利用することにより、複数の異なる標的を同時に切断する単純明快な能力である。ＨｉＵＧＥを用いて、単一のドナーベクターは、多様なＧＯＩおよび種に渡ってドナーベクターを同時に挿入することなしに、ペイロードを送達することができ、内因性タンパク質を操作および標識するためのストラテジーを大いに単純化することができる。本明細書に実証されているように、異なるユニバーサルペイロードのＨｉＵＧＥライブラリーもまた作製することができ、進化的に多様な種における様々な適用のために細胞および組織において用いることができる。これらの適用には、抗体エピトープおよび蛍光タンパク質標識、インサイチュー近位依存性ビオチン標識、除去および構造機能研究のためのタンパク質切り詰め、ならびに内因性タンパク質の細胞内トラップが挙げられる。この方法は、高度にモジュール式でかつ拡張可能であるため、ハイスループットのプロテオミクスおよびゲノム適用を実験検証および表現型スクリーニングと組み合わせて、細胞および生物体の生物学の分子機構に取り組むための新しい道を開く。
このセクションおよび本明細書における開示全体に用いられる場合のセクション見出しは、単に組織化を目的としており、限定することを意図するものではない。

１．定義
他に規定がない限り、本明細書に用いられる全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。矛盾する場合、定義を含む本文書が統制するものとする。好ましい方法および材料が下で記載されているが、本明細書に記載されたものと類似したまたは等価の方法および材料が、本発明の実施または試験に用いることができる。本明細書に言及された全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、全体が参照により組み入れられている。本明細書に開示された材料、方法、および例は実例となるのみであり、限定することを意図するものではない。

本明細書で用いられる場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、およびそれらの変形語は、追加の行為または構造の可能性を除外しないオープンエンドの移行句、用語、または語であることを意図される。単数形「１つの（ａ）」、「および（ａｎｄ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に指図しない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明確に示されているいないにかかわらず、本明細書に提示された実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」他の実施形態を企図する。
本明細書における数値範囲の記述について、同程度の精度でその間に介在するそれぞれの数が、明確に企図される。例えば、６〜９の範囲について、７および８という数が、６および９に加えて、企図され、６．０〜７．０の範囲について、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０という数が明確に企図される。

本明細書で用いられる場合、用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定されるような、その特定の値についての許容できる誤差範囲内を意味し、それは、どのようにしてその値が測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に一部、依存する。例えば、「約」は、当技術分野における慣例により、３標準偏差内または３標準偏差より大きい範囲内を意味し得る。あるいは、「約」は、示された値の最大２０％まで、好ましくは最大１０％まで、より好ましくは最大５％まで、さらにより好ましくは最大１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的系または過程に関して、その用語は、値の１０倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。本明細書で交換可能に用いられる場合、「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、ヒトおよび他の霊長類種、ヒツジ、ブタ、およびニワトリを含む幅広い範囲の脊椎動物種に感染するパルボウイルス科のディペンドウイルス属に属する小型ウイルスを指す。ＡＡＶは、疾患を引き起こすことは現在知られておらず、それゆえに、そのウイルスは、非常に穏やかな免疫応答を引き起こす。
本明細書で用いられる場合、「結合領域」とは、ヌクレアーゼによって認識および結合される、ヌクレアーゼ標的領域内の領域を指す。

本明細書で用いられる場合、「切断する」または「切断」は、ポリヌクレオチド内の２個の隣接したヌクレオチドの間の共有結合性糖−リン酸結合を断ち切る行為を意味する。二本鎖ポリヌクレオチドの場合、他に指定がない限り、両方の鎖における共有結合性糖−リン酸結合が、断ち切られる。
本明細書で用いられる場合、「コード配列」または「コード化核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、その核酸が投与される個体または哺乳類の細胞において発現を命令する能力があるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御エレメントと作動可能に連結された開始および終結シグナルをさらに含み得る。コード配列はコドン最適化され得る。

本明細書で用いられる場合、「相補体」または「相補的な」は、核酸が、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間でワトソン・クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を形成することができることを意味する。「相補性」は、２つの核酸配列間で、それらがお互いに逆平行でアライメントされた時、各位置におけるヌクレオチド塩基が相補的であるような、共有される性質を指す。

本明細書で交換可能に用いられる場合、「ドナーベクター」、「ドナー鋳型」、および「ドナーＤＮＡ」は、ゲノムＤＮＡへ導入されることになっている挿入断片を含む二本鎖ＤＮＡ断片または分子を指す。ドナーベクターは、完全に機能しうるタンパク質、部分的に機能しうるタンパク質、または短いポリペプチドをコードし得る。ドナーベクターは、ＲＮＡ分子をコードする場合もある。
本明細書で用いられる場合、「機能性の」および「完全に機能しうる」は、生物活性を有するタンパク質を記載する。「機能性遺伝子」は、機能性タンパク質へ翻訳されるｍＲＮＡへ転写される遺伝子を指す。
本明細書で用いられる場合、「融合タンパク質」は、本来別々のタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子の連結を通して生成されたキメラタンパク質を指す。融合遺伝子の翻訳は、結果として、本来のタンパク質のそれぞれに由来した機能性を有する単一のポリペプチドを生じる。

本明細書で用いられる場合、「遺伝的構築物」は、タンパク質またはＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。そのコード配列は、その核酸分子が投与される個体の細胞において発現を命令する能力があるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御エレメントに作動可能に連結した開始および終結シグナルを含む。本明細書で用いられる場合、用語「発現可能な形」は、個体の細胞に存在する場合、コード配列が発現するだろうように、タンパク質をコードするコード配列と作動可能に連結された必要な制御エレメントを含有する遺伝子構築物を指す。

本明細書で交換可能に用いられる場合、「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」は、ＤＮＡの相同性小片が核に、たいていは細胞周期のＧ２およびＳ期において、存在する場合の、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復するための細胞における機構を指す。ＨＤＲは、修復をガイドするためにドナーＤＮＡ鋳型を用い、遺伝子全体のターゲティング化付加を含む、そのゲノムへ特定の配列変化を生じさせるために用いられ得る。ドナー鋳型がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子編集システムと共に供給されたならば、その細胞機構は、相同組換えによって切断を修復し、それは、ＤＮＡ切断の存在下で数十倍、増強される。相同性ＤＮＡ小片が存在しない場合、その代わりに、非相同末端結合が起こり得る。
本明細書で用いられる場合、「ゲノム編集」は、遺伝子を変化させることを指す。ゲノム編集は、変異遺伝子を訂正しまたは回復させることを含み得る。ゲノム編集は、変異遺伝子または正常遺伝子などの遺伝子をノックアウトすることを含み得る。ゲノム編集は、タンパク質上へ標識を導入するために用いられ得る。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の関連において本明細書で用いられる場合、「同一の」または「同一性」は、それらの配列が、特定領域に渡って同じである、特定のパーセンテージの残基を有することを意味する。パーセンテージは、その２つの配列を最適にアライメントし、２つの配列を特定領域に渡って比較し、両方の配列に同一の残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を特定領域における位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより、計算され得る。２つの配列が、異なる長さであり、またはアライメントが１つもしくは複数の付着末端を生じて、比較の特定領域が単一配列だけを含む場合、その単一配列の残基は、その計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する時、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は等価とみなされ得る。同一性は、手作業で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを用いることにより、実施され得る。
本明細書で用いられる場合、「ミスマッチ」は、ヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドの逆鎖上の別のヌクレオチドと、または異なるポリヌクレオチド由来の別のヌクレオチドとワトソン・クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を形成することができないことを意味する。

本明細書で用いられる場合、「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」は、相同鋳型を必要とすることなく、切断末端を直接的にライゲーションすることにより、ＤＮＡにおける二本鎖切断を修復する経路を指す。ＮＨＥＪによるＤＮＡ末端の鋳型非依存的再ライゲーションは、ＤＮＡ切断点においてランダムな微量挿入および微量欠失（インデル）を導入することができる確率的で、誤りがちな修復過程である。この方法は、ターゲティングされた遺伝子配列のリーディングフレームを意図的に破壊し、欠失させ、または変化させるために用いられ得る。ＮＨＥＪは、典型的には、修復をガイドするための、マイクロホモロジーと呼ばれる短い相同ＤＮＡ配列を用いる。これらのマイクロホモロジーは、二本鎖切断の末端上の一本鎖オーバーハングに存在する場合が多い。オーバーハングが完全に適合する時、ＮＨＥＪは、通常、その切断を正確に修復するが、それでもなお、ヌクレオチドの欠損をもたらす不正確な修復もまた起こる場合があり、しかし、それは、オーバーハングが適合しない時において、はるかにずっとよく起こる。

本明細書で用いられる場合、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合的に連結された少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。単一鎖の描写はまた、その相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸はまた、描写された単一鎖の相補鎖を包含する。核酸の多くのバリアントは、示された核酸と同じ目的で用いられ得る。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。単一鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。

核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得、または二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。核酸は、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方であるＤＮＡ、ＲＮＡ、または、核酸がデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組合せを含有し得る、ハイブリッドであり得る。核酸は、化学合成法により、または組換え方法により、獲得され得る。
本明細書で用いられる場合、「作動可能に連結された」は、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されているプロモーターの調節下にあることを意味する。プロモーターは、それの調節下にある遺伝子の５’側（上流）または３’側（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターが由来する遺伝子におけるそのプロモーターと、それが調節する遺伝子との間の距離とおよそ同じであり得る。当技術分野において知られているように、この距離は、プロモーター機能が喪失しないように変更し得る。

本明細書で用いられる場合、「プロモーター」は、細胞において核酸の発現を与え、活性化し、または増強する能力がある合成または天然由来の核酸配列を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強するための、ならびに／またはそれの空間的発現および／もしくは時間的発現を変化させるための１つまたは複数の特定の転写制御配列を含み得る。プロモーターはまた、遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含み得、それは、転写の開始部位から数千塩基対ほどの所に位置し得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、遺伝子成分の発現を、恒常的に、あるいは発現が起こる細胞、組織、もしくは器官に関して、発現が起こる発生段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して示差的に、制御し得る。
本明細書で交換可能に用いられる場合、「リーディングフレーム」、「オープンリーディングフレーム」、または「コーディングフレーム」は、ポリペプチドへの翻訳中、特定のアミノ酸についてのコドンを潜在的に構成する、ＤＮＡの配列における３個の連続的塩基のグルーピングを意味する。

本明細書で交換可能に用いられる場合、「対象」および「患者」は、任意の脊椎動物を指し、それには、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザルなどのサル、チンパンジーなど）およびヒト）が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。
本明細書で用いられる場合、「標的遺伝子」は、既知または推定上の遺伝子産物をコードする任意のヌクレオチド配列を指す。
本明細書で用いられる場合、「標的遺伝子特異的配列」は、ＨｉＵＧＥシステムが結合および切断するように設計されている標的遺伝子の領域を指す。

本明細書で用いられる場合、「導入遺伝子」は、１つの生物体から単離されており、かつ異なる生物体へ導入される遺伝子配列を含有する遺伝子または遺伝子材料を指す。このＤＮＡの非天然セグメントは、トランスジェニック生物体においてＲＮＡもしくはタンパク質を産生する能力を保持し得、またはトランスジェニック生物体の遺伝暗号の正常な機能を変化させ得る。導入遺伝子の導入は、生物体の表現型を変化させる可能性を有する。

核酸に関して本明細書で用いられる「バリアント」は、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片；（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列もしくはその部分の相補体；（ｉｉｉ）参照核酸もしくはその相補体と実質的に同一である核酸；または（ｉｖ）参照核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。

ペプチドまたはポリペプチドに関しての「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持する。バリアントはまた、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を類似した性質（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸と置き換えることは、当技術分野において、典型的には、微小変化を伴うものと認識されている。これらの微小変化は、一部には、当技術分野において理解されているような、アミノ酸のヒドロパシー指標を考慮することにより、同定され得る。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。アミノ酸のヒドロパシー指標は、それの疎水性および電荷の考慮に基づいている。類似したヒドロパシー指標のアミノ酸が置換され、かつなおタンパク質機能を保持し得ることは当技術分野において知られている。一態様において、±２のヒドロパシー指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親和性もまた、生物学的機能を保持するタンパク質を生じるだろう置換を明らかにするために用いられ得る。ペプチドの関連におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最も高い局所的な平均親水性の計算を可能にする。置換は、お互いの±２内の親和性値を有するアミノ酸で実施され得る。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方が、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察と一致して、生物学的機能と両立するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の性質によって明らかにされているように、アミノ酸の相対的類似性、特に、それらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
本明細書で用いられる場合、「ベクター」は、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであり得、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。例えば、ベクターは、挿入断片および／または少なくとも１つのｇＲＮＡ分子をコードし得る。

本明細書で他に規定がない限り、本開示に関係して用いられる科学的および技術的用語は、当業者により一般的に理解されている意味をもつものとする。例えば、本明細書に記載された、細胞と組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質と核酸の化学、およびハイブリダイゼーションに関係して用いられる任意の命名法、およびそれらの技術は、当技術分野においてよく知られ、かつ一般的に用いられるものである。その用語の意味および範囲は、明快であるべきであるが、万一、任意の潜在的な曖昧性の場合には、本明細書に提供される定義が、任意の辞書または外部の定義に優先する。さらに、文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。

２．ＨｉＵＧＥシステム
本発明は、対象ゲノムを遺伝子編集するための相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）システムを対象とする。ＨｉＵＧＥシステムは、（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼまたは（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列、（ｂ）相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）ベクター、および（ｃ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列にターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡまたは（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列へターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡをコードする第３のポリヌクレオチドを含む標的遺伝子ベクターを含む。ＨｉＵＧＥベクターは、少なくとも１つの挿入断片をコードする第１のポリヌクレオチド配列、第１のポリヌクレオチド配列（ペイロード）の各側にフランキングする少なくとも１つのドナー認識配列（ＤＲＳ）、およびＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む。ＤＲＳは、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの切断部位を含む。ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡ（ＨＤ−ｇＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをＤＲＳにターゲティングし、かつ対象ゲノム内の特異的配列をターゲティングしない。

図２Ａは、相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）システムの概略図を示す。図２Ａにおいて、上部の左および右のパネルは、遺伝子特異的ｇＲＮＡ（ＧＳ−ｇＲＮＡ）ライブラリーが、関心対象となる遺伝子（ＧＯＩ）の標的ゲノム座位の切断を媒介することを示す；下部の左および右のパネルは、ＨｉＵＧＥベクターが、ドナー認識配列（ＤＲＳ）を特異的に認識し、かつＧＳ−ｇＲＮＡターゲティング化ゲノム座位に挿入されるべきドナーペイロードの切断および放出を方向づけるＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡ（ＨＤ−ｇＲＮＡ）を発現する自己切断性ベクターであることを示す。いくつかの実施形態において、各ＧＳ−ｇＲＮＡベクターは、ターゲティング化相同非依存的ノックイン（ＫＩ）のために、予め作製されたＨｉＵＧＥベクター（ツールキット）のいずれかとペアになり得る。例えば、図２Ｂは、所定のゲノム座位へ挿入されるべきペイロードの交換可能性の概略図を示し、図２Ｃ〜２Ｇは、（ツールキット１）抗体エピトープタグ、（ツールキット２）酵素、（ツールキット３）蛍光タンパク質、（ツールキット４）細胞輸送タグ（ＮＬＳ＝核局在化シグナル、ＮＥＳ＝核外移行配列、ｍｉｔｏ＝ミトコンドリアターゲティング配列）、および（ツールキット５）特定適用のための他のペイロードの例を用いた、ＨｉＵＧＥベクターツールキットの実例を示す。いくつかの実施形態において、エピトープタグおよび細胞輸送タグなどの短いタグ配列を有するＨｉＵＧＥベクターは、挿入断片の標的ゲノム座位へのフォワードかまたはリバースのいずれかの組込み後、タグの効率的発現のための二重配向デザインを用いる。いくつかの実施形態において、より長い挿入断片配列を有するＨｉＵＧＥベクターは、典型的には、フォワード組込み後、ＫＩペイロードの発現を可能にする単一配向デザインを使用する。いくつかの実施形態において、ペイロードのゲノム標的へのリバース組込みがある場合、翻訳は、３つ全ての可能なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）における終止コドンカセット（図２Ｈ）によって終結され得る。いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥシステムは、配列番号１０８〜１２７またはそれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。

３．インテイン媒介性タンパク質スプライシングシステムを用いたＨｉＵＧＥシステム
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼのより高い調節を提供するために、インテイン媒介性タンパク質スプライシングシステムを用いた、対象ゲノムを遺伝子編集するための相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）システムを対象とする。インテイン媒介性タンパク質スプライシングシステムを用いたＨｉＵＧＥシステムは、上記のようなＨｉＵＧＥシステムと同じ様式で用いることができる。本明細書で用いられる場合、「インテイン」は、タンパク質スプライシングによって、自分自身を切除し、その残りの部分（エクステイン）をペプチド結合で連結することができるタンパク質のセグメントを指す。インテインはまた、「タンパク質イントロン」としても知られている。インテイン媒介性タンパク質スプライシングは、インテイン含有ｍＲＮＡがタンパク質へ翻訳された後、起こる。前駆体タンパク質は、Ｎ−エクステイン、続いて、インテイン、続いて、Ｃ−エクステインという３つのセグメントを含有する。スプライシングが起きた後、その結果として生じたタンパク質は、Ｃ−エクステインと連結されたＮ−エクステインを含有し、そのスプライシング産物もまた、エクステインと呼ばれる。「スプリットインテイン」は、２つの遺伝子に由来する前駆体タンパク質のインテインを指す。スプリットインテインを含むインテインの例は、参照により本明細書に組み入れられている、米国特許出願公開第２０１５０２３２８２７号に開示されている。

インテイン媒介性タンパク質スプライシングシステムを用いたＨｉＵＧＥシステムは、相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）ベクターおよび遺伝子特異的ベクターを含む。ＨｉＵＧＥベクターは、少なくとも１つの挿入断片をコードする第１のポリヌクレオチド配列、第１のポリヌクレオチド配列の各側にフランキングする少なくとも１つのドナー認識配列（ＤＲＳ）、ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列、および第１のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分をコードする第３のポリヌクレオチド配列を含む。ＤＲＳは、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの切断部位を含む。ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡ（ＨＤ−ｇＲＮＡ）は、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをＤＲＳにターゲティングし、かつ対象ゲノム内の特異的配列をターゲティングしない。遺伝子特異的ベクターは、第２のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分をコードする第４のポリヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列にターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡをコードする第５のポリヌクレオチド配列を含む。第１のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分および第２のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分は、一緒に連結して、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを形成することができる。第３のポリヌクレオチド配列および第４のポリヌクレオチド配列の発現は、第１のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼポリペプチドの第１の部分および第２のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼポリペプチドの第２の部分の生成を生じる。第１のスプリットインテインおよび第２のスプリットインテインは同時に生じ、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼポリペプチドの第１の部分およびＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼポリペプチドの第２の部分を同時にスプライスして、無傷のＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを形成する。したがって、完全に機能しうるＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼは、インテイン媒介性タンパク質スプライシング後、再構成され得る。

いくつかの実施形態において、第１のスプリットインテインはＮ−インテインであり、第２のスプリットインテインはＣ−インテインである。いくつかの実施形態において、Ｎ−インテインは配列番号６０のポリヌクレオチド配列を含み、第２のスプリットインテインは配列番号６１の配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分は配列番号５５のポリペプチド配列を含み、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分は配列番号５６のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態において、インテイン媒介性タンパク質スプライシングシステムを用いたＨｉＵＧＥシステムは、配列番号１０８〜１２７またはそれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み得る。

４．ＨｉＵＧＥベクター
開示されたＨｉＵＧＥシステムは、標的ゲノムへの挿入のための少なくとも１つのポリヌクレオチド配列挿入断片（ペイロード）、挿入断片配列の両側における少なくとも１つのドナー認識配列（ＤＲＳ）、およびＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡ（ＨＤ−ｇＲＮＡ）をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含有する、ドナーベクターまたはＨｉＵＧＥドナーベクターとも本明細書で呼ばれる、ＨｉＵＧＥベクターを含む。ＤＲＳは、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの切断部位を含有する。ＨＤ−ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを、挿入断片の両側に見出されるＤＲＳへターゲティングする。ＨｉＵＧＥシステムがインテイン媒介性タンパク質スプライシングシステムを用いる場合には、ＨｉＵＧＥベクターはさらに、上記のように、第１のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分をコードする第３のポリヌクレオチド配列を含み得る。

ａ．ドナー認識配列ＤＲＳ
ＤＲＳは、ドナー標的配列およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。ドナー標的配列は、下記のように、ＨＤ−ｇＲＮＡ分子との相同性塩基対形成を通して認識され、下記のように、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼと複合体形成される。ＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼによって認識される。正しいドナー標的配列および対応するＰＡＭを含有する部位のみが、切断される。ドナー標的配列は、対象ゲノムにおけるいかなる類似した長さの配列とも十分に異なることにより、ＨｉＵＧＥベクター（ドナーベクター）へのＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ切断についての特異性を保証する。いくつかの実施形態において、ドナー標的配列は、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列とも少なくとも１つの塩基対ミスマッチを含む。ある特定の実施形態において、ドナー標的配列は、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列とも少なくとも２つの塩基対ミスマッチを含む。

ＨｉＵＧＥベクターは、少なくとも１つの挿入断片のフランキング側のそれぞれに少なくとも１つのドナー認識配列（ＤＲＳ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥベクターは、挿入断片の各側に少なくとも１つのＤＲＳまたは２つのＤＲＳを含み得る。いくつかの実施形態において、１つより多い挿入断片がある場合には、各挿入断片は各側に少なくとも１つのＤＲＳを有する。
ＤＲＳは、以下のルールまたはステップを用いてデザインすることができる。

（１）ステップ１
配列の最初の２０ヌクレオチド（ｎｔ）は、対応するＨＤ−ｇＲＮＡが標的ゲノムのゲノム配列のＣａｓ９媒介性切断を促進しないことを保証するように選択される（そのｇＲＮＡは、標的ゲノムに関して不活性であるべきである）。換言すれば、ＨＤ−ｇＲＮＡは、標的ゲノムに対して外来であり、かつ標的ゲノム内でＣａｓ９切断活性を方向づける能力がないようにあるべきである。Ｃａｓ−ＯｆｆｉｎｄｅｒおよびＣｒｉｓｐｏｒなどのいくつかのバイオインフォマティクスツールが、そのような「オフターゲット」活性を予測するために利用可能である。一般的に、基本的な必要条件は、ｇＲＮＡ配列が、野生型ＳｐＣａｓ９が用いられる場合には、標的ゲノムに対して比較した時、シード領域（１２ｂｐのＰＡＭ近位配列）において少なくとも１つの塩基対（ｂｐ）ミスマッチを有すること、またはｈｙｐａＣａｓ９酵素などの高忠実度Ｃａｓ９バリアントを用いた場合、広域範囲（１８ｂｐのＰＡＭ近位配列）内に少なくとも１つのｂｐミスマッチを有することである。

（２）ステップ２：
ＨｉＵＧＥドナー認識配列（ＤＲＳ）（ＨＤ−ｇＲＮＡによってターゲティングされる配列）がフォワードでもリバースでもどちらの配向でも用いることができるため、このステップは、それのリバース相補体を作製することにより別々に分析され、ＸはＮのリバース相補体を表す。「｜」は、Ｃａｓ９依存性二本鎖切断の部位を表し、その切断部位を取り囲むヌクレオチドは、_-2、_-1、₁、₂と番号づけられる。

遺伝子特異的ｇＲＮＡ（ＧＳ−ｇＲＮＡ）にガイドされるＣａｓ９切断部位に関するゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）位相の定義（切断座位の前の最後のコードトリプレットは灰色で強調されている）。Ｚが任意の標的ゲノムヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔを表し、「｜」がゲノム二本鎖切断部位を表し、その周囲のヌクレオチドは上記で定義されているように番号づけられている。

全体として、ＨｉＵＧＥドナー認識配列についての４つの可能な異なる利用シナリオが、各ＯＲＦ可能性について試験される必要がある。標的ゲノムコード化タンパク質と挿入された外来コード化タンパク質配列との間の融合タンパク質を作製するように、これらは外来ＤＮＡの挿入を考慮する。外来コード化タンパク質配列は、標的ゲノムコード化タンパク質配列のＮ末端側（Ｎ−ｔｅｒｍ）かまたはＣ末端側（Ｃ−ｔｅｒｍ）のいずれかであり得る。

シナリオ１：
フォワード配向、標的遺伝子の上流、挿入断片の下流、ＯＲＦ＋０でのＮ−ｔｅｒｍタグ付け
フォワード配向、標的遺伝子の上流、挿入断片の下流、ＯＲＦ＋１でのＮ−ｔｅｒｍタグ付け
フォワード配向、標的遺伝子の上流、挿入断片の下流、ＯＲＦ＋２でのＮ−ｔｅｒｍタグ付け
シナリオ２：
フォワード配向、標的遺伝子の下流、挿入断片の上流、ＯＲＦ＋０でのＣ−ｔｅｒｍタグ付け
フォワード配向、標的遺伝子の下流、挿入断片の上流、ＯＲＦ＋１でのＣ−ｔｅｒｍタグ付け
フォワード配向、標的遺伝子の下流、挿入断片の上流、ＯＲＦ＋２でのＣ−ｔｅｒｍタグ付け
シナリオ３：
リバース配向、標的遺伝子の上流、挿入断片の下流、ＯＲＦ＋０でのＮ−ｔｅｒｍタグ付け
リバース配向、標的遺伝子の上流、挿入断片の下流、ＯＲＦ＋１でのＮ−ｔｅｒｍタグ付け
リバース配向、標的遺伝子の上流、挿入断片の下流、ＯＲＦ＋２でのＮ−ｔｅｒｍタグ付け
シナリオ４：
リバース配向、標的遺伝子の下流、挿入断片の上流、ＯＲＦ＋０でのＣ−ｔｅｒｍタグ付け
リバース配向、標的遺伝子の下流、挿入断片の上流、ＯＲＦ＋１でのＣ−ｔｅｒｍタグ付け
リバース配向、標的遺伝子の下流、挿入断片の上流、ＯＲＦ＋２でのＣ−ｔｅｒｍタグ付け
（３）ステップ３ａ：
ＤＲＳがフォワード配向で用いられる（ＤＲＳＳｅｑ１）場合のシナリオを満たすために。
シナリオ１：Ｎ−ｔｅｒｍタグ付けについてのＤＲＳルール、（図３Ａにおける濃い破線領域を参照）。

基準１：ＤＲＳがいかなる座位においてもユニバーサルに用いられるために、境界配列（Ｎ_-2Ｎ_-1）は、関心対象となるゲノム遺伝子（ＧＯＩ）ＯＲＦによって定義される場合、標的ゲノム座位に関してスプライスされた時にいかなる終止コドンも生じる能力があってはならない。
ＯＲＦ＋０：制約なし。
ＯＲＦ＋１：Ｎ_-1はＡ、Ｃ、またはＧだけであり得る；Ｔであり得ない。（Ｎ_-1Ｚ₁Ｚ₂は終止コドンであり得ない）
ＯＲＦ＋２：Ｎ_-2Ｎ_-1はＴＴ、ＴＣ、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、またはＧＧだけであり得る；ＴＡでもＴＧでもあり得ない。（Ｎ_-2Ｎ_-1Ｚ₁は終止コドンであり得ない）

基準２：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1は、ＧＯＩＯＲＦに準拠して、終止コドンを導入しない：

シナリオ２：Ｃ−ｔｅｒｍタグ付けについてのＤＲＳルール、（図３Ｂにおける濃い破線領域を参照）。

基準１：ＤＲＳがいかなる座位においてもユニバーサルに用いられるために、境界配列（Ｎ₁Ｎ₂）は、関心対象となるゲノム遺伝子（ＧＯＩ）ＯＲＦによって定義される場合、標的ゲノム座位に関してスプライスされた時にいかなる終止コドンも生じる能力があってはならない。
ＯＲＦ＋０：制約なし。
ＯＲＦ＋１：Ｎ₁Ｎ₂は、ＡＣ、ＡＴ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＣ、またはＧＧだけであり得る；ＡＡでもＡＧでもＧＡでもあり得ない。（Ｚ_-1Ｎ₁Ｎ₂は終止コドンであり得ない）
ＯＲＦ＋２：Ｎ₁はＴまたはＣだけであり得る；ＡでもＧでもあり得ない。（Ｚ_-2Ｚ_-1Ｎ₁は終止コドンであり得ない）

基準２：Ｎ₁Ｎ₂ＮＮＧＧは、ＧＯＩＯＲＦに準拠して、終止コドンを導入しない。

（４）ステップ３ｂ：
ＤＲＳがリバース配向で用いられる（ＤＲＳＳｅｑ２）場合のシナリオを満たすために。
シナリオ３：Ｎ−ｔｅｒｍタグ付けについてのＤＲＳルール、（図３Ｃにおける濃い破線領域を参照）。

基準１：ＤＲＳがいかなる座位においてもユニバーサルに用いられるために、境界配列（Ｘ_-2Ｘ_-1）は、関心対象となるゲノム遺伝子（ＧＯＩ）ＯＲＦによって定義される場合、標的ゲノム座位に関してスプライスされた時にいかなる終止コドンも生じる能力があってはならない。
ＯＲＦ＋０：制約なし。
ＯＲＦ＋１：Ｘ_-1はＡ、Ｃ、またはＧだけであり得る；Ｔであり得ない。（Ｘ_-1Ｚ₁Ｚ₂は終止コドンであり得ない）
ＯＲＦ＋２：Ｘ_-2Ｘ_-1はＴＴ、ＴＣ、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、またはＧＧだけであり得る；ＴＡでもＴＧでもあり得ない。（Ｘ_-2Ｘ_-1Ｚ₁は終止コドンであり得ない）
基準２：ＣＣＸＸＸ_-2Ｘ_-1は、ＧＯＩＯＲＦに準拠して、終止コドンを導入しない。

シナリオ４：Ｃ−ｔｅｒｍタグ付けについてのＤＲＳルール、（図３Ｄにおける濃い破線領域を参照）。

基準１：ＤＲＳがいかなる座位においてもユニバーサルに用いられるために、境界配列（Ｘ₁Ｘ₂）は、関心対象となるゲノム遺伝子（ＧＯＩ）ＯＲＦによって定義される場合、標的ゲノム座位に関してスプライスされた時にいかなる終止コドンも生じる能力があってはならない。
ＯＲＦ＋０：制約なし。
ＯＲＦ＋１：Ｘ₁Ｘ₂は、ＡＣ、ＡＴ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＣ、またはＧＧだけであり得る；ＡＡでもＡＧでもＧＡでもあり得ない。（Ｚ_-1Ｘ₁Ｘ₂は終止コドンであり得ない）
ＯＲＦ＋２：Ｘ₁はＴまたはＣだけであり得る；ＡでもＧでもあり得ない。（Ｚ_-2Ｚ_-1Ｘ₁は終止コドンであり得ない）

基準２：Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸは、ＧＯＩＯＲＦに準拠して、終止コドンを導入しない。

（５）ステップ４：
この最終ステップにおいて、ＧＳ−ｇＲＮＡは、組込み後の最終の編集されたゲノム座位との適合性を決定するために試験される。一般的なルールは、組込み後、Ｃａｓ９が、編集されたゲノム配列をその後、切断できないことを保証するために、ＧＳ−ｇＲＮＡもＨＤ−ｇＲＮＡのいずれについての認識配列も再構成されるべきではないことである。いくつかの実施形態において、ＧＳ−ｇＲＮＡがセンスゲノム鎖をターゲティングするように選択されている場合のシナリオについて、ＤＲＳは、Ｎ−ｔｅｒｍおよびＣ−ｔｅｒｍのいずれのタグ付けについてもリバース配向で用いられることが最善である。いくつかの実施形態において、ＧＳ−ｇＲＮＡがアンチセンスゲノム鎖をターゲティングするように選択されている場合のシナリオについて、ＤＲＳは、Ｎ−ｔｅｒｍおよびＣ−ｔｅｒｍのいずれのタグ付けについてもフォワード配向で用いられることが最善である。全ての実験において、ゲノム組込み後、再構成された配列は、ＨＤ−ｇＲＮＡとＧＳ−ｇＲＮＡの両方と十分な相違を示すことをチェックされるべきである。

例えば、Ｃ−ｔｅｒｍタグ付けの場合、ＧＳ−ｇＲＮＡがセンス鎖をターゲティングしている時、およびＤＲＳがフォワード配向で用いられる時、以下のチェックが実施されるべきである：

いったん、ＨｉＵＧＥドナー認識配列が選択されたならば、ｇＲＮＡ切断効率について実験的に試験されること、加えて、陰性対照実験において、遺伝子コード配列へのオフターゲット挿入を評価することが必要とされる。これは、ＧＳ−ｇＲＮＡなしでＨｉＵＧＥベクターおよびＨＤ−ｇＲＮＡで細胞をターゲティングし、その後、免疫細胞化学法または他の関連技術によるドナータンパク質発現の分析により達成される。

いくつかの実施形態において、ＤＲＳの長さは、ＨｉＵＧＥシステムに利用されるＣａｓ９のバリアントに従って様々であり得る。いくつかの実施形態において、ＤＲＳは、約１９〜２４ヌクレオチド長のドナー標的配列およびＰＡＭ配列を含み得る。いくつかの実施形態において、ドナー標的配列は、約１５〜約３０ヌクレオチド長、約１５〜約２８ヌクレオチド長、約１５〜約２５ヌクレオチド長、約１５〜約２０ヌクレオチド長、約１９〜約３０ヌクレオチド長、約１９〜約２８ヌクレオチド長、約１９〜約２５ヌクレオチド長、または約１９〜約２４ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ドナー標的配列は、長さが少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約１６ヌクレオチド、少なくとも約１７ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約１９ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２１ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２３ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約２６ヌクレオチド、少なくとも約２７ヌクレオチド、少なくとも約２８ヌクレオチド、少なくとも約２９ヌクレオチド、または少なくとも約３０ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態において、ドナー標的配列は、フォワード配向で５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）であり、切断部位におけるＣａｓ９依存性二本鎖切断は、位置Ｎ_-1と位置Ｎ₁の間で起こる；またはドナー標的配列はリバース配向での５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）の配列を含み得、切断部位におけるＣａｓ９依存性二本鎖切断は、位置Ｘ_-1と位置Ｘ₁の間で起こり、式中、Ｎは４つのデオキシリボ核酸アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）のいずれかであり、ＸはＮのリバース相補体であり、Ｎ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂（配列番号１７）は、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）における境界配列であり、Ｘ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂（配列番号１８）は、５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）における境界配列であり、ドナー標的配列は、挿入断片が標的遺伝子へ組み込まれた後、インフレームの終止コドンを導入しない。

いくつかの実施形態において、ドナー標的配列は、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列と比較しても少なくとも１つの塩基対ミスマッチを含み得る。いくつかの実施形態において、ドナー標的配列は、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列と比較しても少なくとも２つの塩基対ミスマッチを含み得る。いくつかの実施形態において、ドナー標的配列は、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列と比較しても、ＰＡＭ配列に隣接するドナー標的配列の約８〜１２ヌクレオチド内に少なくとも１つの塩基対ミスマッチを含み得る。いくつかの実施形態において、ドナー標的配列は、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列と比較しても、ＰＡＭ配列に隣接するドナー標的配列の約８〜１２ヌクレオチド内に少なくとも１つの塩基対ミスマッチ、少なくとも２つの塩基対ミスマッチ、少なくとも３つの塩基対ミスマッチ、少なくとも４つの塩基対ミスマッチ、または少なくとも５つの塩基対ミスマッチを含み得る。

ＨｉＵＧＥベクターは、任意の遺伝子特異的ｇＲＮＡとペアになって、挿入断片配列の特異的な標的遺伝子への組込みを駆動することができる。しかしながら、挿入断片が正しく転写および翻訳されるために、遺伝子特異的切断部位におけるリーディングフレームは、ドナー挿入断片のリーディングフレームとマッチする必要がある。いくつかの実施形態において、標的遺伝子特異的配列は、ＺＺＺＺ_-2Ｚ_-1Ｚ₁Ｚ₂Ｚ（配列番号１９）の配列を含み得、切断部位におけるＣａｓ９依存性二本鎖切断が、位置Ｚ_-1と位置Ｚ₁の間で起こり、Ｚが４つのデオキシリボ核酸アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）のいずれかであり、その境界配列が、挿入断片が標的遺伝子へ組み込まれた後、インフレームの終止コドンを生じず、標的遺伝子のゲノムオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）位相は以下からなる群から選択される：
ＯＲＦ＋０：ＺＺＺＺ_-2Ｚ_-1Ｚ₁Ｚ₂Ｚ（配列番号１９）に対応する位置ＺＺ_-2Ｚ_-1、
ＯＲＦ＋１：ＺＺＺＺ_-2Ｚ_-1Ｚ₁Ｚ₂Ｚ（配列番号１９）に対応する位置ＺＺＺ_-2、および
ＯＲＦ＋２：ＺＺＺＺ_-2Ｚ_-1Ｚ₁Ｚ₂Ｚ（配列番号１９）に対応する位置ＺＺＺ。

いくつかの実施形態において、ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ_-1がＡ、Ｃ、またはＧである。
いくつかの実施形態において、ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ_-2Ｎ_-1は、ＴＴ、ＴＣ、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ₁Ｎ₂は、ＡＣ、ＡＴ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ₁はＴまたはＣである。
いくつかの実施形態において、ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ_-1がＡ、Ｃ、またはＧである。

いくつかの実施形態において、ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ_-2Ｘ_-1は、ＴＴ、ＴＣ、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ₁Ｘ₂は、ＡＣ、ＡＴ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1 Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ₁はＴまたはＣである。
いくつかの実施形態において、ＤＲＳは、ＳｐＣａｓ９またはそのバリアントによって認識され、フォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂ＮＮＧＧ−３’（配列番号２０）の配列またはリバース配向での５’−ＣＣＸＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号２１）の配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＤＲＳは、ＧＴＣＡＴＡＧＴＡＴＣＧＣＧＧＡＧＴＴＣＡＧＧ（配列番号２２）、ＧＡＣＧＣＴＴＣＣＧＡＧＴＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧ（配列番号２３）、ＧＧＴＴＣＴＡＣＧＡＧＧＡＴＡＣＧＴＣＴＴＧＧ（配列番号２４）、ＧＣＧＴＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＡＧＣＣＧＧＧＧ（配列番号２５）、ＧＣＧＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＧＣＧＧ（配列番号２６）、またはＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＡＣＴＣＧＧＡＡＧＣＧＴＣ（配列番号２７）のポリヌクレオチド配列を含み得る。

ｂ．挿入断片ポリヌクレオチド
ＨｉＵＧＥベクターは、１つまたは複数の挿入断片ポリヌクレオチド（ペイロード）を含み、それらは、ＨｉＵＧＥベクターから切断されて、標的ゲノムＤＮＡに挿入される。本開示は、少なくとも１つの挿入断片を含有し得る単一のＨｉＵＧＥベクターを具体化する。いくつかの実施形態において、単一のＨｉＵＧＥベクターは、単一の挿入断片を含有し得る。いくつかの実施形態において、単一のＨｉＵＧＥベクターは２つの挿入断片を含有し得る。いくつかの実施形態において、単一のＨｉＵＧＥベクターは３つの挿入断片を含有し得る。

ある特定の実施形態において、少なくとも１つの挿入断片は、プロモーター領域、エンハンサー領域、リプレッサー領域、インスレーター領域、サイレンサー領域、プロモーター領域とのＤＮＡループ形成に関与する領域、遺伝子スプライシング領域、または転写領域のＮ末端に挿入され得、それにより、Ｎ末端タグ付き融合タンパク質を生じる。ある特定の他の実施形態において、少なくとも１つの挿入断片は、プロモーター領域、エンハンサー領域、リプレッサー領域、インスレーター領域、サイレンサー領域、プロモーター領域とのＤＮＡループ形成に関与する領域、遺伝子スプライシング領域、または転写領域のＣ末端に挿入され、それにより、Ｃ末端タグ付き融合タンパク質を生じる。ある特定の実施形態において、Ｃ末端タグは、終止コドンを含有し得る。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片は、ゲノムのセンス鎖へ挿入される。ある特定の他の実施形態において、少なくとも１つの挿入断片は、ゲノムのアンチセンス鎖へ挿入される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片がゲノムのセンス鎖へ挿入され、かつ少なくとも１つの挿入断片がゲノムのアンチセンス鎖へ挿入される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片はフォワード配向で挿入される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片はリバース配向で挿入される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片がフォワード配向で挿入され、かつ少なくとも１つの挿入断片がリバース配向で挿入される。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片はマーカーまたはタグをコードする。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの挿入断片は、抗体エピトープタグ、蛍光タンパク質タグ、アフィニティ精製タグ、プロテオミクス標識酵素、スプリットＣｒｅリコンビナーゼ、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、局在化配列、酵素、エピトープ、またはそれらの組合せをコードする。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片は、少なくとも１個の抗体エピトープタグをコードする。例えば、少なくとも１つの挿入断片は、少なくとも１個の抗体エピトープタグ、少なくとも２個の抗体エピトープタグ、少なくとも３個の抗体エピトープタグ、少なくとも４個の抗体エピトープタグ、少なくとも５個の抗体エピトープタグ、少なくとも６個の抗体エピトープタグ、少なくとも７個の抗体エピトープタグ、少なくとも８個の抗体エピトープタグ、少なくとも９個の抗体エピトープタグ、または少なくとも１０個の抗体エピトープタグをコードし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片は、１個の抗体エピトープタグ、２個の抗体エピトープタグ、３個の抗体エピトープタグ、４個の抗体エピトープタグ、５個の抗体エピトープタグ、６個の抗体エピトープタグ、７個の抗体エピトープタグ、８個の抗体エピトープタグ、９個の抗体エピトープタグ、または１０個の抗体エピトープタグをコードし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２個以上の抗体エピトープタグは異なる。いくつかの実施形態において、少なくとも２個以上の抗体エピトープタグは同じである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片は、抗体エピトープタグの１つまたは複数のコピーを含む。いくつかの実施形態において、抗体エピトープタグはリンカーによって分離されている。いくつかの実施形態において、リンカーは、剛性リンカー（ＲＬ）および／または可動性リンカー（ＦＬ）であり得る。例示的なリンカーは、国際特許公開第２００９／０８６１３２号に記載されている。

いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥベクターは、挿入断片または「ペイロード」がゲノムへ挿入される配向にかかわらず、高効率標識を促進するために、挿入断片またはドナー配列が二重配向にある、二重配向カセットまたは「ターボ」カセットを含み得る（例えば、図２Ｃおよび２Ｆ参照）。いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥベクターは、第１のポリヌクレオチド配列または挿入断片をコードするポリヌクレオチド配列のフォワードコピー、および第１のポリヌクレオチド配列または挿入断片をコードするポリヌクレオチド配列のリバースコピーを同じ鎖に含み得る。いくつかの実施形態において、終止カセットをコードするポリヌクレオチド配列は、第１のポリヌクレオチド配列のフォワードコピーと第１のポリヌクレオチド配列のリバースコピーの間を連結することができる。

ある特定の実施形態において、挿入断片は、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗体タグ、Ｍｙｃ抗体エピトープタグ、蛍光タンパク質ｅＧＦＰ、蛍光タンパク質ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、蛍光タンパク質ＴｄＴｏｍａｔｏ、ビオチンアフィニティ精製タグ、および／または６×Ｈｉｓアフィニティ精製タグをコードし得る。ある特定の実施形態において、挿入断片は、終止コドンカセットにフランキングする２個のＨＡタグをコードし得、ＨＡタグのうちの１つがリバース配向である。ある特定の実施形態において、挿入断片は、終止コドンを有するＭｙｃ抗体エピトープタグをコードし得る。ある特定の実施形態において、挿入断片は、Ｃ末端終止コドンを有する蛍光タンパク質ｅＧＦＰをコードし得る。ある特定の実施形態において、挿入断片は、Ｃ末端終止コドンを有する蛍光タンパク質ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎをコードし得る。ある特定の実施形態において、Ｃ末端終止コドンを有する蛍光タンパク質ＴｄＴｏｍａｔｏをコードし得る。ある特定の実施形態において、挿入断片は、終止コドンを有するＨＡ抗体エピトープタグと共にビオチンアフィニティ精製タグをコードし得る。ある特定の実施形態において、挿入断片は、終止コドンを有する６×Ｈｉｓアフィニティ精製タグをコードし得る。ある特定の実施形態において、挿入断片は、終止コドンを有するＣｒｅリコンビナーゼのＮ末端側のブタテッショウウイルス−１由来の２ＡペプチドのＮ末端側のＨＡ抗体エピトープタグをコードし得る。ある特定の実施形態において、挿入断片は、終止コドンを有するＧＦＰの高感度青色バリアントのＮ末端側のブタテッショウウイルス−１由来の２ＡペプチドのＮ末端側のＨＡ抗体エピトープタグをコードし得る。ある特定の実施形態において、挿入断片は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルのＮ末端側のウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメントのＮ末端側の、終止コドンを有するＨＡ抗体エピトープタグをコードし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片は、配列番号３４、３９、４１〜５０、またはその組合せの少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。

ある特定の実施形態において、挿入断片は、ＨＡ抗体タグ、Ｍｙｃ抗体エピトープタグ、Ｖ５抗体エピトープタグ、および／またはそれらの組合せをコードし得る。いくつかの実施形態において、挿入断片は、Ｍｙｃ、Ｖ５タグ、およびＨＡの少なくとも１つのコピーをコードし得る。いくつかの実施形態において、挿入断片は、Ｍｙｃ、Ｖ５タグ、およびＨＡの２つのコピーをコードし得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片は、配列番号１５２、配列番号１５３、または配列番号１５４の位置５４２〜９４９に対応するポリヌクレオチド配列を含む。

ｃ．ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡ（ＨＤ−ｇＲＮＡ）
ＨｉＵＧＥベクターは、ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡ（ＨＤ−ｇＲＮＡ）をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む。ＨＤ−ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体形成し、その複合体を、ＨｉＵＧＥベクターにおける挿入断片の両側のＤＲＳへターゲティングする。ＤＲＳへターゲティングされたら、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはベクターを切断して、線状挿入断片ポリヌクレオチドまたは切断された挿入断片を生じることができる。ＨＤ−ｇＲＮＡは、ＨｉＵＧＥベクターＤＲＳに特異的であり、対象ゲノム内の特定の配列をターゲティングしない。いくつかの実施形態において、ＨＤ−ｇＲＮＡは、配列番号２８の配列に対応するヌクレオチド配列を含み得る。

５．標的遺伝子特異的ｇＲＮＡ
上記のＨｉＵＧＥシステムは、標的遺伝子特異的ｇＲＮＡ（ＧＳ−ｇＲＮＡ）またはＧＳ−ｇＲＮＡをコードする核酸を含む。ＧＳ−ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼと複合体を形成し、標的遺伝子特異的配列との相同性塩基対形成により、対象ゲノム内の標的遺伝子または標的遺伝子特異的配列における意図された切断部位の認識を助ける。いくつかの実施形態において、ＧＳ−ｇＲＮＡは、標的遺伝子ベクター、またはＧＳ−ｇＲＮＡについてのポリヌクレオチド配列をコードする遺伝子特異的ベクター上に提供される。

ＨｉＵＧＥシステムは、任意の標的遺伝子または標的遺伝子特異的配列をターゲティングするようにデザインすることができる。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、内因性遺伝子または導入遺伝子であり得る。いくつかの実施形態において、標的遺伝子または標的遺伝子特異的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に隣接して位置し、またはフランキングされている。いくつかの実施形態において、標的遺伝子特異的配列は、対象ゲノムの標的遺伝子内の約１５〜２５ヌクレオチドの連続したポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、標的遺伝子特異的配列は、対象ゲノムの標的遺伝子内の約１５〜２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的遺伝子特異的配列は、対象ゲノムの標的遺伝子内の約１５ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２１ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２３ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、または約２５ヌクレオチドである。

いくつかの実施形態において、ＧＳ−ｇＲＮＡは、標的遺伝子の少なくとも１つの領域をターゲティングする。いくつかの実施形態において、標的遺伝子特異的ｇＲＮＡ（ＧＳ−ｇＲＮＡ）は、プロモーター領域、エンハンサー領域、リプレッサー領域、インスレーター領域、サイレンサー領域、プロモーター領域とのＤＮＡループ形成に関与する領域、遺伝子スプライシング領域、または転写領域からなる群から選択される標的遺伝子の少なくとも１つの領域をターゲティングする。ある特定の実施形態において、遺伝子特異的ｇＲＮＡはプロモーター領域をターゲティングする。ある特定の実施形態において、遺伝子特異的ｇＲＮＡはエンハンサー領域をターゲティングする。ある特定の実施形態において、遺伝子特異的ｇＲＮＡはリプレッサー領域をターゲティングする。ある特定の実施形態において、遺伝子特異的ｇＲＮＡはインスレーター領域をターゲティングする。ある特定の実施形態において、遺伝子特異的ｇＲＮＡはサイレンサー領域をターゲティングする。ある特定の実施形態において、遺伝子特異的ｇＲＮＡは、プロモーター領域とのＤＮＡループ形成に関与する領域をターゲティングする。ある特定の実施形態において、遺伝子特異的ｇＲＮＡは遺伝子スプライシング領域をターゲティングする。ある特定の実施形態において、遺伝子特異的ｇＲＮＡは転写領域をターゲティングする。

遺伝子特異的ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを標的遺伝子または標的遺伝子特異的配列へターゲティングする。いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥシステムは、１つより多い標的遺伝子または標的遺伝子特異的配列をターゲティングする１つより多いＧＳ−ｇＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥシステムは、１つより多い異なる標的遺伝子または標的遺伝子特異的配列をターゲティングする１つより多い異なるＧＳ−ｇＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、異なるＧＳ−ｇＲＮＡは、異なる標的遺伝子または標的遺伝子特異的配列と結合する。例えば、異なるＧＳ−ｇＲＮＡは、異なる標的遺伝子の標的遺伝子特異的配列と結合することができ、その２つ以上の標的遺伝子が編集される。

いくつかの実施形態において、標的遺伝子または標的遺伝子特異的配列は、真核細胞のゲノム内（例えば、真核細胞の染色体内）にあり得、または細胞に存在する染色体外エレメント上にあり得る。代表的な実施形態において、標的遺伝子または標的遺伝子特異的配列は、真核細胞型（例えば、癌細胞における変異）に固有であり得、または種、属、科、もしくは界（例えば、真核細胞に感染するウイルス）に固有であり得る。

いくつかの実施形態において、ＧＳ−ｇＲＮＡは、配列番号１２８〜１３９またはそれらの組合せのいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含む標的ヌクレオチド配列をターゲティングする。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＴＵＢＢ３遺伝子、ＭＡＰ２遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＮＲＣＡＭ遺伝子、ＡＣＴＲ２遺伝子、ＣＬＴＡ遺伝子、ＡＮＫ３遺伝子、ＳＰＴＢＮ４遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＰＤＨＡ１遺伝子、またはＤＣＸ遺伝子であり得る。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、ＴＵＢＢ５遺伝子、ＩＮＳＹＮ１遺伝子、ＩＮＳＹＮ２遺伝子、ＡＲＨＧＡＰ３２遺伝子、ＴＵＢＢ遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子、ＬＭＮＢ１遺伝子、またはＮＥＦＭ遺伝子であり得る。いくつかの実施形態において、ＧＳ−ｇＲＮＡは、配列番号１４０〜１５１のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＧＳ−ｇＲＮＡは、配列番号１６９〜１９５のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含む。

マウスＴＵＢＢ３遺伝子（本明細書で「ｍＴＵＢＢ３」または「ｍＴｕｂｂ３」とも呼ばれる）は、ニューロンおよび精巣細胞中にほぼ例外なく見出されるチューブリンファミリーの微小管要素である、β−チューブリンＩＩＩをコードする。ＭＡＰ２遺伝子（本明細書で「Ｍａｐ２」とも呼ばれる）は、微小管結合タンパク質ファミリーに属する、微小管結合タンパク質２をコードする。このファミリーのタンパク質は、神経突起生成における必須のステップである微小管アセンブリに関与すると考えられている。ＭＡＰ２は、微小管（ＭＴ）増殖を、ＭＴを中間径フィラメントおよび他のＭＴと架橋することにより安定化させる働きをする。ＭＥＣＰ２遺伝子（本明細書で「Ｍｅｃｐ２」とも呼ばれる）は、神経細胞の正常機能に関与する、核局在化メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）タンパク質をコードする。ＮＲＣＡＭ遺伝子（本明細書で「Ｎｒｃａｍ」とも呼ばれる）は、アンキリンと相互作用しかつ軸索起始部に濃縮されている、神経細胞接着分子をコードする。ＡＣＴＲ２遺伝子（本明細書で「Ａｃｔｒ２」とも呼ばれる）は、ＡＲＰ２／３複合体の主要な成分であることが知られている、アクチン関連タンパク質２をコードする。ＡＲＰ２／３複合体は、細胞形態および運動性を調節する分岐アクチンフィラメントの新規アクチン重合を誘導する必須のタンパク質複合体である。ＣＬＴＡ遺伝子（本明細書で「Ｃｌｔａ」とも呼ばれる）は、エンドサイトーシスおよびタンパク質輸送の小胞の形成において主要な役割を果たすタンパク質である、クラスリンタンパク質をコードする。ＡＮＫ３遺伝子（本明細書で「Ａｎｋ３」とも呼ばれる）は、アンキリンＡＮＫ１およびＡＮＫ２とは免疫学的に異なる遺伝子産物である、アンキリン−３をコードする。アンキリン−３は、中枢および末梢神経におけるニューロンの軸索起始部およびランビエ絞輪に見出される。ＳＰＴＢＮ４遺伝子（本明細書で「Ｓｐｔｂｎ４」とも呼ばれる）は、β−スペクトリン遺伝子のファミリーのメンバーである、スペクトリン、ベータ、非赤血球４（βＩＶ−スペクトリン）をコードする。そのコード化タンパク質は、ニューロンにおける軸索起始部に局在する。ＳＣＮ２Ａ遺伝子（本明細書で「Ｓｃｎ２ａ」とも呼ばれる）は、ナトリウムチャネル、電位開口型、ＩＩ型、αサブユニット（ＮａＶ１．２ナトリウムチャネルサブタイプ）をコードする。Ｎａｖα１．２サブユニットを含有するナトリウムチャネルは、Ｎａｖ１．２チャネルと呼ばれる。ＧＦＡＰ遺伝子（本明細書で「ＧＦＡＰ」とも呼ばれる）は、アストロサイトおよび上衣細胞を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞型により発現する中間径フィラメント（ＩＦ）タンパク質である、グリア酸性線維性タンパク質をコードする。ＰＤＨＡ１遺伝子（本明細書で「Ｐｄｈａ１」とも呼ばれる）は、アセチル−ＣｏＡおよびＣＯ₂を生成するピルビン酸の酸化的脱炭酸を触媒するミトコンドリアマトリックス酵素である、ピルピン酸デヒドロゲナーゼ（リポアミド）α１をコードする。ＤＣＸ遺伝子（本明細書で「Ｄｃｘ」とも呼ばれる）は、微小管結合タンパク質である、ダブリン（ｄｏｕｂｌｉｎ）またはリセンセファリン−Ｘ（ｌｉｓｓｅｎｃｅｐｈａｌｉｎ−Ｘ）としても知られた、神経細胞移動タンパク質ダブルコルチンをコードする。

いくつかの実施形態において、標的遺伝子ベクターは、下記のようなＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、標的遺伝子ベクターは、下記のようなＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸はＲＮＡを含む。

６．ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ
ＨｉＵＧＥシステムは、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列はＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列は、ＨｉＵＧＥベクター上でコードされる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列は、遺伝子特異的ベクター上でコードされる。いくつかの実施形態において、第１のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分をコードする核酸配列は、ＨｉＵＧＥベクター上にコードされ、第１のスプリットインテインと補完的な第２のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分をコードする核酸配列は、遺伝子特異的ベクター上にコードされる。いくつかの実施形態において、遺伝子編集されることになっている標的細胞は、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを発現し、かつ含む。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、侵入するファージおよびプラスミドに対する防御に関与する微生物ヌクレアーゼシステムであり、獲得免疫の一形態を提供する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ座位は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の組合せ、およびＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性の原因である非コードＲＮＡエレメントを含有する。

ＣＲＩＳＰＲシステムは、２つのクラスへ組織化され、それぞれが３つのシステムタイプで構成され、それらがさらに、１９個の異なるサブタイプへ分けられる。クラス１システムは、外来核酸の切断を助けるのに複数のＣａｓタンパク質の複合体を用いる。クラス２は、同じ目的のために、単一の大きなＣａｓタンパク質を用いる。クラス２は単一のＣａｓタンパク質のみを必要とするため、クラス２Ｃａｓタンパク質は、真核生物系における使用のために開発および適応されている。各タイプおよびたいていのサブタイプは、そのカテゴリーにほぼ例外なく見出される「シグネチャ遺伝子」によって特徴づけられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、ゲノム編集に用いられる最もよく知られたクラス２タンパク質である。

ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼは、ｇＲＮＡの３’末端と複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲに基づくシステムの特異性は、２つの因子：標的配列とプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に依存する。標的配列は、ｇＲＮＡの５’末端側に位置し、宿主ＤＮＡ上のプロトスペーサーとして知られた正しいＤＮＡ配列における塩基対と結合するようにデザインされる。ｇＲＮＡの認識配列を単純に交換することにより、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを、新しいゲノム標的に方向づけることができる。ＰＡＭ配列は、切断されることになっているＤＮＡ上に位置し、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼによって認識される。ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼのＰＡＭ認識配列は種特異的であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼはＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの細菌属に由来したＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、非限定的に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａｇｌｏｂｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｉｎｅｒｅａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｌａｒｉを含む群から選択される。

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、非限定的に、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＴｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａＣａｓ９（ＴｄＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓＣａｓ９（ＢｌａｔＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、それらのバリアントエンドヌクレアーゼ、またはそれらのキメラエンドヌクレアーゼを含む群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９バリアントエンドヌクレアーゼ、ＳａＣａｓ９バリアントエンドヌクレアーゼ、またはＳｔＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、ＳｐＣａｓ９バリアントは、ＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＶＲＥＲバリアントエンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＥＱＲバリアントエンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９ＶＱＲバリアントエンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１バリアントエンドヌクレアーゼ、またはｅＳｐＣａｓ９（１．１）バリアントエンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、ＳａＣａｓ９バリアントは、ＳａＣａｓ９Ｃａｓ９ＫＫＨバリアントである。いくつかの実施形態において、ＳｔＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓｔ１Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはＳｔｃＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｓｔ３Ｃａｓ９のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）相互作用（ＰＩ）ドメインを有するＳｐＣａｓ９を含むキメラＳｐ−Ｓｔ３Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはＳｐＣａｓ９のＰＩドメインを有するＳｔ３Ｃａｓ９を含むキメラＳｔ３−ＳｐＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。

ａ．ＰＡＭ配列認識
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体は、ＤＮＡ二重鎖を巻き戻し、ｇＲＮＡに相補的な配列および正しいＰＡＭを探索する。そのヌクレアーゼは、両方の条件が満たされた場合のみ、標的ＤＮＡの切断を媒介する。ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼのタイプおよび１つまたは複数のｇＲＮＡ分子の配列を特定化することにより、ＤＮＡ切断部位を、特定の標的ドメインに局在化させることができる。ＰＡＭ配列がバリアントおよび種特異的であることを考慮すれば、標的配列は、ある特定のＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼによってのみ認識されるように操作することができる。

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列ＹＧ（配列番号１）、ＮＧＧ（配列番号２）、ＮＧＡ（配列番号３）、ＮＧＣＧ（配列番号４）、ＮＧＡＧ（配列番号５）、ＮＧＧＮＧ（配列番号６）、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号７）、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号８）、ＮＮＮＲＲＴ（配列番号９）、ＮＡＡＡＡＣ（配列番号１０）、ＮＮＮＮＧＮＮＴ（配列番号１１）、ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号１２）、ＮＮＮＮＣＮＤＤ（配列番号１３）、またはＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１４）を認識し得る。

いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧ（配列番号２）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９バリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧ（配列番号２）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＶＲＥＲバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＣＧ（配列番号４）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＥＱＲバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＡＧ（配列番号５）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９ＶＱＲバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＡ（配列番号３）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号７）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳａＣａｓ９Ｃａｓ９ＫＫＨバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＲＲＴ（配列番号９）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓｔ１Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号１２）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｓｔ３Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧＮＧ（配列番号６）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、キメラＳｐ−Ｓｔ３Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧＮＧ（配列番号６）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＮｍＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＮＧＮＮＴ（配列番号１１）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＴｄＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＡＡＡＡＣ（配列番号１０）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＢｌａｔＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＮＣＮＤＤ（配列番号１３）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＣｊＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１４）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＦｎＣａｓ９ＲＨＡバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＹＧ（配列番号１）のＰＡＭ配列を認識する。

７．遺伝子編集のための組成物
本発明は、マーカーまたはタグを挿入するように遺伝子を編集するなどの遺伝子編集のための組成物を対象とする。その組成物は、上記で開示されているような、ＨｉＵＧＥシステム、または前記システムをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み得る。組成物はまた、ウイルス送達システムを含み得る。例えば、ウイルス送達システムは、アデノ随伴ウイルスベクターまたは改変レンチウイルスベクターを含み得る。

核酸を宿主細胞へ導入する方法は、当技術分野において知られており、核酸（例えば、発現構築物）を細胞へ導入するために任意の公知の方法を用いることができる。適切な方法には、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、イムノリポソーム、リン酸カルシウム沈澱、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガンテクノロジー、リン酸カルシウム沈澱、ダイレクトマイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。
ベクターは、参照により完全に組み入れられているSambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)を含む、日常的技術および容易に入手できる出発材料によりタンパク質を産生するための発現ベクターまたはシステムであり得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列、ＨｉＵＧＥベクターをコードする核酸配列、およびＧＳ−ｇＲＮＡまたは遺伝子特異的ベクターをコードする核酸配列を含む、ＨｉＵＧＥシステムをコードする核酸配列を含み得る。

ａ．構築物およびプラスミド
プラスミド、発現カセット、またはベクターなどの遺伝的構築物は、ＨｉＵＧＥシステム、またはそのサブコンポーネント、例えば、ＨｉＵＧＥベクター、遺伝子特異的ベクター、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ、ＨＤ−ｇＲＮＡ、ＧＳ−ｇＲＮＡ、および／もしくは挿入断片をコードする核酸を含み得る。遺伝的構築物は、機能する染色体外分子として細胞内に存在し得る。遺伝的構築物は、セントロメア、テロメアを含む線状ミニ染色体、またはプラスミドもしくはコスミドであり得る。いくつかの実施形態において、遺伝的構築物は、配列番号６７〜１２７および／またはそれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、遺伝的構築物は、配列番号６７〜１２７、１５２、１５３、１５４、および／またはそれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み得る。

遺伝的構築物はまた、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、および組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝的構築物は、弱毒化した生きている微生物における遺伝子材料の一部、または細胞内で生きる組換え微生物ベクターであり得る。上記のような組成物は、改変アデノ随伴ウイルスＡＡＶベクターをコードする遺伝的構築物、および本明細書に開示されているような、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントをコードする核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、上記のような組成物は、改変アデノウイルスベクターをコードする遺伝的構築物、および本明細書に開示されているような、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントをコードする核酸配列を含み得る。上記のような組成物は、改変レンチウイルスベクターをコードする遺伝的構築物、および本明細書に開示されているような、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントをコードする核酸配列を含み得る。

核酸配列は、ベクターであり得る遺伝的構築物を作り上げ得る。そのベクターは、哺乳類の細胞においてＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ、ＨＤ−ｇＲＮＡ、ＧＳ−ｇＲＮＡ、および／または挿入断片を発現する能力があり得る。ベクターは、組換えであり得る。ベクターは、ＨｉＵＧＥベクター、遺伝子特異的ベクター、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ、ＨＤ−ｇＲＮＡ、ＧＳ−ｇＲＮＡ、および／または挿入断片をコードする異種性核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであり得る。ベクターは、ＨｉＵＧＥベクター、遺伝子特異的ベクター、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ、ＨＤ−ｇＲＮＡ、ＧＳ−ｇＲＮＡ、および／または挿入断片をコードする核酸を細胞にトランスフェクションするのに有用であり得、その形質転換された宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ、ＨＤ−ｇＲＮＡ、ＧＳ−ｇＲＮＡ、および／または挿入断片の発現が起こる条件下で培養および維持される。

本開示のさらなる実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ、ＨＤ−ｇＲＮＡ、ＧＳ−ｇＲＮＡ、および／または挿入断片をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝的構築物およびポリヌクレオチドは、様々な生物体または細胞における発現のために、様々なプロモーター、ターミネーター、および他の制御エレメントと作動可能に付随することができる。いくつかの実施形態において、遺伝的構築物は、核酸のコード配列の遺伝子発現のための制御エレメントを含み得る。いくつかの実施形態において、制御エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。

代表的な実施形態において、少なくとも１つのプロモーターおよび／またはターミネーターは、本開示のポリヌクレオチドと作動可能に連結され得る。この開示に関して有用な任意のプロモーターを用いることができ、それには、例えば、非限定的に、本明細書に記載されているような、構成的、誘導性、発生的に制御されるプロモーターなどを含む、関心対象となる生物体に関して機能しうるプロモーターが挙げられる。本明細書で用いられる場合の制御エレメントは、内因性または異種性であり得る。いくつかの実施形態において、対象生物体に由来した内因性制御エレメントは、それが天然では存在していない（例えば、天然で見出されるのとは異なる、ゲノムにおける位置）遺伝的状況へ挿入することができ、それにより、組換えまたは非天然核酸を産生する。したがって、代表的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼのポリペプチドをコードし、かつ５’末端および３’末端を有する核酸構築物は、その少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは核酸構築物の５’末端に作動可能に連結されたプロモーター、およびその少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは核酸構築物の３’末端に作動可能に連結されたポリＡシグナルをさらに含み得る。

いくつかの態様において、真核細胞へ導入される、ポリヌクレオチド、またはＨｉＵＧＥシステムをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において知られたプロモーターおよび／またはポリＡシグナルと作動可能に連結されている。したがって、いくつかの態様において、５’末端および３’末端を有するＨｉＵＧＥシステムのポリペプチドをコードする本開示の核酸構築物は、５’末端においてプロモーターと、および３’末端においてポリＡシグナルと作動可能に連結され得る。いくつかの態様において、本開示の核酸構築物は、複数の独立したポリペプチド（タンパク質）の同時翻訳を援助するための、当技術分野において知られた２Ａペプチド配列および／または配列内リボソーム進入部位を含み得る。いくつかの態様において、ＨｉＵＧＥシステムのポリペプチドまたはタンパク質をコードする本開示の核酸構築物は、プラスミド、ウイルスベクター、またはナノ粒子を介して真核細胞へ導入することができる。いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントをコードするポリヌクレオチドまたは遺伝的構築物は、１つの構築物または異なる構築物において導入することができる。

発現カセットはまた、任意で、選択された宿主細胞において機能しうる転写および／または翻訳終結領域（すなわち、終結領域）を含み得る。様々な転写ターミネーターが、発現カセットでの使用に利用可能であり、関心対象となる異種性ヌクレオチド配列を越える転写の終結を担うことができる。終結領域は、転写開始領域にとって天然であり得、作動可能に連結された関心対象となるヌクレオチド配列にとって天然であり得、宿主細胞にとって天然であり得、または別の源由来（すなわち、プロモーターにとって、関心対象となるヌクレオチド配列にとって、宿主にとって、またはそれらの任意の組合せにとって、外来または異種性）であり得る。この開示のいくつかの実施形態において、ターミネーターは、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントをコードする組換えポリヌクレオチドと作動可能に連結され得る。

発現カセットはまた、形質転換された宿主細胞を選択するために用いることができる選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含み得る。本明細書で用いられる場合、「選択マーカー」は、発現した時、マーカーを発現する宿主細胞に弁別的な表現型を授け、それに従って、そのような形質転換された細胞が、マーカーを有しない細胞から区別されることを可能にする、ヌクレオチド配列を意味する。そのようなヌクレオチド配列は、マーカーが、選択剤（例えば、抗生物質など）を用いることによるなどの化学的手段によって選択することができる形質を与えるかどうか、またはマーカーが、単に、スクリーニング（例えば、蛍光）によるなどの観察もしくは試験を通して同定することができる形質であるかどうかに依存して、選択マーカーかまたはスクリーニングマーカーかのいずれかをコードし得る。もちろん、適切な選択マーカーの多くの例が、当技術分野において知られており、本明細書に記載された発現カセットに用いることができる。

発現カセットに加えて、本明細書に記載された組換えポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）は、ベクターと接続して用いることができる。用語「ベクター」は、核酸を細胞へ移入、送達、または導入するための組成物を指す。ベクターは、移入、送達、または導入されるべきヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。宿主生物体の形質転換に用いられるベクターは、当技術分野において知られている。一般的なクラスのベクターの非限定的例には、自己伝達性もしくは可動性であってもなくてもよい、二本鎖もしくは一本鎖の線状もしくは環状の形をとる、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、バクテリオファージ、人工染色体、またはアグロバクテリウムバイナリーベクターが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書に定義されているようなベクターは、細胞ゲノムへの組込みか、染色体外エレメント（例えば、ミニ染色体）として存在するかのいずれかにより、真核生物宿主を形質転換することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組換えポリヌクレオチドは、リボ核タンパク質複合体として送達することができる。

追加として、シャトルベクターが含まれ、それは、２つの異なる宿主生物体において、天然でまたはデザインにより、複製する能力があるＤＮＡ媒介物を意味し、例えば、複数の複製起点を有する広宿主プラスミドまたはシャトルベクターなどである。いくつかの代表的な実施形態において、ベクターにおける核酸は、宿主細胞において、転写のための適切なプロモーターまたは他の制御エレメントの調節下にあり、かつそれと作動可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主において機能する二機能性発現ベクターであり得る。ゲノムＤＮＡの場合、これは、それ自身のプロモーターもしくは他の制御エレメントを含み得、ｃＤＮＡの場合、これは、宿主細胞における発現のための適切なプロモーターまたは他の制御エレメントの調節下にあり得る。したがって、この開示のポリヌクレオチドおよび／またはこの開示のポリヌクレオチドを含む発現カセットは、本明細書に記載されているような、および当技術分野において知られているようなベクター内に含まれ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載された組換えポリヌクレオチドは、リボ核タンパク質複合体として送達することができる。
コード配列は、安定性および高レベルの発現のために最適化することができる。場合によっては、コドンは、そのＲＮＡの二次構造形成、例えば、分子内結合により形成された二次構造を低下させるように選択される。

ベクターは、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントをコードする異種性核酸を含み得、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントの上流にあり得る開始コドン、およびＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントの下流にあり得る終止コドンをさらに含み得る。開始および終結コドンは、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントとインフレームであり得る。ベクターはまたは、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントと作動可能に連結されているプロモーターも含み得る。

ベクターはまた、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントの下流にあり得る、ポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルであり得る。

ベクターはまた、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントの上流にエンハンサーを含み得る。エンハンサーは、ＤＮＡ発現に必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶ由来のものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、およびＷＯ９４／０１６７３７（それぞれの内容は参照により完全に組み入れられている）に記載されている。ベクターはまた、細胞においてベクターを染色体外に維持し、かつベクターの複数コピーを産生するために、哺乳類複製起点も含み得る。ベクターは、ベクターが投与される哺乳類またはヒト細胞における遺伝子発現によく適し得る制御配列も含み得る。ベクターはまた、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択マーカーも含み得る。
いくつかの実施形態において、遺伝的構築物は、単一のベクター内に位置し得、または３つの異なるベクターに含まれ得る。これらの構築物では、ＨｉＵＧＥテクノロジーにより分裂および非分裂細胞において対象ゲノム内への挿入が可能である。

（１）プロモーター
本開示のいくつかの実施形態は、ＨＤ−ｇＲＮＡ分子、標的遺伝子ｇＲＮＡ分子、および挿入断片をコードするポリヌクレオチド配列についての遺伝的構築物を含む。いくつかの実施形態において、それぞれがプロモーターと作動可能に連結され得、挿入断片が第１のプロモーターと作動可能に連結され、ＨＤ−ｇＲＮＡが第２のプロモーターと作動可能に連結され得、標的遺伝子ｇＲＮＡ分子が第３のプロモーターと連結されている。いくつかの実施形態において、第１のプロモーター、第２のプロモーター、および／または第３のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または制御性プロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、挿入断片およびｇＲＮＡ分子についてのポリヌクレオチド配列の全てが、同じプロモーターと作動可能に連結され得、プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または制御性プロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは真核生物プロモーターである。
この開示に関して有用な例示的なプロモーターには、真核生物において機能しうるプロモーターが挙げられる。真核生物の非限定的例には、哺乳類、昆虫、両生類、爬虫類、鳥、魚、真菌、植物、および／または線形動物が挙げられる。

いくつかの実施形態において、本開示の構築物の発現は、関心対象となる生物体において機能しうる適切なプロモーターと作動可能に連結された本開示の組換え核酸構築物を用いて、構成的にされ、誘導性にされ、時間的に制御され、発生的に制御され、または化学的に制御され得る。代表的な実施形態において、抑制は、例えば、関心対象となる生物体において機能しうる誘導性プロモーターと、作動可能に連結された本開示の組換え核酸構築物を用いて、可逆性にされ得る。
プロモーターの選択は、発現についての定量的、時間的、および空間的必要条件に依存して、およびまた、形質転換される宿主細胞に依存して、変わる。多くの異なる生物体についてのプロモーターが当技術分野においてよく知られている。当技術分野に存在する広範な知識に基づいて、適切なプロモーターが、関心対象となる特定の宿主生物体について選択することができる。したがって、例えば、モデル生物体において高度に構成的に発現する遺伝子の上流のプロモーターについて多くのことが知られており、そのような知識は、容易にアクセスし、かつ必要に応じて他のシステムにおいて実践することができる。

本開示のいくつかの実施形態において、誘導性プロモーターを用いることができる。したがって、例えば、化学的制御性プロモーターは、外因性化学的制御因子の適用を通して生物体における遺伝子の発現を調節するために用いることができる。化学的に制御されるプロモーターによる本開示のヌクレオチド配列の発現の制御は、本開示のＲＮＡおよび／またはポリペプチドが、例えば生物体が誘導性化学物質で処理される時のみ、合成されることを可能にする。目的によって、プロモーターは、化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する化学的誘導性プロモーター、または化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する化学的抑制性プロモーターであり得る。いくつかの態様において、プロモーターにはまた、特定の波長の光の適用が遺伝子発現を誘導する光誘導性プロモーターを挙げることができる（Levskaya et al. 2005. Nature 438:441-442）。

いくつかの実施形態において、プロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、例えば、ヒトＵ６プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、または７ＳＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、配列番号６２〜６６、またはそれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み得る。

いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチド配列、またはＨＤ−ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、第１のプロモーターと作動可能に連結され、第３のポリヌクレオチド配列、またはＧＳ−ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、第２のプロモーターと作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥシステムがインテイン媒介性タンパク質スプライシングシステムプロモーターを用いる場合には、第２のポリヌクレオチド配列、またはＨＤ−ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、第１のプロモーターと作動可能に連結され、第３のポリヌクレオチド配列、または第１のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分をコードするポリヌクレオチド配列は、第２のプロモーターと作動可能に連結され、第４のポリヌクレオチド配列、または第１のスプリットインテインと補完的な第２のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分をコードするポリヌクレオチド配列は、第３のプロモーターと作動可能に連結され、第５のポリヌクレオチド配列、またはＧＳ−ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、第４のプロモーターと作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、第４のポリヌクレオチド配列および第５のポリヌクレオチド配列は、同じプロモーターと作動可能に連結され得る。

（２）核局在化シグナル（ＮＬＳ）および／または核外移行シグナル（ＮＥＳ）
さらなる態様において、本開示の核酸構築物は、ポリヌクレオチドを細胞質から核へ移動させるためにポリヌクレオチドと連結された１つまたは複数の核局在化シグナルを含み得る。さらなる態様において、本開示の核酸構築物は、ポリヌクレオチドを核から細胞質へ移動させるためにポリヌクレオチドと連結された１つまたは複数の核外移行シグナルを含み得る。いくつかの態様において、本開示の核酸構築物によりコードされるＨｉＵＧＥシステムは、別個の核局在化シグナルおよび／または核外移行シグナルを含み得る。いくつかの実施形態において、核局在化シグナルは、配列番号５２または５３のポリヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態において、核外移行シグナルは、配列番号５１のポリヌクレオチド配列を含み得る。

ｂ．ウイルスパッケージング
いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥベクター、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列、および／または標的遺伝子ベクターについての遺伝的構築物のうちの１つ、２つ、または３つ全部が、ウイルスベクター内にパッケージングされ得る。いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥベクター、およびＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列が、同じウイルスベクター内にパッケージングされる。いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥベクターおよび標的遺伝子ベクターが同じウイルスベクター内にパッケージングされる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列および標的遺伝子ベクターが、同じウイルスベクター内にパッケージングされる。いくつかの実施形態において、遺伝的構築物の３つ全部が、同じウイルスベクター内にパッケージングされる。いくつかの実施形態において、遺伝的構築物の３つ全部が、異なるウイルスベクター内にパッケージングされる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態において、ＨｉＵＧＥベクター、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列、および標的遺伝子ベクターについての遺伝的構築物のそれぞれが、３つの別々のＡＡＶベクターへパッケージングされる。

（１）改変レンチウイルスベクター
レンチウイルスベクターは、ヒトおよび他の哺乳類種に感染することができるレトロウイルスのレンチウイルスファミリーに属するベクターである。遺伝子編集のための組成物は改変レンチウイルスベクターを含み得る。改変レンチウイルスベクターは、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ、ＨｉＵＧＥベクターをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチド配列、および／または少なくとも１つのＧＳ−ｇＲＮＡもしくは遺伝子特異的ベクターをコードする別個のポリヌクレオチド配列を含み得る。改変レンチウイルスベクターは、ＨｉＵＧＥシステムまたはそのサブコンポーネントをコードする第１のポリヌクレオチド配列を含み得る。１つまたは複数のポリヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターと作動可能に連結され得る。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または制御性プロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、改変レンチウイルスベクターは、配列番号６７〜１２７またはそれらの組合せのポリヌクレオチド配列を含み得る。

いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のＧＳ−ｇＲＮＡをコードし得る。例えば、第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも２個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも３個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも４個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも５個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも６個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも７個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも８個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも９個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも１０個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも１１個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも１２個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも１３個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも１４個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも１５個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも１６個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも１７個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも１８個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも１９個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも２０個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも２５個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも３０個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも３５個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも４０個のＧＳ−ｇＲＮＡ、少なくとも４５個のＧＳ−ｇＲＮＡ、または少なくとも５０個のＧＳ−ｇＲＮＡをコードし得る。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチド配列は、１個のＧＳ−ｇＲＮＡ〜５０個のＧＳ−ｇＲＮＡ、１個のＧＳ−ｇＲＮＡ〜４５個のＧＳ−ｇＲＮＡ、１個のＧＳ−ｇＲＮＡ〜４０個のＧＳ−ｇＲＮＡ、１個のＧＳ−ｇＲＮＡ〜３５個のＧＳ−ｇＲＮＡ、１個のＧＳ−ｇＲＮＡ〜３０個のＧＳ−ｇＲＮＡ、１個のＧＳ−ｇＲＮＡ〜２５個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、１個のＧＳ−ｇＲＮＡ〜２０個のＧＳ−ｇＲＮＡ、１個のＧＳ−ｇＲＮＡ〜１６個のＧＳ−ｇＲＮＡ、１個のＧＳ−ｇＲＮＡ〜８個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、４個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜５０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、４個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜４５個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、４個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜４０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、４個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜３５個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、４個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜３０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、４個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜２５個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、４個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜２０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、４個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜１６個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、４個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜８個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、８個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜５０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、８個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜４５個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、８個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜４０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、８個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜３５個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、８個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜３０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、８個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜２５個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、８個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜２０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、８個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜１６個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、１６個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜５０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、１６個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜４５個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、１６個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜４０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、１６個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜３５個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、１６個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜３０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、１６個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜２５個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ、または１６個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡ〜２０個の異なるＧＳ−ｇＲＮＡをコードし得る。いくつかの実施形態において、異なるＧＳ−ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列のそれぞれは、プロモーターと作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、異なるＧＳ−ｇＲＮＡと作動可能に連結されるプロモーターは、同じプロモーターであり得る。いくつかの実施形態において、異なるＧＳ−ｇＲＮＡと作動可能に連結されるプロモーターは、異なるプロモーターであり得る。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または制御性プロモーターであり得る。少なくとも１個のＧＳ−ｇＲＮＡは、標的遺伝子または座位と結合し得る。１個より多いＧＳ−ｇＲＮＡが含まれる場合には、ＧＳ−ｇＲＮＡのそれぞれが、１つの標的座位内の異なる標的領域と結合し、またはＧＳ−ｇＲＮＡのそれぞれが、異なる遺伝子座位内の異なる標的領域と結合する。

（２）アデノ随伴ウイルスベクター
ＡＡＶベクターは、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に属する小型ウイルスである。ＡＡＶは、様々な構築物配置を用いて組成物を細胞へ送達するために用いることができる。例えば、ＡＡＶは、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ、挿入断片、および／またはｇＲＮＡ発現カセットをコードする遺伝的構築物を別々のベクター上で送達することができる。上記のような組成物は、改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。改変ＡＡＶベクターは、哺乳類の細胞においてＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを送達し、かつ発現する能力があり得る。例えば、改変ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＳＡＳＴＧベクター（Piacentino et al. (2012) Human Gene Therapy 23:635−646）であり得る。改変ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢを含む、数個のカプシドの型の１個または複数に基づき得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、脳組織における神経回路操作のためにニューロンへ逆行性に形質導入することができる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、配列番号１５２、１５３、１５４、またはそれらの組合せのポリヌクレオチド配列を含み得る。

８．相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリングテクノロジーを用いる方法
本開示はまた、上記のＨｉＵＧＥシステムを用いて遺伝子編集する方法を対象とする。開示された方法は、ゲノムワイドタンパク質標識、発現マーキング、タンパク質発現の破壊、タンパク質再局在化、タンパク質発現の変化、またはハイスループットスクリーニングのために用いることができる。これらの実施形態に従って、方法は、非限定的に、固定細胞または組織の抗体染色、細胞または組織におけるタンパク質のライブイメージング、タンパク質複合体同定のためのタンパク質捕獲またはアフィニティ精製、細胞型系譜追跡または標識、および個々の遺伝子との複数の異なる融合を用いたトランスジェニック生物体の作製を含む適用において、速さと正確さの両方を可能にするだろう。例えば、方法は、図２Ｃ〜２Ｇに示されたＨｉＵＧＥベクターツールキットのいずれかと共に用いることができる。例えば、方法は、（ツールキット１）抗体エピトープタグ、（ツールキット２）酵素、（ツールキット３）蛍光タンパク質、（ツールキット４）細胞輸送タグ（ＮＬＳ＝核局在化シグナル、ＮＥＳ＝核外移行配列、ｍｉｔｏ＝ミトコンドリアターゲティング配列）、および（ツールキット５）特定適用のための他のペイロードと共に用いることができる。いくつかの実施形態において、方法は、標的ゲノム座位への挿入断片のフォワードまたはリバースのいずれの組込み後でもタグの効率的発現のために二重配向デザインを採用する、エピトープタグおよび細胞輸送タグなどの短いタグ配列を有するＨｉＵＧＥベクターを用いることを含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、典型的にはフォワード組込み後、ＫＩペイロードの発現を可能にする単一配向デザインを用いる、より長い挿入断片配列を有するＨｉＵＧＥベクターを用いることを含み得る。いくつかの実施形態において、ペイロードのゲノム標的へのリバース組込みがある方法において、翻訳は、全ての３つの可能なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）における終止コドンカセット（図２Ｈ）により終結され得る。

開示された方法は、本明細書に記載されたＨｉＵＧＥシステムと細胞を接触させるステップを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼは、第１のポリヌクレオチドの各側にフランキングする少なくとも１つのＤＲＳおよび標的遺伝子特異的配列を切断し、それにより、切断された第１のポリヌクレオチド配列および標的遺伝子の切断された部位を生じ、その切断された第１のポリヌクレオチド配列が、標的遺伝子の切断された部位へ非相同末端結合により組み込まれる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼは、少なくとも１つのＤＲＳおよび標的遺伝子特異的配列を連続的にまたは同時に切断し、それにより、切断された挿入断片を生じる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片または切断された挿入断片は、プロモーター領域、エンハンサー領域、リプレッサー領域、インスレーター領域、サイレンサー領域、プロモーター領域とのＤＮＡループ形成に関与する領域、遺伝子スプライシング領域、または転写領域のＮ末端に挿入されて、Ｎ末端タグ付き融合タンパク質を生じる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片または切断された挿入断片は、プロモーター領域、エンハンサー領域、リプレッサー領域、インスレーター領域、サイレンサー領域、プロモーター領域とのＤＮＡループ形成に関与する領域、遺伝子スプライシング領域、または転写領域のＣ末端に挿入されて、Ｃ末端タグ付き融合タンパク質を生じる。

いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片または切断された挿入断片は、ゲノムのセンス鎖へ挿入される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片または切断された挿入断片は、ゲノムのアンチセンス鎖へ挿入される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片または切断された挿入断片は、フォワード配向で挿入される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの挿入断片または切断された挿入断片は、リバース配向で挿入される。

いくつかの実施形態において、細胞は、分化細胞または非分裂細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、内胚葉、外胚葉、または中胚葉に由来する。いくつかの実施形態において、対象ゲノムは、真核動物対象由来である。いくつかの実施形態において、対象ゲノムは、哺乳類対象である。いくつかの実施形態において、哺乳類対象はげっ歯類または霊長類である。

９．送達の方法
本発明において開示された遺伝的構築物は、非ウイルス方法およびウイルス方法を含む細胞へのＤＮＡ送達の任意の方法を用いて送達され得る。一般的な非ウイルス送達方法には、形質転換およびトランスフェクションが挙げられる。非ウイルス遺伝子送達は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子媒介型遺伝子移入（「遺伝子銃」）、刺入による遺伝子導入（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、静水圧、持続注入、超音波処理、化学的トランスフェクション、リポフェクション、またはインビボでのエレクトロポレーションを用いた、および用いないＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種）などの物理的方法により媒介され得る。ウイルス媒介性遺伝子送達またはウイルス形質導入は、ウイルスが、それのＤＮＡを宿主細胞の内側へ注入する能力を利用する。送達を意図された遺伝的構築物は、複製欠損性ウイルス粒子へパッケージングされる。用いられる一般的なウイルスには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、アデノ随伴ウイルスが、遺伝的構築物の送達に用いられる。

１０．細胞型
これらの送達方法のいずれも、非限定的に、原核細胞、または植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類、ブタ、もしくはヒト細胞などの真核細胞を含む無数の細胞型と共に利用することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、分化細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は非分裂細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はげっ歯類細胞である。
ある特定の実施形態において、細胞は形質転換細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、非限定的に、筋芽細胞、線維芽細胞、神経膠芽腫、癌腫、上皮細胞、幹細胞を含む群から選択される。ある特定の実施形態において、細胞は、非限定的に、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞、およびＣＨＯ細胞を含む群から選択される。
ある特定の実施形態において、細胞は、組織に由来する（初代細胞）。ある特定の実施形態において、初代細胞はニューロンである。ある特定の実施形態において、初代細胞は心筋細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、内胚葉、外胚葉、または中胚葉に由来する。

１１．キット
マーカーまたはタグを挿入するために遺伝子を編集することなどの遺伝子編集に用いられ得るキットが、本明細書で提供される。キットは、上記で開示されているようなＨｉＵＧＥシステムを含む。いくつかの実施形態において、キットは、ＨｉＵＧＥベクターおよびＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを含む。キットは、上記のようなゲノム編集のための遺伝的構築物またはそれを含む組成物、および前記組成物を用いることについての使用説明書を含む。遺伝子へ挿入するための遺伝的構築物（例えば、ベクター）またはそれを含む組成物は、上記のような、挿入断片、ｇＲＮＡ分子、およびＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを含む改変ＡＡＶベクターを含み得る。ある特定の型のタグまたはマーカーをゲノムへ特異的に挿入するための、上記のようなＨｉＵＧＥシステムが、キットに含まれ得る。

キットに含まれる使用説明書は、包装材料に貼られる場合もあるし、または添付文書として含まれる場合もある。使用説明書は典型的には書面または印刷物であるが、そのようなものに限定されない。そのような使用説明書を保存し、それらをエンドユーザーへ伝達することができる任意の媒体がこの開示によって企図される。そのような媒体は、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ）などが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書で用いられる場合、用語「使用説明書」は、使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。

１２．実施例
本明細書に記載された本開示の方法の他の適切な改変および適応が、容易に適用可能および認識可能であり、かつ本開示の範囲から逸脱することのない適切な均等物または本明細書に開示された態様および実施形態を用いてなされ得ることは、当業者にとって容易に明らかであろう。今、本開示を詳細に記載しているが、それは、以下の実施例を参照することにより、より明らかに理解されるだろうし、その実施例は、本開示のいくつかの態様および実施形態を例証することのみを単に意図され、本開示の範囲を限定することとみなされるべきではない。本明細書で言及された、全ての雑誌参考文献、米国特許、および刊行物は、全体が参照により本明細書に組み入れられている。
本発明は、以下の非限定的実施例により例証された、複数の態様を有する。

（実施例１）
相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）方法
ＨｉＵＧＥベクターの構築。遺伝子特異的プラスミドとユニバーサルドナープラスミド（ＨｉＵＧＥベクター）のどちらも、ＡＡＶ：ＩＴＲ−Ｕ６−ｇＲＮＡ（バックボーン）−ｈＳｙｎ−Ｃｒｅ−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ−ＷＰＲＥ−ｓｈｏｒｔＰＡ−ＩＴＲプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅｐｌａｓｍｉｄ＃６０２３１）に由来した。

第１世代（１^st ｇｅｎ）ＨｉＵＧＥシステム：１^st ｇｅｎ遺伝子特異的ｇＲＮＡ（ＧＳ−ｇＲＮＡ）ベクターバックボーンの２つのバージョンを、ＨＡ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ断片を除去することにより調製し、その後、第２の非ニューロンのバージョンのために、ニューロン特異的ｈＳｙｎプロモーターを、Ｅｆ１αプロモーターと置き換えた。これらのベクターは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現し、Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ^{tm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh}マウス（Ｃａｓ９マウス）と共に、コンディショナルＣａｓ９発現の誘導のために用いることができる。それぞれの関心対象となる遺伝子（ＧＯＩ）について、そのアミノ末端かまたはカルボキシル末端のいずれかをターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡ配列を、オンラインｇＲＮＡ評価ツール「Ｃｒｉｓｐｏｒ」（Haeussler et al., Genome Biol. (2016) 17(1):148）を用いてデザインし、ＧＳ−ｇＲＮＡのＵ６プロモーター駆動型発現のために制限消化／ライゲーションクローニング方法を用いてＳａｐＩ部位へクローニングした。１０μＬ反応物において、１０ｎｇ（約２ｆｍｏｌ）のＧＳ−ｇＲＮＡバックボーンプラスミドを、ＳａｐＩ酵素（ＮＥＢＲ０５６９、１μＬ）で消化し、同時に、５０ｆｍｏｌのアニールされた２３〜２４ｍｅｒ（ＳａｐＩ粘着末端を含む）ＧＳ−ｇＲＮＡオリゴとＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢＭ０２０２、１μＬ）で、３７℃（５分間）と２１℃（５分間）の間のサーモサイクリングの１０回の反復によってライゲーションした。約１００ｂｐ単位複製配列を増幅するようにリバースプライマーとしてのリバースＧＳ−ｇＲＮＡオリゴとペアになった上流Ｕ６プロモーター領域におけるフォワードプライマーを用いて、コロニーＰＣＲを実施し、バックボーンプラスミドへのＧＳ−ｇＲＮＡ組込みを検出した。用いられるＧＳ−ｇＲＮＡ標的配列は、表１に列挙されている。

１^st ｇｅｎＨｉＵＧＥベクターについて、ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡ（ＨＤ−ｇＲＮＡ）を、Ｕ６プロモーターの後のＳａｐＩ部位へクローニングした。ＸｂａＩ制限部位とＰｍｌＩ制限部位との間の断片を、ペイロード配列（エピトープタグ、酵素、蛍光タンパク質、細胞輸送タグなど）を含有するドナー配列と置き換えて、標的ゲノム座位へ挿入した。ペイロード配列は、ＨＤ−ｇＲＮＡにより特異的に認識されるドナー認識配列（ＤＲＳ）によって両側でフランキングされた。ＨＤ−ｇＲＮＡは、標的ゲノム座位へ挿入されるように、ドナーペイロード配列のＣａｓ９媒介性切断および放出を方向づけた。表２は、Ｖ２のＨＤ−ｇＲＮＡがｇａｃｇｃｔｔｃｃｇａｇｔａｃｇｇｔａｃ（配列番号２８）に対応する配列を有し、かつＤＲＳバージョンがＶ１（ｃｃｔｇｔａｃｃｇｔａｃｔｃｇｇａａｇｃｇｔｃ（配列番号２７））またはＶ２（ｇａｃｇｃｔｔｃｃｇａｇｔａｃｇｇｔａｃａｇｇ（配列番号２３））である、以下の実施例において用いられる第１世代ＨｉＵＧＥベクターを列挙する。

ＨｉＵＧＥドナーベクターについて、ドナー特異的ｇＲＮＡ（ＨＤ−ｇＲＮＡ）を、Ｕ６プロモーターの後のＳａｐＩ部位へクローニングした。ＸｂａＩ制限部位とＰｍｌＩ制限部位との間の断片を、エピトープタグ（ＨＡ、Ｍｙｃ、およびＶ５）、蛍光タンパク質（例えば、Shaner et al., 2004; Zacharias et al., 2002参照）、「スパゲティモンスター（ｓｐａｇｈｅｔｔｉｍｏｎｓｔｅｒ）」蛍光タンパク質−ＨＡ（Viswanathan et al., 2015）、および細胞輸送タグ（ＳＶ４０核局在化シグナル、ＮＬＳ）などのペイロード配列と置き換えて、標的ゲノム座位へ挿入した。ヒトまたはマウスゲノム内に存在しない人工配列であり、かつＣＲＩＳＰＯＲおよびＣａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ（Bae et al., 2014b; Haeussler et al., 2016; Hsu et al., 2013）によって予測された場合、低いゲノムオフターゲット傾向（ヒトまたはマウスゲノムに対して９８以上の特異性スコア、塩基対ミスマッチが３つ以内であるゲノム標的がない）を以てＨＤ−ｇＲＮＡによって特異的に認識されるドナー認識配列（ＤＲＳ）により、ペイロード配列は両側でフランキングされた。ＨＤ−ｇＲＮＡは、標的ゲノム座位へ挿入されるように、Ｃａｓ９媒介性ＤＲＳ切断およびペイロード配列の放出を方向づける。この研究に用いられる例示的なＤＲＳおよびペイロード配列は、表１に見出すことができる。

２^nd ｇｅｎＨｉＵＧＥシステム：２^nd ｇｅｎＨｉＵＧＥシステムについて、インテインスプリットｃａｓ９システム（Truong et al., Nucleic Acids Res. (2015) 43(13):6450-8）を用いて、Ｃａｓ９コード配列をＧＳ−ｇＲＮＡベクターとＨｉＵＧＥベクターの両方へ分配した。簡単に述べると、第１世代ＧＳ−ｇＲＮＡベクターのｈＳｙｎ−Ｃｒｅを、Ｃ−インテイン−Ｃ−Ｃａｓ９コード配列を駆動するＥＦ１α／ＨＴＬＶ（ｎＥＦ）プロモーターと置き換えることにより、ＧＳ−ｇＲＮＡベクターを構築した。２^nd ｇｅｎＨｉＵＧＥドナープラスミドは１^st ｇｅｎと類似しており、ドナーペイロード配列の後に、同様にＥＦ１α／ＨＴＬＶ（ｎＥＦ）プロモーターによって駆動されるＮ−Ｃａｓ９−Ｎ−インテインコード配列の付加を有した。これらのベクターを、合成ＤＮＡ断片のブロックを用いて構築した。表３は、実施例７に用いられる第２世代ＨｉＵＧＥベクターを列挙する。これらの第２世代ＨｉＵＧＥベクターは、ＳＶ４０ＮＬＳのシグナル配列、Ｖ２のＨＤ−ｇＲＮＡ（ｇａｃｇｃｔｔｃｃｇａｇｔａｃｇｇｔａｃ（配列番号２８）に対応する配列を有する）およびＶ２のＤＲＳ（ｇａｃｇｃｔｔｃｃｇａｇｔａｃｇｇｔａｃａｇｇ（配列番号２３））を含んだ。

ＡＡＶ作製。精製されたＡＡＶを、以前に記載されたプロトコール（Uezu et al., Science. (2016) 353(6304):1123-9）に基づいて作製した。簡単に述べれば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６つの１５ｃｍディッシュ上にプレーティングし、６０〜８０％コンフルエンシーに達した時、ＰＥＩを用いて、１５μｇＡＡＶベクター、３０μｇヘルパープラスミドｐＡｄ−ＤｅｌｔａＦ６、および１５μｇＡＡＶ血清型２／９プラスミドをトランスフェクションした。その後、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、グルタミン、およびピルビン酸塩を含有する、抗生物質を含まないＤＭＥＭにおいて細胞をインキュベートした。トランスフェクションから３日後、細胞を収集し、凍結融解サイクルの反復（３回）で溶解させた。その後、細胞可溶化物を、超遠心精製のためにＯｐｔｉｐｒｅｐ密度勾配（Ｓｉｇｍａ、１５％、２５％、４０％、および６０％）にアプライした。ＡＡＶ含有画分を収集し、その後、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ濾過ユニット（ＮＭＷＬ：１００ｋＤａ）におけるＰＢＳでの反復洗浄により、約１００μＬの最終体積へさらに濃縮し、−８０℃での保存のために分注した。スモールスケールのＡＡＶ粗上清について、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１２ウェルプレート上にプレーティングし、その後、細胞密度が６０〜８０％コンフルエンシーに達した時、ＰＥＩを用いて、０．４μｇＡＡＶプラスミド、０．８μｇヘルパープラスミド、および０．４μｇ血清型２／１プラスミドをトランスフェクションした。１％Ｇｌｕｔａｍａｘおよび１０％ＦＢＳを追加したグルタミンを含まないＤＭＥＭにおいて、細胞を３日間、インキュベートした。ＡＡＶを含有する上清培地を収集し、０．４５μｍ酢酸セルロースＳｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター（Ｃｏｓｔａｒ）を通して濾過し、使用直前まで４℃で一時的に保存した。

インビトロおよびインビボでのＨｉＵＧＥ適用の試験。第１世代ＨｉＵＧＥシステムを試験するために、Ｃｒｅ依存性コンディショナルＣａｓ９発現マウス系統（Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ^{tm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh}マウス（Ｃａｓ９マウス））を用いた。これらのＣａｓ９マウスを用いて、初代ニューロン培養物を、ポリ−Ｌ−リジンコーティング化カバースリップ上に調製し、スモールスケールＡＡＶ上清組合せを形質導入した。形質導入のために、インビトロでの培養日数（ＤＩＶ）４〜６に、培地交換と共に、濾過された上清を初代培養物へ直接加えた（ウェルあたり１００〜２００μＬ）。培地交換に関連した毒性からニューロンを保護するために、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストＤ−ＡＰＶ（３３〜６６μＭ最終濃度）を加えた（Hogins et al., PLoS One. (2011) 6(9):e25633）。代替として、スモールスケールＡＡＶ上清の組合せを、ＤＩＶ１に初代培養物へ加え（この場合、Ｄ−ＡＰＶは必要ではない）、新生改変タンパク質の蓄積期間を延ばすために固定化の日まで、ニューロンと共にインキュベートした。定量的実験について、精製ＡＡＶを、培地中ウイルスごとの５×１０¹⁰ゲノムコピー／ｍＬの最終濃度で初代培養物に加えた。固定化の日（ＤＩＶ１１〜１４）において、細胞を、ＰＢＳ中４％ＰＦＡ＋４％スクロースで４℃、１５分間、処理し、ＨｉＵＧＥ媒介性ＫＩを検出するための免疫細胞化学法に用いた。定性的インビボ適用について、精製された高力価ＡＡＶを組み合わせ（ＧＳ−ｇＲＮＡとドナーペイロード、１：１ｖ／ｖ）、Ｃａｓ９マウス新生仔へ頭蓋内に注射した（半球あたり約２μＬ）。神経回路選択性適用について、成体Ｃａｓ９マウスは、精製ＡＡＶ２−レトロＧＳ−ｇＲＮＡウイルスの、特定の神経回路の軸索終末を含有する脳エリアへの定位注射を受け、一方、精製ＡＡＶ２／９ＨｉＵＧＥドナーウイルスの別個の注射を、投射ニューロン細胞体を含有する脳エリアへ送達した。注射から２〜３週間後、マウスを安楽死させ、脳を、ドライアイスで新鮮凍結するか、または経心的灌流後、ＨｉＵＧＥ媒介性ＫＩを検出するための免疫組織化学法のために単離した。

ＢｉｏＩＤ適用について、細胞を、固定化の前日、２０μＭビオチンで一晩、処理した。固定化の日（ＤＩＶ１１〜１４）において、細胞を、ＰＢＳ中４％ＰＦＡ＋４％スクロースで、４℃、１５分間、処理し、ＨｉＵＧＥ媒介性ノックインを検出するための免疫細胞化学法に用いた。インビボ試験について、精製ＡＡＶ組合せを、マウス新生仔へ脳室内に注射した。２週間後、マウスを屠殺し、脳を、新鮮凍結するか、または経心的灌流後、ＨｉＵＧＥ媒介性ノックインを検出するための免疫細胞化学法のために単離した。第２世代ＨｉＵＧＥシステムの試験について、同様の適用に関して、Ｃａｓ９マウスの代わりに、野生型マウスまたは他の一般的な細胞株由来の細胞を用いた。

ビルトイン式インテインスプリットＣａｓ９発現を有するＨｉＵＧＥベクターについて、ＷＴＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｐ０〜Ｐ２）または他の一般的な細胞株（ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＮＩＨ３Ｔ３）由来の初代培養物を用いた。類似した適用において上記のように、スモールスケールＡＡＶを用いて、初代ニューロンを形質導入した。さらに、これらのＨｉＵＧＥコンポーネントがまた、ヒトまたはマウス起源の一般的な細胞株において、ＡＡＶ形質導入よりむしろプラスミドトランスフェクションによって送達されるのに適していることを実証するために、ＨｉＵＧＥＧＳ−ｇＲＮＡおよびドナープラスミドを、製造会社のプロトコールに従ってＰＥＩＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ２４７６５）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＬ３０００００８）を用いて、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３Ｔ、またはＮＩＨ３Ｔ３細胞へ同時トランスフェクションした。ＨｉＵＧＥ媒介性ＫＩを検出するための免疫細胞化学法のためにトランスフェクションから２〜４日後、細胞を固定化した。インビボ試験について、精製された高力価ＡＡＶ（ＧＳ−ｇＲＮＡとドナーペイロード）を組み合わせ、その後、成体ＷＴマウスの特定脳エリアへ定位的に注射した。注射から２〜３週間後、マウスを安楽死させ、経心的に灌流した。脳を、ＨｉＵＧＥ媒介性ＫＩを検出するための免疫組織化学法のために単離した。

免疫組織化学法および免疫細胞化学法。免疫組織化学法（ＩＨＣ）について、新鮮凍結された検体と灌流された検体の両方を用いた。（たいてい、軸索起始部タンパク質と共に機能している時の）新鮮凍結された検体について、動物を安楽死させ、脳を迅速に単離し、クラッシュドライアイス上で凍結し、厚さ２０μｍで冠状に切片化して、スライドガラス上にマウントした（ＶＷＲ）。検体を、ＰＢＳ中４％ＰＦＡ＋４％スクロースで４℃、１５分間、固定した。その後、ＩＨＣを実施した。検体を、ブロッキングし、ＰＢＳ中０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ、ＳｉｇｍａＧ９０２３）を含有するブロッキングバッファーで室温、３０〜６０分間、透過処理し、一次抗体を、室温で２時間、または４℃で一晩、アプライした。蛍光二次抗体を、室温で３０〜６０分間、アプライし、ＤＡＰＩで対比染色した。（ほとんどの他のタンパク質と共に機能している時の）灌流された検体について、動物を安楽死させ、氷冷のヘパリン化ＰＢＳで、続いて、ＰＢＳ中４％ＰＦＡで、心臓内に灌流し、その後、４％ＰＦＡ中、４℃で一晩、後固定し、ＰＢＳ中３０％スクロース＋１０％グリセロールにおいて４℃で凍結保護した。脳を厚さ４０μｍで冠状に切片化した（浮遊）。同様のＩＨＣ手順を、上記のように行った。その後、検体を、スライドガラス上にＦｌｕｏｒＳａｖｅ媒体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共にマウントした。

免疫細胞化学法（ＩＣＣ）について、細胞を、ＰＢＳ中４％ＰＦＡ＋４％スクロースで４℃、１５分間、固定し、その後、ＰＢＳ中０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、５％ＮＧＳを含有するブロッキングバッファーで室温、３０〜６０分間、ブロッキングおよび透過処理した。一次抗体を、室温で２時間、または４℃で一晩、アプライした。蛍光二次抗体を、室温で３０〜６０分間、アプライし、ＤＡＰＩで対比染色した。その後、カバースリップをＦｌｕｏｒＳａｖｅ媒体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共にスライドガラスへマウントした。

この研究に用いられた一次抗体を、以下の通り、丸括弧で示された希釈度と共に列挙した：ラット抗ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ／Ｓｉｇｍａ１１８６７４２３００１、１：１０００）、ウサギ抗Ｍｙｃ（ＳａｎｔａＣｒｕｚｓｃ−７８９、１：２５０）、マウス抗Ｖ５（ＴｈｅｒｍｏＲ９６０−２５、１：５００）、ニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍａｂ１３９７０、１：２０００）、ウサギ抗ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｂｃａｍａｂ１６７４５３、１：１０００）、ウサギ抗Ｍａｐ２（ＳｙｎａｐｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ１８８００２、１：５０００）。この研究に用いられた追加の一次抗体は、マウス抗アンキリンＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚｓｃ−１２７１９、１：２５０）およびモルモット抗ＶＧＡＴ（ＳｙｎａｐｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ１３１００４、１：２０００）であった。この研究に用いられたフルオロフォア連結型二次抗体または試薬を、以下の通り、列挙した：ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ５６８（ＴｈｅｒｍｏＡ１１０７７１：１０００）、ロバ抗ウサギＡｌｅｘａ６４７（ＴｈｅｒｍｏＡ３１５７３、１：１０００）、ロバ抗マウスＡｌｅｘａ６４７（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ７１５−６０５−１５０、１：１０００）、ヤギ抗ニワトリＡｌｅｘａ４８８（ＴｈｅｒｍｏＡ１１０３９１：１０００）、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ４０５（ＴｈｅｒｍｏＡ３１５５３１：１０００）、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ５５５（ＴｈｅｒｍｏＡ２１４２８、１：１０００）、ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ６４７（ＴｈｅｒｍｏＡ２１２４７、１：１０００）、ストレプトアビジンＡｌｅｘａ６４７（ＴｈｅｒｍｏＳ３２３５７、１：１０００）。この研究に用いられた追加のフルオロフォア連結型二次抗体または試薬を、以下の通り、列挙した：ロバ抗ラットＡｌｅｘａ４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＡ２１２０８、１：１０００）、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ５６８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＡ１１０３６、１：１０００）、ロバ抗モルモットＡｌｅｘａ６４７（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ７０６−６０５−１４８、１：１０００）、ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ５９４（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ１１２−５８５−１６７、１：１０００）、およびヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６４７（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ１１５−６０５−１６６、１：１０００）。

顕微鏡画像を、Ｚｅｉｓｓ７１０もしくはＺｅｉｓｓ８８０倒立共焦点顕微鏡、またはＡｐｏｔｏｍｅ２．０モジュールを備えたＺｅｉｓｓＩｍａｇｅｒＭ２正立顕微鏡を用いて取得した。各画像の最適なダイナミックレンジについて露光を手作業で調整した。対照条件との実験的比較が必要な場合、同じ露光パラメータを、全ての検体コホートに渡って用いた。必要な場合、タイリングおよびｚスタックを実施した。輝度、コントラスト、およびガンマ補正を、ＦＩＪＩまたはＺｅｉｓｓＺｅｎを用いて、各チャネルについて調整した。対照条件に対する比較が必要な場合、同一の露光および調整パラメータを、コホートに渡って用いた。ライブイメージングを、Ｚｅｉｓｓ７１０顕微鏡上で、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーションしながら実施した。ｚ−スタックされた画像の時系列を、１００秒間ごとに取得し、その後、ビデオクリップとしてＦＩＪＩにおいて６ｆｐｓで処理およびエクスポートし、続いて、ＡｄｏｂｅＡｆｔｅｒＥｆｆｅｃｔｓにおいてアノテーションした。全ての画像を、各パネルに示された色割り当てでの提示のために疑似カラーで彩色した。

標的配列：表４は、以下の実施例に用いられた標的配列の、完全には網羅されていないリストを示す。

初代マウス海馬および皮質ニューロン／グリア培養物。初代ニューロン／グリア培養物は、Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ^{tm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh}またはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）新生仔（Ｐ０〜Ｐ２）に由来した。以前に記載された方法（Uezu et al., 2016）に従って初代培養を実施した。簡単に述べれば、安楽死後、脳を迅速に収集し、海馬または皮質を単離した。細胞を、パパイン消化（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）後、ファイヤーポリッシュされたガラスピペットで穏やかに解離させ、ポリ−Ｌ−リジン（ＳｉｇｍａＰ２６３６）コーティング化表面上に１ｃｍ²あたり約１００，０００個の細胞（画像化用、海馬細胞）または１ｃｍ²あたり約３００，０００個の細胞（ＤＮＡ／タンパク質調製用、皮質細胞）の密度でプレーティングした。その後、２％Ｂ２７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ１７５０４０４４）および１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ３５０５００６１）を追加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌＡ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ１０８８８０２２）中、３７℃、５％ＣＯ₂で細胞を維持した。必要な場合、ＤＩＶ４〜６の間、培地交換と共にシトシンアラビノシド（ＳｉｇｍａＣ１７６８、５ｕＭ最終濃度）を加えることにより、グリア増殖を阻害した。

ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞株の細胞培養。この研究に用いられた細胞株は、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣＣＲＬ−１１２６８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ−２）、およびＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５８）を含む。全ての細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（ＳｉｇｍａＦ４１３５）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ１５１４０１２２）を追加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ１１９６５−０９２）中、３７℃、５％ＣＯ₂で維持し、約９５％コンフルエンシーに達した時、トリプシン／ＥＤＴＡ消化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ２５２０００５６）により継代した。

定位注射。定位注射について、成体マウスを、１．５％イソフルオランガスの吸入により麻酔し、定位フレーム（ＫｏｐｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に置いた。炎症を低減するために、手術の開始前、マウスに皮下にメロキシカム（約１０μＬ／２５ｇ）を投与した。ラムダ状縫合と十字縫合が同じ背腹面にあることを確認した後、ＡｌｌｅｎＭｏｕｓｅＢｒａｉｎＡｔｌａｓ（Lein et al., 2007）を参照して、運動皮質（０．５Ａ／Ｐ、０．６〜１．０Ｌ、１．２Ｖ）、線条体（０．５Ａ／Ｐ、２．０Ｌ、３．２Ｖ）、視床（−１．７Ａ／Ｐ、１．２Ｌ、３．４Ｖ）、後部体性感覚皮質（−１．７Ａ／Ｐ、３．５Ｌ、１．２Ｖ）、または背側海馬（−１．６Ａ／Ｐ、２．２Ｌ、１．３Ｖ）のいずれかの上を高速ドリル（ＦｏｒｅｄｏｍＭＨ−１７０）で開頭した。精密圧力注入システム（ＤｒｕｍｍｏｎｄＮａｎｏｊｅｃｔ）を用いて、ウイルスを充填されたガラスピペットを、所望の深さまで下げ、わずかに引き戻し（約０．２ｍｍ）、少量のウイルスを約１０分間に渡って注射した（２０秒間ごとに１８〜３２ｎＬの３０回の注射）。ピペット引き戻し中にウイルスの流出を防ぐためにさらに５〜１０分間、待った後、ガラスピペットを脳から引き戻し、開頭術の上の皮膚を縫合して閉じた。切口へ数滴の表面麻酔剤（ブピバカイン）を塗布し、鎮痛剤（ブプレノルフィン、約２５μＬ／２５ｇ）を皮下に投与した後、マウスを、太陽灯の下、２０〜３０分間、回復させ、その後、ホームケージへ入れた。

ウェスタンブロット。プロテイナーゼインヒビターカクテルを追加した氷冷ＲＩＰＡバッファー中に細胞を収集し、超音波処理した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ方法により決定し、等量のタンパク質を、サンプルバッファー中、９５℃で５分間、加熱し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ電気泳動のためにロードし、その後、ニトロセルロース膜へ転写した。ブロッキングバッファー（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）におけるブロッキング後、ＨＡエピトープ（一次：ラット抗ＨＡ、Ｒｏｃｈｅ／Ｓｉｇｍａ１１８６７４２３００１、１：２０００；二次：ＩＲＤｙｅ８００ＣＷヤギ抗ラット、１：１０，０００）およびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（一次：ウサギ抗ＧＡＰＤＨ、Ａｂｃａｍａｂ９４８５、１：５０００；二次：ＩＲＤｙｅ６８０ＲＤヤギ抗ウサギ、１：１０，０００）について膜を連続的にプローブした。一次抗体と二次抗体のどちらも、室温で１時間、インキュベートした。免疫蛍光シグナルをＯｄｙｓｓｅｙＦＣｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ）で検出した。免疫沈降（ＩＰ）濃縮化ウェスタンブロットについて、等量のインプット（３００μｇ）を、３０μＬマウス抗ＨＡビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ２６１８１）と混合し、ｎｕｔａｔｏｒ上で４℃、一晩、インキュベートした。ＲＩＰＡバッファーでの洗浄後、タンパク質を、８０μＬサンプルバッファー中、９５℃で５分間、煮沸することにより溶出した。溶出されたＩＰ−試料の等量およびインプット試料の等量を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにロードし、その後、ニトロセルロース膜へ転写した。ＩＰ膜を、ＨＡエピトープ（一次：ＳｉｇｍａＨ６９０８、１：２０００；二次：ＩＲＤｙｅ８００ＣＷヤギ抗ウサギ、１：１０，０００）について連続的にプローブし、インプット膜をハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（一次：Ａｂｃａｍａｂ９４８５、１：５０００；二次：ＩＲＤｙｅ６８０ＲＤヤギ抗ウサギ、１：１０，０００）についてプローブした。一次抗体と二次抗体のどちらも、ＣａｎＧｅｔＳｉｇｎａｌ溶液（ＴＯＹＯＢＯＮＫＢ−１０１Ｔ）中、室温で１時間、インキュベートした。免疫蛍光シグナルをＯｄｙｓｓｅｙＦＣｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ）で検出した。

ゲノムＰＣＲ、ＴＯＰＯクローニング、およびＤＮＡシーケンシング。ＨｉＵＧＥ編集後、初代ニューロンからゲノムＤＮＡを、ＭｙＴａｑＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ−ＰＣＲキット（ＢｉｏｌｉｎｅＢＩＯ−２１１２７）またはＰｕｒｅＬｉｎｋＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＫ１８２００１）により抽出した。二重配向ＨＡエピトープペイロードの挿入を検出するために、表１に示されたプライマーを用いて、ＭｙＴａｑＨＳポリメラーゼ（ＢｉｏｌｉｎｅＢＩＯ−２５０４５またはＢＩＯ−２５０４７）を用いるゲノムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。編集されたゲノム座位を増幅し、かつフォワード対リバースのペイロード組込みを区別するために、編集された座位の上流の内因性ゲノム配列に特異的なプライマーを、配向選択的ＨＡエピトープペイロードプライマーとペアにした。ＰＣＲ産物を、ゲル精製（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＧｅｌおよびＰＣＲＣｌｅａｎ−ｕｐキット、ＭａｃｈｅｒｅｙＮａｇｅｌ７４０６０９）、および一般的なＭ１３Ｆ（−２１）プライマー（ＥｔｏｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いるシーケンシングのためのＴＯＰＯクローン化（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＫ４５７５０１）により、単離した。インデル推定について、ＨｉＵＧＥ媒介性ＨＡエピトープＫＩ後、３連のニューロン試料からゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＰＣＲを上記のように実施した。ＰＣＲ産物を、クリーンアップし（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＧｅｌおよびＰＣＲＣｌｅａｎ−ｕｐキット、ＭａｃｈｅｒｅｙＮａｇｅｌ７４０６０９）、３つの独立したプールへと組み合わせ、ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）においてＤｕｋｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄＧｅｎｏｍｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳｈａｒｅｄＲｅｓｏｕｒｃｅによりディープシーケンシングした。

定量的および統計的解析。ｍＴｕｂｂ３へのＣ末端ＨＡエピトープＫＩの免疫蛍光定量化について、実験群について知らされていない実験者により、顕微鏡画像が、コホートに渡って同一の露光パラメータを用いて、取得された。実験群あたり３つのカバースリップが用いられ、ランダムな位置におけるカバースリップあたり、３つの顕微鏡画像が取得された。画像のＨＡ免疫蛍光強度は、自動バックグラウンド引き算後、ＦＩＪＩにより定量化された。画像の総細胞数は、ＦＩＪＩにおけるＤＡＰＩ蛍光の粒子分析により推定された。細胞数に対する平均ＨＡ免疫反応性の比が計算され、その後、陰性群（ウイルス添加なし）および陽性群（ｍＴｕｂｂ３ＧＳ−ｇＲＮＡプラスＨｉＵＧＥドナーＯＲＦ＋１）に対する０〜１００の任意単位（ａ．ｕ．）のスケールで標準化された。標準化された比を、「平均蛍光強度」と定義した。定量化結果に関しては、カバースリップごとに平均値を出し、データ点（ｎ＝３カバースリップ）として報告した。ＡＩＳタンパク質標的へのＣ−ｔｅｒｍＨＡエピトープＫＩの免疫蛍光定量化について、実験群について知らされていない実験者により、顕微鏡画像が、コホートに渡って同一の露光パラメータを用いて、取得された。実験群あたり３つのカバースリップが用いられ、ランダムな位置におけるカバースリップあたり、３つの顕微鏡画像が取得された。ＨＡエピトープ免疫蛍光が陽性であるＡＩＳ構造の数およびＡｎｋ−Ｇ陽性ＡＩＳの総数を手作業でカウントし、その後、解析のためにパーセンテージへ変換した。定量化結果は、カバースリップごとに平均値を出され、データ点（ｎ＝３カバースリップ）として報告された。誤差バーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。ペアワイズ差を検出するために、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後、事後Ｔｕｋｅｙ−ＫｒａｍｅｒＨＳＤを、ＪＭＰＰｒｏ（ｖ１３、ＳＡＳ）において実施し、有意水準を０．０５に設定した。

編集された接合部におけるインデル率の定量的推定は、ＤｕｋｅＧｅｎｏｍｉｃＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＳｈａｒｅｄＲｅｓｏｕｒｃｅにより実施された。Ｃｕｔａｄａｐｔ（Ｍａｒｔｉｎ、２０１１）（ｖ１．１８）を採用するＴｒｉｍＧａｌｏｒｅＴｏｏｌｋｉｔ（ｖ０．５．０、ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅにおいて入手可能）を用いて、生のシングルエンドリード配列からアダプターおよび品質の悪い配列をトリミングした。生のリードの品質を、ＴｒｉｍＧａｌｏｒｅからのＦａｓｔＱＣ（ｖ０．１１．５、ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃで入手可能）アウトプットを調べることにより検証した。組込み（フォワードおよびリバース）組合せによる遺伝子のそれぞれについての単位複製配列を含有する参照ＦＡＳＴＡファイルを準備し、それは、合計１０個の配列を含んでいた。デフォルトパラメータでのｂｗａ−ｍｅｍ（Li and Durbin, 2009）（ｖ０．７．１７）を用いて、参照ＦＡＳＴＡファイルに対して品質トリミング化リードをアライメントし、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（Li et al., 2009）（ｖ１．９）を用いて、後処理した。カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて、補足アライメント（０×８００）フラグを有するアライメントされたリードについてＳＡＭファイルをフィルターにかけ、および組込み部位の重複を有するリードについてフィルターにかけた。具体的には、リードの開始アライメント位置を用いて、そのリードが組込み部位の少なくとも３０ｂｐ下流から開始したことを検証し、ｃｉｇａｒ列をパースして、リードが、組込み部位（組込み部位位置は各遺伝子によって異なる）から３０ｂｐ上流を過ぎて伸びていることを検証した。累積リードカウントについて、その後、ＳＡＭファイルを、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いてパースし、インデルを含有する各リードを数えた。位置リードカウントについて、Ｐｉｃａｒｄ（ＵＲＬ：ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄで入手可能）を用いて、リード群情報を追加し、ｂａｍファイルにインデックスを付けた。その後、インデルをＧＡＴＫＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ（McKenna et al., 2010）（ｖ３．８−１−０−ｇｆ１５ｃ１ｃ３ｅｆ）を用いてコールした。全てのリードに関してインデルをコールするために、いくつかのパラメータを、デフォルト（ｍｉｎ＿ｍａｐｐｉｎｇ＿ｑｕａｌｉｔｙ＿ｓｃｏｒｅ＝０；ｍｉｎ＿ｂａｓｅ＿ｑｕａｌｉｔｙ＿ｓｃｏｒｅ＝０、ｍａｘ＿ａｌｔｅｒｎａｔｅ＿ａｌｌｅｌｅｓ＝５０、ｏｕｔｐｕｔ＿ｍｏｄｅ＝ＥＭＩＴ＿ＡＬＬ＿ＳＩＴＥＳ、ｅｍｉｔＲｅｆＣｏｎｆｉｄｅｎｃｅ＝ＢＰ＿ＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮ）から改変した。その後、生じたＶＣＦファイルを、一塩基多型を有するいかなる部位も排除するように、および挿入または欠失を含有する各部位におけるリードの数をカウントするようにフィルターにかけた。全ての解析について、３つのプールのそれぞれを、位置データと累積データの両方について平均値および平均値の標準誤差の計算まで、独立に処理した。

（実施例２）
ＨｉＵＧＥベクター認識配列ルール
図３Ａは、図３Ａについての凡例を示す図３Ｂと共に、ドナー認識配列（ＤＲＳ）使用シナリオおよびその対応する、ＤＲＳ配列を支配するルールの適用性の例の図を示す。図３Ａにおいて、ＨｉＵＧＥベクターは、各パネルの下部に環状プラスミドとして表されている。ドナー認識配列（ＤＲＳ）の配向は、挿入断片に対するＣａｓ９切断部位の配向により表されている（フォワード配向は上部パネル、リバース配向は下部パネル）。ドナーベクター切断後、関心対象となる標的ゲノム遺伝子（ＧＯＩ）へ挿入されるべき外来配列（ペイロード）は、各パネルにおいて線状カセットとして表されている。各シナリオにおいてＤＲＳのルールを決定するための本文で言及された配列は、濃い色の破線で取り囲まれている。

図３Ｃは、５個の例示的なＤＲＳ配列のリストを示す。各例示的なＤＲＳ配列についての対応するＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡ（ＨＤ−ｇＲＮＡ）の標的ゲノム（マウスＭＭ１０ゲノムアセンブリ）に対する特異性は、オンラインｇＲＮＡ評価ツール「Ｃｒｉｓｐｏｒ」により予測された。これらのＨＤ−ｇＲＮＡの高特異性スコアは、それらがゲノム切断を誘導する見込みの低さを示す。チェックのマークは、特定の使用シナリオおよびＯＲＦについてのＤＲＳの適合性を示す。ドットは、ＤＲＳが特定の使用シナリオおよびＯＲＦについての基準を満たさないことを示す。

図３Ｄ〜３Ｇは、Ｃａｓ９発現マウスに由来した培養海馬ニューロンにおけるマウスＴｕｂｂ３遺伝子へのＨｉＵＧＥ媒介性ＨＡ抗体エピトープノックインのための５つの例示的なＤＲＳのインビトロ試験のＨＡ抗体免疫染色による代表的な画像を示す。５つの例示的なＤＲＳ配列で構築された５つ全てのＨｉＵＧＥベクターは、Ｔｕｂｂ３ＧＳ−ｇＲＮＡベクターとペアになった時、ＨＡエピトープＫＩを誘導するのに成功した（図３Ｄおよび３Ｅにおける上の行のパネル）。ドナーベクターが空のＧＳ−ｇＲＮＡバックボーンベクターとペアになった場合の対照実験（下の行）は、ＨＡ免疫反応性が陰性であった。図３Ｆおよび３Ｇは、図３Ｄおよび３Ｅ、それぞれにおける各対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（３’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示し、各パネルにおいて類似した細胞密度を実証している。スケールバーは各パネルに示されている。

（実施例３）
ＨｉＵＧＥ概念および特異性
図４Ａは、インビトロでの二方向性ＨＡエピトープノックイン（ＫＩ）へのＨｉＵＧＥ適用の例の概略図を示す。Ｃａｓ９マウス由来の初代海馬細胞に、ＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶベクターとＨｉＵＧＥドナーＡＡＶベクターの組合せを、インビトロでの培養日数（ＤＩＶ）４〜６の間に形質導入した。ＨＡエピトープＫＩを検出するための免疫細胞化学法のためにＤＩＶ１１後、細胞を固定した。図４Ｂは、微小管標識を示す、マウスＴｕｂｂ３（ｍＴｕｂｂ３）遺伝子へのＨＡエピトープＫＩを示す免疫染色の代表的な画像を示す。図４Ｂは、ＨｉＵＧＥ編集後のＨＡエピトープ標識βＩＩＩ−チューブリンの特徴的な微小管発現パターンを示す。Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰのＧＦＰ染色およびＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）での核染色もまた示されている。感染からおよそ１週間後、ＨＡの免疫蛍光検出は、内因性βＩＩＩ−チューブリンのＨＡエピトープ標識の成功を示し、微小管に特異的な局在化特性を示した（図４Ｂ）。図４Ｄは、ゲノム組込み座位がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離されたことを示す。ＰＣＲ産物を、シーケンシングのために、単離して、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターへクローニングした。フォワードまたはリバースの両方の配向における正しいＨＡエピトープ組込みを実証する代表的なシーケンシング結果が示されている。ゲノムｍＴｕｂｂ３、ＤＲＳ、またはＨＡカセットを含有する配列の領域は上に示されている。枠で囲まれた配列は、図４Ｄの終止コドンカセットを表す。

原理証明実験として、マウスＴｕｂｂ３（ｍＴｕｂｂ３）遺伝子をターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡおよび二重配向ＨＡエピトープＨｉＵＧＥドナーのスモールスケールＡＡＶを用いて、コンディショナルＣａｓ９マウスの新生仔から調製された初代ニューロンを同時形質導入した。ＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶは、同時に、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現して、コンディショナルＣａｓ９−２Ａ−ＧＦＰ発現を誘導する。感染からおよそ１週間後、ＨＡの免疫蛍光検出は、内因性βＩＩＩ−チューブリンのＨＡエピトープ標識の成功を示し、微小管に特異的な局在化特性を示した（図４Ｂ）。図４Ｂは、ＨｉＵＧＥ編集後のＨＡエピトープ標識βＩＩＩ−チューブリンの特徴的な微小管発現パターンを示す。ＨＡエピトープのウェスタンブロット検出は、βＩＩＩ−チューブリンの予想された分子量と一致した、単一のバンド（約５１ｋＤ）を示した（図４Ｃ）。

図４Ｅは、アウトオブフレームのドナー（ＯＲＦ＋０またはＯＲＦ＋２）に対して、正しいＯＲＦドナーベクター（ＯＲＦ＋１）とペアになった時の高効率標識を実証するための、ベクターの異なる組合せを形質導入された初代ニューロンのＨＡ免疫染色の代表的な画像を示す。追加の陰性対照（ドナーベクターＯＲＦ＋１単独、ｍＴｕｂｂ３ｇＲＮＡベクター単独、ドナーＯＲＦ＋１ベクターと共の空のｇＲＮＡベクター）は、ＨＡエピトープ標識のためのＧＳ−ｇＲＮＡとドナーベクターのペア形成の必要性を実証した。注意：マウスＴｕｂｂ３ＧＳ−ｇＲＮＡベクター（ＯＲＦ＋１）が間違ったＯＲＦ（ＯＲＦ＋０またはＯＲＦ＋２）でのドナーベクターとペアになった時、おそらくフレームシフトするインデル事象のせいで、限られたＨＡ陽性細胞が同定された。図４Ｆは、図４Ｅにおける各対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示し、各パネルにおいて類似した細胞密度を実証している。スケールバーは各パネルに示されている。

相対的免疫蛍光強度は、これらの条件に渡って定量化され、正しいＯＲＦペア形成が、全ての他の条件と比較して、有意により効率的であることを示した（図４Ｇ）。さらに、３つ全てのＯＲＦについてのドナーベクターがＨｉＵＧＥを等しく促進する能力があることを実証するために、ＯＲＦごとに１つ、３つのＧＳ−ｇＲＮＡを、マウスＭａｐ２遺伝子をターゲティングするようにデザインした。これらのＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶを、それらの対応するＯＲＦでのＨＡエピトープドナーＡＡＶとペアにすることが、同等かつ効率的な標識を生じた（図４Ｈ〜４Ｉ）。これらのデータは、ＧＯＩとは無関係な自律的ＨｉＵＧＥドナーベクターを用いて、内因性タンパク質を標識するために、ペイロード配列が切除され、標的ゲノムへ挿入され得ることを確認した。

（実施例４）
多様なゲノムおよびタンパク質標的に渡るＨｉＵＧＥ適用
図５Ａは、１２個の異なるタンパク質へのカルボキシ末端二方向性ＨＡエピトープノックイン（ＫＩ）へのＨｉＵＧＥのスケールアップされた適用の例の概略図を示す。Ｃａｓ９発現マウス由来の初代海馬細胞に、ＤＩＶ４〜５において、ＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶベクターおよびＨｉＵＧＥドナーＡＡＶベクターの組合せを形質導入した。ＨＡエピトープＫＩを検出するための免疫細胞化学法のためにＤＩＶ１１後、細胞を固定し、代表的な画像は、図５Ｂ〜５Ｍに示されている。図５Ｂ〜５Ｃは、微小管へ局在化されたタンパク質をコードする、マウスＴｕｂｂ３遺伝子（図５Ｂ）およびマウスＭａｐ２遺伝子（図５Ｃ）のＨＡエピトープＫＩを示す。図５Ｄは、核局在化ＭｅＣＰ２タンパク質をコードする、マウスＭｅＣＰ２遺伝子のＨＡエピトープＫＩを示す（挿入図は、枠で囲まれた領域のより高い倍率表示である）。図５Ｅは、軸索起始部（ＡＩＳ）に濃縮されている神経細胞接着分子をコードするマウスＮｒｃａｍ遺伝子のＨＡエピトープＫＩを示す。図５Ｆは、ニューロン樹状突起棘内に濃縮されているアクチン関連タンパク質２をコードするマウスＡｃｔｒ２遺伝子のＨＡエピトープＫＩを示す。図５Ｇは、小胞クラスリン依存性タンパク質輸送の部位に濃縮されたクラスリンタンパク質をコードするマウスＣｌｔａ遺伝子のＨＡエピトープＫＩを示す。図５Ｈ〜５Ｊは、ニューロンのＡＩＳ内に濃縮されたアンキリン、βＩＶ−スペクトリン、およびＮａＶ１．２ナトリウムチャネルサブタイプタンパク質をコードする、マウスＡｎｋ３遺伝子（図５Ｈ）、マウスＳｐｔｂｎ４遺伝子（図５Ｉ）、およびマウスＳｃｎ２ａ遺伝子（図５Ｊ）のＨＡエピトープＫＩを示す。図５Ｋは、グリアにおいて選択的に発現したグリア酸性線維性タンパク質をコードするマウスＧＦＡＰ遺伝子のＨＡエピトープＫＩを示す。図５Ｌは、ミトコンドリア局在化ピルビン酸デヒドロゲナーゼタンパク質をコードするマウスＰｄｈａ１遺伝子のＨＡエピトープＫＩを示す。図５Ｍは、微小管結合タンパク質ダブルコルチンをコードするマウスＤｃｘ遺伝子のＨＡエピトープＫＩを示す。スケールバーは、各パネルに示されている。挿入図内のスケールバーは２μｍを表す。矢じり形は、樹状突起棘（図５Ｆ）、ミトコンドリア（図５Ｌ）、または神経突起の遠位端（図５Ｍ）などの、関心対象となる遺伝子に関連した細胞内フィーチャーを示す。

ペイロード組込みを確認し、かつインデル率を推定するために、５つの標的について、編集された接合部の周囲の領域を増幅するようにゲノムＰＣＲを実施した。二重配向ＨＡエピトープ組込みは、陽性ＰＣＲ結果（図１６Ａ〜１６Ｂ）により確認され、単位複製配列のディープシーケンシングにより、フォワードかまたはリバースのいずれかのペイロード挿入後の位置的インデル発生率および継ぎ目のない編集の推定割合が明らかにされた（図１６Ｃ〜１６Ｄ）。また、いくつかのＡＩＳ特異的標的について、各ニューロンは典型的には１つのＡＩＳだけを有し、かつそれらの弁別的な発現パターンは簡単な目視による同定および定量化に適しているため、Ｃ末端エピトープ編集の効率を推定した。（ＡＩＳマーカーアンキリン−Ｇに対する抗体で染色された）全てのＡＩＳと比較したＨｉＵＧＥ標識ＡＩＳ構造の比率を定量化し（図１８Ａ〜１８Ｃ）、異なるウイルス用量における細胞標識の推定効率を示した。さらに、最近発見された抑制性シナプス後肥厚（ｉＰＳＤ）プロテオーム（Uezu et al., 2016）のいくつかのメンバーを可視化するためのＣ末端におけるＨｉＵＧＥ媒介性内因性タンパク質標識を、低発現タンパク質に適した抗原性増強を示すスパゲティモンスターＨＡ（ｓｍＦＰ−ＨＡ）（Viswanathan et al., 2015）などのより大きい挿入断片を用いて、試験した（図１５Ａ）。これらの新規のｉＰＳＤタンパク質は、抑制性シナプスタンパク質１（Ｉｎｓｙｎ１）、抑制性シナプスタンパク質２（Ｉｎｓｙｎ２）、およびＲｈｏＧＴＰアーゼ活性化タンパク質３２（Ａｒｈｇａｐ３２）を含んだ。これらの標識タンパク質の免疫検出により、それらが、小胞ＧＡＢＡ輸送体（ＶＧＡＴ）に隣接して局在化していることが実証され（図１５Ｂ〜１５Ｄ）、抑制性シナプスにおけるそれらの存在が確認された。最後に、３つの異なるＧＳ−ｇＲＮＡ（表１）を、並行して、Ｉｎｓｙｎ１について試験し、それらの全部が、良好かつ同等の抑制性シナプス標識を生じ（図１７Ｂ〜１７Ｄ）、ＧＳ−ｇＲＮＡ選択の柔軟性および標識方法のロバストネスが実証された。これらのデータは、様々な挿入断片サイズの単一ＨｉＵＧＥドナーベクターが、十分特徴づけられたまたは新しく発見されたタンパク質の簡単かつよりハイスループットの局在化のために複数の内因性タンパク質を効果的に修飾することができることを立証している。

次に、発現を複数の異なるタンパク質に渡るＮ−ｔｅｒｍへ限定するために上流終止コドンカセットを有する単一のＭｙｃエピトープペイロードを用いて、アミノ末端（Ｎ−ｔｅｒｍ）修飾を試験した（図１５Ａ）。３つのタンパク質のＮ−ｔｅｒｍをターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡを試験し、アクチン細胞骨格（β−アクチン、Ａｃｔｂ）、核エンベロープ（ＬａｍｉｎＢ１、Ｌｍｎｂ１）、およびニューロフィラメント（Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔｍｅｄｉｕｍ、Ｎｅｆｍ）のタンパク質を含んだ。標的のそれぞれについて、タンパク質局在化と一致したＭｙｃエピトープ免疫標識が、観察された（図１５Ｅ〜１５Ｇ）。二重標識の可能性を、このＮ−ｔｅｒｍ選択性Ｍｙｃエピトープペイロードを、Ｃ−ｔｅｒｍにおける発現を強制するエピトープタグの後に終止コドンカセットを含有する上記のＨＡエピトープＨｉＵＧＥペイロードと組み合わせることにより検討した（図１１Ａ）。この構築物を用いて、２つの異なるタンパク質のＮ−ｔｅｒｍまたはＣ−ｔｅｒｍを示差的にターゲティングすることにより、２つの異なる標的の二重標識を達成することができる。Ｎ−ｔｅｒｍＨｉＵＧＥドナーベクター内の終止コドンカセットは、Ｃ−ｔｅｒｍへの組込みの事象において、翻訳がＭｙｃエピトープの上流で終結することを保証し、それに従って、このペイロードはＮ−ｔｅｒｍ発現に選択的である。これらのドナーを、樹状突起ＭＡＰ２（Ｍａｐ２）のＮ−ｔｅｒｍおよびＡＩＳ濃縮化βＩＶ−スペクトリン（Ｓｐｔｂｎ４）のＣ−ｔｅｒｍをターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶと同時感染させた。単一ニューロンにおける同時染色の実例に関して、ＨＡエピトープおよびＭｙｃエピトープについての同時染色により、各タンパク質への選択的標識が明らかにされた（図１１Ｂ）。したがって、ＨｉＵＧＥＮ−ｔｅｒｍおよびＣ−ｔｅｒｍ選択的ペイロードは、２つの内因性タンパク質の空間的関係を明らかにするためにタンパク質を同時に共標識するのに用いることができる。

まとめると、内因性タンパク質局在化をマッピングするために、単純なオリゴヌクレオチドライゲーションによって迅速に構築されたＧＳ−ｇＲＮＡライブラリーを用いて、ＨｉＵＧＥは、ユニバーサルペイロードを多様なタンパク質コード領域へ高特異性かつよりハイスループットの様式で組み込む。したがって、ＨｉＵＧＥは、ラージスケールプロテオミクスまたは遺伝子発現研究後の事後局在化分析を含むニューロンタンパク質の迅速かつロバストな標識に適している。

ペイロード組込みおよび推定インデル率を確認するためのゲノムＰＣＲおよびディープシーケンシング。接合部において挿入も欠失もなしの、ゲノム部位への正しい挿入の頻度を示すために、次世代シーケンシングを実施した。図１６Ａは、様々なゲノム座位への二重配向ＨＡエピトープペイロード組込みを検出するためのゲノムＰＣＲの概略設計を示す。ＨｉＵＧＥ編集ありかまたはなしのいずれかでの初代ニューロン培養物からゲノムＤＮＡを抽出した。フォワードペイロード組込み事象に特異的なリバースプライマーか、またはリバースペイロード組込み事象に特異的なリバースプライマーかのいずれかとペアになった、５つの遺伝子（マウスＭａｐ２、Ａｃｔｒ２、Ｃｌｔａ、Ｓｐｔｂｎ４、およびＳｃｎ２ａ）の上流ゲノムフォワードプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を実施した。図１６Ｂは、フォワードペイロード組込みとリバースペイロード組込みの両方についての挿入断片特異的ＰＣＲが、陰性対照（編集なし）におけるバンドなしと比較して、編集された試料において陽性バンド（約１５０〜２００ｂｐ）を示したことを示している。図１６Ｃ〜１６Ｄは、フォワードペイロード組込みかまたはリバースペイロード組込みのいずれかのＰＣＲ産物をディープシーケンシングすることによるインデル頻度の分析を示す。ｘ軸上の値は、ＧＡＴＫＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒによりコールされたインデルの開始位置を表示し、その位置のすぐ後に挿入されたまたは欠失した配列が続く。インデル位置の検出（ｉ〜ｖ）は、たいていのインデル事象が、編集された接合部（ｘ軸上の０により表示、赤色の線）と直接隣接して開始されることを示した。インデルなしのリードの割合もまたプロットされ（ｖｉ）、両方の配向における５つの遺伝子に渡る継ぎ目のないペイロード組込みの推定頻度を示している。

図１８Ａ〜１８Ｃは、ＨｉＵＧＥを用いる細胞標識効率の定量化を示す。図１８Ａは、初代ニューロンにおける高いＡＡＶ濃度（ウイルスごとに２．５×１０¹¹ＧＣ／ｍＬ）下でのマウスＳｐｔｂｎ４およびＳｃｎ２ａへのＣ−ｔｅｒｍＨＡエピトープＫＩによるＡＩＳタンパク質βＩＶ−スペクトリンおよびＮａＶ１．２のＨｉＵＧＥ標識の代表的な画像を示す。ＡＩＳマーカーアンキリン−Ｇ（Ａｎｋ−Ｇ）に対する抗体での免疫蛍光染色もまた示されている。ＡＩＳマーカーアンキリン−Ｇ（Ａｎｋ−Ｇ）に対する抗体での免疫蛍光染色もまた示されている。陰性対照（空のＧＳ−ｇＲＮＡバックボーン＋Ｍｙｃエピトープドナー）は、ＨｉＵＧＥ標識ＡＩＳを示さなかった。図１８Ｂは、１：１ウイルス比（ＧＳ−ｇＲＮＡ：ドナー）下でのいくつかのＡＡＶ濃度に渡る細胞標識の推定効率を示す定量化結果を示す。効率的な標識（＞２０％）が、ウイルスごとの５×１０¹⁰ＧＣ／ｍＬまたはそれ以上の用量において達成された。図１８Ｃは、１×１０¹¹ＧＣ／ｍＬの組み合わされたウイルス濃度下でＡＡＶのいくつかの比（ＧＳ−ｇＲＮＡ：ドナー）に渡る細胞標識の推定効率を示す定量化結果を示す。１：９、１：３、１：１、および３：１の比率は、標識効率の有意差を示さず、ＨｉＵＧＥ標識について許容できるウイルス比の幅広い範囲を示唆した。しかしながら、９：１比が、１：１比と比較して有意により低い標識効率を示し（ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後、Ｔｕｋｅｙ−ＫｒａｍｅｒＨＳＤ事後検定、ｎ＝３）、十分なドナーＡＡＶが効率的なＨｉＵＧＥ編集に必要とされることを示唆した。

図１９Ａ〜１９Ｆは、ＨｉＵＧＥのオフターゲット効果；具体的には、オフターゲット挿入およびゲノムへのオンターゲット挿入に対する比率の評価を示す。図１９Ａは、ＨＤ−ｇＲＮＡとｍＳｃｎ２ａＧＳ−ｇＲＮＡの両方についての上位にランク付けされたＣＲＩＳＰＯＲ予測オフターゲット座位を示す。図１９Ｂは、ペイロード特異的プライマーとペアになった遺伝子特異的プライマーを用いるゲノムＰＣＲ反応が、オンターゲット組込みの検出に成功し、一方、ペイロードのオフターゲットゲノム組込みは、予測された部位（ＰｒｅＯｆｆ＿１〜８）について検出されなかったことを示している。接合部に渡るＰＣＲ反応は、これらのゲノムプライマーを用いて、ロバストかつ特異的な増幅を示した。図１９Ｃは、ゲノムＷａｌｋｅｒ実験が、オンターゲット組込み（バンド４）、および非コードゲノム領域への３個の潜在的オフターゲット組込み（バンド５〜７）を検出したことを示す。ベクター断片もまた、予想通り、検出された（バンド１〜３）。図１９Ｄは、ペイロード特異的プライマーとペアになった遺伝子特異的プライマーを用いるゲノムＰＣＲ反応が、オンターゲット組込みの検出に成功し、一方、ペイロードのゲノム組込みは、実験的に同定された潜在的オフターゲット部位（ＥｘｐＯｆｆ＿１〜３）について検出されなかったことを示す。接合部に渡るＰＣＲ反応は、これらのゲノムプライマーを用いて、ロバストかつ特異的な増幅を示した。図１９Ｅは、オンターゲット組込み（緑色）対オフターゲット組込み（赤色）についての反応のリアルタイムＰＣＲ増幅曲線を示す。図１９Ｆは、相対量の半定量的推定が、オフターゲット組込みがオンターゲット組込みと比較してまれであることを示したことを示す。

（実施例５）
ＨｉＵＧＥ方法のインビボ適用
図６Ａは、インビボでのカルボキシ末端二方向性ＨＡエピトープノックイン（ＫＩ）へのＨｉＵＧＥ適用例の概略図を示す。Ｃａｓ９発現マウス新生仔に、生後０〜２日（Ｐ０〜２）に精製ＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶとＨｉＵＧＥドナーＡＡＶの組合せを脳室内に注射し、ＨＡエピトープＫＩを検出するための免疫組織化学法のために、Ｐ１５後、安楽死させた。図６Ｂおよび６Ｄは、軸索起始部に濃縮されたβＩＶ−スペクトリンおよびＮａＶ１．２ナトリウムチャネルサブタイプタンパク質をコードする、マウスＳｐｔｂｎ４遺伝子（図６Ｂ）およびマウスＳｃｎ２ａ遺伝子（図６Ｄ）のＨＡエピトープ免疫染色の代表的な画像を示す。図６Ｆは、微小管に局在化したβ−チューブリンをコードする、マウスＴｕｂｂ３遺伝子（図６Ｆ）のＨＡエピトープ免疫染色の代表的な画像を示す。図６Ｈは、核局在化ＭｅＣＰ２タンパク質をコードするマウスＭｅｃｐ２遺伝子のＨＡエピトープ免疫染色を示す。図６Ｃ、６Ｅ、６Ｇ、および６Ｉは、図６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、および６Ｈにおけるそれぞれの対応する画像の核を可視化するためのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色を示し、各パネルにおいて類似した細胞密度を示した。スケールバーは各パネルに示されている。

（実施例６）
ＨｉＵＧＥ方法の例示的な適用
図７Ａは、ＨｉＵＧＥモザイクエピトープノックイン（ＫＩ）適用例の概略図を示し、異なるドナーベクターが異なるペイロードを同じ遺伝子へ組み込むことができたことを示している。ＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶベクターと異なるエピトープＨｉＵＧＥドナーＡＡＶベクターの組合せを、培養されたＣａｓ９発現ニューロンへアプライし（図７Ｂ）、またはＣａｓ９発現新生仔へ脳室内注射により送達した（図７Ｃ）。異なるエピトープの発現を可視化するために免疫染色を実施した。図７Ｂは、初代海馬ニューロンにおけるマウスＭａｐ２遺伝子へのモザイクエピトープＫＩの免疫染色の代表的な画像を示す（太い矢じり形、ｍｙｃエピトープ染色；矢印、ＨＡエピトープ染色；細い矢じり形、Ｖ５エピトープ染色）。図７Ｃは、ＨＡエピトープとｍｙｃエピトープの両方についてインビボで染色されたマウスＴｕｂｂ３遺伝子のモザイクエピトープＫＩからの冠状脳切片の免疫染色の代表的な画像を示す。

図８Ａは、近位ビオチン化実験へのＨｉＵＧＥＢｉｏＩＤ２酵素ＫＩ適用例の概略図を示す。細胞を、固定化前に一晩、２０μＭビオチンで処理した。ＢｉｏＩＤ２−ＨＡＫＩおよびビオチン化活性を可視化するために免疫細胞化学法を実施した。図８Ｂは、マウスＧＦＡＰ遺伝子によりコードされたグリア酸性線維性タンパク質のカルボキシ末端へのＢｉｏＩＤ２−ＨＡＫＩを示す免疫染色、および対応する、蛍光ストレプトアビジンを用いたビオチン化タンパク質の検出（右パネル）の代表的な画像を示す。図８Ｃは、マウスＭａｐ２遺伝子によりコードされたＭａｐ２タンパク質のカルボキシ末端へのＢｉｏＩＤ２−ＨＡＫＩを示す免疫染色、および対応する、蛍光ストレプトアビジンを用いたビオチン化タンパク質の陽性検出（右パネル）の代表的な画像を示す。

タンパク質切り詰め実験は、機能性ドメインを同定し、タンパク質相互作用を明らかにし、構造機能関係を描写する。またしても、通常の方法は、典型的には、外因性構築物の過剰発現に頼る。内因的に発現したタンパク質の切り詰め研究を可能にするために、ＨＡ−終止−３’ＵＴＲＨｉＵＧＥペイロードをデザインした（図９Ａ）。この構築物は、切り詰め型内因性タンパク質のエピトープでの標識を可能にし、同時に、ポリアデニル化配列を含有する３’ＵＴＲの付加により、ナンセンス媒介性減衰からの回避を促進する。この適用は、βＩＶ−スペクトリンの切り詰めにより例示され、それが、ＡＩＳに濃縮され、かつカルポニン相同（ＣＨ）ドメイン、複数のスペクトリンリピート（１４番目〜１５番目のリピート内にアンキリン結合部位を含有する）、およびＣ−ｔｅｒｍプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインからなるモジュールドメイン構造で構成される（図９Ｂ）。

図９Ｃ〜９Ｄは、マウスＳｐｔｂｎ４遺伝子のエクソン３１（ｅ．３１）をターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡを用いることによるβＩＶ−スペクトリンからのＰＨドメインの切り詰めが、エクソン３６（ｅ．３６）をターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡを用いるカルボキシ末端ＫＩと比較して、ＡＩＳへのそれの局在化を変化させないことを示している。終止コドン近くの最後のコードエクソン（正準Σ１アイソフォームのエクソン３６）をターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡをＨＡ−終止−３’ＵＴＲドナーとペアにすることは、ＡＩＳに限定された強いＨＡエピトープ免疫反応性を生じた（図９Ｃ）。βＩＶ−スペクトリンからＰＨドメインを欠失させるためにエクソン３１をターゲティングすることは、以前の研究と一致して、それのＡＩＳ局在化を破壊せず（図９Ｄ）、ＰＨドメインが、それのＡＩＳへの局在化に必要とされないことを示唆した。顕著なことには、βＩＶ−スペクトリンを１４番目のスペクトリンリピート内で切り詰めるために、より上流のエクソン２６をターゲティングすることは、それのＡＩＳに濃縮された免疫反応性を完全に抑止し、不明瞭に広がった細胞質染色を生じた（図９Ｅ）。これらの結果は、βＩＶ−スペクトリンの１４番目のスペクトリンリピートとＰＨドメインの間の領域が、それのＡＩＳ内での濃縮に必要とされることを実証した。これは、βＩＶ−スペクトリンが、１４番目〜１５番目のスペクトリンリピート内でＡＩＳ足場タンパク質アンキリンと相互作用することを示す以前の研究と一致しており、この相互作用が、それの適切なＡＩＳ局在化に重要であることを示唆している。

βＩＶ−スペクトリンのＨｉＵＧＥ媒介性切り詰めをさらに、ウェスタンブロット分析により確認し、予測される連続的切り詰めと一致したタンパク質分子量の段階的低下が明らかにされた（図９Ｆ）。マウスＳｐｔｂｎ４遺伝子（上記）の異なる領域をターゲティングする３つのＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶを個々に、ＨＡ−３’ＵＴＲＨｉＵＧＥペイロードＡＡＶと共に初代Ｃａｓ９ニューロンへ同時形質導入した。陰性対照群は、ウイルスを受けなかった。ＨＡエピトープタグ付きタンパク質をまず、マウス抗ＨＡアガロースビーズでの免疫沈降により濃縮し、その後、ＳＤＳ-ＰＡＧＥに供し、別個のウサギ抗ＨＡ抗体を用いてイムノブロットした。連続的切り詰め条件に一致した分子量の段階的低下は明らかである（矢じり形）。矢じり形は、βＩＶ−スペクトリンのΣ１アイソフォームを示し、一方、矢印はΣ６アイソフォームを示す。エクソン２６（ｅ．２６）における切り詰めのΣ６アイソフォームは検出できないように思われた。スケールバーは各パネルに示されている。したがって、ＨｉＵＧＥは、根底にある細胞機構と関連した構造機能関係をインサイチューで調べるための、内因性タンパク質の迅速な連続的切り詰めを可能にする。

まとめると、タンパク質局在化および動態の可視化、タンパク質細胞内居住のターゲティング化操作、および構造機能関係の分析によって本明細書に例証された、内因性タンパク質を調べるための複数の独立したアプローチを促進するために、異なる機能性部分を有するＨｉＵＧＥペイロードのライブラリーを交換することができる。ＨｉＵＧＥの交換可能な性質により、他のＤＮＡ配列もまた、ペイロードとして組み入れて、多様なＧＳ−ｇＲＮＡ特異的ゲノム座位へ送達することができ、遺伝子／タンパク質改変および操作の無数の新しい可能性を開くことができる。

図１０Ａは、ＨｉＵＧＥ蛍光タンパク質（ＦＰ）ＫＩの例の概略図を示す。図１０Ｂは、ＧＦＡＰへのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質（ｍＣｈ）ＫＩを示し、図１０Ｃは、Ｐｄｈａ１へのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質（ｍＣｈ）ＫＩを示す。図１０Ｄは、Ｔｕｂｂ３へのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質（ｍＣｈ）ＫＩを示す。図１０Ｂ〜１０Ｄは、ｍＣｈ蛍光が、直接的に画像化されることも（図１０Ｂ、図１０Ｃ）、またはｍＣｈｅｒｒｙに対する抗体を用いる免疫細胞化学法に従って画像化されることも（図１０Ｄ）、いずれも可能であることを示す。

図１１Ａは、ＨｉＵＧＥアミノ末端（Ｎ−ｔｅｒｍ）ＫＩ構築物の例の概略図を示す。このデザインの目的は、２つの異なるタンパク質のＮ−ｔｅｒｍまたはカルボキシ末端（Ｃ−ｔｅｒｍ）を示差的にターゲティングすることにより、２つの異なる標的の二重標識を達成することであった。Ｎ−ｔｅｒｍＨｉＵＧＥベクター内の終止コドンカセットは、Ｃ−ｔｅｒｍへの組込みの事象において、翻訳がＭｙｃタグエピトープの上流で終結するだろうことを保証する。図１１Ｂは、Ｍａｐ２へのＭｙｃエピトープのＮ−ｔｅｒｍＫＩ、およびタンパク質βＩＶ−スペクトリンをコードするＳｐｔｂｎ４へのＨＡエピトープのＣ−ｔｅｒｍＫＩ（矢じり形）による、Ｍａｐ２およびＳｐｔｂｎ４コード化タンパク質の二重標識の代表的な免疫染色画像を示す。破線円形は、二重標識ニューロンの神経細胞体を表す。

二重配向ＨＡ−ＮＬＳＨｉＵＧＥペイロード（図１２Ａ）をマウスＡｒｐ２のＣ−ｔｅｒｍへとターゲティングして、この大量の細胞骨格タンパク質が核（図１２Ｃ）へ再配置されるように操作することができるかどうかを決定した。図１２Ａは、ＨｉＵＧＥ細胞内再局在化構築物の例の概略図を示す。このデザインの目的は、内因性タンパク質をそれらの正常な機能の部位から離れて、再局在化させることであり、それは、機能喪失型または機能獲得型実験デザインを創出するための効果的方法であり得る。図１２Ｂは、ニューロンにおける、細胞体および神経突起内にあるが、核内にはない、正常な分布を実証するための、Ｃ末端にＨＡでタグ付けされたＭａｐ２の免疫染色の代表的な画像（左パネル）を示す。あるいは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）でＭａｐ２をタグ付けすること（右パネル）が、Ｍａｐ２の大部分を核へ再局在化させた。両方のパネルにおける矢じり形は、核の部位を示す。スケールバーは各パネルに示されている。ニューロンに、マウスＡｃｔｒ２ＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶ、およびＨＡ−ＮＬＳＨｉＵＧＥペイロードとＭｙｃエピトープ（ＮＬＳなし）ＨｉＵＧＥペイロードの混合物を形質導入した。ＨＡ−ＮＬＳ−タグ付きＡｒｐ２（赤色）は、核へ完全に再方向づけされたが、Ｍｙｃタグ付きＡｒｐ２（緑色）はほとんど、Ａｒｐ２の正常な局在化を表す樹状突起棘に見出された（図１２Ｄ）。したがって、ＮＬＳなどの細胞内輸送タグのＨｉＵＧＥペイロードは、潜在的な機能喪失型または機能獲得型実験を創出することなどを目的として、内因性タンパク質の細胞内居住を操作するために利用することができる。

（実施例７）
第２世代ＨｉＵＧＥ方法についての概念模式図および実験的証拠
図１３Ａは、ビルトイン式Ｃａｓ９コード配列を有する第２世代ＨｉＵＧＥシステムの例の概略図を示す。インテイン媒介性スプリットＣａｓ９デザインを用いて、Ｃａｓ９コード配列をＧＳ−ｇＲＮＡベクターとＨｉＵＧＥベクターの両方へ、両方のベクターが、ＡＡＶサイズ制限を満たし、かつペイロードについての十分な空間を有するように、分配した。インテイン媒介性タンパク質スプライシング後、完全に機能しうるＣａｓ９が再構築された。第１世代ＨｉＵＧＥ方法の全ての適用がまた、第２世代方法にも当てはまり得る。

図１３Ｂ〜１３Ｅは、野生型（ＷＴ）初代培養マウスニューロンにおける第２世代ＨｉＵＧＥ技術の適用例を示す。細胞に、第２世代ＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶベクターと第２世代ＨｉＵＧＥドナーＡＡＶベクターの組合せをＤＩＶ４〜６に形質導入し、ＤＩＶ１１後、免疫染色によりＨＡエピトープまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＫＩを検出するための免疫細胞化学法のために細胞を固定した。マウスＴｕｂｂ３遺伝子（図１３Ｂ）およびＰｄｈａ１遺伝子（図１３Ｃ）へのＨＡエピトープＫＩの代表的な画像は、ＨＡ免疫反応性の特徴的な（図１３Ｂ）微小管または（図１３Ｃ）ミトコンドリア局在化を示した。マウスＴｕｂｂ３遺伝子（図１３Ｄ）およびＰｄｈａ１遺伝子（図１３Ｅ）のＧＦＰＫＩの代表的な画像は、（図１３Ｄ）微小管または（図１３Ｅ）ミトコンドリアの免疫染色を示した。スケールバーは各パネルに示されている。

ＨｉＵＧＥシステムは、ｌｏｘ−終止−ｌｏｘＣａｓ９−２Ａ−ＧＦＰマウスにおけるＣａｓ９のＣｒｅ依存性活性化などの外因性Ｃａｓ９発現に頼る。多様な野生型（ＷＴ）細胞および動物においてＨｉＵＧＥシステムの適用を単純化するために、Ｃａｓ９発現のための配列を、ＨｉＵＧＥベクターへ組み入れた。ｓｐＣａｓ９（コード配列約４．１ｋｂ）のＡＡＶによる送達の１つの制限は、ＡＡＶウイルスベクターが約４．５ｋｂの挿入断片サイズのみを収容し得ることである。この制約を克服するために、ｓｐＣａｓ９を、各ＨｉＵＧＥベクター間で半分に分割し、各半分が、Ｎｐｕスプリットインテイン配列を組み入れた。したがって、ｓｐＣａｓ９のインテイン媒介性タンパク質トランススプライシングが、両方のＨｉＵＧＥベクターを形質導入された細胞においてｓｐＣａｓ９発現を可能にするだろう（図１３Ａ）。ＷＴ細胞および動物における適用のためにこのシステムに多様なＨｉＵＧＥペイロードを容易に適応させることができる。このアプローチの実現可能性を、ＷＴ初代マウスニューロン、および一般的なヒトまたはマウス細胞株において、マウスＴｕｂｂ３、Ｍａｐ２、Ｐｄｈａ１、Ｔｕｂｂ５、またはヒトＴＵＢＢ遺伝子のいずれかをターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶとペアになった、二重配向ＨＡエピトープまたはＧＦＰＨｉＵＧＥペイロードを用いて、試験した。形質導入されたニューロンの免疫染色は、チューブリン細胞骨格またはミトコンドリアネットワークを示すＨＡエピトープおよびＧＦＰＫＩの成功を示した（図１３Ｂ〜１３Ｅ）。同様に、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３Ｔ、およびＮＩＨ３Ｔ３などの一般的な細胞株へのプラスミド同時トランスフェクションにより送達されたＨｉＵＧＥコンポーネントもまた、チューブリンネットワークを示すＨＡエピトープおよびＧＦＰＫＩの成功を実証した（図１３Ｆ〜１３Ｋ）。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＷＴ初代ニューロンにおけるインテインスプリットＣａｓ９媒介性ＨｉＵＧＥベクターについての対照実験を行った。ＨＡエピトープまたはＧＦＰペイロードをヒトＴＵＢＢ（ｈＴＵＢＢ）またはマウスＴｕｂｂ３（ｍＴｕｂｂ３）ゲノム座位へノックインするために、ＨｉＵＧＥＧＳ−ｇＲＮＡおよびドナーを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にプラスミドトランスフェクションし、初代ニューロンにＡＡＶ形質導入した。実験条件は図に示されている。チューブリン様発現パターンを示す陽性ＨＡエピトープまたはＧＦＰ免疫反応性は、ＧＳ−ｇＲＮＡが対応するＨｉＵＧＥドナーとペアになった時（一番左の列）のみ見出された。ＧＳ−ｇＲＮＡまたはＨｉＵＧＥドナーが単独でアプライされた時、または空のＧＳ−ｇＲＮＡバックボーンがドナーとペアになった時、ＨＡエピトープＫＩもＧＦＰＫＩも検出されなかった。これらの特異性対照実験は、ＨＡエピトープまたはＧＦＰペイロードの取り込みが、ＧＳ−ｇＲＮＡベクターとペイロードベクターの両方を必要とすることを示した（図１４Ａ〜１４Ｂ）。さらに、インテインスプリットＣａｓ９媒介性ＨｉＵＧＥの適応性をインビボで試験した。精製高力価ＡＡＶ（二重配向ＨＡエピトープペイロード、およびマウスＭａｐ２をターゲティングするＧＳ−ｇＲＮＡ）を、成体ＷＴマウスの背側海馬体へ一側性に同時注射した。感染からおよそ２週間後、ＨＡエピトープ免疫標識により、注射された海馬内の樹状突起および細胞体においてロバストなＭＡＰ２標識が明らかにされ、反対側の非感染部位においては示されなかった（図１３Ｌおよび１３Ｍ）。さらに、精製ＡＡＶ（約１０¹⁰〜１０¹¹ゲノムコピー／μＬ）のウイルス力価は、インテインスプリットＣａｓ９なしの類似のＨｉＵＧＥＡＡＶと実質的に異なることはなく、取り込まれた配列がウイルス産生を妨害しなかったことを実証した。したがって、インテインスプリットＣａｓ９媒介性ＨｉＵＧＥは、ＷＴ哺乳類種および実験モデルに渡る適用を単純化しながら、Ｃａｓ９の発現および効果的なゲノム改変を促進する。

（実施例８）
神経回路に基づいたＨｉＵＧＥペイロード送達
最近報告された逆行性輸送型ＡＡＶ２−ｒｅｔｒｏ血清型（Tervo et al., 2016）を利用することにより、ゲノム編集活性は特定の神経回路へ限定され、したがって、ＨｉＵＧＥツールを用いる回路特異的研究が可能になった。回路選択性を可能にするために、回路の投射軸索終末を含有する脳エリアへ注射されるＡＡＶ２−ｒｅｔｒｏＧＳ−ｇＲＮＡを、いつものＡＡＶＨｉＵＧＥドナーの特定の投射領域への注射とペアにした。この組合せは、神経回路選択的プロテオーム操作のための、標的脳領域から投射エリアへの逆行性アクセスおよび投射ニューロンのＨｉＵＧＥ媒介性ゲノム編集を可能にした。皮質線条体回路および視床皮質回路を用いた。皮質線条体回路について、ｍＴｕｂｂ３ＧＳ−ｇＲＮＡＡＡＶ２−ｒｅｔｒｏを線条体へ注射し、一方、個々のＡＡＶ２／９ＨｉＵＧＥドナーＡＡＶを、成体コンディショナルＣａｓ９マウスの一次運動皮質（ＭＯｐ、ＨＡエピトープ）かまたは二次運動皮質（ＭＯｓ、Ｍｙｃエピトープ）のいずれかへ側方に注射した（図２０Ａ）。運動皮質における投射ニューロンへの逆行性アクセスは、陽性ＧＦＰ標識により確認され、Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰのＣｒｅ依存性活性化を示した（図２０Ｂ）。運動皮質内のＨｉＵＧＥ編集された投射ニューロンの細胞体および神経突起は、注射部位に対応するＨＡエピトープおよびＭｙｃエピトープ標識βＩＩＩ−チューブリンにより明らかに描写された（図２０Ｃ〜２０Ｄ）。皮質線条体投射を表す、ＧＦＰ陽性線維の束もまた線条体において観察された（図２０Ｅ〜２０Ｆ）。おそらく異なる運動皮質の小領域のニューロンから生じた、ＨＡエピトープかまたはＭｙｃエピトープのいずれかが免疫陽性である個々の軸索は、隣接皮質線条体の軸索束内に存在した（図２０Ｇ〜２０Ｈ）。視床投射ニューロン内のβＩＩＩ−チューブリンの同様の回路選択的ＨＡエピトープタグ付けもまた、視床皮質回路に観察された（図２０Ｉ〜２０Ｋ）。したがって、ＨｉＵＧＥシステムをＡＡＶ２−ｒｅｔｒｏとペアにすることにより、投射ニューロンの逆行性感染が、回路接続性に特異的なＨｉＵＧＥ媒介性タンパク質改変を可能にした。これは、神経回路機能の根底にある分子機構を研究するためにインビボで多様なＨｉＵＧＥペイロードを用いるのに新しい場を提供する。

（実施例９）
万華鏡（Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ）ペイロード
混合された抗体エピトープを含有する顕微鏡法における検出向上のための抗体標識エピトープのノックイン（Ｋｎｏｃｋ−ｉｎｏｆＡｎｔｉｂｏｄｙＬａｂｅｌｉｎｇＥｐｉｔｏｐｅｓｆｏｒＩｍｐｒｏｖｅｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（「万華鏡（Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ）」）ペイロードを作製した。複数のモノクローナル一次抗体の混合物は、標識タンパク質と同時に結合することができる。このアプローチは、複数のエピトープを検出するポリクローナル抗体のロバストな抗原認識機構を模倣するが、なお、同時に、モノクローナル抗体の親和性および特異性を保持する。さらに、ペイロードは、スパゲティモンスター（約１ｋｂ）と比較してサイズがより小さい（約４１０ｂｐ）。図２１Ａは、剛性リンカー（ＲＬ）および可動性リンカー（ＦＬ）によって間隔が開けられた散在エピトープタグを含有する「万華鏡」ペイロードの概略図を示す。ベクター含有万華鏡の例には、１^st ＧｅｎＨｉＵＧＥドナー万華鏡ＯＲＦ＋０ベクター（３７４１ｂｐ）（配列番号１５２）、１^st ＧｅｎＨｉＵＧＥドナー万華鏡ＯＲＦ＋１ベクター（３７４０ｂｐ）（配列番号１５３）、および１^st ＧｅｎＨｉＵＧＥドナー万華鏡ＯＲＦ＋２ベクター（３７４２ｂｐ）（配列番号１５４）が挙げられる。

図２１Ｂは、ニューロンにおいて万華鏡標識マウスβＩＩＩ−チューブリンを検出するために抗ＨＡ抗体、抗Ｍｙｃ抗体、および抗Ｖ５抗体の混合物を用いた免疫蛍光シグナルが、単一のＨＡエピトープまたはｓｍＦＰ−ＨＡ標識を検出するために抗ＨＡ抗体（Ａｂ）を用いる場合よりも高く、抗ＨＡ一次抗体が３倍高い濃度でアプライされた場合でさえもそうである（１×Ａｂ対３×Ａｂ）ことを示している。図２１Ｃは、万華鏡が、抑制性シナプス後肥厚のプロテオミクス研究において最近、同定された抑制性シナプスタンパク質１（ＩｎＳｙｎ１）などの少量のタンパク質を標識および検出するために用いられ得ることを示している。万華鏡は、ＨｉＵＧＥについて、単一ＨＡエピトープタグまたはスパゲティモンスター−ＨＡ（ｓｍＦＰ−ＨＡ）と比較して、免疫蛍光検出の向上を促進した。

完全を期するために、本発明の様々な態様が、以下の番号付けされた条項に提示されている：
条項１。以下を含む、対象ゲノムを遺伝子編集するための相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）システム：（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼまたは（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列；（ｂ）（ｉ）少なくとも１つの挿入断片をコードする第１のポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）第１のポリヌクレオチド配列の各側にフランキングする少なくとも１つのドナー認識配列（ＤＲＳ）であって、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの切断部位を含むＤＲＳ；および（ｉｉｉ）ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列であって、ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをＤＲＳへターゲティングし、かつ対象ゲノム内の特異的配列をターゲティングしない、第２のポリヌクレオチド配列を含む相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）ベクター；ならびに（ｃ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列にターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡ、または（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列へターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡをコードする第３のポリヌクレオチドを含む標的遺伝子ベクター。

条項２。以下を含む、対象ゲノムを遺伝子編集するための相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）システム：（ａ）（ｉ）少なくとも１つの挿入断片をコードする第１のポリヌクレオチド配列；（ｉｉ）第１のポリヌクレオチド配列の各側にフランキングする少なくとも１つのドナー認識配列（ＤＲＳ）であって、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの切断部位を含むＤＲＳ；（ｉｉｉ）ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列であって、ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをＤＲＳへターゲティングし、かつ対象ゲノム内の特異的配列をターゲティングしない、第２のポリヌクレオチド配列；（ｉｖ）第１のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分をコードする第３のポリヌクレオチド配列を含む相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）ベクター；ならびに（ｂ）（ｉ）第１のスプリットインテインと補完的な第２のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分をコードする第４のポリヌクレオチド配列であって、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分およびＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分が一緒に連結して、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを形成する、第４のポリヌクレオチド配列；および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列へターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡをコードする第５のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子特異的ベクター。
条項３。第１のスプリットインテインがＮ−インテインであり、第２のスプリットインテインがＣ−インテインである、条項２に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４。Ｎ−インテインが配列番号６０のポリヌクレオチド配列を含み、第２のスプリットインテインが配列番号６１の配列を含む、条項２または３に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項５。ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分が配列番号５５のポリペプチド配列を含み、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分が配列番号５６のポリペプチド配列を含む、条項２〜４のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項６。標的遺伝子特異的配列が、対象ゲノムの標的遺伝子内の約１５〜２５ヌクレオチドの連続したポリヌクレオチド配列である、条項１〜５のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項７。標的遺伝子特異的ｇＲＮＡが、プロモーター領域、エンハンサー領域、リプレッサー領域、インスレーター領域、サイレンサー領域、プロモーター領域とのＤＮＡループ形成に関与する領域、遺伝子スプライシング領域、または転写領域からなる群から選択される標的遺伝子の少なくとも１つの領域をターゲティングする、条項６に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項８。ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼが、第１のポリヌクレオチドの各側にフランキングする少なくとも１つのＤＲＳ、および標的遺伝子特異的配列を切断し、それにより、切断された第１のポリヌクレオチド配列および標的遺伝子の切断された部位を生じ、切断された第１のポリヌクレオチド配列が標的遺伝子の切断された部位へ非相同末端結合により組み込まれる、条項１〜７のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項９。ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼが少なくとも１つのＤＲＳおよび標的遺伝子特異的配列を連続的にまたは同時に切断する、条項８に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項１０。少なくとも１つの挿入断片が遺伝子スプライシング領域または転写領域のＮ末端に挿入されて、Ｎ末端タグ付き融合タンパク質を生成する、条項１〜９のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項１１。少なくとも１つの挿入断片が、プロモーター領域、エンハンサー領域、リプレッサー領域、インスレーター領域、サイレンサー領域、プロモーター領域とのＤＮＡループ形成に関与する領域、遺伝子スプライシング領域、または転写領域のＣ末端に挿入されて、Ｃ末端タグ付き融合タンパク質を生成する、条項１〜９のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項１２。少なくとも１つの挿入断片がゲノムのセンス鎖へ挿入される、条項１０または１１に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項１３。少なくとも１つの挿入断片がゲノムのアンチセンス鎖へ挿入される、条項１０または１１に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項１４。少なくとも１つの挿入断片がフォワード配向で挿入される、条項１０〜１３のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項１５。少なくとも１つの挿入断片がリバース配向で挿入される、条項１０〜１３のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項１６。ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの細菌属に由来したＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、条項１〜１５のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項１７。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａｇｌｏｂｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｉｎｅｒｅａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｌａｒｉからなる群から選択される細菌種に由来する、条項１６に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項１８。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＴｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａＣａｓ９（ＴｄＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓＣａｓ９（ＢｌａｔＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、それらのバリアントエンドヌクレアーゼ、またはそれらのキメラエンドヌクレアーゼである、条項１６または１７に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項１９。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、ＳｐＣａｓ９バリアントエンドヌクレアーゼ、ＳａＣａｓ９バリアントエンドヌクレアーゼ、またはＳｔＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、条項１６〜１８のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項２０。ＳｐＣａｓ９バリアントが、ＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＶＲＥＲバリアントエンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＥＱＲバリアントエンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９ＶＱＲバリアントエンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１バリアントエンドヌクレアーゼ、もしくはｅＳｐＣａｓ９（１．１）バリアントエンドヌクレアーゼであり；ＳａＣａｓ９バリアントが、ＳａＣａｓ９Ｃａｓ９ＫＫＨバリアントであり；またはＳｔＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓｔ１Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼもしくはＳｔｃＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、条項１９に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項２１。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓｔ３Ｃａｓ９のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）相互作用（ＰＩ）ドメインを有するＳｐＣａｓ９を含むキメラＳｐ−Ｓｔ３Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはＳｐＣａｓ９のＰＩドメインを有するＳｔ３Ｃａｓ９を含むキメラＳｔ３−ＳｐＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、条項１６〜２０のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項２２。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、ＹＧ（配列番号１）、ＮＧＧ（配列番号２）、ＮＧＡ（配列番号３）、ＮＧＣＧ（配列番号４）、ＮＧＡＧ（配列番号５）、ＮＧＧＮＧ（配列番号６）、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号７）、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号８）、ＮＮＮＲＲＴ（配列番号９）、ＮＡＡＡＡＣ（配列番号１０）、ＮＮＮＮＧＮＮＴ（配列番号１１）、ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号１２）、ＮＮＮＮＣＮＤＤ（配列番号１３）、またはＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１４）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する、条項１６〜２１のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項２３。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧ（配列番号２）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐＣａｓ９バリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧ（配列番号２）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＶＲＥＲバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＣＧ（配列番号４）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＥＱＲバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＡＧ（配列番号５）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐＣａｓ９ＶＱＲバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＡ（配列番号３）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号７）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳａＣａｓ９Ｃａｓ９ＫＫＨバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＲＲＴ（配列番号９）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｔ１Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号１２）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｔ３Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧＮＧ（配列番号６）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐ−Ｓｔ３Ｃａｓ９キメラエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧＮＧ（配列番号６）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＮｍＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＮＧＮＮＴ（配列番号１１）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＴｄＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＡＡＡＡＣ（配列番号１０）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＢｌａｔＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＮＣＮＤＤ（配列番号１３）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＣｊＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１４）のＰＡＭ配列を認識し；Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがまたはＦｎＣａｓ９ＲＨＡバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＹＧ（配列番号１）のＰＡＭ配列を認識する、条項１６〜２１のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項２４。ＤＲＳが、約１９〜２４ヌクレオチド長のドナー標的配列およびＰＡＭ配列を含む、条項１〜２３のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項２５。ドナー標的配列が、フォワード配向で５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−２Ｎ−１Ｎ１Ｎ２Ｎ−３’（配列番号１５）の配列を含み、切断部位におけるＣａｓ９依存性二本鎖切断が、位置Ｎ_-1と位置Ｎ₁の間で起こり；またはドナー標的配列が、リバース配向で５’−ＸＸ−２Ｘ−１Ｘ１Ｘ２ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）の配列を含み、切断部位におけるＣａｓ９依存性二本鎖切断が、位置Ｘ−１と位置Ｘ１の間で起こり、式中、Ｎが４つのデオキシリボ核酸アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）のいずれかであり、ＸがＮのリバース相補体であり、Ｎ−２Ｎ−１Ｎ１Ｎ２（配列番号１７）が、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−２Ｎ−１Ｎ１Ｎ２Ｎ−３’（配列番号１５）における境界配列であり、Ｘ−２Ｘ−１Ｘ１Ｘ２（配列番号１８）が、５’−ＸＸ−２Ｘ−１Ｘ１Ｘ２ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）における境界配列であり、ドナー標的配列が、挿入断片が標的遺伝子へ組み込まれた後、インフレームの終止コドンを導入しない、条項２４に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項２６。ドナー標的配列が、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列と比較しても少なくとも１つの塩基対ミスマッチを含む、条項２５に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項２７。ドナー標的配列が、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列と比較しても少なくとも２つの塩基対ミスマッチを含む、条項２５または２６に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項２８。ドナー標的配列が、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列と比較しても、ＰＡＭ配列に隣接するドナー標的配列の約８〜１２ヌクレオチド内に少なくとも１つの塩基対ミスマッチを含む、条項２５〜２７のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項２９。標的遺伝子特異的配列が、ＺＺＺＺ−２Ｚ−１Ｚ１Ｚ２Ｚ（配列番号１９）の配列を含み、切断部位におけるＣａｓ９依存性二本鎖切断が、位置Ｚ−１と位置Ｚ１の間で起こり、Ｚが４つのデオキシリボ核酸アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）のいずれかであり、その境界配列が、挿入断片が標的遺伝子へ組み込まれた後、インフレームの終止コドンを生じず、標的遺伝子のゲノムオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）位相が以下からなる群から選択される、条項２５〜２８のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム：ＯＲＦ＋０：ＺＺＺＺ−２Ｚ−１Ｚ１Ｚ２Ｚ（配列番号１９）に対応する位置ＺＺ−２Ｚ−１、ＯＲＦ＋１：ＺＺＺＺ−２Ｚ−１Ｚ１Ｚ２Ｚ（配列番号１９）に対応する位置ＺＺＺ−２、およびＯＲＦ＋２：ＺＺＺＺ−２Ｚ−１Ｚ１Ｚ２Ｚ（配列番号１９）に対応する位置ＺＺＺ。
条項３０。ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−２Ｎ−１Ｎ１Ｎ２Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ−１がＡ、Ｃ、またはＧである、条項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項３１。ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−２Ｎ−１Ｎ１Ｎ２Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ−２Ｎ−１が、ＴＴ、ＴＣ、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される、条項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項３２。ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−２Ｎ−１Ｎ１Ｎ２Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ１Ｎ２が、ＡＣ、ＡＴ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される、条項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項３３。ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−２Ｎ−１Ｎ１Ｎ２Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ１がＴまたはＣである、条項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項３４。ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ−２Ｘ−１Ｘ１Ｘ２ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ−１がＡ、Ｃ、またはＧである、条項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項３５。ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ−２Ｘ−１Ｘ１Ｘ２ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ−２Ｘ−１が、ＴＴ、ＴＣ、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される、条項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項３６。ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ−２Ｘ−１Ｘ１Ｘ２ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ１Ｘ２が、ＡＣ、ＡＴ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される、条項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項３７。ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ−２Ｘ−１Ｘ１Ｘ２ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ１がＴまたはＣである、条項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項３８。ＤＲＳが、ＳｐＣａｓ９またはそのバリアントによって認識され、フォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−２Ｎ−１Ｎ１Ｎ２ＮＮＧＧ−３’（配列番号２０）の配列またはリバース配向での５’−ＣＣＸＸＸ−２Ｘ−１Ｘ１Ｘ２ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号２１）の配列を含む、条項２５〜３７のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項３９。少なくとも１つの挿入断片がマーカーまたはタグである、条項１〜３８のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項４０。少なくとも１つの挿入断片が、抗体エピトープタグ、蛍光タンパク質タグ、アフィニティ精製タグ、プロテオミクス標識酵素、スプリットＣｒｅリコンビナーゼ、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、局在化配列、酵素、エピトープ、またはそれらの組合せである、条項１〜３９のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４０ｂ。少なくとも１つの挿入断片が少なくとも１つの抗体エピトープタグを含む、条項１〜４０のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４０ｃ。少なくとも１つの挿入断片が少なくとも２つ以上の抗体エピトープタグを含む、条項１〜４０のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４０ｄ。少なくとも２つ以上の抗体エピトープタグが異なる、条項４０ｃに記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４０ｅ。少なくとも２つ以上の抗体エピトープタグが同じである、条項４０ｃに記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４０ｆ。少なくとも１つの挿入断片が抗体エピトープタグの１つまたは複数のコピーを含む、条項４０ｂ〜４０ｅのいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４０ｇ。抗体エピトープタグがリンカーによって分離されている、条項４１ｃ〜４１ｆのいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４１。少なくとも１つの挿入断片が、配列番号３４、３９、４１〜５０、またはそれらの組合せの少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、条項１〜４０のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４１ｂ。少なくとも１つの挿入断片が、配列番号１５２、配列番号１５３、または配列番号１５４の位置５４２〜９４９に対応するポリヌクレオチド配列を含む、条項１〜４０のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４２。ＨｉＵＧＥベクターが、同じ鎖にコードされた、第１のポリヌクレオチド配列のフォワードコピーおよび第１のポリヌクレオチド配列のリバースコピーを含む、条項１〜４０のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４３。終止カセットをコードするポリヌクレオチド配列が、第１のポリヌクレオチド配列のフォワードコピーと第１のポリヌクレオチド配列のリバースコピーの間に連結されている、条項４２に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項４４。ＤＲＳが、ＧＴＣＡＴＡＧＴＡＴＣＧＣＧＧＡＧＴＴＣＡＧＧ（配列番号２２）、ＧＡＣＧＣＴＴＣＣＧＡＧＴＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧ（配列番号２３）、ＧＧＴＴＣＴＡＣＧＡＧＧＡＴＡＣＧＴＣＴＴＧＧ（配列番号２４）、ＧＣＧＴＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＡＧＣＣＧＧＧＧ（配列番号２５）、ＧＣＧＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＧＣＧＧ（配列番号２６）、またはＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＡＣＴＣＧＧＡＡＧＣＧＴＣ（配列番号２７）のポリヌクレオチド配列を含む、条項１〜４３のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４５。第２のポリヌクレオチド配列が第１のプロモーターと作動可能に連結され、第３のポリヌクレオチド配列が第２のプロモーターと作動可能に連結されている、条項１または６〜４４のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項４６。第２のポリヌクレオチド配列が第１のプロモーターと作動可能に連結され、第３のポリヌクレオチド配列が第２のプロモーターと作動可能に連結され、第４のポリヌクレオチド配列が第３のプロモーターと作動可能に連結され、第５のポリヌクレオチド配列が第４のプロモーターと作動可能に連結されている、条項２〜４４のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４７。第４のポリヌクレオチド配列と第５のポリヌクレオチドが同じプロモーターと作動可能に連結されている、条項２〜４４のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４８。プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または制御性プロモーターである、条項４３〜４７のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項４９。プロモーターが真核生物プロモーターである、条項４３〜４８のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項５０。プロモーターがＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、条項４９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項５１。プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、または７ＳＫプロモーターである、条項５０に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項５２。プロモーターが、配列番号６２〜６６、またはそれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、条項４９〜５１のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項５３。ポリヌクレオチドの少なくとも１つが核局在化シグナルおよび／または核外移行シグナルをさらに含む、条項１〜５２のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項５４。核局在化シグナルが配列番号５２または５３のポリヌクレオチド配列を含み、核外移行シグナルが配列番号５１のポリヌクレオチド配列を含む、条項１〜５３のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項５５。条項１の（ｃ）（ｉｉ）の標的遺伝子ベクターが、条項１の（ａ）（ｉｉ）のＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列をさらに含む、条項１、６〜４５、または４８〜５４のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項５６。条項１の（ａ）（ｉｉ）の核酸がＤＮＡを含む、条項１、６〜４５、または４８〜５４のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項５７。条項１の（ａ）（ｉｉ）の核酸がＲＮＡを含む、条項１、６〜４５、または４８〜５４のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項５８。条項１の（ａ）（ｉｉ）、条項１の（ｂ）、および条項１の（ｃ）（ｉｉ）のうちの１つ、２つ、または３つ全部が、ウイルスベクター内にパッケージングされている、条項１、６〜４５、または４８〜５７のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項５９。条項１の（ａ）（ｉｉ）および条項１の（ｂ）が同じウイルスベクター内にパッケージングされ、条項１の（ａ）（ｉｉ）および条項１の（ｃ）（ｉｉ）が同じウイルスベクター内にパッケージングされ、条項１の（ｂ）および条項１の（ｃ）（ｉｉ）が同じウイルスベクター内にパッケージングされ、または条項１の（ａ）、条項１の（ｂ）、および条項１の（ｃ）（ｉｉ）が同じウイルスベクター内にパッケージングされている、条項１、６〜４５、または４８〜５８のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項６０。条項１の（ａ）（ｉｉ）が第１のウイルスベクター内にパッケージングされ、条項１の（ｂ）が第２のウイルスベクター内にパッケージングされ、条項１の（ｃ）（ｉｉ）が第３のウイルスベクター内にパッケージングされている、条項１、６〜４５、または４８〜５８のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項６１。ポリヌクレオチド配列の少なくとも１つがウイルスベクター内にパッケージングされている、条項２〜４４または４６〜５４のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項６２。ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターを含む、条項５８〜６１のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項６３。配列番号６７〜１０７またはそれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、条項１、６〜４５、または４８〜６０および６２のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項６４。配列番号１０８〜１２７またはそれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、条項２〜４４または４６〜５４、６１、および６２のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項６５。対象ゲノムが真核生物対象由来である、条項１〜６２４のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項６６。対象ゲノムが哺乳類対象である、条項６５に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項６７。哺乳類対象がげっ歯類または霊長類である、条項６６に記載のＨｉＵＧＥシステム。

条項６８。ＴＵＢＢ３遺伝子、ＭＡＰ２遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＮＲＣＡＭ遺伝子、ＡＣＴＲ２遺伝子、ＣＬＴＡ遺伝子、ＡＮＫ３遺伝子、ＳＰＴＢＮ４遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＰＤＨＡ１遺伝子、またはＤＣＸ遺伝子の標的遺伝子特異的配列をターゲティングする、条項１〜６７のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
条項６９。対象ゲノムにおける標的遺伝子の相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）の方法であって、細胞を条項１〜６８のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステムと接触させるステップを含む方法。
条項７０。ゲノムワイドタンパク質標識、発現マーキング、タンパク質発現の破壊、タンパク質再局在化、タンパク質発現の変化、またはハイスループットスクリーニングにおいて用いられる、条項６９に記載の方法。

条項７１。ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼが、第１のポリヌクレオチドの各側にフランキングする少なくとも１つのＤＲＳ、および標的遺伝子特異的配列を切断し、それにより、切断された第１のポリヌクレオチド配列および標的遺伝子の切断された部位を生じ、切断された第１のポリヌクレオチド配列が標的遺伝子の切断された部位へ非相同末端結合により組み込まれる、条項６８または６９に記載の方法。
条項７２。ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼが少なくとも１つのＤＲＳおよび標的遺伝子特異的配列を連続的にまたは同時に切断する、条項７１に記載の方法。
条項７３。細胞が分化細胞または非分裂細胞である、条項６９〜７２のいずれか１条項に記載の方法。
条項７４。細胞が真核細胞である、条項７３に記載の方法。
条項７５。細胞がヒト細胞である、条項７３または７４に記載の方法。
条項７６。細胞が、内胚葉、外胚葉、または中胚葉に由来する、条項６９〜７５のいずれか１条項に記載の方法。
条項７７。条項１〜６８のいずれか１条項に記載のＨｉＵＧＥシステムを含むキット。
条項７８。配列番号１５２、配列番号１５３、または配列番号１５４のポリヌクレオチド配列を含むＨｉＵＧＥシステム。

付録

Claims

以下を含む、対象ゲノムを遺伝子編集するための相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）システム：
（ａ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼまたは（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列；
（ｂ）（ｉ）少なくとも１つの挿入断片をコードする第１のポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）第１のポリヌクレオチド配列の各側にフランキングする少なくとも１つのドナー認識配列（ＤＲＳ）であって、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの切断部位を含むＤＲＳ；および
（ｉｉｉ）ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列であって、ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをＤＲＳへターゲティングし、かつ対象ゲノム内の特異的配列をターゲティングしない、第２のポリヌクレオチド配列
を含む相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）ベクター；ならびに
（ｃ）（ｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列にターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡ、または（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列へターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡをコードする第３のポリヌクレオチドを含む標的遺伝子ベクター。
以下を含む、対象ゲノムを遺伝子編集するための相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）システム：
（ａ）（ｉ）少なくとも１つの挿入断片をコードする第１のポリヌクレオチド配列；
（ｉｉ）第１のポリヌクレオチド配列の各側にフランキングする少なくとも１つのドナー認識配列（ＤＲＳ）であって、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの切断部位を含むＤＲＳ；
（ｉｉｉ）ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチド配列であって、ＨｉＵＧＥベクター特異的ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをＤＲＳへターゲティングし、かつ対象ゲノム内の特異的配列をターゲティングしない、第２のポリヌクレオチド配列；
（ｉｖ）第１のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分をコードする第３のポリヌクレオチド配列
を含む相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）ベクター；ならびに
（ｂ）（ｉ）第１のスプリットインテインと補完的な第２のスプリットインテインを有するＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分をコードする第４のポリヌクレオチド配列であって、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分およびＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分が一緒に連結して、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを形成する、第４のポリヌクレオチド配列；および
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを対象ゲノム内の標的遺伝子特異的配列へターゲティングする標的遺伝子特異的ｇＲＮＡをコードする第５のポリヌクレオチド配列
を含む遺伝子特異的ベクター。
第１のスプリットインテインがＮ−インテインであり、第２のスプリットインテインがＣ−インテインである、請求項２に記載のＨｉＵＧＥシステム。
Ｎ−インテインが配列番号６０のポリヌクレオチド配列を含み、第２のスプリットインテインが配列番号６１の配列を含む、請求項２または３に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第１の部分が配列番号５５のポリペプチド配列を含み、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼの第２の部分が配列番号５６のポリペプチド配列を含む、請求項２〜４のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
標的遺伝子特異的配列が、対象ゲノムの標的遺伝子内の約１５〜２５ヌクレオチドの連続したポリヌクレオチド配列である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
標的遺伝子特異的ｇＲＮＡが、プロモーター領域、エンハンサー領域、リプレッサー領域、インスレーター領域、サイレンサー領域、プロモーター領域とのＤＮＡループ形成に関与する領域、遺伝子スプライシング領域、または転写領域からなる群から選択される標的遺伝子の少なくとも１つの領域をターゲティングする、請求項６に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼが、第１のポリヌクレオチドの各側にフランキングする少なくとも１つのＤＲＳ、および標的遺伝子特異的配列を切断し、それにより、切断された第１のポリヌクレオチド配列および標的遺伝子の切断された部位を生じ、切断された第１のポリヌクレオチド配列が標的遺伝子の切断された部位へ非相同末端結合により組み込まれる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼが少なくとも１つのＤＲＳおよび標的遺伝子特異的配列を連続的にまたは同時に切断する、請求項８に記載のＨｉＵＧＥシステム。
少なくとも１つの挿入断片が遺伝子スプライシング領域または転写領域のＮ末端に挿入されて、Ｎ末端タグ付き融合タンパク質を生成する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
少なくとも１つの挿入断片が、プロモーター領域、エンハンサー領域、リプレッサー領域、インスレーター領域、サイレンサー領域、プロモーター領域とのＤＮＡループ形成に関与する領域、遺伝子スプライシング領域、または転写領域のＣ末端に挿入されて、Ｃ末端タグ付き融合タンパク質を生成する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
少なくとも１つの挿入断片がゲノムのセンス鎖へ挿入される、請求項１０または１１に記載のＨｉＵＧＥシステム。
少なくとも１つの挿入断片がゲノムのアンチセンス鎖へ挿入される、請求項１０または１１に記載のＨｉＵＧＥシステム。
少なくとも１つの挿入断片がフォワード配向で挿入される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
少なくとも１つの挿入断片がリバース配向で挿入される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、またはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの細菌属に由来したＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａｇｌｏｂｕｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｉｎｅｒｅａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｌａｒｉからなる群から選択される細菌種に由来する、請求項１６に記載のＨｉＵＧＥシステム。
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＴｒｅｐｏｎｅｍａｄｅｎｔｉｃｏｌａＣａｓ９（ＴｄＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓＣａｓ９（ＢｌａｔＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、それらのバリアントエンドヌクレアーゼ、またはそれらのキメラエンドヌクレアーゼである、請求項１６または１７に記載のＨｉＵＧＥシステム。
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、ＳｐＣａｓ９バリアントエンドヌクレアーゼ、ＳａＣａｓ９バリアントエンドヌクレアーゼ、またはＳｔＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ＳｐＣａｓ９バリアントが、ＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＶＲＥＲバリアントエンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＥＱＲバリアントエンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９ＶＱＲバリアントエンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１バリアントエンドヌクレアーゼ、もしくはｅＳｐＣａｓ９（１．１）バリアントエンドヌクレアーゼであり；
ＳａＣａｓ９バリアントが、ＳａＣａｓ９Ｃａｓ９ＫＫＨバリアントであり；または
ＳｔＣａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓｔ１Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼもしくはＳｔｃＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、
請求項１９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、Ｓｔ３Ｃａｓ９のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）相互作用（ＰＩ）ドメインを有するＳｐＣａｓ９を含むキメラＳｐ−Ｓｔ３Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはＳｐＣａｓ９のＰＩドメインを有するＳｔ３Ｃａｓ９を含むキメラＳｔ３−ＳｐＣａｓ９エンドヌクレアーゼである、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼが、ＹＧ（配列番号１）、ＮＧＧ（配列番号２）、ＮＧＡ（配列番号３）、ＮＧＣＧ（配列番号４）、ＮＧＡＧ（配列番号５）、ＮＧＧＮＧ（配列番号６）、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号７）、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号８）、ＮＮＮＲＲＴ（配列番号９）、ＮＡＡＡＡＣ（配列番号１０）、ＮＮＮＮＧＮＮＴ（配列番号１１）、ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号１２）、ＮＮＮＮＣＮＤＤ（配列番号１３）、またはＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１４）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧ（配列番号２）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐＣａｓ９バリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧ（配列番号２）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＶＲＥＲバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＣＧ（配列番号４）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐＣａｓ９Ｃａｓ９ＥＱＲバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＡＧ（配列番号５）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐＣａｓ９ＶＱＲバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＡ（配列番号３）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳａＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＧＲＲＴ（配列番号７）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳａＣａｓ９Ｃａｓ９ＫＫＨバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＲＲＴ（配列番号９）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｔ１Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＡＧＡＡＷ（配列番号１２）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｔ３Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧＮＧ（配列番号６）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＳｐ−Ｓｔ３Ｃａｓ９キメラエンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧＮＧ（配列番号６）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＮｍＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＮＧＮＮＴ（配列番号１１）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＴｄＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＡＡＡＡＣ（配列番号１０）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＢｌａｔＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＮＣＮＤＤ（配列番号１３）のＰＡＭ配列を認識し；
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＣｊＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号１４）のＰＡＭ配列を認識し；または
Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがＦｎＣａｓ９ＲＨＡバリアントエンドヌクレアーゼであり、ＹＧ（配列番号１）のＰＡＭ配列を認識する、
請求項１６〜２２のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ＤＲＳが、約１９〜２４ヌクレオチド長のドナー標的配列およびＰＡＭ配列を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ドナー標的配列が、フォワード配向で５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）の配列を含み、切断部位におけるＣａｓ９依存性二本鎖切断が、位置Ｎ_-1と位置Ｎ₁の間で起こり；または
ドナー標的配列が、リバース配向で５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）の配列を含み、切断部位におけるＣａｓ９依存性二本鎖切断が、位置Ｘ_-1と位置Ｘ₁の間で起こり、
式中、Ｎが４つのデオキシリボ核酸アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）のいずれかであり、
ＸがＮのリバース相補体であり、
Ｎ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂（配列番号１７）が、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）における境界配列であり、Ｘ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂（配列番号１８）が、５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）における境界配列であり、
ドナー標的配列が、挿入断片が標的遺伝子へ組み込まれた後、インフレームの終止コドンを導入しない、
請求項２４に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ドナー標的配列が、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列と比較しても少なくとも１つの塩基対ミスマッチを含む、請求項２５に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ドナー標的配列が、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列と比較しても少なくとも２つの塩基対ミスマッチを含む、請求項２５または２６に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ドナー標的配列が、対象ゲノムにおける等しい長さのいかなる配列と比較しても、ＰＡＭ配列に隣接するドナー標的配列の約８〜１２ヌクレオチド内に少なくとも１つの塩基対ミスマッチを含む、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
標的遺伝子特異的配列が、ＺＺＺＺ_-2Ｚ_-1Ｚ₁Ｚ₂Ｚ（配列番号１９）の配列を含み、切断部位におけるＣａｓ９依存性二本鎖切断が、位置Ｚ_-1と位置Ｚ₁の間で起こり、Ｚが４つのデオキシリボ核酸アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）のいずれかであり、その境界配列が、挿入断片が標的遺伝子へ組み込まれた後、インフレームの終止コドンを生じず、標的遺伝子のゲノムオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）位相が以下からなる群から選択される、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム：
ＯＲＦ＋０：ＺＺＺＺ_-2Ｚ_-1Ｚ₁Ｚ₂Ｚ（配列番号１９）に対応する位置ＺＺ_-2Ｚ_-1、
ＯＲＦ＋１：ＺＺＺＺ_-2Ｚ_-1Ｚ₁Ｚ₂Ｚ（配列番号１９）に対応する位置ＺＺＺ_-2、および
ＯＲＦ＋２：ＺＺＺＺ_-2Ｚ_-1Ｚ₁Ｚ₂Ｚ（配列番号１９）に対応する位置ＺＺＺ。
ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ_-1がＡ、Ｃ、またはＧである、請求項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ_-2Ｎ_-1が、ＴＴ、ＴＣ、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される、請求項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ₁Ｎ₂が、ＡＣ、ＡＴ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される、請求項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがフォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂Ｎ−３’（配列番号１５）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｎ₁がＴまたはＣである、請求項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ_-1がＡ、Ｃ、またはＧである、請求項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＮ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ_-2Ｘ_-1が、ＴＴ、ＴＣ、ＡＡ、ＡＴ、ＡＣ、ＡＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＡ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される、請求項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋１であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ₁Ｘ₂が、ＡＣ、ＡＴ、ＴＡ、ＴＴ、ＴＣ、ＴＧ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＣ、ＣＧ、ＧＴ、ＧＣ、およびＧＧからなる群から選択される、請求項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ゲノムＯＲＦ位相がＯＲＦ＋２であり、ＤＲＳがリバース配向での５’−ＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号１６）であり、かつ少なくとも１つの挿入断片がＣ末端タグ付き融合タンパク質を生成するために用いられる場合には、Ｘ₁がＴまたはＣである、請求項２９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ＤＲＳが、ＳｐＣａｓ９またはそのバリアントによって認識され、フォワード配向での５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ_-2Ｎ_-1Ｎ₁Ｎ₂ＮＮＧＧ−３’（配列番号２０）の配列またはリバース配向での５’−ＣＣＸＸＸ_-2Ｘ_-1Ｘ₁Ｘ₂ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ−３’（配列番号２１）の配列を含む、請求項２５〜３７のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
少なくとも１つの挿入断片がマーカーまたはタグである、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
少なくとも１つの挿入断片が、抗体エピトープタグ、蛍光タンパク質タグ、アフィニティ精製タグ、プロテオミクス標識酵素、スプリットＣｒｅリコンビナーゼ、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、局在化配列、酵素、エピトープ、またはそれらの組合せである、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
少なくとも１つの挿入断片が、配列番号３４、３９、４１〜５０、またはその組合せの少なくとも１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ＨｉＵＧＥベクターが、同じ鎖にコードされた、第１のポリヌクレオチド配列のフォワードコピーおよび第１のポリヌクレオチド配列のリバースコピーを含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
終止カセットをコードするポリヌクレオチド配列が、第１のポリヌクレオチド配列のフォワードコピーと第１のポリヌクレオチド配列のリバースコピーの間に連結されている、請求項４２に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ＤＲＳが、ＧＴＣＡＴＡＧＴＡＴＣＧＣＧＧＡＧＴＴＣＡＧＧ（配列番号２２）、ＧＡＣＧＣＴＴＣＣＧＡＧＴＡＣＧＧＴＡＣＡＧＧ（配列番号２３）、ＧＧＴＴＣＴＡＣＧＡＧＧＡＴＡＣＧＴＣＴＴＧＧ（配列番号２４）、ＧＣＧＴＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＡＧＣＣＧＧＧＧ（配列番号２５）、ＧＣＧＡＴＴＧＡＣＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＧＣＧＧ（配列番号２６）、またはＣＣＴＧＴＡＣＣＧＴＡＣＴＣＧＧＡＡＧＣＧＴＣ（配列番号２７）のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
第２のポリヌクレオチド配列が第１のプロモーターと作動可能に連結され、第３のポリヌクレオチド配列が第２のプロモーターと作動可能に連結されている、請求項１または６〜４４のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
第２のポリヌクレオチド配列が第１のプロモーターと作動可能に連結され、第３のポリヌクレオチド配列が第２のプロモーターと作動可能に連結され、第４のポリヌクレオチド配列が第３のプロモーターと作動可能に連結され、第５のポリヌクレオチド配列が第４のプロモーターと作動可能に連結されている、請求項２〜４４のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
第４のポリヌクレオチド配列と第５のポリヌクレオチドが同じプロモーターと作動可能に連結されている、請求項２〜４４のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
プロモーターが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または制御性プロモーターである、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
プロモーターが真核生物プロモーターである、請求項４３〜４８のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
プロモーターがＩＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである、請求項４９に記載のＨｉＵＧＥシステム。
プロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、または７ＳＫプロモーターである、請求項５０に記載のＨｉＵＧＥシステム。
プロモーターが、配列番号６２〜６６、またはそれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ポリヌクレオチドの少なくとも１つが核局在化シグナルおよび／または核外移行シグナルをさらに含む、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
核局在化シグナルが配列番号５２または５３のポリヌクレオチド配列を含み、核外移行シグナルが配列番号５１のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５３のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
請求項１の（ｃ）（ｉｉ）の標的遺伝子ベクターが、請求項１の（ａ）（ｉｉ）のＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１、６〜４５、または４８〜５４のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
請求項１の（ａ）（ｉｉ）の核酸がＤＮＡを含む、請求項１、６〜４５、または４８〜５４のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
請求項１の（ａ）（ｉｉ）の核酸がＲＮＡを含む、請求項１、６〜４５、または４８〜５４のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
請求項１の（ａ）（ｉｉ）、請求項１の（ｂ）、および請求項１の（ｃ）（ｉｉ）のうちの１つ、２つ、または３つ全部が、ウイルスベクター内にパッケージングされている、請求項１、６〜４５、または４８〜５７のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
請求項１の（ａ）（ｉｉ）および請求項１の（ｂ）が同じウイルスベクター内にパッケージングされ、請求項１の（ａ）（ｉｉ）および請求項１の（ｃ）（ｉｉ）が同じウイルスベクター内にパッケージングされ、請求項１の（ｂ）および請求項１の（ｃ）（ｉｉ）が同じウイルスベクター内にパッケージングされ、または請求項１の（ａ）、請求項１の（ｂ）、および請求項１の（ｃ）（ｉｉ）が同じウイルスベクター内にパッケージングされている、請求項１、６〜４５、または４８〜５８のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
請求項１の（ａ）（ｉｉ）が第１のウイルスベクター内にパッケージングされ、請求項１の（ｂ）が第２のウイルスベクター内にパッケージングされ、請求項１の（ｃ）（ｉｉ）が第３のウイルスベクター内にパッケージングされている、請求項１、６〜４５、または４８〜５８のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ポリヌクレオチド配列の少なくとも１つがウイルスベクター内にパッケージングされている、請求項２〜４４または４６〜５４のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターを含む、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
配列番号６７〜１０７またはそれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１、６〜４５、または４８〜６０および６２のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
配列番号１０８〜１２７またはそれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、請求項２〜４４または４６〜５４、６１、および６２のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
対象ゲノムが真核生物対象由来である、請求項１〜６４のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
対象ゲノムが哺乳類対象である、請求項６５に記載のＨｉＵＧＥシステム。
哺乳類対象がげっ歯類または霊長類である、請求項６６に記載のＨｉＵＧＥシステム。
ＴＵＢＢ３遺伝子、ＭＡＰ２遺伝子、ＭＥＣＰ２遺伝子、ＮＲＣＡＭ遺伝子、ＡＣＴＲ２遺伝子、ＣＬＴＡ遺伝子、ＡＮＫ３遺伝子、ＳＰＴＢＮ４遺伝子、ＳＣＮ２Ａ遺伝子、ＧＦＡＰ遺伝子、ＰＤＨＡ１遺伝子、またはＤＣＸ遺伝子の標的遺伝子特異的配列をターゲティングする、請求項１〜６７のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステム。
対象ゲノムにおける標的遺伝子の相同性非依存的ユニバーサルゲノムエンジニアリング（ＨｉＵＧＥ）の方法であって、細胞を請求項１〜６８のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステムと接触させるステップを含む方法。
ゲノムワイドタンパク質標識、発現マーキング、タンパク質発現の破壊、タンパク質再局在化、タンパク質発現の変化、またはハイスループットスクリーニングにおいて用いられる、請求項６９に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼが、第１のポリヌクレオチドの各側にフランキングする少なくとも１つのＤＲＳ、および標的遺伝子特異的配列を切断し、それにより、切断された第１のポリヌクレオチド配列および標的遺伝子の切断された部位を生じ、切断された第１のポリヌクレオチド配列が標的遺伝子の切断された部位へ非相同末端結合により組み込まれる、請求項６８または６９に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼが少なくとも１つのＤＲＳおよび標的遺伝子特異的配列を連続的にまたは同時に切断する、請求項７１に記載の方法。
細胞が分化細胞または非分裂細胞である、請求項６９〜７２のいずれか１項に記載の方法。
細胞が真核細胞である、請求項７３に記載の方法。
細胞がヒト細胞である、請求項７３または７４に記載の方法。
細胞が、内胚葉、外胚葉、または中胚葉に由来する、請求項６９〜７５のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜６８のいずれか１項に記載のＨｉＵＧＥシステムを含むキット。