CN101113417B - Hpv基因酵母体外翻译系统的建立 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种HPV基因酵母体外翻译系统的建立方法，本发明方法建立的改良的酵母体外翻译系统特别适用于人乳头瘤病毒(HPV)衣壳蛋白的体外表达，为研究HPV衣壳蛋白表达机制提供了一种方便快捷的方法；该系统还可同时适用于其他真核蛋白的体外表达。同时本发明所述体外翻译系统的建立为研究HPV晚期蛋白表达后VLP形成和DNA的包装提供了有效工具，并有望为HPV预防和治疗性疫苗的研究提供帮助。利用本发明方法还可用来制备各种酵母突变株的裂解物，用于研究真核mRNA转录后影响蛋白翻译的各种因素及相关分子的相互作用机制。

Description

HPV基因酵母体外翻译系统的建立

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及HPV基因酵母体外翻译系统的建立。本发明建立的改良的酵母体外翻译系统特别适用于人乳头瘤病毒(HPV)衣壳蛋白的体外表达，为研究HPV衣壳蛋白表达机制提供了一种方便快捷的方法；该系统还可同时适用于其他真核蛋白的体外表达。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是一种大小约为8kb的双链DNA肿瘤病毒。HPV感染可导致人类皮肤粘膜的多种良、恶性增生性疾病，高危型HPV(16、18、45、58型)感染与宫颈癌等恶性肿瘤的发生关系密切，低危型HPV(6、11型)感染引起性病尖锐湿疣。

HPV基因组可以分为非编码区(NCR)、早期区(E区)和晚期区(L区)。晚期区基因编码2个病毒衣壳蛋白，其中L1是主要衣壳蛋白，L2是次要衣壳蛋白。L1蛋白可单独组装成病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，VLP在形态上与HPV病毒颗粒相似，能够诱导机体产生高效价的中和抗体，是开发HPV预防性疫苗研究的主要靶抗原。但是，目前HPV尚不能在组织细胞中培养，由于HPV生活周期依赖于宿主表皮细胞的分化，衣壳蛋白(L1和L2)的合成以及病毒颗粒装配只能在上皮终末分化细胞中进行；在体外未分化的哺乳动物细胞中衣壳蛋白(L1和L2)的表达也受限。HPV的这一特性限制了对其基因的表达和功能，尤其是衣壳蛋白L1和L2表达的研究。

无细胞蛋白合成系统，即体外翻译系统是近些年来发展起来的一种利用细胞提取物进行体外蛋白翻译的系统。相比活细胞培养该系统有更多优势，体外翻译系统制备简单，蛋白翻译迅速；灵活性强，可以根据实验需要随意修饰蛋白翻译环境，方便快捷地研究提高其蛋白产量和溶解性等指标的优化成分，可以表达对活细胞毒性强，对水解敏感或者不稳定的蛋白。而且所得结果很高程度上反应活细胞内的情况。然而，现存的几种主要的体外翻译系统在研究翻译调控方面都存在着明显的不足，如：大肠杆菌提取物系统来自原核生物，这限制了其在真核生物RNA表达上的应用；兔网织红细胞系统成本太高，细胞特异性太强；麦胚提取物系统效率不稳定等。有关酵母体外翻译系统的建立与应用，目前国内尚未见报道。

啤酒酵母，作为一种单细胞真核生物，具有遗传背景清楚，繁殖迅速，操作方便，成本低等特点，具备制备体外翻译系统的优势。国外已有报道自啤酒酵母中提取到了具有高蛋白翻译活性的提取物用于建立酵母体外翻译系统，进行球蛋白基因和植物病毒基因的表达。迄今为止，用于人类病毒蛋白表达的酵母体外翻译系统报道较少，尤其是HPV基因在酵母体外翻译系统中的表达及影响其表达的因素等尚未见报道。

研究发现，酵母和哺乳动物细胞在许多方面有相似性，比如，自主复制序列(ARSs)；起始识别复合物(ORC)；TATA-box结合蛋白等等；对比密码子使用情况可见，酵母的密码子使用比哺乳动物更接近于HPV，按照“密码子与tRNA相符程度决定蛋白表达水平”的学说，HPV基因在酵母中的表达有望比在哺乳动物细胞中更有优势。因此，酵母体外翻译系统有望成为研究HPV翻译水平调控机制的理想工具。

发明内容

针对现有体外翻译系统的不足，本发明要解决的问题是提供一种HPV基因酵母体外翻译系统的建立方法以及用该方法建立的HPV基因酵母体外翻译系统。

本发明所述HPV基因酵母体外翻译系统的建立方法，步骤为：酵母细胞的选择与培养；酵母细胞原生质体的制备；酵母细胞裂解物的制备；含有目的基因的载体的构建；体外转录mRNA；外源性mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译；Western Blotting检测目的蛋白的体外翻译；其特征是：所述酵母细胞选择啤酒酵母细胞Y303，保藏号为：ATCCNo.96659，或者啤酒酵母细胞YPH500，保藏号为：ATCC No.76626；所述酵母细胞裂解物的制备中，酵母原生质体细胞的光密度值为A660nm＝1.0，裂解缓冲液每毫升含成分为：100mM Hepes-KOH，120mM醋酸钾，2.5mM醋酸镁，1mM二硫苏糖醇，2.5mM ATP，1mM GTP，100μM S-腺蛋氨酸，1mM亚精胺，20mM磷酸肌酸，100mM蔗糖，40U肌酸磷酸激酶；所述外源性mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译中，反应温度和时间是：30℃反应1～3小时，反应前外源性氨基酸尤其是亮氨酸的加入剂量为100μM，外源性的tRNA的加入剂量为10^-5mM。

上述HPV基因酵母体外翻译系统的建立方法中：所述含有目的基因的载体为带有T7或SP6启动子的且含有HPV58全长L1序列的重组子。

其中：所述含有目的基因的载体优选是pcDNA3.0-HPV58L1。

上述HPV基因酵母体外翻译系统的建立方法中：所述外源性mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译中，反应温度和时间优选是：30℃反应1小时。

本发明的特征还在于提供用上述方法建立的HPV基因酵母体外翻译系统以及该外翻译系统用于人乳头瘤病毒衣壳蛋白的体外表达。

本发明建立了一种改良的酵母体外翻译系统，该系统特别适用于人乳头瘤病毒(HPV)衣壳蛋白的体外表达，为研究HPV衣壳蛋白表达机制提供了一种方便快捷地的方法；该系统还可同时适用于其他真核蛋白的体外表达。

本发明所述体外翻译系统的建立为研究HPV晚期蛋白表达后VLP形成和DNA的包装提供了有效工具，并有望为HPV预防和治疗性疫苗的研究提供帮助。利用本发明方法还可用来制备各种酵母突变株的裂解物，用于研究真核mRNA转录后影响蛋白翻译的各种因素及相关分子的相互作用机制，对于阐明蛋白翻译的分子调控机制具有潜在的重要应用价值。

本发明方法所具有的突出特点在于：

1.改进了制备方法。

本发明提供了一种经过改良的酵母体外翻译系统制备方法。其改进主要突出在：①裂解缓冲液配方的改良，裂解缓冲液的配制基于以往建立体外培养系统的方法进行综合优化，改良后的配方可充分裂解酵母细胞并获取含高蛋白翻译活性物质的酵母提取物。②简化了制备过程，无需高速离心，降低了实验成本，使之操作简便化。

酵母培养至对数期后，制备酵母原生质体。利用改良后的含有ATP、S-腺蛋氨酸、磷酸肌酸、蔗糖、肌酸磷酸激酶、醋酸钾、醋酸镁、亮抑酶肽等成分的裂解缓冲液破碎细胞并提供体外翻译所需离子及能量等，微球菌核酸酶消除内源性mRNA；200g，4℃离心5分钟后的上清粗提物即可高效地进行体外翻译。

酵母裂解缓冲液配方中用醋酸钾，醋酸镁代替氯化钾和氯化镁，排除了氯离子对系统活性的潜在的抑制作用；亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂和胰凝乳蛋白酶抑制剂的加入显著增加了合成蛋白的稳定性，提高了体系的翻译活性；制备好的裂解物在-20℃中存放6个月后检验其活性，仍然无明显的降低，证明该裂解物与以往报道的裂解物相比更加稳定。加入氯化高铁血红素显著提高了裂解物的翻译活性；制备过程中无需去除多核糖体的存在，制备好的裂解物即可有效启动翻译。

制备时无需高速离心，离心速度仅需200g即可得到反应活性较高的裂解物。

2.反应条件的优化。

本发明针对高危型人乳头瘤病毒(HPV)衣壳蛋白的体外表达，对酵母体外翻译系统进行反应条件的优化。

本发明涉及构建的含有HPV58全长L1序列的重组子：pcDNA3.0-HPV58L1。本发明提供了能够提高HPV衣壳蛋白L1表达效率的优选方案：(1)反应时间和温度：外源性mRNA加入反应体系后，30℃反应1小时，即可得到L1蛋白的高表达。(2)反应前外源性氨基酸(尤其是亮氨酸)的加入，可以显著提高L1蛋白的翻译，氨基酸和亮氨酸的最佳添加剂量为100μM。(3)反应前外源性的tRNA的加入可以提高L1蛋白的翻译，最佳添加剂量为10^-5mM。(4)制备细胞裂解物时酵母细胞的最佳生长状态，A660nm＝1.0。

本发明方案中酵母优先选自：啤酒酵母细胞Y303(ATCC保藏号：96659)和YPH500(ATCC保藏号：76626)。

总之，本发明针对现有体外翻译系统的不足，建立了一种新型的酵母体外翻译系统，检验了高危型HPV衣壳蛋白在此系统中的表达，并利用此系统分析了影响其表达效率的几个因素。该酵母体外翻译系统操作简便，反应高效，成本低廉，对HPV mRNA的翻译效果理想，是研究HPV基因翻译的有效工具，并有望利用此系统进行HPV预防性和治疗性疫苗的相关研究。该系统还可同时适用于其他真核蛋白的体外表达。

附图说明

图1：酵母裂解物中的体外蛋白合成反应

利用L1mRNA或者含有L1基因的质粒DNA作为模板，分别在Y303和YPH500酵母裂解物中进行体外蛋白合成反应，反应结束后的WesternBlot图。

1代表mRNA作为反应模板；2代表质粒DNA作为模板；3为阴性对照。

1，2说明该体外翻译系统严格以外源性mRNA作为反应模板启动体外翻译；质粒DNA模板无法在此体系中同时完成体外转录和翻译，不能用来作为模板。

3空白对照无蛋白条带，说明微球菌酶处理内源性mRNA充分，反应体系中无酵母的mRNA存在，证明加入外源性L1mRNA后出现的蛋白条带确实是由L1mRNA翻译得来。

图2：mRNA剂量效应图

在Y303和YPH500酵母裂解物中分别加入不同剂量的L1mRNA(0.5微克，1微克，2微克)进行体外蛋白合成反应，反应结束后进行Western Blot。

A图为Western Blot的结果。B图是Y303和YPH500两个体系中L1蛋白相对产量与各自加入的mRNA量的线性关系图；体外蛋白翻译呈mRNA剂量依赖性，随着外源性mRNA加入的量的提高，翻译的蛋白的量也呈同样的线性关系的提高。

图3：反应时间效应图

等量的L1mRNA在Y303和YPH500酵母裂解物中进行体外蛋白合成反应，分别在10分钟，20分钟，30分钟，1小时，2小时，3小时后结束反应。

A图为反应10分钟，20分钟，30分钟后进行Western Blot的结果，L1mRNA可在10分钟内启动翻译；B图为反应1小时，2小时，3小时后进行Western Blot的结果，反应可维持到3小时。

图4：氨基酸效应图

在Y303和YPH500酵母裂解物中分别加入不同量的外源性氨基酸混合物(0微摩尔，50微摩尔，100微摩尔)，在等量的mRNA反应条件下分别进行体外蛋白合成反应。

A图为Western Blot的结果；L1蛋白在Y303和YPH500中相对产量随着加入的外源性氨基酸的增加而增加。

B图为L1蛋白相对产量与加入的外源性氨基酸量的线性关系图，L1蛋白相对产量呈氨基酸剂量依赖性。

图5：亮氨酸效应图

在Y303和YPH500酵母裂解物中分别加入不同量的外源性亮氨酸混合物(0微摩尔，50微摩尔，100微摩尔)，在相同的mRNA反应条件下分别进行体外蛋白合成反应。

A图为不同亮氨酸浓度下，L1蛋白的Western Blot结果；L1蛋白相对产量随着加入的外源性亮基酸的增加而增加。

B直方图显示L1蛋白信号随加入的外源性氨基酸量的增加而显著增加。

图6：tRNA效应图

在Y303和YPH500酵母裂解物中分别加入不同量的外源性酵母tRNA(0mM，10^-6mM，10^-5mM)，在等量的mRNA反应条件下分别进行体外蛋白合成反应。图为反应结束后L1蛋白的Western Blot结果；结果可见，L1蛋白在Y303和YPH500中相对产量随着加入的外源性酵母tRNA的增加而增加。

图7：生长状态效应图

Y303和YPH500酵母细胞培养24及48小时后收集细胞后分别制备细胞裂解物，加入等量的L1mRNA进行体外翻译反应，反应结束后的Western Blot结果图。

结果显示，酵母细胞生长状态对不同酵母菌株影响不同，Y303酵母株的生长状态对酵母细胞裂解物的制备至关重要，生长48小时的Y303细胞(A660nm＝3)制备的裂解物体外翻译L1mRNA的活性显著降低；YPH500酵母株的生长状态对酵母细胞裂解物的制备影响较小，生长48小时的YPH500细胞(A660nm＝3)制备的裂解物体外翻译L1mRNA的活性无显著变化。

具体实施方式

以下结合具体实例和附图说明对本发明做进一步的说明，但下述的实施例并非用于限定本发明的保护范围。

实施例1

一、酵母细胞的培养

啤酒酵母株Y303和YPH500接种标准的YPED液体培养基，28℃-30℃需氧条件下，200rpm/分钟振荡培养24小时，待细胞生长至10⁸个/ml左右，离心2500rpm，10分钟收集细胞，弃上清待用。

二、酵母细胞原生质体的制备

酵母细胞沉淀用无菌水重悬，离心2500rpm，10分钟，弃上清；然后用1M的山梨醇重悬沉淀，离心2500rpm，10分钟，弃上清；后将沉淀再次重悬于含有20000U的溶细胞酶和0.2mMβ-巯基乙醇的SCE缓冲液(1M山梨醇，0.1M柠檬酸钠，10mM EDTA，pH6.8)中。悬浮液28℃-30℃避光轻微振荡3小时，随时镜检以确定是否充分消化酵母细胞壁。

待大部分细胞消化为原生质体(显微镜下变大变圆)后，2800rpm离心15分钟沉淀酵母原生质体，STC缓冲液(1M山梨醇，10mM CaCl₂，10mM Tris-Cl，pH7.5)重悬沉淀，同样离心后弃上清，洗涤两次，沉淀待用。

三、酵母细胞裂解物的制备

将制备好的酵母原生质体沉淀重悬在裂解缓冲液(Lysis Buffer)中，立即将重悬物置于冰上。

将重悬液通过25-gauge的一次性针管上下抽吸20-30次(冰上放置)后，200g，4℃离心5分钟，吸取上清于一新管中，加入10U/ml微球菌核酸酶和1mM CaCl₂，20℃孵育10min以水解内源性的mRNA。反应结束后加入终浓度2.5mM EGTA(pH7.0)和0.02mM血晶素，所得即为酵母细胞裂解物，放至-80℃冻存备用。

其中：上述裂解缓冲液(Lysis Buffer)每毫升含成分如下：100mM Hepes-KOH(pH7.4)，120mM醋酸钾(pH7.4)，2.5mM醋酸镁，1mM二硫苏糖醇，2.5mM ATP，1mM GTP，100μM S-腺蛋氨酸，1mM亚精胺，20mM磷酸肌酸，100mM蔗糖，40U肌酸磷酸激酶。

四、体外转录mRNA

将含有目的基因的载体(一般为带有T7或SP6启动子的载体)单酶切线性化后，酚氯仿抽提纯化，乙醇漂洗后，将沉淀重新溶于DEPC水中待用。利用体外转录反应试剂盒将目DNA转录为mRNA。反应体系中各个成分如下：

20ul反应体系

线性化DNA            2ug

10×转录缓冲液       2ul

RNA酶抑制剂(40U/ul)  1ul

10mM dATP            1ul

10mM dCTP            1ul

10mM dTTP            1ul

10mM dGTP            1ul

7mGpppG(0.1M)        1ul

T7 RNA聚合酶         2ul

DEPC水               补至20ul

37℃水浴反应过夜。

反应结束后，琼脂糖电泳及紫外分光光度计检测体外转录效率。

如体外转录RNA成功，往反应液中加入2μl不含RNA酶的DNA酶(20000U/ml)，37℃反应1小时以去除内源性的模板DNA，酚氯仿法抽提，100％乙醇沉淀，70％乙醇漂洗纯化所得的mRNA，重悬mRNA于DEPC水中待用。

五、外源性mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译

将体外转录得到的mRNA作为模板加入酵母细胞裂解物中，按照下列方法建立酵母体外翻译体系：

25ul反应体系

1mM氨基酸混合物         1ul

RNA酶抑制剂(40U/ul)     0.5ul

酵母细胞裂解物          17.5ul

mRNA                    1ug

DEPC水                  补齐至25ul

30℃反应1-3小时(依实验需求及mRNA翻译效率而定)。

六、Western Blotting检测目的蛋白的体外翻译

体外翻译反应液中加入2×SDS蛋白上样缓冲液终止反应后，80℃煮10分钟处理，SDS-PAGE胶分离蛋白条带，然后转印至PVDF膜。特异性抗体识别体外翻译的蛋白，ECL试剂盒检测蛋白的特异性信号。

七、HPV58L1mRNA在酵母体外翻译系统中的表达情况研究

(一)克隆载体的构建

1、目的基因的扩增：将含有HPV58全基因组的质粒plink322-HPV58作为模板，设计引物扩增L1基因。引物序列如下：

上游引物：5’CGGGATCCGCCACCATGGTGCTGATTTTATGTTGC-3’；

下游引物：5’CCCTCGAGGCAGGAAGGGAAAGGATTAAC-3’；

plink322-HPV58作为模板，高保真Taq酶及常规PCR反应试剂，设立PCR体系进行L1的扩增。PCR反应条件为94℃预变性2min，经35个循环后，在72℃延伸15min。取5μlPCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

2、PCR产物与T载体的连接

将扩增所得的PCR产物与pGEM-T载体按摩尔数之比3∶1混合，建立如下反应体系：

表1.pGEM-T载体和PCR产物的连接

总体积10μl，4℃过夜。

3、连接产物的转化

取无菌、新鲜感受态300μl，加入连接产物10μl，轻轻混匀后冰浴30min，42℃，热休克90sec(不要摇动试管)，冰浴2min。加无抗生素的LB液体培养基700μl，37℃150rmp培养45min。

制备含Ampicillin的琼脂平板，室温放置30min，于平板表面加X-gal(20mg/ml)40μl和IPTG(200mg/ml)4μl。用无菌涂布棒将试剂均匀涂布于整个平板表面，室温放置直到所有液体消失。

将培养45min后的菌液，3000g离心1min，去除部分液体，保留100μl，重悬菌体，全部铺于LA平板上，37℃平放20min，然后倒置培养过夜。同时设对照组，一组为空的大肠杆菌，另一组为pGEM空载体。

4、DNA测序和分析

选取鉴定阳性的克隆菌株，进行序列测定，利用DNAstar软件分析插入片段的正确性。

5、L1基因与pcDNA3.0的连接

(1)将含有L1的pGEM-T载体的重组菌克隆接种到5ml含100μg/ml Amp的LB液体培养基中过夜培养，按照如下碱裂解法提取纯化质粒：

取1.5ml菌液，10000×g离心1min，弃上清。

加入250μl溶液I，盖紧管口，缓慢颠倒离心管4次。

加入250μl溶液II，盖紧管口，缓慢颠倒离心管4次，室温放置5min。

加入350μl溶液III，盖紧管口，快速颠倒离心管4次，12000×g离心10min。

取上清，加入套在离心管上的小柱子中，10000×g离心1min。

弃液体，加500μl HB Buffer，10000×g离心1min。

弃液体，加750μl Wash Buffer，10000×g离心1min。

重复洗柱一次。

弃液体，10000×g离心空柱子1min。

加50μl去离子水，10000×g离心1min，即为提取的质粒。紫外分光光度计测定质粒的浓度和OD₂₆₀/OD₂₈₀值。-20℃保存备用。

(2)用限制性内切酶BamHI and Xho I同时双酶切重组质粒载体和pcDNA3.0载体，建立如下酶切反应体系：

表2限制性内切酶酶切反应体系

酶切反应体系共20μl，37℃2h。

(3)目的片段的回收与纯化

按常规的操作制备普通的1％琼脂糖凝胶，并将酶切反应产物进行电泳，电泳20min后，在紫外灯下观察结果，发现目的DNA带已经与溴酚兰和杂带充分分开。

在长波紫外灯下切下含所需DNA片段凝胶，移入一个1.5ml Eppendorf管中，加入0.2mlBinding Buffer，50℃保温7min熔化凝胶，期间颠倒试管2-3次。

将凝胶与Buffer的混合液转移至2ml装在离心管上的纯化柱中，1000×g离心1min。

加300μl Binding Buffer洗涤纯化柱，1000×g离心1min。

加入无水乙醇稀释的SPW Buffer 700μl，放置2-3min；1000×g离心1min；弃取液体离心空柱，1000×g 1min。

将纯化柱装到1.5ml Ep管中，加入30μl去离子水，放置1-2min，1000×g离心1min，将微量核酸定量仪调零，吸取1μl DNA样品至比色杯中，加水至50μl，混匀后分别读出DNA样品的浓度和OD₂₆₀/OD₂₈₀比值。-20℃储存备用。

(4)L1片段和pcDNA3.0的连接

将双酶切后回收的L1基因与经同样双酶切后回收的pcDNA3.0载体按摩尔数之比3∶1混合，建立同上的连接反应体系，同法转化大肠杆菌后挑取阳性克隆，酶切鉴定结果，筛选到插入有L1的克隆，碱裂解法提取纯化质粒，得到了pcDNA3.0-HPV58L1载体。

(二)体外转录HPV58 L1 mRNA

将pcDNA3.0-HPV58 L1质粒用BamHI单酶切线性化，酶切反应体系如下：

表3限制性内切酶单酶切反应体系

37℃反应3小时后酚氯仿抽提纯化，乙醇漂洗后，将沉淀重新溶于DEPC水中待用。利用体外转录反应试剂盒将目DNA转录为mRNA。反应体系中各个成分同前，37℃水浴反应过夜。反应结束后，琼脂糖电泳及紫外分光光度计检测体外转录效率。

如体外转录RNA成功，往反应液中加入2μl不含RNA酶的DNA酶(20000U/ml)，37℃反应1小时以去除内源性的模板DNA，酚氯仿法抽提，100％乙醇沉淀，70％乙醇漂洗纯化所得的mRNA，重悬mRNA于DEPC水中待用。

(三)HPV58 L1蛋白在酵母体外翻译系统中的表达

按照前述方法制备好酵母细胞提取物，将上述得到的HPV58 L1 mRNA分别加入酵母细胞提取物中进行反应。监测不同反应时间(10分钟-30分钟；1小时-3小时)、不同剂量的L1mRNA(0.5μg，1μg，2μg)、不同浓度的外源性氨基酸或者亮氨酸(0μM，1μM，2μM)和酵母的tRNA(0μM，10^-6μM，10^-5μM)等因素对HPV58 L1蛋白表达的不同影响。

(四)Western Blot检测L1蛋白的表达

反应结束后，向反应液中加入2×SDS蛋白上样缓冲液终止反应后，80℃煮10分钟处理，10％SDS-PAGE胶电泳分离蛋白条带，恒压150V，电泳50分钟左右；然后转印至PVDF膜，恒压100V，转膜70分钟左右。转印好的膜先用PBST轻轻晃动清洗5分钟，然后用5％脱脂奶(脱脂奶粉+PBST)封闭非特异性结合位点；封闭好的膜用PBST清洗(3次，每次5分钟)后，加入1∶4000稀释的抗HPV L1蛋白的多克隆抗体(抗体溶于PBST，含0.3％BSA，4℃保存)，4℃过夜。次日回收一抗后，加入0.1％叠氮钠，放入4℃保存。膜再次用PBST清洗(3次，每次5分钟)后，加入1∶4000稀释的辣根过氧化物酶结合的兔抗兔IgG作为二抗(溶于5％脱脂奶中)，室温结合2小时后，弃去二抗，膜重新用PBST清洗膜3次后，加入ECL反应试剂(Amersham，ECL试剂盒)避光反应5分钟后在Kozak胶片下曝光，显影剂显影固定后，观察蛋白表达情况。

实验结果总结(参见附图及附图说明)：

(一)克隆载体的构建

1、目的基因的扩增：PCR方法扩增plink322-HPV58上的全长L1基因，PCR反应完毕后取5μl产物行1％琼脂糖凝胶电泳，DL2000作为DNA marker，可见2kb左右处有很强的单一条带。

2、PCR产物与T载体的连接：将扩增所得的PCR产物与pGEM-T载体连接后转化大肠杆菌后涂板，长出数十个白色克隆，对照平板长出数十个蓝斑。挑白色克隆摇菌提质粒后测序，软件分析证明，已成功将HPV58 L1各自插入到T载体中，序列未出现突变。

3、L1基因与pcDNA3.0的连接

用限制性内切酶BamH I and Xho I同时双酶切重组质粒载体pGEM-HPV58L1和pcDNA3.0载体，酶切反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收L1片段和线性化的pcDNA3.0载体后T4连接酶连接，转化大肠杆菌后将菌铺于含有100μg/ml的LB平皿上过夜培养后，挑取生长出的菌落酶切鉴定，筛选到了插入有L1的克隆，从而成功构建了含有HPV58L1的载体，pcDNA3.0-HPV58 L1。

(二)体外转录

将pcDNA3.0-HPV58 L1质粒用BamH I单酶切线性化后酚、氯仿抽提纯化后利用紫外分光光度计检测其浓度约为500ng/ul。利用体外转录反应试剂盒进行体外转录实验。反应结束后，琼脂糖电泳可见RNA较亮的弥散条带，mRNA转录良好，紫外分光光度计也可检测到mRNA浓度。转录效率大约为5μg mRNA/μg DNA。

(三)HPV58 L1蛋白在酵母体外翻译系统中的表达

按照前述方法制备好酵母细胞提取物，将上述得到的HPV58 L1 mRNA分别加入酵母细胞提取物中进行反应。改变反应时间、L1 mRNA的剂量、外源性氨基酸或者亮氨酸和酵母的tRNA的浓度等，反应结束后进行Western Blot，抗HPV L1蛋白的多克隆一抗和二抗结合后进行ECL反应，可见在蛋白分子量标准75-50KD之间出现一条特异性的带，而对照组未见反应条带，证明此系统成功表达了HPV58L1蛋白。L1表达在10分钟内即可充分启动，1～2小时达到最高表达且可维持至3小时；加入外源性的氨基酸(尤其是亮氨酸)和外源性酵母tRNA可提高L1的翻译；Y303酵母的过度生长会导致制备的细胞提取物效率大大降低。实验结果分析表明，该酵母体外翻译系统构建成功，HPV58L1基因在其中得到良好表达；且酵母细胞提取物活性好，体外翻译效率高，酵母体外翻译系统制备成功。

Claims (6)

1. 一种HPV基因酵母体外翻译系统的建立方法，步骤为：酵母细胞的选择与培养；酵母细胞原生质体的制备；酵母细胞裂解物的制备；含有目的基因的载体的构建；体外转录mRNA；外源性mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译；Western Blotting检测目的蛋白的体外翻译；其特征是：所述酵母细胞选择啤酒酵母细胞Y303，保藏号为：ATCC No.96659，或者啤酒酵母细胞YPH500，保藏号为：ATCC No.76626；所述酵母细胞裂解物的制备中，酵母原生质体细胞的光密度值为A660nm＝1.0，裂解缓冲液每毫升含成分为：100mMHepes-KOH，120mM醋酸钾，2.5mM醋酸镁，1mM二硫苏糖醇，2.5mM ATP，1mM GTP，100μM S-腺蛋氨酸，1mM亚精胺，20mM磷酸肌酸，100mM蔗糖，40U肌酸磷酸激酶；所述外源性mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译中，反应温度和时间是：30℃反应1-3小时，反应前外源性氨基酸尤其是亮氨酸的加入剂量为100μM，外源性的tRNA的加入剂量为10^-5mM。

2. 如权利要求1所述HPV基因酵母体外翻译系统的建立方法，其特征是：所述含有目的基因的载体为带有T7或SP6启动子的且含有HPV58全长L1序列的重组子。

3. 如权利要求1或2所述HPV基因酵母体外翻译系统的建立方法，其特征是：所述含有目的基因的载体是pcDNA3.0-HPV58 L1。

4. 如权利要求1所述HPV基因酵母体外翻译系统的建立方法，其特征是：所述外源性mRNA在酵母体外翻译系统中的翻译中，反应温度和时间是：30℃反应1小时。

5. 权利要求1所述方法建立的HPV基因酵母体外翻译系统。

6. 权利要求1所述方法建立的HPV基因酵母体外翻译系统用于人乳头瘤病毒(HPV)衣壳蛋白的体外表达。

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