CN100506999C

CN100506999C - Hpv31l1在酵母中的优化表达

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Publication number: CN100506999C
Application number: CNB2004800077258A
Authority: CN
Inventors: K·U·詹森; L·D·舒尔茨; M·P·尼佩; H·Z·马库斯
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Priority date: 2003-03-24
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2009-07-01
Anticipated expiration: 2024-03-19
Also published as: CA2519112C; RU2005132603A; IL171067A; ATE546529T1; CN1761759A; NL300772I2; BRPI0408639A; WO2004084831A3; KR101080628B1; EP1608767A2; AU2004224335A1; US7482428B2; HK1090953A1; ES2381964T3; NO20054889L; NO20054889D0; AU2004224335B2; US20080166371A1; BRPI0408639B8; NO341527B1

Abstract

提供了编码HPV31 L1蛋白质的合成DNA分子。具体地，本发明提供了编码HPV31 L1蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸没有酵母识别的内部转录终止信号。还提供了编码HPV31 L1的合成多核苷酸，其中该多核苷酸已经经密码子优化以在酵母细胞中高水平表达。该合成分子可用于产生HPV31病毒类似颗粒(VLPs)，和产生含有HPV31 VLPs的疫苗和药物组合物。本发明的疫苗通过中和抗体和细胞介导的免疫提供了针对乳头瘤病毒感染的有效免疫预防。

Description

HPV31L1在酵母中的优化表达

本申请要求在2003年3月24日递交的美国临时申请号60/457,172的利益，将所述专利的内容完整并入本文作为参考.

发明领域

本发明一般涉及人乳头瘤病毒(HPV)的治疗.更具体地，本发明涉及编码HPV31 L1蛋白质的合成多核苷酸，还涉及含有所述多核苷酸的重组载体和宿主.本发明还涉及HPV31病毒类似颗粒(VLPs)和它们在用于预防和治疗HPV的疫苗和药物组合物中的用途.

发明背景

有80种以上的人乳头瘤病毒(HPV)，许多与多种生物表型有关，这些表型从良性增殖性瘤到恶性癌(综述见McMurray等人，Int.J.Exp.Pathol.82(1):15-33(2001)).HPV6和HPV11是最通常与良性瘤、非恶性尖锐湿疣和/或生殖或呼吸粘膜的低等发育异常相关的类型.HPV16和HPV18是高危险类型，最经常与宫颈、阴道、阴门和肛管的原位和侵染性癌相关.90％以上的宫颈癌与HPV16、HPV18或者较不普遍的致癌类型HPV31、-33、-45、-52和-58有关(Schiffman等人，J.Natl.Cancer Inst.85(12)：958-64(1993)).观察到在90-100％宫颈癌中检测到HPV DNA，该观察提供了有力的疫学证据证明HPVs导致宫颈癌(见Bosch等人，J.Clin.Pathol.55：244-265(2002)).

乳头瘤病毒是小的(50-60nm)、无被膜的十二面体DNA病毒，其编码多达8种早基因和2种晚基因.病毒基因组的可读框(ORFs)称作E1到E7，和L1和L2，其中“E”代表早，“L”代表晚.L1和L2编码病毒壳体蛋白质，而E基因与诸如病毒复制和细胞转化的功能有关.

L1蛋白质是主要的壳体蛋白并且具有55-60kDa的分子量.L2蛋白质是次要的壳体蛋白。免疫学数据表明多数L2蛋白质是L1蛋白质内部的.L1和L2蛋白质在不同乳头瘤病毒中都高度保守.

L1蛋白质或者L1和L2蛋白质在酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或者细菌中的表达导致病毒类似颗粒(VLPs)的自装配(综述见Schiller和Roden，Papillomavirus Reviews：Current Research onPapillomaviruses；Lacey，编者Leeds，UK：Leeds MedicalInformation，101-12页(1996)).VLP在形态上与真实的病毒体相似并且当施用于动物或者人时能够诱导高效价中和抗体.因为VLPs不含有潜在的致癌病毒基因组，所以它们提供了HPV疫苗开发中对活病毒使用的安全的备选方案(综述见Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol.19：67-74(2000)).为此，已经将L1和L2基因鉴定为开发HPV感染和疾病的预防和治疗性疫苗的免疫靶标.

HPV疫苗开发和商业化受到了与在成功转化的宿主生物中得到壳体蛋白的高表达水平有关困难的阻碍，限制了纯化蛋白质的生产.因此，尽管鉴定了编码HPV L1蛋白质如HPV31L1蛋白质的野生型核苷酸序列(Goldsborough等人，Virology 171(1)：306-311(1989)，将非常希望开发粗品HPV蛋白质的容易更新的来源，所述来源利用在目标宿主细胞中优化表达的HPV31L1编码核苷酸序列.此外，有用的是产生大量具有天然蛋白质的免疫赋予性质的HPV31L1VLPs以用于疫苗开发.

发明概述

本发明涉及用于引起或增强对HPV31 L1基因表达的蛋白质产物的免疫性的组合物和方法，其中HPV31 L1基因与宫颈癌有关.具体地，本发明提供了编码HPV31 L1蛋白质的多核苷酸，其中所述多核苷酸没有酵母识别的内部转录终止信号.还提供了编码HPV31 L1的合成多核苷酸，其中所述多核苷酸已经经密码子优化以在酵母细胞中高水平表达.本发明还提供了HPV31病毒类似颗粒(VLP)并公开了所述VLPs在用于预防和/或治疗HPV疾病或者HPV-相关的癌症的免疫原性组合物和疫苗中的用途.

本发明还涉及编码HPV31 L1蛋白质的合成DNA分子.在本发明的一方面，改变合成分子的核苷酸序列以除去酵母识别的转录终止信号.另一方面，设计合成分子的密码子使得使用酵母细胞优选的密码子.所述合成分子可用作HPV31 L1蛋白质的来源，所述蛋白质可以自身装配成VLPs.所述VLPs可以用于基于VLP的疫苗.

本发明的具体实施方案包括合成的核酸分子，其编码如SEQ IDNO：4中提出的HPV31L1蛋白质，所述核酸分子含有如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中提出的核苷酸序列.

如上所述，文中提供了编码HPV31 L1基因的合成的多核苷酸，其没有酵母识别的转录终止信号.本发明还提供了编码如所述的HPV31 L1的合成多核苷酸，将其进一步改变以含有酵母细胞优选的密码子。

还提供了含有整个说明书中公开的核酸分子的重组载体和重组宿主细胞，该宿主细胞可以是原核或者真核的.

本发明涉及在重组宿主细胞中表达HPV31 L1蛋白质的方法，其包括：(a)将含有编码HPV31 L1蛋白质的核酸导入酵母宿主细胞；其中所述核酸分子没有酵母识别的内部转录终止信号和；(b)在允许所述HPV31 L1蛋白质表达的条件下培养所述宿主细胞.

本发明还涉及在重组宿主细胞中表达HPV31 L1蛋白质的方法，其包括：(a)将含有编码HPV31 L1蛋白质的载体导入酵母宿主细胞；其中所述核酸分子受到密码子优化以在酵母宿主细胞中最佳表达和；(b)在允许所述HPV31 L1蛋白质表达的条件下培养酵母宿主细胞.

在优选实施方案中，所示核酸含有如SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3中提出的核苷酸序列.

本发明还涉及HPV31病毒类似颗粒(VLPs)、产生HPV31 VLP的方法，和使用HPV31 VLP的方法.

在本发明的优选实施方案中，在酵母中产生HPV31 VLP.在进一步优选的实施方案中，酵母选自：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、胞壁克鲁维氏酵母(Kluyvermyces fragilis)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、和粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe).

本发明的另一方面是HPV31 VLP，其含有无酵母识别的转录终止信号的HPV31 L1基因产生的HPV31 L1蛋白质.

本发明的另一方面是HPV31 VLP，其含有经密码子优化的HPV31L1基因产生的HPV31 L1蛋白质.在本发明的该方面的优选实施方案中，经密码子优化的HPV31 L1基因基本上由SEQ ID NO：2或SEQID NO：3中提出的核苷酸序列组成.

本发明还提供了在动物中诱导免疫应答的方法，该方法包括对该动物施用HPV31病毒类似颗粒.在优选实施方案中，通过密码子优化的基因产生HPV31 VLP.在进一步优化的实施方案中，通过无酵母识别的转录终止序列的基因产生HPV31 VLP.

本发明的另一方面是防止或治疗HPV-相关的宫颈癌的方法，该方法包括对哺乳动物施用含有HPV31 VLP的疫苗.在本发明的该方面的优选实施方案中，在酵母中产生HPV31 VLP.

本发明还涉及含有HPV31病毒类似颗粒(VLPs)的疫苗.

在本发明的该方面的备选实施方案中，所述疫苗还含有至少一种额外HPV类型的VLPs.在优选实施方案中，至少一种额外的HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68.

如说明书全文和所附权利要求书中所用的，除非明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数.

如说明书全文和所附权利要求书中所用的，应用下面的定义和简写：

术语“启动子”指DNA链上RNA聚合酶结合的识别位点.启动子与RNA聚合酶形成起始复合体以开始和驱动转录活性.通过称作“增强子”或者“上游活化序列”的活化序列或者称作“沉默子”的抑制序列可以修饰该复合体.

术语“载体”指某些工具，通过它们可以将DNA片段导入宿主生物或者宿主组织中.有多种类型的载体，包括质粒、病毒(包括腺病毒)、噬菌体和粘粒.

名称“31L1野生型序列”指如SEQ ID NO：1中公开的HPV31 L1序列.尽管HPV 31 L1野生型序列以前已被描述，但是在从临床分离物所得的DNA之间发现小的序列差异并不罕见.因此，代表性HPV31L1野生型序列从以前表明含有HPV31 DNA的临床样品分离(见实施例1).31 L1野生型序列用作参考序列以比较文中公开的经密码子优化的HPV31 L1序列(见图1).

名称“31 L1部分重建”指文中公开的构建体(SEQ ID NO：2)，其中HPV31 L1核苷酸序列经部分重建而含有用于在酵母中最佳表达的酵母优化的密码子.31 L1部分重建包括在HPV 31 L1野生型核苷酸序列的中间部分(核苷酸697-1249)改变.重建带有酵母优选的密码子的完整HPV 31 L1序列，其在文中也称作“31 L1完全重建”(SEQ ID NO：3).

术语“有效量”指导入足够疫苗组合物以产生足够水平的多肽，从而导致免疫应答.本领域技术人员将认识到该水平可以改变.

“保守氨基酸替换”指将一个氨基酸残基通过另一个化学上相似的氨基酸代替.这种保守替换的实例为：用一个疏水残基(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或者甲硫氨酸)替换另一疏水残基；用一个极性残基替换相同电荷的另一个极性残基(例如，精氨酸替换赖氨酸；谷氨酸替换天冬氨酸).

术语“哺乳动物”指任意哺乳动物，包括人类.

“VLP”或者“VLPs”指病毒类似颗粒.

“合成的”指HPV31 L1基因已经受到修饰从而其含有与天然发生的野生型HPV31 L1基因中存在的核苷酸序列不同的核苷酸序列.如上文所述，文中提供了合成分子，其含有经改变而除去酵母识别的转录终止信号的核苷酸序列.文中还提供了含有酵母细胞表达所优选的密码子的合成分子.文中提供的合成分子编码与野生型HPV31 L1基因相同的氨基酸序列.

附图简述

图1是序列比对，其显示了部分改变的(SEQ ID NO：2)和完全重建的(SEQ ID NO：3)的31 L1基因的核苷酸(见实施例2).参考序列为31L1野生型序列(SEQ ID NO：1，见实施例1).与参比序列相同的31L1部分和完全重建序列中的核苷酸以点表示.经改变的核苷酸在它们相应位置指出.括号中含有核苷酸编号.

图2显示了31 L1完全重建核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4).在左边指出核苷酸编号.

图3概述了三种HPV31 L1序列构建体之间的改变，其在左边列出.第四栏指出所示构建体和31 L1野生型序列之间的百分数核苷酸同一性，第五栏指出氨基酸同一性.最后一栏指出改变成酵母优选的密码子序列的核苷酸编号和作出改变的区域.

图4显示了在高度严格条件下对HPV31 L1特异的RNA印迹(见实施例4).左边的箭头指出HPV31 L1全长和截短的转录物的位置.标记“31wt”的泳道来自含有31 L1野生型序列的酵母的相同RNA制备物.标记“16”的泳道含有来自HPV16的RNA，由于高度严格条件，所述RNA不被HPV31 L1探针识别.标记“Neg”的泳道是不含有L1编码序列的酵母提取物.标记“31R”的泳道来自两种单独分离的表达31 L1部分重建序列的菌落的RNA.

图5显示了来自两种捕获放射免疫测定法(RIA)实验的数据的部分，其以计数/分钟(cpm)/mg总蛋白质表示(见实施例7).RIA中所得Cpm是HPV31 L1 VLPs的相对指示.RIA数据表明来自酵母优选的密码子重建基因序列的酵母蛋白质提取物中增加的31 L1 VLP表达.

图6显示了通过透射电镜术显现的文中描述的31 L1 VLPs的代表性样品(见实施例8).条形代表100nm.

发明详述

多数宫颈癌与人乳头瘤病毒(HPV)的特定致癌类型的感染有关.本发明涉及用于引起或增强对致癌HPV类型的基因表达的蛋白质产物的免疫的组合物和方法。具体地，本发明提供了编码HPV31 L1蛋白质的多核苷酸和HPV31病毒类似颗粒(VLP)，并公开了所述多核苷酸和VLPs在用于预防和/或治疗HPV相关癌症的免疫原性组合物和疫苗中的用途.

已经报导了野生型HPV31 L1核苷酸序列(Goldsborough等人，Virology 171(1)：306-311(1989)；Genbank保藏号J04353).本发明提供了编码HPV31 L1蛋白质的合成的DNA分子.本发明的合成分子含有核苷酸序列，其中一些核苷酸已经经改变从而除去了酵母识别的转录终止信号.在备选实施方案中，设计合成分子的密码子从而使用酵母细胞优选的密码子以便高水平表达.合成分子可用作HPV31 L1蛋白质的来源，所述蛋白质可以自装配成VLPs.所述VLPs可用于基于VLP的疫苗以通过中和抗体和细胞介导的免疫提供针对乳头瘤病毒感染的有效免疫预防.此类基于VLP的疫苗也可用于治疗已经确定的HPV感染.

在酵母细胞中表达HPV VLPs的优点是效能成本合算并且容易适于在发酵罐中大规模生长。然而，许多HPV L1蛋白质，包括HPV31L1(见实施例4)，在酵母细胞中低水平表达.根据本发明已经确定HPV31 L1的低水平表达是由于存在酵母识别的转录终止信号导致mRNA转录物的截短.通过改变HPV31 L1 DNA以除去类似酵母转录终止位点的任何可能的序列，有可能促进全长mRNA的转录，从而增加HPV31 L1蛋白质表达.

因此，在本发明的一些实施方案中，已经对HPV31 L1 DNA进行了改变以除去类似酵母转录终止信号的任何可能的序列.这些改变使得可以表达全长HPV31转录物，相对于截短的转录物(见实施例4)，提高了表达产率.

如上文提到的，本发明的合成DNA含有对野生型HPV31 L1序列的改变，所述改变用于除去酵母识别的转录终止位点.本领域中技术人员将认识到可以构建编码HPV31 L1蛋白质的额外的DNA分子，但是其不含有酵母转录终止位点.关于发现酵母转录终止序列的技术是本领域中熟知的.酵母mRNA的转录终止和3’末端形成需要存在三种信号：(1)效率元件，如TATATA或者相关序列，所述效率元件增强位于下游的定位元件(positioning elements)的效率；(2)定位元件，其确定poly(A)位点的位置和(3)多聚腺苷酸化位点(通常Py(A)n).

有大量科学文献描述编码酵母转录终止信号的序列.见，例如，Guo和Sherman，Trends Biochem.Sci.21：477-481(1986)；Guo和Sherman，Mol.Cell.Biol.16(6)：2772-2776(1996)；Zaret等人，Cell 28：563-573(1982)；Henikoff等人，Cell 33：607-614(1983)；Thalenfeld等人，J.Biol.Chem.258(23)：14065-14068(1983)；Zaret等人，J.Mol.Biol.176：107-135(1984)；Heidmann等人，Mol.Cell Biol 14：4633-4642(1984)；和Russo，Yeast 11：447-453(1985).因此，本领域技术人员对于确定避免哪些序列以构建产生根据本发明的全长mRNA转录物的合成的HPV31 L1基因是没有困难的.此外，用于评估合成序列中是否存在酵母转录终止序列的测定法和步骤是本领域中成熟的，因此，普通技术人员将能够确定所构建的HPV31 L1序列是否含有需要除去的终止序列.

如上述，本发明涉及编码HPV型31L1蛋白质的核酸分子，该核酸分子没有酵母识别的内部转录终止信号.在本发明的代表性实施方案中，合成的核酸分子含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中给出的核苷酸序列.

在本发明的备选实施方案中，HPV31 L1基因序列经“优化”以在酵母细胞环境中高水平表达.本发明预期的经密码子优化的HPV31L1基因包括编码无酵母识别的内部转录终止信号的HPV31 L1的合成分子，还包括经密码子优化以在酵母细胞中高水平表达的至少一种密码子.

四种可能的核苷碱基的“三联体”密码子可以以60种以上的变体形式存在.因为这些密码子为仅20种不同的氨基酸提供信息(以及转录起始和终止信息)，一些氨基酸可以由一种以上的密码子编码，该现象称作密码子冗余.由于不完全了解的原因，备选密码子不均匀地存在于不同类型细胞的内源DNA中.实际上，在某种类型细胞中似乎存在可变的天然级别或者对某些密码子的“优选”.作为一个实例，氨基酸亮氨酸由包括CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、和TTG的六种DNA密码子的任一个指定.对微生物的基因组密码子频率的彻底分析已经揭示大肠杆菌(E.coli)的内源DNA最通常含有CTG亮氨酸指定密码子，而酵母和粘液菌类的DNA最通常包括TTA亮氨酸指定密码子.考虑到该级别，通常认为通过大肠杆菌宿主得到富含亮氨酸的多肽的高水平表达将在某种程度上取决于密码子使用频率.例如，可能富含TTA密码子的基因在大肠杆菌中的表达将很差，而富含CTG的基因可能在该宿主中高水平表达.类似地，在酵母宿主细胞中富含亮氨酸的多肽的表达的优选密码子将是TTA.

密码子优选现象对重组DNA技术的含义是显然的，并且该现象可以用于解释为了实现在成功转化的宿主生物中高水平表达外源基因的许多以前的失败—所插入的基因中可能重复存在较不“优选”的密码子并且进行表达的宿主细胞机器不能有效运行.该现象暗示经设计而包括计划的宿主细胞优选密码子的合成基因将提供用以实施重组DNA技术的外来遗传物质的优选形式.从而，本发明的一方面是经密码子优化以在酵母细胞中表达的HPV31 L1基因.在本发明的优选实施方案中，已经发现使用编码相同蛋白质序列的备选密码子可以除去对酵母细胞表达HPV31 L1蛋白质的抑制.

根据本发明，将HPV31 L1基因节段转化成具有相同的翻译序列但是具有如Sharpand Cowe(Synonymous Codon Usage inSaccharomyces cerevisiae。Yeast 7：657-678(1991))所描述的备选密码子选择的序列，将所述文献并入本文作为参考.该方法通常由鉴定野生型序列中通常不与高水平表达的酵母基因相关的密码子并将这些密码子由最佳密码子替换以在酵母细胞中高水平表达组成.然后检查新基因序列中通过这些密码子替换产生的不想要的序列(例如，“ATTTA”序列、不小心产生的内含子剪接识别位点、不想要的限制性酶位点，等等).通过将现有密码子用编码相同氨基酸的不同密码子替换除去不想要的序列。然后检验所合成的基因节段的提高的表达.

用上述方法产生合成的HPV31 L1基因节段，导致含有为高水平表达优化的密码子的基因.尽管上面的方法提供了我们关于设计用于HPV疫苗中的经密码子优化基因的方法学概述，但是本领域技术人员可以理解通过该方法中的微小改变或者通过序列中的小的变化可以实现相似的疫苗功效或者增加的基因表达.

因此，本发明涉及合成的核苷酸序列，其含有编码HPV31 L1蛋白质或者HPV31 L1蛋白质的生物活性片段或者突变形式的核苷酸序列，还涉及含有为在酵母宿主中表达优化的密码子的多核苷酸序列.所述HPV31 L1蛋白质的突变形式包括，但不限于：保守氨基酸替换、氨基酸末端截短、羧基末端截短、缺失、或者加入.任何这种生物活性片段和/或突变体将编码至少基本上模拟SEQ ID NO：4中提出的HPV31 L1蛋白质的免疫学性质的蛋白质或者蛋白质片段.本发明的合成多核苷酸编码表达功能HPV31 L1蛋白质的mRNA分子从而可用于开发治疗性或预防性HPV疫苗.

本发明的一方面是编码SEQ ID NO：4中提出的HPV31 L1蛋白质的经密码子优化的核酸分子，所述核酸分子含有SEQ ID NO：2中提出的核酸序列.

本发明的另一方面是编码SEQ ID NO：4中提出的HPV31 L1蛋白质的经密码子优化的核酸分子，所述核酸分子含有SEQ ID NO：3中提出的核苷酸序列.

本发明还涉及原核生物和真核生物的重组载体和重组宿主细胞，所述重组载体和重组宿主细胞含有该说明书全文中公开的核酸分子.

通过文中描述的方法构建的合成HPV31 DNA或者其片段可以通过将其分子克隆到含有适宜的启动子和其他适宜的转录调节元件的表达载体中并用该表达载体转化到原核或真核宿主细胞以产生重组HPV31 L1进行重组表达.这些操作的技术在文献中公开(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，(1989)；CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel等人，Green Pub.Associatesand Wiley-Interscience，New York(1988)；YeastGenetics：ALaboratory Course Manual，Rose等人，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1990)，将这些文献完整并入本文作为参考).

从而，本发明还涉及在重组宿主细胞中表达HPV31 L1蛋白质的方法，该方法包括：(a)将含有编码HPV31 L1蛋白质的核酸的载体导入酵母宿主细胞；其中该核酸分子经密码子优化以在酵母宿主细胞中最佳表达和；(b)在允许所述HPV31 L1蛋白质表达的条件下培养酵母宿主细胞.

本发明还涉及在重组宿主细胞中表达HPV31 L1蛋白质的方法，其包括：(a)将含有编码HPV31 L1蛋白质的核酸的载体导入酵母宿主细胞；其中该核酸分子没有酵母识别的内部转录终止信号和；(b)在允许所述HPV31 L1蛋白质表达的条件下培养酵母宿主细胞.

本发明还涉及在重组宿主细胞中表达HPV31 L1蛋白质的方法，其包括：(a)将含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中提出的核酸的载体导入酵母宿主细胞；和(b)在允许所述HPV31 L1蛋白质表达的条件下培养宿主细胞。

本发明的合成基因可以装配到表达盒中，该表达盒含有经设计以提供在宿主细胞中有效表达HPV58 L1蛋白质的序列.该盒优选含有合成基因，其可操作地连接转录和翻译控制序列，如启动子和终止序列。在优选实施方案中，启动子为酿酒酵母GAL 1启动子，然而本领域技术人员将认识到可以使用许多其他公知的酵母启动子的任一种，如GAL10、GAL7、ADH1、TDH3或PGK启动子，或者其他真核基因启动子.优选的转录终止子是酵母ADH1终止子，尽管也可以使用其他公知的转录终止子.尤其优选GAL1启动子-ADH1终止子的联合.

本发明的另一方面是HPV31病毒类似颗粒(VLP)、产生HPV31VLP的方法，和使用HPV31 VLP的方法.当人和动物乳头瘤病毒的主要壳体蛋白质L1在酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或者细菌中表达时，VLPs可以自装配(综述见Schiller和Roden，PapillomavirusReviews：Current Researchon Papillomaviruses；Lacey，编者Leeds，UK：Leeds Medical Information，101-12页(1996)).通过L1和L2壳体蛋白质组合的表达可以产生形态上难以辨别的HPV VLPs.VLPs在T＝7二十面体结构中由L1的72个五聚体组成(Baker等人，Biophys.J.60(6)：1445-56(1991)).

VLPs在形态上类似于真实的病毒体并且在施用于动物时能够诱导高效价的中和抗体.证明用VLPs免疫兔(Breitburd等人，J.Virol.69(6)：3959-63(1995))和狗(Suzich等人，Proc.Natl.Acad.Sci.MM92(25)：11553-57(1995))都诱导针对实验乳头瘤病毒感染的中和抗体和保护.然而，因为VLPs不含有潜在的致癌病毒基因组并且可以从一种基因自装配，所以它们为HPV疫苗开发中活病毒的使用提供了安全的备选方案(综述见Schiller和Hidesheim，J.Clin.Virol.19：67-74(2000)).

从而，本发明涉及由HPV31的重组L1蛋白质或者重组L1+L2蛋白质组成的病毒类似颗粒.

1.在本发明的优选实施方案中，在酵母中产生HPV31 VLPs.在进一步优选的实施方案中，酵母选自酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母和粟酒裂殖糖酵母.

本发明的另一方面是HPV31 VLP，其含有没有酵母识别的内部转录终止信号的HPV31 L1基因产生的HPV31 L1蛋白质.

本发明的另一方面是含有经密码子优化的HPV31 L1基因产生的HPV31 L1蛋白质的HPV31 VLP.在本发明该方面的优选实施方案中，经密码子优化的HPV31 L1基因基本上由SEQ ID NO：2或SEQID NO：3中提出的核苷酸的序列组成.

本发明的再一个方面是产生HPV31 VLPs的方法，其包括：(a)用编码HPV31 L1蛋白质或者HPV31 L1+L2蛋白质的重组DNA分子转化酵母；(b)在允许表达重组DNA分子产生重组HPV31蛋白质的条件下培养所转化的酵母；和(c)分离重组HPV31蛋白质以产生HPV31 VLP.

在本发明该方面的优选实施方案中，用没有酵母识别的转录终止信号的HPV31 L1基因转化酵母.在另一优选实施方案中，用经密码子优化的HPV31 L1基因转化酵母以产生HPV31 VLPs.在尤其优选的实施方案中，经密码子优化的HPV31 L1基因基本上由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中提出的核苷酸的序列组成.

本发明还提供了在动物中诱导免疫应答的方法，该方法包括对该动物施用HPV31病毒类似颗粒.在优选实施方案中，通过无酵母识别的内部转录终止信号的基因产生HPV31 VLPs.在另一优选实施方案中，通过经密码子优化的基因产生HPV31 VLPs.

本发明的再一方面是预防或治疗HPV相关的宫颈癌的方法，该方法包括对哺乳动物施用含有HPV31 VLPs的疫苗.在本发明该方面的优选实施方案中，HPV31 VLPs在酵母中产生.

本发明还涉及含有HPV31病毒类似颗粒(VLPs)的疫苗.

在本发明该方面的备选实施方案中，所述疫苗还含有至少一种额外HPV类型的VLPs.在优选实施方案中，所述至少一种额外HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68.

在本发明该方面的优选实施方案中，疫苗还含有HPV16 VLPs.

在本发明的另一优选实施方案中，疫苗还含有HPV16 VLPs和HPV18 VLPs.

在本发明的另一优选实施方案中，疫苗还含有HPV6 VLPs、HPV11 VLPs、HPV16 VLPs和HPV18 VLPs.

本发明还涉及含有HPV 31病毒类似颗粒的药物组合物.此外，本发明涉及含有HPV31 VLPs和至少一种额外HPV类型的VLPs的药物组合物.在优选实施方案中，所述至少一种额外HPV类型选自：HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68.

本发明的疫苗组合物可以以常规试验界定的适宜剂量单独使用以得到HPV31感染的最佳抑制而最小化任何潜在毒性.此外，其他试剂的共同施用或者顺序施用是所希望的.

将导入疫苗接受者的病毒类似颗粒的量取决于所表达的基因产物的免疫原性.通常将约10μg到100μg，优选约20μg到60μg VLPs的免疫或者预防有效剂量直接施用于肌肉组织.也可以预期皮下注射、皮内导入、通过皮肤透入，和其他施用方式，如腹膜内、静脉内、或者吸入递送.还预期可以提供强化接种.本发明疫苗的肠胃外导入的同时或者随后用佐剂进行肠胃外施用，如静脉内、肌内、皮下或者其他施用方式也是有利的，所述佐剂如明矾或Merck明矾佐剂.

为了描述和公开与本发明有关的方法和材料，将文中提到的所有出版物并入本文作为参考.所有这些参考文献都不应认为承认这些公开作为在先发明而本发明没有资格先于这些公开.

已经参考附图描述了本发明的优选实施方案，将理解本发明不限于那些精确实施方案，并且通过本领域技术人员可以实现多种改变和修饰而不背离所附权利要求书中限定的本发明的范围和精神.

下面的实施例阐明但不限制本发明.

实施例1 确定代表性HPV 31 L1序列

已经报导了HPV31L1野生型序列(Goldsborough等人，Virology171(1)：306-311(1989)；Genbank保藏号J04353).但是在从临床分离物所得的DNA之间发现小的序列差异并不罕见.为了分离代表性HPV31L1野生型序列，从以前表明含有HPV31 L1 DNA的临床样品分离DNA.在聚合酶链式反应(PCR)中用Taq DNA聚合酶和下面的引物：HPV 31 L1 F 5′-CGT CGA CGT AAA CGT GTA TCA TAT TTTTTT ACA G-3′(SEQ ID NO：5)和HPV 31 L1 B 5′-CAG ACA CATGTA TTA CAT ACA CAA C-3′(SEQ ID NO：6)扩增HPV31L1序列。在琼脂糖凝胶上电泳扩增产物并通过溴化乙锭染色显现.切除～1500bp L1带并使用QIA quick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化DNA.将DNA连接到TA克隆载体pCR-II(Invitrogen Corp·，Carlsbad，CA)，大肠杆菌转化，并铺在含有氨苄青霉素和IPTG和用于蓝色/白色菌落选择的X-gal的LB琼脂平板上.将平板颠倒并在37℃孵育16小时.将白色菌落在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，37℃摇动16小时，并进行小量制备以提取质粒DNA.

为了证明质粒中存在L1基因，进行限制性内切酶消化并通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色观看.对含有来自三个临床分离物的每一个的克隆L1的质粒进行DNA测序.将DNA和翻译的氨基酸序列相互比较和与Genbank HPV 31 L1序列比较.三个临床分离物的序列分析揭示没有序列与Genbank序列相同.选择pCR-II-HPV31L1/81克隆为代表性31L1序列并在本文中称作“31L1野生型序列”(SEQ IDNO：1，见图1).选作31L1野生型的序列在核苷酸1266处含有一个沉默替换和在核苷酸1295处C向G的改变，将编码氨基酸从苏氨酸改变成丝氨酸.31L1部分和完全重建基因(分别为SEQ ID NO：2和3)也编码该位置上的丝氨酸(见图1).在所有情况中，氨基酸序列是相同的.在重建构建体中改变核苷酸以使用酵母优选的密码子序列编码氨基酸和除去潜在的转录终止信号(见实施例2).

将31L1野生型序列用LS-101 5′-CTC AGA TCT CAC AAA ACAAAA TGT CTC TGT GGC GGC CTA GC-3′(SEQ ID NO：7)和LS- 102 5′-GAC AGA TCT TAC TTT TTA GTT TTT TTA CGT TTT GCTGG-3′(SEQ ID NO：8)引物扩增以加入BglII延伸.用Vent^TM DNA聚合酶实施PCR.通过琼脂糖凝胶的溴化乙锭染色显现PCR产物.切除-1500bp条条并用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化DNA.然后PCR产物经BglII在37℃消化2小时并使用QIA quick PCR纯化试剂盒纯化.将BglII消化的31L1PCR产物与BamHI消化的pGAL110连接并转化DH5大肠杆菌.通过PCR筛选具有正确方向上HPV31L1插入片段的菌落.通过DNA测序证实序列和方向.所选克隆命名为pGAL110-HPV 31 L1#2.

然后制备Maxiprep DNA并制备感受态酿酒酵母并将其转化.将酵母转化株铺在Lue-山梨醇板上的Leu-山梨醇顶层琼脂中并在30℃颠倒孵育3-5天.挑选菌落并在Leu-山梨醇板上划线分离.为了诱导L1转录和蛋白质表达，将所分离的菌落随后生长在旋转管中含有1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml5×Leu^-Ade^-山梨醇中30℃培养.

实施例2 酵母密码子优化

已经描述了酵母优选的密码子(Sharp和Cowe，Yeast 7：657-678(1991)).最初，用酵母优选的密码子重建HPV31L1的中间部分，其代表核苷酸697-1249.用于重建的策略是设计长的重叠的正义和反义寡聚体，其跨越所要重建的区域，用酵母优选的密码子序列代替原有核苷酸并保持相同的氨基酸序列.这些寡聚体用于替换PCR反应中的模板DNA.设计额外的扩增引物并用于用Pfu DNA聚合酶从模板寡聚体扩增重建序列(Stratagene，La Jolla，CA).扩增的最优条件是片段特异的；然而，多数使用类似下面的程序：94℃1分钟的最初变性步骤，然后是15-25轮95℃30秒变性，55℃30秒退火，72℃3.5分钟延伸，然后是72℃10分钟的最终延伸并保持在4℃.

通过琼脂糖电泳检查PCR产物.将适宜大小的条带切除并用凝胶纯化DNA.所扩增的片段用作模板以装配552个核苷酸重建HPV 31中L1片段.用PCR扩增野生型核苷酸1-725(5’末端)和1221-1515(3’末端).使用5’末端、3’末端和重建的中间部分进行最后PCR以产生全长31L1部分重建，其在本文中称作“31 L1部分重建”.

还用酵母优选的密码子重建了完整31 L1序列.该构建体在文中称作“31 L1完全重建”.用9种长的重叠寡聚体产生从1-753的酵母优选的密码子核苷酸序列，并用四种长的重叠寡聚体产生从1207-1515的酵母优选的密码子核苷酸序列.扩增并凝胶纯化后，这些片段，以及上述中间重建部分(核苷酸697-1249)一起用于PCR反应中以产生全长31 L1完全重建序列.用BamHI延伸产生该片段.将凝胶纯化的重建31 L1 DNA用BamHI消化，连接到BamHI消化的pGAL110表达载体并转化到大肠杆菌DH5细胞中.通过PCR筛选菌落以寻找正确方向的HPV 31 L1插入.通过DNA测序证实序列和方向.

制备质粒DNA.制备感受态酿酒酵母并将其转化.将酵母铺在Leu^-山梨醇板上的Leu^-山梨醇顶层琼脂中并颠倒孵育3-5天.在Leu^-山梨醇板上划线分离菌落.将所分离的菌落随后生长在旋转管中含有1.6％葡萄糖和4％半乳糖的5ml5×Leu^-Ade^-山梨醇中30℃培养以诱导L1转录和蛋白质表达.48-72小时后，沉淀OD600＝10的培养体积，除去上清液，冻干沉淀并在-70℃保存.

实施例3 RNA制备

将所转化酵母的细胞沉淀在冰上解冻并悬浮在1ml冷DEPC处理的水中，其中所述经转化的酵母通过半乳糖诱导而表达HPV 31L1.离心沉淀细胞并除去所得上清液.然后将细胞沉淀重悬浮在400μl TES(10mM Tris pH7.0，10mM EDTA和0.5％SDS)中.加入等体积的AE缓冲液饱和的苯酚(50mM NaOAc和10mM EDTA).将管涡旋10秒并在65℃加热50分钟，每10分钟混合.将管置于冰上5分钟，然后在4℃离心5分钟.收集上清液并将其转移到无菌管中.加入额外的400μl苯酚，管经涡旋，置于冰上5分钟并离心.将上清液转移到无菌管中并加入400μl氯仿，混合并离心.再次收集上清液并转移到无菌管中加入40μl 3M乙酸钠(pH5.2)和1ml100％EtOH.将管置于干冰上1小时，之后将其高速离心以沉淀RNA.然后将RNA悬浮在100μl DEPC处理的水中并在65℃加热5分钟溶解.实施分光光度法以确定样品中RNA浓度，使用如下假定：当A260/280为1.7-2.0时A260读数1＝40μg/ml RNA.

实施例4 RNA印迹分析

对表达31 L1野生型的酵母的初步分析表明HPV 31 L1蛋白质的表达产率显著小于所预期的.为了确定是否由于转录水平和翻译水平上的问题而发生低表达，进行HPV 31 L1转录物的RNA印迹分析.从凝胶进行RNA印迹，在所述凝胶中来自表达HPV16 L1的酵母的RNA和表达HPV31 L1的酵母的RNA在相同凝胶中运行以比较转录物大小.

浇铸1.2％琼脂糖甲醛凝胶.10微克RNA与变性缓冲液(终浓度：6％甲醛、45％甲酰胺和0.9×MOPS)混合并在55℃加热15分钟。加入1/10体积凝胶上样缓冲液并将样品装入凝胶.在65优下1×MOPS缓冲液中进行电泳约5小时.在无菌水中洗涤凝胶15分钟并在10×SSC中洗涤两次，每次5分钟.通过毛细管作用在10×SSC中16小时内将RNA转移到Hybond-N+尼龙膜(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)中.使用设定在700单位能量的Amersham交联仪通过交联将RNA固定到尼龙膜.固定后，允许尼龙膜风干.将膜置于30ml Zetaprobe缓冲液中55℃2小时，之后加入32P标记的探针并在53-65℃孵育16小时.将膜在5×SSC中室温下洗涤3次20分钟，然后在0.4×SSC中室温下洗涤2次20分钟，和60℃下洗涤一次10分钟.通过PCR使用HPV31 L1序列特异的正义和反义引物产生探针DNA.通过用多核苷酸激酶(PNK)和γ-32P ATP在37℃处理1小时标记扩增的DNA.将印迹包在莎伦包装膜中并暴露于x光片16小时.胶片显影时，探针杂交的RNA检测为放射自显影上的黑色带.

对上述RNA印迹的分析表明多数全长HPV 31 L1野生型转录物显著小于全长(见图4).然而，31 L1部分重建经设计不仅插入基因中间的酵母优选的密码子，而且除去类似酵母转录终止位点的任何可能的序列.RNA印迹分析清楚地表明重建时31 L1基因转录物的长度显著增加到相应于全长HPV 16 L1转录物的大小(未显示).从而，未成熟的转录终止可能大部分解释31 L1野生型构建体的低表达产率.

实施例5 HPV 31 L1蛋白质表达

将相当于OD600＝10的半乳糖诱导的培养物的冰冻酵母细胞沉淀在冰上解冻并悬浮在含有2mM PMSF的300μl PC缓冲液(100mMNa₂HPO₄和0.5M NaCl，pH7.0)中.加入酸洗涤的0.5mm玻璃珠，～0.5g/管.将管在4℃涡旋处理15分钟.加入7.5μl20％Triton100并在4℃再次涡旋处理5分钟.将管置于冰上15分钟，然后4℃下离心15分钟.上清液转移到无菌微量离心管中并在-70℃保存.

实施例6 RNA印迹分析

通过蛋白质印迹分析从每种HPV 31 L1构建体的20到40个分离的酵母菌落提取总酵母蛋白质以证实半乳糖诱导后HPV 31 L1蛋白质的表达.

10微克总酵母蛋白质提取物与SDS-PAGE上样缓冲液合并并在95℃加热10分钟.将蛋白质加到8％SDS-PAGE凝胶上并在Tris-甘氨酸缓冲液中电泳.蛋白质分离后，将蛋白质从凝胶Western转移到硝酸纤维素并将印迹在TTBS(Tris缓冲盐溶液与Tween20)中的10％无脂干奶溶液中封闭16小时.在TTBS中洗涤印迹三次.将与HPV31L1交叉反应的多克隆血清——山羊抗trpE-HPV 16 L1血清以TTBS中的1∶1000稀释液在室温下应用1小时.将印迹在TTBS中洗涤3次并将抗-山羊-HRP缀合的抗体以TTBS中的1∶2500稀释液应用1小时.再次洗涤印迹3次并应用ECL^TM检测试剂(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ).进行放射自显影.通过检测试剂将抗血清识别的蛋白质检测为放射自显影照片上的黑色带.

在所有情况中，HPV 31 L1蛋白质被检测为放射自显影照片上相应于约55kD的清晰条带(数据未显示).凝胶上包括作为阳性对照的HPV 16 L1蛋白质.

实施例7 放射免疫测定法(RIA)

通过多种方法生长表达HPV 31 L1的酵母细胞，所述方法包括旋转管培养、摇瓶和发酵罐.裂解酵母并提取蛋白质以确定每毫克总蛋白质产生的HPV 31 L1病毒类似颗粒(VLPs)的量.为了证明HPV31 L1 VLP表达，通过捕获放射免疫测定法(RIA)分析每种总酵母蛋白质提取物的一部分.

用检测单克隆抗体H31.A6进行RIA，所述单克隆抗体是HPV型31特异的和VLP构象特异的.H31.A6对HPV型31 L1特异，因为发现H31.A6结合完整HPV 31 L1 VLPs并且不识别变性的HPV 31VLPs.随后通过I125标记的山羊抗小鼠抗体检测该mAb.因此，每分钟计数(cpm)值相当于HPV 31 L1 VLP表达的相对水平.

将聚苯乙烯珠用山羊抗-trpE-HPV31 L1多克隆血清在PBS中的1∶1000稀释液过夜包被.然后用5体积无菌蒸馏水洗涤珠子并风干。然后将从分离的酵母菌落得到的总酵母蛋白质提取物抗原通过用含有1％BSA、0.1％Tween-20和0.1％叠氮化钠的PBS稀释后加入珠子上并旋转下孵育1小时.洗涤后，珠子以每孔一个分布在20孔聚苯乙烯板中并用以1∶50,000稀释的H31.A6mAb在室温下孵育17-24小时.洗涤珠子并加入活性范围为23000-27000cpm/10μl的I125标记的山羊抗小鼠IgG.2小时后，洗涤珠子并以cpm/ml记录放射性计数.从总cpm/ml扣除来自空白孔的背景值，得到RIA减背景值.

进行两种实验：在实验1中，比较来自31 L1野生型和31 L1部分重建的蛋白质提取物，在实验2中，比较来自31 L1部分重建的和31L1完全重建的蛋白质提取物(见图5).结果表明31 L1部分重建VLP表达比31 L1野生型高6.9倍.31 L1完全重建比31 L1部分重建表达增加1.7倍.因此，通过导入酵母优选的密码子序列和除去潜在的转录终止信号使31 L1表达水平增加了7倍以上.

实施例8 透射电镜术

为了证明BPV 31 L1蛋白质实际上自装配而形成五聚体L1壳体，其又自装配成病毒类似颗粒，将部分纯化的31 L1完全重建蛋白质提取物进行透射电镜术(TEM)分析.酵母在小规模发酵条件下生长并沉淀.将沉淀进行纯化处理.通过免疫印迹分析沉淀和澄清的酵母提取物以证明L1蛋白质表达并通过纯化方法保留.将澄清的酵母提取物在45％蔗糖层上离心并将所得沉淀悬浮在缓冲液中以进行TEM分析(见图6).结果表明该粗制样品中球形颗粒的直径为30到60nm，某些颗粒显示出壳体的规则排列.

序列表

<110>Merck & Co.，Inc.

Jansen，Kathrin U.

Schultz，Loren D.

Neeper，Michael P.

Markus，Henry Z.

<120>HPV 31 L1在酵母中的优化表达

<130>21188-PCT

<150>60/457,172

<151>2003-03-24

<160>8

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>1515

<212>DNA

<213>HPV31 L1野生型

<400>1

<210>2

<211>1515

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>31部分重建

<400>2

<210>3

<211>1515

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>31完全重建

<400>3

<210>4

<211>504

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>HPV 31 L1

<400>4

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>5

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>6

<210>7

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>7

<210>8

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物

<400>8

Claims

1.核酸分子，其由编码SEQ ID NO：4中提出的HPV31 L1蛋白质的核苷酸序列组成，所述核苷酸序列经密码子优化以在酵母细胞中高水平表达。

2.载体，其含有权利要求1的核酸分子。

3.酵母宿主细胞，其含有权利要求2的载体。

4.权利要求3的酵母宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞选自：酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母和粟酒裂殖糖酵母。

5.权利要求4的酵母宿主细胞，其中酵母宿主细胞为酿酒酵母。

6.权利要求1的核酸分子，其中核苷酸序列由SEQ ID NO：2中提出的核苷酸序列组成。

7.载体，其含有权利要求6的核酸分子。

8.酵母宿主细胞，其含有权利要求7的载体。

9.权利要求1的核酸分子，其中核苷酸序列由SEQ ID NO：3中提出的核苷酸序列组成。

10.载体，其含有权利要求9的核酸分子。

11.酵母宿主细胞，其含有权利要求10的载体。

12.病毒类似颗粒(VLPs)，其包含HPV31的重组L1蛋白质，其中所述重组L1蛋白质由SEQ ID NO：4中提出的序列组成并且由HPV31 L1核酸分子编码，该HPV31 L1核酸分子列经密码子优化以在酵母细胞中高水平表达。

13.权利要求12的VLPs，其中在酵母中产生所述重组L1蛋白质或者重组L1+L2蛋白质。

14.权利要求13的VLPs，其中所述重组L1蛋白质或者重组L1+L2蛋白质由经密码子优化的HPV31L1核酸分子编码。

15.权利要求14的VLPs，其中经密码子优化的核酸分子由SEQID NO：2或SEQ ID NO：3中提出的核苷酸序列组成。

16.产生HPV31病毒类似颗粒(VLP)的方法，该方法包括：

(a)用编码HPV 31 L1蛋白质的核酸分子转化酵母细胞，所述HPV 31 L1蛋白质由SEQ ID NO：4中提出的氨基酸序列组成；其中所述核酸分子包含经密码子优化以在酵母细胞中高水平表达的核苷酸序列；

(b)在允许该核酸分子表达的条件下培养经转化的酵母细胞以产生重组乳头瘤病毒蛋白质；和

(c)分离重组乳头瘤病毒蛋白质以产生所述HPV31VLP。

17.疫苗，其含有权利要求14的VLPs。

18.药物组合物，其含有权利要求14的VLPs。

19.权利要求16的方法，其中酵母细胞选自酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤氏酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母和粟???酒裂殖糖酵母。

20.权利要求19的方法，其中酵母细胞为酿酒酵母。

21.权利要求17的疫苗，其还含有至少一种额外HPV类型的VLPs。

22.权利要求21的疫苗，其中所述至少一种额外HPV类型选自HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV55、HPV56、HPV58、HPV59、和HPV68。

23.权利要求22的疫苗，其中所述至少一种HPV类型包括HPV16。

24.权利要求23的疫苗，其还含有HPV18VLPs。

25.权利要求24的疫苗，其还含有HPV6VLPs和HPV11VLPs.