BRPI0408639B1

BRPI0408639B1 - Molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira de levedura e método para produzir partículas semelhantes a vírus de hpv31

Info

Publication number: BRPI0408639B1
Application number: BRPI0408639-2A
Authority: BR
Inventors: Kathrin U. Jansen; Loren D. Schultz; Michael P. Neeper; Henry Z. Markus
Original assignee: Merck Sharp & Dohme Corp
Priority date: 2003-03-24
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2020-08-18
Also published as: CA2519112C; AU2004224335B2; US20080166371A1; KR20050119141A; NO341527B1; NO20054889L; ES2381964T3; NO2018010I1; AU2004224335A1; WO2004084831A2; NL300772I2; IS2859B; CN100506999C; MXPA05010285A; IL171067A; RU2356943C2; US7276243B2; BRPI0408639B8; ECSP056032A; HK1090953A1

Abstract

molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, partículas semelhantes a vírus, método para produzir partículas semelhantes a vírus, vacina, composições farmacêuticas, e, métodos para prevenir a infecção por hpv e para induzir uma resposta imune em um animal. as moléculas de dna sintéticas que codificam a proteína hpv31 l1 são fornecidas. especificamente, a presente invenção fornece polinucleotídeos que codificam a proteína hpv31 l1, em que os ditos polinucleotídeos são isentos de sinais de terminação de transcrição internos que são reconhecidos pela levedura. também são fornecidos polinucleotídeos sintéticos que codifica hpv31 l1 em que os polinucleotídeos foram otimizados por códon para a expressão de alto nível em uma célula de levedura. as moléculas sintéticas podem ser usadas para produzir partículas semelhantes ao vírus hpv31 (vlps) e para produzir vacinas e composições farmacêuticas que compreendem os hpv31 vlps. as vacinas da presente invenção fornecem imunoprofilaxia eficaz contra infecção por papilomavírus através do anticorpo neutralizador e imunidade mediada por célula.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Condicional U.S. N° 60/457.172 depositado em 24 de março de 2003, cujos conteúdos são incorporados neste por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção, no geral, diz respeito, no geral, à terapia contra o papilomavírus humano (HPV). Mais especificamente, a presente invenção diz respeito a polinucleotídeos sintéticos que codificam proteína HPV31 LI e a vetores e hospedeiros recombinantes que compreendem os ditos polinucleotídeos. Esta invenção também diz respeito a partículas semelhantes ao vírus HPV31 (VLPs) e a seu uso em vacinas e composições farmacêuticas para prevenir e tratar HPV.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Existem mais do que 80 tipos de papilomavírus humano (HPV), muitos dos quais foram associados com uma ampla variedade de fenótipos biológicos, a partir de verrugas proliferativas benignas a carcinomas malignos (para revisão, ver McMurray et ai., Int. J. Exp. Pathol. 82 (1): 15 a 33 (2001)). HPV6 e HPV11 são os tipos mais comumente associados com verrugas benignas, condilomata acuminado não malignos e/ou displasia de grau baixo da mucosa genital ou respiratória. O HPV16 e o HPV18 são os tipos de alto risco mais frequentemente associados com carcinoma in situ e invasivos do nuca, vagina, vulva e canal. Mais do que 90 % dos carcinomas cervicais são associados com infecções de HPV16, HPV18 ou os tipos oncogênicos menos prevalecentes HPV31, -33, -45, -52 e -58 (Schiffman et al., J. Natl. Cancer Inst. 85 (12): 958-64 (1993)). A observação de que o DNA de HPV é detectado de 90 a 100 % dos cânceres cervicais fornece evidência epidemiológica forte que os HPVs causam cervical carcinoma (ver Bosch et a!., J. Clin. Pathol. 55: 244-265 (2002)).

[004] Os papilomavírus são vírus de DNA pequenos (50 a 60 nm), não envelopados, icosaédricos que codificam até oito genes precoces e dois tardios. As estruturas de leitura abertas (ORFs) dos genomas virais são designados de El a E7 e LI e L2, onde "E" denota precursor e "L" denota tardio. LI e L2 codificam as proteínas capsídicas de vírus, enquanto os genes E são associados com as funções tais como a replicação virai e a transformação celular.

[005] As proteínas LI são a proteína capsídica principal e têm um peso molecular de 55 a 60 kDa. A proteína L2 é uma proteína capsídica menor. Os dados imunológicos sugerem que a maioria das proteínas L2 é interna com relação à proteína Ll. Tanto a proteína LI quanto a L2 são altamente conservadas entre os papilomavírus diferentes.

[006] A expressão da proteína Ll ou uma combinação das proteínas Ll e L2 em levedura, células de inseto, células de mamífero ou bactérias leva à automontagem de partículas semelhantes a vírus (VLPs) (para revisão, ver Schiller and Roden, em Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomavirus; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)). As VLPs são morfologicamente similares à virions autênticos e são capazes de induzir tituladores altos de anticorpos neutralizadores na administração a um animal ou um ser humano. Por causa das VLPs não conterem o genoma virai potencialmente oncogênico, estes apresentam uma alternativa segura ao uso de vírus vivos no desenvolvimento da vacina contra HPV (para revisão, ver Schiller e Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67 a 74 (2000) ). Por esta razão, os genes de Ll e L2 foram identificados como alvos imunológicos para o desenvolvimento de vacinas profiláticas e terapêuticas contra a infecção e doença de HPV.

[007] O desenvolvimento e a comercialização da vacina contra foi impedido por dificuldades associadas coma obtenção de níveis de expressão altos de proteínas capsídicas em organismos hospedeiros bem sucedidamente transformados, limitando a produção de proteína purificada. Portanto, a despeito da identificação de sequências de nucleotídeo do tipo selvagem que codificam proteínas HPV LI tais como proteínas de HPV31 LI (Goldsborough et al., Virology 171(1): 306 a 311 (1989), deve ser altamente desejável desenvolver uma fonte facilmente renovável de proteínas de HPV brutas que utilizam sequências de nucleotídeo que codificam HPV31 LI que são otimizados quanto à expressão na célula hospedeira pretendida. Adicionalmente, deve ser útil para produzir grandes quantidades de VLPs de HPV31 LI tendo as propriedades que conferem imunidade das proteínas naturais para o uso no desenvolvimento de vacina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção diz respeito a composições e métodos para evocar ou intensificar a imunidade aos produtos de proteína expressados pelos genes de HPV31 Ll, que foram associados como câncer cervical. Especificamente, a presente invenção fornece polinucleotídeos que codificam a proteína HPV31 Ll, em que ditos polinucleotídeos são isentos de sinais de terminação de transcrição internos que são reconhecidos pela levedura. Também são fornecidos polinucleotídeos sintéticos que codificam HPV31 Ll em que os polinucleotídeos foram códon-otimizados para a expressão de alto nível em uma célula de levedura. A presente invenção ainda fornece partículas semelhantes ao vírus HPV31 (VLPs) e divulga o uso de VLPs em composições imunogênicas e vacinas para a prevenção e/ou tratamento de doença de HPV câncer associado com HPV.

[009] A presente invenção diz respeito a moléculas de DNA sintéticas que codificam uma proteína HPV31 Ll. Em um aspecto da invenção, a sequência de nucleotídeo da molécula sintética é alterada para eliminar os sinais de terminação de transcrição que são reconhecidos pela levedura. Em um outro aspecto, os códons das moléculas sintéticas são projetados a fim de usar os códons preferidos por uma célula de levedura. As moléculas sintéticas podem ser usadas como uma fonte de proteína HPV31 Ll, que pode se auto-montar em VLPs. As ditas VLPs podem ser usadas em uma vacina com base em VLP.

[010] Uma forma de realização particular da presente invenção compreende uma molécula de ácido nucleico sintética que codifica a proteína HPV31 Ll como apresentado na SEQ ID NO: 4, a dita molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[011] Como estabelecido acima, são fornecidos neste os polinucleotídeos sintéticos que codificam o gene de HPV31 Ll que são isentos de dos sinais de terminação de transcrição que são reconhecidos pela levedura. Esta invenção também fornece polinucleotídeos sintéticos que codificam HPV31 Ll como descrito, que ainda são alterados a fim de conter os códons que são preferidos pelas células de levedura.

[012] Também são fornecidos vetores recombinantes e células hospedeiras recombinantes, tanto procarióticas quanto eucarióticas, que contém as moléculas de ácido nucleico por todo este relatório descritivo.

[013] A presente invenção diz respeito a um processo para a expressão de uma proteína HPV31 Ll em uma célula hospedeira recombinante, que compreende: (a) introduzir um vetor que compreenda um ácido nucleico que codifica uma proteína HPV31 Ll em uma célula hospedeira de levedura; em que a molécula de ácido nucleico é isenta de sinais de terminação de transcrição internos que são reconhecidos pela levedura e; (b) cultivar a célula hospedeira de levedura sob condições que permitam a expressão da dita proteína de HPV31 Ll.

[014] A presente invenção ainda diz respeito a um processo para a expressão e uma proteína HPV31 Ll em uma célula hospedeira recombinante, que compreende: (a) introduzir um vetor que compreenda um ácido nucleico que codifica uma proteína HPV31 Ll em uma célula hospedeira de levedura; em que a molécula de ácido nucleico é códon-otimizada para a expressão ótima na célula hospedeira de levedura e; (b) cultivar a célula hospedeira de levedura sob condições que permitam a expressão da dita proteína HPV31 Ll.

[015] Em formas de realização preferidas, o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[016] Esta invenção também diz respeito a partículas semelhantes ao vírus HPV31 (VLPs), métodos de produzir VLPs de HPV31 e métodos de usar VLPs de HPV31.

[017] Em uma forma de realização preferida da invenção, as VLPs de HPV31 são produzidas em levedura. Em uma outra forma de realização preferida, a levedura é selecionada do grupo que consiste em: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe.

[018] Um outro aspecto desta invenção é um VLP de HPV31, que compreende uma proteína HPV31 Ll produzido por um gene de HPV31 Ll que é isento de sinais de terminação de transcrição que são reconhecidos pela levedura.

[019] Ainda, um outro aspecto desta invenção é um VLP de HPV31, que compreende uma proteína HPV31 Ll produzida por um gene códon-otimizado de HPV31 Ll. Em uma forma de realização preferida deste aspecto da invenção, o gene códon-otimizado de HPV31 Ll consiste, essencialmente de uma sequência de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[020] Esta invenção também fornece um método para a produção de uma resposta imune em um animal que compreendem administrar partículas semelhantes ao vírus HPV31 ao animal. Em uma forma de realização preferida, as VLPs de HPV31 são produzidas por um gene códon-otimizado. Em uma outra forma de realização preferida, as VLPs de HPV31 são produzidas por um gene que é isento de sequências de terminação de transcrição que são reconhecidas pela levedura.

[021] Ainda um outro aspecto desta invenção é um método de evitar ou tratar o câncer cervical associado com HPV que compreende administrar a um mamífero uma vacina que compreendem VLPs de HPV31. Em uma forma de realização preferida deste aspecto da invenção, as VLPs de HPV31 são produzidas em levedura.

[022] Esta invenção também diz respeito a uma vacina que compreende partículas semelhantes ao vírus HPV31 (VLPs).

[023] Em uma forma de realização alternativa deste aspecto da invenção, a vacina ainda compreende VLPs de pelo menos um tipo de HPV adicional. Em uma forma de realização preferida, pelo menos um tipo de HPV adicional é selecionado do grupo que consiste em: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 e HPV68.

[024] Esta invenção também diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem partículas semelhantes ao vírus de HPV 31. Além disso, esta invenção diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem VLPs de HPV31 e VLPs de pelo menos um tipo de HPV adicional. Em um forma de realização preferida, pelo menos um tipo de HPV adicional é selecionado do grupo que consiste em: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, e HPV68.

[025] Como usado por todo o relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", e "o" incluem as referências plurais a não ser que o contexto dite claramente de outra maneira.

[026] Como usado por todo o relatório descritivo e reivindicações anexas, as seguintes definições e abreviações aplicam-se:

[027] O termo "promotor" refere-se a um local de recognição em um filamento de DNA ao qual a RNA polimerase liga-se. O promotor forma um complexo de iniciação com a RNA polimerase para iniciar e conduzir a atividade de transcrição. O complexo pode ser modificado pelas sequências de ativação denominadas "intensificadores" ou "sequências de ativação a montante" ou sequências de inibição denominadas "silenciadores".

[028] O termo "vetor" refere-se a alguns meios pelos quais os fragmentos de DNA podem ser introduzidos em um organismo hospedeiro ou tecido hospedeiro. Existem vários tipos de vetores que incluem plasmídeos, vírus (incluindo adenovirus), bacteriófagos e cosmídeos.

[029] A designação "sequência do tipo selvagem 31 Ll" refere-se à sequência de HPV31 Ll divulgada neste como SEQ ID NO: 1. Embora a sequência do tipo selvagem de HPV 31 Ll seja descrita anteriormente, não é incomum encontrar variações de sequência menores entre os DNAs obtidos a partir de isolados clínicos.

[030] Portanto, uma sequência de HPV31 Ll do tipo selvagem representativa foi isolada a partir de amostras clínicas previamente mostradas conter o DNA de HPV 31 (ver EXEMPLO 1). A sequência do tipo selvagem 31 Ll foi usada como uma sequência de referência para a comparação das sequências de HPV 31 Ll códon-otimizadas divulgadas neste (ver a FIGURA 1).

[031] A designação "reconstrução parcial de 31 Ll" refere-se a uma construção, divulgada neste (SEQ ID NO: 2), em que a sequência de nucleotídeo de HPV31 Ll foi parcialmente reconstruída para conter códons preferidos da levedura para a expressão ótima em levedura. A reconstrução parcial de 31 Ll compreende alterações na porção intermediária da sequência de nucleotídeo do tipo selvagem de HPV 31 Ll (nucleotídeos de 697 a 1249). A sequência completa de HPV 31 Ll também foi reconstruída com códons preferidos da levedura, que é referido neste como a reconstrução de "31 Ll total" (SEQ ID NO: 3).

[032] O termo "quantidade eficaz" significa composição de vacina suficiente é introduzido para produzir os níveis adequados do polipeptídeo, de modo que resulte em uma resposta imune. Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que este nível pode variar.

[033] Uma "substituição de aminoácido conservative" refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido por um outro, resíduo de aminoácido quimicamente similar. Os exemplos de tais substituições conservativas são: substituição de um resíduo hidrofóbico (isoleucina, leucina, valina ou metionina) por um outro; substituição de um resíduo polar por um outro resíduo polar da mesma carga (por exemplo, arginina por lisina; ácido glutâmico por ácido aspártico).

[034] O termo "mamífero" refere-se a qualquer mamífero, incluindo um ser humano.

[035] "VLP" ou "VLPs" significam partícula semelhante a vírus ou partículas semelhantes a vírus.

[036] "Sintético" significa que o gene de HPV31 Ll foi modificado de modo que este contenha uma sequência de nucleotídeos que não é a mesma como a sequência de nucleotídeo presentes no gene de HPV31 Ll do tipo selvagem de ocorrência natural. Como estabelecido acima, as moléculas sintéticas que são fornecidas neste compreendem uma sequência de nucleotídeos que é alterada para eliminar os sinais de terminação de transcrição reconhecidos pela levedura. Neste, também são fornecidas moléculas sintéticas que compreendem códons que são preferidos para a expressão por células de levedura. As moléculas sintéticas fornecidas neste codificam as mesmas sequências de aminoácido como o gene do tipo selvagem de HPV31 Ll.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[037] A FIGURA 1 é um alinhamento de sequência que mostra os nucleotídeos que foram alterados nos genes 31 Ll de reconstrução parcial (SEQ ID NO: 2) e reconstrução total (SEQ ID NO: 3) (ver EXEMPLO 2). A sequência de referência é a sequência do tipo selvagem 31 Ll (SEQ ID NO: 1; ver EXEMPLO 1). Os nucleotídeos nas sequências de reconstrução de 31 Ll parcial e total que são idênticos à sequência de referência são indicados com pontos. Os nucleotídeos alterados são indicados em sua localização correspondente. O número de nucleotídeo está contido dentro de parênteses.

[038] A FIGURA 2 mostra o nucleotídeo de reconstrução total de 31 Ll (SEQ ID NO: 3) e sequências de aminoácido (SEQ ID NO: 4). O número de nucleotídeo é indicado na esquerda.

[039] A FIGURA 3 resume as mudanças entre as três construções da sequência de HPV 31 Ll, que são listados na esquerda. A quarta coluna indica a porcentagem de identidade de nucleotídeo entre a construção indicada e a sequência do tipo selvagem de 31 Ll e a quinta coluna indica a identidade do aminoácido. A última coluna indica o número de nucleotídeos que foram alterados quanto às sequências de códon preferidos da levedura e a região onde as alterações foram realizadas.

[040] A FIGURA 4 mostra um Northern blot sondado especificamente quanto ao HPV 31 Ll sob estringência alta (ver EXEMPLO 4). Setas à esquerda indicam a posição das transcrições truncadas e de comprimento total de HPV 31 Ll. Vias rotuladas "31 em peso" são da mesma preparação de RNA de levedura contendo sequências do tipo selvagem de 31 Ll. A via rotulada "16" contém RNA de HPV16, que não é reconhecido pela sonda de HPV 31 Ll por causa das condições de alta estringência. A via rotulada "Neg" é um extrato de levedura que não contém nenhuma sequência codificadora de Ll. As vias rotuladas "31R" são de RNA de duas colônias isoladas separadas que expressam a sequência de reconstrução parcial de 31 Ll.

[041] A FIGURA 5 mostra uma porção dos dados de dois experimentos de radioimunoensaio de captura (RIA) em contagens por minuto (cpm)/mg de proteína total (ver EXEMPLO 7). A Cpm obtida no RIA é um indicador relativo de VLPs de HPV 31 Ll. Os dados de RIA demonstraram aumento na expressão de 31 Ll VLP em extratos e proteína de levedura a partir das sequências de gene de reconstrução do códon preferido pela levedura.

[042] A FIGURA 6 mostra uma amostra representativa dos 31 Ll VLPs descritos neste, como visualizado pela microscopia de transmissão de elétrons (ver EXEMPLO 8). A barra representa 100 nm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[043] A maioria dos carcinomas cervicais são associados com infecções de tipos oncogênicos específicos de papilomavírus humano (HPV). A presente invenção diz respeito a composições e métodos para evocar ou intensificar imunidade aos produtos de proteínas expressados pelos genes de tipos de HPV oncogênicos. Especificamente, a presente invenção fornece polinucleotídeos que codificam HPV31 Ll e partículas semelhantes ao vírus HPV31(VLPs) e divulgam o uso dos ditos polinucleotídeos e VLPs em composições imunogênicas e vacinas para a prevenção e/ou tratamento de câncer associado com HPV.

[044] A sequência de nucleotídeo de HPV31 Ll do tipo selvagem foi relatada (Goldsborough et al., Virology 171(1): 306 a 311 (1989); Acessão Genbank # J04353). A presente invenção fornece moléculas de DNA sintéticas que codifica a proteína HPV31 Ll. As moléculas sintéticas da presente invenção compreendem uma sequência de nucleotídeos, em que alguns nucleotídeos foram alterados a fim de eliminar os sinais de terminação de transcrição que são reconhecidos pela levedura. Em formas de realização alternativas, os códons das moléculas sintéticas são projetados a fim de usar os códons preferidos por uma célula de levedura para a expressão de alto nível. As moléculas sintéticas podem ser usadas como uma fonte de proteína HPV31 Ll, que pode se automontar nas VLPs. As ditas VLPs podem ser usadas em uma vacina com base em VLP para fornecer imunoprofilaxia eficaz contra infecção por papilomavírus através do anticorpo neutralizador e imunidade mediada por célula. Tais vacinas com base em VLP também são úteis para o tratamento de infecções por HPV já estabelecidas.

[045] A expressão de VLPs de HPV em células de levedura oferecem as vantagens de serem eficazes em custo e facilmente adaptados para o desenvolvimento em larga escala em fermentadores. Entretanto, muitas proteínas de HPV Ll, incluindo HPV31 Ll (ver EXEMPLO 4), são expressados em níveis baixos em células de levedura. Foi determinado de acordo com a presente invenção que a expressão de baixo nível de HPV31 Ll ocorre devido ao truncamento da transcrição de RNA que resulta da presença dos sinais de terminação de transcrição que são reconhecidos pela levedura. Alterando-se o DNA de HPV31 Ll para eliminar quaisquer sequências potenciais remontando os locais de terminação de transcrição de levedura, é possível facilitar a transcrição de RNA de comprimento total resultando na expressão de proteína HPV31 Ll aumentada.

[046] Consequentemente, em algumas formas de realização desta invenção, alterações foram feitas ao DNA de HPV31 Ll para eliminar quaisquer sequências potenciais sinais de terminação de transcrição de levedura. Estas alterações permitem a expressão da transcrição de HPV31 de comprimento total, como oposto a uma transcrição truncada (ver EXEMPLO 4), que melhora o rendimento da expressão.

[047] Como observado acima, os DNAs sintéticos da presente invenção compreendem alterações da sequência de HPV31 Ll do tipo selvagem que são feitos para eliminar os locais de terminação de transcrição reconhecidos pela levedura. Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que as moléculas de DNA adicionais podem ser construídas codificando a proteína HPV31 Ll, mas não contendo locais de terminação de transcrição de levedura. As técnicas para encontras as sequências de terminação de transcrição de levedura são bem conhecidas na técnica. A terminação de transcrição e a formação de extremidade 3' de mRNAs de levedura requerem a presença de três sinais: (1) um elemento eficiente, tal como TATATA ou sequências relacionadas, que intensifica a eficiência dos elementos de posicionamento localizados a jusante; (2) os elementos de posicionamento, que determinam a localização do local poli (A) e (3) o local de poliadenilação (usualmente Py (A) n).

[048] A literatura científica está repleta com descrições de sequências que codificam os sinais de terminação de transcrição de levedura. Ver, por exemplo, Guo e Sherman, Trends Biochem. Sei. 21: 477 a 481 (1986); Guo and Sherman, Mol. Cell. Biol. 16 (6): 2772 a 2776 (1996); Zaret et al, Cell 28: 563 a 573 (1982); Henikoff et al, Cell 33: 607 a 614 (1983); Thalenfeld et al, J. Biol. Chem. 258 (23): 14065 a 14068 (1983); Zaret et al, J. Mol. Biol. 176:107 a 135 (1984); Heidmann etal, Mol. Cell Biol 14:4633 a 4642 (1984); e Russo, Yeast 11: 447 a 453 (1985). Portanto, uma pessoa habilitada na técnica não terá dificuldade de determinar quais sequências evitam a fim de construir um gene sintético de HPV31 Ll que produz uma transcrição de mRNA de comprimento total de acordo com a presente invenção. Adicionalmente, os ensaios e os procedimentos para estimar quando uma sequência de terminação de transcrição de levedura está presente dentro da sequência sintética são bem estabelecidos na técnica, de modo que um técnico de habilidade comum seja capaz de determinar se uma sequência de HPV31 Ll construída compreende as sequências de terminação que necessitam ser eliminadas.

[049] Como descrito acima, a presente invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que codifica proteína 31 Ll tipo HPV, a molécula de ácido nucleico sendo isenta de sinais de terminação de transcrição internos que são reconhecidos pela levedura. Em formas de realização da invenção exemplares, as moléculas sintéticas e ácido nucleico compreendem uma sequência de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[050] Em formas de realização alternativas da presente invenção, sequências de gene de HPV31 Ll são "otimizadas" para a expressão de alto nível em um ambiente celular de levedura. Os genes de HPV31 Ll códon- otimizados abrangidos pela presente invenção incluem moléculas sintéticas que codificam HPV31 Ll que são isentos de sinais de terminação de transcrição internos que são reconhecidos pela levedura, outros que compreendem pelo menos um códon que é códon-otimizado para a expressão de alto nível em células de levedura.

[051] Um códon "tripleto" de quatro bases de nucleotídeo possíveis podem existir em mais de 60 formas variantes. Por causa destes códons fornecerem a mensagem para apenas 20 aminoácido diferentes (bem como iniciação e terminação de transcrição), alguns aminoácidos podem ser codificados por mais do que um códon, um fenômeno conhecido como redundância de códon. Por razões não completamente entendidas, os códons alternativos não estão uniformemente presentes no DNA endógeno de diferentes tipos de células. De fato, parece existir uma hierarquia ou "preferência" variável quanto a certos códons em certos tipos de células. Como um exemplo, a leucina do aminoácido é especificada por qualquer um de seis códons de DNA incluindo CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, e TTG. Análise exaustiva das frequências de códon do genoma de microorganismos revelou que o DNA endógeno de E. coli mais comumente contém o códon de especificação de CTG leucina, enquanto o DNA das leveduras e dos bolores de limo, mais comumente incluem um códon de especificação de TTA leucina. Em vista desta hierarquia, No geral, acredita-se que a probabilidade de se obter altos níveis de expressão de um polipeptídeo rico em leucina por um hospedeiro de E. coli dependerá, até certo ponto, da frequência de uso do códon. Por exemplo, é provável que um gene rico em códons de TTA será deficientemente expressado em E. coli, por meio do qual um gene rico em CTG será, provavelmente expressado de maneira superior neste hospedeiro. Similarmente, um códon preferido para a expressão de um polipeptídeo rico em leucina em célula hospedeira de levedura deve ser o TTA.

[052] As implicações dos fenômenos de preferência de códon em técnicas de DNA recombinante são manifestadas e o fenômeno pode servir para explicar muitos fracassos anteriores para atingir níveis de expressão altos de genes exógenos em organismos hospedeiros bem sucedidamente transformados -- um códon menos "preferido" pode estar repetidamente presente no gene inserido e o mecanismo da célula hospedeira pode não operar com eficiência. Este fenômeno sugere que os genes sintéticos que foram designados incluem códons preferidos da célula hospedeira projetada fornecem uma forma ótima de material genético estranho para as práticas de técnicas de DNA recombinantes. Desta maneira, um aspecto desta invenção é um gene de HPV31 Ll é códon-otimizado para a expressão em uma célula de levedura. Em uma forma de realização preferida desta invenção, foi observado que o uso de códons alternativos que codificam uma mesma sequência de proteína pode remover as limitações na expressão de proteínas HPV31 Ll pelas células de levedura.

[053] De acordo com esta invenção, os segmentos do gene de HPV31 Ll foram convertidos à sequências tendo sequências traduzidas idênticas mas com o uso de códon alternativo como descrito por Sharpand Cowe (Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 657 a 678 (1991) ), que é incorporado neste por referência. No geral, uma metodologia consiste em códons de identificação na sequência do tipo selvagem que não são comumente associados com genes de levedura altamente expressados e que os substituem por códons ótimos para a expressão alta em células de levedura. A nova sequência de gene é então inspecionada quanto a sequências indesejadas por estas substituições de códon (por exemplo, as sequências "ATTTA", criação negligente de locais de locais de recognição de junção de íntron, locais de enzima de restrição indesejadas, etc.), as sequências indesejáveis são eliminadas pela substituição dos códons existentes com códons que codificam quanto ao mesmo aminoácido. Os segmentos de gene sintético são então testados quanto à expressão melhorada.

[054] Os métodos descritos acima foram usados para criar segmentos de gene sintéticos para HPV31 Ll, resultando em um gene compreende códons otimizados para expressão de alto nível. Enquanto o procedimento acima fornece um sumário de nossa metodologia para projetar genes códon- otimizados parra o uso em vacinas contra o HPV, é entendido por uma pessoa habilitada na técnica que a eficácia da vacina similar ou expressão aumentada de genes podem ser atingidos por variações menores no procedimento ou por variações menores na sequência.

[055] Consequentemente, a presente invenção diz respeito a um polinucleotídeo sintético que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína HPV31 Ll ou um fragmento biologicamente ativo ou forma mutante de uma proteína HPV31 Ll, a sequência de nucleotídeo compreendendo códons otimizados para a expressão em um hospedeiro de levedura. As ditas formas mutantes da proteína HPV31 Ll incluem, mas não são limitadas a: substituições conservativas de aminoácido, truncamentos de terminal amino, truncamentos de terminal carbóxi, anulações ou adições. Qualquer tal fragmento biologicamente ativo e/ou mutante codificará uma proteína ou fragmento de proteína que pelo menos imita substancialmente as propriedades imunológicas da proteína HPV31 Ll como apresentado na SEQ ID NO: 4. Os polinucleotídeos sintéticos da presente invenção codificam as moléculas de RNA que expressam uma proteína HPV31 Ll funcional a fim de ser útil no desenvolvimento de uma vacina contra HPV terapêutica ou profilática.

[056] Um aspecto desta invenção é uma molécula códon-otimizada de ácido nucleico que codifica a proteína HPV31 Ll como apresentado na SEQ ID NO: 4, a dita molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO: 2.

[057] Um outro aspecto desta invenção é um molécula códon-otimizada de ácido nucleico que codifica a Proteína HPV31 Ll como apresentado na SEQ ID NO: 4, a dita molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO: 3.

[058] A presente invenção também diz respeito a vetores recombinantes e células hospedeiras recombinantes, tanto procariótica e eucariótica, que contém as moléculas de ácido nucleico divulgadas por todo este relatório descritivo.

[059] O DNA de HPV31 sintético ou fragmentos deste construído através dos métodos descritos neste podem ser recombinantemente expressados pela clonagem molecular em um vetor de expressão contendo um promotor adequado e outros elementos reguladores de transcrição apropriados e transferidos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas para produzir HPV31 Ll recombinante. As técnicas para tais manipulações são descritas na técnica (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Green Pub. Associates and Wiley-lnterscience, New York (1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1990), que são incorporados neste por referência em sua totalidade).

[060] Desta maneira, a presente invenção ainda diz respeito a um processo para a expressão de uma proteína de HPV31 Ll em uma célula hospedeira recombinante, que compreende: (a) introduzir um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína HPV31 Ll em uma célula hospedeira de levedura; em que a molécula de ácido nucleico é códon- otimizada para a expressão ótima na célula hospedeira de levedura e; (b) cultivar a célula hospedeira de levedura sob condições que permitam a expressão da dita proteína HPV31 Ll.

[061] A presente invenção também diz respeito a um processo para a expressão de uma proteína HPV31 Ll em uma célula hospedeira recombinante, que compreende: (a) introduzir um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma proteína HPV31 Ll em uma célula hospedeira de levedura; em que a molécula de ácido nucleico é isenta de sinais de terminação de transcrição internos que são reconhecidos pela levedura e; (b) cultivar a célula hospedeira de levedura sob condições que permitam expressão da dita proteína HPV31 Ll.

[062] Esta invenção ainda diz respeito a um processo para a expressão e uma proteína HPV31 Ll em uma célula hospedeira recombinante, que compreende: (a) introduzir um vetor que compreende um ácido nucleico como apresentado na SEQ ID NO: 2 ou SEQID NO: 3 em uma célula hospedeira de levedura e, (b) cultivar uma célula hospedeira sob condições que permitam expressão da dita proteína HPV31 Ll.

[063] Os genes sintéticos da presente invenção podem ser montados em um cassete de expressão que compreende as sequências projetadas para fornecer expressão suficiente da proteína HPV58 Ll na célula hospedeira. O cassete preferivelmente contém o gene sintético, com sequências de controle transcricional e de traduções relacionado operacionalmente ligadas a este, tal como um promotor e sequências de terminação. Em uma forma de realização preferida, o promotor é o promotor GALI de S. cerevisiae, embora aqueles habilitados na técnica reconheçam que qualquer um de diversos outros promotores de levedura conhecidos, tais como os promotores GAL10, GAL7, ADH1, TDH3 ou PGK ou outros promotores de genes eucarióticos podem ser usados. Um terminador transcricional preferido é o terminador ADH1 de S.cerevisiae, embora outros terminadores de transcrição também possam ser usados. A combinação de promotor GALl-terminador ADH1 é particularmente preferida.

[064] Um outro aspecto desta invenção é uma partícula semelhante a vírus de HPV31 (VLP), métodos de produzir VLPs de HPV31 e métodos de usar VLPs de HPV31. As VLPs podem se auto-montar quando Ll, a proteína capsídica principal do papilomavírus humano e animal, é expressado em levedura, células de isento, células de mamífero ou bactérias (para revisão, ver Schiller e Roden, em Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomavirus; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)). As VLPs de HPV morfologicamente indistintos também podem ser produzidas pela expressão de uma combinação das proteínas capsídicas Ll e L2. As VLPs são compostas de 72 pentâmeros de Ll em uma estrutura icosaédrica T = 7 (Baker etal., Biophys. J. 60(6): 1445-56(1991)).

[065] As VLPs são morfologicamente similares aos virions autênticos e são capazes de induzir tituladores altos de anticorpos de neutralização na administração em um animal. A imunização de coelhos (Breitburd et a!., J. Virol. 69 (6): 3959-63 (1995)) e cães (Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92 (25): 11553-57 (1995) ) com VLPs foi mostrado tanto induzir anticorpos de neutralização quanto proteger contra a infecção experimental por papilomavírus. Entretanto, por causa das VLPs não conterem o genoma virai potencialmente oncogênico e poderem auto-montar a partir de um gene simples, estes representam uma alternativa segura ao uso de vírus vivo no desenvolvimento de vacina de HPV (para revisão, ver Schiller and Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)).

[066] Desta maneira, a presente invenção diz respeito a partículas semelhantes a vírus compreendidas de proteína recombinante de Ll ou proteínas recombinantes de Ll + L2 de HPV31.

[067] Em uma forma de realização preferida da invenção, as VLPs de HPV31 são produzidas em levedura. Em uma outra forma de realização preferida, a levedura é selecionada do grupo que consiste em Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis, e Schizosaccharomyces pombe.

[068] Um outro aspecto desta invenção é uma VLP de HPV31, que compreende uma proteína HPV31 Ll produzida por um gene de HPV31 Ll que é isento de sinais de terminação de transcrição internos que são reconhecidos pela levedura.

[069] Ainda um outro aspecto desta invenção é uma VLP de HPV31 que compreende uma proteína HPV31 Ll produzida por um gene códon-otimizado de HPV31 Ll. Em uma forma de realização preferida deste aspecto da invenção, o gene códon-otimizado de HPV31 Ll consiste essencialmente de uma sequência de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[070] Ainda, um outro aspecto desta invenção é um método de produzir VLPs de HPV31, que compreende: (a) transformar levedura com uma molécula de DNA recombinante que codifica a proteína HPV31 Ll ou proteínas de HPV31 Ll + L2; (b) cultivar a levedura transformada sob condições que permitem a expressão da molécula de DNA recombinante para produzir a proteína de HPV31 recombinante e (c) isolar a proteína de HPV31 recombinante para produzir VLPs de HPV31.

[071] Em uma forma de realização preferida deste aspecto da invenção, a levedura é transformada com um gene de HPV31 Ll que é isento de sinais de terminação de transcrição que são reconhecidos pela levedura. Em uma outra forma de realização preferida, a levedura é transformada com um gene códon- otimizado de HPV31 Ll para produzir VLPs de HPV31. Em uma forma de realização particularmente preferida, o gene de HPV31 Ll códon-otimizado consiste essencialmente de uma sequência de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

[072] Esta invenção também fornece um método para a produção de uma resposta imune em um animal que compreende administrar partículas semelhantes ao vírus HPV31 ao animal. Em uma forma de realização preferida, as VLPs de HPV31 são produzidos por um gene que é isento de sequências internas de terminação de transcrição que são reconhecidas pela levedura. Em uma outra forma de realização preferida, as VLPs de HPV31 são produzidas por um gene códon-otimizado.

[073] Ainda um outro aspecto desta invenção é um método de evitar ou tratar o câncer cervical associado com HPV que compreende administrar a um mamífero uma vacina que compreende VLPs de HPV31. Em uma forma de realização preferida deste aspecto da invenção, as VLPs de HPV31 são produzidas em levedura.

[074] Esta invenção também diz respeito a uma vacina que compreende partículas semelhantes ao vírus de HPV31 (VLPs).

[075] Em uma forma de realização alternativa deste aspecto da invenção, a vacina ainda compreende VLPs de pelo menos um tipo de HPV adicional. Em uma forma de realização preferida, pelo menos um tipo de HPV adicional é selecionado do grupo que consiste em: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 e HPV68.

[076] Em uma forma de realização preferida deste aspecto da invenção, a vacina ainda compreende VLPs de HPV16.

[077] Em uma outra forma de realização preferida da invenção, a vacina ainda compreende VLPs de HPV16 e VLPs de HPV18.

[078] Ainda em uma outra forma de realização preferida da invenção, a vacina ainda compreende VLPs de HPV6, VLPs de HPV11, VLPs de HPV16 e VLPs de HPV18.

[079] Esta invenção também diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem partículas semelhantes ao vírus de HPV 31. Além disso, esta invenção diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem VLPs de HPV31 e VLPs de pelo menos um tipo de HPV adicional. Em uma forma de realização preferida, pelo menos um tipo de HPV adicional é selecionado do grupo que consiste em: HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 e HPV68.

[080] As composições de vacina da presente invenção podem ser usadas sozinhas em dosagens apropriadas definidas pelo teste de rotina a fim de obter a inibição ótima da infecção por HPV31 enquanto minimiza-se qualquer toxicidade potencial. Além disso, a co-administração ou a administração sequencial de outros agentes pode ser desejada.

[081] A quantidade de partículas semelhantes ao vírus a ser introduzido em um recipiente de vacina dependerá da imunogenicidade do produto de gene expressado. Em general, uma dose imunológica ou profilaticamente eficaz de cerca de 10 pg a 100 pg e, preferivelmente cerca de 20 pg a 60 pg de VLPs é diretamente administrado no tecido muscular. A injeção subcutânea, introdução intradérmica, impressão através da pele e, outros modos de administração, tais como liberação intraperitoneal, intravenosa ou, por inalação também são considerados. Também é considerado que as vacinações intensificadoras possam ser fornecidas. A administração parenteral, tal como intravenosa, intramuscular, subcutânea ou outros meios de administração com adjuvantes tais como adjuvante de alum ou de Merck alum, concorrentemente com ou, subsequente a introdução parenteral da vacina desta invenção também são vantajosas.

[082] Todas as publicações mencionadas neste, são incorporadas por referência para o propósito de descrever e divulgar as metodologias e materiais que possam ser usado em conexão com a presente invenção. Nada neste deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não é intitulada para atender tal divulgação em virtude da invenção anterior.

[083] Tendo descrito as formas de realização preferidas da invenção com referência aos desenhos anexos, deve ser entendido que a invenção não é limitada àquelas formas de realização precisas e, que várias alterações e modificações podem ser realizadas nesta, por uma pessoa habilitada na técnica sem divergir do escopo ou do espírito da invenção como definido nas reivindicações anexas.

[084] Os seguintes exemplos ilustram, mas não limitam a invenção.

EXEMPLO 1 Determinação de uma sequência de HPV 31 Ll representativa

[085] A sequência de HPV 31 Ll do tipo selvagem foi previamente descrita (Goldsborough et al., Virology 171(1): 306-311 (1989); Acessão Genbank # J04353). Não é incomum, entretanto, encontrar variações sequenciais menores entre os DNAs obtidos dos isolados químicos. Para isolar uma sequência de HPV31 Ll do tipo selvagem, representativa, o DNA foi isolado das três amostras clínicas previamente mostradas conter o DNA de HPV 31. As sequências de HPV 31 Ll foram amplificadas em uma reação de cadeia de polimerase (PCR) usando-se Taq DNA polimerase e os seguintes iniciadores: HPV 31 Ll F 5' - CGT CG A CGT AAA CGT GTA TCA TAT TTT TTT ACA G - 3' (SEQ ID NO: 5) e HPV 31 Ll B 5' - CAG ACA CAT GTA TTA CAT ACA CAA C - 3' (SEQ ID NO: 6). Os produtos amplificados foram submetidos a eletroforese em géis de agarose e visualizados pela pigmentação com brometo de etídio. As faixas de ~1500 bp de Ll foram excisadas e o DNA purificado usando-se o conjunto de purificação de PCR rápido de QIA (Qiagen, Hilden, Alemanha). O DNA foi então ligado ao vetor de clonagem TA, pCR-ll (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), E. coli transformado e, colocado em ágar LB com ampicilina mais IPTG e X-gal para a seleção de colônia azul/branca. As placas foram invertidas e incubadas por 16 horas a 372 c. As colônias brancas foram cultivadas em meio de LB com ampicilina, agitadas a 372 c por 16 horas e, minipreps foram realizadas para extrair o DNA de plasmídeo.

[086] Para demonstrar a presença do gene de Ll no plasmídeo, as digestões de endonuclease de restrição foram conduzidas e examinadas pela eletroforese em gel de agarose e pigmentação com brometo de etídio. O sequenciamento foi realizado em plasmídeos que contêm Ll clonado de cada um dos três isolados clínicos. As sequências de DNA e de aminoácido traduzidas foram comparadas uma com a outra e as sequências de Genbank de HPV 31 Ll. A análise da sequência dos três isolados clínicos revelou que nenhuma sequência foi idêntica à sequência de Genbank. O clone pCR-ll-HPV 31L1/81 foi escolhido para ser a sequência de 31L1 representativa e é referido neste como a "sequência de 31 Ll do tipo selvagem" (SEQ ID NO: 1, ver FIGURA 1). A sequência escolhida como 31 Ll do tipo selvagem continha uma substituição silenciosa no nucleotídeo 1266 e uma mudança de um C para um G no nucleotídeo 1295, alterando-se o aminoácido codificado de treonina para serina. Os genes de reconstrução total e parcial 31 Ll (SEQ ID NOs: 2 e 3, respectivamente) também codificam uma serina nesta localização (ver FIGURA 1). Em todos os casos, as sequências de aminoácido são idênticas. Os nucleotídeos foram mudados nas construções reconstruídas para codificar os aminoácidos usando-se sequências de códon preferidas pela levedura e para eliminar sinais de terminação de transcrição potenciais (ver EXEMPLO 2).

[087] A sequência de 31 Ll do tipo selvagem foi amplificada usando-se os iniciadores LS-101 5'- CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TGT GGC GGC CTA GC - 3' (SEQ ID NO: 7) e LS-102 5' - GAC AGA TCT TAC TTT TTA GTT TTT TTA CGT TTT GCT GG - 3' (SEQ ID NO: 8) para adicionar as extensões Bglll. PCR foi realizado usando-se polimerase de DNA Vent®. O produto de PCR foi visualizado pela pigmentação com brometo de etídio de um gel de agarose. A faixa de ~ 1500 bp foi excisada e o DNA purificado usando-se o conjunto de extração de gel QIAEX II (Qiagen). 0 produto de PCR foi então digerido com Bglll a 372 c por 2 horas e purificado usando-se o conjunto de purificação de PCR rápido de QIA. O produto de PCR de 31 Ll digerido por Bglll foi ligado ao pGALHO digerido por Ba7nHI e E. coli DH5 foi transformado. As colônias foram avaliadas por PCR para o HPV31 Ll inserir na orientação correta. A sequência e a orientação foram confirmadas pelo sequenciamento. O clone selecionado foi chamado de dpGAL110-HPV 31L1 #2.

[088] O DNA maxiprep foi então preparado e Saccharomyces cerevisiae foi tornado competente e transformado. A transformação da levedura foi colocada em Leu’ sorbitol top-ágar em placas de Leu’ sorbitol e incubadas invertidas por 3 a 5 dias a 30s C. As colônias foram selecionadas e estriadas para isolamento nas placas de Leu sorbitol. Para induzir a transcrição de Ll e a expressão de proteína, as colônias isoladas foram subsequentemente cultivadas em 5 ml de 5 X Leu’ Ade’ sorbitol com 1,6 % de glicose e 4 % de galactose em culturas de tubo de rotação a 309 C.

EXEMPLO 2 Otimização de códon de levedura

[089] Os códons preferidos de levedura foram descritos (Sharp e Cowe, Yeast 7: 657-678 (1991)). Inicialmente, a porção intermediária de HPV 31 Ll, que representa os nucleotídeos 697-1249, foi reconstruída utilizando-se códons preferidos pela levedura. A estratégia utilizada para reconstrução foi projetar oligômeros sentido e anti-sentido de sobreposição longa que atravessam a região a ser reconstruída, substituindo nucleotídeos por sequências de códon preferidas pela levedura enquanto mantém a mesma sequência de aminoácido. Estes oligômeros foram usados em vez do padrão de DNA na reação de PCR. Os iniciadores de amplificação adicional foram projetados e usados para amplificar as sequências reconstruídas de padrões de oligômeros com polimerase de DNA pfu (Stratagene, La Jolla, CA). As condições ótimas para a amplificação foram específicos da seção; entretanto, o mais utilizado foi um programa semelhante ao seguinte: uma etapa de desnaturação de 942 C por 1 minuto, seguido por 15 a 25 ciclos de 952 c para desnaturar por 30 segundos, 559 C para recozer por 30 segundos, 722 c para extensão por 3,5 minutos, seguido por 722 c para uma extensão final por 10 minutos e manter a 42 C.

[090] Os produtos de PCR foram examinados pela eletroforese em gel de agarose. Faixas do tamanho apropriado foram excisadas e o DNA foi purificado em gel. Os fragmentos amplificados foram então usados como padrão para montar o fragmento de Ll intermediário de HPV 31 de reconstrução do nucleotídeo 552. O PCR foi então usado para amplificar os nucleotídeos 1-725 (extremidade 5') e 1221-1515 (extremidade 3'). Um PCR final usando-se a extremidade 5', a extremidade 3' e, o intermediário reconstruído foi realizado para gerar a reconstrução parcial de 31 Ll de comprimento total, referido neste como a "reconstrução parcial de 31 Ll".

[091] A sequência de 31 Ll completa também foi reconstruída com os códons preferidos pela levedura. Esta construção é referida neste como a "reconstrução total de 31 Ll". Nove oligômeros sobrepostos longos foram usados para gerar sequências de nucleotídeo de códon preferido pela levedura de 1 a 753 e quatro oligômeros sobrepostos longos foram usados para gerar sequências de nucleotídeo de códon preferido pela levedura de 1207 a 1515. Depois da amplificação e purificação por gel, estes fragmentos, junto com a secção reconstruída intermediária descrita acima (nucleotídeos 697 - 1249), foram usados juntos em uma reação de PCR para gerar a sequência de reconstrução total de 31 Ll de comprimento total. Este pedaço foi gerado com extensões BamHI. O DNA de 31L1 reconstruído, purificado em gel foi digerido com BamHI, ligado a vetor de expressão de pGAL 110 digerido por BamHI e transformado em células DH5 de E. coli. As colônias foram avaliadas por PCR quanto ao HPV 31 Ll inserir na orientação correta. A sequência e a orientação foram confirmadas pelo sequenciamento.

[092] O DNA de plasmídeo foi preparado. As células de S. cerevisiae foram tornadas competentes e transformadas. A levedura foi colocada em Leu’ sorbitol top-ágar em placas de Leu’ sorbitol e incubadas invertidas por 3 a 5 dias. As colônias foram estriadas por isolamento em placas de Leu' sorbitol. As colônias isoladas foram subsequentemente cultivadas em 5 ml de 5 X Leu-Ade- sorbitol com 1,6 % de glicose e 4 % de galactose em culturas em tubo de rotação a 309 C para induzir a transcrição de Ll e a expressão de proteína. Depois de 48 a 72 horas, o volume de cultura equivalente a um OD600 = 10 foi pelotizado, o sobrenadante removido e as pelotas congeladas e armazenadas a -702 c.

EXEMPLO 3 Preparação de RNA

[093] As pelotas de célula de levedura transformada, que foram induzidas a expressar HPV 31 Ll por indução de galactose, foram descongeladas em gelo e colocados em suspensão em 1 ml de água tratada com DEPC gelada. As células foram pelotizadas por centrifugação e o sobrenadante resultante foi removido. A pelota de célula foi então recolocada em suspensão em 400 pl de TES (10 mM de Tris, pH 7,0,10 mM de EDTA e 0,5 % de SDS). Um volume igual de fenol saturado em tampão de AE (50 mM de NaOAc e 10 mM de EDTA) foi adicionado. O tubo foi submetido a turbilhonamento por 10 segundos e aquecido a 659 C por 50 minutos com mistura a cada 10 minutos. O tubo foi então colocado no gelo por 5 minutos, seguido por centrifugação a 49 C por 5 minutos. O sobrenadante foi coletado e transferido a um tubo estéril. Um adicional de 400 pl de fenol foi adicionado, o tubo submetido a turbilhonamento, colocado em gelo por 5 minutos e centrifugado. 0 sobrenadante foi transferido a um tubo estéril e 400 pl de clorofórmio adicionados, misturados e centrifugados. O sobrenadante foi novamente coletado e transferido a um tubo estéril e 40 pl de Acetato de Na a 3 M, pH 5,2 adicionados, além de 1 ml de EtOH a 100 %. O tubo foi colocado em gelo seco por uma hora, após o que este foi centrifugado em velocidade alta para pelotizar o RNA. O RNA foi lavado uma vez com 70 % de EtOH e secado ao ar. O RNA foi então colocado em suspensão em 100 pl de água tratada com DEPC e aquecido a 652 C por 5 minutos para dissolver. A espectrofotometria foi realizada para determinar a concentração de RNA na amostra usando-se a suposição que uma leitura A260 de 1 = 40 pg/ml de RNA quando o A260/280 é 1,7 - 2,0.

EXEMPLO 4 Análise de Northern blot

[094] A análise inicial de levedura que expressa 31 Ll do tipo selvagem sugeriu que o rendimento de expressão de proteína HPV 31 Ll foi consideravelmente menor do que foi esperado. Para determinar se a expressão baixa ocorreu devido a um problema no nível de transcrição versus o nível de tradução, a análise de Northern blot da transcrição de HPV 31 Ll foi realizada. Northern blots foram feitas a partir de géis em que o RNA de levedura que expressa HPV16 Ll foi conduzido com RNA de levedura que expressa HPV31 Ll no mesmo gel para comparar tamanhos de transcrição.

[095] Um gel de formaldeído de agarose a 1,2 % foi moldado. Dez microgramas de RNA foram combinados com tampão de desnaturação (concentrações finais: 6 % de formaldeído, 45 % de formamida e 0,9 x MOPS) e aquecidos a 552 C por 15 minutos. Um volume de um décimo de tampão de carregamento de gel foi adicionado e a amostra carregada em gel. Eletroforese foi realizada em 65 volts em tampão de 1 x MOPS por ~ 5 horas. 0 gel foi lavado por 15 minutos em água estéril seguido por duas lavagens de cinco minutos em 10 x SSC. O RNA foi transferido a uma membrana de náilon Hybond-N+ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) pela ação capilar durante 16 horas em 10 x SSC. O RNA foi então fixado à membrana de náilon por reticulação usando-se o reticulador Amersham ajustado para 700 unidades de energia. Depois da fixação, a membrana de náilon foi deixada secar ao ar. A membrana foi colocada em 30 ml de tampão Zetaprobe a 552 C por 2 horas após o que sondas rotuladas por 32P foram adicionadas e incubadas por 16 horas de 53 a 652 c. A membrana foi então lavada 3 vezes em 5 X SSC em temperatura ambiente por 20 minutos, seguido por 2 vezes em 0,4 x SSC por 20 minutos em temperatura ambiente e uma vez a 609 C por 10 minutos. O DNA da sonda foi gerado por PCR usando-se os iniciadores sentido e anti-sentido específicos da sequência HPV 31 Ll. O DNA amplificado foi rotulado pelo tratamento com polinucleotídeo cinase (PNK) e y-32P ATP a 37e C por 1 hora. A mancha foi enrolado no invólucro de "sarem" e exposta a película de raio X por 16 horas. No desenvolvimento da película, o RNA hidridizado por sonda foi detectado como uma faixa preta na auto-radiografia.

[096] A análise de Northern blot descrita acima revelou que a maioria das transcrições de HPV 31 Ll do tipo selvagem, de comprimento total, foram consideravelmente menores do que o comprimento total (ver FIGURA 4). Entretanto, a reconstrução parcial de 31 Ll foi projetada não apenas para inserir os códons preferidos pela levedura no meio do gene, mas também para eliminar quaisquer sequências potenciais semelhante aos locais de terminação de transcrição de levedura. A análise de Northern blot mostrou claramente que na reconstrução, o comprimento da transcrição do gene 31 Ll foi significantemente aumentado a um tamanho correspondente com aquele da transcrição de HPV 16 Ll de comprimento total (não mostrado). Dessa maneira, a terminação de transcrição prematura é provável ser calculada por uma porção significante do rendimento de expressão baixa da construção de 31 Ll do tipo selvagem.

EXEMPLO 5 Expressão de proteína HPV 31 Ll

[097] As pelotas de célula de levedura congeladas de culturas induzidas por galactose equivalentes a OD600 = 10 foram descongelados em gelo e colocados em suspensão em 300 pl de tampão de PC (100 mM de Na2HPO4 e 0,5 M de NaCI, pH 7,0) com 2 mM de PMSF. Contas de vidro de 0,5 mm lavadas com ácido foram adicionadas, ~0,5 g/tubo. Os tubos foram submetidos a turbilhonamento por 15 minutos a 49 C. 7,5 pl de TritonXlOO a 20 % foram adicionados e turbilhonamento repetido por 5 minutos a 49 C. Os tubos foram colocados em gelo por 15 minutos, depois centrifugados por 15 minutos a 49 C. O sobrenadante foi transferido a um tubo de microcentrífuga estéril e armazenado a -709 C.

EXEMPLO 6 Análise de Western blot

[098] O extrato de proteína de levedura total de vinte a quarenta colônias de levedura isoladas para cada construção de HPV 31 Ll foi analisado por Western blot para confirmar a expressão de proteína HPV 31 Ll depois da indução por galactose.

[099] Dez microgramas do extrato de proteína de levedura total foram combinados com tampão de carregamento de SDS-PAGE e aquecidos a 959 c por 10 minutos. As proteínas foram carregadas em um gel de SDS-PAGE a 8 % e submetidas a eletroforese em tampão de Tris-Glicina. Depois da separação de proteína, as proteínas foram transferidas para Western do gel para nitrocelulose e a mancha foi bloqueada em 10 % de leite desidratado não gorduroso em TTBS (solução salina não tamponada por Tris com Tween-20) por 16 horas. A mancha foi lavada três vezes em TTBS. O soro anti-trpE-HPV 16 Ll de cabra, um soro policlonal que reage com HPV 31L1, foi aplicado em uma diluição de 1:1000 em TTBS por 1 hora em temperatura ambiente. A mancha foi lavada três vezes em TTBS e anticorpo conjugado de anti-cabra-HRP foi aplicado em uma diluição de 1:2500 em TTBS por 1 hora. A mancha foi novamente lavada três vezes e reagente de detecção ECL™ foi aplicado (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A auto-radiografia foi então realizada. As proteínas reconhecidas pelo anti-soro foram visualizadas pelo agente de detecção como faixas escuras na auto-radiografia.

[0100] Em todos os casos, a proteína HPV 31 Ll foi detectada como uma faixa nítida na auto-radiografia correspondente a aproximadamente 55 kD (dados não mostrados). A proteína HPV 16 Ll foi incluída como um controle positivo nos géis.

EXEMPLO 7 Radioimunoensaio (RIA)

[0101] As células de levedura que expressam HPV 31 Ll foram cultivadas por uma variedade de métodos, que incluem culturas em tubo de rotação, frascos de agitação e fermentadores. A levedura foi lisada e os extratos de proteína fabricados para determinar a quantidade de partículas de HPV31 Ll semelhantes ao vírus (VLPs) produzida por miligrama de proteína total. Para demonstrar a expressão de VLP de HPV 31 Ll, uma porção de cada extrato de proteína de levedura total foi analisado pelo radioimunoensaio (RIA) de captura.

[0102] O RIA foi realizado usando-se um anticorpo monoclonal de detecção, H31.A6, que é específico do HPV tipo 31 e específico da VLP conformacional. H31.A6 é específico para HPV tipo 31 Ll como é observado ligar-se às VLPs de HPV 31 Ll intactos e não reconhece as VLPs de HPV 31 desnaturados. Este mAb pode ser subsequentemente detectado por um anticorpo anti-camundongo de cabra radio-rotulado com 1125. Portanto, os valores de contagem por minuto (cpm) correspondem aos níveis relativos de expressão de VLP de HPV31 Ll.

[0103] As contas de poliestireno foram revestidas com um soro policlonal anti-trpE-HPV31 Ll de cabra diluídas em 1:1000 em PBS durante a noite. As contas foram então lavadas com 5 volumes de água destilada estéril e secadas ao ar. O antígeno, o extrato de proteína de levedura total de colônias de levedura isoladas, foi então carregado nas contas por diluição em PBS com 1 % de BSA, 0,1 % de Tween-20 e 0,1 % de Azida de Na e incubado com rotação por uma hora. Depois da lavagem, as contas foram distribuídas uma por reservatório em uma placa de poliestireno de 20 reservatórios e incubadas com H31.A6mAb diluído a 1: 50.000 de 17 a 24 horas em temperatura ambiente. As contas foram lavadas e IgG anti-camundongo de cabra rotulado por 1125 foi adicionado em uma faixa de atividade de 23000 a 27000 cpm por 10 pl. Depois de 2 horas, as contas foram lavadas e contagens radioativas foram registradas em cpm/ml. As contagens de base de reservatórios em branco foram subtraídas do cpm/ml total, dando o RIA menos o valor de base.

[0104] Dois experimentos foram realizados: no experimento 1, os extratos de proteína do 31 Ll tipo selvagem e da reconstrução parcial de 31 Ll foram comparados e no experimento 2, os extratos de proteína da reconstrução parcial de 31 Ll e da reconstrução total de 31 Ll foram comparados (ver FIGURA 5). Os resultados indicam que a expressão de VLP de reconstrução parcial de 31 Ll é 6,9 vezes maior do que a do 31 Ll do tipo selvagem. A reconstrução total de 31 Ll tem uma expressão 1,7 vezes aumentada sobre a reconstrução parcial de 31 Ll. Portanto, os níveis de expressão de 31 Ll foram aumentados > 7 vezes pela introdução de sequências de códon preferidas pela levedura e pela eliminação de sinais de terminação de transcrição potenciais.

EXEMPLO 8 Microscopia de elétron de transmissão

[0105] Para demonstrar que a proteína HPV 31 Ll foi de fato auto- montada para formar capsômeros de Ll pentaméricos, que por sua vez auto- montam em partículas semelhantes ao vírus, um extrato de proteína de reconstrução total de 31 Ll parcialmente purificado, foi submetida a microscopia de elétron de transmissão (TEM). A levedura foi cultivada sob fermentação de escala pequena e pelotizada. As pelotas foram submetidas a tratamentos de purificação. A pelota e os extratos de levedura clarificados foram analisados por immunoblot para demonstrar a expressão de proteína Ll e a retenção através do procedimento de purificação. Os extratos de levedura clarificados foram então submetidos a centrifugação em uma almofada de sacarose a 45 % e a pelota resultante colocada em suspensão em tampão para análise de TEM (ver FIGURA 6). Os resultados indicaram que o diâmetro das partículas esféricas nesta amostra bruta variou entre 30 e 60 nm com algumas partículas apresentando uma disposição regular de capsômeros.

Claims

1. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína HPV31 Ll, a molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos definida na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

2. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 1.

3. Célula hospedeira de levedura, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor definido na reivindicação 2.

4. Célula hospedeira de levedura de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis e Schizosaccharomyces pombe.

5. Célula hospedeira de levedura de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é Saccharomyces cerevisiae.

6. Método para produzir partículas semelhantes a vírus (VLPs) de HPV31, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar levedura com uma molécula de DNA códon-otimizada que codifica a proteína HPV31 Ll, definida na reivindicação 1; (b) cultivar a levedura transformada sob condições que permitam a expressão da molécula de DNA códon-otimizada para produzir uma proteína de papilomavírus recombinante; e (c) isolar a proteína de papilomavírus recombinante para produzir as VLPs de HPV31.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada a partir do grupo que consiste em: Saccharomyces Kluyveromyces lactis, e Schizosaccharomyces pombe.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae