KR20050119141A

KR20050119141A - 효모에서 ｈｐｖ 31 ｌ1의 최적 발현

Info

Publication number: KR20050119141A
Application number: KR1020057017936A
Authority: KR
Inventors: 카트린 유 얀센; 로렌 디 슐츠; 마이클 피 니퍼; 헨리 제트 마르쿠스
Original assignee: 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드
Priority date: 2003-03-24
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2005-12-20
Also published as: ZA200507178B; WO2004084831A2; CA2519112A1; ECSP056032A; US7276243B2; US7482428B2; KR101080628B1; JP4505452B2; IL171067A; CN1761759A; WO2004084831A3; ATE546529T1; EP1608767A4; CA2519112C; US20060177817A1; FR15C0079I2; AU2004224335A1; RU2005132603A; NO20054889D0; FR15C0079I1

Abstract

HPV31 L1 단백질을 암호화하는 합성 DNA 분자를 제공한다. 특히, 본 발명은 HPV31 L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는데, 이때, 당해 뉴클레오타이드는 효모가 인지하는 내부 전사 종결 시그날이 없다. 또한, 효모 세포에서 다량 발현을 위해 코돈-최적화된, HPV31 L1을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 합성 분자를 사용하여 HPV31 바이러스 유사 입자(VLP)를 제조하고, HPV31 VLP를 포함하는 백신 및 약제학적 조성물을 제조할 수 있다. 본 발명의 백신은 중화 항체 및 세포 매개 면역 반응을 통하여 파필로마바이러스 감염에 대하여 효과적인 면역예방을 제공한다.

Description

효모에서 ＨＰＶ 31 Ｌ1의 최적 발현{Optimized expression of HPV 31 L1 in yeast}

본 출원은 2003년 3월 24일자 출원된 미국 가출원 제60/457,172호의 우선권을 주장하며, 이 내용은 본원에 참조로서 인용된다.

본 발명은 일반적으로 사람 파필로마바이러스(HPV)의 치료법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 HPV 31 L1 단백질을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오타이드 및 이들 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터 및 숙주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HPV31 바이러스-유사 입자(VLP); HPV의 예방 및 치료용 백신과 약제학적 조성물에서의 이의 용도에 관한 것이다.

80종 이상의 사람 파필로마바이러스(HPV)가 있으며, 이들중 대부분은 양성 증식성 사마귀부터 악성 암종에 이르기 까지 다양한 생물학적 표현형과 연관되어 있다(참고 McMurray et al., Int. J. Exp. Pathol. 82 (1) : 15-33 (2001)). HPV6 및 HPV 11가 가장 흔히 양성 사마귀, 비-악성 음부사마귀(condylomata acuminate), 성기 또는 호흡기 점막의 저등급 형성 장애와 연관된다. HPV16 및 HPV18는 흔히, 경부, 질, 음부, 도관의 침투성 암종과 연관된 가장 위험한 것들이다. 경부 암종의 90% 이상이 HPV16, HPV18 또는 덜 만연된 발암 타입 HPV31, -33, -45, -52, -58(Schiffman et al., J. Natl. Cancer Inst. 85 (12): 958-64 (1993))와 연관이 있다. 90-100% 경부 암에서 HPV DNA가 검출된다는 것은 HPVs가 경부암의 원인이라는 강력한 역학적 증거를 제공하는 것이다(Bosch et al., J. Clin. Pathol. 55: 244-265 (2002)).

파필로마바이러스는 크기가 작고(50-60 nm), 외피가 없으며, 20면체 DNA 바이러스로 8개의 어얼리(early) 유전자 및 2개의 레이트(late) 유전자를 갖고 있다. 바이러스 게놈의 개방 판독 프레임(ORF)을 E1 부터 E7, L1 및 L2로 지정하고 이때, "E"는 어얼리의 약어이고, "L"은 레이트의 약어이다. L1 및 L2는 바이러스 캡시드 단백질을 암호화하고, E 유전자는 바이러스 복제 및 세포 형질전환과 같은 기능과 연관되어 있다.

L1 단백질은 주요 캡시드 단백질로써 분자량이 55-60kDa이다. L2 단백질은 소수의 캡시드 단백질이다. 면역학적 데이터에 따르면, 대부분의 L2 단백질은 L1 단백질의 내부에 있다고 할 수 있다. L1 및 L2 단백질은 상이한 파필로마바이러스간에도 상당히 보존되어 있다.

효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 또는 세균에서 L1 단백질 또는 L1과 L2 복합 단백질의 발현으로 바이러스 유사 입자(VLP)의 자체-어셈블리를 유도한다(참고 Schiller and Roden, in Papillomavirus Reviews : Current Research on Papillomaviruses ; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)). VLP는 고유 비리온과 형태학적으로 유사하여, 동물 또는 사람에 투여 시에 고역가의 중화 항체를 유도할 수 있다. VLP에는 잠재적 발암 바이러스 게놈이 포함되어 있지 않기 때문에, HPV 백신 개발에서 생(live) 바이러스를 사용하기 위해 안전한 대체물질이 될 수 있다(Schiller and Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)). 이와 같은 이유로, L1 및 L2 유전자는 HPV 감염 및 질환의 예방 및 치료용 백신 개발에 있어서 면역학적 표적으로서 동정되었다.

성공적으로 형질전환된 숙주 유기체내에서 높은 수준으로 발현된 캡시드 단백질을 수득하는데 있어서의 어려움 및 정제된 단백질을 생산하는데 있어서의 한계점 등으로 인하여 HPV 백신 개발 및 상업화가 방해를 받아왔다. 따라서, HPV 31 L1 단백질과 같은 HPV L1 단백질을 암호화하는 야생형 뉴클레오타이드 서열이 동정되었음에도 불구하고(Goldsborough et al., Virology 171 (1): 306-311 (1989), 원하는 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 HPV 31 L1-암호화 뉴클레오타이드 서열을 이용한 천연상태의 HPV 단백질의 용이한 공급원을 개발하는 것이 절실하다. 또한, 백신 개발용으로서 고유 단백질의 면역성 부여 성질을 가지는 다량의 HPV 31 L1 VLP를 생산하는 것이 유용하다.

발명의 요약

본 발명은 경부암과 연관이 있는 HPV 31 L1 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성물에 대한 면역성을 유도 또는 증진시키는 조성물 및 그 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HPV 31 L1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는데, 이 폴리뉴클레오타이드는 효모에 의해 인지되는 내부 전사 종결 시그날이 없다. 또한, HPV 31 L1 단백질을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오타이드를 제공하는데, 이때 이 폴리뉴클레오타이드는 효모 세포에서 많이 발현될 수 있도록 코돈 최적화된 것이다. 본 발명은 또한 HPV 31 바이러스 유사 입자(VLP)를 제공하고, HPV 질환 또는 HPV-연관 암의 예방 및 치료용 면역학적 조성물 및 백신에서 VLP의 용도에 대해 설명한다.

본 발명은 HPV 31 L1 단백질을 암호화하는 합성 DNA 분자에 관한 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 합성 분자의 뉴클레오타이드 서열을 변형시켜 효모에서 인지되는 전사 종결 시그날을 제거하였다. 또 다른 한 특징에서 합성 분자의 코돈을 효모 세포가 선호하는 코돈을 사용할 수 있도록 고안하였다. 합성 분자를 HPV 31 L1 단백질의 공급원으로 이용할 수도 있는데, 이는 VLP로 자체 어셈블리 될 수 있다. 이와 같은 VLP를 VLP계 백신에 이용할 수 있다.

본 발명의 특정 구체예는 서열번호 4에서 제시하는 HPV 31 L1 단백질을 암호화하는 합성 핵산 분자를 포함하는데, 이 핵산 분자는 서열번호 2 또는 서열번호 3에서 제시한 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명에서는 효모가 인지하는 전사 종결 시그날이 없는 HPV 31 L1 유전자를 암호화하는 합성 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 여기에서 설명하는 바와 같이 효모 세포가 선호하는 코돈을 포함시키기 위해 코돈을 추가로 변형시킨 HPV 31 L1을 암호화하는 합성 폴리뉴클레오타이드를 또한 제공한다.

또한 명세서 전반에서 설명하는 핵산 분자를 함유하는 진핵 및 원핵 재조합 숙주 세포 및 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 재조합 숙주 세포에서 HPV 31 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것인데, 이 방법은 (a) HPV 31 L1 단백질을 암호화하고 효모가 인지하는 내부 전사 종결 시그날이 없는 핵산을 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포내로 도입시키는 단계; 및 (b) HPV 31 L1 단백질을 발현시키는 조건하에 효모 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명은 재조합 숙주 세포에서 HPV 31 L1 단백질을 발현시키는 추가 방법에 관한 것인데, 이 방법은 (a) HPV 31 L1 단백질을 암호화하고 효모 숙주 세포에서 최적 발현할 수 있도록 코돈-최적화된 핵산을 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포내로 도입시키는 단계; 및 (b) HPV 31 L1 단백질을 발현시키는 조건하에 효모 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

적절한 구체예에서, 핵산은 서열번호 2 또는 서열번호 3에서 제시한 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 HPV31 바이러스 유사 입자(VLP), HPV31 VLP를 제조하는 방법 및 HPV31 VLP를 사용하는 방법도 제공한다.

본 발명의 적절한 구체예에서, HPV31 VLP는 효모에서 제조된다. 좀더 적절한 구체예에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베르마이세스 프라질리스(Kluyvermyces fragilis), 클루이베르마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 특징은 HPV31 VLP인데, 이는 효모가 인지하는 전사 종결 시그날이 없는 HPV 31 L1 유전자에 의해 만들어진 HPV 31 L1 단백질을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 코돈 최적화된 HPV 31 L1 유전자에 의해 만들어진 HPV 31 L1 단백질을 포함하는 HPV31 VLP이다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 코돈-최적화된 HPV 31 L1 유전자는 필수적으로 서열번호 2 또는 서열번호 3에서 제시하고 있는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

본 발명은 또한 동물에 HPV 31 바이러스 유사 입자를 투여함을 포함하는 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 적절한 구체예에서, HPV31 VLP는 코돈-최적화 유전자에 의해 만들어진다. 또 다른 적절한 구체예에서, HPV 31 VLP는 효모가 인지하는 전사 종결 서열이 없는 유전자에 의해 만들어진다.

본 발명의 또 다른 특징은 HPV 31 VLP를 포함하는 백신을 포유류에 투여함을 포함하는 HPV-연관된 경부암을 예방 또는 치료하는 방법이다. 본 발명의 적절한 구체예에서, HPV31 VLP는 효모에서 만들어진다.

본 발명은 HPV 31 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함하는 백신에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 백신은 하나 이상의 추가 HPV 타입의 VLP를 포함한다. 적절한 구체예에서, 하나 이상의 추가 HPV 타입은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명은 HPV 31 바이러스 유사 입자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HPV31 VLP 및 하나 이상의 추가 HVP 타입의 VLP을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 적절한 구체예에서, 하나 이상의 추가 HPV 타입은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

명세서 및 청구범위 전반에서 사용된 바와 같이, 단수 및 정관사에는 특별히 다른 언급이 없는 한 복수의 의미도 포함된다.

명세서 및 청구범위 전반에서 사용된 바와 같이, 다음의 정의 및 약어를 이용한다;

"프로모터(promoter)"는 RNA 폴리머라제 가 결합하는 DNA 가닥상에 있는 인지 부위를 말한다. 프로모터는 RNA 폴리머라제 와 초기 복합체를 형성하여 전사 활동을 개시하고 전사를 구동한다. 복합체는 활성화 서열 "인핸서(enhancers)" 또는 "상류 활성화 서열(upstream activating sequences)" 또는 "억제서열(silencers)"에 의해 변형될 수 있다.

용어 "벡터"는 DNA 단편을 숙주 유기체 또는 숙주 조직으로 도입시킬 수 있는 수단을 말한다. 플라스미드, 바이러스(아데노바이러스 포함), 박테리오파아지, 코스미드를 포함한 다양한 형태의 벡터가 있다.

명시된 "31 L1 야생형 서열"은 서열번호 1에서 제시하는 것과 같은 HPV 31 L1 서열을 말한다. HPV 31 L1 야생형 서열은 이미 보고된 바가 있지만, 임상 분리체로부터 수득된 DNA간에 작은 서열 변이를 찾는 것은 흔한 일이다. 따라서, HPV 31 DNA를 포함하는 것으로 기존에 공지된 임상 샘플로부터 대표적인 HPV31 L1 야생형 서열을 분리하였다(실시예 1 참조). 31 L1 야생형 서열을 기준 서열로 이용하여 여기에서 설명하는 코돈-최적화된 HPV 31 L1 서열을 비교한다(도 1 참조).

"31 L1 부분 재구성된"이란 본원에 기재된 서열번호 2의 작제물을 말하는데, 이때 HPV31 L1 뉴클레오타이드 서열을 부분적으로 재구성하여, 효모에서 최적 발현될 수 있도록 효모가 선호하는 코돈을 포함시킨 것이다. 31 L1 부분 재구성체는 HPV 31 L1 야생형 뉴클레오타이드 서열의 중간 부분(뉴클레오타이드 697-1249)에 변이를 포함한다. 또한 완전한 HPV 31 L1 서열을 효모가 선호하는 코돈으로 재구성하는데, 이를 여기에서는 "31 L1 전체 재구성체" (서열번호 3)로 언급한다.

"유효량(effective amount)"은 적절한 수준의 폴리펩티드를 생산하여, 면역 반응을 일으키기 위한 충분한 양의 백신 조성물을 말한다. 당업자는 이 양이 상당히 다양하다는 것을 인지할 것이다.

"보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"이란 하나의 아미노산 잔기를 화학적으로 유사한 또 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것을 말한다. 이와 같은 보존적 치환의 예는 한 가지 소수성 잔기를 또 다른 소수성 잔기(이소루이신, 루이신, 발린 또는 메티오닌)로의 치환; 극성 잔기를 동일한 하전을 가지는 또 다른 극성 잔기(리신의 경우 아르기닌, 아스파르트산의 경우 글루타민산)로의 치환이다.

"포유류"는 사람을 포함하는 임의 포유류를 말한다.

"VLP" 또는 "VLP"는 바이러스형(유사) 입자(들)을 말한다.

"합성"이란 HPV31 L1 유전자가 변형되어, 천연의 야생형 HPV 31 L1 유전자에 존재하는 뉴클레오타이드 서열과 동일하지 않은 뉴클레오타이드 서열을 가지는 것을 말한다. 상기에서 설명한 바와 같이, 합성 분자는 효모가 인지하는 전사 종결 시그날을 제거하기 위해 변형된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 합성 분자를 제공한다. 효모에서 발현에 바람직한 코돈을 포함하는 합성 분자를 제공한다. 여기에서 제공되는 합성 분자는 야생형 HPV 31 L1 유전자와 같은 동일한 아미노산 서열을 암호화한다.

도 1은 일부 변형된(서열번호 2) 서열 또는 전체 재구성된 서열(서열번호 3)의 뉴클레오타이드를 나열한 것이다. 기준 서열은 31 L1 야생형 서열(서열번호 1: 실시예 1)이다. HPV 31 L1 부분 및 전체 재구성 서열의 뉴클레오타이드들이 기준 서열과 동일한 부분을 점으로 나타내었다. 상응하는 위치에서 변형된 뉴클레오타이드를 표시하였다. 뉴클레오타이드 번호를 괄호안에 기입하였다.

도 2에서는 31 L1 전체 재구성 뉴클레오타이드(서열번호 3) 및 아미노산(서열번호 4)을 나타내었다. 뉴클레오타이드 숫자는 좌측에 표시하였다.

도 3은 좌측에 나열된 세 가지 HPV 31 L1 서열 작제물간에 변화를 요약한 것이다. 4번째 컬럼은 나타낸 작제물과 야생형 HPV 31 L1 서열간에 뉴클레오타이드 상동성 비율을 나타낸 것이고, 다섯 번째 컬럼은 아미노산 상동성 비율을 나타낸 것이다. 마지막 컬럼은 효모가 선호하는 코돈 서열로 변형된 뉴클레오타이드 번호와 이와 같은 변경이 일어난 영역을 나타낸 것이다.

도 4는 엄격성이 높은(high stringency) 상태 하에서 HPV 31 L1에 대한 특이적 노던 블롯을 나타낸 것이다(실시예 4 참고). 좌측의 화살표는 HPV 31 L1 전장 및 절단된 전사체의 위치를 나타낸 것이다. "31 wt"로 표시된 레인은 31 L1 야생형 서열을 함유하는 효모의 동일한 RNA 제제를 기술하는 것이다. "16" 표시된 레인은 높은 엄중 조건으로 인하여 HPV 31 L1 프로브가 인지하지 못하는 HPV16의 RNA를 포함한다. "Neg"로 표시된 레인은 L1 암호화 서열이 포함되지 않은 효모 추출물이다. "31 R"로 표시된 레인은 31 L1 부분 재구성 서열을 발현시키는 두 가지 분리 콜로니의 RNA에서 얻은 것이다.

도 5는 두 가지 포획 방사선면역검정(RIA) 실험의 데이터 일부를 나타낸 것이다-분당 계수(cpm)/총 단백질 mg-(실시예 7 참조). RIA에서 수득한 Cpm이 HPV 31 LI VLP의 상대적 지표이다. RIA 데이터에서 효모가 선호하는 코돈 재구성 유전자 서열로부터 얻은 효모 단백질 추출물에서 31 L1 VLP 발현이 증가되었다는 것을 알 수 있다.

도 6에서는 투과 전자 현미경으로 가시화되었을 때 본원에 기술된 31 L1 VLP의 대표적인 샘플을 나타낸 것이다(실시예 8 참조). 막대는 100nm을 나타낸다.

경부 암종의 대부분은 사람의 발암 타입 특정 파필로마바이러스(HPV) 감염과 연관된다. 본 발명은 발암 HPV 타입 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성물에 대항한 면역성을 유도 또는 증진시키는 조성물 및 그 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 HPV 31 L1 및 HPV31-바이러스 유사 입자(VLP)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하고, 이들 폴리뉴클레오타이드 및 VLP를 HPV-연관 암 치료 및 예방용 면역 조성물 및 백신에 이용하는 것에 대해 설명한다.

야생형 HPV31 L1 뉴클레오타이드 서열은 이미 보고된 바 있다 (Goldsborough et al., Virology 171 (1) : 306-311 (1989); Genbank Accession # J04353). 본 발명은 HPV 31 L1 단백질을 암호화하는 합성 DNA 분자를 제공한다. 본 발명의 합성 분자는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는데, 이때 이 뉴클레오타이드의 일부를 변형시켜, 효모가 인지하는 전사 종결 시그날을 제거하였다. 또 다른 적절한 구체예에서는 합성 분자의 코돈은 다량 발현을 위해 효모 세포가 선호하는 코돈을 사용하도록 디자인되었다. 합성 분자는 HPV 31 L1 단백질의 공급원으로 이용될 수 있고, 이는 VLP로 자체 어셈블리된다. 이와 같은 VLP를 VLP계 백신에 이용하여 중화 항체 및 세포 매개 면역을 통하여 파필로마바이러스 감염에 대해 효과적인 면역 예방을 할 수 있다. 이와 같은 VLP계 백신은 이미 확립된 HPV 감염된 경우의 치료에도 유용하다.

효모 세포내에서 HPV VLP를 발현시키면 비용 측면에서 효과적이며, 발효기에서 대규모로 생장시키기도 용이하다. 그러나, 많은 HPV L1 단백질(HPV31 L1 포함(실시예 4 참조))이 효모 세포에서 발현 정도가 상당히 낮다. 본 발명에 따르면, 이와 같이 HPV 31 L1의 발현 수준이 낮은 이유는 효모가 인지하는 전사 종결 시그날로 인하여 mRNA 전사체가 절단(truncation)되기 때문인 것으로 확인되었다. HPV31 L1 DNA를 변형시켜 효모 전사 종결 부위와 유사한 임의 잠정적 서열을 제거함으로써, 전장 mRNA 전사가 촉진되며, HPV31 L1 단백질 발현이 증가된다.

따라서, 본 발명의 일부 구체예에서, HPV31 L1 DNA를 변형시켜, 효모 전사 종결 시그날과 유사한 임의 잠정적 서열을 제거하였다. 이와 같이 변형시키면, 절단된 전사체와는 반대로 전장 HPV31 L1 전사체가 발현될 수 있어(실시예 4 참조), 발현 수율이 개선된다.

상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명의 합성 DNAs는 효모가 인지하는 내부 전사 종결 시그날 부위를 제거하도록 야생형 HPV31 L1 서열에 변형이 포함된다. 당업자는 추가 DNA 분자가 HPV31 L1 단백질을 암호화하나, 효모 전사 종결 부위를 포함하지 않는 것으로 해석될 수 있음을 인지할 것이다. 효모가 인지하는 내부 전사 종결 서열 검색 기술은 당분야에 공지되어 있다. 전사 종결 및 효모 mRNA의 3' 말단 형성에는 세가지 시그날이 존재해야 한다; (1) 하류에 위치한 정치(positioning) 요소의 효능을 증진시키는 TATATA 또는 관련 서열과 같은 효과 요소; (2) 폴리 A 부위의 위치를 결정하는 정치 (positioning) 요소; (3) 폴리아데닐화 부위(통상 Py(A)n).

문헌에서는 효모가 인지하는 전사 종결 시그날을 암호화하는 서열에 대한 설명은 많다. 예를 들면, 문헌[참조: Guo and Sherman, Trends Biochem. Sci. 21: 477-481 (1986); Guo and Sherman, Mol. Cell. Biol. 16 (6): 2772-2776 (1996); Zaret et al, Cell 28 : 563-573 (1982); Henikoff et al, Cell 33 : 607-614 (1983); Thalenfeld et al, J. Biol. Chern. 258 (23): 14065-14068 (1983); Zaret et al, J. Mol. Biol. 176: 107-135 (1984) ; Heidmann et al, Mol. Cell Biol 14 : 4633-4642 (1984) ; and Russo, Yeast 11: 447-453 (1985)]을 들 수 있다. 따라서, 당업자는 본 발명에 따른 전장의 mRNA 전사체를 만들 수 있는 합성 HPV31 L1 유전자를 작제하기 위해 별 어려움 없이 어떤 서열을 피해야 하는 지를 결정할 수 있을 것이다. 또한, 효모 전사 종결 서열이 합성 서열내에 존재하는지를 평가하는 분석 및 과정이 당분야에 잘 공지되어 있어, 당업자는 작제된 HPV31 L1 서열이 제거할 필요가 있는 종결 서열을 포함하는 지를 결정할 수 있을 것이다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 HPV31 L1 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것인데, 이 핵산에는 효모가 인지하는 내부 전사 종결 시그날이 없다. 본 발명의 예시적인 구체예에서 합성 핵산 분자는 서열번호 2 또는 서열번호 3에서 제시된 것과 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, HPV31 L1 유전자 서열은 효모 세포 환경에서 다량 발현될 수 있는 "최적화"된 것이다. 본 발명에서 고려하는 코돈-최적화된 HPV31 L1 유전자에는 효모가 인지하는 내부 전사 종결 시그날이 없는 HPV31 L1를 암호화하는 합성 분자가 포함되고, 추가로 효모 세포에서 다량 발현될 수 있도록 코돈-최적화된 하나 이상의 코돈을 포함한다.

4개 잠정적 뉴클레오타이드 염기의 "트리플렛"코돈은 60개 이상의 다양한 형태로 존재할 수 있다. 이들 코돈은 20개의 상이한 아미노산( 및 전사 개시, 종료)에 대한 메시지를 제공하기 때문에, 일부 아미노산들은 하나 이상의 코돈에 의해 암호화될 수 있고, 이와 같은 현상을 코돈 축퇴성(codon redundancy)이라고 한다. 완전하게 밝혀지지 않은 이유로 인하여, 상이한 세포 유형에 내생 DNA에 존재하는 대체 코돈(alternative codons)이 항상 균일하게 존재하는 것은 아니다. 또한, 특정 세포 유형에서 특정 코돈에 대해 다양한 자연적인 우선 선위 또는 "선호"성이 존재하는 것으로 보인다. 한 가지 예를 들면, 아미노산 루이신은 CTA, CTC, CTG, CTT, TTA 및 TTG을 포함하는 6개 DNA 코돈중에 하나에 의해 정해진다. 미생물에서 게놈 코돈 빈도에 대한 광범위한 연구 분석을 통하여, 이. 콜리 내생 DNA에서 가장 흔히 포함하고 있는 것이 CTG 루이신 코돈이고, 효모 DNA 및 점균류(slime molds) DNA에서는 TTA 루이신 코돈이 가장 흔하다는 것을 알았다. 이와 같은 선호 순위에 의해 이. 콜리 숙주에 의한 루이신이 많은 폴리펩티드를 많이 발현시키는 방법은 이용되는 코돈의 사용 빈도에 따라 어느 정도 달라진다고 일반적으로 보고있다. 예를 들면, TTA 코돈이 많은 유전자는 이. 콜리에서는 발현이 잘 안되는 반면에, CTG가 많은 코돈이 이. 콜리 숙주에서는 많이 발현될 수 있다는 것이다. 유사하게, 효모 숙주 세포에서는 루이신이 풍부한 폴리펩티드가 선호하는 코돈이 TTA일 것이다.

재조합 DNA 기술에서 코돈 선호 현상의 연관성은 명백하고, 이와 같은 현상을 이용하면, 성공적으로 형질전환된 숙주 유기체에서 외생 유전자를 많이 발현시키지 못한 예전의 실패 원인을 설명할 수 있을 것이다-아마도 "선호도가 낮은"코돈이 삽입된 유전자가 반복적으로 존재했을 것이고, 발현을 위한 숙주 세포 기전이 효과적으로 작동하지 않았을 것이다. 이와 같은 현상으로 합성 유전자에 의도한 숙주 세포가 선호하는 코돈을 포함하도록 만들면, 재조합 DNA 기술을 실행하는데 최적의 외부 유전 물질형태를 제공할 수 있다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 가지 특징은 효모 세포에서 코돈-최적화된 발현을 할 수 있는 HPV31 L1 유전자를 제공하는 것이다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 동일한 단백질 서열을 암호화하는 대체 코돈을 이용하는 경우에 효모 세포에 의한 HPV31 L1 발현시에 제약을 제거할 수 있다는 것을 알았다.

본 발명에 따르면, HPV31 L1 유전자 절편을 동일한 해독 서열을 가지나 문헌(참조: Sharp and Cowe(Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 657-678 (1991))에서 설명하는 것과 같이 대체 코돈을 이용한 서열로 변환시켰다(상기 문헌은 전문을 참조로 인용한다). 이 방법은 일반적으로, 고도 발현과 일반적으로 연관되지 않은 코돈을 야생형 서열에서 동정하고, 이를 효모 세포에서 다량 발현을 위한 최적 코돈으로 대체하는 것으로 이루어진다. 이와 같은 코돈 대체에 의해 생성된 신규한 유전자 서열내에 원하지 않은 서열이 있는 지를 조사한다(예를 들면, "ATTTA" 서열, 인트론 스플라이스 인지 부위가 의도되지 않게 생성, 원치 않은 제한 효소 인지 부위 등). 바람직하지 않은 서열은 동일 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈을 이용하여 기존 코돈에 대체시켜 제거한다. 합성 유전자 절편에 대해 발현 개선 여부를 테스트 하였다.

상기에서 설명하는 방법을 이용하여 HPV31 L1에 대한 합성 유전자 절편을 만들고, 이로써 다량 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 유전자를 수득할 수 있다. 상기 과정은 HPV 백신에 이용할 수 있는 코돈-최적화된 유전자를 고안하는 본 발명의 방법을 요약한 것이며, 당업자는 상기 과정을 약간 변형시키거나 서열에 사소한 작은 변형에 의해 유사한 백신 효과 또는 유전자 발현을 증가시킬 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명은 HPV31 L1 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 합성 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 폴리뉴클레오타이드 서열은 효모 숙주에서 발현 최적화된 코돈으로 구성된다. HPV31 L1 단백질의 돌연변이 형에는 보존 아미노산 치환, 아미노-말단 절단, 카복시-말단 절단, 결실 또는 부가 등이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 임의 생물학적 활성 단편 및/또는 돌연변이는 서열번호 4에서 제시하는 것과 같은 HPV31 L1 단백질의 면역학적 성질을 적어도 실질적으로 모방하는 단백질 또는 단편을 암호화할 것이다. 본 발명의 합성 폴리뉴클레오타이드는 치료 또는 예방 HPV 백신 개발에 유용할 수 있도록 기능을 하는 HPV31 L1 단백질을 발현시키는 mRNA 분자를 암호화한다.

본 발명의 한 가지 특징은 서열번호 4에서 제시하는 HPV31 L1 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 핵산 분자인데, 이 핵산 분자는 서열번호 2에서 제시하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

또 다른 본 발명의 특징은 서열번호 4에서 제시하는 HPV31 L1 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 핵산 분자인데, 이 핵산 분자는 서열번호 3에서 제시하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 명세서를 통하여 설명하고 있는 핵산 분자를 포함하고 있는 진핵 또는 원핵 재조합 숙주 세포 및 재조합 벡터에 관한 것이다.

여기에서 설명하는 방법을 통하여 만들어진 합성 HPV31 DNA 또는 이의 단편은 적절한 프로모터 및 다른 적절한 전사 조절 요소를 포함하는 발현 벡터내로 분자 클로닝시키고, 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 벡터를 전이시켜 발현시킴으로써 재조합 HPV31 L1 단백질을 생산할 수 있다. 이와 같은 조작 기술은 당분야에 공지된 것이다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Green Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York (1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose et al. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1990), 이들 문헌은 참조로서 인용한다).

따라서, 본 발명은 재조합 숙주 세포에서 HPV31 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것인데, 이 방법은 (a) 효모 숙주 세포내로 HPV 31 L1 단백질을 암호화하고 효모 숙주 세포에서 최적 발현할 수 있도록 코돈-최적화된 핵산을 포함하는 벡터를 도입시키는 단계; 및 (b) HPV 31 L1 단백질을 발현시키는 조건하에 효모 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명은 재조합 숙주 세포에서 HPV31 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것인데, 이 방법은 (a) 효모 숙주 세포내로 HPV 31 L1 단백질을 암호화하고 효모가 인지하는 내부 전사 종결 시그날이 없는 핵산을 포함하는 벡터를 도입시키는 단계 ; 및 (b) HPV 31 L1 단백질을 발현시키는 조건하에 효모 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명은 재조합 숙주 세포에서 HPV31 L1 단백질을 발현시키는 방법에 관한 것인데, 이 방법은 (a) 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 핵산을 포함하는 벡터를 효모 숙주 세포로 도입시키는 단계, 및 (b) HPV 31 L1 단백질을 발현시키는 조건하에 효모 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 합성 유전자는 숙주 세포에서 HPV58 L1 단백질을 충분한 양으로 발현시키기 위해 고안된 서열을 포함하는 발현 카세트내에 어셈블리될 수 있다. 이 카세트에는 적절하게는 프로모터 및 종료서열과 같은 전사 및 해독 조절 서열이 작동가능하도록 연결되어 있다. 당업자는 GAL10, GAL7, ADH1, TDH3, PGK 프로모터와 같은 다른 공지의 효모 프로모터 또는 다른 진핵 유전자 프로모터를 이용할 수 있다는 것을 인지할 수 있으나, 적절한 구체예에서 프로모터는 에스 세레비지애 GALl 프로모터이다. 다른 공지의 전사 터미네이터를 이용할 수 있으나, 적절한 구체예에서 적절한 터미네이터는 에스 세레비지애 ADH1 터미네이터이다. GALl 프로모터와 -ADHI 터미네이터를 복합 사용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 또 다른 특징은 HPV31 바이러스-유사 입자(VLP), HPV31 VLP를 생산하는 방법 및 HPV31 VLP를 이용하는 방법이다. 사람 및 동물 파필로마바이러스의 주요 캡시드 단백질인 L1이 효모, 곤충세포, 포유류 또는 세균에서 발현되면 VLP는 자체-어셈블리될 수 있다(참조 Schiller and Roden, in Papillomavirus Reviews : Current Research on Papillomaviruses ; Lacey, ed. Leeds, UK: Leeds Medical Information, pp 101-12 (1996)). L1 및 L2 캡시드 단백질이 복합 발현됨으로써 형태학적으로 뚜렷하지 않은 HPV VLP가 만들어 질 수도 있다. VLP는 T=7 20면체 구조에서 L1이 72개 펜타머로 구성된다(Baker et al., Biophys. J. 60 (6): 1445-56 (1991)).

VLP는 형태학적으로 고유 비리온과 유사하고, 동물에 투여하였을 때 고역가의 중화항체를 유도할 수 있다. VLP를 토끼 및 개에 면역주사하면, (토끼의 경우-Breitburd et al. , J. Virol. 69 (6): 3959-63 (1995)) (개의 경우-Suzich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. MM 92 (25): 11553-57<BR> (1995)) 중화항체를 유도하였고, 실험용 파필로마바이러스 감염에 대해 보호하는 것으로 나타났다. 그러나, VLP에는 잠정적으로 발암성인 바이러스 게놈이 포함되어 있지 않고, 단일 유전자로부터 자체-어셈블리하기 때문에 HPV 백신 개발에서 생(live) 바이러스를 사용하기 위해 안전한 대체물을 제공한다(참조Schiller and Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)).

따라서, 본 발명은 HPV31의 재조합 L1 단백질 또는 재조합 L1 +L2 단백질로 이루어진 바이러스 유사 입자에 관한 것이다.

적절한 구체예에서, HPV31 VLP는 효모에서 만들어진다. 추가 적절한 구체예에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베르마이세스 프라질리스(Kluyvermyces fragilis), 클루이베르마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 특징은 HPV31 VLP인데, 이는 효모가 인지하는 내부 전사 종결 시그날이 없는 HPV 31 L1 유전자에 의해 만들어진 HPV 31 L1 단백질을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 코돈 최적화된 HPV 31 L1 유전자에 의해 만들어진 HPV 31 L1 단백질을 포함하는 HPV31 VLP이다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 코돈-최적화된 HPV 31 L1 유전자는 필수적으로 서열번호 2 또는 서열번호 3에서 제시하고 있는 뉴클레오타이드로 이루어진다.

본 발명의 또 다른 특징은 HPV31 VLP를 생산하는 방법인데, 이 방법은 (a) HPV31 L1 단백질 또는 HPV31 L1+L2 단백질을 암호화하는 재조합 DNA 분자로 효모를 형질전환시키고; (b) 재조합 HPV31 단백질을 만들 수 있도록 재조합 DNA 분자 발현을 허용하는 조건하에 형질전환된 효모를 배양하고; (c) HPV31 VLP를 생산하기 위해 재조합 HPV31 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 효모는 효모에 의해 인지되는 전사 종결 시그날이 없는 HPV31 L1 유전자에 의해 형질전환된다. 또 다른 적절한 구체예에서, 효모는 HPV31 VLP를 만들기 위해 코돈-최적화된 HPV31 L1 유전자에 의해 형질전환된다. 특별히 적절한 구체예에서, 코돈-최적화된 HPV31 L1 유전자는 필수적으로 서열번호 2 또는 서열번호 3에서 제시된 뉴클레오타이드 서열로 구성된다.

본 발명은 또한 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는데, 동물에 HPV31 VLP 입자를 투여하는 것이다. 적절한 구체예에서, 효모가 인지하는 내부 전사 종결 시그날이 없는 유전자에 의해 HPV31 VLP가 만들어진다. 또 다른 적절한 구체예에서 코돈-최적화된 유전자에 의해 HPV31 VLP가 만들어진다.

본 발명의 또 다른 특징은 HPV-연관 경부 암을 예방 또는 치료하는 방법인데, 이 방법은 포유류에 HPV31 VLP로 구성된 백신을 투여하는 것으로 구성된다. 본 발명의 또 다른 적절한 구체예에서 효모에서 HPV31 VLP가 만들어진다.

본 발명은 또한 HPV31 바이러스 유사 입자(VLP)로 구성된 백신에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 백신은 하나 이상의 추가 HPV 타입의 VLP로 구성된다. 적절한 구체예에서, 하나 이상의 추가 HPV 타입은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 백신은 HPV16 VLP를 추가로 포함한다.

본 발명의 적절한 구체예에서, 백신은 HPV16 VLP 및 HPV18 VLP을 추가로 포함된다.

본 발명의 또 다른 적절한 구체예에서, 백신에는 HPV6 VLP, HPV11 VLP, HPV16 VLP 및 HPV18 VLP을 추가 포함한다.

본 발명은 HPV 31 바이러스 유사 입자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 HPV31 VLP 및 하나 이상의 추가 HVP 타입의 VLP를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 적절한 구체예에서, 하나 이상의 추가 HPV 타입은 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 백신 조성물은 임의 잠정적 독성은 최소화시키면서, HPV31 감염을 가장 적절하게 저해시키기 위해 통상의 테스트에 의해 확인된 적절한 용량으로 단독 투여될 수도 있다. 또한 다른 물질과 연속 투여하는 것이 바람직할 수도 있다.

백신 수용 개체내로 도입되는 바이러스 유사 입자의 양은 발현되는 유전자 생성물의 면역원성에 따라 달라진다. 일반적으로, 근육 조직으로 바로 투여되는 경우에 VLP의 면역학적 또는 예방학적으로 효과적인 용량은 약 10㎍ 내지 100㎍이고, 바람직하게는 약 20㎍ 내지 60㎍이다. 피하 주사, 피내주사, 피부를 통한 인상(impression) 및 복막, 정맥 또는 흡입과 같은 다양한 투여 방법 또한 사용할 수 있다. 또한 부스터 백신 접종(booster vaccinations)으로 제공될 수도 있다. 정맥, 근육내, 피하와 같은 비경구 투여(parenteral administration) 또는 알룸 또는 Merck 알룸 어쥬번트와 같은 어쥬번트와 동시에 또는 본 발명의 백신을 비경구 도입시키고 연속하여 투여하는 것도 유익하다.

여기에서 언급한 모든 공보는 본 발명과 연관하여 사용될 수 있는 방법, 재료를 설명하는 목적으로 언급한 참고문헌이다. 선행 발명의 견지에서 그 내용을 제공한 발명은 없다.

첨부 도면을 참고하여 적절한 구체예를 설명하는데, 이들 구체예에 본원 발명을 한정시키지 않으며, 당업자는 첨부 청구범위에서 정의하는 바의 본 발명의 범위 또는 영역에 벗어나지 않고 다양한 변화 및 수정이 가능함을 인지할 수 있을 것이다.

다름의 실시예를 설명을 위함이며, 본원 발명을 이에 한정시키고자 함이 아니다.

실시예 1

대표적 HPV31 L1 서열의 결정

HPV 31 L1 야생형 서열은 이미 설명된 바 있다(Goldsborough et al., Virology 171 (1) : 306-311 (1989); Genbank Accession # J04353). 그러나, 임상 분리체들로부터 수득된 DNA간에 작은 서열 변이를 발현하는 것은 흔한 일이다. 대표적인 HPV31 L1 야생형 서열을 분리하기 위해, HPV31 DNA를 포함하는 것으로 나타난 세가지 임상 샘플로부터 DNA를 분리하였다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에서, Taq DNA 폴리머라제 와 다음의 프라이머들: HPV 31 L1 F 5'-CGT CGA CGT AAA CGT GTA TCA TAT TTT TTT ACA G-3' (서열번호 5) 및 HPV 31 L1 B 5'-CAG ACA CAT GTA TTA CAT ACA CAA C-3' (서열번호 6)을 이용하여 HPV 31 L1 서열을 증폭시켰다. 증폭된 생성물을 아가로즈 겔상에서 전기영동시키고, 에티디움 브로마이드 착색시켜 볼 수 있다. ~1500 bp L1 밴드를 잘라내고, QIA quick PCR 정제 키트(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 그 다음 TA 클로닝 벡터인, pCR-II(Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA)에 결찰시키고, E. coli 에 형질도입시키고, 청색/흰색 콜로니 선별용 암피실린+IPTG, X-gal이 보강된 LB 한천배지에 도말한다. 플레이트를 뒤집어, 37℃에서 16시간 배양시켰다. 흰색 콜로니는 LB+암피실린 배지에서 배양되는데, 37℃에서 16시간 진탕배양(shaing incubation)시키고, 미니프렙(minipreps)을 실시하여 플라스미드 DNA를 추출해낸다.

플라스미드에서 L1 유전자가 존재하는지를 설명하기 위해, 제한효소 절단을 실시하고, 아가로즈 겔 전기영동 및 에티디움 브로마이드 착색으로 확인한다.

세가지 각 임상 분리물로부터 클론된 L1을 포함하는 플라스미드에서 DNA 서열화 작업을 실시하였다. DNA 및 해독된 아미노산 서열을 서로 간에, 그리고 Genbank HPV 31 L1 서열과 비교하였다. 세 가지 임상 분리체의 서열 분석에서, Genbank 서열과 동일한 서열은 나타나지 않았다. pCR-II-HPV 31L1/81 클론을 대표 31 L1 서열로 선택하고, 이를 "31 L1 야생형 서열 " (서열번호 1, 도 1)로 명명하였다. 31 L1 야생형 서열로 선택된 서열에는 뉴클레오타이드 1266에서 한 개 침묵 치환과 1295에서는 C가 G로 변화된 것이 포함되는데, 이는 트레오닌에서 세린으로 암호화된 아미노산이 변경된 것이다. 31 L1 부분 및 전체 재구성된 유전자(각각 SEQ ID NOs: 2 및 3) 는 이 위치에서 세린을 암호화한다(도 1참조). 모든 경우에, 아미노산 서열은 동일하다. 효모가 선호하는 코돈 서열을 이용하여 아미노산을 암호화하고, 잠정적 전사 종결 시그날을 제거하도록 뉴클레오타이드를 재구성 작제물에서 변화시킨다(실시예 2 참조).

31 L1 야생형 서열을 LS-101 5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TGT GGC GGC CTA GC-3' (서열번호 7) 및 LS-102 5'-GAC AGA TCT TAC TTT TTA GTT TTT TTA CGT TTT GCT GG-3' (서열번호 8) 프라이머를 이용하여 증폭시켜, BglII 연장부를 첨가한다. Velt^TM DNA 폴리머라제 를 이용하여 PCR을 실행하였다. PCR 산물은 아가로즈 겔을 에티디움 브로마이드로 착색시켜 볼 수 있다. ~1500 bp L1 밴드를 잘라내고, QIAEX II 겔 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 DNA를 정제하였다. PCR 산물을 BglII를 이용하여 37 ℃에서 2시간동안 절단하고, QIA quick PCR 정제 키트를 이용하여 정제하였다. BglII 절단된 31 L1 PCR 산물을 Ba7nHI 절단된 pGAL110 에 결찰시키고, DH5 이. 콜리에 형질도입시켰다. 정확한 방향으로 HPV31 L1 삽입된 경우에만 PCR을 이용하여 콜로니를 스크리닝하였다. DNA 서열 분석을 통하여 서열 및 방향을 확인하였다. 선택된 클론은 pGAL110-HPV 31L1 #2로 명명하였다.

Maxiprep DNA를 준비하고, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 컴피턴트로 만들고, 형질전환시켰다. 효모 형질전환체를 Leu^- 소르비톨 플레이트상에서 Leu^- 소르비톨 탑-한천상에 도말하고, 3-5일간 30℃에서 역배양하였다. 콜로니를 찍어서, Leu^- 소르비톨 플레이트상에서 분리시키기 위해 사선(streak) 접종한다. L1 전사 및 단백질 발현을 유도하기 위해, 분리된 콜로니를 연속하여 5㎖ 5 X Leu^- Ade^- 소르비톨+1.6% 포도당, 4% 갈락토즈를 이용한 튜브 배양물을 30℃에서 회전 배양시켜 생장시킨다.

실시예 2

효모 코돈 최적화

효모-선호 코돈에 대해서는 설명된 바 있다(Sharp and Cowe, Yeast 7: 657-678 (1991)). 우선, 뉴클레오타이드 697-1249로 나타내는 HPV31 L1의 중간 부분을 효모 선호 코돈을 이용하여 재구성하였다. 재구성에 이용된 방법은 재구성될 부분 길이의 긴 오버래핑 센스 및 안티센스 올리고머를 고안하고, 동일한 아미노산 서열을 유지시키면서 뉴클레오타이드를 효모가 선호하는 코돈 서열로 치환시키는 것이다. 이와 같은 올리고머는 PCR 반응에서 주형 DNA 대신에 이용된다. 추가 증폭 프라이머를 고안하고, 이를 이용하여 Pfu DNA 폴리머라제 를 이용하여 주형 올리고머로부터 재구성된 서열을 증폭시킨다(Stratagene, La Jolla, CA). 증폭을 위한 최적의 조건은 부위-특이적이나; 그러나 대부분은 다음과 같은 프로그램을 이용한다: 1분간 94℃에서 초기 변성 단계 ; 95℃에서 30초간 변성-55℃에서 30초간 어닐링-72℃에서 3.5 분간 연장-과정을 15-25회; 72℃에서 최종 10분간 연장, 4℃ 유지.

아가로즈 겔 전기영동을 이용하여 PCR 산물을 검사하였다. 적절한 크기의 밴드를 잘라내고, 그 DNA를 겔 정제하였다. 증폭된 단편을 주형으로 이용하여 552개 뉴클레오타이드의 재구성된 HPV 31 중간 L1 단편을 어셈블리한다. 그 다음 PCR를 이용하여, 야생형 뉴클레오타이드 1-725(5'말단) 및 뉴클레오타이드 1221-1515(3'말단)을 증폭시킨다. 5' 말단과 3'말단, 재구성된 중간 부분을 이용한 최종 PCR을 실행하여, 전장의 31 L1 부분 재구성물을 만들고 이를 "31 L1 부분 재구성체"로 명명한다.

완전한 31 L1 서열을 효모가 선호하는 코돈을 이용하여 재구성하였다. 이 구성체는 "31 L1 전체 제구성체"로 명명하였다. 9개 긴 오버래핑 올리고머를 이용하여 1-753의 효모 선호 코돈 뉴클레오타이드 서열을 만들고, 4개의 긴 오버래핑 올리고머를 이용하여 1207-1515의 효모 선호 코돈 뉴클레오타이드 서열을 만들었다. 증폭 및 겔 정제후에, 상기에서 설명한 중간 재구성 부분(뉴클레오타이드 697-1249)와 함께 이들 단편들을 PCR 반응에 이용하여, 전장의 31 L1 전체 재구성 서열을 만든다. 이 조각은 BamHI 연장부와 함께 생성된다. 겔 정제된 재구성된 31 L1 DNA를 BamHI로 처리하고, BamHI 처리된 pGAL110 발현 벡터에 결찰시키고, E. coli DH5 세포로 형질도입시켰다. 정확한 방향으로 삽입된 HPV31 L1에 대해 PCR을 이용하여 콜로니 스크리닝하였다. 서열 및 방향은 DNA 서열화를 통하여 확인하였다.

플라스미드 DNA를 준비하였다. 에스 세레비지애 세포는 컴피턴트로 만들고 형질전환시켰다. 효모를 Leu^- 소르비톨 플레이트상에서 Leu^- 소르비톨 탑-한천상에 도말하고, 3-5일간 역배양하였다. Leu^- 소르비톨 플레이트상에서 분리시키기 위해 콜로니를 사선(streak) 접종한다. L1 전사 및 단백질 발현을 유도하기 위해, 분리된 콜로니를 연속하여 5㎖ 5 X Leu^- Ade^- 소르비톨+1.6% 포도당, 4% 갈락토즈를 이용한 튜브 배양물을 30℃에서 회전 배양시켜 생장시킨다. 48-72시간 후에, OD600=10에 상응하는 배양 용적을 펠렛화시키고, 상층액은 제거하고, 펠렛은 냉동시켜 -70℃에서 보관한다.

실시예 3

RNA 준비

갈락토즈 유도에 의한 HPV31 L1 발현을 위해 유도된 형질전환된 효모 세포 펠렛을 해동시켜, 1㎖ 냉각 DEPC-처리된 물에 재현탁시킨다. 세포를 원심분리시켜 펠렛화시키고, 생성된 상층액은 버린다. 그 다음 세포 펠렛은 400㎕ TES (10 mM Tris pH7.0, 10 mM EDTA, 0.5% SDS)에 재현탁시킨다. 동량의 AE 완충액-포화된 페놀(50 mM NaOAc 및 10 mM EDTA)을 첨가하였다. 튜브를 10초간 볼텍스하고, 50분간 65℃까지 가열하는데, 매 10분마다 혼합한다. 그 다음 튜브를 얼음위에 10분간 둔 다음 4℃에서 5분간 원심분리시킨다. 상층액을 수집하고, 이를 멸균 튜브에 옮긴다. 추가 400㎕ 페놀을 첨가하고 튜브를 다시 볼텍스하고, 얼음위에 5분간 둔 후 원심분리하였다. 상층액을 멸균 튜브에 옮기고, 400㎕ 클로로포름을 첨가하고, 다시 혼합시키고, 원심분리하였다. 상층액을 다시 수득하고, 이를 멸균 튜브로 옮기고, 40 ㎕ 3M Na Acetate pH 5.2와 1㎖ 100% EtOH을 함께 첨가하였다. 튜브를 1시간동안 드라이아이스상에 두고, 고속에서 원심분리시켜, RNA를 펠렛화시켰다. RNA를 1회 70% EtOH로 헹군다음 대기-건조시켰다. RNA를 다시 100㎕ DEPC-처리된 물로 현탁시키고, 5분간 65℃로 가열시켜 용해시켰다. 샘플안에 있는 RNA 농도를 측정하기 위해 분광광도를 측정하는데, A260/280가 1.7-2.0인 경우에, A260에서 판독치가 1인 경우에 RNA농도는 40㎍/㎖라고 추정한다.

실시예 4

노던 블롯 분석

31 L1 야생형을 발현시키는 효모의 초기 분석에서 HPV31 L1 단백질의 발현 수득율은 예상된 것보다 상당히 작다는 것이다. 이와 같은 낮은 발현이 일어나는 이유가 전사 수준때문인지 또는 해독 수준때문인지를 결정하기 위해 HPV31 L1 전사체의 노던 블롯 분석을 실시하였다. HPV16 L1을 발현시키는 효모의 RNA를 HPV31 L1를 발현시키는 효모와 함께 동일한 겔 상에서 전사체 크기를 비교하기 위해 겔상에서 노던 블롯을 실시하였다.

1.2% 아가로즈 포름알데히드 겔을 만들었다. RNA 10㎍과 변성 완충액(최종 농도: 6% 포름알데히드, 45% 포름아미드, 0.9 x MOPS)를 배합시키고, 15분간 55℃로 가열시켰다. 겔 로딩 완충액 용적의 1/10 양을 첨가하고, 겔상에 샘플을 로딩하였다. 5시간동안 65volts, 1 x MOPS 완충액을 이용하여 전기영동하였다. 겔을 15분간 멸균수로 헹군 다음, 5분간 10 x SSC로 2회 세척한다. RNA를 Hyb10 x SSC에서 16시간동안 모세관 작용을 통하여 Hybond-N+ 나일론 막으로 옮겨간다(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). 그 다음 RNA를 700 단위 에너지에 대해 세트된 Amersham 크로스 링커를 이용하여 크로스 링커시켜 나일론 막에 고정시켰다. 고정시킨 후에, 나일론 막을 대기(air) 건조시켰다. 막을 30㎖ Zetaprobe 완충액에 55℃에서 2시간 동안 방치한 후, ³²P-라벨된 프로브를 첨가하고, 16시간 동안 53-65℃에서 배양시켰다. 그 다음 막을 5 X SSC로 실온에서 20분간 3회 세척하고, 실온에서 20분간 0.4 x SSC로 2회 세척하고, 60℃에서 10분간 세척하였다. HPV31 L1 특이적 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 프로브 DNA가 생성된다. 폴리뉴클레오타이드 및 y-32P ATP를 이용하여 37℃에서 1 시간동안 처리함으로써 증폭된 DNA를 라벨시킨다. 블롯은 사란(Saran)랩으로 싸고, 16시간 동안 X-선 필름에 노출시켰다. 필름 현상시에, 프로브-하이브리드된 RNA는 자가방사사진상에 검은 밴드로 감지되었다.

상기에서 설명한 노던 블롯 분석에 따르면, 전장의 HPV31 L1 야생형전사체의 대부분이 전장보다 상당히 작은 것으로 나타났다(도 4 참조). 그러나, 31 L1 부분 재구성체는 유전자의 중간 부분에 효모-선호 코돈을 삽입하였을 뿐만 아니라 효모 전사 종결 부위를 닮은 임의 잠정적 서열도 제거하도록 고안되었다. 노던 블롯 분석으로 분명하게 알 수 있는 것은 재구성시에, 31 L1 유전자의 길이가 HPV 16 L1 전사체의 것에 상응하게 상당히 증가된다는 것이다(나타내지 않음). 따라서, 미숙한 전사 종결은 31 L1 야생형 작제물에서 상당 부분의 낮은 발현 수율 때문인 것으로 설명될 수 있다.

실시예 5

HPV31 L1 단백질 발현

OD600=10에 등가의 갈락토즈 유도된 배양물의 냉동된 효모 세포 펠렛을 얼음위에서 해동시켜, 300㎕ PC 완충액(100 mM Na₂HP0₄, 0.5 M NaCl, pH 7.0)와 2mM PMSF으로 현탁시켰다. 산으로 세척한 0.5mm 유리 비드를 튜브당 ~0.5g의 양으로 첨가하였다. 튜브를 4℃에서 15분간 볼텍스하였다. 7.5㎕ 20% Triton 100을 첨가하고, 4℃에서 5분간 볼텍스를 반복하였다. 튜브를 15분간 얼음위에 방치하고, 그 다음 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 상층액은 멸균 마이크로원심분리기 튜브로 옮기고, -70℃에 보관하였다.

실시예 6

웨스턴 블롯 분석

각 HPV31 L1 작제물에 대해 20 내지 40개 분리된 효모 콜로니에서 총 효모 단백질 추출물을 웨스턴 블롯 분석하여 갈락토즈 유도후에 HPV31 L1 단백질의 발현을 확인하였다.

10㎍ 전체 효모 단백질 추출물을 SDS-PAGE 로딩 완충액과 배합시키고, 10분간 95℃로 가열하였다. 단백질을 8% SDS-PAGE겔상에 로딩하고, Tris-Glycine 완충액에서 전기영동하였다. 단백질 분리 후에, 단백질은 겔로부터 니트로셀룰로오즈로 웨스턴 이동되고, 블롯은 16시간동안 10% 탈지분유(non-fat dry milk)/TTBS(Tris buffered saline + Tween-20)에서 블락킹되었다. 그 다음 블롯을 TTBS로 3회 세척하였다. HPV31 L1와 교차 반응할 수 있는 폴리클로날 혈청인 염소 항-trpE-HPV 16 L1(Goat anti-trpE-HPV 16 Ll serum)를 실온에서 1시간동안 TTBS로 1: 1000 희석하였다. 블롯은 TTBS로 3회 세척하고, 항-염소-HRP 콘쥬게이트 항체는 1시간동안 TTBS로 1:2500 희석시킨다. 블롯을 3회 세척하고, ECLTM 감지 시약을 제공한다(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). 자가방사사진촬영을 실행하였다. 항혈청에 의해 인지되는 단백질을 감지 시약으로 볼 수 있는데, 사진상에서 검은 밴드로 나타낸다.

모든 경우에, HPV 31 L1 단백질은 사진상에 약 55kD에 상응하는 뚜렷한 밴드로 감지된다(데이타 없음). HPV 16 L1 단백질은 겔상에 포지티브 대조군으로 포함된다.

실시예 7

방사선면역분석(Radioimmunoassay(RIA))

HPV31 L1를 발현시키는 효모 세포는 튜브 배양물의 회전, 플라스크 교반, 발효기를 포함한 다양한 방법으로 생장시킨다. 효모를 용해시켜, 단백질 추출물을 만들어, 총 단백질 ㎎당 생산되는 HPV31 L1 VLP의 양을 결정하였다. HPV 31 L1 VLP 발현을 설명하기 위해, 캡쳐 방사능면역검사(RIA)를 통하여 총 효모 단백질 추출물 일부를 분석하였다.

감지 모노클로날 항체인 H31.A6를 이용하여 RIA를 실행하였는데, 이 항체는 HPV 타입 31-특이적이고, VLP 형태-특이적이다. H31.A6은 HPV 타입 31 L1에 특이적인데, 고유 HPV 31 LI VLP에는 결합하나 변성된 HPV31 VLP는 인지하지 않은 것으로 나타났다. 이 모노클로날 항체(mAb)는 ¹²⁵I로 방사능라벨된 염소 항-쥐 항체를 이용하여 감지할 수도 있다. 따라서, cpm은 HPV31 L1 VLP 발현의 상대적 수준에 상응한다.

PBS에 1:1000으로 희석된 염소 항-trpE-HPV31 L1 폴리클로날 혈청으로 하룻밤동안 폴리스티렌 비드를 피복시켰다. 그 다음 비드를 5배 용적의 멸균 증류수로 세척하고, 대기(air) 건조시켰다. 분리된 효모 콜로니에서 얻은 전체 효모 단백질 추출물을 항원으로 PBS+ 1% BSA, 0.1% Tween-20, 0.1% Na Azide와 희석시켜 비드상에 적하시키고, 1시간 동안 회전 배양시켰다. 세척 후에, 비드를 20-웰 폴리스티렌 플레이트 상에 웰당 하나씩 분포시키고, 1:50,000으로 희석된 H31.A6와 실온에서 17-24시간동안 배양시켰다. 비드를 씻고, ¹²⁵I로 라벨된 염소 항-쥐 IgG를 10㎕당 23000-27000cpm 활성 범위에서 첨가하였다. 2시간 후에, 비드를 씻고, 방사능활성 카운트를 기록하였다(cpm/㎖). RIA에서 배경 값을 빼기 위해 전체 cpm/㎖ 값에서 블랙 웰의 배경 카운트를 뺀다.

두 가지 실험을 실시하였다: 실험 1에서 31 L1 야생형의 단백질 추출물과 31 L1 부분 재구성체의 단백질 추출물을 비교하였고, 실험 2에서는 31 L1 부분 재구성체와 31 L1 전체 재구성체를 비교하였다(도 5 참고). 결과를 보면, 31 L1 부분 재구성체 VLP 발현이 31 L1 야생형과 비교하였을 때 6.9배 증가되었다는 것을 알 수 있다. 31 L1 전체 재구성체는 31 L1 부분 재구성체와 비교하였을 때, 1.7배 증가되었다. 따라서, 31 L1 발현은 효모 선호 코돈 서열을 도입하고, 잠정적 전사 종결 시그날을 제거하면 7배 이상 증가되었다.

실시예 8

투과 전자 현미경

HPV31 L1 단백질이 실제 자체 어셈블리되어 오량체 L1 캡소머를 형성하고, 다시 바이러스 유사 입자로 자체 어셈블리되는 지를 설명하기 위해, 부분적으로 정제된 31 L1 전체 재구성 단백질 추출물을 투과 전자 현미경(TEM)으로 관찰하였다. 효모를 소규모로 발효시켜, 펠렛화시켰다. 펠렛을 정제 처리하였다. 펠렛과 정제된 효모 추출물을 면역블롯으로 분석하여 L1 단백질 발현 및 정제과정을 통한 유지상태를 설명하였다. 정제된 효모 추출물을 45%-슈크로즈 쿠션상에서 원심분리시키고, 생성된 펠렛을 완충액에 현탁시켜 TEM 분석하였다(도 6 참조). 결과에 따르면, 가공안된 샘플에서 구형 입자의 직경 범위는 30 내지 60nm이고, 일부 입자는 규칙적인 캡소머 배열을 가진다는 것을 알 수 있었다.

<110> Merck & Co., Inc. <120> OPTIMIZED EXPRESSION OF HPV 31 L1 IN YEAST <130> 21188-PCT <150> US 60/457,172 <151> 2003-03-24 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1515 <212> DNA <213> HPV31 L1 wild-type <400> 1 atgtctctgt ggcggcctag cgaggctact gtctacttac cacctgtccc agtgtctaaa 60 gttgtaagca cggatgaata tgtaacacga accaacatat attatcacgc aggcagtgct 120 aggctgctta cagtaggcca tccatattat tccataccta aatctgacaa tcctaaaaaa 180 atagttgtac caaaggtgtc aggattacaa tatagggtat ttagggttcg tttaccagat 240 ccaaacaaat ttggatttcc tgatacatct ttttataatc ctgaaactca acgcttagtt 300 tgggcctgtg ttggtttaga ggtaggtcgc gggcagccat taggtgtagg tattagtggt 360 catccattat taaataaatt tgatgacact gaaaactcta atagatatgc cggtggtcct 420 ggcactgata atagggaatg tatatcaatg gattataaac aaacacaact gtgtttactt 480 ggttgcaaac cacctattgg agagcattgg ggtaaaggta gtccttgtag taacaatgct 540 attacccctg gtgattgtcc tccattagaa ttaaaaaatt cagttataca agatggggat 600 atggttgata caggctttgg agctatggat tttactgctt tacaagacac taaaagtaat 660 gttcctttgg acatttgtaa ttctatttgt aaatatccag attatcttaa aatggttgct 720 gagccatatg gcgatacatt atttttttat ttacgtaggg aacaaatgtt tgtaaggcat 780 ttttttaata gatcaggcac ggttggtgaa tcggtcccta ctgacttata tattaaaggc 840 tccggttcaa cagctacttt agctaacagt acatactttc ctacacctag cggctccatg 900 gttacttcag atgcacaaat ttttaataaa ccatattgga tgcaacgtgc tcagggacac 960 aataatggta tttgttgggg caatcagtta tttgttactg tggtagatac cacacgtagt 1020 accaatatgt ctgtttgtgc tgcaattgca aacagtgata ctacatttaa aagtagtaat 1080 tttaaagagt atttaagaca tggtgaggaa tttgatttac aatttatatt tcagttatgc 1140 aaaataacat tatctgcaga cataatgaca tatattcaca gtatgaatcc tgctattttg 1200 gaagattgga attttggatt gaccacacct ccctcaggtt ctttggagga tacctatagg 1260 tttgtaacct cacaggccat tacatgtcaa aaaagtgccc cccaaaagcc caaggaagat 1320 ccatttaaag attatgtatt ttgggaggtt aatttaaaag aaaagttttc tgcagattta 1380 gatcagtttc cactgggtcg caaattttta ttacaggcag gatatagggc acgtcctaaa 1440 tttaaagcag gtaaacgtag tgcaccctca gcatctacca ctacaccagc aaaacgtaaa 1500 aaaactaaaa agtaa 1515 <210> 2 <211> 1515 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 31 partial rebuild <400> 2 atgtctctgt ggcggcctag cgaggctact gtctacttac cacctgtccc agtgtctaaa 60 gttgtaagca cggatgaata tgtaacacga accaacatat attatcacgc aggcagtgct 120 aggctgctta cagtaggcca tccatattat tccataccta aatctgacaa tcctaaaaaa 180 atagttgtac caaaggtgtc aggattacaa tatagggtat ttagggttcg tttaccagat 240 ccaaacaaat ttggatttcc tgatacatct ttttataatc ctgaaactca acgcttagtt 300 tgggcctgtg ttggtttaga ggtaggtcgc gggcagccat taggtgtagg tattagtggt 360 catccattat taaataaatt tgatgacact gaaaactcta atagatatgc cggtggtcct 420 ggcactgata atagggaatg tatatcaatg gattataaac aaacacaact gtgtttactt 480 ggttgcaaac cacctattgg agagcattgg ggtaaaggta gtccttgtag taacaatgct 540 attacccctg gtgattgtcc tccattagaa ttaaaaaatt cagttataca agatggggat 600 atggttgata caggctttgg agctatggat tttactgctt tacaagacac taaaagtaat 660 gttcctttgg acatttgtaa ttctatttgt aaatatccag attatcttaa aatggttgct 720 gagccatacg gcgacacctt gttcttctat ttgcgtagag aacagatgtt cgtaaggcac 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Ser Ala Arg Leu Leu Thr Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Tyr Ser Ile Pro Lys Ser Asp Asn Pro Lys Lys Ile Val Val Pro 50 55 60 Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Arg Leu Pro Asp 65 70 75 80 Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Glu Thr 85 90 95 Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln 100 105 110 Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Phe Asp 115 120 125 Asp Thr Glu Asn Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Gly Pro Gly Thr Asp Asn 130 135 140 Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Leu 145 150 155 160 Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys 165 170 175 Ser Asn Asn Ala Ile Thr Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys 180 185 190 Asn Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala 195 200 205 Met Asp Phe Thr Ala Leu Gln Asp Thr Lys Ser Asn Val Pro Leu Asp 210 215 220 Ile Cys Asn Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Val Ala 225 230 235 240 Glu Pro Tyr Gly Asp Thr Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met 245 250 255 Phe Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ser Gly Thr Val Gly Glu Ser Val 260 265 270 Pro Thr Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Ala 275 280 285 Asn Ser Thr Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp 290 295 300 Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Met Gln Arg Ala Gln Gly His 305 310 315 320 Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp 325 330 335 Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Val Cys Ala Ala Ile Ala Asn Ser 340 345 350 Asp Thr Thr Phe Lys Ser Ser Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly 355 360 365 Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu 370 375 380 Ser Ala Asp Ile Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Pro Ala Ile Leu 385 390 395 400 Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Thr Thr Pro Pro Ser Gly Ser Leu Glu 405 410 415 Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Ser 420 425 430 Ala Pro Gln Lys Pro Lys Glu Asp Pro Phe Lys Asp Tyr Val Phe Trp 435 440 445 Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro 450 455 460 Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Tyr Arg Ala Arg Pro Lys 465 470 475 480 Phe Lys Ala Gly Lys Arg Ser Ala Pro Ser Ala Ser Thr Thr Thr Pro 485 490 495 Ala Lys Arg Lys Lys Thr Lys Lys 500 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 5 cgtcgacgta aacgtgtatc atattttttt acag 34 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 6 cagacacatg tattacatac acaac 25 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 7 ctcagatctc acaaaacaaa atgtctctgt ggcggcctag c 41 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 8 gacagatctt actttttagt ttttttacgt tttgctgg 38

Claims

서열번호 4에서 제시된 HPV31 L1 단백질을 암호화하고, 효모에서 다량 발현될 수 있도록 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
제1항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제3항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제3항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베르마이세스 프라질리스(Kluyvermyces fragilis), 클루이베르마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
제4항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 숙주 세포.
제1항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제6항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제7항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제9항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제10항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
HPV31의 재조합 L1 단백질 또는 재조합 L1 + L2 단백질로 이루어진 바이러스 유사 입자(VLP).
제12항에 있어서, 재조합 L1 단백질 또는 재조합 L1 + L2 단백질이 효모에서 만들어지는 바이러스 유사 입자(VLP).
제13항에 있어서, 재조합 L1 단백질 또는 재조합 L1 + L2 단백질이 코돈-최적화된 HPV31 L1 핵산 분자에 의해 암호화되어 있는 바이러스 유사 입자(VLP).
제14항에 있어서, 코돈 최적화된 핵산 분자가 필수적으로 서열번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 바이러스 유사 입자(VLP).
(a) HPV31 L1 단백질 또는 HPV31 L1+L2 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 DNA 분자로 효모를 형질전환시키는 단계;

(b) 코돈 최적화된 DNA 분자를 발현시켜 재조합 파필로마 바이러스 단백질이 제조될 수 있도록 하는 조건하에 형질전환된 효모를 배양하는 단계;

(c) 재조합 파필로마바이러스 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 제14항에 따른 VLP를 제조하는 방법.
제14항에 따른 VLP를 포함하는 백신.
제14항에 따른 VLP를 포함하는 약제학적 조성물.
동물에 제17항에 따른 백신을 투여함을 포함하는 HPV의 감염을 예방하는 방법.
동물에 제14항에 따른 VLP를 투여함을 포함하는 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법.
제14항에 있어서, 효모가 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베르마이세스 프라질리스(Kluyvermyces fragilis), 클루이베르마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 바이러스 유사 입자.
제21항에 있어서, 효모가 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 바이러스 유사 입자.
제17항에 있어서, 하나 이상의 추가의 HPV 타입의 VLP를 추가로 포함하는 백신.
제23항에 있어서, 하나 이상의 추가 HPV 타입이 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 백신.
제24항에 있어서, 하나 이상의 HPV 타입이 HPV 16을 포함하는 백신.
제25항에 있어서 HPV18 VLP을 추가로 포함하는 백신.
제26항에 있어서, HPV6 VLP 및 HPV11 VLP를 추가로 포함하는 백신.
HPV31 L1 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 효모가 인지하는 전사 종결 시그날이 없는 핵산 분자.
제28항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제29항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제30항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베르마이세스 프라질리스(Kluyvermyces fragilis), 클루이베르마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포.
제31항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 숙주 세포.
제13항에 있어서, 재조합 L1 단백질 또는 재조합 L1 + L2 단백질이 효모가 인지하는 전사 종결 시그날이 없는 HPV31 L1 핵산 분자에 의해 암호화된 바이러스 유사 입자(VLP).
(a) HPV31 L1 단백질 또는 HPV31 L1+L2 단백질을 암호화하고 효모가 인지하는 전사 종결 서열이 없는 DNA 분자로 효모를 형질전환시키는 단계;

(b) DNA 분자를 발현시켜 재조합 파필로마바이러스 단백질이 제조될 수 있도록 하는 조건하에 형질전환된 효모를 배양하는 단계; 및

(c) 재조합 파필로마바이러스 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 제33항에 따른 VLP를 제조하는 방법.
제33항에 따른 VLP를 포함하는 백신.
제33항에 따른 VLP를 포함하는 약제학적 조성물.
포유동물에 제35항에 따른 백신을 투여함을 포함하는 HPV의 감염을 예방하는 방법.
동물에 제33항에 따른 VLP을 투여함을 포함하는 동물에서 면역 반응을 유도하는 방법.
제35항에 있어서, 하나 이상의 추가의 HPV 타입의 VLP를 추가로 포함하는 백신.
제39항에 있어서, 하나 이상의 추가의 HPV 타입이 HPV6, HPV11, HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 및 HPV68로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 백신.
제40항에 있어서, 하나 이상의 HPV 타입이 HPV 16을 포함하는 백신.
제41항에 있어서, HPV18 VLP를 추가로 포함하는 백신.
제42항에 있어서, HPV6 VLP 및 HPV11 VLP를 추가로 포함하는 백신.