MXPA05010285A - Expresion optimizada de hpv 31 l1 en levadura. - Google Patents

Abstract

Se proveen moleculas de ADN sinteticas que codifican la proteina de HPV31 L1; especificamente, la presente invencion provee polinucleotidos que codifican la proteina de HPV31 L1, en donde dichos polinucleotidos estan libres de senales de terminacion de la transcripcion internas que son reconocidas por levadura; tambien se proveen polinucleotidos sinteticos que codifican HPV31 L1 en donde los polinucleotidos han sido optimizados por codones para obtener altos niveles de expresion en una celula de levadura; las moleculas sinteticas pueden ser utilizadas para producir particulas del tipo virus HPV31 (VLPs), y para producir vacunas y composiciones farmaceuticas que comprenden las VLPs de HPV31; las vacunas de la presente invencion proveen inmunoprofilaxis efectiva contra la infeccion por papilomavirus a traves de anticuerpo neutralizante e inmunidad mediada por celulas.

Description

EXPRESION OPTIMIZADA DE HPV 31 L1 EN LEVADURA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere generalmente a la terapia del virus del papiloma humano (HPV), Más específicamente, la presente invención se refiere a polinucleótidos sintéticos que codifican a la proteína HPV31 L1 , y a vectores recombinantes y huéspedes que comprenden dichos polinucleótidos. Esta invención también se refiere a partículas del tipo virus HPV31 (VLPs) y a su utilización en vacunas y composiciones farmacéuticas para evitar y tratar el HPV.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Hay más de 80 tipos del virus del papiloma humano (HPV), muchos de los cuales han sido asociados con una amplia variedad de fenotipos biológicos, desde verrugas proliferativas benignas hasta carcinomas malignos (para una revisión, véase McMurray y otros, Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001)). HPV6 y HPV11 son los tipos más comúnmente asociados con verrugas benignas, condiloma acuminado no maligno y/o displasia de grado bajo de la mucosa genital o respiratoria. HPV16 y HPV18 son los tipos de alto riesgo más frecuentemente asociados con carcinomas in situ e invasivos del cuello, vagina, vulva y canal anal. Más del 90% de los carcinomas de cuello uterino están asociados con infecciones de HPV16, HPV18 o los tipos oncogénicos menos prevalentes HPV31 , 33, 45, 52 y 58 (Schiffman y col, J Nati. Cáncer Inst. 85(12): 958-64 (1993)). La observación de que el ADN del HPV es detectado en 90-100% de los cánceres de cuello uterino provee fuerte evidencia epidemiológica de que los HPVs causan carcinoma de cuello uterino (véase Bosch y col., J. Clin. Pathol. 55: 244- 265 (2002)). Los virus del papiloma son pequeños virus de ADN (50-60 nm), no envueltos, icosahédricos que codifican hasta ocho genes tempranos y dos tardíos. Los marcos de lectura abierta (ORFs) de los genomas virales son designados E1 a E7, y L1 y L2, donde ?" denota temprano (por el término en inglés "early") y "L" denota tardío (por el término en inglés "late"). L1 y L2 codifican proteínas cápside del virus, mientras que los genes E están asociados con funciones tales como replicación viral y transformación celular. La proteína L1 es la proteína de cápside principal y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La proteína L2 es una proteína de cápside menor. Los datos inmunológicos sugieren que la mayoría de la proteína L2 es interna a la proteína L1. Ambas proteínas L1 y L2 son altamente conservadas entre diferentes papilomavirus. La expresión de la proteína L1 o una combinación de las proteínas L1 y L2 en levadura, células de insecto, células de mamífero o bacterias conduce al autoensamble de partículas del tipo virus (VLPs) (para una revisión, véase Schiller y Roden, en Virus del Papiloma Reviews: Current Research on Virus del Papilomaes; Lacey, ed. Leeds, Reino Unido: Leeds Medical Information, págs. 101-12 (1996)). Las VLPs son morfológicamente similares a los viriones auténticos y son capaces de inducir altos títulos de anticuerpos neutralizantes luego de la administración en un animal o un humano. Debido a que las VLPs no contienen el genoma viral potencialmente oncogénico, presentan una alternativa segura al uso de virus vivos en el desarrollo de vacunas para el HPV (para una revisión, véase Schiller y Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)). Por este motivo, los genes L1 y L2 han sido identificados como objetivos inmunológicos para el desarrollo de vacunas profilácticas y terapéuticas para la infección y enfermedad de HPV. El desarrollo de vacunas para el HPV y su comercialización han sido obstaculizados por dificultades asociadas con la obtención de altos niveles de expresión de proteínas cápside en organismos huéspedes exitosamente transformados, limitando la producción de proteína purificada. Por lo tanto, a pesar de la identificación de secuencias de nucleótidos del tipo salvaje que codifican proteínas de HPV L1 tales como proteínas de HPV31 L1 (Goldsborogh y col, Virology 171 (1): 306-311 (1989), sería altamente conveniente desarrollar una fuente fácilmente renovable de proteínas de HPV crudas que utiliza secuencias de nucleótidos que codifican HPV31 L1 que son optimizadas para la expresión en la células huésped pretendida. Adicionalmente, sería de utilidad producir grandes cantidades de VLPs de HPV31 L1 que tengan las propiedades que confieren inmunidad de las proteínas naturales para utilización en el desarrollo de vacunas.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a composiciones y métodos para activar o aumentar la inmunidad a los productos proteicos expresados por genes HPV31 L1 , los cuales han sido asociados con el cáncer de cuello uterino. Específicamente, la presente invención provee polinucleótidos que codifican a la proteína HPV31 L1, en donde dichos polinucleótidos están libres de señales de terminación de transcripción interna que son reconocidas por levadura. También se proveen polinucleótidos sintéticos que codifican HPV31 L1 donde los polinucleótidos han sido optimizados por codones para la expresión en niveles altos en una célula de levadura. La presente invención provee además partículas del tipo virus (VLPs) HPV31 y describe el uso de VLPs en composiciones inmunogénicas y vacunas para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad de HPV o el cáncer asociado al HPV. La presente invención se refiere a moléculas de ADN sintéticas que codifican a la proteína HPV31 L1. En un aspecto de la invención, la secuencia de nucleótidos de la molécula sintética es alterada para eliminar las señales de terminación de la transcripción que son reconocidas por levadura. En otro aspecto, los codones de las moléculas sintéticas están diseñados a fin de utilizar los codones preferidos por una célula de levadura. Las moléculas sintéticas pueden ser utilizadas como una fuente de proteína HPV31 L1 , la cual puede autoensamblarse en VLPs. Dichas VLPs pueden ser utilizadas en una vacuna a base de VLP.

Una modalidad en particular de la presente invención comprende una molécula de ácido nucleico sintética la cual codifica a la proteína HPV31 L1 según lo expuesto en SEC ID NO: 4, dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos según lo expuesto en SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. Según lo antes señalado, se provee en la presente memoria descriptiva polinucleotidos sintéticos que codifican el gen HPV31 L1 los cuales están libres de señales de terminación de la transcripción que son reconocidas por levadura. Esta invención también provee polinucleotidos sintéticos que codifican HPV31 L1 según lo descrito, los cuales son adicionalmente alterados de modo de contener codones que son preferidos por células de levadura. También se proveen vectores recombinantes y células huéspedes recombinantes, tanto procarióticas como eucarióticas, las cuales contienen las moléculas de ácido nucleico descritas a lo largo de esta memoria descriptiva. La presente invención se refiere a un proceso para expresar una proteína HPV31 L1 en una célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína HPV31 L1 en una célula huésped de levadura; donde la molécula de ácido nucleico está libre de señales de terminación de la transcripción internas que son reconocidas por levadura, y; (b) cultivar la célula huésped de levadura bajo condiciones las cuales permiten la expresión de dicha proteína HPV31 L1. La presente invención se refiere además a un proceso para expresar una proteína HPV31 L1 en una célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína HPV31 L1 en una célula huésped de levadura; donde la molécula de ácido nucleico es optimizada por codones para la óptima expresión en la célula huésped de levadura y; (b) cultivar la célula huésped de levadura bajo, condiciones las cuales permiten la expresión de dicha proteína HPV31 L1. En modalidades preferidas, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos según lo expuesto en SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. Esta invención también se refiere a partículas del tipo virus HPV31 (VLPs), métodos para producir VLPs de HPV31 , y métodos para utilizar VLPs de HPV31. En una modalidad preferida de la invención, las VLPs de HPV31 son producidas en levadura. En una modalidad adicionalmente preferida, la levadura se selecciona entre el grupo que consiste en: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastorís, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis, y Schizosaccharomyces pombe. Otro aspecto de esta invención es una VLP de HPV31 , la cual comprende una proteína HPV31 L1 producida por un gen HPV31 L1 el cual está libre de señales de terminación de la transcripción que son reconocidas por levadura. Aun otro aspecto de esta invención es una VLP de HPV31 , la cual comprende una proteína HPV31 L1 producida por un gen HPV31 L1 optimizado por codones. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, el gen HPV31 L1 optimizado por codones consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos según lo expuesto en SEC ID NO:2 o SEC ID NO: 3. Esta invención también provee un método para inducir una respuesta inmune en un animal que comprende administrar partículas del tipo virus HPV31 al animal. En una modalidad preferida, las VLPs del tipo HPV31 son producidas por un gen optimizado por codones. En una modalidad preferida adicional, las VLPs del tipo HPV31 son producidas mediante un gen que está libre de secuencias de terminación de la transcripción que son reconocidas por levadura. Aun otro aspecto de esta invención es un método para evitar o tratar cáncer de cuello uterino asociado a HPV que comprende administrar a un mamífero una vacuna que comprende VLPs del tipo HPV31. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, las VLPs del tipo HPV31 son producidas en levadura. Esta invención también se refiere a una vacuna que comprende partículas del tipo virus HPV31 (VLPs).

En una modalidad alternativa de este aspecto de la invención, la vacuna comprende además VLPs de por lo menos un tipo de HPV adicional. En una modalidad preferida, el por lo menos un tipo de HPV adicional se selecciona entre el grupo que consiste en: HPV6, HPV1 1 , HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51 , HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 y HPV68. Esta invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden partículas del tipo virus HPV31. Adicionalmente, esta invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden VLPs del tipo HPV31 y VLPs de por lo menos un tipo de HPV adicional. En una modalidad preferida, el por lo menos un tipo de HPV adicional se selecciona entre el grupo que consiste en: HPV6, HPV1 1 , HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51 , HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 y HPV68. Como se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique lo contrario en forma clara. Como se utiliza a lo largo de la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las siguientes definiciones y abreviaturas son aplicables: El término "promotor" se refiere a un sitio de reconocimiento en una hebra de ADN al cual se une la polimerasa de ARN. El promotor forma un complejo de iniciación con polimerasa de ARN para iniciar e impulsar la actividad transcripcional. El complejo puede ser modificado activando secuencias denominadas "intensificadoras" o "secuencias activadores corriente arriba" o secuencias inhibidoras denominadas "silenciadoras". El término "vector" se refiere a algún medio por el cual los fragmentos de ADN pueden ser introducidos en un organismo huésped o tejido huésped. Existen diversos tipos de vectores incluyendo plásmido, virus (incluyendo adenovirus), bacteriófagos y cósmidos. La designación "secuencia del tipo salvaje 31 L1" se refiere a la secuencia HPV31 L1 descrita en la presente memoria descriptiva como SEC ID NO: 1. Si bien la secuencia del tipo salvaje HPV31 L1 ha sido descrita previamente, no es extraño encontrar variaciones de secuencias menores entre los ADNs obtenidos de aislados clínicos. Por consiguiente, se aisló una secuencia del tipo salvaje HPV31 L1 representativa de muestras clínicas previamente mostradas que contienen ADN de HPV 31 (ver el Ejemplo 1 ). Se utilizó la secuencia del tipo salvaje 31 L1 como una secuencia de referencia para comparar las secuencias de HPV 31 L1 optimizadas por codones descritas en la presente memoria descriptiva (véase la figura 1 ). La designación "reconstrucción parcial de 31 L1" se refiere a una construcción, descrita en la presente memoria descriptiva (SEC ID NO: 2), en donde la secuencia de nucleótidos HPV31 L1 fue reconstruida parcialmente para contener codones preferidos de levadura para la expresión óptima en levadura. La reconstrucción parcial de 31 L1 comprende alteraciones en la porción media de la secuencia de nucleotidos del tipo salvaje de HPV 31 L1 (nucleotidos 697- 1249). La secuencia de HPV 31 L1 completa también fue reconstruida con codones preferidos de levadura, la cual se denomina en la presente memoria descriptiva la "reconstrucción total de 31 L1" (SEC ID NO: 3). El término "cantidad efectiva" significa una composición de vacuna suficiente se introduce para producir los niveles adecuados del polipéptido, de modo que se obtiene una respuesta inmune. Un experto en la técnica reconoce que este nivel puede variar. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere al reemplazo de un residuo aminoácido por otro, residuo aminoácido, químicamente similar. Ejemplos de ese tipo de sustituciones conservativas son: sustitución de un residuo hidrófobo (isoleucina, leucina, valina o metionina) por otro; sustitución de un residuo polar por otro residuo polar de la misma carga (por ejemplo, arginina por lisina; ácido glutámico por ácido aspártico). El término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo un ser humano. "VLP" o "VLPs" significa partícula del tipo virus o partículas del tipo virus. "Sintético" significa que el gen HPV31 L1 ha sido modificado de modo que contiene una secuencia de nucleotidos que no es la misma que la secuencia de nucleotidos presente en el gen HPV31 L1 del tipo salvaje natural. Como se señaló anteriormente, las moléculas sintéticas son provistas en la presente memoria descriptiva que comprenden una secuencia de nucleótidos que son alterados para eliminar señales de terminación de la transcripción reconocidas por levadura. También se proveen en la presente memoria descriptiva moléculas sintéticas que comprenden codones que son preferidos para la expresión por células de levadura. Las moléculas sintéticas provistas en la presente memoria descriptiva codifican las mismas secuencias de aminoácidos que el gen HPV31 L1 del tipo salvaje.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 D son una alineación de secuencia que muestra nucleótidos que fueron alterados en los genes 31 L1 de reconstrucción parcial (SEC ID NO: 2) y total (SEC ID NO: 3) (Ver ejemplo 2). La secuencia de referencia es la secuencia del tipo salvaje 31 L1 (SEC ID NO: 1 ; ver ejemplo 1 ). Los nucleótidos en las secuencias de reconstrucción parcial o total de 31 L1 que son idénticas a la secuencia de referencia son indicados con puntos. Los nucleótidos alterados son indicados en su ubicación correspondiente. El número de nucleótidos es contenido dentro de los paréntesis. Las figuras 2A-2C muestran las secuencias de nucleótidos (SEC ID NO: 3) y de aminoácidos (SEC ID NO: 4) de reconstrucción total de 31 L1. El número de nucleótidos está indicado a la izquierda. La figura 3 muestra un Northern blot sondeado específicamente para HPV 31 L1 bajo alta severidad (ver el ejemplo 4). Las flechas a la izquierda indican la posición de las transcripciones de longitud completa de HPV 31 L1 y truncadas. Las sendas rotuladas "31 ts" son de la misma preparación de ARN de levadura que contiene secuencias del tipo salvaje de 31 L1. La senda rotulada "16" contiene ARN de HPV16, que no es reconocido por la sonda de HPV 31 L1 debido a las condiciones de alta severidad. La senda rotulada "Neg" es un extracto de levadura que no contiene secuencias codificadoras de L1. Las sendas rotuladas "31 R" son de ARN de dos colonias aisladas separadas que expresan la secuencia de reconstrucción parcial de 31 L1. La figura 4 muestra una muestra representativa de las VLPs de 31 L1 descritas en la presente memoria descriptiva, según lo visualizado por microscopía de electrones de transmisión (ver el ejemplo 8). La barra representa 100 nm.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La mayoría de los carcinomas de cuello uterino están asociados con infecciones de tipos oncogénicos específicos del virus del Papiloma humano (HPV). La presente invención se refiere a composiciones y métodos para activar o aumentar la inmunidad a los productos proteicos expresados por genes de tipos de HPV oncogénicos. Específicamente, la presente invención provee polinucleótidos que codifican HPV 31 L1 y partículas del tipo virus (VLPs) de HPV31 y describe el uso de dichos polinucleótidos y VLPs en composiciones inmunogénicas y vacunas para la prevención y/o tratamiento del cáncer asociado con el HPV. La secuencia de nucleótidos HPV 31 L1 del tipo salvaje ha sido informada (Goldsborough y col., Virology 171(1): 306-311 (1989); Número de acceso al Genbank J04353). La presente invención provee moléculas de ADN sintéticas que codifican a la proteína HPV 31 L1. Las moléculas sintéticas de la presente invención comprenden una secuencia de nucleótidos, en la cual algunos de los nucleótidos han sido alterados de modo de eliminar las señales de terminación de la transcripción que son reconocidas por levadura. En modalidades alternativas, los codones de las moléculas sintéticas están diseñados de modo de utilizar los codones preferidos por una célula de levadura para la expresión en altos niveles. Las moléculas sintéticas pueden ser utilizadas como una fuente de proteína HPV 31 L1 , la cual puede autoensamblarse en VLPs. Dichas VLPs pueden ser utilizadas en una vacuna a base de VLP para proveer inmunoprofilaxis efectiva contra la infección por papilomavirus a través del anticuerpo neutralizante e inmunidad mediada por células. Ese tipo de vacunas a base de VLPs son también útiles para el tratamiento de infecciones de HPV ya establecidas. La expresión de VLPs de HPV en células de levadura ofrece las ventajas de ser efectiva en cuanto al costo y fácilmente adaptadas al crecimiento en gran escala en fermentadores. Sin embargo, muchas proteínas de HPV L1 , incluyendo HPV 31 L1 (ver ejemplo 4), son expresadas en niveles bajos en células de levadura. Se ha determinado de conformidad con la presente invención que los niveles bajos de expresión de HPV 31 L1 se deben a la truncamiento de la transcripción de ARNm que es el resultado de la presencia de señales de terminación de la transcripción que son reconocidas por levadura. Alterando el ADN de HPV 31 L1 para eliminar cualquier secuencia potencial que se asemeje a los sitios de terminación de la transcripción en levadura, es posible facilitar la transcripción de ARNm de longitud completa dando como resultado una expresión de la proteína HPV 31 L1 incrementada. Por consiguiente, en algunas modalidades de esta invención, se han hecho alteraciones al ADN de HPV 31 L1 para eliminar cualquier secuencia potencial que se asemeje a las señales de terminación de la transcripción en levadura. Estas alteraciones permiten la expresión de la transcripción de HPV31 de longitud completa, en oposición a una transcripción truncada (ver el ejemplo 4), mejorando el rendimiento de la expresión. Como se señaló anteriormente, los ADNs sintéticos de la presente invención comprenden alteraciones de la secuencia HPV31 L1 del tipo salvaje que se realizaron para eliminar sitios de terminación de la transcripción reconocidos en levadura. Un experto en la técnica reconocerá que pueden construirse moléculas de ADN adicionales que codifican a la proteína HPV31 L1 , aunque no contienen sitios de terminación de la transcripción de levadura. Las técnicas para encontrar secuencias de terminación de la transcripción de levadura son bien conocidas en la técnica.

La terminación de la transcripción y la formación del extremo 3' de ARNms en levadura requiere la presencia de tres señales: ( ) un elemento de eficiencia tal como TATATA o secuencias relacionadas, el cual aumenta la eficiencia de elementos de posicionamiento ubicados corriente abajo; (2) elemento(s) de posicionamiento, los cuales determinan la ubicación del sitio poli (A) y (3) el sitio de poliadenilación (generalmente Py(A)n). La bibliografía científica está repleta de descripciones de secuencias que codifican señales de terminación de la transcripción de levadura. Ver, por ejemplo, Guo y Sherman, Trends Biochem. Sci. 21 : 477-481 (1986); Guo y Sherman, Mol. Cell. Biol. 16 (6): 2772- 2776 (1996); Zaret y col, Cell 28:563- 573 (1982); Henikoff y col, Cell 33: 607-614 (1983); Thalenfeld y col, J. Biol. Chem. 258 (23): 14065- 14068 (1983); Zaret y col, J. Mol. Biol. 176: 107-135 (1984); Heidmann y col, Mol. Cell Biol 14: 4633- 4642 (1984); y Russo, Yeast 11:447-453 (1985). Por lo tanto, un experto en la técnica no tendría ninguna dificultad para determinar cuales son las secuencias que hay que evitar a fin de construir un gen HPV 31 L1 sintético que produce una transcripción de ARNm de longitud completa de conformidad con la presente invención. Adicionalmente, los ensayos y procedimientos para evaluar si una secuencia de terminación de la transcripción de levadura está presente dentro de la secuencia sintética son bien establecidos en la técnica, de modo que un experto podría determinar si una secuencia de HPV31 L1 construida comprende secuencias de terminación que deben ser eliminadas.

Según lo descrito anteriormente, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica proteína 31 L1 del tipo HPV, estando la molécula de ácido nucleico libre de señales de terminación de la transcripción internas las cuales son reconocidas por levadura. En modalidades ejemplares de la invención, las moléculas de ácido nucleico sintéticas comprenden una secuencia de nucleótidos según lo expuesto en SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. En modalidades alternativas de la presente invención, las secuencias genéticas de HPV31 L1 son "optimizadas" para la expresión en altos niveles en un ambiente celular de levadura. Los genes HPV31 L1 optimizados por codones contemplados por la presente invención incluyen moléculas sintéticas que codifican HPV31 L1 que están libres de señales de terminación de la transcripción internas las cuales son reconocidas por levadura, que comprenden adicionalmente por lo menos un codón que es codón- optimizado para la expresión en altos niveles en células de levadura. Un codón "triplete" de cuatro bases de nucleótidos posibles puede existir en más de 60 formas variantes. Debido a que estos codones proveen el mensaje para solamente 20 aminoácidos diferentes (como así también iniciación y terminación de la transcripción), algunos aminoácidos pueden ser codificados por más de un codón, un fenómeno conocido como redundancia de codones. Por razones no completamente comprendidas, los codones alternativos no están uniformemente presentes en el ADN endógeno de diferentes tipos de células. De hecho, parece existir una jerarquía natural variable o "preferencia" por ciertos codones en ciertos tipos de células. Como un ejemplo, el aminoácido leucina es especificado por cualquiera de seis codones de ADN incluyendo CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, y TTG. El análisis exhaustivo de las frecuencias de codones de genoma para microorganismos ha revelado ADN endógeno de E. coli más comúnmente contiene el codón de especificación de CTG leucina, mientras que el ADN de levaduras y mohos de légamo más comúnmente incluye un codón especificador de leucina TTA. En vista de esta jerarquía, se cree generalmente que la probabilidad de obtener altos niveles de expresión de un polipéptido rico en leucina por un huésped de E. coli dependerá hasta cierto punto de la frecuencia de uso de codones. Por ejemplo, es probable que un gen rico en codones TTA sea pobremente expresado en E. coli, mientras que un gen rico en CTG probablemente será altamente expresado en este huésped. Similarmente, un codón preferido para la expresión de un polipéptido rico en leucina en células huéspedes de levadura seria TTA. Las implicaciones de los fenómenos de preferencia de codones en técnicas de ADN recombinante son evidentes, y el fenómeno puede servir para explicar muchas fallas anteriores de lograr altos niveles de expresión de genes exógenos en organismos huéspedes exitosamente transformados, un codón menos "preferido" puede estar presente repetidamente en el gen insertado y la maquinaria de células huésped para la expresión puede no operar tan eficientemente. Este fenómeno sugiere que genes sintéticos los cuales han sido diseñados para incluir un huésped proyectado, los codones preferidos de las células proveen una forma óptima de material genético extraño para llevar a la práctica las técnicas de ADN recombinante. Por lo tanto, un aspecto de esta invención es un gen HPV31 L1 que es optimizado por codones para la expresión en una célula de levadura. En una modalidad preferida de esta invención, se ha descubierto que el uso de codones alternativos que codifican a la misma secuencia proteica puede eliminar las restricciones sobre la expresión de proteínas de HPV31 L1 por células de levadura. De acuerdo con esta invención, los segmentos de genes HPV31 L1 fueron convertidos en secuencias que tienen secuencias traducidas idénticas aunque con uso de codones alternativo según lo descrito por Sharp and Cowe (Synonymous Codon Usage en Saccharomyces cerevísiae. Yeast 7: 657- 678 (1991 )), la cual se incorpora a la presente como referencia. La metodología generalmente consiste en identificar codones en la secuencia del tipo salvaje que no están comúnmente asociadas con genes de levadura altamente expresados y reemplazándolos con codones óptimos para alta expresión en células de levadura. Luego, la nueva secuencia genética es inspeccionada para determinar secuencias no deseadas generadas por estos reemplazos de codones (por ejemplo, secuencias "ATTTA", creación involuntaria de sitios de reconocimiento de empalme de intrones, sitios de enzima de restricción no deseados, etc.). Las secuencias no deseables son eliminadas por sustitución de los codones existentes con diferentes codones que codifican al mismo aminoácido. Los segmentos de genes sintéticos son luego analizados para determinar la expresión mejorada. Los métodos antes descritos se utilizaron para crear segmentos de genes sintéticos para HPV31 L1 , dando como resultado un gen que comprende codones optimizados para ia expresión de niveles elevados. Si bien el procedimiento antes mencionado provee un resumen de nuestra metodología para diseñar genes optimizados por codones para utilizar en vacunas para HPV, el experto en la técnica entiende que pueden lograrse eficacia de vacuna similar o expresión incrementada de genes por variaciones menores en el procedimiento o por variaciones menores en la secuencia. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polinucleótido sintético que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HPV 31 L1 , o un fragmento biológicamente activo o forma mutante de una proteína HPV31 L1 , la secuencia de polinucleótidos que comprende codones optimizados para la expresión en un huésped de levadura. Dichas formas mutantes de la proteína HPV31 L1 incluyen, aunque sin limitarse a: sustituciones de aminoácidos conservativas, truncamientos de terminal amino, truncamientos de terminal carboxi, deleciones o adiciones. Cualquier fragmento y/o mutante biológicamente activo de ese tipo codificará una proteína o fragmento proteico el cual por lo menos imita sustancialmente las propiedades inmunológicas de la proteína HPV31 L1 según lo expuesto en SEC ID NO: 4. Los polinucleótidos sintéticos de la presente invención codifican moléculas de ARNm que expresan una proteína HPV31 L1 funcional de modo que sea útil en el desarrollo de una vacuna de HPV terapéutica o profiláctica. Un aspecto de esta invención es una molécula de ácido nucleico optimizada por codones la cual codifica la proteína HPV31 L1 según lo expuesto en SEC ID NO: 4, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos según lo expuesto en SEC ID NO: 2. Otro aspecto de esta invención es una molécula de ácido nucleico optimizada por codones la cual codifica la proteína HPV31 L1 según lo expuesto en SEC ID NO: 4, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos según lo expuesto en SEC ID NO: 3. La presente invención también se refiere a vectores recombinantes y células huéspedes recombinantes, tanto procarióticas como eucarióticas, los cuales contienen las moléculas de ácido nucleico descrito a lo largo de esta memoria descriptiva. El ADN de HPV31 sintético o sus fragmentos construidos a través de los métodos descritos en la presente invención pueden ser expresados recombinantemente por clonación molecular en un vector de expresión que contiene un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción apropiados, y transferidos en células huéspedes procarióticas o eucarióticas para producir HPV31 L1 recombinante. Las técnicas para ese tipo de manipulaciones son descritas en la técnica (Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., Green Pub. Associates y Wiley-Interscience, Nueva York (1988); Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Rose y col., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, (1990), dichos documentos son incorporados como referencia en su totalidad). Por consiguiente, la presente invención se refiere además a un proceso para expresar una proteína HPV31 L1 en una célula huésped recombinante, que comprende (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de HPV31 L1 en una célula huésped de levadura; en donde la molécula de ácido nucleico es optimizada por codones para la óptima expresión en la célula huésped de levadura y; (b) cultivar la célula huésped de levadura bajo condiciones las cuales permiten la expresión de dicha proteína HPV31 L1. La presente invención también se refiere a un proceso para expresar una proteína HPV31 L1 en una célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína HPV 31 L1 en una célula huésped de levadura; en donde la molécula de ácido nucleico está libre de señales de terminación de la transcripción internas las cuales son reconocidas por levadura y; (b) cultivar la célula huésped de levadura bajo condiciones las cuales permiten la expresión de dicha proteína HPV31 L1. Esta invención se refiere además a un proceso para expresar una proteína HPV31 L1 en una célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico según lo expuesto en SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3 en una célula huésped de levadura; y, (b) cultivar la célula huésped bajo condiciones las cuales permiten la expresión de dicha proteína HPV 31 L1. Los genes sintéticos de la presente invención pueden ser ensamblados en un cásete de expresión que comprende secuencias diseñadas para proveer la eficiente expresión de la proteína HPV58 L1 en la célula huésped. El cásete contiene preferentemente el gen sintético, con secuencias de control de la traducción y transcripcionales relacionadas ligadas operativamente al mismo, tal como un promotor, y secuencias de terminación. En una modalidad preferida, el promotor es el promotor de S. cerevisiae GAL1 , si bien los expertos en la técnica reconocerán que puede utilizarse cualquiera de una cantidad de otros promotores de levadura conocidos tales como los promotores GAL10, GAL7, ADH1, TDH3 o PGK u otros promotores genéticos eucarióticos. Un terminador transcripcional preferido es el terminador ADH1 de S. cerevisiae, si bien también pueden utilizarse otros terminadores transcripcionales conocidos. La combinación de promotor GAL1 - terminador ADH1 es particularmente preferida. Otro aspecto de esta invención es una partícula del tipo virus HPV31 (VLP), métodos para producir VLPs de HPV31 , y métodos para utilizar VLPs de HPV31. Las VLPs pueden autoensamblarse cuando L1 , la proteína de cápside principal del virus del Papiloma humano y animal, es expresado en levadura, células de insecto, células mamíferas o bacterias (para una revisión, ver Schiller y Roden, en Virus del Papiloma Reviews: Current Research on Virus del Papilomaes; Lacey, ed. Leeds, Reino Unido: Leeds Medical Information, págs. 101-12 (1996)). Las VLPs de HPV morfológicamente indistintas también pueden ser producidas expresando una combinación de las proteínas cápside L1 y L2. Las VLPs están compuestas por 72 pentámeros de L1 en una estructura icosahédrica T=7 (Baker y col., Biophys. J. 60(6): 1445-56 (1991)). Las VLPs son morfológicamente similares a los viriones auténticos y son capaces de inducir altos títulos de anticuerpos neutralizantes luego de la administración en un animal. La inmunización de conejos (Breitburd y col., J. Viral. 69(6): 3959-63 (1995)) y perros (Suzich y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92(25): 11553-57 (1995)) con VLPs se mostró que inducía anticuerpos neutralizantes y protegía contra la infección por papilomavirus experimental. Sin embargo, puesto a que las VLPs no contienen el genoma viral potencialmente oncogénico y puede autoensamblarse a partir de un gen único, presentan una alternativa segura al uso de virus vivos en el desarrollo de vacunas para HPV (para una revisión, véase Schiller y Hidesheim, J. Clin. Viral. 19: 67-74 (2000)). Por consiguiente, la presente invención se refiere a partículas del tipo virus compuestas por proteína L1 recombinante o proteínas L1 + L2 recombinantes de HPV31. En una modalidad preferida de la invención, las VLPs de HPV31 son producidas en levadura. En una modalidad preferida adicional, la levadura se selecciona entre el grupo que consiste en: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastorís, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis y Schizosaccharomyces pombe. Otro aspecto de esta invención es una VLP de HPV31 , la cual comprende una proteína de HPV 31 L1 producida por un gen HPV 31 L1 que está libre de señales de terminación de la transcripción internas que son reconocidas por levadura. Aun otro aspecto de esta invención es una VLP de HPV31 la cual comprende una proteína de HPV 31 L1 producida por un gen HPV 31 L1 optimizado por codones. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, el gen HPV 31 L1 optimizado por codones consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos según lo expuesto en SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. Aun otro aspecto de esta invención es un método para producir VLPs de HPV31 , que comprende: (a) transformar levadura con una molécula de ADN recombinante que codifica una proteína HPV31 L1 o proteínas de HPV31 L1 + L2; (b) cultivar la levadura transformada bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de ADN recombinante para producir la proteína de HPV31 recombinante; y (c) aislar la proteína de HPV31 recombinante para producir VLPs de HPV31. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, la levadura es transformada con un gen HPV31 L1 que está libre de señales de terminación de la transcripción que son reconocidas por levadura. En otra modalidad preferida, la levadura es transformada con un gen HPV31 L1 optimizado por codones para producir VLPs de HPV31. En una modalidad particularmente preferida, el gen HPV31 L1 optimizado por codones consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos según lo expuesto en SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3. Esta invención también provee un método para inducir una respuesta inmune en un animal que comprende administrar partículas del tipo virus HPV31 al animal. En una modalidad preferida, las VLPs de HPV31 son producidas por un gen que está libre de secuencias de terminación de la transcripción internas que son reconocidas por levadura. En una modalidad preferida adicional, las VLPs de HPV31 son producidas por un gen optimizado por codones. Aun otro aspecto de esta invención es un método para evitar o tratar el cáncer de cuello uterino asociado con HPV que comprende administrar a un mamífero una vacuna que comprende VLPs de HPV31. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, las VLPs de HPV31 son producidas en levadura. Esta invención también se refiere a una vacuna que comprende partículas del tipo virus HPV31 (VLPs). En una modalidad alternativa de este aspecto de la invención, la vacuna comprende además VLPs de por lo menos un tipo de HPV adicional.

En una modalidad preferida, el por lo menos un tipo de HPV adicional se selecciona entre el grupo que consiste en HPV6, HPV11 , HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51 , HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 y HPV68. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, la vacuna comprende además VLPs de HPV16. En otra modalidad preferida de la invención, la vacuna comprende además VLPs de HPV16 y VLPs de HPV18. En aun otra modalidad preferida de la invención, la vacuna comprende además VLPs de HPV6, VLPs de HPV11, VLPs de HPV16 y VLPs de HPV18. Esta invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden partículas del tipo virus HPV 31. Adicionalmente, esta invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden VLPs del tipo HPV31 y VLPs de por lo menos un tipo de HPV adicional. En una modalidad preferida, el por lo menos un tipo de HPV adicional se selecciona entre el grupo que consiste en: HPV6, HPV1 1 , HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51 , HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59 y HPV68. Las composiciones de vacunas de la presente invención pueden utilizarse solas en dosificaciones apropiadas definidas por análisis de rutina a fin de obtener una inhibición óptima de la infección por HPV31 reduciendo al mínimo cualquier toxicidad potencial. Adicionalmente, la co-administración o la administración secuencial de otros agentes pueden ser convenientes.

La cantidad de partículas del tipo virus a ser introducidas en un receptor de vacuna dependerá de la inmunogenicidad del producto genético expresado. En general, se administra una dosis ¡nmunológica o profilácticamente efectiva de aproximadamente 10 ug a 100 ug, y preferentemente aproximadamente 20 ug a 60 ug de VLPs en forma directa en el tejido muscular. La inyección subcutánea, introducción intradérmica, impresión a través de la piel y otros modos de administración tales como administración intraperitoneal, intravenosa o por inhalación son también contemplados. También se contempla que pueden proveerse vacunas de refuerzo. La administración parenteral, tal como la intravenosa, intramuscular, subcutánea u otros medios de administración con adyuvantes tales como alumbre o adyuvante de alumbre de Merck, concurrentemente con o posterior a la introducción parenteral de la vacuna de esta invención es también ventajosa. Todas las publicaciones mencionadas en la presente memoria descriptiva son incorporadas como referencia con el fin de describir y revelar las metodologías y los materiales que podrían utilizarse en conexión con la presente invención. Nada de lo aquí expuesto debe ser interpretado como un reconocimiento de que la invención no tiene derecho a preceder a tal descripción en virtud de la invención anterior. Habiendo descrito las modalidades preferidas de la invención con referencia a los dibujos acompañantes, debe entenderse que la invención no está limitada a aquellas modalidades precisas, y que pueden efectuarse diversos cambios y modificaciones en la misma por un experto en la técnica sin apartarse del alcance o espíritu de la invención según lo definido en las reivindicaciones anexadas. Los siguientes ejemplos ilustran, aunque no limitan la invención.

EJEMPLO 1 Determinación de una secuencia de HPV 31 L1 representativa La secuencia del tipo salvaje de HPV 31 L1 ha sido descrita previamente (Goldsborough y col., Virology 171 (1): 306-311 (1989); Número de acceso al Genbank J04353). Sin embargo, no es extraño encontrar variaciones de secuencias menores entre los ADNs obtenidos de aislados clínicos. Para aislar una secuencia del tipo salvaje de HPV 31 L1 representativa, se aisló el ADN de tres muestras clínicas que mostraron previamente contener el ADN de HPV 31. Las secuencias de HPV 31 L1 fueron amplificadas en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando polimerasa de ADN Taq y los siguientes cebadores: HPV 31 L1 F 5' - CGT CGA CGT AAA CGT GTA TCA TAT TTT TTT ACA G - 3' (SEC ID NO: 5) y HPV 31 L1 B 5* - CAG ACA CAT GTA TTA CAT ACA CAA C - 3' (SEC ID NO: 6). Los productos amplificados fueron sometidos a electroforesis sobre geles de agarosa y visualizados por tinción con bromuro de etidio. Las bandas de L1 de ~ 1500 pb fueron separadas y el ADN purificado utilizando el kit de purificación por CRP QIA quick (Qiagen, Hilden, Alemania). Luego, el ADN se ligó al vector de clonación TA, pCR-ll (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), transformado por E. coli, y plaqueado sobre agar LB con ampicilina más IPTG y X-gal para selección de colonias azules/ blancas. Las placas fueron invertidas e incubadas durante 16 horas a 37°C. Las colonias blancas se cultivaron en medio LB con ampicilina, agitando a 37°C durante 16 horas, y se llevaron a cabo minipreps para extraer el ADN plásmido. Para demostrar la presencia del gen L1 en el plásmido, se llevaron a cabo digestiones con endonucleasa de restricción y se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Se llevó a cabo el secuenciado de ADN sobre plásmidos que contienen L1 clonado de cada uno de los tres aislados clínicos. El ADN y las secuencias de aminoácidos traducidas se compararon entre sí y las secuencias de HPV 31 L1 del Genbank. El análisis de las secuencias de los tres aislados clínicos reveló que ninguna secuencia era idéntica a la secuencia del Genbank. El clon pCR-ll-HPV 31 L1/81 se escogió como la secuencia 31 L1 representativa y se denomina en la presente memoria descriptiva la "secuencia del tipo salvaje 31 L1 " (SEC ID NO: 1 , véase la figura 1). La secuencia escogida como del tipo salvaje 31 L1 contenía una sustitución silenciosa en el nucleótido 1266 y un cambio de un C a un G en el nucleótido 1295, alterando el aminoácido codificado de treonina a serina. Los genes reconstruidos parcial y total 31 L1 (SEC ID NOs: 2 y 3, respectivamente) también codificaban una serina en esta ubicación (véase la figura 1 ). En todos los casos, las secuencias de aminoácidos son idénticas. Los nucleótidos se cambiaron en las construcciones reconstruidas para codificar aminoácidos utilizando las secuencias de codones preferidas por levadura y para eliminar las señales de terminación de la transcripción potenciales (véase el ejemplo 2). La secuencia del tipo salvaje 31 L1 se amplificó utilizando los cebadores LS-101 5' - CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT CTC TGT GGC GGC CTA GC - 3' (SEC ID NO: 7) y LS-102 5" - GAC AGA TCT TAC TTT TTA GTT TTT TTA CGT TTT GCT GG - 3' (SEC ID NO: 8) para agregar extensiones BglW. Se llevó a cabo la PCR utilizando la polimerasa de ADN Vent™. Se visualizó el producto de la PCR mediante tinción con bromuro de etidio de un gel de agarosa. Se separó la banda de ~ 1500 pb y se purificó el ADN utilizando el kit de extracción en gel QIAEX II (Qiagen). Luego, el producto de la PCR se digirió con BglW a 37°C durante 2 horas y se purificó utilizando el kit de purificación por PCR QIA quick. El producto de PCR 31 L1 digerido con BglW se ligó a pGAL1 0 digerido con BamHI y se transformaron DH5 E. coli. Se cribaron las colonias por PCR para la inserción HPV 31 L1 en la orientación correcta. Se confirmaron la secuencia y orientación por secuenciado de ADN. El clon seleccionado se denominó pGAL110-HPV 31 L1 #2. Luego, el ADN de Maxiprep se preparó y Saccharomyces cerevisi'ae se hicieron competentes y se transformaron. La transformación de levadura se plaqueó en placas de Leu" sorbitol agar-superior sobre Leu" sorbitol y se incubó invertido durante 3-5 días a 30°C. Las colonias se recogieron y vetearon para determinar el aislamiento en placas de Leu" sorbitol. Para inducir la transcripción de L1 y la expresión proteica, las colonias aisladas fueron posteriormente cultivadas en 5 mi de 5 X Leu" Ade" sorbitol con 1.6% glucosa y 4% galactosa en cultivos en tubos rotativos a 30°C.

EJEMPLO 2 Optimización por codones de levadura Los codones preferidos por levadura han sido descritos (Sharp y Cowe, Yeast 7: 657- 678 (1991 )). Inicialmente, la porción del medio de HPV 31 L1, la cual representa a los nucleótidos 697- 1249, se reconstruyó utilizando codones preferidos por levadura. La estrategia empleada para reconstruir fue diseñar oligómeros sentido y antisentido superpuestos largos que cubren la región a ser reconstruida, sustituyendo a los nucleótidos con secuencias de codones preferidos por levadura manteniendo al mismo tiempo la misma secuencia de aminoácidos. Estos oligómeros se utilizaron en lugar del ADN templado en la reacción de PCR. Se diseñaron los cebadores de amplificación adicionales y se utilizaron para amplificar las secuencias reconstruidas de oligómeros templados con polimerasa de ADN Pfu (Stratagene, La Jolla, CA). Las condiciones óptimas para amplificación fueron específicas de la sección; sin embargo, la mayoría empleaba un programa que se asemejaba al siguiente: un paso de desnaturalización inicial de 94°C durante 1 minuto, seguido por 15-25 ciclos de 95°C durante 30 seg de desnaturalización, 55°C durante 30 seg. recocido, 72°C durante 3.5 minutos de extensión, seguido por una extensión final de 10 minutos a 72°C y 4°C detenerse. Se examinaron los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Las bandas del tamaño apropiado se separaron y el ADN se purificó en gel. Luego, los fragmentos amplificados se utilizaron como templado para ensamblar el fragmento L1 del medio de HPV 31 reconstruido con 552 nucleótidos. Luego, se utilizó PCR para amplificar los nucleótidos del tipo salvaje 1-725 (extremo 5') y 1221-1515 (extremo 3'). Se llevó a cabo PCR final utilizando el extremo 5', el extremo 3' y el medio reconstruido para generar la reconstrucción parcial 31 L1 de longitud completa, denominado en la presente memoria descriptiva como la "reconstrucción parcial 31 L1". La secuencia 31 L1 completa también se reconstruyó con codones preferidos por levadura. Esta construcción se denomina en la presente memoria descriptiva la "reconstrucción total de 31 L1". Nueve oligómeros superpuestos largos fueron utilizados para generar secuencias nucleótidas de codones preferidos por levadura de 1-753 y cuatro oligómeros superpuestos largos se utilizaron para generar secuencias de nucleótidos de codones preferidos por levadura de 1207-1515. Después de amplificación y purificación en gel, estos fragmentos, junto con la sección reconstruida del medio antes descrita (nucleótidos 697- 1249), se utilizaron en forma conjunta en una reacción de PCR para generar la secuencia de reconstrucción total de 31 L1 de longitud completa. Esta pieza se generó con extensiones BamHI. El ADN de 31 L1 purificado en gel se digirió con BamHI, se ligó al vector de expresión pGAL110 digerido con BamHI y se transformó en células DH5 de E. coli. Las colonias se cribaron por PCR para la inserción HPV 31 L1 en la orientación correcta. Se confirmaron la secuencia y orientación por secuenciado de ADN.

CÜADRO 1 RESUMEN! DE SECUENCIAS HPV 31 CONSTRUCCION: Ll NUCLEOTIDOS AMINOACIDOS I0E- TÍDAD' DE MUQ.EOT'00 IDEMTIDAO OE MIINWCIDO COMENTARIOS ! HPV 31 LA 5 5 50 , TIPO SILVESTRE HPV 31 Ll 1515 92% 100% 121 CAMBIOS. €Kf RE nt 697-1249 HPV' 31 L1 1515 504» 75% 10ÜJS 376 CAMBIOS EN TRE . R£DOSiíSrRIJeCI DH Ti TAL nt 1-1515 El cuadro 1 sintetiza los cambios entre las tres construcciones de secuencias de HPV 31 L1 , los cuales se enlistan a la izquierda. La cuarta columna indica el porcentaje de identidad de nucleótidos entre la construcción indicada y la secuencia del tipo salvaje de 31 L1 y la quinta columna indica la identidad de aminoácidos. La última columna indica el número de nucleótidos que fueron alterados a secuencias de codones preferidas de levadura y la región donde se hicieron las alteraciones.

Se preparó el ADN plásmido. Las células de S. cerevisiae se hicieron competentes y se transformaron. La levadura se colocó en placas de Leu" sorbitol agar-superior sobre Leu" sorbitol y se incubó invertido durante 3-5 días. Las colonias fueron veteadas para aislamiento en placas de Leu-sorbitol. Las colonias aisladas fueron posteriormente cultivadas en 5 mi de 5 X Leu- Ade- sorbitol con 1 ,6% glucosa y 4% galactosa en cultivos en tubos rotativos a 30°C para inducir la transcripción de L1 y la expresión proteica. Después de 48-72 horas, se peletizó un volumen de cultivo equivalente a una DO600 = 10, se eliminó el sobrenadante y los pellets se congelaron y almacenaron a -70°C.

EJEMPLO 3 Preparación de ARN Los pellets celulares de levadura transformada, los cuales fueron inducidos para expresar HPV 31 L1 por inducción con galactosa, se congelaron en hielo y se suspendieron en 1 mi de agua fría tratada con DEPC. Las células fueron peletizadas mediante centrifugación y el sobrenadante resultante fue eliminado. Luego, el pellet celular fue resuspendido en 400 ul TES (Tris 10 mM, pH 7.0, EDTA 10 mM y SDS 0.5%). Se agregó un volumen igual de buffer AE- fenol saturado (NaOAc 50 mM y EDTA 10 mM). El tubo se sometió a vórtice durante 10 segundos y se calentó hasta 65°C durante 50 minutos con mezclado cada 10 minutos. Luego, el tubo se colocó en hielo durante 5 minutos, seguido por centrifugación a 4°C durante 5 minutos. El sobrenadante se recogió y se transfirió a un tubo estéril. Se agregaron 400 ul adicionales de fenol, el tubo se sometió a vórtice, se colocó sobre hielo durante 5 minutos y se centrifugó. El sobrenadante se transfirió a un tubo estéril y se agregaron 400 ul de cloroformo, se mezclaron y centrifugaron. El sobrenadante se recogió nuevamente y se transfirió a un tubo estéril y se agregaron 40 ul de Acetato de Na 3 M pH 5,2 además de 1 mi de EtOH al 100%. El tubo se colocó sobre hielo seco durante 1 hora, después de lo cual se centrifugó a alta velocidad para peletizar el ARN. El ARN se lavó una vez con EtOH al 70% y se secó al aire. Luego, se suspendió el ARN en 100 ul de agua tratada con DEPC y se calentó hasta 65°C durante 5 minutos para disolver. Se llevó a cabo la espectrometría para determinar la concentración de ARN en la muestra utilizando la presunción de que una lectura A260 de 1 = 40 ug/ml de ARN cuando A260/280 es 1.7-2.0.

EJEMPLO 4 Análisis de Northern blot El análisis inicial de levadura que expresa tipo salvaje 31 L1 sugirió que el rendimiento de expresión de la proteína de HPV 31 L1 era considerablemente inferior al esperado. Para determinar si la baja expresión se debía a un problema en el nivel de transcripción contra el nivel de traducción, se llevó a cabo el análisis Northern blot de la transcripción HPV 31 L1. Se realizaron los Northern blots de geles en donde el ARN de levadura que expresa HPV 16 L1 se probó con ARN de levadura que expresa HPV31 L1 en el mismo gel para comparar los tamaños de las transcripciones. Se probó con un gel de formaldehído de agarosa 1 ,2%. 10 microgramos de ARN se combinaron con buffer desnaturalizante (concentraciones finales: 6% formaldehído, 45% formamida y 0,9 x MOPS) y se calentó hasta 55°C durante 15 minutos. Se agregó un volumen de un décimo de buffer de carga de gel y la muestra se cargó sobre el gel. Se llevó a cabo la electroforesis a 65 voltios en buffer de 1 x MOPS durante ~ 5 horas. El gel se lavó durante 15 minutos en agua estéril seguido por dos lavados de cinco minutos en 10 x SSC. El ARN se transfirió a una membrana de Hybond-N + nilón (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) por acción capilar durante 16 horas en 10 x SSC. Luego el ARN se fijó a la membrana de nilón por entrecruzamiento utilizando el entrecruzador Amersham fijado para 700 unidades de energía. Después del fijado, la membrana de nilón se dejó secar al aire. La membrana se colocó en 30 mi de buffer Zetaprobe a 55°C durante 2 horas después de lo cual se agregaron sondas rotuladas con 32P y se incubaron durante 16 horas a 53-65 °C. Luego, la membrana se lavó 3 veces en 5 X SSC a temperatura ambiente durante 20 minutos, seguido por 2 veces en 0.4 x SSC durante 20 minutos a temperatura ambiente y una vez a 60°C durante 10 minutos. Se generó el ADN de la sonda por PCR utilizando cebadores sentido y antisentido específicos de secuencia de HPV 31 L1. El ADN amplificado se rotuló mediante tratamiento con quinasa de polinucleótido (PNK) y Y-32P ATP a 37°C durante 1 hora. Se envolvió el blot en envoltura de sarán y se expuso a película de rayos x durante 16 horas. Luego del revelado de la película, el ARN hlbridado por sonda se detectó como una banda negra en el autoradiógrafo. El análisis del Northern blot antes descrito reveló que la mayoría de las transcripciones del tipo salvaje de HPV 31 L1 de longitud completa eran considerablemente más pequeñas que longitud completa (ver la figura 3). Sin embargo, la reconstrucción parcial 31 L1 se diseñó no solo para insertar codones preferidos por levadura en el medio del gen, sino además para eliminar cualquier potencial secuencia que se asemeje a ios sitios de terminación de la transcripción de levadura. El análisis de Northern blot mostró claramente que luego de la reconstrucción, la longitud de la transcripción del gen 31 L1 había aumentado considerablemente hasta un tamaño correspondiente a aquel de la transcripción HPV 16 L1 de longitud completa (no mostrado). Por consiguiente, la terminación de la transcripción prematura probablemente es responsable de una porción significativa del rendimiento de baja expresión de la construcción del tipo salvaje de 31 L1.

EJEMPLO 5 Expresión de proteína de HPV 31 L1 Los pellets de células de levadura congelados de cultivos inducidos por galactosa equivalentes a DO600 = 10 se descongelaron en hielo y se suspendieron en 300 ul de buffer PC (Na2HP04 100 mM y NaCI 0.5 M, pH 7.0) con PMSF 2 mM. Se agregaron perlas de vidrio 0.5 mm lavadas con ácido, ~ 0.5 g /tubo. Los tubos fueron sometidos a vórtice durante 15 minutos a 4°C. Se agregaron 7.5 ul de 20% Tritón X100 y se repitió el vórtice durante 5 minutos a 4°C. Los tubos se colocaron en hielo durante 15 minutos, luego se centrifugaron durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante se transfirió a un tubo de microcentrifugación estéril y se almacenó a -70°C.

EJEMPLO 6 Análisis de Western blot Se analizaron extracto de proteína de levadura total de veinte a cuarenta colonias de levadura aisladas para cada construcción de HPV 31 L1 por Western blot para confirmar la expresión de la proteína de HPV 31 L1 después de inducción con galactosa.

Diez microgramos de extracto de proteína de levadura total se combinaron con buffer de carga de SDS-PAGE y se calentaron hasta 95°C durante 10 minutos. Las proteínas se cargaron sobre un gel de SDS-PAGE 8% y se sometieron a electroforesis en buffer de Tris-Glicina. Después de la separación proteica, las proteínas se transfirieron por Western del gel a nitrocelulosa y el blot se bloqueó en leche deshidratada sin contenido de grasa 10% en TTBS (solución salina con tampón Tris con Tween-20) durante 16 horas. El blot se lavó tres veces en TTBS. Suero anti-trpE-HPV 16 L1 de cabra, un suero policlonal que reacciona en forma cruzada con HPV 31 L1, se aplicó a una dilución 1 :1000 en TTBS durante 1 hora a temperatura ambiente. El blot se lavó tres veces en TTBS y se aplicó anticuerpo conjugado anti-cabra-HRP a una dilución 1 :2500 en TTBS durante 1 hora. El blot se lavó nuevamente tres veces y se aplicó reactivo de detección ECL™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Luego se llevó a cabo la autoradiografía. Se visualizaron las proteínas reconocidas por el antisuero mediante el reactivo de detección como bandas oscuras en el autoradiógrafo. En todos los casos, la proteína de HPV 31 L1 se detectó como una banda distinta en el autoradiógrafo correspondiente a aproximadamente 55 kD (datos no mostrados). Se incluyó la proteína de HPV 16 L1 como un control positivo en los geles.

EJEMPLO 7 Radioinmunoensayo (RIA) Las células de levadura que expresan HPV 31 L1 se cultivaron por una variedad de métodos, incluyendo cultivos en tubos rotativos, frascos de agitación y fermentadores. La levadura se lisó y los extractos proteicos se prepararon para determinar la cantidad de partículas del tipo virus (VLPs) de HPV 31 L1 producidas por miligramo de proteína total. Para demostrar la expresión de VLPs de HPV 31 L1 , una porción de cada extracto proteico de levadura total se analizó por radioinmunoensayo de captura (RIA). Se llevó a cabo el RIA utilizando un anticuerpo monoclonal de detección, H31.A6, que es específico de HPV tipo 31 y específico conformacional de VLP. H31.A6 es específico para HPV tipo 31 L1 ya que se descubrió que une VLPs de HPV 31 L1 intactas y no reconoce VLPs de HPV 31 desnaturalizadas. Este mAb puede ser subsiguientemente detectado por un anticuerpo anti-ratón de cabra radiorotulado con 1125. Por consiguiente, los calores de conteos por minuto (cpm) corresponden a los niveles relativos de expresión de VLP de HPV 31 L1. Las perlas de poliestireno se recubrieron con un suero policlonal anti-trpE-HPV31 L1 de cabra diluido 1 :1000 en PBS durante la noche. Luego, las perlas se lavaron con 5 volúmenes de agua destilada estéril y se secaron al aire. El antígeno, extracto de proteínas de levadura total de colonias de levadura aisladas, se cargó luego sobre las perlas mediante dilución en PBS CUADRO 2 El cuadro 2 muestra una porción de la información de dos experimentos de radioinmunoensayo (RIA) de captura en conteos por minuto (cpm)/mg de proteína total (ver el ejemplo 7). Los cpm obtenidos en el RIA son un indicador relativo de VLPs de HPV 31 L1. Los datos del RIA demuestran expresión de VLP de 31 L1 incrementada en extractos proteicos de levadura de secuencias genéticas de reconstrucción por codones preferidas de levadura. con 1% BSA, 0.1% Tween-20 y 0.1% Azida de Na y se incubó con rotación durante 1 hora. Después del lavado, las perlas se distribuyeron una por pocilio en una placa de poliestireno de 20 pocilios y se incubaron con H31.A6 mAb diluido 1 :50.000 durante 17-24 horas a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron y se agregó IgG anti-ratón de cabra rotulado con 1125 a un rango de actividad de 23000-27000 cpm por cada 10 ul. Después de 2 horas, las perlas se lavaron y se registraron los conteos radioactivos en cpm/ml. Los conteos de fondo de pocilios de blanco se restaron de los cpm/ml totales, proporcionando el valor RIA menos fondo. Se llevaron a cabo dos experimentos: en el experimento 1 , los extractos proteicos de 31 L1 tipo salvaje y reconstrucción parcial de 31 L1 se compararon y en el experimento 2, los extractos proteicos de la reconstrucción parcial de 31 L1 y la reconstrucción total de 31 L1 fueron comparados (véase el cuadro 2). Los resultados indican que la expresión de VLPs de reconstrucción parcial de 31 L1 es 6,9 veces mayor que el tipo salvaje de 31 L1. La reconstrucción total de 31 L1 tiene una expresión 1.7 veces aumentada con respecto a la reconstrucción parcial de 31 L1. Por lo tanto, los niveles de expresión de 31 L1 fueron aumentados > 7 veces introduciendo secuencias de codones preferidos por levadura y eliminando potenciales señales de terminación de la transcripción.

EJEMPLO 8 Microscopía de electrones por transmisión Para demostrar que la proteína de HPV 31 L1 era de hecho de auto-ensamblaje para formar capsómeros pentamér¡cos-L1 , los cuales a su vez se auto-ensamblan en partículas del tipo virus, un extracto proteico de reconstrucción total de 31 L1 parcialmente purificado se sometió a microscopía de electrones por transmisión (TEM, "transmission electrón microscopy"). Se cultivaron levaduras bajo fermentación a pequeña escala y se peletizaron. Los pellets se sometieron a tratamientos de purificación. El pellet y los extractos de levadura clarificados se analizaron por ¡nmunoblot para demostrar la expresión de la proteína L1 y retención a través del procedimiento de purificación. Luego, los extractos de levadura clarificados se sometieron a centrifugación sobre un colchón de 45% sacarosa y el pellet resultante se suspendió en buffer para análisis de TEM (véase la figura 4). Los resultados indicaron que el diámetro de las partículas esféricas en esta muestra cruda osciló entre 30 y 60 nm con algunas partículas exhibiendo un grupo regular de capsómeros.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de HPV31 L1 según lo expuesto en SEC ID NO:4, estando la secuencia de ácidos nucleicos optimizada por codones para altos niveles de expresión en una célula de levadura. 2.- Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1. 3. - Una célula huésped que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 3. 4. - La célula huésped de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragllis, Kluyveromyces lactis, y Schizosaccharomyces pombe. 5. - La célula huésped de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae. 6. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos según lo expuesto en SEC ID NO: 2. 7. - Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6. 8. - Una célula huésped que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 7. 9. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos según lo expuesto en SEC ID NO: 3. 10. - Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9. 11. - Una célula huésped que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 10. 12. - Partículas tipo virus (VLPs) compuestas por proteína L1 recombinante o proteínas L1 + L2 recombinantes de HPV31. 13. - Las VLPs de conformidad con la reivindicación 12, caracterizadas además porque la proteína L1 recombinante o las proteínas L1 + L2 recombinantes son producidas en levadura. 14. - Las VLPs de conformidad con la reivindicación 13, caracterizadas además porque la proteína L1 recombinante o las proteínas L1 + L2 recombinantes son codificadas por una molécula de ácido nucleico HPV31 L1 optimizada por codones. 15.- Las VLPs de conformidad con la reivindicación 14, caracterizadas además porque la molécula de ácido nucleico optimizada por codones consiste esencialmente en una secuencia de nucieótidos según lo expuesto en SEC ID NO:2 o SEC ID NO:3. 16.- Un método para producir las VLPs de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende: (a) transformar levadura con una molécula de ADN optimizada por codones que codifica la proteína de HPV31 L1 o las proteínas de HPV31 L1 + L2; (b) cultivar la levadura transformada bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de ADN optimizada por codones para producir una proteína del papilomavirus recombinante; y (c) aislar la proteína del papilomavirus recombinante para producir las VLPs de acuerdo con la reivindicación 14. 17.- Una vacuna que comprende las VLPs de acuerdo con la reivindicación 14. 8.- Composiciones farmacéuticas que comprenden las VLPs de acuerdo con la reivindicación 14. 19 - El uso de las VLPs de la reivindicación 14, para preparar una vacuna para evitar la infección por HPV en un mamífero. 20 - El uso de las VLPs de la reivindicación 14, para preparar un medicamento para inducir una respuesta inmune en un animal. 21.- Las partículas del tipo virus de conformidad con la reivindicación 14, caracterizadas además porque la levadura se selecciona entre el grupo que consiste en Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluyveromyces lactis, y Schizosaccharomyces pombe. 22. - Las partículas del tipo virus de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizadas además porque la levadura es Saccharomyces cerevisiae. 23. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque comprende adicionalmente VLPs de por lo menos un tipo de HPV adicional. 24 - La vacuna de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada además porque el por lo menos un tipo de HPV adicional se selecciona entre el grupo que consiste en: HPV6, HPV , HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51 , HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, y HPV68. 25. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque el por lo menos un tipo de HPV comprende HPV16. 26. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque comprende adicionalmente VLPs de HPV18. 27. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque comprende adicionalmente VLPs de HPV6 y VLPs de HPV11. 28. - Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de HPV31 L1 , la molécula de ácido nucleico está libre de señales de terminación de la transcripción que son reconocidas por levadura. 29.- Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 28. 30.- Una célula huésped que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 29. 31. - La célula huésped de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada además porque la célula huésped se selecciona entre el grupo que consiste en: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastorís, Kluyvermyces fragilis, Kluyveromyces lactis, y Schizosaccharomyces pombe. 32. - La célula huésped de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae. 33.- Las VLPs de conformidad con la reivindicación 13, caracterizadas además porque la proteína L1 recombinante o las proteínas L1 + L2 recombinantes son codificadas por una molécula de ácido nucleico de HPV31 L1 que está libre de señales de terminación de la transcripción que son reconocidas por levadura. 34.- Un método para producir las VLPs de acuerdo con la Reivindicación 33 que comprende: (a) transformar levadura con una molécula de ADN que codifica la proteína de HPV31 L1 o las proteínas de HPV31 L1 + L2, la molécula de ADN está libre de secuencias de terminación de la transcripción que son reconocidas por levadura; (b) cultivar la levadura transformada bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula de ADN para producir una proteína del papilomavirus recombinante; y (c) aislar la proteína del papilomavirus recombinante para producir las VLPs de acuerdo con la reivindicación 33. 35. - Una vacuna que comprende las VLPs de acuerdo con la reivindicación 33. 36. - Las composiciones farmacéuticas que comprenden las VLPs de acuerdo con la reivindicación 33. 37.- El uso de VLPs de la reivindicación 33, para preparar una vacuna para evitar la infección por HPV en un mamífero. 38. - El uso de las VLPs de la reivindicación 33, para preparar un medicamento para inducir una respuesta inmune en un animal. 39. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque comprende adicionalmente las VLPs de por lo menos un tipo de HPV adicional. 40. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque el por lo menos un tipo de HPV adicional se selecciona entre el grupo que consiste en: HPV6, HPV1 , HPV16, HPV18, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV55, HPV56, HPV58, HPV59, y HPV68. 41. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada además porque el por lo menos un tipo de HPV comprende HPV16. 42. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizada además porque comprende adicionalmente VLPs de HPV18. 43. - La vacuna de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque comprende adicionalmente VLPs de HPV6 y VLPs de HPVH .