WO2016104923A1 - 인유두종 바이러스의 바이러스 유사 입자 제조방법 - Google Patents

인유두종 바이러스의 바이러스 유사 입자 제조방법 Download PDF

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WO2016104923A1
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nacl
protein
salt
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PCT/KR2015/010740
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조양제
김광성
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아이진 주식회사
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing L1 virus-like particles (VLP) of human papilloma virus (HPV).
  • VLP L1 virus-like particles
  • HPV human papilloma virus
  • HPVs human Papillomaviruses
  • VLP Virus-Like Particles
  • Korean Patent No. 10-0959145 documents disclose that a protein is precipitated by adding ammonium sulfate to a yeast lysate obtained by culturing a transformed yeast expressing HPV L1 protein, and then lysing it.
  • a method for purifying HPV L1 protein by sequentially performing size-exclusion chromatography and cation-exchange chromatography on a protein precipitate is disclosed.
  • the inventors have conducted studies on purification conditions that can increase production yield in producing and purifying HPV L1 protein on an industrial scale using a yeast expression system.
  • the precipitate obtained by ammonium sulfate precipitation on the yeast product containing L1 protein was treated with 0.35-0.60 M of salt to remove impurities, and then chromatographed.
  • This invention was completed by confirming that the refinement
  • an object of the present invention is to provide a method for producing L1 virus-like particles of human papilloma virus.
  • Another object of the present invention is to provide an L1 virus-like particle of the human papilloma virus prepared by the above method.
  • the present invention provides a method for preparing L1 virus-like particles (VLP) of human papilloma virus (HPV), comprising the following steps:
  • step (b) subjecting the product of the transformed yeast cultured in step (a) to ammonium sulfate precipitation to obtain a precipitate;
  • step (d) chromatography the product of step (c) to obtain L1 protein.
  • the inventors have conducted studies on purification conditions that can increase production yield in producing and purifying HPV L1 protein on an industrial scale using a yeast expression system. As a result, the precipitate obtained by ammonium sulfate precipitation on the yeast product containing L1 protein was treated with 0.35-0.60 M of salt to remove impurities, and then chromatographed. It was confirmed that the purification efficiency of can be significantly improved.
  • step (a) of the present invention the transformed yeast expressing the L1 protein of HPV.
  • Viable cells used to express the HPV L1 protein in the present invention is a yeast, for example Saccharomyces three Levy in my process jiae (Saccharomyces cerevisiae), my process as Saccharomyces Pas thoria Taunus (Saccharomyces pastorianus ), Saccharomyces sp . Schizosaccharomyces, Schizosaccharomyces pombe ) and baker's yeast.
  • the transgenic yeast of the invention is Saccharomyces cerevisiae .
  • the transformed yeast expressing the HPV L1 protein means a yeast cell transformed with an expression vector that successfully expresses the HPV L1 protein.
  • the expression vector may include transcriptional or translational regulatory elements and other marker genes known in the art.
  • HPV L1 protein expression transformed yeast of the present invention can be readily prepared using methods known in the art, such methods are described in US Pat. Nos. US 7250170, US 6613557, US 5888516, US 5871998, US 5618536, US5437951 and the like, the contents of these patent documents are incorporated herein by reference.
  • the transformed yeast may be cultured by a method used in the art for the production of HPV L1 protein using yeast.
  • the transformed yeast may be cultured in a medium to which at least one carbon source of glucose and galactose is added as a carbon source, and an exemplary medium used for culturing the transformed yeast is YPDG medium (yeast extract, peptone, glucose and Galactose).
  • YPDG medium yeast extract, peptone, glucose and Galactose
  • the transgenic yeast may be incubated for less than 96 hours (eg, 95 hours or less, 10-95 hours, 15-95 hours, 20-95 hours, or 24-95 hours) in a medium to which a carbon source is added.
  • the L1 protein of HPV is HPV type 6a, HPV type 6b, HPV type 11, HPV type 16, HPV type 18, HPV type 31, HPV type 33, HPV type 35, HPV type 39 , HPV type 45, HPV type 51, HPV type 52, HPV type 56, HPV type 58 and HPV type 68.
  • the L1 protein of HPV is HPV type 16 or HPV type 18.
  • step (b) of the present invention the product of the transformed yeast cultured in step (a) (containing the L1 protein) is treated with ammonium sulfate to obtain a precipitate.
  • the transformed yeast cultured in step (a) may be lysed and the yeast lysate may be treated with ammonium sulfate to obtain a precipitate.
  • the lysing method of the cultured yeast cells can be used without limitation, methods for obtaining cell lysates known in the art, such as, for example, sonication, disruption by glass beads.
  • yeast product is treated (added) with ammonium sulfate to precipitate the expressed protein, and the impurities are removed by centrifugation or the like.
  • the concentration of ammonium sulphate treated in step (b) is 20-60% by weight. According to a more specific embodiment, the treatment concentration of the ammonium sulfate is 40-50% by weight or 42-48% by weight.
  • the precipitate obtained by the ammonium sulphate precipitation in step (b) is incubated in a solution containing a salt (eg NaCl).
  • a salt eg NaCl
  • the precipitate obtained by the ammonium sulphate precipitation is diluted to 25-65 mg / mL by adding a buffer and then 0.5 M or more (e.g., 0.5-0.9 M, 0.6-0.9 M or 0.7-0.9 M) is added to NaCl and stirred for a period of time, followed by incubation for at least 12 hours (eg 18-20 hours).
  • the temperature of the incubation may be 3-5 ° C (eg 4 ° C).
  • step (c) of the present invention the ammonium sulphate precipitate is treated with 0.35-0.60 M of salt, and the resultant salt is incubated to form an insoluble protein as an impurity. Thereafter, by removing the insoluble protein formed, the purification efficiency of the HPV L1 protein is greatly improved.
  • the salt treatment of 0.35-0.60 M in step (c) is a step that greatly contributes to the improvement of the purification efficiency of the HPV L1 protein (see Example 3). That is, when the insoluble protein produced in this step is removed by centrifugation, the purity of the VLP eluted in the next step chromatography can be greatly increased.
  • step (c) the ammonium sulfate precipitate-containing solution incubated for a period of time in the presence of the above-described salt (eg, NaCl) is dialyzed in a buffer containing 0.35-0.60 M of salt. After incubation, impurities are made insoluble and removed.
  • the buffer containing the salt of 0.35-0.60 M may include a nonionic surfactant.
  • the nonionic surfactant may be included at a concentration of 0.001-0.1%.
  • the concentration of ammonium sulphate precipitate to be treated with a salt of 0.35-0.60 M is 25-65 mg / mL.
  • the concentration of such ammonium sulphate precipitate can be adjusted by mixing the buffer with the ammonium sulphate precipitate.
  • the concentration of the ammonium sulfate precipitate is 28-62 mg / mL, 28-60 mg / mL, 28-55 mg / mL, 28-50, 30-62 mg / mL, 30-60 mg / mL, 30-55 mg / mL or 30-50 mg / mL.
  • the salt is NaCl, KCl or Na 2 CO 3 .
  • the concentration of the salt treated in step (c) is 0.35-0.60 M, 0.35-0.55 M, 0.35-0.50 M or 0.35-0.45 M; 0.40-0.60 M, 0.40-0.55 M, 0.40-0.50 M or 0.40-0.45 M; 0.45-0.60 M, 0.45-0.55 M or 0.45-0.50 M; Or 0.50-0.60 M or 0.50-0.55 M.
  • the salt treated in step (c) is NaCl
  • the treatment concentration of NaCl is 0.35-0.60 M or 0.35-0.55 M; 0.40-0.60 M or 0.40-0.55 M; Or 0.45-0.60 M or 0.45-0.55 M.
  • the salt treated in step (c) is KCl
  • the treatment concentration of KCl is 0.35-0.60 M or 0.40-0.60 M; 0.35-0.55 M; Or 0.55-0.60 M.
  • the salt treated in step (c) is Na 2 CO 3
  • the treatment concentration of Na 2 CO 3 is 0.35-0.60 M or 0.40-0.60 M; 0.35-0.55 M or 0.40-0.55 M; 0.35-0.50 M or 0.40-0.50 M; Or 0.35-0.45 M.
  • the incubation temperature in step (c) is 25-34 ° C.
  • the incubation temperature is 26-34 °C, 27-34 °C, 28-34 °C, 29-34 °C or 29.5-34 °C, according to another embodiment 25-33.5 °C, 26 -33.5 ° C, 27-33.5 ° C, 28-33.5 ° C, 29-33.5 ° C, 29.5-33.5 ° C or 30-33 ° C.
  • the incubation time in step (c) is 21-27 hours. According to a more specific embodiment, the incubation time is 21-26 hours or 22-26 hours.
  • step (d) of the present invention chromatography on the solution from which impurities are removed yields L1 protein.
  • the solution from which impurities are removed through the above steps (a) to (c) is purified through chromatography, residual impurities may be removed very effectively.
  • the chromatography is affinity chromatography or cation exchange chromatography.
  • the affinity chromatography is heparin chromatography.
  • heparin resin when performing heparin chromatography, heparin resin is first equilibrated with a suitable binding buffer before the result of step (c) is applied to the heparin resin column.
  • the binding buffer preferably comprises NaCl and a nonionic surfactant (eg, Tweeen 80), with NaCl being preferably low in concentration (0.1-0.4 M).
  • the sample is then subjected to heparin chromatography and the protein bound to the resin is eluted.
  • the elution method is preferably a NaCl linear gradient, more preferably eluting impurities in a 0.33-0.66 M NaCl linear gradient, and then eluting the desired L1 protein at a 0.66-2 M NaCl linear gradient.
  • the resin when cation exchange chromatography is performed, the resin is first equilibrated with a suitable binding buffer before the resultant is treated with 0.35-0.60 M of salt to remove impurities.
  • the binding buffer preferably comprises NaCl and a nonionic surfactant (eg, Tweeen 80), with NaCl being preferably low in concentration (0.3-0.6 M).
  • the sample is then subjected to cation exchange chromatography and the protein bound to the resin is eluted.
  • the elution method is preferably NaCl step concentration gradient, more preferably eluting the desired L1 protein using an elution buffer containing 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M and 1 M NaCl.
  • Cation exchange chromatography can be carried out using a variety of resins, preferably using a cation exchanger combined with sulfo, sulfoalkyl (e.g. sulfomethyl, sulfoethyl and sulfopropyl), phosphate or phosphatealkyl functional groups. And most preferably, using a cation exchanger having a phosphate functional group bonded thereto.
  • a cation exchanger having a phosphate functional group bonded thereto.
  • the L1 protein fraction obtained through the chromatography process may be concentrated by a membrane filter.
  • the chromatographic fractions can be concentrated using a membrane capable of cut-off a molecular weight of 50-100 kDa. Since VLPs having an average size of 50 nm are larger than other proteins, they are concentrated by not passing through the membrane, while most residual impurities are removed through the membrane.
  • the salt treated in step (c) is NaCl
  • the treatment concentration of NaCl is 0.35-0.60 M, 0.40-0.60 M, 0.45-0.60 M or 0.45-0.55 M.
  • step (d) when the chromatography of step (d) is heparin chromatography, the salt treated in step (c) is KCl, and the treatment concentration of KCl is 0.35-0.60 M, 0.40-0.60 M , 0.45-0.60 M, 0.50-0.60 M or 0.55-0.60 M.
  • step (d) when the chromatography of step (d) is heparin chromatography, the salt treated in step (c) is Na 2 CO 3, and the treatment concentration of Na 2 CO 3 is 0.35- 0.60 M or 0.40-0.60 M; 0.35-0.45 M; Or 0.55-0.60 M.
  • step (d) when the chromatography of step (d) is cation exchange chromatography, the salt treated in step (c) is NaCl, and the treatment concentration of NaCl is 0.35-0.60 M, 0.40- 0.60 M or 0.45-0.55 M.
  • step (d) when the chromatography of step (d) is cation exchange chromatography, the salt treated in step (c) is KCl, and the treatment concentration of KCl is 0.35-0.60 M, 0.35- 0.55 M, 0.35-0.50 M or 0.35-0.45 M.
  • step (d) when the chromatography of step (d) is cation exchange chromatography, the salt treated in step (c) is Na 2 CO 3 , the treatment concentration of Na 2 CO 3 is 0.35 -0.60 M, 0.35-0.55 M, 0.35-0.50 M or 0.35-0.45 M.
  • the present invention provides a method for preparing L1 virus-like particles (VLP) of HPV.
  • the present invention performs one chromatographic process by first removing impurities through ammonium sulphate precipitation and then dialysis in a solution containing 0.35-0.60 M of salt to remove impurities. It is possible to produce HPV L1 protein with high purity.
  • HPV antigen prepared according to the production method of the present invention is excellent in stability, it is suitable not only for vaccines but also for use as a raw material for HPV antibody diagnostic agents requiring high stability.
  • Example 1 is a view related to Example 1, which shows the removal efficiency of insoluble protein according to the type of incubation temperature and the type of size up buffer in the purification of HPV type 16 L1 protein.
  • FIG. 2 is a diagram related to Example 1 showing the removal efficiency of insoluble protein according to the type of incubation time and incubation time in the purification of HPV type 16 L1 protein.
  • FIG. 3 is a view related to Example 1, and shows the purification pattern of each fraction when incubated at 35 ° C. in the insoluble protein removal step in the purification of HPV type 16 L1 protein.
  • FIG. 4 is a diagram associated with Example 2, showing changes in purification yield of HPV Type 16 L1 protein with ammonium sulfate precipitation concentration.
  • FIG. 5 is a view related to Example 3, which shows the result of purification by cation exchange chromatography after performing NaCl concentration at 0.15-0.6 M in a size-up step.
  • FIG. 6 is a view related to Example 3, which shows purification yield purified by cation exchange chromatography after NaCl concentration was 0.15-0.6 M in the size-up step.
  • Example 7 is a view related to Example 3, which shows the result of purification by cation exchange chromatography after performing KCl concentration at 0.15-0.6 M in the size-up step.
  • Example 8 is a view related to Example 3, which shows the purification yield purified by cation exchange chromatography after performing KCl concentration at 0.15-0.6 M in the size-up step.
  • Example 9 is a view related to Example 3, which shows the result of purification by cation exchange chromatography after performing Na 2 CO 3 concentration in the size-up step to 0.15-0.6 M.
  • FIG. 9 is a view related to Example 3, which shows the result of purification by cation exchange chromatography after performing Na 2 CO 3 concentration in the size-up step to 0.15-0.6 M.
  • FIG. 10 is a view related to Example 3, which shows purification yield purified by cation exchange chromatography after Na 2 CO 3 concentration in a size-up step is 0.15-0.6 M.
  • FIG. 10 is a view related to Example 3, which shows purification yield purified by cation exchange chromatography after Na 2 CO 3 concentration in a size-up step is 0.15-0.6 M.
  • FIG. 11 is a view related to Example 3, which shows the result of purification by affinity chromatography after NaCl concentration was performed at a size-up step of 0.15-0.6 M.
  • FIG. 11 is a view related to Example 3, which shows the result of purification by affinity chromatography after NaCl concentration was performed at a size-up step of 0.15-0.6 M.
  • Example 12 is a view related to Example 3, which shows the purification yield purified by affinity chromatography after performing NaCl concentration at 0.15-0.6 M in the size-up step.
  • FIG. 13 is a view related to Example 3, which shows the result of purification by affinity chromatography after performing a KCl concentration of 0.15-0.6 M in a size-up step.
  • FIG. 14 is a view related to Example 3, which shows the purification yield purified by affinity chromatography after performing KCl concentration at 0.15-0.6 M in the size-up step.
  • Example 15 is a view related to Example 3, which shows the result of purification by affinity chromatography after performing Na 2 CO 3 concentration in the size-up step to 0.15-0.6 M.
  • FIG. 15 is a view related to Example 3, which shows the result of purification by affinity chromatography after performing Na 2 CO 3 concentration in the size-up step to 0.15-0.6 M.
  • FIG. 16 is a view related to Example 3, which shows the purification yield purified by affinity chromatography after performing Na 2 CO 3 concentration in the size-up step to 0.15-0.6 M.
  • FIG. 16 is a view related to Example 3, which shows the purification yield purified by affinity chromatography after performing Na 2 CO 3 concentration in the size-up step to 0.15-0.6 M.
  • FIG. 17 is a diagram related to Example 3, showing cation exchange chromatography purification results for HPV Type 16 and Type 18 L1 proteins.
  • FIG. Lane 1 0.5 M NaCl
  • lane 2 0.4 M KCl
  • lane 3 0.4 M Na 2 CO 3 .
  • Lane 18 is a diagram related to Example 3, showing the results of affinity chromatography purification for HPV type 16 protein.
  • Lane 1 0.5 M NaCl
  • lane 2 0.4 M KCl
  • lane 3 0.4 M Na 2 CO 3 .
  • Example 19 is a view related to Example 4, which shows the results of evaluation of the stability of HPV antigen according to the type and concentration of salt and reaction temperature in the size-up step.
  • Lane 1 0.5 M NaCl
  • Lane 2 0.4 M KCl
  • Lane 3 0.4 M Na 2 CO 3
  • Lane 4 0.15 M NaCl.
  • YPDG medium was used to express HPV type 16 L1 and type 18 L1 proteins from the GAL10 promoter.
  • yeast extract (Duchefa Biochem, Netherlands) and 2% peptone (Duchefa Biochem, Netherlands) were added to all media, glucose and galactose were added. After inoculating the transformed yeast strain in YPDG medium was cultured using a fermentor (fermentor) at 30 °C, the culture time was not more than 96 hours.
  • the yeast cells were mixed with a buffer solution (20 mM sodium phosphate, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80), and the cells were disrupted with a cell disruptor, and the supernatant was recovered by centrifugation of the disruption solution. . 45% by weight of ammonium sulfate was added to the collected supernatant, followed by centrifugation at high speed (24,000 g) to discard the supernatant, and only the precipitate was recovered.
  • a buffer solution (20 mM sodium phosphate, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80
  • the recovered precipitate was measured for protein concentration by BCA assay, 1X PBS-T was added to dilute the concentration of the ammonium salt precipitate to a concentration of 30 mg / mL, and NaCl was added to the final concentration at 0.8 M. After stirring for about 30 minutes, the mixture was left at 4 ° C and incubated for 18 hours.
  • the precipitate sample was dialyzed in the size-up buffer to which the four kinds of salts were added, and the incubator at a temperature of 30 ° C. ( ⁇ 2 ° C.) was allowed to stand for 16-26 hours (two hour intervals) or 48 hours for the lowest value. The time zone indicating turbidity was confirmed.
  • Insoluble protein removal is a method of increasing the purity of the purified by precipitating impurities at room temperature, the lower the OD value of the supernatant centrifuged after incubation means that more impurities were removed.
  • the turbidity value was different according to the salt type of the size-up buffer, but overall, the higher the incubation temperature, the lower the OD 600 nm value. It may be inferred that it is easy, but at too high temperature, there was a problem with protein structure.
  • the purification yield of HPV type 16 L1 protein purified by incubation at 30 ° C. and 35 ° C. for 24 hours to remove insoluble protein, respectively was about 2.65. It was mg / L, but the purification yield at 35 ° C. was about 1.24 mg / L, and the purity was also low.
  • the incubation time of the insoluble protein was measured at 2 hours interval and 48 hours at 16-26 hours under the respective salt conditions, and as a result, the insoluble protein precipitated over time. It was confirmed that turbidity increased and then maintained at a constant level. Turbidity of the suspension means that impurities are induced to increase the purity. However, since incubation for too long may cause the target protein to precipitate, the incubation time suitable for the removal of insoluble protein is considered to be 21-26 hours.
  • the yeast cells of Example 1 were mixed with a buffer solution (20 mM sodium phosphate, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80), and then the cells were disrupted with a cell disrupter, and then the crushed solution was fast (24,000 g). The supernatant was recovered by centrifugation. 45% by weight of ammonium sulfate was added to the recovered supernatant, followed by centrifugation at high speed (24,000 g) to discard the supernatant and recover only the precipitate.
  • a buffer solution (20 mM sodium phosphate, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80
  • the supernatant was recovered by centrifugation. 45% by weight of ammonium sulfate was added to the recovered supernatant, followed by centrifugation at high speed (24,000 g) to discard the supernatant and recover only the precipitate.
  • the recovered precipitate was measured for protein concentration by BCA assay, and the concentration of ammonium salt precipitate was diluted to 10 mg / mL-60 mg / mL (10 mg / mL interval) by adding 1X PBS-T. NaCl was added at a final concentration of 0.8 M to the precipitate for each concentration, stirred for about 30 minutes, and left at 4 ° C for incubation for 18 hours. After incubation with NaCl, the suspension was added to the dialysis membrane at each concentration to undergo dialysis with a size-up buffer.
  • the size-up buffer of Example 1 was added to dilute the protein concentration to 10 mg / mL or less, and then allowed to stand in a 30 ° C ( ⁇ 2 ° C) incubator and incubated for 24 hours. After 24 hours, the resulting supernatant was recovered by centrifugation at high speed (24,000 g), and the collected supernatant was placed in a dialysis membrane and dialyzed at 4 ° C. with binding buffer (PBS + 0.35 M NaCl pH 7.2, 0.01% Tween 80). It was. After dialysis, the supernatant was filtered by centrifugation at high speed (24,000 g). This filtrate was purified by cation exchange chromatography.
  • a 1.6 cm X 5 cm Poly-Prep column (GE healthcare lifescience, USA) filled with P-11 cellulose phosphate resin (Whatman, UK) was run with binding buffer (PBS + 0.5 M NaCl) at 5 times the resin volume. Subject equilibrium was maintained. The dialysis solution was combined by passing through a P-11 column, followed by washing the binding buffer by doubling the resin volume. After washing, 4-5 mL of elution buffer containing 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M and 1 M NaCl was flowed into the binding buffer to elute the L1 protein). Fractions identified with the target band were classified to calculate the yield after purification of BCA.
  • the concentration conditions of ammonium salt precipitates having high purification yields of HPV antigens range from 25 mg / mL to 65 mg / mL.
  • the size-up step is to remove impurities through incubation with a salt.
  • a type of salt suitable for HPV VLP antigen purification and to confirm the degree of removal of impurities by salt concentration The experiment was conducted. Table 1 shows the types of common salts.
  • the yeast cells of Example 1 After mixing the buffer solution (20 mM sodium phosphate, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80) to the yeast cells of Example 1, the cells were disrupted by a cell disruptor, and the supernatant solution was centrifuged. Was recovered. 45% by weight of ammonium sulfate was added to the recovered supernatant, centrifuged at high speed (24,000 g), and the supernatant was discarded and only the precipitate was recovered (at this time, the precipitate was added with a small amount of 1X PBS-T buffer to form a suspension).
  • buffer solution (20 mM sodium phosphate, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80
  • Protein concentration was measured by BCA assay, and 1X PBS-T was added to dilute the concentration of the ammonium salt precipitate to within 30 mg / mL. NaCl was slowly added to the diluted precipitate with a final concentration of 0.8 M. After stirring for about 30 minutes, the mixture was left at 4 ° C and incubated for 18 hours. After incubation with NaCl, the suspension was placed in a dialysis membrane and dialyzed using the components of Table 2 in the size-up buffer composition. After dialysis was completed, each size-up buffer was added to dilute the protein concentration to 10 mg / mL or less, and then incubated in a 30 ° C. ( ⁇ 2 ° C.) incubator for 24 hours.
  • the resultant was centrifuged at high speed (24000 g) to recover the supernatant, and the recovered supernatant was dialyzed at 4 ° C. with binding buffer (PBS + 0.35 M NaCl pH 7.2, 0.01% Tween 80). .
  • the supernatant was filtered by dialysis with binding buffer and centrifugation at high speed (24000 g).
  • the filtrate was purified by cation exchange chromatography as in Example 2, and only the fractions of high purity were collected and analyzed for yield calculation.
  • purification using affinity chromatography is performed based on the salt conditions showing the highest yields of the respective salt types in cation exchange chromatography. The experiment was further performed.
  • affinity chromatography maintained equilibrium by flowing binding buffer (PBST with 0.33M NaCl) 10 times the resin volume on a column filled with heparin Sepharose resin (GE healthcare life science, USA). .
  • the dialysis solution was combined by passing through a heparin column and washed by pouring an elution buffer containing 2 M NaCl in a linear concentration gradient from 0.33 M NaCl to 0.5 M NaCl at 50 times the resin volume. After washing, the elution buffer containing 2 M NaCl was flowed 20 times the resin volume in a linear concentration gradient from 0.5 M NaCl to 1.5 M NaCl to elute the L1 protein.
  • the fractions identified with the target bands were classified and the purification yield was calculated after BCA quantification.
  • Affinity chromatography used a 1 mL Heparin column (GE, USA).
  • Purification yields were calculated using different types and concentrations of salts using cation exchange chromatography. As a result, purification was not performed at all salt concentration conditions in MgCl 2 , and in other NaCl, KCl, and Na 2 CO 3 , respectively. To 10 were obtained. In addition, affinity chromatography performed also showed a high yield at a high salt concentration of 0.3 M or more, similarly to cation exchange chromatography (FIGS. 11 to 16).
  • the samples were quantified by the BCA assay for the highest yield samples for each salt type, and 0.5 ⁇ g of the sample was placed on two 12% acrylamide gels for 150 V, 150 mA, and 1.5 hours. Electrophoresis. One sheet was subjected to silver staining to identify the developed sample, and the other was western blot using commercially available monoclonal antibodies that specifically reacted with HPV 16 and 18 antigens.
  • the types of salts showing good effects in preparing HPV type 16 and 18 L1 VLP antigens are NaCl, KCl and Na 2 CO 3 , and the concentration range of these salts is 0.35-0.60 for optimal insoluble protein removal. M could be confirmed.
  • the antigen produced according to the salt type and concentration was evaluated for the stability of the antigen by varying the reaction temperature and storage time conditions.
  • a size-up process was performed according to the type and concentration of salt to prepare the produced HPV type 16 L1 VLP antigen (0.15 M NaCl, 0.5 M NaCl, 0.4 M KCl, 0.4 M Na 2 CO 3 ).
  • the antigen stability was set at 40 ° C. and 60 ° C. and the reaction time was 12, 24 and 36 hours to evaluate the stability of the antigen.
  • Antigens were dispensed into new tubes at 150 ⁇ l according to the conditions in Table 3 below. The antigen samples were collected hourly and the status of the antigen was confirmed via Western blot.
  • Western blot was performed by quantifying the sample by BCA assay, 0.6 ⁇ g electrophoresis on 12% acrylamide gel for 150 V, 150 mA, 1.5 hours, and then transferred to nitrocellulose membrane. Transcribed samples were identified by color reaction after reaction with commercially available monoclonal antibodies that specifically react with HPV 16 and 18 antigens.
  • the antigen samples were confirmed by Western blot according to the temperature. As a result, it was confirmed that the stability of the antigen was maintained at 40 ° C. and 60 ° C. Considering that 40 ° C. and 60 ° C. are harsh temperature conditions, the above results support that the HPV antigen prepared in the preparation method of the present invention can maintain stability as an antigen even at normal refrigeration and freezing temperatures.

Abstract

본 발명은 HPV의 L1 바이러스-유사 입자(VLP)의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 암모늄 설페이트 침전을 통하여 불순물을 1차적으로 제거한 후, 2차적으로 0.35-0.60 M의 염이 포함된 용액에서 투석하여 불순물을 제거하는 방법을 통하여, 한 번의 크로마토그래피 공정을 실시하고도 높은 순도로 HPV L1 단백질을 생산할 수 있다.

Description

인유두종 바이러스의 바이러스 유사 입자 제조방법
본 발명은 인유두종 바이러스(HPV)의 L1 바이러스-유사 입자(VLP)의 제조방법에 관한 것이다.
인유두종 바이러스(Human Papillomavirus: HPV)는 현재 80종 이상이 알려져 있으며, 대략 30종이 성적인 접촉으로 자궁경부에 감염을 일으키고, 이중 반 정도가 자궁경부암과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, HPV 중에서 특히 HPV 타입 16과 18에 감염된 여성의 암 발생률이 비감염자의 500배나 높으며, 이들은 생식기의 상피세포를 통해 감염된 후, 자궁경부암으로 악성 전환(malignant transformation)되는 것으로 알려져 있다(Hausen, Biochemica. Biophysica. Acta. 1288: 55-78, 1996).
현재 개발된 자궁경부암의 예방 백신은 고위험 타입의 HPV 바이러스-유사 입자(Virus-Like Particles, VLPs)를 이용하여 개발되었다. VLP는 HPV의 주 캡시드 단백질인 L1 단백질(약 55 kDa)로 다른 바이러스 유전자 산물 없이도 VLP로 자가정렬 되는 성질을 가지고 있으며, 이는 천연 HPV 바이리온과 거의 유사하다. 또한, 면역능은 오래 지속되며, 유전자형에 특이(Type-specific)하여 백신 후보로서 높은 효율을 기대할 수 있는 장점이 있다.
효모 발현 시스템을 이용하여 인유두종 바이러스의 VLPs를 제조하려는 시도가 이루어지고 있고, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae )에서 생산된 인유두종 바이러스의 VLPs를 고순도로 정제하기 위한 다음과 같은 방법이 알려져 있다. 대한민국 등록특허 제10-0959145호 문헌에는 HPV L1 단백질을 발현하는 형질전환 효모를 배양한 후 용해(lysis)시켜 얻은 효모 용해물(lysate)에 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)를 첨가하여 단백질을 침전시키고, 단백질 침전물에 대해 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)와 양이온 교환 크로마토그래피(cation-exchange chromatography)를 순차적으로 실시하여 HPV L1 단백질을 정제하는 방법이 개시되어 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 효모 발현 시스템을 이용하여 HPV L1 단백질을 산업적 규모로 생산 및 정제하는데 있어, 생산 수율을 증가시킬 수 있는 정제 조건에 대한 연구를 수행하였다. 그 결과, L1 단백질이 포함된 효모 생산물에 대하여 암모늄 설페이트 침전을 실시하여 얻은 침전물에 0.35-0.60 M의 염을 처리하여 불순물을 제거하는 과정을 실시한 후 크로마토그래피를 실시하는 방법을 통하여, HPV L1 단백질의 정제 효율을 크게 향상시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 인유두종 바이러스의 L1 바이러스-유사 입자의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 인유두종 바이러스의 L1 바이러스-유사 입자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인유두종 바이러스(HPV)의 L1 바이러스 유사 입자(VLP)의 제조방법을 제공한다:
(a) HPV의 L1 단백질을 발현하는 형질전환 효모를 배양하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 배양된 형질전환 효모의 생산물에 대하여 암모늄 설페이트 침전을 실시하여 침전물을 얻는 단계;
(c) 암모늄 설페이트 침전을 실시하여 얻은 침전물에 0.35-0.60 M의 염을 처리하고 인큐베이션 한 후, 형성된 불용성 단백질을 제거하는 단계; 및
(d) 단계 (c)의 결과물에 대하여 크로마토그래피를 실시하여 L1 단백질을 얻는 단계.
본 발명자들은 효모 발현 시스템을 이용하여 HPV L1 단백질을 산업적 규모로 생산 및 정제하는데 있어, 생산 수율을 증가시킬 수 있는 정제 조건에 대한 연구를 수행하였다. 그 결과, L1 단백질이 포함된 효모 생산물에 대하여 암모늄 설페이트 침전을 실시하여 얻은 침전물에 0.35-0.60 M의 염을 처리하여 불순물을 제거하는 과정을 실시한 후 크로마토그래피를 실시하는 방법을 통하여, HPV L1 단백질의 정제 효율을 크게 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 각 단계를 상세하게 설명한다.
(a) HPV L1 단백질을 발현하는 형질전환 효모 배양
본 발명의 단계 (a)에서는 HPV의 L1 단백질을 발현하는 형질전환 효모를 배양한다.
본 발명에서 HPV L1 단백질을 발현시키기 위하여 이용 가능한 세포는 효모이며, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp .), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 빵효모(baker's yeast) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 현질전환 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다.
상기 HPV L1 단백질을 발현하는 형질전환 효모는 HPV L1 단백질을 성공적으로 발현시키는 발현 벡터로 형질전환된 효모 세포를 의미한다. 상기 발현 벡터는 당업계에 공지된 전사(transcription) 또는 번역(translation) 조절 요소, 다른 마커 유전자(marker gene)를 포함할 수 있다.
본 발명의 HPV L1 단백질 발현 형질전환된 효모는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 용이하게 제조할 수 있으며, 이러한 방법은 미국특허 Pat. Nos. US 7250170, US 6613557, US 5888516, US 5871998, US 5618536, US5437951 등에 개시되어 있고, 이들 특허 문헌의 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
상기 형질전환 효모는 효모를 이용한 HPV L1 단백질의 제조를 위하여 당업계에서 사용되고 있는 방법으로 배양될 수 있다. 예를 들어, 상기 형질전환 효모는 탄소원으로서 글루코오스와 갈락토오스 중 어느 하나 이상의 탄소원이 첨가된 배지에서 배양할 수 있고, 형질전환 효모 배양 시 이용되는 예시적인 배지는 YPDG 배지(효모추출액, 펩톤, 글루코오스 및 갈락토오스 포함)이다. 또한, 상기 형질전환 효모는 탄소원이 첨가된 배지에서 96시간 미만(예컨대, 95시간 이하, 10-95시간, 15-95시간, 20-95시간 또는 24-95시간)으로 배양될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 HPV의 L1 단백질은 HPV 타입 6a, HPV 타입 6b, HPV 타입 11, HPV 타입 16, HPV 타입 18, HPV 타입 31, HPV 타입 33, HPV 타입 35, HPV 타입 39, HPV 타입 45, HPV 타입 51, HPV 타입 52, HPV 타입 56, HPV 타입 58 및 HPV 타입 68로 구성된 군으로부터 선택된 HPV의 L1 단백질이다. 보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 HPV의 L1 단백질은 HPV 타입 16 또는 HPV 타입 18이다.
(b) 암모늄 설페이트 침전물 수득
본 발명의 단계 (b)에서는 단계 (a)에서 배양된 형질전환 효모의 생산물(L1 단백질이 포함됨)에 대하여 암모늄 설페이트를 처리하여 침전물을 얻는다. 예를 들어, 단계 (b)에서는 단계 (a)에서 배양된 형질전환 효모를 용해(lysis)하고, 효모 용해물에 대하여 암모늄 설페이트를 처리하여 침전물을 얻을 수 있다.
상기 배양된 효모 세포의 용해 방법은, 예를 들어 소니케이션, 유리 비드에 의한 파쇄 등과 같이 당업계에 알려진 세포 용해물을 얻기 위한 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.
이후, 효모 생산물에 대하여 암모늄 설페이트를 처리(첨가)하여 발현된 단백질을 침전시키고, 원심분리 등을 통하여 불순물을 제거한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (b)에서 처리되는 암모늄 설페이트의 농도는 20-60 중량%이다. 보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 암모늄 설페이트의 처리 농도는 40-50 중량% 또는 42-48 중량%이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (b)에서의 암모늄 설페이트 침전을 실시하여 얻은 침전물(단백질 펠릿)은 염(예컨대, NaCl)이 포함된 용액에서 인큐베이션 한다.
보다 구체적인 일구현예에 따르면, 암모늄 설페이트 침전을 실시하여 얻은 침전물은 완충액을 첨가하여 이의 농도를 25-65 mg/mL로 희석한 다음 0.5 M 이상(예컨대, 0.5-0.9 M, 0.6-0.9 M 또는 0.7-0.9 M)으로 NaCl을 첨가하고 일정 시간 동안 교반한 후, 12시간 이상(예컨대, 18-20시간) 동안 인큐베이션 한다. 상기 인큐베이션의 온도는 3-5℃(예컨대, 4℃)일 수 있다.
(c) 0.35-0.60 M의 염을 처리하여 불순물을 제거
본 발명의 단계 (c)에서는 암모늄 설페이트 침전물에 0.35-0.60 M의 염을 처리하고, 염이 처리된 결과물을 인큐베이션 하여 불순물인 불용성 단백질을 형성시킨다. 이후, 형성된 불용성 단백질을 제거함으로써 HPV L1 단백질의 정제 효율을 크게 향상시키게 된다.
하기 실시예에 기술된 바와 같이, 단계 (c)에서의 0.35-0.60 M의 염 처리 과정은 HPV L1 단백질의 정제 효율의 개선이 크게 기여하는 단계이다(실시예 3 참조). 즉, 이 단계에서 생성된 불용성 단백질을 원심분리 하여 제거할 경우 다음 단계인 크로마토그래피에서 용출되는 VLP의 순도를 크게 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (c)에서는 상술한 염(예컨대, NaCl)의 존재 하에서 일정 시간 동안 인큐베이션 된 암모늄 설페이트 침전물-포함 용액을 0.35-0.60 M의 염이 포함된 완충액에서 투석한 후 인큐베이션 하여 불순물들을 불용성 상태로 만들어 제거한다. 상기 0.35-0.60 M의 염이 포함된 완충액은 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 일예로, 상기 비이온성 계면활성제는 0.001-0.1%의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 0.35-0.60 M의 염이 처리될 암모늄 설페이트 침전물의 농도는 25-65 mg/mL이다. 이러한 암모늄 설페이트 침전물의 농도는 암모늄 설페이트 침전물에 완충액을 혼합함으로써 조절할 수 있다.
보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 암모늄 설페이트 침전물의 농도는 28-62 mg/mL, 28-60 mg/mL, 28-55 mg/mL, 28-50, 30-62 mg/mL, 30-60 mg/mL, 30-55 mg/mL 또는 30-50 mg/mL이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 염은 NaCl, KCl 또는 Na2CO3이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (c)에서 처리되는 염의 농도는 0.35-0.60 M, 0.35-0.55 M, 0.35-0.50 M 또는 0.35-0.45 M; 0.40-0.60 M, 0.40-0.55 M, 0.40-0.50 M 또는 0.40-0.45 M; 0.45-0.60 M, 0.45-0.55 M 또는 0.45-0.50 M; 또는 0.50-0.60 M 또는 0.50-0.55 M이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (c)에서 처리되는 염은 NaCl이고, NaCl의 처리 농도는 0.35-0.60 M 또는 0.35-0.55 M; 0.40-0.60 M 또는 0.40-0.55 M; 또는 0.45-0.60 M 또는 0.45-0.55 M이다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 단계 (c)에서 처리되는 염은 KCl이고, KCl의 처리 농도는 0.35-0.60 M 또는 0.40-0.60 M; 0.35-0.55 M; 또는 0.55-0.60 M이다.
본 발명의 또 다른 일구현예에 따르면, 단계 (c)에서 처리되는 염은 Na2CO3이고, Na2CO3의 처리 농도는 0.35-0.60 M 또는 0.40-0.60 M; 0.35-0.55 M 또는 0.40-0.55 M; 0.35-0.50 M 또는 0.40-0.50 M; 또는 0.35-0.45 M이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 인큐베이션 온도는 25-34℃이다. 보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 인큐베이션 온도는 26-34℃, 27-34℃, 28-34℃, 29-34℃ 또는 29.5-34℃이고, 다른 일구현예에 따르면 25-33.5℃, 26-33.5℃, 27-33.5℃, 28-33.5℃, 29-33.5℃, 29.5-33.5℃ 또는 30-33℃이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 인큐베이션 시간은 21-27시간이다. 보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 인큐베이션 시간은 21-26시간 또는 22-26시간이다.
(d) 크로마토그래피
본 발명의 단계 (d)에서는 불순물이 제거된 용액에 대하여 크로마토그래피를 실시하여 L1 단백질을 수득한다. 상술한 (a) 내지 (c) 단계를 통해 불순물이 제거된 용액을 크로마토그래피를 통해 정제할 경우 잔여 불순물을 매우 효과적으로 제거할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 보다 구체적인 일구현예에 따르면, 상기 친화성 크로마토그래피는 헤파린 크로마토그래피이다.
일예로, 헤파린 크로마토그래피를 실시하는 경우, 우선 단계 (c)의 결과물을 헤파린 레진 컬럼에 적용하기 전에 헤파린 레진을 적합한 결합 완충액으로 평형화시킨다. 결합 완충액은 바람직하게는 NaCl 및 비이온성 계면활성제(예컨대, Tweeen 80)를 포함하며, NaCl은 저농도(0.1-0.4 M)가 바람직하다. 이어, 헤파린 크로마토그래피에 시료를 적용한 다음 레진에 결합된 단백질을 용출한다. 용출방법은 NaCl 선형 농도구배가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.33-0.66 M NaCl 선형 농도구배에서는 불순물을 용출시킨 다음, 0.66-2 M NaCl 선형 농도구배에서 원하는 L1 단백질을 용출시킨다.
다른 예로, 양이온 교환 크로마토그래피를 실시하는 경우, 우선 0.35-0.60 M의 염을 처리하여 불순물을 제거한 결과물을 컬럼에 적용하기 전에 레진을 적합한 결합 완충액으로 평형화시킨다. 결합 완충액은 바람직하게는 NaCl 및 비온성 계면활성제(예컨대, Tweeen 80)를 포함하며, NaCl은 저농도(0.3-0.6 M)가 바람직하다. 이어, 양이온 교환 크로마토그래피에 시료를 적용한 다음 레진에 결합된 단백질을 용출한다. 용출방법은 NaCl 단계 농도구배가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M과 1 M NaCl이 포함된 용출 버퍼를 이용하여 원하는 L1 단백질을 용출시킨다.
양이온 교환 크로마토그래피는 다양한 레진을 이용하여 실시할 수 있으며, 바람직하게는 설포, 설포알킬(예컨대, 설포메틸, 설포에틸 및 설포프로필), 포스페이트 또는 포스페이트알킬 작용기가 결합된 양이온교환제를 이용하여 실시하며, 가장 바람직하게는 포스페이트 작용기가 결합된 양이온교환제를 이용하여 실시한다.
본 발명에서는, 상기 크로마토그래피 과정을 통하여 얻은 L1 단백질 분획물을 멤브레인 필터로 농축시킬 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피 분획물을 50-100 kDa의 분자량을 cut-off 할 수 있는 멤브레인을 사용하여 농축할 수 있다. 평균 50 nm 정도의 크기를 가지는 VLP의 경우 다른 단백질들에 비해 큰 크기를 가지기 때문에 멤브레인을 통과하지 못하여 농축되는 반면 대부분의 잔여 불순물은 멤브레인을 통과하여 제거되는 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (d)의 크로마토그래피가 헤파린 크로마토그래피인 경우, 단계 (c)에서 처리되는 염은 NaCl이고, NaCl의 처리 농도는 0.35-0.60 M, 0.40-0.60 M, 0.45-0.60 M 또는 0.45-0.55 M이다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 단계 (d)의 크로마토그래피가 헤파린 크로마토그래피인 경우, 단계 (c)에서 처리되는 염은 KCl이고, KCl의 처리 농도는 0.35-0.60 M, 0.40-0.60 M, 0.45-0.60 M, 0.50-0.60 M 또는 0.55-0.60 M이다.
본 발명의 또 다른 일구현예에 따르면, 단계 (d)의 크로마토그래피가 헤파린 크로마토그래피인 경우, 단계 (c)에서 처리되는 염은 Na2CO3이고, Na2CO3의 처리 농도는 0.35-0.60 M 또는 0.40-0.60 M; 0.35-0.45 M; 또는 0.55-0.60 M이다.
본 발명의 또 다른 일구현예에 따르면, 단계 (d)의 크로마토그래피가 양이온 교환 크로마토그래피인 경우, 단계 (c)에서 처리되는 염은 NaCl이고, NaCl의 처리 농도는 0.35-0.60 M, 0.40-0.60 M 또는 0.45-0.55 M이다.
본 발명의 또 다른 일구현예에 따르면, 단계 (d)의 크로마토그래피가 양이온 교환 크로마토그래피인 경우, 단계 (c)에서 처리되는 염은 KCl이고, KCl의 처리 농도는 0.35-0.60 M, 0.35-0.55 M, 0.35-0.50 M 또는 0.35-0.45 M이다.
본 발명의 또 다른 일구현예에 따르면, 단계 (d)의 크로마토그래피가 양이온 교환 크로마토그래피인 경우, 단계 (c)에서 처리되는 염은 Na2CO3이고, Na2CO3의 처리 농도는 0.35-0.60 M, 0.35-0.55 M, 0.35-0.50 M 또는 0.35-0.45 M이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 HPV의 L1 바이러스-유사 입자(VLP)의 제조방법을 제공한다.
(ii) 본 발명은 암모늄 설페이트 침전을 통하여 불순물을 1차적으로 제거한 후, 2차적으로 0.35-0.60 M의 염이 포함된 용액에서 투석하여 불순물을 제거하는 방법을 통하여, 한 번의 크로마토그래피 공정을 실시하고도 높은 순도로 HPV L1 단백질을 생산할 수 있다.
(iii) 본 발명의 제조방법에 따라 제조한 HPV 항원은 안정성이 우수하므로, 백신뿐만 아니라, 높은 안정성이 요구되는 HPV 항체 진단제의 원료로서의 사용에 적합하다.
도 1은 실시예 1과 관련된 도면으로서, HPV 타입 16 L1 단백질의 정제에 있어 사이즈 업 완충액의 종류 및 인큐베이션 온도에 따른 불용성 단백질의 제거 효율을 보여준다.
도 2는 실시예 1과 관련된 도면으로서, HPV 타입 16 L1 단백질의 정제에 있어 사이즈 업 완충액의 종류 및 인큐베이션 시간에 따른 불용성 단백질의 제거 효율을 보여준다.
도 3은 실시예 1과 관련된 도면으로서, HPV 타입 16 L1 단백질의 정제에 있어 불용성 단백질 제거 단계에서 35℃로 인큐베이션 했을 경우 각 분획별 정제 패턴을 보여준다.
도 4는 실시예 2와 관련된 도면으로서, 암모늄 설페이트 침전 농도에 따른 HPV 타입 16 L1 단백질의 정제 수율 변화를 보여준다.
도 5는 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 NaCl 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한 결과를 보여준다.
도 6은 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 NaCl 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한 정제 수율을 보여준다.
도 7은 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 KCl 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한 결과를 보여준다.
도 8은 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 KCl 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한 정제 수율을 보여준다.
도 9는 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 Na2CO3 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한 결과를 보여준다.
도 10은 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 Na2CO3 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한 정제 수율을 보여준다.
도 11은 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 NaCl 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 친화성 크로마토그래피로 정제한 결과를 보여준다.
도 12는 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 NaCl 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 친화성 크로마토그래피로 정제한 정제 수율을 보여준다.
도 13은 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 KCl 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 친화성 크로마토그래피로 정제한 결과를 보여준다.
도 14는 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 KCl 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 친화성 크로마토그래피로 정제한 정제 수율을 보여준다.
도 15는 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 Na2CO3 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 친화성 크로마토그래피로 정제한 결과를 보여준다.
도 16은 실시예 3과 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서 Na2CO3 농도를 0.15-0.6 M로 하여 수행한 후 친화성 크로마토그래피로 정제한 정제 수율을 보여준다.
도 17은 실시예 3과 관련된 도면으로서, HPV 타입 16과 타입 18 L1 단백질에 대한 양이온 교환 크로마토그래피 정제 결과를 보여준다. 1 레인: 0.5 M NaCl, 2 레인: 0.4 M KCl, 3 레인: 0.4 M Na2CO3.
도 18은 실시예 3과 관련된 도면으로서, HPV 타입 16 단백질에 대한 친화성 크로마토그래피 정제 결과를 보여준다. 1 레인: 0.5 M NaCl, 2 레인: 0.4 M KCl, 3 레인: 0.4 M Na2CO3.
도 19는 실시예 4와 관련된 도면으로서, 사이즈-업 단계에서의 염의 종류 및 농도와 반응 온도에 따른 HPV 항원의 안정성 평가 결과를 보여준다. 1레인: 0.5 M NaCl, 2레인: 0.4 M KCl, 3레인: 0.4 M Na2CO3, 4레인: 0.15 M NaCl.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 불용성 단백질(Insoluble protein)의 효율적 제거를 위한 온도 및 시간 설정
1-1. 실험방법
HPV 타입 16 및 타입 18의 L1 단백질의 생산 과정 중에서, 불순물을 제거하기 위한 단계인 불용성 단백질 제거의 효율적인 온도와 시간 범위를 설정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 실시하였다.
재조합 HPV 타입 16 L1 및 HPV 타입 18 L1이 도입된 YEGα-HPV16L1-ROS 및 YEGα-HPV18L1-ROS 벡터로 각각 형질전환된 효모 세포(Saccharomyces cerevisiae; 각각 KCCM11036P 및 KCCM11037P)를 방해판(baffle)이 부착된 플라스크에 우라실이 없는 합성 완전 배지 SD-ura에 접종하고, 30℃에서 진탕 배양하였다. GAL10 프로모터로부터 HPV 타입 16 L1 및 타입 18 L1 단백질을 발현시키기 위하여 YPDG 배지를 사용하였다. 모든 배지에 1％ 효모추출액(Duchefa Biochem, Netherlands) 및 2％ 펩톤(Duchefa Biochem, Netherlands)을 첨가하였으며, 글루코오스와 갈락토오스를 추가하였다. YPDG 배지에 상기 형질전환된 효모 균주를 접종한 후 30℃에서 발효기(fermentor)를 이용하여 배양하였으며, 배양시간은 96시간이 넘지 않도록 하였다.
상기 효모 세포에 완충액(20 mM 인산나트륨, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80)를 섞은 후 세포파쇄기로 세포를 파쇄한 후, 파쇄액을 원심분리 하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액에 45 중량%의 암모늄 설페이트를 첨가하여 침전시킨 다음 고속(24,000 g)으로 원심분리 하여 상층액을 버리고 침전물만 회수하였다. 회수한 침전물을 BCA assay로 단백질 농도를 측정하고, 1X PBS-T를 넣어 암모늄염 침전물의 농도를 30 mg/mL의 농도가 되도록 희석하고, 희석물에 최종 농도 0.8 M로 NaCl을 넣어주었다. 약 30분 정도 교반 후 4℃에서 정치하여 18시간 동안 인큐베이션 하였다.
NaCl로 인큐베이션한 후 현탁액을 네 개의 그룹으로 나눈 다음, 각각을 투석막에 넣어 3 종류의 염(NaCl, KCl, Na2CO3)이 첨가된(0.15 M NaCl, 0.5 M NaCl, 0.4 M KCl, 0.4 M Na2CO3) 사이즈-업 완충액(Size-up buffer; PBS + 0.01% Tween 80)으로 투석하였다. 투석 완료 후 각각의 사이즈-업 완충액을 첨가하여 단백질의 농도를 10 mg/mL 이하가 되도록 희석한 다음, 20-35℃(±2℃) 온도의 인큐베이터에서 정치하여 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 24시간 후, 결과물을 고속(24,000 g)으로 원심분리 하여 상층액을 회수한 다음, 회수한 상층액의 탁도를 분광광도계(OD=600 nm)를 이용하여 측정하였다.
또한, 상기 4 종류의 염이 첨가된 사이즈-업 완충액에 침전물 샘플을 투석하고, 30℃(±2℃) 온도의 인큐베이터에서 16-26시간 동안(2시간 간격) 또는 48시간 동안 정치하여 가장 낮은 탁도를 나타내는 시간대를 확인하였다.
1-2. 실험 결과
불용성 단백질 제거 과정은 상온에서 불순물들을 침전시켜 정제 시 순도를 증가시키는 방법으로서, 인큐베이션 후 원심분리 한 상층액의 OD값이 낮을수록 불순물이 많이 제거되었음을 의미한다.
도 1에 나타난 바와 같이, 사이즈-업 완충액의 염 종류에 따라 탁도의 값은 달랐지만, 전반적으로는 인큐베이션 온도가 높을수록 OD 600 nm 값이 낮게 측정되었으며, 이를 바탕으로 온도가 높을수록 불용성 단백질의 제거가 용이하다고 유추할 수 있겠으나, 너무 높은 온도에서는 단백질 구조에 문제가 있을 것으로 판단되었다. 이에, 추가 분석을 수행한 결과, 30℃와 35℃에서 24시간 동안 인큐베이션 하여 불용성 단백질을 제거하여 정제한 HPV 타입 16 L1 단백질의 정제 수율을 각각 비교한 결과, 30℃에서의 정제 수율은 약 2.65 mg/L이었으나, 35℃에서의 정제수율은 약 1.24 mg/L이었고, 순도 또한 낮았다. 이러한 결과를 통하여 적정범위 이상의 온도에서 불용성 단백질을 제거하는 것은 효율이 낮음을 확인할 수 있었고, 정제에 효율적인 온도 범위로서 약 25-34℃를 확인하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 불용성 단백질의 인큐베이션 시간은, 각각의 염 조건에서 16-26시간까지 2시간 간격 및 48시간에 현탁도를 측정한 결과, 시간이 지남에 따라 불용성 단백질이 침전되어 현탁액의 탁도가 증가하다가 일정한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 현탁액의 탁도는 불순물이 유도되어 순도가 증가하는 것을 의미한다. 그러나, 너무 오랜 시간 동안 인큐베이션을 하면 목적단백질도 침전될 가능성이 있기 때문에, 불용성 단백질의 제거에 적합한 인큐베이션 시간의 범위는 21-26시간이 적절할 것으로 판단된다.
실시예 2. 암모늄염 침전물(ammonium sulfate PPT)의 농도에 따른 정제 수율 비교
2-1. 실험방법
실시예 1의 효모 세포와 완충액(20 mM 인산나트륨, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80)을 섞은 후 세포파쇄기로 세포를 파쇄한 후, 파쇄액을 고속(24,000 g)으로 원심분리 하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액에 45 중량%의 암모늄 설페이트를 첨가하여 침전시킨 다음, 고속(24,000 g)으로 원심분리 하여 상층액을 버리고 침전물만 회수하였다. 회수한 침전물을 BCA assay로 단백질 농도를 측정하고, 1X PBS-T를 넣어 암모늄염 침전물의 농도를 10 mg/mL-60 mg/mL(10 mg/mL 간격)으로 희석하였다. 각 농도별 침전물에 최종 농도 0.8 M로 NaCl을 넣어 약 30분 정도 교반한 후, 4℃에서 정치하여 18시간 동안 인큐베이션 하였다. NaCl로 인큐베이션한 후, 각 농도별 현탁액을 투석막에 넣어 사이즈-업 완충액으로 투석을 진행하였다. 투석 완료 후, 실시예 1의 사이즈-업 완충액을 첨가하여 단백질의 농도를 10 mg/mL 이하가 되도록 희석한 후, 30℃(±2℃) 인큐베이터에서 정치하여 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 24시간 후, 결과물을 고속(24,000 g)으로 원심분리 하여 상층액을 회수하고, 회수한 상층액을 투석막에 넣어 결합 완충액(PBS + 0.35 M NaCl pH 7.2, 0.01% Tween 80)으로 4℃에서 투석하였다. 투석 후, 고속(24,000 g)으로 원심분리 하여 상층액을 여과하였다. 이 여과액을 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 구체적으로, P-11 셀룰로오스 포스페이트 레진(Whatman, UK)으로 충진된 1.6 cm X 5 cm Poly-Prep 컬럼(GE healthcare lifescience, USA)은 결합 완충액(PBS + 0.5 M NaCl)을 레진 부피의 5배로 흘려주어 평형 상태를 유지하였다. 투석이 완료된 용액은 P-11 컬럼을 통과시켜 결합시킨 후 결합 완충액을 레진 부피의 5배로 흘려주어 세척하였다. 세척 후 결합 버퍼에 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M과 1 M NaCl이 포함된 용출 버퍼를 각각 4-5 ㎖씩 흘려주어 L1 단백질을 용출시켰다). 타겟 밴드가 확인된 분획을 분류하여 BCA 정량 후 정제 수율을 계산하였다.
2-2. 실험결과
암모늄염 침전물의 농도에 따른 정제 수율을 비교한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 암모늄염 침전물의 농도가 30 mg/mL일 때의 정제 수율은 약 2.6 mg/L로 가장 높았으며, 그 다음으로는 암모늄염 침전물의 농도가 40 mg/mL 일 때 약 2.2 mg/L의 수율을 나타내었다. 이러한 결과를 통하여, HPV 항원의 정제 수율이 높은 암모늄염 침전물의 농도 조건은 25 mg/mL-65 mg/mL의 범위일 것으로 판단된다.
실시예 3. 사이즈-업 단계에서의 최적 염의 종류 및 농도 설정
3-1. 실험방법
HPV L1 단백질 생산 단계 중에서 사이즈-업 단계는 염을 이용한 인큐베이션을 통하여 불순물을 제거하는 단계로, HPV VLP 항원 정제에 적합한 염의 종류를 선택하고, 염의 농도별로 불순물이 제거되는 정도를 확인하기 위하여 하기의 실험을 진행하였다. 일반적인 염의 종류를 표 1에 나타내었다.
양이온/음이온 NO3 - Cl- S2- SO4 2 - CO3 2 -
Na+ NaNO3 NaCl Na2S Na2SO4 Na2CO3
K+ KNO3 KCl K2S K2SO4 K2CO3
NH4 + NH4NO3 NH4Cl (NH4)2S (NH4)2SO4 (NH4)2CO3
Mg2 + Mg(NO3)2 MgCl2 MgS MgSO4 MgCO3
Ba2 + Ba(NO3)2 BaCl2 BaS BaSO4 BaCO3
Ca2 + Ca(NO3)2 CaCl2 CaS CaSO4 CaCO3
Pb3 + Pb(NO3)2 PbCl2 PbS PbSO4 PbCO3
Ag+ AgNO3 AgCl Ag2S Ag2SO4 Ag2CO3
실시예 1의 효모 세포에 완충액(20 mM 인산나트륨, pH 7.2, 100 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80)를 섞은 후 세포파쇄기로 세포를 파쇄한 후, 파쇄액을 원심분리 하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액에 45 중량%의 암모늄 설페이트를 첨가하고, 고속(24,000 g)으로 원심분리 하여 상층액은 버리고 침전물만 회수하였다(이때, 침전물은 1X PBS-T 완충액을 조금 넣어 현탁액을 만듦). 이 침전물을 BCA assay로 단백질 농도를 측정하고, 1X PBS-T를 넣어 암모늄염 침전물의 농도를 30 mg/mL 이내의 농도가 되도록 희석하였다. 희석된 침전물에 최종 농도 0.8 M로 NaCl을 천천히 교반하면서 넣어주었다. 약 30분 정도 교반 후 4℃에서 정치하여 18시간 동안 인큐베이션 하였다. NaCl로 인큐베이션한 후 현탁액을 투석막에 넣어 표 2의 성분을 사이즈-업 완충액 조성에 사용하여 투석하였다. 투석 완료 후 각각의 사이즈-업 완충액을 첨가하여 단백질의 농도를 10 mg/mL 이하가 되도록 희석한 후 30℃(±2℃) 인큐베이터에서 정치하여 24시간 동안 인큐베이션 하였다.
NaCl KCl Na2CO3 MgCl2
0.15M NaCl 0.15M KCl 0.15M Na2CO3 0.15M MgCl2
0.3M NaCl 0.3M KCl 0.3M Na2CO3 0.3M MgCl2
0.4M NaCl 0.4M KCl 0.4M Na2CO3 0.4M MgCl2
0.5M NaCl 0.5M KCl 0.5M Na2CO3 0.5M MgCl2
0.6M NaCl 0.6M KCl 0.6M Na2CO3 0.6M MgCl2
24시간 후 결과물을 고속(24000 g)으로 원심분리 하여 상층액을 회수하고, 회수한 상층액을 투석막에 넣어 결합 완충액(PBS + 0.35 M NaCl pH 7.2, 0.01% Tween 80)으로 4℃에서 투석하였다. 결합 완충액으로 투석한 후 고속(24000 g)으로 원심분리 하여 상층액을 여과하였다. 여과액을 실시예 2와 같이 양이온 교환 크로마토그래피로 정제한 후 높은 순도의 분획만을 모아 수율을 계산하여 분석하였다. 또한, 다른 성질의 레진에서도 동일한 결과가 도출됨을 확인하기 위하여, 양이온 교환 크로마토그래피에서 각각의 염 종류 중 가장 높은 수율을 나타낸 염 조건을 바탕으로, 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography)를 이용하여 정제하는 실험을 추가적으로 실시하였다.
구체적으로, 친화성 크로마토그래피는 헤파린 세파로오즈 레진(GE healthcare life science, USA)으로 충진된 컬럼에 결합 완충액(0.33M NaCl이 포함된 PBST)을 레진 부피의 10배로 흘려주어 평형상태를 유지하였다. 투석이 완료된 용액은 헤파린 컬럼을 통과시켜 결합시킨 후 2 M NaCl이 포함된 용출 버퍼를 0.33 M NaCl 부터 0.5 M NaCl까지 선형 농도구배로 레진 부피의 50배로 흘려주어 세척하였다. 세척 후 2 M NaCl이 포함된 용출 버퍼를 0.5 M NaCl부터 1.5 M NaCl까지 선형 농도구배로 레진 부피의 20배로 흘려주어 L1 단백질을 용출시켰다. 타겟 밴드가 확인된 분획을 분류하여 BCA 정량 후 정제수율을 계산하였다. 친화성 크로마토그래피는 1 mL Heparin column(GE, USA)을 사용하였다.
3-2. 실험 결과
양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 염의 종류와 농도를 다르게 하여 정제 수율을 계산한 결과, MgCl2에서는 모든 염 농도 조건에서 정제가 이루어지지 않았으며, 그 밖의 NaCl, KCl 및 Na2CO3에서는 각각 도 5 내지 10과 같은 결과가 도출되었다. 추가적으로 수행한 친화성 크로마토그래피에서도 양이온 교환 크로마토그래피와 동일하게 0.3 M 이상의 높은 염 농도에서 높은 수율을 나타내었다(도 11 내지 16).
상기의 결과를 바탕으로 각 염의 종류별로 수율이 가장 높은 농도의 샘플에 대하여 BCA assay를 통해 샘플을 정량화 한 후 0.5 ㎍의 샘플을 두 장의 12% 아크릴 아마이드 겔에 150 V, 150 mA, 1.5시간 동안 전기영동 하였다. 전개된 샘플을 확인하기 위하여 한 장은 실버염색을 수행하였고, 다른 한 장은 HPV 16 및 18 항원과 특이적으로 반응하는 시판 중인 단일클론 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한 각각의 완충액 조건에서 모두 높은 순도와 적합한 크기에서의 항체 반응성을 확인하였다(1 레인: 0.5 M NaCl, 2 레인: 0.4 M KCl, 3 레인: 0.4 M Na2CO3). 추가적으로 수행한 친화성 크로마토그래피 결과에서도 도 18과 같이 높은 순도와 적합한 크기에서의 항체 반응성을 확인하였다(1 레인: 0.5 M NaCl, 2 레인: 0.6 M KCl, 3 레인: 0.4 M Na2CO3).
위의 결과를 통하여, HPV 타입 16 및 18 L1 VLP 항원을 제조하는데 있어서 좋은 효과를 보이는 염의 종류는 NaCl, KCl 및 Na2CO3이며, 최적의 불용성 단백질 제거를 위한 이들 염의 농도범위가 0.35-0.60 M임을 확인할 수 있었다.
4. 사이즈-업 단계에서의 염 종류 및 농도에 따른 안정성 평가
4-1. 실험방법
사이즈-업 단계에서 염의 종류 및 농도에 따라 생산된 항원을 반응 온도와 보관시간 조건을 달리하여 항원의 안정성을 평가하였다. 이를 위하여, 염의 종류와 농도에 따라 사이즈-업 과정을 진행하고 생산된 HPV 타입 16 L1 VLP 항원을 준비하였다(0.15 M NaCl, 0.5 M NaCl, 0.4 M KCl, 0.4 M Na2CO3). 항원의 반응온도를 40℃와 60℃로 설정하고, 반응시간을 12, 24 및 36시간으로 하여 항원의 안정성을 평가하였다. 항원을 아래 표 3의 조건에 맞게 150 ㎕씩 새 튜브에 분주하였다. 시간별로 항원 샘플을 회수하여, 항원의 상태를 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 웨스턴 블랏은 BCA assay를 통해 샘플을 정량화 한 후 0.6 ㎍을 12% 아크릴 아마이드 겔에 150 V, 150 mA, 1.5시간 동안 전기 영동한 후 니트로셀룰로오스 막에 전사하여 수행하였다. 전사된 샘플을 HPV 16 및 18 항원과 특이적으로 반응하는 시판 중인 단일클론 항체를 이용하여 반응시킨 후 발색하여 확인하였다.
Figure PCTKR2015010740-appb-T000001
4-2. 실험결과
도 19에 나타난 바와 같이, 온도에 따라 항원 샘플을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과, 40℃와 60℃에서 항원으로서의 안정성을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다. 40℃와 60℃가 가혹한 온도조건임을 고려하여 볼 때, 이상의 결과는 본 발명의 제조방법에 제조한 HPV 항원이 일반적인 냉장 및 냉동 온도에서도 항원으로서의 안정성을 유지할 수 있음을 뒷받침해준다.
또한, 도 19에 나타난 바와 같이, 염의 종류 및 농도에 따라서 0.4 M KCl 조건과 0.4 M Na2CO3 및 0.5 M NaCl에서는 이보다 낮은 염 농도 조건인 0.15 M NaCl일 때 보다 항원으로서의 안정성이 높았다. 이러한 결과는, 본 발명의 제조방법에 따라 제조한 HPV 항원은 0.15 M NaCl의 염 조건으로 제조한 HPV 항원보다 정제 수율측면에서 뿐만 아니라, 안정성 측면에서도 더 우수하므로, 높은 안정성이 요구되는 HPV 항체 진단제의 원료로서의 사용에 보다 적합함을 보여준다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 다음의 단계를 포함하는 인유두종 바이러스(HPV)의 L1 바이러스 유사 입자(VLP)의 제조방법:
    (a) HPV의 L1 단백질을 발현하는 형질전환 효모를 배양하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 배양된 형질전환 효모의 생산물에 대하여 암모늄 설페이트 침전을 실시하여 침전물을 얻는 단계;
    (c) 암모늄 설페이트 침전을 실시하여 얻은 침전물에 0.35-0.60 M의 염을 처리하고 인큐베이션 한 후, 형성된 불용성 단백질을 제거하는 단계; 및
    (d) 단계 (c)의 결과물에 대하여 크로마토그래피를 실시하여 L1 단백질을 얻는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 처리되는 암모늄 설페이트의 농도는 40-50 중량%인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b)와 (c) 사이에, 암모늄 설페이트 침전을 실시하여 얻어진 침전물을 염이 포함된 용액에서 인큐베이션 하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 암모늄 설페이트 침전을 실시하여 얻은 침전물은 25-65 mg/mL의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 염은 NaCl, KCl 또는 Na2CO3인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 처리되는 염의 농도는 0.35-0.55 M인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 25-34℃의 온도로 인큐베이션 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 21-27시간 동안 인큐베이션 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 HPV는 HPV 타입 6a, HPV 타입 6b, HPV 타입 11, HPV 타입 16, HPV 타입 18, HPV 타입 31, HPV 타입 33, HPV 타입 35, HPV 타입 39, HPV 타입 45, HPV 타입 51, HPV 타입 52, HPV 타입 56, HPV 타입 58 및 HPV 타입 68로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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