KR20140018794A

KR20140018794A - 인유두종바이러스 바이러스 유사입자의 고효율 정제방법

Info

Publication number: KR20140018794A
Application number: KR20130085605A
Authority: KR
Inventors: 김홍진; 김형진
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2013-07-19
Publication date: 2014-02-13
Also published as: CN104507956B; MX361186B; KR101559622B1; JP2015524817A; CN104507956A; EP2881401B1; EP2881401A4; CA2880420A1; MX2015001413A; CA2880420C; EP2881401A1; AU2013297306B2; WO2014021604A1; AU2013297306A1; BR112015002126A2; JP6014763B2; CL2015000037A1; BR112015002126B1; US9994618B2; US20150266927A1

Abstract

본 발명은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) L1 단백질을 고순도 및 고효율로 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 정제 방법에 의하면, 세포 파쇄물을 환원제 처리하여 가열 냉각할 경우 HPV L1 단백질의 정제 순도 및 수율을 크게 향상시킬 수 있다. 또한 본 발명의 정제 방법으로 정제된 HPV L1 바이러스 유사입자는 우수한 항원성 및 면역성원을 나타낸다.

Description

인유두종바이러스 바이러스 유사입자의 고효율 정제방법{An Efficient Method for Purifying Virus-Like Particles of Human Papillomavirus}

본 발명은 구조 특성 및 면역 특성이 우수한 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)의 바이러스 유사입자(Virus-Like Particles, VLPs)를 고효율로 정제할 수 있는 방법에 관한 것이다.

인유두종바이러스(HPV)는 자궁경부암 발병원인의 거의 100%를 차지하는 병인체이다[1]. 전 세계적으로 매년 500,000명의 여성이 자궁경부암으로 진단받으며 250,000명의 여성이 자궁경부암으로 사망하는 것으로 알려져 있다[2]. 자궁경부암을 일으키는 고위험군 인유두종바이러스의 타입(type)에는 16형, 18형, 45형, 31형, 33형, 52형, 58형, 35형, 59형 등이 있으며, 저 위험군 타입에는 6형 및 11형 등이 알려져 있다[3,4]. 이중 인유두종바이러스 타입 16형과 18형이 전체 자궁경부암 원인의 70%를 차지하고 있어 자궁경부암 예방에 가장 중요한 타입으로 인식되고 있다[5]. 자궁경부암 발병에 원인이 되는 인유두종바이러스의 타입은 지역에 따라 그 종류가 매우 다르다[5]. 아프리카, 유럽, 북아메리카 및 중남미 지역에서는 인유두종바이러스 16형, 18형, 31형, 45형에 의한 감염이 자궁경부암 발병 원인의 주를 이루는 반면, 아시아 지역에서는 16형, 18형, 58형, 33형에 의한 감염이 자궁경부암 발병 원인의 주를 이룬다[5].

인유두종바이러스의 캡시드는 메이저 항원인 L1 단백질과 마이너 항원인 L2 단백질로 구성되어 있다[6]. 이중 L1 단백질은 자가조립되어(self-assembly) 바이러스 유사입자(virus-like particles, VLPs)를 이루는 성질을 가지고 있어 자궁경부암 예방백신의 항원 및 진단용 항원으로 사용되고 있다[6, 27]. 재조합 L1 단백질은 대장균(Escherichia coli), 사카로마에세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia Pastoris), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), Sf(Spodoptera frugiperda) 세포 및 식물세포 등을 발현 세포로 하여 생산되었다[7-12, 28]. 현재 시판되고 있는 자궁경부암 예방 백신에는 Gardasil^TM(Merck)과 Cervarix^TM(GlaxosmithKline, GSK)가 있다. Gardasil^TM은 인유두종바이러스의 타입 16형, 18형, 6형, 11형에 대한 L1 바이러스 유사입자를 항원으로 포함하며 Cervarix^TM은 인유두종바이러스 타입 16형, 18형에 대한 L1 바이러스 유사입자를 항원으로 포함하고 있다[13]. Gardasil^TM은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 항원 발현 세포로 사용하며 Cervarix^TM은 곤충세포인 Sf(Spodoptera frugiperda)세포를 항원 발현 세포로 사용하고 있다[13,14]. 두 백신은 모두 근육주사를 통해 접종하며, 1회 접종 시 $120, 3회 접종 시 $360의 비용이 소요되어 매우 고가이다[15]. 현재 시판중인 자궁경부암 예방백신의 높은 접종가는 자궁경부암이 주로 발생하는 지역인 개발도상국에까지 널리 이용되는데 많은 한계를 가지고 있다[16]. 따라서 저비용 고효율 자궁경부암 백신의 개발은 여전히 중요한 과제로 남아있다.

재조합 단백질을 이용한 의약품의 경우, 다운스트림 공정(downstream processing)에 드는 비용은 전체 생산 비용의 80%를 차지할 만큼 그 비중이 높다 [17]. 자궁경부암 예방백신의 항원 생산을 위해서는 다운스트림 공정(downstream processing)에서 여러 단계의 정제 과정을 통해 타켓 항원의 순도를 순차적으로 올리는 방법이 사용되어져 왔다[18]. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 생산된 바이러스 유사입자의 경우 타겟 단백질의 순도를 증가시키기 위해 초원심분리법(ultra-centrifugation)을 이용한 수크로오스 쿠션(sucrose cushion) 또는 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)가 주로 사용되어왔다. Hofmann 등은 바이러스 유사입자 정제를 위해 초원심분리법을 이용한 수크로오스 쿠션, 음이온 교환 크로마토그래피, 암모늄설페이트 침전 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하였다[19]. Kim 등은 초원심분리법을 이용한 수크로오스 쿠션, 크기 배제 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 순차적으로 사용하여 바이러스 유사입자를 정제하였다[7]. Park 등은 암모늄설페이트 침전, 크기 배제 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피를 순차적으로 사용하는 정제방법을 사용한바 있다[20]. 이들 방법을 통해 고순도의 바이러스 유사입자를 얻을 수 있지만 정제 단위를 증가시키는데 한계를 가지고 있어 대량생산에 적용하기에 적합하지 않다는 단점을 가지고 있다.

사카로마이세스 세레비지애에서 생산된 인유두종바이러스 바이러스 유사입자의 대량 정제를 위해서 다음과 같은 방법들이 사용되었다. Cook 등은 크로스-플로우 마이크로여과(cross-flow microfiltration), 양이온 교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피를 순차적으로 사용하는 방법을 사용하였다[21]. Kim 등은 암모늄설페이트 침전과 침전된 오염물의 제거 과정을 통해 불순물 단백질을 제거한 후 헤파린 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 바이러스 유사입자를 정제하는 방법을 사용하였다[22]. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 생산된 인유두종바이러스 L1 단백질은 전체 세포 파쇄액 단백질의 1% 이하로 알려져 있어 회수가 용이하지 않다[20]. 재조합 단백질 제조방법을 통해 생산된 인유두종바이러스의 바이러스 유사입자를 고순도로 정제하기 위해서는 여러 단계의 침전 및 크로마토그래피를 거쳐야 하며 반복적인 투석(dialysis)과정도 필요하다. 또한 인유두종바이러스 바이러스 유사입자는 쉽게 부서지는 성질을 가지고 있어 우수한 구조로 조립된 바이러스 유사입자를 얻는 것은 매우 중요하게 인식되고 있다 [31]. 연구자들은 효모(yeast) 발현 시스템과 같은 숙주 세포 파쇄물 내의 불순물을 효과적으로 제거하기 위한 공정 개발에 많은 노력을 기울여 왔으나, 바이러스 유사입자를 고효율로 정제하기 위한 기술은 아직 까지도 뚜렷한 진전을 보이지 않고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 특허출원 제2008-0026586호 대한민국 특허출원 제2011-0137242호

Kim et al., 2010, One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 70: 68-74. Park MA, Kim HJ, Kim H-J (2008) Optimum conditions for production and purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 59: 175-181.

본 발명자들은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)의 L1 단백질을 발현하는 숙주세포로부터 생산된 HPV L1 단백질을 고순도 및 고효율로 정제하기 위한 새로운 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, HPV의 L1 단백질을 발현시킨 숙주세포의 파쇄물에 환원제를 처리하거나, 또는 환원제를 처리한 후 가열 및 냉각(heating and chilling) 과정을 거치게 하여 크로마토그래피를 통해 정제하면, HPV L1 단백질의 순도가 놀라울 정도로 향상될 뿐만 아니라, L1 단백질로부터 조립되는 바이러스유사입자(Virus like particle, VLP)의 구조 특성 및 면역 특성이 매우 우수하게 된다는 사실을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인유두종바이러스(HPV) L1 단백질을 고순도 및 고효율로 정제하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) L1 단백질의 정제 방법을 제공한다: (a) HPV의 L1 단백질을 발현하는 형질전환 숙주세포를 배양한 후 배양된 숙주세포를 회수하여 파쇄하는 단계; (b) 상기 숙주세포의 파쇄물에 환원제를 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 환원제가 첨가된 숙주세포의 파쇄물로부터 크로마토그래피를 행하여 HPV L1 단백질을 정제하는 단계.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) L1 단백질의 정제 방법을 제공한다: (ⅰ) HPV의 L1 단백질을 발현하는 형질전환 숙주세포를 배양한 후 배양된 숙주세포를 회수하여 파쇄하는 단계; (ⅱ) 상기 숙주세포의 파쇄물에 환원제를 첨가하는 단계; (ⅲ) 상기 환원제가 첨가된 숙주세포의 파쇄물을 가열한 후 냉각시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 가열 및 냉각된 숙주세포의 파쇄물로부터 크로마토그래피를 행하여 HPV L1 단백질을 정제하는 단계.

본 발명자들은 인유두종바이러스(HPV)의 L1 단백질을 발현하도록 제작된 숙주세포로부터 생산된 HPV L1 단백질을 고순도 및 고효율로 정제하기 위한 새로운 방법을 개발하고자 노력한 결과, 배양한 상기 숙주세포의 파쇄물에 환원제를 처리하거나, 또는 환원제를 처리한 후 가열 및 냉각(heating and chilling) 과정을 거치게 하고, 크로마토그래피를 통해 정제하면, HPV L1 단백질의 순도가 놀라울 정도로 향상될 뿐만 아니라, L1 단백질로부터 조립되는 바이러스유사입자(Virus like particle, VLP)의 구조 특성 및 면역 특성이 우수하게 된다는 사실을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하 각 단계에 따라 본 발명을 상세하게 설명한다.

(ⅰ) HPV의 L1 단백질을 발현하는 형질전환 숙주세포를 배양한 후 배양된 숙주세포를 회수하여 파쇄하는 단계

본 발명의 명세서에서 용어 "HPV L1 단백질"은 HPV의 L1 유전자로부터 발현되는 것으로서 HPV의 캡시드(capsid)를 구성하는 주요(major) 단백질을 의미한다. L1 단백질은 캡시드를 구성하는 다른 마이너(minor) 단백질인 L2 단백질과 함께 또는 L1 단백질 단독으로 적합한 조건하에서 바이러스 유사 입자(Virus-Like Particle, VLP)로 자가조립(self-assemble)되는 특성을 갖는다.

유두종바이러스(Papillomavirus)는 최대 8 개의 초기(early, E) 및 2 개의 후기(late, L) 유전자를 갖고, 50-60 nm의 크기이며, 엔벨로프가 없고, 정이십면체(icosahedral)의 DNA 지놈 바이러스이다. 유전자 E에서 "E"는 초기(early)를 의미하며, 유전자 L에서 "L"은 후기(late)를 의미한다. E 유전자는 바이러스 복제 및 형질전환(transformation)의 기능에 관련된 유전자이다. L1 및 L2 유전자는 바이러스 캡시드 단백질을 인코딩한다. L1 단백질은 주요 캡시드 단백질이고, 55-60 kDa의 분자량을 갖는다. L2 단백질은 55-60 kDa의 예측 분자량 및 75-100 kDa의 PAGE에 의해 측정되는 겉보기 분자량를 갖는 마이너(minor) 캡시드 단백질이다.

본 발명의 방법에서 L1 단백질이 유래되는 인유두종바이러스(HPV)의 타입(type)은 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 HPV 타입 6a, HPV 타입 6b, HPV 타입 11, HPV 타입 16, HPV 타입 18, HPV 타입 30, HPV 타입 31, HPV 타입 33, HPV 타입 35, HPV 타입 39, HPV 타입 41, HPV 타입 42, HPV 타입 43, HPV 타입 44, HPV 타입 45, HPV 타입 51, HPV 타입 52, HPV 타입 54, HPV 타입 55, HPV 타입 56, HPV 타입 58, HPV 타입 68 및 HPV 타입 70으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 본 발명의 L1 단백질은 HPV 타입 6a, HPV 타입 6b, HPV 타입 11, HPV 타입 16, HPV 타입 18, HPV 타입 31, HPV 타입 33, HPV 타입 45 및 HPV 타입 58로 이루어지는 군으로부터 선택되는 HPV로부터 유래된 것이며, 가장 바람직하게는 HPV 타입 16, HPV 타입 18, 또는 HPV 타입 58로부터 유래된다.

본 발명에서 숙주세포(host cell)로 이용되는 세포는 박테리아, 효모세포, 곤충세포, 식물세포 또는 동물세포이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 효모세포는 사카로마에세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스에스피.(Saccharomyces sp .), 쉬조사카로마이세스폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia Pastoris), 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)이다.

본 발명에서 HPV L1 단백질을 발현하는 형질전환 숙주세포(transformed host cell)는 HPV L1 단백질을 성공적으로 발현시키는 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 의미한다. 상기 발현 벡터는 당업계에 공지된 전사(transcription) 또는 트랜스레이션(translation) 조절 요소, 다른 마커 유전자(marker gene)를 포함할 수 있다. 본 발명의 HPV L1 단백질을 발현하는 형질전환 숙주세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다.

(ⅱ) 상기 숙주세포의 파쇄물에 환원제를 첨가하는 단계

본 발명의 명세서에서 용어 "환원제(reducing agent)"는 환원-산화 반응(reduction-oxidation reaction)에서 전자를 다른 종(species)에 공여하는 원소 또는 화합물을 의미하며, 바람직하게는 펩타이드 또는 단백질에서의 이황화결합(disulfide bond)의 환원 또는 자유 설프히드릴기(free sulfhydryl group)의 안정화를 위해 사용되는 화합물을 의미한다.

본 발명에서 환원제는 예를 들어 β-머캅토에탄올 (β-mercaptoethanol), DTT (dithiothreitol), 2-머캅토에틸아민-HCl (2-mercaptoethylamine-HCl), TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine], 시스테인-HCl (cystein-HCl)으로 이루어지는 군에서 선택되며, 보다 바람직하게는 β-머캅토에탄올 또는 DTT이다.

본 발명에서 세포 파쇄물 내에서의 환원제의 최종 농도는 0.1 중량% 이상, 바람직하게는 0.1-20 중량%, 보다 바람직하게는 0.1-10 중량%, 보다 더 바람직하게는 1-8 중량%, 보다 더 바람직하게는 3-7 중량%, 가장 바람직하게는 4-6 중량%이다.

본 발명에서 환원제를 세포 파쇄물에 첨가한 후 반응시키는 시간은 특정의 시간 범위로 한정되지 않으며, 당업자가 본 발명의 방법에 적합한 반응시간을 선택하여 사용할 수 있다.

(ⅲ) 상기 환원제가 첨가된 숙주세포의 파쇄물을 가열한 후 냉각시키는 단계

본 발명에서 상기 세포 파쇄물에 환원제를 첨가한 후 가열 및 냉각(heating and chilling) 조건을 거친다. 하기 구체적인 일 실시예에서 실험결과로 입증되는 바와 같이, 환원제를 첨가한 세포 파쇄물을 가열 및 냉각 처리를 행하면 형질전환 숙주세포의 파쇄물 중의 불순물의 제거 효율이 크게 증대될 뿐만 아니라 L1 단백질로부터 조립되는 VLP가 바람직한 구조 및 면역 특성을 갖게 된다.

본 발명에서 세포 파쇄물의 가열 온도는 상온(room temperature) 초과의 온도를 의미하며, 바람직하게는 25℃ 초과의 온도이며, 보다 바람직하게는 25℃ 초과 80℃ 이하의 온도이며, 보다 더 바람직하게는 30-65℃의 온도이며, 보다 더욱 바람직하게는 35-65℃이며, 가장 바람직하게는 35-60℃이며, 최적의 가열 조건은 35-55℃의 온도이다.

본 발명에서 세포 파쇄물의 가열 시간은 가열온도에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 10분-72 시간의 범위에서 적합하게 선택할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 30분-72시간의 범위, 보다 바람직하게는 30분-48시간의 범위이며, 보다 더 바람직하게는 30분-24시간의 범위이며, 가장 바람직하게는 30분-12시간의 범위이다.

본 발명에서 상기 냉각의 온도는 세포 파쇄물의 시료가 얼지 않을 정도의 온도를 의미하며, 이러한 냉각온도로는 0-10℃의 온도이며, 바람직하게는 0℃ 초과 8℃미만의 온도이며, 보다 바람직하게는 0℃ 초과 7℃ 미만, 보다 더 바람직하게는 0℃초과 6℃미만, 가장 바람직하게는 0℃초과 5℃미만의 온도로 냉각시킨다. 냉각시키는 시간은 본 발명의 방법에 맞도록 적합한 냉각 시간을 선택하여 사용할 수 있다.

한편, 실시예에 따라서는 상기 환원제가 첨가된 숙주세포의 파쇄물을 가열 및 냉각하지 않고, 상온에서 유지시킬 수도 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 "상온"은 가열하거나 냉각하지 않은 그대로의 기온으로서, 15℃ 이상 25℃ 이하의 온도를 나타낸다.

(ⅳ) 상기 환원제가 첨가된 숙주세포의 파쇄물, 또는 상기 가열 및 냉각된 숙주세포의 파쇄물로부터 크로마토그래피를 행하여 HPV L1 단백질을 정제하는 단계

환원제가 첨가된 숙주세포의 파쇄물에 대해 크로마토그래피 정제 방법을 행하거나, 또는 상기 숙주세포의 파쇄물에 환원제를 첨가하고 가열 및 냉각시킨 후 크로마토그래피 정제 방법을 행하여 HPV L1 단백질을 정제한다.

본 발명에서 사용가능한 크로마토그래피는 당업계에서 공지된 것으로서, 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피와 같은 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 소수성 결합 크로마토그래피 (hydrophobic interaction chromatography), 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 사용할 수 있다. 본 발명에서 분리 및 정제하고자 하는 물질이 단백질이므로 단백질 또는 펩타이드의 분리에 가장 적합한 이온교환 크로마토그래피가 바람직하다. 하기 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 양이온 교환 크로마토그래피의 일종인 헤파린 수지 크로마토그래피 및 양이온 교환크로마토그래피를 이용하여 HPV L1 단백질을 성공적으로 분리 및 정제하였다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

ⅰ) 본 발명은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) L1 단백질을 고순도 및 고효율로 정제하는 방법을 제공한다.

ⅱ) 본 발명의 정제 방법은 HPV의 L1 단백질이 발현된 형질전환 숙주세포의 세포 파쇄물에 환원제를 첨가한 후, 또는 환원제 첨가하여 가열 및 냉각(heating and chilling) 처리를 추가적으로 행한 후, 크로마토그래피를 통해 L1 단백질을 정제하는 것에 특징이 있다.

ⅲ) 본 발명의 정제 방법에 의하면, HPV L1 단백질의 정제 순도를 크게 향상시킬 수 있다.

ⅳ) 본 발명의 정제방법에 의해 정제된 HPV L1 단백질의 VLP는 양질의 구조를 형성하며 면역원성이 매우 뛰어나다.

본 발명은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) L1 단백질을 고순도 및 고효율로 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 정제 방법에 의하면, HPV L1 단백질의 정제 순도를 크게 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라, 정제된 HPV L1 단백질의 VLP는 본래 HPV 비리온에 보다 더 유사한 구조를 형성함으로써 면역원성이 매우 뛰어나다.

도 1은 인유두종바이러스의 바이러스 유사입자를 정제하기 위한 선행 문헌의 방법과(이하 "T-1" 방법으로 기재함) 본 발명의 방법(이하 "T-5"방법으로도 기재함)의 과정을 보여준다. T-1 방법에 관한 선행문헌은 아래와 같다.
(선행 문헌 1) Kim HJ, Kim SY, Lim SJ, Kim JY, Lee SJ, et al. (2010) One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 70: 68-74.
(선행 문헌 2) Kim HJ, Lim SJ, Kim JY, Kim SY, Kim H-J (2009) A method for removing contaminating protein during purification of human papillomavirus type 18 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Arch Pharm Res 32: 1759-1766.
(선행 문헌 3) 등록특허, 자궁경부암 백신, 출원번호: 10-2011-0137242 (2011.12.19), 등록번호: 1011780560000 (2012.08.21)
(선행 문헌 4) 등록특허, 자궁경부암 백신, 출원번호(출원일):10-2009-0099982 (2009.10.20), 등록번호(등록일): 1011819070000 (2012.09.05)
T-5 방법을 위해 HPV L1 단백질을 발현시킨 숙주세포 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 파쇄한 후 환원제를 첨가하였다. 환원제를 처리한 후 가열 및 냉각(heating and chilling) 과정을 거치게하여 불순물을 제거하였다. 상기 불순물을 제거한 세포 파쇄액에 포함된 L1 단백질은 헤파린 크로마토그래피(heparin chromatography)를 통해 1차 정제하였다. 1차 정제된 L1 단백질은 2차 헤파린 크로마토그래피를 추가적으로 수행하여 고 순도로 정제하였다.
T-1 방법을 위해 상기 사카로마이세스 세레비지애 파쇄물 내 L1 단백질은 암모니움 설페이트 침전(ammonium sulfate precipitation)을 통해 회수되었다. 회수된 분획 내 불순물은 침전물 제거과정(removal of precipitated contaminants)을 통해 제거되었다. 이들 과정을 거친 파쇄물 내 L1 단백질은 헤파린 크로마토그래피를 통해 정제되었다.
도 2는 T-5 방법에 의한 정제 결과에 관한 것으로, L1 단백질 발현 숙주세포의 파쇄물에 대해 투석을 행하고, 환원제를 처리한 후 가열 및 냉각 과정을 거치고, 1차 헤파린 크로마토그래피를 행한 후, SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 1차 헤파린 크로마토그래피를 행한 후에 고순도의 HPV L1 단백질이 회수되었음을 보여준다. LS는 헤파린 수지에 로딩된 파쇄액(loading sample)을 가리키고, FT는 헤파린 수지에 결합되지 않고 흘러나온 분획(flow-through)을 가리킨다. W는 헤파린 수지를 세척하는 단계에서 흘러나온 분획(wash)이며, E는 1M NaCl이 포함된 완충액으로 HPV L1 단백질을 용출시킨 분획 (elution)을 의미한다.
도 3은 T-5 방법에 의한 정제 결과에 관한 것으로, HPV L1 단백질 발현 숙주세포의 파쇄물에 대해 투석을 행하지 않고, 세포 파쇄물에 대해 직접 환원제를 처리한 후 가열 및 냉각 과정을 거치고, 1차 헤파린 크로마토그래피를 행하고, SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 도 2에서의 결과와 유사하게, 1차 헤파린 크로마토그래피를 행한 후에 역시 고순도의 HPV L1 단백질이 회수되었다. LS, FT, W 및 E는 도 2에서와 설명된 바와 동일하다.
도 4a는 T-5 방법에 의한 정제 결과에 관한 것으로, HPV L1 단백질 발현 숙주세포의 파쇄물에 환원제를 처리한 후 가열 및 냉각 과정을 거치고, 1차 헤파린 크로마토그래피를 행하고, 2차 헤파린 크로마토그래피를 행하고, SDS-PAGE로 확인한 결과이다. LS와 FT는 도 2에서 설명된 바와 동일하다. SDS-PAGE 사진 상부에 표기된 3 부터 18 까지의 숫자는 NaCl에 의한 경사구배(linear gradient) 용출 시 회수된 각각의 분획 숫자를 의미한다.
도 4b는 상기 2차 헤파린 크로마토그래피의 프로파일(profile)을 보여준다. 도 4a의 SDS-PAGE의 FT(flow-through)에서는 단백질 밴드가 검출되지 않았지만, 도 4b에서는 FT(flow-through)에서 많은 양의 불순물이 흘러나오는 것이 확인되었다. 따라서 도 4b의 결과는 2차 헤파린 크로마토그래피를 통해 상당양의 불순물이 제거되었음을 보여준다.
도 5는 T-1 방법의 헤파린 크로마토그래피의 SDS-PAGE 결과이다. 헤파린 크로마토그래피 전 샘플의 처리는 도 1에 나타난 바와 같이 진행되었다. LS는 loading sample을 의미한다. 헤파린 수지에 결합한 단백질은 NaCl의 경사구배(linear gradient) 증가에 의한 방법으로 용출되었다. 경사구배 용출은 0.325 M NaCl부터 2 M NaCl까지 진행되었다. SDS-PAGE 결과 상단의 숫자는 용출 분획의 숫자를 의미한다. 분획 11 - 14에서 L1 단백질이 고순도로 용출됨을 보여준다.
도 6a는 종래의 방법(이하 "T-1" 방법으로도 기재함)과 본 발명의 T-5 방법으로 정제된 VLP의 순도를 SDS-PAGE를 통해 비교한 결과이다. "T-1 HPV 16 VLP"는 종래의 공지된 방법[Kim et al. (2010) Protein Expr Purif 70: 68-74; Kim et al. (2009) Arch Pharm Res 32: 1759-1766]을 사용하여 정제된 결과이며, "T-5 HPV 16 VLP"는 본 발명의 방법에 따라 정제된 결과이다. HPV L1 단백질의 SDS-PAGE 분석을 위해 단백질 정량을 실시한 후 웰당 500 ng, 250 ng, 125 ng, 62 ng의 단백질을 로딩하였다. 독립적으로 2회 반복 실험하였고, 각각 패널 A와 B로 제시하였다. 2회 실험 결과 모두 T-5 HPV 16 VLP의 L1 단백질 밴드의 강도가 T-1 HPV 16 VLP의 것 보다 월등히 높게 나타났다.
도 6b는 도 6a의 2회 실험에서 확인된 T-1 HPV 16 VLP와 T-5 HPV 16 VLP의 L1 단백질 밴드 강도를 그래프로 표시한 결과이다. 결과는 평균±표준편차로 나타내었으며 웰당 500 ng이 로딩된 T-5 HPV 16 VLP의 L1 단백질 밴드의 강도를 100%로 하여 계산하였다. 이 결과는 T-5 방법으로 정제된 VLP의 순도가 T-1 방법으로 정제된 VLP의 순도보다 월등히 우수함을 보여준다.
도 7은 T-1 HPV 16 VLP의 L1 단백질 밴드의 강도가 T-5 HPV 16 VLP의 L1 단백질 밴드의 강도와 동일하게 나타나도록 로딩하여 SDS-PAGE를 진행한 결과이다.
도 8은 T-1 HPV16 VLP와 T-5 HPV 16 VLP의 전자현미경 분석 결과를 보여준다. T-1 HPV 16 VLP는 20 - 50 nm의 크기로 확인된 반면, T-5 HPV16 VLP는 40 - 65 nm의 크기로 확인되었다. 이는 T-5 HPV 16 VLP의 크기가 원래 HPV가 가지는 크기(50 - 60 nm)에 더 가깝다는 것을 의미한다[29, 30].
도 9 및 도 10은 다이나믹 광산란 (dynamic light scattering, DLS) 분석 결과이다. 다이나믹 광산란 분석은 VLP가 용액에 존재할 때의 크기를 측정한다. VLP의 용액 내 크기 분포는 DLS-700(도 9)과 ELS-Z2(도 10) 시스템을 사용하여 분석하였다. 도 9와 도 10의 결과에서 볼 수 있듯이 두 VLP 입자의 크기별 분포는 다른 것으로 나타났다. 이 결과는 T-5 HPV 16 VLP의 물리적 특성이 T-1 HPV16 VLP와 상이함을 보여 준다.
도 11은 T-1 HPV 16 L1 VLP와 T-5 HPV16 L1 VLP에 대한 단클론 항체들의 반응성을 보여준다. 항-HPV 16 L1 단클론 항체 반응성 조사를 위해 이미 공지된 단클론 항체인 H16.V5와 H16.E70을 사용하였다. 두 항체에 대한 VLP의 반응성의 증가는 면역원성의 증가와 밀접한 연관이 있는 것으로 알려져 있다 [26, 32-34]. T-5 HPV 16 VLP의 H16.V5와 H16.E70 항체에 대한 반응성은 T-1 HPV 16 VLP의 두 항체에 대한 반응성 보다 월등히 높은 것으로 확인되었다.
도 12는 T-1 HPV16 L1 VLP와 T-5 HPV16 L1 VLP의 면역원성을 분석한 결과이다. 면역원성 비교를 위해 각 1 ng의 VLP는 200 μg의 aluminium hydroxide와 같이 마우스에 피하로 투여되었다. 면역은 2주 간격 4회 실시하였다. 3차와 4차 면역 10일 후 혈청으로부터 항-HPV16 L1 IgG 항체역가를 측정하였다. 항-HPV16 L1 IgG 항체역가 측정결과 T-5 HPV16 L1 VLP가 T-1 HPV16 L1 VLP보다 10배 이상 높은 수준으로 항-HPV16 L1 IgG를 유도함을 확인하였다.
도 13은 도 12에서 실시된 면역에서 4차 면역 후 채혈된 혈청의 항-HPV16 중화항체 활성을 측정한 결과를 보여준다. T-5 HPV16 L1 VLP로 면역한 마우스 혈청의 중화 활성은 78%인 반면 T-1 HPV16 L1 VLP로 면역한 마우스 혈청의 중화 활성은 33%로 나타났다.
도 14는 세포 파쇄액에 아무런 처리도 하지 않은 조건(non-treatment), 환원제를 처리한 조건(β-ME), 환원제 처리 후 가열 및 냉각 과정을 거친 조건(β-ME + heating and chilling)에서 정제한 HPV L1 단백질의 순도를 비교한 결과이다. 상기 각 조건을 거친 시료를 1차 헤파린 크로마토그래피를 행하여 용출시키고, 용출된 분획으로부터 동일한 부피(5, 2.5, 1.2 μL)의 단백질을 취하고 젤에 로딩하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅(western blotting)을 행하였다. 도 14의 결과로부터 환원제 처리 후 가열 및 냉각 과정을 거친 조건(T-5, β-ME + heating and chilling)의 HPV L1 단백질의 순도가 다른 조건에 비해 월등히 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 15는 세포 파쇄액에 아무런 처리도 하지 않은 조건(non-treatment), 환원제를 처리한 조건(β-ME), 환원제 처리 후 가열 및 냉각 과정을 거친 조건(T-5, β-ME + heating and chilling)에서 정제한 HPV L1 단백질의 순도를 비교한 결과이다. 상기 각 조건을 거친 시료를 1차 헤파린 크로마토그래피를 행하여 용출시키고, 용출된 분획으로부터 동일한 양의 단백질 (1, 0.5, 0.25 μg)을 취하고 젤에 로딩하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅(western blotting)을 행하였다. 도 15의 결과로부터 환원제 처리 후 가열 및 냉각 과정을 거친 조건(T-5, β-ME + heating and chilling)의 HPV L1 단백질의 순도가 다른 조건에 비해 월등히 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 16은 세포 파쇄액에 아무런 처리도 하지 않은 조건 (non-treatment), 환원제를 처리하지 않고 가열 및 냉각 과정만을 거친 조건 (heating and chilling), 환원제 처리 후 가열 및 냉각과정을 거친 조건 (T-5, β-ME + heating and chilling)에서 정제한 HPV L1 단백질의 순도를 비교한 결과이다. 상기 각 조건을 거친 시료를 1차 헤파린 크로마토그래피에서 용출된 분획으로부터 동일한 부피의 단백질(5, 2.5, 1.2 μL)을 취하고 젤에 로딩하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅(western blotting)을 행하였다. 도 16의 결과로부터 환원제 처리 후 가열 및 냉각 과정을 거친 조건(T-5, β-ME + heating and chilling)의 HPV L1 단백질의 회수율 및 순도가 다른 조건에 비해 월등히 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 17은 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography SEC)에 의한 정제 방법, 암모니움 설페이트 침전에 의한 정제 방법(ammonium sulfate precipitation), 환원제 처리 후 가열/냉각하는 방법(T-5, β-ME + heating & chilling)에 의한 정제 방법의 과정을 보여준다. 크기 배제 크로마토그래피, 암모니움 설페이트 침전 방법의 효과를 환원제 처리 후 가열/냉각하는 방법의 효과와 비교하기 위해 T-5 정제 방법 중 환원제 처리 후 가열/냉각하는 단계를 크기 배제 크로마토그래피 또는 암모니움 설페이트 침전 방법으로 대체하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 암모니움 설페이트 침전에 의한 방법(T-1 방법 기반의 방법)은 기존에 공지된 선행문헌의 방법에 기반한다.
1) 크기 배제 크로마토그래피 방법의 선행 문헌
(선행 문헌 1) Park MA, Kim HJ, Kim H-J (2008) Optimum conditions for production and purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 59: 175-181.
(선행 문헌 2) 등록특허, 인유두종바이러스 바이러스 유사 입자의 생산 및 정제 방법, 출원번호: 10-2008-0026586 (2008.03.21), 등록번호: 1009591450000 (2010.05.13)
2) 암모니움 설페이트 크로마토그래피 방법의 선행 문헌
(선행 문헌 1) Kim HJ, Kim SY, Lim SJ, Kim JY, Lee SJ, et al. (2010) One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 70: 68-74.
(선행 문헌 2) Kim HJ, Lim SJ, Kim JY, Kim SY, Kim H-J (2009) A method for removing contaminating protein during purification of human papillomavirus type 18 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Arch Pharm Res 32: 1759-1766.
(선행 문헌 3) 등록특허, 자궁경부암 백신, 출원번호: 102011-0137242 (2011.12.19), 등록번호: 1011780560000 (2012.08.21)
(선행 문헌 4) 등록특허, 자궁경부암 백신, 출원번호(출원일):102009-0099982 (2009.10.20), 등록번호(등록일): 1011819070000 (2012.09.05)
도 18은 암모니움 설페이트 침전 방법, 환원제만 처리한 방법(β-ME), 환원제 처리 후 가열/냉각하는 정제 방법(T-5, β-ME + heating & chilling)간의 차이를 보여준다. 각 정제 조건별 1차 크로마토그래피 용출 분획의 순도를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅으로 분석하였다. 그 결과 β-ME 처리 후 가열/냉각하는 방법으로부터 회수된 L1 단백질의 순도가 가장 우수함을 확인하였다.
도 19는 암모니움 설페이트 침전(ammonium sulfate precipitation)에 의한 정제 방법과 환원제 처리 후 가열/냉각하는 정제 방법(T-5, β-ME + heating & chilling)의 1차 헤파린 크로마토그래피 결과를 보여준다. 도 18의 결과와 마찬가지로 환원제 처리 후 가열/냉각하는 방법의 경우 1차 헤파린 크로마토그래피에서 용출된 L1 단백질이 높은 순도를 나타낸 반면 암모니움 설페이트 침전 후 1차 헤파린 크로마토그래피를 행한 경우 용출된 L1 단백질 분획에 다수의 불순물 단백질을 포함하고 있음을 확인할 수 있었다. 웨스턴 블럿 분석 결과 암모니움 설페이트 침전법으로 정제한 경우 헤파린 크로마토그래피에서 L1 단백질이 칼럼 수지에 부착되지 않고 FT(flow-through)로 흘러나온 반면 환원제 처리한 후 가열/냉각 과정을 거친 경우 FT로 L1 단백질이 흘러나오지 않음이 확인되었다.
도 20은 크기배제 크로마토그래피를 통한 정제 방법(SEC 방법)에서 크기배제 크로마토그래피의 용출 분획을 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이다. 분획 3번에서 9번 사이에 L1 단백질이 높은 순도로 용출되어 이 구간의 분획을 모아 비교 분석에 사용하였다.
도 21은 크기배제 크로마토그래피 방법(SEC), 암모니움 설페이트 침전에 의한 방법(ammonium sulfate precipitation)과 환원제 처리 후 가열/냉각하는 정제 방법(T-5, β-ME + heating & chilling)의 1차 크로마토그래피의 L1 단백질 용출 분획을 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿으로 분석한 결과이다. 1차 크로마토그래피(1^st chromatography)를 위해 각 조건의 샘플은 도 17에 나타나 있는 바와 같이 준비되었다. 크기 배제 크로마토그래피 방법(SEC)을 위해 세포파쇄액은 암모니움 설페이트 침전을 거치고 크기 배제 크로마토그래피(1차 크로마토그래피)를 수행하였다. 암모니움 설페이트 침전법에 의한 방법(ammonium sulfate precipitation)을 위해 세포 파쇄물은 암모니움 설페이트 침전된 후 침전물 제거과정을 거치고 헤파린 크로마토그래피(1차 크로마토그래피)를 거쳤다. 환원제 처리 후 가열/냉각하는 정제 방법을 위해 세포 파쇄액은 환원제 처리 후 가열 냉각 과정을 거치고 헤파린 크로마토그래피(1차 크로마토그래피)를 거쳤다. 1차 크로마토그래피의 용출 분획 분석을 위해 각 조건의 분획을 동일부피(0.35, 0.17, 0.08 μL)로 하여 로딩하였다. 분석결과 환원제 처리 후 가열/냉각하는 방법의 L1 단백질 순도가 가장 우수한 것으로 나타났다.
도 22는 도 21의 1차 크로마토그래피 L1 단백질 용출 분획을 2차 크로마토그래피로 추가 정제한 결과이다. 2차 크로마토그래피 후 L1 단백질 용출 분획간의 차이를 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿으로 분석한 결과이다. 분석을 위해 각 정제 조건 용출분획을 동일 부피(2, 1, 0.5 μL)로 로딩하였다. 분석결과 환원제 처리 후 가열/냉각하는 정제 방법이 L1 단백질 회수율 면에서 가장 우수한 것으로 나타났다.
도 23은 도 22에서 최종 정제된 L1 단백질들의 단클론 항체(H16.E70) 반응성을 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)로 분석한 결과이다. 각 정제 조건으로부터 회수된 HPV16 L1 VLP를 동일양으로 코팅하기 위해 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제 방법(SEC), 암모니움 설페이트 침전에 의한 정제 방법(ammonium sulfate precipitation), 환원제 처리 후 가열/냉각하는 정제 방법(β-ME + heating & chilling)으로부터 얻어진 L1 단백질을 동일 농도가 되게 맞추어 준 후 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿으로 L1 단백질의 양을 확인하였다(도 23A). 이후 ELISA를 진행하여 H16.E70에 대한 각 HPV16 L1 VLP의 반응성을 확인하였다(도 23B). 그 결과 환원제 처리 후 가열/냉각하는 조건에 의해 정제된 HPV16 L1 VLP (T-5 HPV16 L1 VLP)의 H16.E70에 대한 반응성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 이는 환원제 처리 후 가열/냉각하는 정제방법을 통해 얻어진 HPV16 L1 VLP의 구조적 특성이 가장 우수함을 나타낸다[26].
도 24는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제 방법(SEC), 암모니움 설페이트 침전에 의한 정제 방법, 환원제 처리 후 가열/냉각하는 정제 방법의 면역원성을 분석한 결과이다. 각 HPV16 L1 VLP를 마우스에 면역하기 전 L1 단백질의 양은 도 23A에서 확인한 것처럼 동일하게 맞추었다. 1 ng의 HPV16 L1 VLP는 200 μg의 aluminium hydroxide와 혼합된 후 마우스에 피하로 투여되었다. 마우스 면역은 2주 간격 4회 진행되었다. 4회 면역 후 마우스 혈청을 취한 후 기존에 공지된 슈도바이러스 기반의 중화항체 활성 측정법을 통해[26] 각 마우스 그룹의 중화활성을 측정하였다. 그 결과 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제를 통해 얻어진 HPV16 L1 VLP를 면역한 마우스의 중화활성은 16%, 암모니움 설페이트 침전에 의한 정제를 통해 얻어진 HPV16 L1 VLP를 면역한 마우스의 중화활성은 28%, 환원제 처리 후 가열/냉각하는 정제를 통해 얻어진 HPV16 L1 VLP를 면역한 마우스의 중화활성은 50%로 나타났다. 따라서 환원제 처리 후 가열/냉각하는 정제법을 통해 얻어진 HPV16 L1 VLP의 중화항체 유도능이 가장 우수한 것으로 나타났다.
도 25는 T-5 방법으로 HPV16 L1 단백질 정제 시 환원제 처리 후 가열 냉각하는 과정에 있어 가열 온도에 따른 효과를 보여준다. 각 가열 온도 조건으로 세포 파쇄물을 15분간 가열하고 냉각한 후 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 패널 A는 가열 온도에 따른 단백질 농도 측정 결과를 보여준다. 패널 B는 각 가열 온도 조건의 샘플을 동일 부피로 로딩하여 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 패널 C는 각 가열 온도 조건의 샘플을 동일 부피로 로딩하여 웨스턴 블럿으로 L1 단백질을 분석한 결과이다. 패널 D는 각 가열 온도 조건의 샘플을 단백질 정량 한 후 동일양의 단백질을 로딩하여 웨스턴 블럿으로 L1 단백질을 분석한 결과이다. 따라서 패널 D는 L1 단백질의 순도를 나타낸다. 이들 결과를 통해 HPV16 L1 단백질은 60℃ 가열 조건 까지 세포파쇄물에 남아있음을 확인하였고 35-50℃로 가열시 L1 단백질의 순도가 높아짐을 확인하였다.
도 26은 T-5 방법으로 HPV18 L1 단백질 정제 시 환원제 처리 후 가열 냉각하는 과정에 있어 가열 온도에 따른 효과를 보여준다. 각 패널에 대한 세부 내용은 도 25와 동일하다. 이들 결과를 통해 HPV18 L1 단백질은 65℃ 가열 조건까지 세포 파쇄물에 남아있음을 확인하였고 45-55℃로 가열시 L1 단백질의 순도가 높아짐을 확인하였다.
도 27은 T-5 방법을 통한 HPV16 L1 VLP 정제에 있어, 환원제 처리 후 가열, 냉각하는 과정에서 냉각 과정의 효과를 보여준다. 패널 A는 45℃와 50℃로 가열한 후 냉각 과정을 거친 샘플과(heating & chilling) 냉각 과정을 거치지 않은 샘플(heating)의 단백질 농도 차이를 보여준다. 패널 B는 45℃로 가열한 후 냉각과정을 거친 샘플과 냉각과정을 거치지 않은 샘플의 웨스턴 블럿상의 L1 단백질 양 분석 결과를 보여준다. 패널 C는 50℃로 가열한 후 냉각과정을 거친 샘플과 냉각과정을 거치지 않은 샘플의 웨스턴 블럿상 L1 단백질 양 분석 결과를 보여준다. 이들 결과는 냉각과정을 통해 불순물 단백질들이 침전됨으로써 제거될 수 있음을 보여주며 이 과정에서 L1 단백질의 손실은 일어나지 않음을 보여준다.
도 28은 T-5 방법을 통한 HPV16 L1 VLP 정제에 있어, 환원제 처리 후 가열, 냉각하는 과정에서 냉각 과정의 효과를 보여준다. 45℃로 가열 후 냉각 과정을 거친 샘플(HC)과 냉각과정을 거치지 않은 샘플(H)의 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿 상의 차이를 보여준다. SDS-PAGE와 웨스턴 블럿 결과 냉각 과정을 거친 후 L1 단백질은 감소되지 않는 것으로 확인되었지만 불순물 단백질은 감소가 일어나는 것으로 확인되었다.
도 29는 도 28의 SDS-PAGE 상에서 보여지는 불순물 단백질 protein 1, protein 2, protein 3의 밴드 강도를 수치로서 나타낸 결과이다. 이들 결과는 냉각과정을 통해 불순물 단백질의 농도가 감소됨을 보여준다.
도 30은 HPV16 L1 VLP와 HPV18 L1 VLP를 60℃ 가열 조건으로 하여 T-5 방법을 통해 정제한 결과이다. 패널 A는 1차 크로마토그래피의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. LS는 칼럼에 로딩한 샘플, FT는 칼럼에 결합하지 않고 흘러나온 샘플을 나타낸다. Elution은 칼럼 수지에 결합한 후 용출된 분획을 의미한다. 화살표는 HPV16 L1과 HPV18 L1의 위치를 나타낸다. 패널 B는 1차와 2차 크로마토그래피를 거처 최종 정제된 HPV16 L1과 HPV18 L1을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 패널 C는 최종 정제산물을 투과 전자현미경으로 분석한 결과이다. 전자 현미경 분석 결과 정제된 L1 단백질이 바이러스 유사입자를 이루는 것으로 확인되었다.
도 31은 T-5 방법으로 HPV18 L1을 1차 크로마토그래피로 정제한 결과를 보여준다. 각 분획은 SDS-PAGE를 통해 분석되었다. LS는 로딩 샘플, FT는 flow-through, W는 칼럼을 세척한 분획, E는 칼럼에 부착된 단백질을 1 M NaCl을 포함하는 완충액으로 흘려주어 용출시킨 분획을 의미한다. HPV18 L1은 환원제 처리 후 가열/냉각 과정을 거친 후 크로마토그래피 진행 시 높은 순도로 정제될 수 있음을 보여준다.
도 32는 도 31의 1차 크로마토그래피에서 용출된 HPV18 L1 단백질 분획을 2차 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. LS, FT, W는 상기에서 설명한 바와 같다. 칼럼 수지에 부착된 단백질들은 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 M NaCl이 포함된 완충액을 흘려주어 순차적으로 용출시켰다. HPV18 L1 단백질은 0.9 M과 1 M NaCl 분획에서 용출되는 것으로 확인되었다.
도 33은 T-5 방법으로 정제된 HPV18 L1 VLP의 다이나믹 광산란 분석 결과를 보여준다. T-5 HPV18 L1 VLP의 다이나믹 광산란은 ELS-Z2 시스템을 사용하여 분석하였다.
도 34는 HPV58 L1을 T-5 정제 방법으로 정제한 결과들을 보여준다. 패널 A는 1차 크로마토그래피에서 용출된 L1 단백질 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 패널 B는 2차 크로마토그래피의 SDS-PAGE 분석 결과이다. 패널 B의 세부 내용은 도 32에 기술한 바와 같다.
도 35는 T-5 정제 방법으로 1차 2차 크로마토그래피를 거처 최종적으로 회수된 HPV58 L1 단백질의 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿 결과를 보여준다. HPV58 L1은 환원제 처리 후 가열 냉각과정을 거치는 방법을 통해 성공적으로 정제될 수 있음을 보여준다.
도 36은 HPV16 L1 단백질을 암호화하는 DNA 서열(HPV16 L1 NG2)을 보여준다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 HPV16 L1 NG2가 삽입된 발현벡로 형질전환되었다. 형질 전환된 세포는 HPV16 L1 단백질의 발현, 정제를 위해 사용되었다. HPV16 L1 핵산 서열은 GenBank KC792555.1로 공지되었다.
도 37은 HPV18 L1 단백질을 암호화하는 DNA 서열(HPV18 L1 NG3)을 보여준다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 HPV18 L1 NG3이 삽입된 발현벡로 형질전환되었다. 형질 전환된 세포는 HPV18 L1 단백질의 발현, 정제를 위해 사용되었다. HPV18 L1 핵산 서열은 GenBank KC792556.1로 공지되었다.
도 38은 HPV16 L1 NG2와 HPV18 L1 NG3가 암호화하는 HPV16 L1과 HPV18 L1의 아미노산 서열을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

실험방법

1. 세포배양

HPV L1 단백질을 발현하는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) Y2805는 기존에 공지된 방법에 따라 배양하였다[25]. HPV L1 단백질 발현 세포주는 우라실(uracil)이 없는 합성 완전 배지(complete medium)인 "SD-ura"에 도말하고 4일 또는 5일간 배양하였다. 단일 콜로니를 SD-ura 액체 배지에 접종하여 2일간 배양하였다. GAL10 프로모터로부터 HPV 16 L1 단백질을 발현시키기 위해, 배양한 형질전환 세포를 1% 효모 추출물(Duchefa, Netherlands), 2% 펩톤(Duchefa), 7% 글루코오스(Duchefa) 및 1% 갈락토오스(Duchefa)를 포함하는 YPDG 배지에서 배양하였다. 배양 완료 후 배양한 세포를 원심분리하여 배양액을 제거하고, PBS(phosphate-buffered saline)을 사용하여 세척하였다. 세척한 세포는 다시 원심분리를 행하여 회수하고, 단백질 정제 전까지 -70℃에 보관하였다.

2. T-1 방법을 통한 HPV VLP의 정제

T-1 방법을 통한 HPV VLP의 정제는 기존에 공지된 방법에 따라 세포 파쇄액 내 단백질을 암모늄설페이트 침전을 통해 pellet으로 회수한 후 헤파린 크로마토그래피(Heparin chromatography)를 통해 정제하였다[22,23,24]. 헤파린 크로마토그래피를 위해 HiTrapTM Heparin HP (GE Healthcare, USA) 수지를 사용하였다. 암모니움설페이트와 침전물 제거과정을 거친 샘플을 0.325 M NaCl이 포함된 PBST로 투석하였으며 0.325 M NaCl이 포함된 PBST로 평형화된 헤파린 수지에 통과시켰다. 헤파린 수지는 수지 부피의 5배 부피의 완충액(0.325 M NaCl 포함 PBST)을 흘려주어 세척하였으며 수지와 결합한 단백질은 NaCl이 0.325부터 2 M까지 경사구배로 증가하도록 하여 용출시켰다. 용출된 분획 중 HPV L1을 포함하는 분획을 SDS-PAGE 분석을 통해 선별하여 모았다. 정제 완료된 HPV L1 VLP는 0.33 M NaCl이 포함된 PBS + 0.01 Tween 80 (PBST)에 대해 투석하였다.

3. T-5 방법을 통한 HPV VLP 의 정제 (β- me + heating & chilling method )

3-1. 세포 파쇄, 환원제 처리, 및 가열 / 냉각

배양한 HPV L1 단백질 발현 세포는 파쇄 완충액(10 mM sodium phosphate dibasic, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80 pH 7.2)에 혼합시켰다. 상기 세포 혼합액을 다시 0.5 mm 유리 비드(glass bead, Biospec Product, USA)와 혼합한 후 볼텍스(vortex)하여 세포를 파쇄하였다. 세포 잔여물은 12000xg로 15분간 원심분리하여 제거하였다. 칼럼 크로마토그래피를 행하기 전의 세포 파쇄물은 두 가지의 서로 다른 방법으로 준비하였다. 첫 번째 방법은 세포 파쇄물에 최종 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol, β-ME, Sigma, USA)의 농도가 4-6 중량%가 되도록 β-ME를 첨가한 후 pH를 7.0 - 7.3으로 조정하는 방법이다. 두 번째 방법은 세포 파쇄물을 상기 파쇄 완충액(10 mM sodium phosphate dibasic, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80 pH 7.2)에 대해 4 - 6 시간 투석한 후에, 최종 β-ME 농도가 4 - 6%가 되도록 β-ME를 첨가하는 방법이다. 이어서, β-ME가 첨가된 세포 파쇄물을 25 - 65℃의 항온 수조에 30 - 50 분간 둔 후에, 얼음에 30분 - 3시간 또는 4℃에 16시간 두어 냉각시켰다. 냉각된 세포 파쇄물을 12000xg로 15 분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다.

3-2. 1차 크로마토그래피

환원제 처리 후 가열 및 냉각과정을 거쳐 준비한 세포 파쇄물을 헤파린 수지 (HiTrapTM Heparin HP, GE Healthcare, USA 또는 POROS^® 50 HE, Applied Biosystems, USA) 또는 양이온교환 수지 (POROS^® XS, Applied Biosystems, USA)에 통과시켰다. 헤파린 수지 또는 양이온교환 수지는 세포 파쇄물 통과 전에 4 - 6%의 β-ME가 포함된 세포 파쇄 완충액(10 mM sodium phosphate dibasic, 0.15 - 0.48 M NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80 pH 7.2)으로 평형화 시켰다. 세포 파쇄물을 로딩한 후에 헤파린/양이온교환 수지를 세척 완충액 (0.35 - 0.48 M NaCl과 5% β-ME 이 포함된 PBST)을 칼럼 부피의 5배 이상으로 흘려주어 세척하였다. 헤파린 수지와 결합된 HPV L1 단백질은 1 M NaCl, 5% β-ME가 포함된 PBST를 흘려주어 용출시켜 주거나 5% β-ME가 포함된 PBST에 최종 NaCl 농도가 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 1 M이 포함되게 준비한 완충용액을 순차적으로 흘려주어 용출시켰다. L1 단백질을 포함하는 용출액은 Amicon Ultra (Millipore, USA)를 사용하여 농축한 후 1 M NaCl, 0.2 M 암모늄설페이트가 포함된 PBST에 20 - 24 시간 동안 투석을 행하였다.

3-3. 2차 크로마토그래피

상기 1차 크로마토그래피 후에 투석 완료한 용액을 0.3 - 0.42 M NaCl이 포함된 PBST에 대해 추가로 투석한 후에, 헤파린 수지 또는 양이온교환 수지에 통과시켜 2차 크로마토그래피를 행하였다. 2차 크로마토그래피를 위해 사용된 헤파린 수지와 양이온교환수지는 1차 크로마토그래피에서 사용된 수지와 동일하다. 헤파린/양이온교환 수지는 시료를 로딩하기 전에 0.42 M NaCl이 포함된 PBST로 평형화 시켰다. 시료를 로딩하고, 수지에 컬럼 부피의 5배 이상의 0.42 M NaCl이 포함된 PBST를 흘려주어 세척하였다. 헤파린/양이온교환 수지와 결합한 HPV L1 단백질은 NaCl의 농도가 0.42 에서 2.0 M까지 상승하도록 하여 용출시키거나, NaCl 농도가 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 1 M이 포함되게 준비한 완충용액을 순차적으로 흘려주어 용출시켰다. 크로마토그래피의 용출 패턴은 280 nm의 파장으로 측정하고, Autochro-2000 프로그램(Young Lin Instrument Co., South Korea)을 사용하여 수집하였다. L1 단백질이 용출된 분획을 회수한 후 Amicon Ultra (Millipore, USA)를 사용하여 농축하고, 0.33 M NaCl 이 포함된 PBST에 투석하였다.

4. 비처리 정제 방법(non-treatment method)

비처리 정제를 위해 세포는 상기에서 기술한 것과 동일한 방법으로 파쇄되어 준비되었다. 준비된 세포 파쇄액은 완충액(10 mM sodium phosphate dibasic, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80 pH 7.2)에 4 - 6시간 투석하였다. 투석된 샘플의 침전물은 12000xg로 10분간 원심분리하여 제거한 후 상기 완충액으로 평형화된 헤파린 수지에 통과시켰다. 그 후 헤파린 수지를 0.42 M NaCl이 포함된 PBST를 수지 부피의 5배로 흘려주어 세척하였고, 세척 후 헤파린 수지에 결합한 단백질들은 1 M NaCl이 포함된 PBST를 흘려주어 용출시켰다.

5. β- me 처리 정제 방법 (β- me method )

β-me 처리 정제 방법은 상기 T-5 정제 방법에서 heating & chilling 과정을 생략한 정제방법이다. β-me 처리 정제 방법을 위해 HPV L1 발현 세포는 상기에서 기술한 바와 같이 준비하였으며 완충용액(10 mM sodium phosphate dibasic, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80 pH 7.2)에 4 - 6시간 투석하였다. 투석된 파쇄액에 β-me을 최종 4 - 6%가 되게 첨가하였다. 헤파린 수지는 4 - 6% β-me가 포함된 완충액(10 mM sodium phosphate dibasic, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80 pH 7.2)으로 평형화 시킨 후 준비된 세포 파쇄액을 통과시켰다. 세포 파쇄액을 통과시킨 헤파린 수지를 4 - 6% β-me와 0.42 M NaCl을 포함하는 PBST를 수지 부피의 5배로 흘려주어 세척시켰다. 헤파린 수지에 부착된 단백질들은 4 - 6% β-me와 1 M NaCl을 포함하는 PBST를 흘려주어 용출시켰다.

6. Heating & chilling 처리 정제 방법 (heating & chilling method)

Heating & chilling 처리 정제 방법은 T-5 정제 방법에서 β-me를 처리를 생략한 정제방법이다. HPV L1 단백질 정제를 위해 세포는 파쇄 후 완충용액(10 mM sodium phosphate dibasic, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80 pH 7.2)에 4 - 6시간 투석하였다. 투석된 파쇄액을 37 - 45℃에서 30분간 처리하고, 얼음에 30분-3시간 두어 냉각시켰다. 가열 냉각 과정을 거친 파쇄액의 침전물을 12000xg로 10분간 원심분리하여 제거한 후 완충액(10 mM sodium phosphate dibasic, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80 pH 7.2)으로 평형화된 헤파린 수지에 통과시켰다. 이후 헤파린 수지를 0.42 M NaCl이 포함된 PBST를 수지 부피의 5배로 흘려주어 세척하였으며 세척 후 수지와 결합한 단백질들은 1 M NaCl이 포함된 PBST를 흘려주어 용출시켰다.

7. 크기배제 크로마토그래피를 이용한 정제( size - exclusion chromatography , SEC )

크기배제 크로마토그래피(SEC)를 이용한 정제는 기존에 공지된 방법(20)을 약간 수정하여 진행하였다. HPV L1 발현 효모를 상기와 동일하게 파쇄하여 준비한 후 45% 암모니움 설페이트가 포화되게 하여 단백질을 침전시켰다. 침전된 단백질을 PBST로 재 분산(resuspension)시킨 후 완충액에(10 mM sodium phosphate dibasic, 0.65M NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80 pH 7.2) 4시간 투석시켰다. 투석된 분획은 크기배제 크로마토그래피를 1차 크로마토그래피로 하여 정제가 진행되었다. 상기 준비된 샘플은 0.65 M NaCl이 포함된 PBST로 평형화된 Superose-6 resin (1.5 x 32 cm, GE Healthcare, USA)에 통과시켰다(1차 크로마토그래피)[36]. 크기배제 크로마토그래피의 용출 패턴은 280 nm의 파장으로 측정하고, Autochro-2000 프로그램(Young Lin Instrument Co., South Korea)을 사용하여 수집하였다.

HPV L1을 포함하는 분획을 모은 후 0.33 M NaCl이 포함된 PBST에 투석하였고, 0.33 M NaCl이 포함된 PBST로 평형화된 헤파린 수지에 통과시켰다(2차 크로마토그래피). 이후 헤파린 수지를 0.42 M이 포함된 PBST를 수지 부피의 5배로 흘려주어 세척하였다. 세척 후 헤파린 수지에 결합한 단백질들은 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 1 M NaCl이 포함된 PBST를 순차적으로 흘려주어 용출시켰다.

8. 암모니움설페이트 침전을 이용한 정제 (ammonium sulfate precipitation method)

암모니움 설페이트 침전을 이용한 정제는 상기의 T-5 정제 방법에서 β-me 처리 후 heating & chilling 과정을 ammonium sulfate 침전으로 대체한 방법이다. 크로마토그래피 단계 전 암모니움 설페이트 침전과 침전물 제거 과정은 기존에 공지된 방법에 따라 진행하였다(22, 24). 세포 파쇄물 단백질을 45% 암모니움설페이트로 포화시켜 침전시킨 후 침전 불순물(removal of precipitated contaminants)을 제거하는 과정을 거쳤다. 크로마토그래피 전 상기에서 준비된 샘플을 완충액에 (10 mM sodium phosphate dibasic, 150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 0.01% Tween 80 pH 7.2) 4시간 투석시켰다. 헤파린 수지를 상기 완충액과 동일한 완충액으로 평형화 시킨 후 투석된 샘플을 통과시켰다(1차 크로마토그래피). 이후 0.42 M NaCl이 포함된 PBST를 수지 부피의 5배로 흘려주어 세척한 후 1 M NaCl이 포함된 PBST를 흘려주어 결합된 단백질을 용출시켰다. 2차 크로마토 그래피를 위해 용출된 분획을 0.33 M NaCl이 포함된 완충액에 투석시켰다. 이 후 과정은 크기배제 크로마토그래피 방법의 2차 크로마토그래피 방법과 동일하게 진행되었다.

9. 단백질 정량

단백질의 농도는 우혈청알부민(BSA; Pierce, USA)을 표준물질로 하여 단백질 정량 키트(Bio-Rad Laboratories, USA)를 사용하여 측정하였다.

10. SDS - PAGE 및 웨스턴 블로팅

SDS-PAGE는 Laemmli의 방법에 따라 행하였고[35], 웨스턴 블로팅은 공지된 방법을 사용하여 행하였다[26]. SDS-PAGE 젤 상에서 전개된 단백질은 은 염색을 실시하여 시각화 하였다. 1차 항체로서 토끼의 항-HPV 16 L1 혈청과, 2차 항체로서 염소 HRP-컨쥬게이트된 항-토끼 IgG 폴리클로날 항체(HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG, Bethyl, USA)를 사용하여 HPV L1 단백질을 검출하였다[26]. 밴드의 강도는 National Institute Health (NIH) open source software Image J으로 측정하여, 공지된 방법[25]에 따라 산출하였다.

11. 전자현미경 분석

정제한 HPV 16 L1 단백질을 카본-코팅된 그리드에 흡착시킨 후, 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid) 또는 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하였다. 투과 전자 현미경 사진은 150,000X의 최종배율에서 TEM200CX (JEOL, Japan)를 사용하여 촬영하였다[25].

12. HPV VLP 의 다이나믹 광산란 분석

HPV VLP의 다이나믹 광산란(dynamic light scattering, DLS) 분석은 이미 공지된 방법에 따라 행하였다[26]. 정제한 HPV VLP는 0.13 M NaCl이 포함된 PBST를 사용하여 0.13 mg/ml로 희석한 후 DLS-700 시스템 (Otsuka Electronics, Japan) 또는 ELS-Z2 system (Otsuka Electronics, Japan)을 사용하여 분석하였다.

13. HPV VLP 에 대한 단클론 항체 반응성 분석

HPV VLP에 대한 단클론 항체의 반응성은 기존에 공지된 방법에 따라 행하였다[26]. 96-웰 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 플레이트를 정제한 HPV VLP로 400 ng 씩 코팅하였다. 각기 다른 방법으로 정제된 HPV L1 VLP는 코팅 전 SDS-PAGE 분석을 통해 각 HPV L1 VLP의 L1 단백질 양이 정량적으로 동일함을 확인한 후 코팅되었다. VLP가 코팅된 플레이트는 3% 우혈청알부민이 포함된 PBS-T₂₀ (0.05% Tween 20을 포함하는 PBS)로 상온에서 두 시간 동안 블로킹하였다. 항-HPV16 L1 단클론 항체인 H16.V5와 H16.E70을 0.3% 우혈청알부민이 포함된 PBS-T₂₀을 사용하여 0.25 μg/ml, 0.12 μg/ml, 0.06 μg/ml, 0.03 μg/ml, 0.015 μg/ml이 되게 희석시킨 후, 코팅된 HPV VLP와 37℃에서 90분간 반응시켰다. PBS-T로 3회 세척한 후 HRP 부착된 항-생쥐 IgG 항체 (Bethyl, USA)를 0.3% 우혈청알부민이 포함된 PBS-T₂₀에 1:5000 비율로 희석하여 37℃에서 40분간 플레이트에서 반응시켰다. 플레이트를 PBS-T₂₀으로 5회 세척 후 발색반응을 진행하였다. 발색은 o-phenylenediamine (Sigma, USA)를 사용하여 진행하였으며 흡광도는 492 nm에서 측정하였다.

14. 정제된 HPV L1 VLP 의 마우스 면역 및 면역원성 평가

HPV16 L1의 면역원성 평가를 위해 6주령 Balb/c 마우스를 사용하였다 (Orientbio. south Korea). HPV L1 단백질을 마우스에 면역하기 위해 상기에서 공지된 단백질 정량법 및 SDS-PAGE 방법에 따라 L1 단백질의 순도 및 농도를 확인하였다. 마우스는 피하주사를 통해 면역되었으며 2주 간격으로 4회 면역되었다. 1회 면역을 위해 1 ng의 L1 단백질과 200 μg aluminium hydroxide (Sigma, USA)가 피하로 투여되었다. 1 ng의 단백질양은 T-5 HPV16 L1 VLP의 정량 결과를 기준으로 한다. 다른 방법으로 정제된 HPV16 L1 단백질은 T-5 HP16 L1을 표준품으로 하여 정량되었다. 3차, 4차 면역 10일 후 마우스 꼬리 정맥을 통해 혈액을 채취하였다. 혈청을 회수하기 위해 마우스 혈액을 12000xg로 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하였으며 항체역가 측정 및 중화항체 활성 평가전 까지 -70℃에 보관하였다. 마우스 혈액 내 항-HPV16 L1 IgG 항체 역가와 항-HPV16 중화활성을 공지된 방법에 따라 Enzyme-linked immnosorbent assay (ELISA)와 pseudovirus-based neutralization assay를 통해 측정하였다 [26].

15. 통계 분석

그룹간의 차이의 통계학적 유의성은 two tailed Student's t-test를 사용하여 결정하였다. P < 0.05를 유의한 차이로 간주하였다.

실험결과

1. T-5 정제: 1차 크로마토그래피에 의한 L1 단백질 정제 결과

T-5 정제 과정은 도 1에 나타나있다. 1차 헤파린 크로마토그래피를 위한 로딩 시료는 투석 과정을 거친 경우와 투석 과정을 거치지 않은 경우로 나누어 준비하였다. 투석 과정을 거친 경우는 세포파쇄 후 세포 파쇄 완충액에 투석을 실시한 후 환원제(β-ME)를 첨가하였고, 투석과정을 거치지 않은 경우는 세포 파쇄물에 직접 환원제를 첨가하였다. 이 후 두 시료는 모두 37 - 42℃로 온도를 상승시켜 30 - 50 분간 방치한 후 얼음에 두어 0℃ 부근으로 냉각시켰다. 가열 / 냉각 과정으로 침전된 불순물을 제거한 후 헤파린 크로마토그래피를 실시하였다. 도 2와 도 3은 투석과정을 거친 시료와 투석과정을 거치지 않은 시료의 헤파린 크로마토그래피 결과를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 두 경우의 시료 모두 L1 단백질이 높은 순도로 회수되었음을 알 수 있다.

2. T-5 정제: 2차 크로마토그래피에 의한 L1 단백질 정제 결과

1차 헤파린 크로마토그래피를 통해 회수된 L1 단백질 용출 분획은 2차 헤파린 크로마토그래피를 통해 추가 정제하였다. 도 4a는 2차 헤파린 크로마토그래피를 행하여 정제한 결과를 보여준다. 헤파린 수지와 결합한 L1 단백질은 NaCl의 경사 구배 증가에 의해 용출되었다(도 4b). SDS-PAGE 확인 결과 헤파린 수지에 결합되지 않고 흘러나온 L1 단백질은 FT (flow-through) 분획에서 관찰되지 않았다. 헤파린 수지에 결합한 L1 단백질은 NaCl의 경사구배 (linear gradient) 증가에 의해 용출되는 것이 확인되었다(분획 11 - 17). 도 4b는 280 nm의 파장으로 헤파린 크로마토그래피 시에 용출되는 물질을 검출한 결과이다. SDS-PAGE 결과에서는 FT(flow-through)로 용출되는 단백질이 관찰되지 않았으나, 280 nm에서 측정 시 FT(flow-through)로 상당한 양의 불순물이 흘러나오는 것이 확인되었다. 따라서 2차 헤파린 크로마토그래피를 통해 L1 단백질 이외의 불순물들이 제거되었음을 확인하였다.

3. T-1 과 T-5 방법에 의해 분리된 HPV 16 L1 VLP 의 순도 분석

2차 헤파린 크로마토그래피에서 회수된 L1 단백질 (T-5 HPV16 L1 VLP)의 순도를 기존에 공지된 방법[22. 24]으로 정제된 L1 단백질 (T-1 HPV16 L1 VLP)의 순도와 비교하였다. T-1 정제 방법은 도 1에 나타나 있으며, T-1 정제 방법의 헤파린 크로마토그래피의 SDS-PAGE 분석 결과는 도 5에 나타나 있다. 도 5에서 LS는 칼럼에 로딩한 샘플(loading sample)을 의미한다. T-1 방법의 헤파린 크로마토그래피에서 L1 단백질은 NaCl 농도를 0.325 M부터 2 M 까지 경사 구배로 상승하게 하여 용출시켰으며 L1 단백질은 분획 11에서 15번 사이에 용출되었다. 도 6a는 T-1과 T-5 방법으로 정제된 HPV16 L1 VLP의 순도를 비교한 결과이다. VLP의 순도 분석을 위해 독립된 2회의 정제 실험을 실시하여 패널 A와 패널 B의 결과로 제시하였다. T-1 HPV16 L1 VLP와 T-5 HPV16 L1 VLP는 단백질 정량 후 웰 당 500 ng, 250 ng, 125 ng, 62 ng을 로딩하였으며, SDS-PAGE 전개 후 은 염색을 통해 시각화하였다. 두 VLP 모두에서 55 kDa의 L1 밴드가 높은 순도로 관찰되었다. 그러나, T-5 HPV 16 VLP의 L1 밴드의 강도가 T-1 HPV 16 VLP의 L1 밴드 강도 보다 강하게 나타났다. 도 6b는 도 6a의 2회 실험 결과 값을 평균±표준편차로 나타낸 결과이다. 결과 산출을 위해 500 ng이 로딩된 T-5 HPV 16 VLP의 L1 밴드의 강도를 100%로 하였다. 이들 결과에 의해 T-5 HPV16 L1 VLP의 순도가 T-1 HPV16 L1 VLP의 순도보다 높음을 확인할 수 있었다.

후술하는 HPV L1 단백질의 전자현미경분석, 다이나믹 광산란 분석 및 단클론 항체 반응성 분석을 위해, T-1 HPV 16 VLP의 L1 양을 T-5 HPV16 VLP의 L1양과 동일하게 조정하였다. 도 7은 두 VLP의 L1 양을 동일하게 조정한 후 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.

4. T-1과 T-5 정제 방법으로 분리된 HPV16 L1 VLP의 전자 현미경 분석

도 8은 T-1 HPV 16 VLP와 T-5 HPV 16 VLP를 전자현미경으로 분석한 결과이다. T-5 HPV16 L1 VLP의 크기는 40 - 65 nm로 확인된 반면, T-1 HPV16 L1 VLP의 크기는 20 - 50 nm로 확인되었다. 따라서 T-5 방법으로 정제된 HPV16 L1 VLP의 형태는 T-1 방법으로 정제된 HPV16 L1 VLP와 형태와 구분되는 특징을 가지고 있었다. 자연적으로 발생하는 HPV 비리온(virion)의 크기는 50 - 60 nm인 것으로 알려져 있다[29,30]. 따라서 이러한 결과는 T-5 HPV 16 VLP의 크기가 원래 HPV가 가지는 크기에 더 가깝다는 것을 의미한다.

5. T-1과 T-5 정제 방법으로 분리된 HPV16 L1 VLP의 다이나믹 광산란 분석

다이나믹 광산란 분석은 VLP가 용액 내 존재하는 상태를 조사할 때 널리 쓰이고 있다[31]. 도 9는 정제한 T-1 HPV16 L1 VLP와 T-5 HPV 16 L1 VLP를 DLS-700 시스템을 사용하여 분석한 대표 결과를 보여준다. 도 10은 각 HPV16 L1 VLP를 ELS-Z2 시스템을 사용하여 분석한 대표 결과를 보여준다. VLP 크기는 평균±표준편차로 나타내었다. 도 9에서, T-1 HPV16 L1 VLP는 29 - 438 nm 사이에 분포한 반면, T-5 HPV16 L1 VLP는 17 - 233 nm 사이에 분포하는 것으로 나타났다. 따라서 두 VLP의 크기에 따른 유체 분포는 상이하게 나타났다. 도 10A는 각 VLP의 다이나믹 광산란의 Intensity profile을 보여준다. 도 10B는 각 VLP의 다분산 지표(polydispersity index, P.I.)를 나타낸다. 도 10A에서도 마찬가지로 T-1 HPV16 L1 VLP는 T-5 HPV16 L1 VLP보다 넓은 범위의 크기 분포를 나타내는 것으로 확인되었다. T-5 HPV16 L1 VLP의 다분산성(P.I.)은 T-1 HPV16 L1 VLP보다 낮은 것으로 확인되었다(도 10B). 결론적으로 T-5 HPV16 L1 VLP는 T-1 HPV16 L1 VLP에 비해 용액 내에서 균일한 형태로 존재하는 것으로 확인되었다.

6. T-1과 T-5 방법으로 정제된 HPV16 L1 VLP에 대한 단클론 항체 반응성 조사

HPV 16 VLP에 대한 항-HPV 16 L1 단클론 항체의 반응성은 HPV16 L1 VLP의 구조적 우수성 및 중화항체 유도능을 평가하는데 중요한 척도로 사용되고 있다[26, 32-34]. 이와 같은 평가를 위해 가장 보편적으로 사용되고 있는 항체인 H16.V5와 H16.E70을 사용하여 T-1 HPV16 L1 VLP와 T-5 HPV16 L1 VLP의 반응성을 비교하였다 [26]. 두 항체에 대한 반응성의 증가는 면역원성의 증가와 밀접한 연관이 있다 [26, 36]. 도 11에서 보여지는 바와 같이 두 항체에 대한 반응성은 T-5 HPV16 VLP가 T-1 HPV16 VLP보다 월등히 우수한 것으로 확인되었다.

7. T-1과 T-5 방법으로 정제된 HPV16 L1 VLP의 면역원성 비교

T-1 HPV16 L1 VLP의 L1 단백질 순도는 T-5 HPV16 L1 VLP보다 낮은 것으로 확인되었다(도 6a, 도 6b). 두 HPV16 L1 VLP를 동일한 양으로 면역하기 위해 T-1 HPV16 L1 VLP의 양을 T-5 HPV16 L1 VLP양에 조정하고 SDS-PAGE로 L1 단백질의 양을 확인하였다(도 7). 1회 면역을 위해 1 ng의 HPV16 L1 VLP를 aluminium hydroxide와 같이 투여하였다. 1 ng의 단백질의 양은 T-5 HPV16 L1 VLP의 단백질 정량값(Bradford 단백질 정량 값)을 기준으로 하였다. T-1과 T-5 정제 방법으로 정제된 HPV16 L1 VLP를 마우스 피하로 2주 간격 4회 투여하였다. 3차 면역과 4차 면역을 실시한 후 혈청 내 항-HPV16 L1 IgG역가를 측정한 결과를 도 12에 나타나있다. 3차 면역 후 T-5 HPV16 L1 VLP 면역 그룹은 450의 중간 값을 나타낸 반면 T-1 HPV16 L1 VLP 면역 그룹은 0의 중간값(media value)을 나타내었다. 4차 면역 후 T-5 HPV16 L1 VLP 면역 그룹은 4050의 중간 값을 나타낸 반면 T-1 HPV16 L1 VLP 면역 그룹은 300의 중간 값을 나타내었다. 따라서 T-5 HPV16 L1 VLP는 T-1 HPV16 L1 VLP보다 10배 이상 높은 항-HPV16 L1 IgG 항체역가를 유도하는 것으로 확인되었다.

4차 면역 후 마우스 혈청 내 항-HPV16 중화항체 활성을 측정하였다 (도 13). T-5 HPV16 L1 VLP 면역그룹은 78%의 중화활성(median value)을 나타낸 반면 T-1 HPV16 L1 VLP 면역그룹은 33%의 중화활성을 나타내었다. 이러한 두 그룹 간에 중화활성은 유의한 차이를 나타내었다.

8. 환원제 처리 후 가열 / 냉각 처리의 효과 조사( 비처리 , β- ME 처리, heating & chilling , β- ME 처리 후 heating & chilling 조건의 비교)

상기의 결과들에서 보는 바와 같이 첫 번째 헤파린 크로마토그래피를 통해 고순도의 L1 단백질을 얻을 수 있었다. 환원제 처리 후 가열/냉각 과정이 L1 단백질의 순도에 미치는 영향을 구체적으로 조사하기 위해 두 가지 종류의 실험을 진행하였다. 첫 번째 실험에서는 아무런 처리도 하지 않은 조건 (비처리 정제 방법, non-treatment), 환원제만 처리한 조건 (β-ME 처리 정제 방법, β-ME treatment method), 및 환원제 처리 후 가열 / 냉각 과정을 거친 조건 (T-5 정제 방법. β-ME + heating & chilling)간에 헤파린 크로마토그래피 후의 L1 단백질 순도를 비교하였다. 두 번째 실험에서는 아무런 처리도 하지 않은 조건 (비처리 정제 방법, non-treatment), 가열 / 냉각 처리만 한 조건 (heating & chilling 처리 정제 방법), 및 환원제 처리 후 가열 / 냉각 과정을 거친 조건 (T-5, β-ME + heating & chilling)간에 헤파린 크로마토그래피 후의 L1 단백질 순도를 비교하였다.

표 1 및 표 2는 첫 번째 및 두 번째 실험에서 헤파린 크로마토그래피를 위한 각 조건의 로딩 샘플의 단백질 양과 불순물 단백질의 제거율을 나타낸 결과이다. 표 1에서 보는 바와 같이 아무런 처리도 하지 않은 조건과 환원제만을 처리한 조건은 헤파린 크로마토그래피 전 24 - 25%의 단백질이 제거된 반면 환원제를 처리한 후 가열 / 냉각을 거친 조건은 66%의 단백질이 제거되었다. 표 2에서도 마찬가지로 아무런 처리도 하지 않은 조건과 가열 / 냉각만을 거친 조건에서는 헤파린 크로마토그래피 전 34 - 40%의 단백질이 제거된 반면 환원제 처리 후 가열 / 냉각을 거친 조건은 70%의 단백질이 제거되었음이 확인되었다.

조건	세포 파쇄물내의 단백질의 양(mg)	1차 헤파린 크로마토그래피 로딩 시료내의 단백질의 양 (mg)	오염물 제거율(%)
비처리 (Non-treatment)	196	147	25
β-ME	196	150	24
β-ME + 가열 및 냉각	196	67	66

조건	세포 파쇄물내의 단백질의 양(mg)	1차 헤파린 크로마토그래피 로딩 시료내의 단백질의 양 (mg)	오염물 제거율(%)
비처리 (Non-treatment)	290	172	40
가열	290	193	34
β-ME + 가열 및 냉각	290	89	70

도 14는 1차 헤파린 크로마토그래피 후 회수된 분획을 동일 부피 (5 μL, 2.5 μL, 1.2 μL)로 로딩하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과이다. 아무런 처리도 하지 않은 경우 L1 단백질의 회수된 양은 크게 떨어지는 것으로 확인되었다. 또한 회수액 내 불순물 단백질을 많이 포함하고 있어 순도 또한 매우 낮은 것으로 확인되었다. 환원제 β-ME만을 처리한 조건에서는 회수된 L1 단백질의 양은 증가하였으나 회수액 내 불순물 단백질을 많이 포함하고 있어 역시 순도가 좋지 않음이 확인되었다. 반면, 환원제 β-ME 처리 후 가열 / 냉각 과정을 거친 경우는 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅에서 L1 단백질이 주요 밴드로 확인되어 L1 단백질의 순도뿐만 아니라 회수율 또한 우수함이 확인되었다.

각 조건에서 회수된 L1 단백질의 순도를 비교하기 위해 회수액내의 단백질을 정량한 후 동일한 양 (1 μg, 0.5 μg, 0.25 μg)의 단백질을 로딩하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅으로 확인하였다 (도 15). 결과에서 볼 수 있듯이 L1 단백질의 순도는 β-ME 첨가 후 가열 / 냉각 과정을 거친 조건에서 가장 높음이 확인되었다.

도 16은 아무런 처리도 하지 않은 조건(non-treatment), 가열 냉각만 한 조건(heating & chilling), 환원제 처리 후 가열 냉각한 조건(T-5 정제 방법. β-ME + heating & chilling)의 1차 헤파린 크로마토그래피의 용출 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 1차 헤파린 크로마토그래피 후 회수된 분획을 동일 부피 (5 μL, 2.5 μL, 1.2 μL)로 로딩하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과, 아무런 처리도 하지 않은 경우와 가열 및 냉각 과정만 거친 조건에서 L1 단백질의 회수된 양은 크게 떨어지는 것으로 확인되었다. 또한 회수액 내 불순물 단백질을 많이 포함하고 있어 순도 또한 매우 낮은 것으로 확인되었다. 반면, 환원제 β-ME 처리 후 가열 / 냉각 과정을 거친 경우는 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅에서 L1 단백질이 주요 밴드로 확인되어 L1 단백질의 순도 뿐만 아니라 회수율 또한 우수함이 확인되었다.

결론적으로 환원제 처리만 한 경우 또는 가열 및 냉각만 한 경우에서는 높은 순도의 L1 단백질을 얻을 수 없었으며, L1 단백질을 높은 순도로 정제하기 위해서는 환원제 처리 후 가열 / 냉각을 거치는 것이 필수적임을 확인하였다.

9. 환원제 처리 후 가열 / 냉각 처리의 효과 조사( 암모니움 설페이트 침전, β- ME 처리, β- ME 처리 후 heating & chilling 조건의 비교)

암모니움 설페이트 침전에 의한 정제 과정은 도 17에 나타나 있다. 암모니움 설페이트 침전에 의한 정제 방법은 T-5 정제 방법 중 β-ME 처리 후 heating & chilling 과정을 ammonium sulfate 침전으로 대체한 것으로, 도 1의 T-1 정제 방법과 구분된다. β-ME 처리(β-ME method)에 의한 방법은 상기 실시예에 나타나 있는 것과 동일하다. 1차 크로마토그래피 후 칼럼에 결합한 단백질의 용출 분획을 동일한 부피(10, 5, 2.5 μL)로 로딩하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅으로 분석하였다(도 18, 도 19). β-ME 처리 후 가열 냉각을 거친 조건의 경우 L1 단백질이 우수한 순도를 나타낸 반면 암모니움 설페이트 침전 방법과 β-ME만 처리한 방법은 낮은 L1 단백질 순도를 나타내었다(도 18). 암모니움 설페이트 침전방법과 β-ME 처리 후 가열 냉각한 방법의 1차 크로마토그래피 결과를 분석한 결과 β-ME 처리 후 가열 냉각한 조건의 경우 로딩 샘플(LS) 내 L1 단백질이 모두 칼럼에 결합한 반면 암모니움 설페이트 침전을 사용한 방법은 로딩 샘플(LS)의 L1 단백질의 일부가 칼럼에 결합하지 못하고 FT(flow-through)로 흘러나오는 것으로 확인되었다(도 19).

10. 환원제 처리 후 가열 / 냉각 처리의 효과 조사(크기배제 크로마토그래피, 암모니움 설페이트 침전, β- ME 처리 후 heating & chilling 조건의 비교)

크기배제 크로마토그래피에 의한 정제(SEC) 과정은 도 17에 나타나있다. 크기 배제 크로마토그래피의 방법은 기존에 공지된 방법에 기초하였다[20]. 암모니움 설페이트 침전에 의한 방법은 상기에 기술한 방법과 동일하다. 크기배제 크로마토그래피에 의한 대표 결과는 도 20에 나타나 있다. 크기배제 크로마토그래피 후 HPV16 L1 단백질은 분획 3 - 9에서 높은 순도로 용출되었고 이 분획을 1차 크로마토그래피에 의한 L1 단백질 순도 비교에 사용하였다(도 21). 크기배제 크로마토그래피(SEC), 암모니움 설페이트 침전 방법, β-ME 처리 후 가열 냉각(β-ME + heating & chilling)한 방법에 의한 1차 크로마토그래피 용출 분획 내 L1 단백질의 순도를 비교하였다(도 21). 각 방법의 용출 분획을 동일한 부피(7 ml)로 맞춘 후 동일한 부피의 샘플(0.35, 0.17, 0.08 μL)을 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 분석을 위해 로딩하였다. 1차 크로마토그래피의 용출 분획 중 β-ME 처리 후 가열 냉각한 조건의 L1 단백질 순도가 가장 높은 것으로 확인되었다.

도 22는 도 21의 1차 크로마토그래피 용출 분획을 2차 크로마토그래피를 통해 정제한 후 SDS-PAGE, 웨스턴 블럿으로 분석한 결과이다. 각 조건의 2차 크로마토그래피 용출 분획을 동일 부피(2, 1, 0.5 μL)로 로딩하였다. 2차 크로마토그래피 용출분획 분석 결과 β-ME 처리 후 가열 냉각한 조건의 L1 단백질 회수율이 가장 높은 것으로 확인되었다.

각 조건으로 정제한 HPV16 L1 VLP의 항원성 분석을 위해 HPV16 중화 단클론 항체인 H16.E70과의 반응성을 ELISA로 비교하였다(도 23b). 동일양의 HPV16 L1 VLP를 코팅하기 위해 항원 코팅 전 크기배제 크로마토그래피 기반의 정제방법(SEC)과 암모니움 설페이트 침전법으로 정제된 HPV16 L1 VLP의 농도를 β-ME 처리 후 가열 냉각 과정을 통해 정제된 HPV16 L1 VLP (T-5 HPV16 L1 VLP)의 농도와 동일하게 맞추었다. 농도 조정 후 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿으로 3종류의 VLP간에 L1 단백질의 양차이가 없음을 확인하였다(도 23a). H16.E70과 반응성 분석 결과 β-ME 처리 후 가열 냉각한 조건(T-5)으로 정제한 HPV16 L1 VLP의 반응성이 가장 우수한 것으로 나타났다(도 23b).

결론적으로 β-ME 처리 후 가열 냉각과정을 거치는 방법에 의해 회수된 바이러스 유사입자(VLP)는 크기 배제 크로마토그래피, 암모니움 설페이트 침전 방법과 같은 기존에 공지되어 사용되고 있던 방법으로 정제, 회수한 바이러스 유사입자에 비해 우수한 순도를 나타내었고 회수된 VLP의 항원적 특성 또한 우수한 것으로 나타났다.

11. 크기 배제 크로마토그래피 기반 방법(SEC), 암모니움 설페이트 침전법, 환원제 처리 후 가열 냉각하는 방법(T-5)으로 정제된 HPV16 L1 VLP 의 면역원성 비교

도 23에서 최종 정제된 3종류의 HPV16 L1 VLP를 마우스 피하로 1 ng씩 면역하였다. 면역 전 도 23A에서 보는 바와 같이 각 VLP의 농도는 동일하게 맞추어졌다. 마우스 면역 시 1 ng의 VLP는 200 μg의 aluminium hydroxide와 혼합하여 투여되었다. 면역은 2주 간격 4회 진행되었다. 4회 면역한 마우스 혈청 내 중화활성을 측정한 결과, 크기 배제 크로마토그래피 기반 방법(SEC)으로 정제한 HPV16 L1 VLP로 면역된 그룹의 경우 16%의 중화활성을 나타내었고, 암모니움 설페이트 침전법으로 정제한 HPV16 L1 VLP로 면역된 그룹의 경우 28%의 중화활성을 나타내었다. 한편, 환원제 처리 후 가열 냉각 과정을 거치는 방법(T-5)으로 정제된 HPV16 L1 VLP로 면역된 그룹의 경우 50%중화 활성을 나타내었다. 결론적으로, T-5 방법으로 정제된 HPV16 L1 VLP는 공지된 방법에 의해 정제된 HPV16 L1 VLP보다 우수한 면역원성을 나타내었다.

12. 환원제 처리 후 가열 온도에 따른 효과 분석

도 25와 도 26은 HPV16 L1 VLP와 HPV18 L1 VLP 정제에 있어 환원제 처리 후 가열 온도에 따른 불순물 단백질 제거 효과를 보여준다. 세포 파쇄물에 β-ME를 처리한 후 상온(starting), 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65℃ 조건으로 15분간 반응시켰다. 이후 이들 샘플을 얼음에 1시간 방치한 후 12000xg로 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 침전물이 제거된 각 샘플의 단백질 농도를 측정한 결과를 패널 A에 나타내었다. 각 샘플을 동일 부피로 로딩하여 SDS-PAGE 상에서 분석한 결과를 패널 B에 나타내었다. 각 샘플을 동일 부피로 로딩한 후 웨스턴 블로팅으로 L1 단백질의 양을 확인한 결과를 패널 C에 나타내었다. 각 샘플의 단백질 농도를 측정한 후 동일한 양의 단백질을 로딩하고 웨스턴 블로팅으로 L1 단백질의 양을 확인 한 결과를 패널 D에 나타내었다. 따라서 패널 D의 웨스턴 블로팅 결과는 L1 단백질의 순도를 나타낸다.

가열에 따른 불순물 단백질 제거율은 35℃ 이상에서 크게 증가한 것으로 나타났다(도 25A, 도 25B 및 도 26A, 도 26B). 도 25C와 도 26C에서 볼 수 있듯이 HPV16 L1 단백질은 65℃ 및 60℃ 가열조건에서도 세포 파쇄액에 남아 있었고 HPV18 L1 단백질은 60℃ 가열조건에서도 세포 파쇄액에 남아 있는 것으로 확인되었다. 각 온도 조건별 L1 단백질의 순도를 분석한 결과 HPV16 L1 단백질의 순도는 35-50℃ 조건에서 우수한 것으로 나타났고(도 25D) HPV18 L1의 단백질 순도는 45-60℃ 조건에서 가장 우수한 것으로 나타났다(도 26D). 따라서 35-60℃ 조건으로 세포 파쇄액을 가열시 불순물 단백질은 제거되는 반면 L1 단백질은 안정성을 유지하는 것으로 확인되었다. 환원제 처리 조건하에서 이러한 L1 단백질의 열 안정성은 가열을 통해 불순물 단백질로부터 L1 단백질의 분리를 용이하게 할 수 있다.

13. 환원제 처리 후 가열, 냉각 과정에서 냉각에 따른 효과 분석

도 27은 환원제 처리 후 가열만 한 조건(heating), 가열 후 냉각과정을 거친 조건(heating & chilling)을 비교한 결과를 보여준다. 도 27에서 패널 A는 가열만 한 조건, 가열 후 냉각과정을 거친 조건의 단백질 농도를 측정 결과를 보여준다. 패널 B와 C는 45℃와 50℃ 가열 조건에서 가열만 한 조건(heating), 가열 후 냉각과정을 거친 조건(heating and chilling)의 웨스턴 블럿 결과를 보여준다. 웨스턴 블럿 분석을 위해 각 조건의 샘플은 동일 부피(5, 2.5, 1.25 μL)로 로딩하였다. 패널 A에서 볼 수 있듯이 가열만 한 조건보다 가열 후 냉각과정을 거친 조건에서 전체 단백질 양이 줄어든 것으로 확인되었다. 반면 L1 단백질은 감소를 보이지 않는 것으로 확인되었다(도 27B, 도 27C). 이들 결과는 냉각과정을 통해 L1 단백질의 순도가 증가됨을 보여준다.

도 28은 환원제 처리 후 가열만 한 조건(H), 가열 후 냉각과정을 거친 조건(HC)을 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 보여준다. 정확한 분석을 위해 각 샘플은 2.5 μL와 1.25 μL로 로딩하였다. 환원제 처리 후 가열만 한 조건에서는 protein 1, protein 2, protein 3등 불순물 단백질의 밴드 강도가 강하게 나타난 반면, 가열 후 냉각 과정을 거친 조건에서는 protein 1, protein 2, protein 3의 단백질 밴드 강도가 감소한 것으로 나타났다(도 28). 한편 L1 단백질의 양은 냉각과정에서 손실 되지 않은 것으로 나타났다(도 28 웨스턴 블럿 결과). 가열만 한 조건(H only)과 가열 후 냉각을 거친 조건(HC)의 불순물 단백질 protein 1, protein 2, protein 3의 SDS-PAGE 상 밴드 강도는 도 29에 나타나 있다.

14. 60℃ 고온 처리에 따른 HPV16 L1 VLP , HPV18 L1 VLP 정제

HPV16 L1과 HPV18 L1을 발현하는 효모세포의 파쇄물에 환원제를 가한 후 60℃로 가열하고 냉각과정을 거쳐 VLP 정제를 시도하였다. 도 30의 패널 A는 1차 크로마토그래피의 SDS-PAGE 분석 결과이다. LS와 FT는 loading 샘플과 flow-through를 나타낸다. Elution은 L1 단백질이 용출된 분획을 의미한다. 패널 B는 2차 크로마토그래피 후 최종 산물의 SDS-PAGE로 분석 결과이다. 각 L1 단백질은 고순도로 정제되었다. 패널 C는 최종 정제 산물을 투과전자현미경을 통해 분석한 결과이다. 60℃로 가열 후 L1 단백질을 정제한 결과 바이러스 유사입자 모양을 형성하는 것으로 확인되었다.

15. T-5 방법을 통한 HPV18 L1 VLP의 정제

도 31은 T-5 방법으로 HPV18 L1 VLP를 정제 시 1차 크로마토그래피의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 1차 헤파린 크로마토그래피 전 환원제를 세포 파쇄물에 가한 후 45℃로 가열하고 얼음에 냉각시켰다. 도 31은 1차 헤파린 크로마토그래피를 통해 불순물 단백질이 효과적으로 제거되었음을 보여준다. 도 32는 2차 양이온 교환 크로마토그래피의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 2차 크로마토그래피에서 불순물은 0.6 M과 0.7 M NaCl을 포함하는 분획에서 용출되었고 L1 단백질은 0.9 M과 1 M NaCl을 포함하는 분획에서 용출되었다. 이로서 T-5 방법을 통해 HPV18 L1 단백질을 고순도로 정제할 수 있음을 확인하였다. 도 33은 최종 정제된 T-5 HPV18 L1 VLP의 다이나믹 광산란 분석 결과를 보여준다.

16. T-5 방법을 통한 HPV58 L1 VLP 정제

도 34A는 HPV58 L1 VLP를 T-5 방법으로 정제 시 1차 크로마토그래피를 통해 분리된 HPV58 L1 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 보여준다. 1차 크로마토그래피에서 HPV58 L1 단백질은 주요 밴드로 확인되었다. 도 34B는 HPV58 L1 VLP를 2차 크로마토그래피를 통해 분리한 결과를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. HPV58 L1 단백질은 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 1 M NaCl을 포함하는 분획 전반에 걸쳐 용출되었다. 도 35는 T-5 방법으로 최종 정제된 HPV58 L1 VLP를 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 보여준다. T-5 방법을 통해 HPV58 L1 VLP는 고순도로 정제되었음이 확인되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조문헌

1. Woodman CB, Collins SI, Young LS (2007) The natural history of cervical HPV infection: unresolved issues. Nat Rev Cancer 7: 11-22.

2. National Cancer Institute (2007) Women's Health Report, Fiscal Years 2005-2006. NCI Women's Health Report FY2005-2006.

3. Burk RD, Chen ZG, Van Doorslaer K (2009) Human Papillomaviruses: Genetic Basis of Carcinogenicity. Public Health Genomics 12: 281-290.

4. de Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU, zur Hausen H (2004) Classification of papillomaviruses. Virology 324: 17-27.

5. Clifford G, Franceschi S, Diaz M, Munoz N, Villa LL (2006) Chapter 3: HPV type-distribution in women with and without cervical neoplastic diseases. Vaccine 24 Suppl 3: S3/26-34.

6. Conway MJ, Meyers C (2009) Replication and assembly of human papillomaviruses. J Dent Res 88: 307-317.

7. Kim SN, Jeong HS, Park SN, Kim H-J (2007) Purification and immunogenicity study of human papillomavirus type 16 L1 protein in Saccharomyces cerevisiae. J Virol Methods 139: 24-30.

8. Li M, Cripe TP, Estes PA, Lyon MK, Rose RC, et al. (1997) Expression of the human papillomavirus type 11 L1 capsid protein in Escherichia coli: characterization of protein domains involved in DNA binding and capsid assembly. J Virol 71: 2988-2995.

9. Hanumantha Rao N, Baji Babu P, Rajendra L, Sriraman R, Pang YY, et al. (2011) Expression of codon optimized major capsid protein (L1) of human papillomavirus type 16 and 18 in Pichia pastoris; purification and characterization of the virus-like particles. Vaccine 29: 7326-7334.

10. Aires KA, Cianciarullo AM, Carneiro SM, Villa LL, Boccardo E, et al. (2006) Production of human papillomavirus type 16 L1 virus-like particles by recombinant Lactobacillus casei cells. Appl Environ Microbiol 72: 745-752.

11. Baek JO, Seo JW, Kim IH, Kim CH (2011) Production and purification of human papillomavirus type 33 L1 virus-like particles from Spodoptera frugiperda 9 cells using two-step column chromatography. Protein Expr Purif 75: 211-217.

12. Maclean J, Koekemoer M, Olivier AJ, Stewart D, Hitzeroth, II, et al. (2007) Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. J Gen Virol 88: 1460-1469.

13. Garland SM, Smith JS (2010) Human papillomavirus vaccines: current status and future prospects. Drugs 70: 1079-1098.

14. Madrid-Marina V, Torres-Poveda K, Lopez-Toledo G, Garcia-Carranca A (2009) Advantages and disadvantages of current prophylactic vaccines against HPV. Arch Med Res 40: 471-477.

15. National Cancer Institute Human Papillomavirus (HPV) Vaccines,

http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/prevention/HPV-vaccine.

16. Mukhopadhyay P, Paul B (2009) Introducing HPV Vaccine in Developing Countries - Addressing the Challenge. Indian J Community Med 34: 370-371.

17. Walsh G (2010) Biopharmaceutical benchmarks 2010. Nat Biotechnol 28: 917-924.

18. Vicente T, Roldao A, Peixoto C, Carrondo MJ, Alves PM (2011) Large-scale production and purification of VLP-based vaccines. J Invertebr Pathol 107 Suppl: S42-48.

19. Hofmann KJ, Cook JC, Joyce JG, Brown DR, Schultz LD, et al. (1995) Sequence determination of human papillomavirus type 6a and assembly of virus-like particles in Saccharomyces cerevisiae. Virology 209: 506-518.

20. Park MA, Kim HJ, Kim H-J (2008) Optimum conditions for production and purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 59: 175-181.

21. Cook JC (2003) Process for purifying human papillomavirus virus-like particles. Merck & Co., Inc.

22. Kim HJ, Kim SY, Lim SJ, Kim JY, Lee SJ, et al. (2010) One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 70: 68-74.

23. Kim HJ, Lee SJ, Kim H-J (2010) Optimizing the secondary structure of human papillomavirus type 16 L1 mRNA enhances L1 protein expression in Saccharomyces cerevisiae. J Biotechnol 150: 31-36.

24. Kim HJ, Lim SJ, Kim JY, Kim SY, Kim H-J (2009) A method for removing contaminating protein during purification of human papillomavirus type 18 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Arch Pharm Res 32: 1759-1766.

25. Kim HJ, Kwag HL, Jin Y, Kim H-J (2011) The composition of the carbon source and the time of cell harvest are critical determinants of the final yield of human papillomavirus type 16 L1 protein produced in Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 80: 52-60.

26. Kim HJ, Lim SJ, Kwag HL, Kim H-J (2012) The choice of resin-bound ligand affects the structure and immunogenicity of column-purified human papillomavirus type 16 virus-like particles. PLoS One 7: e35893.

27. Jin Y, Kim HJ, Yim GW, Tae Kim Y, Chang DY, et al. (2012) A single serum dilution enzyme-linked immunosorbent assay for determining anti-human papillomavirus (HPV) antibody titres in humans immunised with prophylactic HPV vaccines. J Pharm Biomed Anal 66: 352-355.

28. Han JE, Wui SR, Park SA, Lee NG, Kim KS, et al. (2012) Comparison of the immune responses to the CIA06-adjuvanted human papillomavirus L1 VLP vaccine with those against the licensed HPV vaccine Cervarix in mice. Vaccine 30: 4127-4134.

29. Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, Galloway DA (1994) Three-dimensional structure of vaccinia virus-produced human papillomavirus type 1 capsids. J Virol 68: 4503-4505.

30. Baker TS, Newcomb WW, Olson NH, Cowsert LM, Olson C, et al. (1991) Structures of bovine and human papillomaviruses. Analysis by cryoelectron microscopy and three-dimensional image reconstruction. Biophys J 60: 1445-1456.

31. Shi L, Sanyal G, Ni A, Luo Z, Doshna S, et al. (2005) Stabilization of human papillomavirus virus-like particles by non-ionic surfactants. J Pharm Sci 94: 1538-1551.

32. Ryding J, Dahlberg L, Wallen-Ohman M, Dillner J (2007) Deletion of a major neutralizing epitope of human papillomavirus type 16 virus-like particles. J Gen Virol 88: 792-802.

33. Culp TD, Spatz CM, Reed CA, Christensen ND (2007) Binding and neutralization efficiencies of monoclonal antibodies, Fab fragments, and scFv specific for L1 epitopes on the capsid of infectious HPV particles. Virology 361: 435-446.

34. White WI, Wilson SD, Palmer-Hill FJ, Woods RM, Ghim SJ, et al. (1999) Characterization of a major neutralizing epitope on human papillomavirus type 16 L1. J Virol 73: 4882-4889.

35. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

36. Chang DY, Kim HJ, Kim H-J (2012) Effects of downstream processing on structural integrity and immunogenicity in the manufacture of papillomavirus type 16 L1 virus-like particles, Biotechnol Bioprocess Eng 17: 755-763.

Claims

다음의 단계를 포함하는 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) L1 단백질의 정제 방법:
(a) HPV의 L1 단백질을 발현하는 형질전환 숙주세포를 배양한 후 배양된 숙주세포를 회수하여 파쇄하는 단계;
(b) 상기 숙주세포의 파쇄물에 환원제를 첨가하는 단계; 및
(c) 상기 환원제가 첨가된 숙주세포의 파쇄물로부터 크로마토그래피를 행하여 HPV L1 단백질을 정제하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계 이후, 상기 환원제가 첨가된 숙주세포의 파쇄물을 상온에서 유지시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, HPV L1 단백질의 정제 방법.
다음의 단계를 포함하는 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV) L1 단백질의 정제 방법:
(ⅰ) HPV의 L1 단백질을 발현하는 형질전환 숙주세포를 배양한 후 배양된 숙주세포를 회수하여 파쇄하는 단계;
(ⅱ) 상기 숙주세포의 파쇄물에 환원제를 첨가하는 단계;
(ⅲ) 상기 환원제가 첨가된 숙주세포의 파쇄물을 가열한 후 냉각시키는 단계; 및
(ⅳ) 상기 가열 및 냉각된 숙주세포의 파쇄물로부터 크로마토그래피를 행하여 HPV L1 단백질을 정제하는 단계.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 HPV는 HPV 타입 6a, HPV 타입 6b, HPV 타입 11, HPV 타입 16, HPV 타입 18, HPV 타입 30, HPV 타입 31, HPV 타입 33, HPV 타입 35, HPV 타입 39, HPV 타입 41, HPV 타입 42, HPV 타입 43, HPV 타입 44, HPV 타입 45, HPV 타입 51, HPV 타입 52, HPV 타입 54, HPV 타입 55, HPV 타입 56, HPV 타입 58, HPV 타입 68 및 HPV 타입 70으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 숙주세포는 박테리아, 효모세포, 곤충세포, 식물세포 또는 동물세포인 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 효모세포는 사카로마에세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia Pastoris), 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)인 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 환원제는 β-머캅토에탄올 (β-mercaptoethanol), DTT (dithiothreitol), 2-머캅토에틸아민-HCl(2-mercaptoethylamine-HCl), TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine], 시스테인-HCl(cystein-HCl)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 환원제는 β-머캅토에탄올 (β-mercaptoethanol) 또는 DTT (dithiothreitol)인 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)은 숙주세포의 파쇄물에서의 최종 농도가 0.1 중량% 이상이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 DTT (dithiothreitol)는 숙주세포의 파쇄물에서의 최종 농도가 2 mM 이상이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 단계 (ⅲ)에서의 가열은 상온(room temperature) 초과의 온도로 가열하는 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 단계 (ⅲ)에서의 상온 초과의 온도는 25℃ 초과의 온도인 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 단계 (ⅲ)에서의 상온 초과의 온도는 25℃ 초과 80℃ 이하의 온도인 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 단계 (ⅲ)에서의 가열은 10분-72시간 동안 행하는 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 단계 (ⅲ)에서의 냉각은 0-10℃의 온도로 냉각시키는 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.
제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 크로마토그래피는 이온교환 크로마토그래피, 헤파린 크로마토그래피 및 친화 크로마토그래피 (affinity chromatography)인 것을 특징으로 하는 HPV L1 단백질의 정제 방법.