CN104507956B - 人乳头瘤病毒病毒样颗粒的高效提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人乳头瘤病毒(HPV)L1蛋白的高纯度和高效提纯方法。根据所述提纯方法,当利用还原剂处理细胞匀浆而形成加热/冷却的时候,所提纯的HPV L1蛋白的纯度和产率大大地提高。此外,通过所述提纯方法提纯的HPV L1蛋白的VLP具有极佳的抗原性和免疫原性。
Description
技术领域
本发明涉及具有极佳的结构和免疫学特性的人乳头瘤病毒(HPV)的病毒样颗粒(VLP)的高效提纯方法。
背景技术
HPV为引起约100%宫颈癌的病原体[1]。据报道,全世界每年有500,000位女性被诊断患有宫颈癌,并且250,000位女性死于宫颈癌[2]。16、18、45、31、33、52、58、35和59型被认为是为导致宫颈癌的高风险类型的HPV,而6和11型被认为是低风险类型的HPV[3,4]。特别地,HPV16和HPV18被认为导致全部宫颈癌的70%,并且因此被认为是是预防宫颈癌的最重要类型[5]。导致宫颈癌的HPV类型不同地区而有所不同[5]。在非洲、欧洲、北美以及中南美洲,HPV16、HPV18、HPV31和HPV45感染为宫颈癌的主要原因,在亚洲,HPV16、HPV18、HPV58和HPV33感染为宫颈癌的主要原因[5]。
HPV的衣壳由作为主要抗原的L1蛋白和作为次要抗原的L2蛋白组成[6]。在这里,L1蛋白已被用作用于预防宫颈癌的疫苗的抗原和用于诊断宫颈癌的抗原,因为其具有自组装形成病毒样颗粒(VLP)的特性[6,27]。重组L1蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia Pastoris)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)或草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda,Sf)细胞,或者植物细胞中作为表达细胞进行生产[7-12,28]。目前,商用宫颈癌疫苗为GardasilTM(Merck)和CervarixTM(GlaxosmithKline,GSK)。GardasilTM包括HPV16、HPV18、HPV6和HPV11作为抗原的L1VLP,并且CervarixTM包括HPV16和HPV18作为抗原的L1VLP[13]。GardasilTM使用酿酒酵母作为抗原表达细胞,CervarixTM使用草地贪夜蛾(Sf)细胞作为抗原表达细胞,其为昆虫细胞[13,14]。两种疫苗均通过肌肉注射而被注射,并且具有每剂120美元的高成本,三剂需要360美元[15]。由于商用宫颈癌疫苗的注射成本高,所述疫苗在发展中国家的广泛使用受到许多限制,而宫颈癌主要发生在发展中国家中[16]。据此,低成本和高效的宫颈癌疫苗的研发就仍将是一个重要的课题。
在使用重组蛋白的药物中,下游加工成本高至总制造成本的80%[17]。为了制造用于宫颈癌疫苗的抗原,使用了通过在下游加工中的数个提纯步骤来提高目标抗原纯度的方法[18]。在酿酒酵母中生产VLP的情况中,为了提高目标蛋白的纯度,主要使用蔗糖垫层超速离心或排阻层析。为了提纯VLP,Hofmann等使用蔗糖垫层超速离心、阴离子交换层析、硫酸铵沉淀和排阻层析[19]。Kim等相继地使用蔗糖垫层超速离心、排阻层析和阳离子交换层析来提纯VLP[7]。Park等使用的提纯方法包括硫酸铵沉淀、排阻层析和阳离子交换层析,其被相继地执行[20]。根据所述方法,可以获得高纯度VLP,但是所述方法会限制提纯装置的增大,并且不适用于在大规模生产中使用。
对于由酿酒酵母制造的HPV的VLP的大规模生产,使用如下的方法。Cook等使用的方法中,相继地使用交叉微流量过滤、阳离子交换层析和羟磷灰石层析[21]。Kim等使用的方法中,在外来的蛋白通过硫酸铵沉淀而被清除以及清除沉淀的污染物的步骤之后,通过肝素层析或阳离子交换层析来提纯VLP[22]。由酿酒酵母制造的HPV L1蛋白共计不超过全部已知匀浆蛋白的1%,并且其回收并不容易[20]。为了提纯通过制备高纯度重组蛋白的方法来制造的HPV VLP,应当执行数个沉淀和层析步骤,并且也需要反复透析。此外,因为HPV的VLP容易分解,所以VLP在极佳结构中的组装就被认为是非常重要的[31]。虽然研究人员已经付诸了大量的努力来研发在宿主细胞的匀浆、例如酵母表达系统中有效地清除外来物质的方法,但是用于高效提纯VLP的技术尚未被明确地推进。
纵观全文,多个公开物和专利文献已被涉及,并表述了对其的引用。所引用的公开物和专利文献的内容作为参考而被引入至本文,并且由此包括本发明的技术领域的程度以及本发明的内容会被更加清楚地解释。
发明内容
技术问题
本发明人付诸了大量的努力来研发提纯由表达HPV L1蛋白的宿主细胞制造的HPVL1蛋白的新的高纯度和高效的方法。因此,当HPV L1蛋白通过包括利用还原剂来处理表达HPV L1蛋白的宿主细胞的匀浆的层析而被提纯的时候,或者利用还原剂处理匀浆并执行加热和冷却的时候,HPV L1蛋白的纯度就可被显著地提高,并且由L1蛋白组装的VLP的结构和免疫学特性也可被显著地增强,其通过实验而被确认,并且本发明因此而被完成。
据此,本发明涉及提供一种HPV L1蛋白的高纯度和高效提纯方法。
本发明的目标和优点将通过本发明的详细描述的说明书、权利要求和附图而变得更加清晰。
技术方案
在本发明的一个方面中,本发明提供了一种HPV L1蛋白的提纯方法,包括:(a)培育表达HPV L1蛋白的转化的宿主细胞,收获所培育的宿主细胞,并使所述细胞破碎;(b)将还原剂添加至宿主细胞的匀浆;和(c)通过对添加还原剂的宿主细胞的匀浆执行层析来提纯HPV L1蛋白。
在本发明的另一个方面中,提供了一种HPV L1蛋白的提纯方法。所述方法包括(i)培育表达HPV L1蛋白的转化的宿主细胞,收获所培育的宿主细胞,并使所述细胞破碎;(ii)将还原剂添加至宿主细胞的匀浆;(iii)加热和冷却添加还原剂的宿主细胞的匀浆;和(iv)通过对加热和冷却的宿主细胞的匀浆执行层析来提纯HPV L1蛋白。
通过努力研发由经制备以表达HPV L1蛋白的宿主细胞制造的HPVL1蛋白的新的高纯度和高效提纯方法,通过实验证实,当表达HPV L1蛋白的宿主细胞的匀浆利用还原剂处理之后,或者利用还原剂处理之后匀浆被加热并冷却,HPV L1蛋白通过层析而被提纯的时候,HPV L1蛋白的纯度被显著地提高,并且由L1蛋白组装的VLP的结构和免疫学特性会变为极佳的,并且由此本发明被完成。
在下文,本发明将通过如下的操作而被详细地描述:
(i)培育表达HPV L1蛋白的转化的宿主细胞,收获所培育的宿主细胞,并使所述细胞破碎的操作
在这里使用的术语“HPV L1蛋白”涉及构成HPV衣壳的主要蛋白,其由HPV的L1基因表达。L1蛋白可以单独地自组装为VLP,或者与次要蛋白、L2蛋白一起构成衣壳。
乳头瘤病毒为二十面体DNA基因组病毒,其具有最多8个早期基因(E)和2个晚期基因(L),和50至60nm的尺寸,并且无外壳。在基因E中,“E”表示早期,并且在基因L中,“L”表示晚期。E基因为参与病毒复制和转化的基因。L1和L2基因编码病毒衣壳蛋白。L1蛋白为主要衣壳蛋白,并且具有55至60kDa的分子量。L2蛋白为次要衣壳蛋白,估算具有55至60kDa的分子量以及75至100kDa的表观分子量,通过PAGE测量。
在本发明的方法中,L1蛋白由其衍生的HPV的类型可以选自但不是特别地限定于由HPV6a型、HPV6b型、HPV11型、HPV16型、HPV18型、HPV30型、HPV31型、HPV33型、HPV35型、HPV39型、HPV41型、HPV42型、HPV43型、HPV 44型、HPV 45型、HPV 51型、HPV 52型、HPV 54型、HPV 55型、HPV 56型、HPV 58型、HPV 68型和HPV70型构成的组,并且更优选地,本发明的L1蛋白可以衍生自选自由HPV6a型、HPV 6b型、HPV 11型、HPV 16型、HPV 18型、HPV 31型、HPV33型、HPV 45型和HPV 58型构成的组的HPV,并且最优选地,衍生自HPV 16型、HPV18型或HPV58型。
在本发明中,用作宿主细胞的细胞为细菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞。
根据本发明示例性的实施方式,酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、酵母菌(Saccharomyces sp.)、栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia Pastoris)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)。
在本发明中,表达HPV L1蛋白的转化的宿主细胞为由成功表达HPV L1蛋白的表达载体转化的宿主细胞。表达载体可以包括现有技术已知的转录调节因子或翻译调节因子,或标记基因。本发明的表达HPV L1蛋白的转化的宿主细胞可以使用现有技术已知的方法容易地制备。
(ii)将还原剂添加至宿主细胞匀浆的操作
在这里使用的术语“还原剂”涉及在还原-氧化反应中将电子贡献给其它形态(species)的元素或化合物,并且优选地,用于减少肽或蛋白质中的二硫键,或者稳定游离的巯基基团的化合物。
在本发明中,还原剂例如选自由β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙胺-HCl、三(2-羧乙基)磷化氢(TCEP)和半胱氨酸-HCl构成的组,并且优选为β-巯基乙醇或DTT。
在本发明中,还原剂在细胞匀浆中的最终浓度可以是0.1wt%或更大,优选为0.1至20wt%,更优选为0.1至10wt%,还更优选为1至8wt%,又更优选为3至7wt%,并且最优选为4至6wt%。
在本发明中,还原剂与细胞匀浆的反应时间并不限于特定的时间范围,并且本领域技术人员可以选择适用于本发明方法的反应时间。
(iii)加热和冷却添加还原剂的宿主细胞的匀浆的操作
在本发明中,还原剂被添加至细胞匀浆,并执行加热和冷却。如在示例性的实施方式中的实验结果所证实的,当添加还原剂的细胞匀浆被加热和冷却的时候,从转化的宿主细胞的匀浆清除杂质的效率被显著地提高,并且由L1蛋白组装的VLP具有优选的结构和免疫学特性。
在本发明中,细胞匀浆的加热温度高于室温,优选高于25℃,更优选25-80℃,进一步更优选为30-65℃,还更优选35-65℃,并且最优选35-60℃,并且最优化的加热条件为35-55℃。
在本发明中,细胞匀浆的加热时间可以根据加热温度而变化,并且可以恰当地选择10分钟至72小时,但是本发明并不限于这样的范围。加热时间优选为30分钟至72小时,更优选为30分钟至48小时,还更优选为30分钟至24小时,并且最优选为30分钟至12小时。
在本发明中,冷却温度为细胞匀浆的试样不会被冻结的温度。这样的冷却温度为0至10℃,优选0℃至8℃,更优选0℃至7℃,还更优选0℃至6℃,并且最优选0℃至5℃。冷却时间可以通过选择适用于本发明方法的冷却时间来使用。
同时,根据该实施例,添加还原剂的宿主细胞的匀浆可能不会被加热和冷却,并维持在室温。
在这里使用的术语“室温”为未被加热或未被冷却的环境温度,其为15℃至25℃。
(iv)通过对添加还原剂的宿主细胞的匀浆或者加热和冷却的宿主细胞匀浆执行层析来提纯HPV L1蛋白的操作
HPV L1蛋白通过对添加还原剂的宿主细胞匀浆执行基于层析的提纯而被提纯,或者通过对将还原剂添加至匀浆并加热和冷却所述匀浆之后在宿主细胞的匀浆执行基于层析的提纯而被提纯。
在本发明中,可利用的层析为现有技术已知的,并且例如可以是但不限于离子交换层析、例如阳离子交换层析或阴离子交换层析,排阻层析(SEC),疏水作用层析或者亲和层析。在本发明中,最适用于分离蛋白或肽的离子交换层析为优选使用的,因为将被分离和提纯的物质为蛋白。在本发明示例性的实施例中,阳离子交换层析、肝素树脂层析或阳离子交换层析的类型被用于成功地分离和提纯HPV L1蛋白。
本发明的特性和优点概括如下:
i)本发明提供HPV L1蛋白的高纯度和高效提纯方法。
ii)本发明的提纯方法的特征在于,在将还原剂添加至表达HPV L1蛋白的转化的宿主细胞的细胞匀浆之后,或者在利用还原剂处理细胞匀浆并执行加热和冷却之后,通过层析来提纯L1蛋白。
iii)根据本发明的提纯方法,HPV L1蛋白的提纯纯度可被显著地提高。
iv)通过本发明的提纯方法提纯的HPV L1蛋白的VLP形成高质量的结构,并且具有非常好的免疫原性。
有益效果
本发明涉及HPV L1蛋白的高纯度和高效提纯方法。根据本发明的提纯方法,HPVL1蛋白的提纯纯度可被显著地提高,并且因为所提纯的HPV L1蛋白的VLP形成与原始HPV病毒粒子更加相似的结构,所以VLP具有非常好的免疫原性。
附图说明
图1示出现有技术文献中描述的用于提纯HPV VLP的方法(在下文被称为“T-1”方法),以及本发明的方法(在下文被称为“T-5”方法)。涉及T-1方法的现有技术文献如下:
(现有技术文献1)Kim HJ,Kim SY,Lim SJ,Kim JY,Lee SJ等(2010)One-stepchromatographic purification of human papillomavirus type 16L1protein fromSaccharomyces cerevisiae.Protein Expr Purif 70:68-74;
(现有技术文献2)Kim HJ,Lim SJ,Kim JY,Kim SY,Kim H-J(2009)A method forremoving contaminating protein during purification of human papillomavirustype 18L1protein from Saccharomyces cerevisiae.Arch Pharm Res 32:1759-1766;
(现有技术文献3)已登记专利,宫颈癌疫苗,申请号:10-2011-0137242(12/19/2011),登记号:1011780560000(08/21/2012);和
(现有技术文献4)已登记专利,宫颈癌疫苗,申请号:10-2009-0099982(10/20/2009),登记号:1011819070000(09/05/2012)。
为了执行T-5方法,表达HPV L1蛋白的宿主细胞、酿酒酵母被破碎,并随后将还原剂添加至细胞匀浆中。在还原剂被处理之后,进行加热和冷却以清除杂质。清除杂质的细胞匀浆中包含的L1蛋白通过肝素层析而被提纯。通过第一提纯而被提纯的L1蛋白通过第二肝素层析而被进一步高纯度地提纯。
在T-1方法中,酿酒酵母匀浆中的L1蛋白通过硫酸铵沉淀而回收。回收部分中的杂质通过清除所沉淀的污染物而被清除。通过上述过程而被加工的匀浆中的L1蛋白通过肝素层析而被提纯。
图2示出通过T-5方法获得的提纯结果,包括表达L1蛋白的宿主细胞匀浆的透析、利用还原剂处理透析的细胞匀浆并执行加热和冷却、执行第一肝素层析,层析结果通过SDS-PAGE来确认。高纯度的HPV L1蛋白在第一肝素层析之后被回收。LS表示被负载至肝素树脂上的负载试样,并且FT表示流过,其为流过而未结合至肝素树脂的部分。W表示冲洗,其为流过的同时肝素树脂被冲洗的部分,并且E表示洗脱,其为HPV L1蛋白利用包括1M NaCl的缓冲溶液而被洗脱的部分。
图3示出通过T-5方法获得的提纯结果,包括利用还原剂直接处理表达HPV L1蛋白的宿主细胞匀浆,而不透析细胞匀浆,执行加热和冷却,并执行第一肝素层析。层析结果通过SDS-PAGE而确定。类似于图2的结果,高纯度HPV L1蛋白也在第一肝素层析之后获得。LS、FT、W和E与在图2中描述的相同。
图4a示出通过T-5方法获得的提纯结果,包括利用还原剂处理表达HPV L1蛋白的宿主细胞匀浆,执行加热和冷却,执行第一肝素层析并执行第二肝素层析。结果通过SDS-PAGE来确认。LS和FT与在图2中描述的相同。在SDS-PAGE图像的上部示出的数字3至18表示在使用NaCl的线性梯度洗脱中获得的各个部分的数字。
图4b示出第二肝素层析的图形。在图4a的SDS-PAGE的流过(FT)部分中,未检测到蛋白带,同时在图4b的FT中,确认流过大量的污染物质。据此,图4b的结果示出不可忽视量的污染物质通过第二肝素层析而被清除。
图5示出根据T-1方法的肝素层析的SDS-PAGE结果。试样在肝素层析之前的处理如在图1中所示地执行。LS表示负载试样。结合至肝素树脂的蛋白通过渐增的NaCl的线性梯度的方法而被洗脱。进行线性梯度洗脱以令NaCl的含量由0.325M达到2M。在SDS-PAGE结果中,上部的数字表示洗脱部分的数字。在部分11至14中示出L1蛋白被高纯度地洗脱。
图6a示出通过传统方法(T-1方法)和T-5方法提纯的VLP的纯度的对比结果。“T-1HPV16VLP”为通过常规的已知方法提纯的产物[Kim等(2010)Protein Expr Purif 70:68-74;Kim等(2009)Arch Pharm Res 32:1759-1766],并且“T-5HPV16VLP”为通过本发明的方法提纯的产物。在HPV L1蛋白的SDS-PAGE分析中,进行蛋白的定量,并且每孔上样500ng、250ng、125ng和62ng蛋白。实验被单独地执行两次,并且各个实验被表示为组A(Panel A)和组B(Panel B)。根据由所述的两个实验获得的结果,可以看到T-5HPV 16VLP的L1蛋白带的强度比T-1HPV16VLP的高得多。
图6b为示出在图6a中所示的两个实验中检测到的T-1HPV 16VLP和T-5HPV 16VLP的L1蛋白带的强度的图形。结果被表示为平均值±标准偏差,并且将500ng每孔上样的T-5HPV 16VLP的L1蛋白带的强度设定为100%。这种结果示出通过T-5方法提纯的VLP的纯度远高于通过T-1方法提纯的VLP。
图7示出当T-1HPV 16VLP被上样至具有与T-5HPV 16VLP相同的L1蛋白带强度的时候的SDS-PAGE结果。
图8示出T-1HPV16VLP和T-5HPV16VLP的电子显微镜结果。其确认T-1HPV 16VLP具有20至50nm的尺寸,并且T-5HPV 16VLP具有40至65nm的尺寸。这表示T-5HPV 16VLP的尺寸更接近于HPV的原始尺寸(50至60nm)[29,30]。
图9和10示出动态光散射(DLS)结果。DLS测量VLP在溶液中的尺寸。VLP在溶液中的尺寸分布使用DLS-700(图9)和ELS-Z2(图10)系统来分析。如在图9和10的结果中所示,两种类型的VLP的尺寸分布相互不同。该结果示出T-5HPV 16VLP的物理特性不同于T-1HPV16VLP的物理特性。
图11示出关于T-1HPV 16L1VLP和T-5HPV 16L1VLP的单克隆抗体的反应活性。为了评价抗HPV 16L1单克隆抗体的反应活性,现有技术已知的单克隆抗体H16.V5和H16.E70被使用。VLP相对于这两种抗体的反应活性的提高被认为与免疫原性的提高具有密切的关系[26,32-34]。确认了T-5HPV 16VLP相对于H16.V5和H16.E70抗体的反应活性远高于T-1HPV16VLP。
图12示出通过分析T-1HPV 16L1VLP和T-5HPV 16L1VLP的免疫原性而获得的结果。为了比较免疫原性,将1ng的VLP利用200μg的氢氧化铝皮下注射至小鼠内。免疫作用以每隔两周执行四次。在第三次和第四次免疫作用之后的10天,从血清测定抗HPV 16L1IgG的抗体效价。根据抗HPV16L1IgG抗体滴定的结果,确认由T-5HPV 16L1VLP产生的抗HPV16L1IgG的含量比由T-1HPV16L1VLP产生的高10倍。
图13示出在图12中执行的免疫作用中,在第四免疫作用之后收集的免疫血清的抗HPV16中和抗体活性。利用T-5HPV16L1VLP免疫的小鼠免疫血清的中和活性为78%,而利用T-1HPV16L1VLP免疫的小鼠免疫血清的中和活性为33%。
图14示出当匀浆未被处理的时候(非处理)、匀浆利用还原剂(β-巯基乙醇)处理的时候、以及当匀浆在利用还原剂处理之后被加热和冷却的时候(β-巯基乙醇+加热和冷却)提纯的HPV L1蛋白的纯度的比较。经历每种条件的试样通过第一肝素层析而被洗脱,并且对于每种条件来说相同体积的蛋白(5、2.5或1.2μl)从洗脱部分收集并上样在凝胶中来执行SDS-PAGE和Western印迹。根据图14的结果,确认了当匀浆利用还原剂处理并被加热和冷却的时候(T-5,β-巯基乙醇+加热和冷却),HPV L1蛋白的纯度远高于其它条件。
图15示出当匀浆未被处理的时候(非处理)、当匀浆利用还原剂处理的时候(β-巯基乙醇)、以及当匀浆在利用还原剂处理之后被加热和冷却的时候(T-5,β-巯基乙醇+加热和冷却)所提纯的HPV L1蛋白的纯度的比较。经历每种条件的试样通过第一肝素层析而被洗脱,并且相同量的每种蛋白(1、0.5或25μg)从洗脱部分收集并上样在凝胶中来执行SDS-PAGE和Western印迹。根据图15的结果,确认了当匀浆利用还原剂处理并被加热和冷却的时候(T-5,β-巯基乙醇+加热和冷却),HPV L1蛋白的纯度远高于其它条件。
图16示出当匀浆未被处理的时候(非处理)、当匀浆未利用还原剂处理但是仅被加热和冷却的时候(加热和冷却)、以及当匀浆在利用还原剂处理并被加热和冷却的时候(T-5,β-巯基乙醇+加热和冷却)所提纯的HPV L1蛋白的纯度的比较。经历每种条件的试样通过第一肝素层析而被洗脱,并且对于每种条件来说相同量的每种蛋白(5、2.5或1.2μl)从洗脱部分收集并上样在凝胶中来执行SDS-PAGE和Western印迹。根据图16的结果,确认了当匀浆利用还原剂处理并被加热和冷却的时候(T-5,β-巯基乙醇+加热和冷却),HPV L1蛋白的纯度远高于其它条件。
图17示出基于排阻层析(SEC)的提纯方法,基于硫酸铵沉淀的提纯方法,以及在利用还原剂处理之后通过加热和冷却来执行的提纯方法(T-5,β-巯基乙醇+加热和冷却)。为了比较SEC和硫酸铵沉淀以及在利用还原剂处理之后通过加热和冷却来执行的方法的作用,在T-5提纯方法中利用还原剂处理之后进行加热和冷却的步骤由SEC或硫酸铵沉淀来替代。SEC和硫酸铵沉淀(基于T-1的方法)为基于在现有技术文献中公开的方法。
1)涉及SEC的现有技术文献
(现有技术文献1)Park MA,Kim HJ,Kim H-J(2008)Optimum conditions forproduction and purification of human papillomavirus type 16L1protein fromSaccharomyces cerevisiae.Protein Expr Purif 59:175-181。
(现有技术文献2)已登记专利,Methods of producing and purifying HPVvirus-like particles,申请号:10-2008-0026586(2008.03.21),登记号:1009591450000(05/13/2010)。
2)涉及硫酸铵层析的现有技术文献
(现有技术文献1)Kim HJ,Kim SY,Lim SJ,Kim JY,Lee SJ等(2010)One-stepchromatographic purification of human papillomavirus type16L1protein fromSaccharomyces cerevisiae.Protein Expr Purif 70:68-74。
(现有技术文献2)Kim HJ,Lim SJ,Kim JY,Kim SY,Kim H-J(2009)A method forremoving contaminating protein during purification of human papillomavirustype 18L1protein from Saccharomyces cerevisiae.Arch Pharm Res 32:1759-1766。
(现有技术文献3)已登记专利,宫颈癌疫苗,申请号:102011-0137242(12/19/2011),登记号:1011780560000(08/21/2012)。
(现有技术文献4)已登记专利,宫颈癌疫苗,申请号:102009-0099982(10/20/2009),登记号:1011819070000(09/05/2012)。
图18示出硫酸铵沉淀、还原剂处理方法(β-巯基乙醇)和通过利用还原剂处理以及加热/冷却执行的提纯方法(T-5,β-巯基乙醇+加热和冷却)之间的差异。在每个提纯条件中第一层析的洗脱部分的纯度通过SDS-PAGE和Western印迹来分析。结果,确认了由包括利用β-巯基乙醇处理和加热/冷却的方法回收的L1蛋白具有最高的纯度。
图19示出对于根据硫酸铵沉淀的提纯方法以及在利用还原剂处理之后通过加热和冷却来执行的提纯方法(T-5,β-巯基乙醇+加热和冷却)来说,第一肝素层析结果。就像在图18中所示的结果,确认了由第一肝素层析洗脱的L1蛋白在利用还原剂处理和加热/冷却执行的方法中具有高纯度,同时大量的污染蛋白被包括在L1蛋白部分中,其在硫酸铵沉淀之后执行第一肝素层析时而被洗脱。根据Western印迹的结果,确认L1蛋白并未被结合至柱树脂,并且当L1蛋白通过硫酸铵沉淀而被提纯的时候在肝素层析中流过,并且当L1蛋白利用还原剂处理并被加热/冷却的时候L1蛋白不会流过。
图20示出在根据SEC的提纯方法中,对于通过SEC获得的洗脱部分的SDS-PAGE和Western印迹结果。在部分3至9之间,L1蛋白被高纯度地洗脱,并且由此,该片段中的部分被收集以进行比较。
图21示出在根据SEC的提纯方法中(SEC),根据硫酸铵沉淀的提纯方法中,以及利用还原剂进行处理和加热/冷却来执行的提纯方法中(T-5,β-巯基乙醇+加热和冷却),在第一层析中获得的L1蛋白洗脱部分的SDS-PAGE和Western印迹结果。对于第一层析来说,每个条件的试样如在图17中所示的制备。对于SEC来说,细胞匀浆经历硫酸铵沉淀和SEC(第一层析)。对于根据硫酸铵沉淀的方法来说,在硫酸铵沉淀之后,细胞匀浆经历清除沉淀的污染物的步骤,并且随后经历肝素层析(第一层析)。对于利用还原剂处理和加热/冷却来执行的方法来说,匀浆利用还原剂进行处理,加热和冷却,并经历肝素层析(第一层析)。对于由第一层析获得的洗脱部分的分析来说,每个条件的部分均以相同的量上样(0.35、0.17或0.08μl)。根据分析结果,可以看出,由包括利用还原剂处理和加热/冷却的方法获得的L1蛋白表现为具有最高的纯度。
图22示出对由图21的第一层析获得的洗脱部分进行第二层析来进一步提纯L1蛋白所获得的结果。在第二层析之后,L1蛋白洗脱部分之间的差异通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析。对于分析来说,每个提纯条件的洗脱部分均以相同的量上样(2、1或0.5μl)。根据分析结果,可以看出包括利用还原剂处理和加热/冷却的提纯方法相对于L1蛋白的回收速率为最佳的。
图23示出单克隆抗体(H16.E7)对在图22中最终提纯的L1蛋白的反应活性,其通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行分析。为了以相同的量涂覆在每个提纯条件中获得的HPV16L1VLP,由根据SEC的提纯方法(SEC)、根据硫酸铵沉淀的提纯方法、以及在利用还原剂处理之后通过加热和冷却执行的提纯方法(β-巯基乙醇+加热和冷却)获得的L1蛋白经调节至具有相同的浓度,并且L1蛋白的量通过SDS-PAGE和Western印迹来检测(图23A)。其后,HPV16L1VLP对H16.E70的反应活性通过ELISA进行检测(图23B)。结果,可以看出利用还原剂处理和加热/冷却提纯的HPV16L1VLP(T-5HPV16L1VLP)具有对H16.E70最佳的反应活性。这显示出由利用还原剂处理和加热/冷却来执行的提纯方法所获得的HPV16L1VLP具有最佳的结构特性[26]。
图24示出根据SEC的提纯方法、根据硫酸铵沉淀的提纯方法、以及利用还原剂处理和加热/冷却所执行的提纯方法的免疫原性分析。在利用HPV16L1VLP对小鼠进行免疫作用之前,L1蛋白的量经调节至与在图23A中检测的相同。1ng的HPV16L1VLP与200μg的氢氧化铝相混合、,并随后被皮下注射至小鼠内。小鼠免疫作用每隔两周执行四次。在四次免疫作用之后,采集小鼠免疫血清,并且每个小鼠组的中和活性通过现有技术已知的用于测量中和抗体活性的基于假病毒的方法检测[26]。结果,可以看到由经过排阻层析提纯获得的HPV16L1VLP进行免疫的小鼠的中和活性为16%,由硫酸铵沉淀获得的HPV16L1VLP进行免疫的小鼠的中和活性为28%,并且由利用还原剂处理和加热/冷却来执行提纯所获得的HPV16L1VLP进行免疫的小鼠的中和活性为50%。因此,由利用还原剂处理和加热/冷却来执行的提纯方法所获得的HPV16L1VLP对诱导中和抗体的能力表现为最佳的。
图25示出在T-5方法中利用还原剂进行处理之后,在加热/冷却过程中作用与加热温度的关系。细胞匀浆在每个加热温度下加热15分钟并冷却,并且随后所沉淀的污染物通过离心而被清除。组A示出根据加热温度测量的蛋白浓度。组B示出在各个加热温度下以相同的量上样的试样的SDS-PAGE结果。组C为Western印迹结果,用于对在各个加热温度下以相同的量上样的试样进行L1蛋白分析。组D为Western印迹结果,用于当试样以相同的蛋白量上样的时候,对以各个加热温度下定量的试样进行L1蛋白分析。据此,组D示出L1蛋白的纯度。根据该结果,确认了HPV16L1蛋白在60℃的加热温度下保留在细胞匀浆中,并且L1蛋白的纯度在细胞匀浆被加热至35至50℃时会提高。
图26示出根据T-5方法在HPV18L1蛋白的提纯中利用还原剂进行处理之后,在加热/冷却步骤中加热温度与作用的关系。每个组的详细描述与图25的相同。根据该结果,确认了HPV18L1蛋白在高至65℃的加热温度下保留在细胞匀浆中,并且L1蛋白的纯度在细胞匀浆被加热至45至55℃时会提高。
图27示出根据T-5方法,在HPV16L1VLP的提纯中,利用还原剂进行处理之后,在加热/冷却中冷却步骤的作用。组A示出被加热至45至50℃并被冷却的试样(加热合冷却)和未被冷却的试样(加热)之间的蛋白浓度的差异。租B示出对于被加热至45℃并被冷却的试样和未被冷却的试样来说,通过Western印迹分析的L1蛋白的量。组C示出,对于被加热至50℃并被冷却的试样和未被冷却的试样来说,通过Western印迹分析的L1蛋白的量。该结果示出污染的蛋白通过经历冷却步骤的沉淀而被清除,并且在该操作中,不会发生L1蛋白的损失。
图28示出根据T-5方法,在HPV16L1VLP的提纯中,利用还原剂进行处理之后,在加热和冷却中冷却步骤的作用。其示出被加热至45℃并被冷却的试样(HC)和未被冷却的试样(H)之间的差异,其通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析。根据SDS-PAGE和Western印迹结果,确认了L1蛋白在冷却步骤之后未减少,而污染的蛋白会有所减少。
图29示出通过图28的SDS-PAGE检测的污染蛋白,蛋白1、蛋白2和蛋白3的带强度的数值。这显示出通过冷却步骤,污染蛋白的浓度有所下降。
图30示出根据T-5方法,通过在60℃的加热温度下提纯HPV16L1VLP和HPV18L1VLP获得的结果。组A示出第一层析的SDS-PAGE结果。LS表示上样至柱上的试样,并且FT表示流过而未结合至柱的试样。洗脱表示在结合至柱树脂之后洗脱的部分。箭头表示HPV16L1和HPV18L1的位置。组B示出在执行第一和第二层析之后最终提纯的HPV16L1和HPV18L1的SDS-PAGE结果。组C为最终提纯的产品的透射电子显微镜。根据电子显微镜结果,确认提纯的L1蛋白形成VLP。
图31示出根据T-5方法,通过第一层析提纯HPV18L1所获得的结果。每个部分均通过SDS-PAGE来进行分析。LS表示上样试样,FT表示流过,W表示柱被冲洗的部分,并且E表示蛋白部分,其被结合至柱,通过添加包括1M NaCl的缓冲溶液而被洗脱。可以看出HPV18L1通过在利用还原剂处理和加热/冷却之后的层析而被高纯度地提纯。
图32示出使用图31的第一层析的洗脱部分执行的,在第二阳离子交换层析之后洗脱的HPV18L1蛋白部分的SDS-PAGE结果。LS、FT和W为与如上所述相同的。结合至柱树脂的蛋白利用包含0.6、0.7、0.8、0.9或1M NaCl的缓冲溶液而被相继地洗脱。确认了HPV18L1蛋白在0.9M和1M NaCl部分中洗脱。
图33示出通过T-5方法提纯的HPV18L1VLP的DLS结果。T-5HPV18L1VLP的DLS使用ELS-Z2系统进行分析。
图34示出通过T-5提纯方法来提纯HPV58L1所获得的结果。组A示出通过第一层析洗脱的L1蛋白部分的SDS-PAGE结果。组B示出第二层析的SDS-PAGE结果。组B的详细说明与在图32中描述的相同。
图35示出根据T-5提纯方法,通过第一和第二层析最终回收的HPV58L1蛋白的SDS-PAGE和Western印迹结果。其示出HPV58L1可以通过利用还原剂进行处理并随后通过执行加热/冷却步骤的方法而被成功地提纯。
图36示出编码HPV16L1蛋白的DNA序列(HPV16L1NG2)。酿酒酵母利用载有HPV16L1NG2基因的表达载体而被转化。所转化的细胞被用于表达和提纯HPV16L1蛋白。HPV16L1的核酸序列在基因库的登记号为KC792555.1。
图37示出编码HPV18L1蛋白的DNA序列(HPV18L1NG3)。酿酒酵母利用载有HPV18L1NG3基因的表达载体而被转化。所转化的细胞被用于表达和提纯HPV18L1蛋白。HPV18L1的核酸序列在基因库的登记号为KC792556.1。
图38分别示出通过HPV16L1NG2编码的HPV16L1氨基酸序列和通过HPV18L1NG3编码的HPV18L1氨基酸序列。
发明方式
在下文,本发明将参考实施例进行更加详细的描述。所述实施例仅被提供用来更加详细地解释本发明,并且本发明的范围并不限于所述实施例,但是本领域技术人员将清楚理解的是本发明的范围并不限于根据本发明这些要点的实施例。
具体实施方式
试验方法
1、细胞培养
表达HPV L1蛋白的酿酒酵母(S.cerevisiae)Y2805根据现有技术已知的方法来培养[25]。表达HPV L1蛋白的细胞被置于不含尿嘧啶的完全合成培养基“SD-ura”上,并培养四天或五天。单个菌落接种于SD-ura液体培养基并培养两天。为了由GAL10启动子表达HPV16L1蛋白,培养的转化细胞在包含1%酵母提取物(Duchefa,荷兰)、2%蛋白胨(Duchefa)、7%葡萄糖(Duchefa)和1%半乳糖(Duchefa)的YPDG培养基中进行培养。培养之后,所培养的细胞被离心以清除培养基,并利用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行冲洗。所冲洗的细胞再次通过离心来采集,并在蛋白的提纯之前储存在-70℃。
2、使用T-1方法提纯HPV VLP
根据T-1方法提纯HPV VLP,根据现有技术已知的方法,在匀浆中的蛋白作为球粒通过硫酸铵沉淀而被回收之后,通过肝素层析来执行[22,23,24]。对于肝素层析,使用HiTrapTM肝素HP(GE Healthcare,USA)树脂。由清除硫酸铵和清除沉淀的污染物的步骤所回收的试样利用包含0.325M NaCl的PBST进行透析,并令其经过利用包含0.325M NaCl的PBST平衡的肝素树脂。肝素树脂利用五倍于树脂床体积的缓冲溶液(包含0.325M NaCl的PBS)冲洗,并且结合有树脂的蛋白通过将NaCl的浓度由0.325提高至2M的线性梯度而洗脱。在洗脱部分中,包括HPV L1的那些部分通过SDS-PAGE来选择。所提纯的HPV L1VLP利用包含0.01%吐温80和0.33M NaCl的PBS(PBST)进行透析。
3、通过T-5方法提纯HPV VLP((β-巯基乙醇+加热和冷却方法)
3-1、细胞破碎,利用还原剂处理并加热/冷却
所培养的表达HPV L1蛋白的细胞在破碎缓冲溶液(10mM磷酸氢二钠,150mM NaCl,1.7mM EDTA,0.01%吐温80pH 7.2)中混合。细胞混合物与0.5mm玻璃珠(Biospec Product,USA)再次混合,并且所述细胞通过涡流而被破碎。细胞碎片通过在12000xg下离心15分钟而被清除。在柱层析之前,细胞裂解液通过两种不同的方法而被制备。第一种方法包括将β-巯基乙醇添加至细胞裂解液至具有4至6wt%的β-巯基乙醇(β-巯基乙醇,Sigma,USA)的最终浓度,并调节pH至7.0至7.3。第二种方法包括利用细胞破碎缓冲溶液(10mM磷酸氢二钠,150mMNaCl,1.7mM EDTA,0.01%吐温80pH 7.2)透析细胞匀浆4至6小时,并将β-巯基乙醇添加至细胞裂解液至具有4-6%的β-巯基乙醇的最终浓度。随后,添加β-巯基乙醇的细胞裂解液被保持在25至65℃的恒温水浴中30至50分钟,并在冰上冷却30分钟至3小时或者在4℃下冷却16小时。冷却的细胞裂解液以12000xg离心15分钟来清除沉淀的污染物。
3-2、第一层析
在利用还原剂处理之后通过加热和冷却制备的细胞裂解液经过肝素树脂(HiTrapTM肝素HP,GE Healthcare,USA或50HE,Applied Biosystems,USA)或阳离子交换树脂(XS,Applied Biosystems,USA)。在细胞匀浆经过肝素树脂或阳离子交换树脂之前,所述树脂利用包含4至6%β-巯基乙醇的破碎缓冲溶液(10mM磷酸氢二钠,0.15to0.48M NaCl,1.7mM EDTA,0.01%吐温80,pH 7.2)来平衡。细胞匀浆被上样在树脂上,并且肝素或阳离子交换树脂利用五倍于或多于五倍于树脂床体积的冲洗缓冲溶液(包含0.35to 0.48M NaCl和5%β-巯基乙醇的PBST)进行冲洗。结合至肝素树脂的HPV L1蛋白利用包含1MNaCl和5%β-巯基乙醇的PBST,或者通过连续地添加经制备在包含5%β-巯基乙醇的PBST中具有0.6M、0.7M、0.8M、0.9M和1M的最终NaCl浓度的缓冲溶液进行洗脱。包括L1蛋白的洗脱溶液使用Amicon Ultra(Millipore,USA)来浓缩,并利用包含1M NaCl和0.2M硫酸铵的PBST透析20至24小时。
3-3、第二层析
在第一层析之后透析的溶液被再次利用包含0.3至0.42M NaCl的PBST进行额外的透析,经过肝素树脂或阳离子交换树脂来执行第二层析。用于第二层析的肝素树脂或阳离子交换树脂与在第一层析中使用的那些相同。在试样上样之前,肝素/阳离子交换树脂利用包含0.42M NaCl的PBST平衡。在试样上样之后,树脂利用五倍于或多于五倍于树脂床体积的包含0.42M NaCl的PBST进行冲洗。结合至肝素/阳离子交换树脂的HPV L1蛋白通过将NaCl的浓度由0.42提高至2.0M,或者通过连续地添加经制备具有0.6M、0.7M、0.8M、0.9M和1M的NaCl浓度的缓冲溶液来洗脱。层析的洗脱模式在280nm的波长下检测,并使用Autochro-2000程序来收集(Young Lin Instrument Co.,韩国)。洗脱的L1蛋白部分被收集,使用Amicon Ultra(Millipore,USA)进行浓缩,并利用包含0.33M NaCl的PBST来透析。
4、非处理方法
对于非处理提纯来说,细胞通过如上所述的破碎来制备。所制备的匀浆利用缓冲溶液(10mM磷酸氢二钠,150mM NaCl,1.7mM EDTA,0.01%吐温80pH 7.2)透析4至6小时。透析试样的沉淀污染物通过在12000xg下离心10分钟来清除,并且随后制备产物经过如上利用缓冲溶液平衡的肝素树脂。随后,肝素树脂利用五倍于树脂床体积的包含0.42M NaCl的PBST进行冲洗,并且在冲洗步骤之后,结合至肝素树脂的蛋白利用包含1M NaCl的PBST洗脱。
5、利用β-巯基乙醇进行处理的提纯方法(β-巯基乙醇方法)
利用β-巯基乙醇进行处理的提纯方法为T-5提纯方法中不包括加热和冷却步骤的提纯方法。对于通过利用β-巯基乙醇进行处理的提纯方法来说,表达HPV L1的细胞如上所述地制备,并利用缓冲溶液(10mM磷酸氢二钠,150mM NaCl,1.7mM EDTA,0.01%吐温80pH7.2)透析4至6小时。β-巯基乙醇被添加至透析的裂解液至具有4至6%β-巯基乙醇的最终浓度。肝素树脂利用包含4至6%β-巯基乙醇的缓冲溶液(10mM磷酸氢二钠,150mM NaCl,1.7mMEDTA,0.01%吐温80pH 7.2)平衡,并令所制备的匀浆经过树脂。裂解液经过的肝素树脂利用五倍于树脂床体积的包含4至6%-巯基乙醇和0.42M NaCl的PBST进行冲洗。结合至肝素树脂的蛋白利用包含4至6%β-巯基乙醇和1M NaCl的PBST洗脱。
6、加热和冷却方法
加热和冷却方法为T-5提纯方法中不包括β-巯基乙醇处理步骤的提纯方法。对于HPV L1蛋白的提纯来说,细胞利用缓冲溶液(10mM磷酸氢二钠,150mM NaCl,1.7mM EDTA,0.01%吐温80pH 7.2)来破碎和透析4至6小时。所透析的裂解液在37℃至45℃下处理30分钟,并在冰上冷却30分钟至3小时。经历加热/冷却的裂解液的沉淀污染物通过在12000xg下离心10分钟而被清除,并经过利用缓冲溶液(10mM磷酸氢二钠,150mM NaCl,1.7mM EDTA,0.01%吐温80pH 7.2)平衡的肝素树脂。随后,肝素树脂利用五倍于树脂床体积的包含0.42M NaCl的PBST冲洗,并且结合至树脂的蛋白在冲洗步骤之后利用包含1M NaCl的PBST来洗脱。
7、使用排阻层析(SEC)进行提纯
使用SEC进行提纯通过对现有技术方法[20]的些许改进来执行。HPVL1表达酵母通过如上所述的破碎来制备,并且蛋白通过45%的饱和硫酸铵来沉淀。所沉淀的蛋白使用PBST再悬浮,并利用缓冲溶液(10mM磷酸氢二钠,0.65M NaCl,1.7mM EDTA,0.01%吐温80pH7.2)透析4小时。透析部分的提纯通过作为第一层析的SEC来执行。所制备的试样经过利用包含0.65M NaCl的PBST平衡的superose-6树脂(1.5x 32cm,GE Healthcare,USA)(第一层析)[36]。SEC的洗脱模式利用280nm的波长来检测,并使用Autochro-2000程序来收集(Young Lin Instrument Co.,韩国)。
收集包含HPV L1的部分,利用包含0.33M NaCl的PBST进行透析,并经过利用包含0.33M NaCl的PBST平衡的肝素树脂(第二层析)。随后,肝素树脂利用五倍于树脂床体积的包含0.42M NaCl的PBST来冲洗。在冲洗之后,结合至肝素树脂的蛋白通过相继地流过包含0.6M、0.7M、0.8M、0.9M和1M NaCl的PBST来洗脱。
8、使用硫酸铵沉淀进行提纯(硫酸铵沉淀方法)
使用硫酸铵沉淀的提纯为在T-5方法中β-巯基乙醇处理之后的加热和冷却步骤被硫酸铵沉淀所替代的方法。在层析之前,硫酸铵沉淀和沉淀污染物的清除根据现有技术已知方法来执行[22,24]。细胞裂解液中的蛋白利用45%的硫酸铵饱和来沉淀,并且污染物质被清除(沉淀污染物的清除)。在层析之前如上制备的试样利用缓冲溶液(10mM磷酸氢二钠,150mM NaCl,1.7mM EDTA,0.01%吐温80pH 7.2)透析4小时。肝素树脂利用与如上所述相同的缓冲溶液来平衡,并随后令透析的试样经过树脂(第一层析)。其后,树脂利用五倍于树脂床体积的包含0.42MNaCl的PBST来冲洗,并且结合蛋白利用包含1M NaCl的PBST来洗脱。对于第二层析来说,洗脱部分利用包含0.33M NaCl的缓冲溶液进行透析。随后,SEC的第二层析以与如上所述相同的方式来执行。
9、蛋白的定量分析
蛋白的浓度利用牛血清白蛋白(BSA;Pierce,USA)作为标准通过蛋白定量分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories,USA)来测量。
10、SDS-PAGE和Western印迹
SDS-PAGE根据Laemmli方法来执行[35],并且Western印迹通过已知方法来执行[26]。在SDS-PAGE凝胶上扩展的蛋白通过染色而被观察到。HPV L1蛋白使用兔抗HPV 16L1血清作为一级抗体和山羊过氧化物酶标记兔IgG多克隆抗体(氧化物酶标记山羊抗兔IgG,Bethyl,USA)作为二级抗体来检测[26]。带强度通过国立卫生研究院(NIH)开源软件图像J来测量,并根据已知方法来评估[25]。
11、电子显微镜
提纯的HPV 16L1蛋白被吸附在碳涂覆的格栅上,并利用磷钨酸或乙酸双氧铀染色。透射电子显微镜图像使用TEM200CX(JEOL,日本)以150,000倍的最终放大倍数来采集。
12、HPV VLP的动态光散射(DLS)
HPV VLP的DLS通过已知方法来执行[26]。提纯的HPV VLP在包含0.13M NaCl的PBST中稀释至具有0.13mg/ml的浓度,并使用DLS-700系统(Otsuka Electronics,日本)或者ELS-Z2系统(Otsuka Electronics,日本)进行分析。
13、单克隆抗体对HPV VLP的反应活性分析
单克隆抗体对HPV VLP的反应活性根据现有技术已知方法进行分析[26]。96孔酶联免疫吸附试验(ELISA)板利用400ng提纯的HPV VLP进行涂覆。在执行SDS-PAGE之后,通过不同方法提纯的HPV L1VLP被用作为涂层,从而确认在每种方法中提纯的HPV L1VLP的L1蛋白的量在数量上为相同的。VLP涂覆的板利用包含3%牛血清白蛋白的PBS-T20(包含0.05%吐温20的PBS)在室温下封闭2小时。抗HPV16L1单克隆抗体,H16.V5和H16.E70,利用包含0.3%牛血清白蛋白的PBS-T20稀释至具有0.25μg/ml、0.12μg/ml、0.06μg/ml、0.03μg/ml和0.015μg/ml的浓度,并与涂覆的HPV VLP在37℃下反应90分钟。所获得的抗体利用PBS-T冲洗三次,过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体(Bethyl,USA)在包含0.3%牛血清白蛋白的PBS-T20中以1:5000的比例稀释,并在37℃下于板上反应40分钟。利用PBS-T20冲洗所述板五次,并执行显色反应。所述的显色反应使用邻苯二胺(Sigma,USA)来执行,并且光密度在492nm下测量。
14、提纯的HPV L1VLP对小鼠的免疫和免疫原性评估
为了评价HPV16L1的免疫原性,使用6周大的Balb/c小鼠(Orientbio.韩国)。为了利用HPV L1蛋白使小鼠免疫,L1蛋白的纯度和浓度根据已知的蛋白定量分析方法和SDS-PAGE方法来确认。小鼠通过以每两周皮下注射四次而免疫。对于单独的免疫作用来说,1ng的L1蛋白与200μg的氢氧化铝(Sigma,USA)一起皮下注射。1ng的蛋白是基于T-5HPV16L1VLP的定量分析结果。通过另一种方法提纯的HPV16L1蛋白使用T-5HP16L1作为标准物质进行定量分析。在第三和第四次免疫之后的10天,血液从小鼠尾巴的静脉收集。为了收集血清,小鼠血液以12000xg离心10分钟来制备上清液,并且所述上清液被存储在-70℃,直至测定抗体效价和评价中和抗体的活性。抗HPV16L1IgG抗体的效价和小鼠血液中抗HPV16的中和活性根据已知方法通过ELISA和基于假病毒的中和实验来测量[26]。
15、统计分析
不同组之间统计学意义上的显著性使用双尾t检验来确定。P<0.05被认为是显著性差异。
实验结果
1、T-5提纯:通过第一层析提纯L1蛋白的结果
T-5提纯方法在图1中示出。第一肝素层析的上样试样被制备成两种类型,包括透析被执行的情况和透析未被执行的情况。在透析被执行的情况中,在细胞被破碎之后,透析在细胞破碎缓冲溶液中执行,并且随后添加还原剂(β-巯基乙醇),并且当透析未被执行的时候,还原剂被直接添加至匀浆。随后,两个试样被加热至37℃至42℃,并留在冰上30至50分钟以冷却至约0℃。由加热/冷却步骤获得的沉淀的污染物质被清除,并且执行肝素层析。图2和3示出透析试样和未透析试样的肝素层析结果,其通过SDS-PAGE进行分析。在两种情况中获得的L1蛋白均为高纯度的。
2、T-5提纯:通过第二层析提纯L1蛋白的结果
由第一肝素层析获得的L1蛋白洗脱部分通过第二肝素层析而被进一步提纯。图4a示出通过第二肝素层析获得的提纯结果。结合至肝素树脂的L1蛋白通过线性增加的NaCl梯度来洗脱(图4b)。根据SDS-PAGE的结果,流过而未被结合至肝素树脂的L1蛋白未在FT部分中观察到。确认了结合至肝素树脂的L1蛋白通过线性梯度增加而被洗脱(11-17部分)。图4b示出在肝素层析中在280nm的波长检测到的洗脱物质。当考虑SDS-PAGE结果的时候,洗脱的蛋白并未在FT中(流过)观察到,但当在280nm检测的时候,确认在FT中大量的物质会流过。据此,认为污染物质,而非L1蛋白会通过第二肝素层析被清除。
3、通过T-1和T-5方法分离的HPV16L1VLP的纯度分析
通过第二肝素层析(T-5HPV16L1VLP)收集的L1蛋白的纯度与通过现有技术已知方法[22.24](T-1HPV16L1VLP)提纯的L1蛋白的纯度进行比较。T-1提纯方法在图1中示出,并且T-1提纯方法的肝素层析的SDS-PAGE结果在图5中示出。在图5中,LS表示上样在层析柱上的试样(上样试样)。根据T-1方法的肝素层析,L1蛋白通过NaCl浓度从0.325M至2M的线性梯度提高而被洗脱,并且L1蛋白在11至15部分之间洗脱。图6a示出通过T-1和T-5方法提纯的HPV16L1VLP的纯度对比结果。为了分析VLP的纯度,提纯实验被单独地执行两次,并且结果表示于组A和组B中。在蛋白的定量分析之后,T-1HPV16L1VLP和T-5HPV16L1VLP以500ng、250ng、125ng和62ng每孔上样,并且在由SDS-PAGE分级之后,其结果通过染色而可视化。根据两个VLP,高纯度的55kDa L1带被观察到。然而,可以看出T-5HPV 16VLP的L1带的强度高于T-1HPV 16VLP。图6b示出在图6a中实施的两个实验的数值,其用平均值±标准偏差表示。为了生成结果,以500ng上样的T-5HPV 16VLP的L1带的强度被设定为100%。根据该结果,确认T-5HPV16L1VLP的纯度高于T-1HPV16L1VLP。
对于电子显微镜来说,DLS和单克隆抗体反应活性的分析将在下文描述,T-1HPV16VLP的L1量经调节以与T-5HPV16VLP相同。图7示出两种类型的VLP的L1量的SDS-PAGE结果,其被调节为相同的。
4、通过T-1和T-5提纯方法分离的HPV16L1VLP的电子显微镜观察
图8示出T-1HPV 16VLP和T-5HPV 16VLP的电子显微镜结果。确认T-5HPV16L1VLP的尺寸范围为40至65nm,并且T-1HPV16L1VLP的尺寸范围为20至50nm。据此,通过T-5方法提纯的HPV16L1VLP的类型具有不同于通过T-1方法提纯的HPV16L1VLP类型的特征。已知HPV病毒粒子的尺寸天然存在为50至60nm[29,30]。这样的结果表明T-5HPV 16VLP的尺寸更接近于原始HPV尺寸。
5、通过T-1和T-5方法分离的HPV16L1VLP的DLS分析
DLS被广泛用于评价在溶液中存在的VLP的状态[31]。图9示出使用DLS-700系统来分析提纯的T-1HPV16L1VLP和T-5HPV 16L1VLP的代表性结果。图10示出使用ELS-Z2系统来分析HPV16L1VLP的代表性结果。VLP尺寸用平均值±标准偏差表示。在图9中,T-1HPV16L1VLP分布于29至438nm之间,并且T-5HPV16L1VLP分布于17至233nm之间。据此,根据两种类型的VLP的尺寸的流体静力分布相互不同。图10A示出两种VLP的DLS的强度图形。图10B示出两种类型VLP的多分散指数(P.I.)。在图10B中,就像在图10A中,确认T-1HPV16L1VLP比T-5HPV16L1VLP具有更宽的尺寸分布范围。确认T-5HPV16L1VLP的P.I.低于T-1HPV16L1VLP(图10B)。因此,确认与T-1HPV16L1VLP相比,T-5HPV16L1VLP在溶液中以均一的类型存在。
6、对通过T-1和T-5方法提纯的HPV16L1VLP的单克隆抗体反应活性的分析
抗HPV 16L1单克隆抗体对HPV 16VLP的反应活性被用作为用于评价HPV16L1VLP的结构优势和诱导中和抗体能力的重要标准[26,32-34]。T-1HPV16L1VLP和T-5HPV16L1VLP对单克隆抗体的反应活性使用抗体H16.V5和H16.E70进行比较,其为评价这些特性最为常用的[26]。对两种抗体的反应活性的增加与免疫原性的增加极为相关[26,36]。如在图11中所示的,确认了T-5HPV16VLP对两种类型抗体的反应活性显著高于T-1HPV16VLP。
7、通过T-1和T-5方法提纯的HPV16L1VLP的免疫原性的比较
确认了T-1HPV16L1VLP的L1蛋白的纯度低于T-5HPV16L1VLP(图6a、图6b)。为了以相同的量免疫接种两种HPV16L1VLP,T-1HPV16L1VLP的量被调节为T-5HPV16L1VLP的量,并且L1蛋白的量通过SDS-PAGE来评价(图7)。对于免疫作用来说,1ng的HPV16L1VLP与氢氧化铝一起注射。由T-5HPV16L1VLP定量分析的1ng的蛋白量(数值由Bradford蛋白测定获得)被设定为标准的。通过T-1或T-5提纯方法提纯的HPV16L1VLP每隔两周被四次皮下注射至小鼠内。在第三次和第四次免疫作用之后检测的在血清中的抗HPV16L1IgG的效价在图12中示出。在第三次免疫作用之后,T-5HPV16L1VLP免疫组具有的中值为450,而T-1HPV16L1VLP免疫组具有的中值为0。在第四次免疫作用之后,T-5HPV16L1VLP免疫组具有的中值为4050,而T-1HPV16L1VLP免疫组具有的中值为300。据此,确认T-5HPV16L1VLP诱导比T-1HPV16L1VLP高10倍或大于10倍的抗HPV16L1IgG抗体效价。
在第四次免疫作用之后,小鼠血清中的抗HPV16中和抗体活性被检测(图13)。T-5HPV16L1VLP免疫组具有78%的中和活性(中值),而T-1HPV16L1VLP免疫组具有33%的中和活性。在两组之间,中和活性显示出显著性差异。
8、在利用还原剂处理之后,加热/冷却作用的评价(未处理、β-巯基乙醇处理以及在β-巯基乙醇处理之后进行加热和冷却条件的比较)
如上文结果可知的,高纯度的L1蛋白可以通过第一肝素层析获得。为了具体评价在利用还原剂处理之后进行加热/冷却对L1蛋白纯度的作用,两种类型的试验被执行。在第一种试验中,在未处理时,当仅利用还原剂处理的时候(β-巯基乙醇处理方法),和当在利用还原剂处理之后执行加热/冷却的时候(T-5提纯方法,β-巯基乙醇+加热和冷却),在肝素层析之后,比较L1蛋白的纯度。在第二种试验中,在未处理时,当仅执行加热/冷却的时候(加热和冷却方法),和当在利用还原剂处理之后执行加热/冷却的时候(T-5提纯方法,β-巯基乙醇+加热和冷却),在肝素层析之后,比较L1蛋白的纯度。
表1和2示出分别在第一种和第二种试验中,对于肝素层析来说,在每种条件下的蛋白量和清除上样试样的污染蛋白的比率。如在表1中所示的,在未处理和当利用还原剂处理的时候,24至25%的蛋白在肝素层析之前被清除,但是当加热/冷却在利用还原剂进行处理之后被执行的时候,66%的蛋白被清除。同样地,在表2中,在未处理和当利用还原剂处理的时候,34至40%的蛋白在肝素层析之前被清除,但是当加热/冷却在利用还原剂进行处理之后被执行的时候,70%的蛋白被清除。
[表1]
[表2]
图14示出当以相同量上样的时候(5μL、2.5μL、1.2μL),在第一肝素层析之后获得部分的SDS-PAGE和Western印迹。确认未处理时,所获得的L1蛋白的量大大地降低。还确认的是,因为许多外来蛋白包括在回收的溶液中,所以纯度也是非常低的。确认当仅利用还原剂处理的时候,即用β-巯基乙醇处理的时候,回收的L1蛋白的量提高,但是由于在所获得溶液中存在大量的污染蛋白,纯度也不高。同时,当用还原剂β-巯基乙醇处理,并且加热/冷却被执行的时候,L1蛋白被确定为SDS-PAGE和Western印迹中的主要带,并且由此L1蛋白的回收率以及纯度很高。
为了比较在上述条件下获得的L1蛋白的纯度,对在所获得的溶液中的蛋白进行定量分析,并以相同的量上样(1μg、0.5μg、0.25μg)以通过SDS-PAGE和Western印迹来确定(图15)。如从该结果可以看到的,当加热/冷却在β-巯基乙醇添加之后被执行的时候,L1蛋白的纯度为最高的。
图16示出在未处理时,当仅加热/冷却被执行的时候(加热和冷却方法),以及在利用还原剂处理之后执行加热/冷却的时候(T-5,β-巯基乙醇+加热和冷却),由第一肝素层析获得的洗脱部分的SDS-PAGE结果。在第一肝素层析之后收集的部分以相同的量上样(5μL、2.5μL、1.2μL),并通过SDS-PAGE和Western印迹分析。结果,在未处理时和当仅加热/冷却被执行的时候,回收的L1蛋白的量大大降低。此外,由于收集溶液中存在大量的污染蛋白,纯度也是非常低的。同时,当在利用还原剂处理之后加热/冷却被执行的时候,L1蛋白被确认为SDS-PAGE和Western印迹中的主要带,并且由此,L1蛋白的回收率以及纯度也很高。
因此,当仅用还原剂处理的时候,或者当仅加热和冷却被执行的时候,高纯度的L1蛋白无法获得,并且为了高纯度地提纯L1蛋白,确认在利用还原剂处理之后进行加热/冷却是重要的。
9、在利用还原剂处理之后进行加热/冷却的作用的评价(硫酸铵沉淀、β-巯基乙醇处理、在β-巯基乙醇处理之后进行加热/冷却的比较)
使用硫酸铵的提纯方法在图17中示出。通过硫酸铵沉淀的提纯方法被设计为利用硫酸铵沉淀来替代在T-5提纯方法中在β-巯基乙醇处理之后的加热和冷却步骤,并与在图1中所示的T-1提纯方法相区别。通过β-巯基乙醇处理的方法(β-巯基乙醇方法)与在上文的实施例中描述的相同。由第一层析洗脱的蛋白以相同的量被上样(10、5、2.5μL),并且通过SDS-PAGE和Western印迹进行分析(图18和图19)。当加热和冷却在β-巯基乙醇处理之后被执行的时候,L1蛋白具有极佳的纯度,在硫酸铵沉淀和仅β-巯基乙醇处理的方法中,L1蛋白纯度低(图18)。根据由硫酸铵沉淀和在β-巯基乙醇处理之后进行加热/冷却的方法所获得的第一层析结果,确认了当在β-巯基乙醇处理之后加热/冷却被执行的时候,上样试样中(LS)所有的L1蛋白均被结合至层析柱,并且当使用硫酸铵沉淀的时候,上样试样(LS)中的一部分L1蛋白并未结合至柱,并且流过(FT)(图19)。
10、利用还原剂处理之后进行加热/冷却的作用的评价(SEC、硫酸铵沉淀和在β-巯基乙醇处理之后进行加热和冷却的比较)
排阻层析(SEC)方法在图17中示出。SEC方法是基于现有技术已知的方法[20]。硫酸铵沉淀与如上所述的相同。代表性的SEC结果在图20中示出。在3至9部分中,在SEC之后HPV16L1蛋白被高纯度地洗脱,并且所述部分被用于通过第一层析比较L1蛋白的纯度(图21)。对于SEC、硫酸铵沉淀和在β-巯基乙醇处理之后进行加热/冷却(β-巯基乙醇+加热和冷却),比较第一层析洗脱部分中的L1蛋白的纯度(图21)。通过每种方法获得的洗脱部分被调节为相同的量(7ml),并且具有相同量的试样(0.35、0.17或0.08μL)被上样用于SDS-PAGE和Western印迹。确认通过在β-巯基乙醇处理之后进行加热/冷却获得的第一层析洗脱部分之一具有最高纯度的L1蛋白。
图22示出使用在图21中示出的第一层析的洗脱部分来执行的第二层析的洗脱部分的SDS-PAGE和Western印迹结果。第二层析中每种条件的洗脱部分以相同的量上样(2、1或0.5μL)。根据第二层析的洗脱部分的分析,确认当加热/冷却在β-巯基乙醇处理之后被执行的时候,L1蛋白的产率为最高的。
为了分析在每种条件下提纯的HPV16L1VLP的抗原性,HPV16中和单克隆抗体H16.E70的反应活性通过ELISA进行比较(图23b)。为了涂覆相同量的HPV16L1VLP,通过基于SEC的提纯方法和硫酸铵沉淀方法提纯的HPV16L1VLP的浓度被调节至在抗原涂覆之前在β-巯基乙醇处理之后进行加热/冷却(T-5HPV16L1VLP)来提纯的HPV16L1VLP的浓度。在调节浓度之后,确认通过SDS-PAGE和Western印迹,三种类型的VLP之间不存在不同的L1蛋白量(图23a)。根据对HPV16中和单克隆抗体H16.E70的反应活性的分析结果,可以看到在β-巯基乙醇处理之后进行加热/冷却(T-5)来提纯的HPV16L1VLP具有最佳的反应活性(图23b)。
综上所述,通过在β-巯基乙醇处理之后进行加热/冷却所实施的方法来产生的VLP具有比通过现有技术已知方法、例如SEC和硫酸铵沉淀来提纯的那些具有更高的纯度,并且具有极佳的抗原特性。
11、通过SEC、硫酸铵沉淀和利用还原剂处理之后进行加热/冷却(T-5)来提纯的HPV16L1VLP的免疫原性比较
在图23中最终提纯的三种类型的每种1ng的HPV16L1VLP被用于免疫。在免疫之前,如在图23A中所示的,VLP经调节至具有相同的浓度。在小鼠的免疫作用中,1ng的VLP与200μg的氢氧化铝一起注射。免疫作用每两周执行四次。根据在免疫四次的小鼠的血清中测量中和活性的结果,在利用通过基于SEC的方法提纯的HPV16L1VLP免疫的组中,中和活性为16%,并且在利用通过硫酸铵沉淀提纯的HPV16L1VLP免疫的组中,中和活性为28%。同时,在利用通过基于在利用还原剂处理之后进行加热/冷却的方法(T-5)提纯的HPV16L1VLP免疫的组中,中和活性为50%。因此,通过T-5方法提纯的HPV16L1VLP比通过已知方法提纯的HPV16L1VLP具有更高的免疫原性。
12、在利用还原剂处理之后加热温度与作用关系的分析
图25和26示出在HPV16L1VLP和HPV18L1VLP的提纯中,在利用还原剂处理之后根据加热温度来清除污染蛋白的作用。匀浆利用β-巯基乙醇处理,并在室温(初始)、25、30、35、40、45、50、55、60或65℃反应15分钟。随后,试样被置于冰上1小时,并以12000xg离心来清除沉淀的污染物。测量清除沉淀的污染物的试样中蛋白的浓度并在组A中示出。每个试样以相同的量上样,并且通过SDS-PAGE分析的结果在组B中表示。每个试样以相同的量上样,并且L1蛋白的量通过Western印迹检测并在组C中示出。在测量每个试样的蛋白浓度之后,相同量的蛋白被上样,并且L1蛋白的量通过Western印迹来检测,并在组D中示出。据此,在组D中所示的Western印迹结果表示L1蛋白的纯度。
很明显,污染蛋白根据加热温度的清除率在35℃或更高温度下表现为高度增加的(图25A、25B、26A和26B)。如在图25C和26C中所示的,确认HPV16L1蛋白在65℃和60℃的加热温度下保留在匀浆中,并且HPV18L1蛋白在60℃的加热温度下保留在匀浆中。根据不同温度分析的L1蛋白的纯度,HPV16L1蛋白的纯度在35℃至50℃的温度下为高的(图25D),并且HPV18L1蛋白的纯度在45℃至60℃的温度下为最高的(图26D)。据此,当匀浆被加热至35℃至60℃的时候,污染蛋白被清除,而L1蛋白保持稳定。L1蛋白的热稳定性可以帮助L1蛋白通过在利用还原剂进行处理的条件下的加热步骤与污染蛋白的分离。
13、在利用还原剂处理之后进行加热/冷却操作的冷却作用分析
图27示出在利用还原剂处理之后仅加热被执行的情况(加热)以及在加热之后冷却被执行的情况(加热和冷却)之间的对比结果。在图27中,组A示出当仅加热被执行时,以及当在加热之后冷却被执行时所测得的蛋白浓度。组B和C示出当仅加热在45℃和50℃被执行时,以及当在加热之后冷却被执行时(加热和冷却)所获得的Western印迹结果。对于Western印迹来说,每种条件的试样均以相同量上样(5、2.5和1.25μl)。如在组A中所示的,当在加热之后执行冷却的时候,与当仅加热被执行的时候相比,确认蛋白总量被降低。同时,确认L1蛋白的量未降低(图27B和27C)。这样的结果示出L1蛋白的纯度通过冷却而提高。
图28示出当在利用还原剂处理之后仅加热被执行时(H)以及当在加热之后冷却被执行时(HC),SDS-PAGE和Western印迹结果。为获得精确的分析,每个试样以2.5μl和1.25μl上样。当仅加热被执行的时候,污染蛋白,蛋白1、蛋白2和蛋白3的带强度为高的,而当在加热之后执行冷却的时候,污染蛋白,蛋白1、蛋白2和蛋白3的带强度为降低的(图28)。同时,L1蛋白的量并未通过冷却而降低(图28中的Western印迹结果)。图29示出当仅加热被执行的时候(仅H)以及当在加热之后执行冷却的时候(HC),通过SDS-PAGE检测的污染蛋白,蛋白1、蛋白2和蛋白3的带强度。
14、根据在60℃下的热处理,HPV16L1VLP和HPV18L1VLP的提纯
表达HPV16L1和HPV18L1的酵母细胞的匀浆利用还原剂进行处理,其被加热至60℃,并被冷却以尝试执行VLP提纯。图30中的组A示出第一层析的SDS-PAGE分析结果。LS和FT分别表示上样试样和流过。洗脱表示由所洗脱的L1蛋白形成的部分。组B示出第二层析的最终产物的SDS-PAGE分析结果。每种类型的L1蛋白均被高纯度地提纯。组C示出最终提纯制品的透射电子显微镜结果。确认在60℃下进行加热之后提纯L1蛋白之后形成VLP。
15、通过T-5方法提纯HPV18L1VLP
图31示出当HPV18L1VLP通过T-5方法提纯的时候,第一层析的SDS-PAGE结果。在第一肝素层析之前,细胞匀浆利用还原剂进行处理,在45℃下加热,并在冰上冷却。图31示出污染蛋白通过第一肝素层析而被有效地清除。图32示出第二阳离子交换层析的SDS-PAGE结果。在第二层析中,污染物质由包括0.6M和0.7M NaCl的部分洗脱,并且L1蛋白由包括0.9M和1M NaCl的部分洗脱。据此,确认HPV18L1蛋白通过T-5方法而被高纯度地提纯。图33示出最终提纯的T-5HPV18L1VLP的动态光散射(DLS)结果。
16、通过T-5方法提纯HPV58L1VLP
图34A示出根据T-5方法通过第一层析分离的HPV58L1部分的SDS-PAGE结果。根据第一层析,HPV58L1蛋白被检测为主要带。图34B示出通过第二层析分离的HPV58L1VLP的SDS-PAGE结果。HPV58L1蛋白由包括0.6M、0.7M、0.8M、0.9M和1M NaCl的所有部分进行洗脱。图35示出通过T-5方法最终提纯的HPV58L1VLP的SDS-PAGE和Western印迹结果。根据T-5方法,确认HPV58L1VLP被高纯度地提纯。
虽然本发明已经参考特定的示例性的实施方式而被示出并描述,但是本领域技术人员清楚理解的是,这样的详细说明仅为示例性的实施方式,本发明的范围并不被限制于此。因此,将会理解的是,本发明的实际范围通过所附的权利要求及其等价形式来定义。
工业实用性
本发明涉及HPV L1蛋白的高纯度和高效提纯方法。根据本发明的提纯方法,HPVL1蛋白的提纯纯度大大地提高,并且所提纯的HPV L1蛋白的VLP形成更加类似于天然HPV病毒粒子的结构,并且由此具有极佳的免疫原性。
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Claims (9)
1.一种提纯人乳头瘤病毒(HPV)L1蛋白的方法,包含:
(i)培养表达HPV L1蛋白的转化的宿主细胞,收获所培养的宿主细胞并破碎所述细胞;
(ii)将还原剂添加至宿主细胞的匀浆;
(iii)将上述添加还原剂的宿主细胞的匀浆在25至80℃下加热10分钟至72小时后在0至10℃下冷却30分钟至3小时;和
(iv)通过对加热和冷却的宿主细胞的匀浆执行第一层析来提纯HPV L1蛋白;
(v)对第一层析的洗脱部分执行第二层析来清除污染物质;和
(vi)将上述清除了污染物质的HPV L1蛋白质以病毒样颗粒的形态回收。
2. 根据权利要求1所述的方法,其中HPV选自由HPV6a型、HPV 6b型、HPV 11型、HPV 16型、HPV 18型、HPV 30型、HPV 31型、HPV 33型、HPV 35型、HPV 39型、HPV 41型、HPV 42型、HPV 43型、HPV 44型、HPV 45型、HPV 51型、HPV 52型、HPV 54型、HPV 55型、HPV 56型、HPV58型、HPV 68型和HPV 70型构成的组。
3.根据权利要求1所述的方法,其中宿主细胞为细菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞。
4.根据权利要求3所述的方法,其中酵母细胞为酿酒酵母、毕赤酵母或多形汉逊酵母。
5. 根据权利要求1所述的方法,其中还原剂选自由β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙胺-HCl、 三(2-羧乙基)磷化氢(TCEP)或半胱氨酸-HCl构成的组。
6.根据权利要求1所述的方法,其中还原剂为β-巯基乙醇或二硫苏糖醇。
7.根据权利要求6所述的方法,其中β-巯基乙醇被添加至宿主细胞的匀浆至具有0.1wt%或更高的最终浓度。
8.根据权利要求6所述的方法,其中二硫苏糖醇被添加至宿主细胞的匀浆至具有2mM或更高的最终浓度。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述层析为离子交换层析、肝素层析或亲和层析。
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