CN105176934B - 柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法，在有活性的柑桔黄化脉明病毒提取液中加入等体积的保护剂，颠倒混合后迅速置于液氮中2～3min，然后转移至‑80℃超低温冰箱保存；所述保护剂为用PBS缓冲液配制的含13～17％葡萄糖，5～7％蛋白胨以及10～30％甘油的溶液；所述的PBS缓冲液为：将NaCl 6.8～8g，Na2HPO4·12H2O 2.2～2.9g，KH2PO40.1～0.2g，KCl 0.15～0.2g，NaN30.2～0.5g，吐温‑200.5～1.5mL，1000mL去离子水溶解灭菌备用。本方法离体保存的柑桔黄化脉明病毒在保存2年后仍能保持极高的侵染活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物病毒的保存方法，具体涉及一种柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法。
背景技术
柑桔黄化脉明病毒(Citrusyellow vein clearing virus,CYVCV)引起的柑桔黄脉病是一种新近出现在我国柠檬上的重要病毒病，其发生呈不断扩大、加重的趋势。
目前除使用无病毒苗木和铲除病树外，尚无有效的防治方法。在开展防治柑桔黄脉病的研究过程中，病毒的保存是必不可少的重要环节。由于常温下植物病毒的体外存活期极短，目前包括柑桔病毒在内的植物病毒均主要是通过将病毒接种于寄主植物的方式进行保存，因此就需要不断在寄主植物间进行转移、继代和扩繁。这种保存方法在长期保存过程中不仅可能会发生意外丢失、混杂，甚至可能会发生病毒变异，导致其生物学特性改变，而且不断重复的工作也消耗了大量的人力物力。因此寻找一种操作简便，又可长期保持病毒活力的保存方法是一项十分重要的基础工作。
关于植物病毒的长期保存方法国内做了大量相关研究，除了早期采用的低温保存、干燥保存、以及组织培养保存外，目前应用最为广泛、效果最好的病毒保存方式是真空冷冻干燥处理。经过真空冷冻干燥处理的病毒提取物在使用时通过摩擦接种的方式即可将病毒接种于相应的寄主植物。此外，超低温保存也因其操作简单而被广泛运用。但是目前此类研究的对象主要集中于侵染草本植物的病毒，本发明中涉及的CYVCV，作为一种果树病毒其在植株中的含量、稳定性、接种方式等特性均与草本植物的病毒存在很大的差异，现有保存方法无法长期保持该病毒的致病力。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题提供一种能够对柑桔黄化脉明病毒进行长期离体保存的方法。
本发明的目的是这样实现的：在有活性的柑桔黄化脉明病毒提取液中加入等体积的保护剂，颠倒混合后迅速置于液氮中2～3min，然后转移至-80℃超低温冰箱保存；所述保护剂为用PBS缓冲液配制的含13～17％葡萄糖，5～7％蛋白胨以及10～30％甘油的溶液；所述的用于配制保护剂的PBS缓冲液为：将NaCl 6.8～8g，Na2HPO4·12H2O 2.2～2.9g，KH2PO40.1～0.2g，KCl 0.15～0.2g，NaN3 0.2～0.5g，吐温-20 0.5～1.5mL，用1000mL去离子水溶解混匀，高温灭菌后保存备用。
作为优选地，所述保护剂为用PBS缓冲液配制的含15％葡萄糖，5％蛋白胨以及10％甘油的溶液；所述的用于配制保护剂的PBS缓冲液为：将NaCl 8g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，NaN3 0.2g，吐温-20 0.5mL，用1000mL去离子水溶解混匀，高温灭菌后保存备用。
所述有活性的柑桔黄化脉明病毒提取液的提法方法包括以下步骤：
1)取柑桔黄化脉明病病株组织5～10g在液氮中研磨，研磨后按照重量/体积比加入2～4倍体积的提取缓冲液进行匀浆；
2)将步骤1)得到的匀浆液在冰上静置3～7min，用纱布过滤，将滤液4℃3000～5000rpm离心15～25min后取上清，将上清液用Miracloth滤膜过滤，滤液倒入超速离心管中，每管分装9mL滤液；
3)在步骤2)中的离心管中从底部缓慢加入1mL蔗糖垫；
4)将步骤3)中的离心管进行4℃36000～40000rpm超速离心2～3h，离心结束后用无菌针头在离心管底部扎小洞，用无菌离心管承接最初流出的1～1.3mL溶液，即为粗提液；
5)将步骤4)得到的2个离心管中的粗提液倒入1个新的超速离心管中，并加入提取缓冲液将总体积配至9mL，颠倒混匀后从离心管底部缓慢加入1mL蔗糖垫，进行4℃36000～40000rpm超速离心2～3h；
6)将步骤5)中的离心管用针头在离心管底部扎小洞，弃去最初流出的300μL溶液，并用无菌离心管承接随后流出的400μL病毒提取液，即得到有活性的柑桔黄化脉明病毒，冰上放置备用；
以上所述提取缓冲液为用pH 7.4 40mM磷酸盐缓冲液配制的4～6％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT；以上所述蔗糖垫为用pH 7.4 40mM磷酸盐缓冲液配制的65～75％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT；所述pH 7.4 40mM磷酸盐缓冲液用K2HPO4、KH2PO4和无菌水制得。
作为优选地，所述提取缓冲液为用pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的5％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT；所述蔗糖垫为用pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的70％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT；所述pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液每升含32.08mL 1MK2HPO4、7.92mL 1M KH2PO4，用无菌水定容至1L。
作为优选地，所述步骤4)中用无菌离心管承接最初流出的粗提液，承接体积为1.0mL。
作为优选地，所述步骤4)、5)中的超速离心转速为38000rpm，离心2h。
本发明的有益效果是：解决了当前柑桔黄化脉明病毒只能通过嫁接植株活体保存、无法进行离体保存，且现有其它植物病毒的离体保存技术均不适用于柑桔黄化脉明病毒的问题。本发明方法可避免传统的柑桔黄化脉明病毒活体嫁接保存方法在连续嫁接接种过程中可能出现的病毒变异以及植株中混有其它病毒造成的污染问题。通过本发明方法离体保存的柑桔黄化脉明病毒在保存2年后仍能保持极高的侵染活性，能高效侵染多种柑桔品种，可应用于制备高度专一的抗血清，致病性鉴定、病毒特性分析，以及抗性品种测定等，应用范围广，对柑桔黄化脉明病毒的进一步研究具有极其重要的意义。
附图说明
图1为用本发明保存方法保存的柑桔黄化脉明病毒接种植株后的RT-PCR检测结果电泳条带图；其中：1：100bp标准分子量，2：水对照，3-8：接种植株，9：负对照，10-11：正对照。
图2为采用本发明方法保存的柑桔黄化脉明病毒接种尤力克柠檬植株后表现脉明、黄化典型症状的叶片。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明作进一步的详细说明：
主要试剂及生产者：
Miracloth滤膜(Merck Millipore公司，德国)
Sephadex G-50-80构成的微柱(Sigma公司，美国)
PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒(TaKaRa公司，日本)
pMD19-T载体(TaKaRa公司，日本)
感受态菌株JM-109(TaKaRa公司，日本)
DIECA(二乙胺基二硫代甲酸钠)(上海生工生物工程有限公司，中国)
EDTA(乙二胺四乙酸)(上海生工生物工程有限公司，中国)
DTT(二硫苏糖醇)(上海生工生物工程有限公司，中国)
Triton X-100(上海生工生物工程有限公司，中国)
Tris(三羟甲基氨基甲烷)(上海生工生物工程有限公司，中国)
SDS(十二烷基硫酸钠)(上海生工生物工程有限公司，中国)
TES缓冲液(1M Tris-HCl 50mL，0.5M EDTA2mL，SDS 10g，用水定容至500mL，pH8.0，高温灭菌后保存)
实施例1 柑桔黄化脉明病毒的提取
本实施例中所用提取缓冲液为用pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的5％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT。所用蔗糖垫为用pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的70％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT。pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液每升用32.08mL 1M K2HPO4，7.92mL 1M KH2PO4和无菌水配得。
提取柑桔黄化脉明病毒，按照如下步骤操作：
1)将5～10g柑桔黄化脉明病病株的叶片或树皮(植株来源于西南大学柑桔研究所毒源库)在液氮中研磨成粉状转移至一干净的无菌50mL离心管中，并按重量/体积比加入3倍体积(即1g病株组织加入3mL提取缓冲液)的提取缓冲液进行匀浆。
2)匀浆后将离心管在冰上静置5min，将混液经三层纱布进行过滤，将滤液进行4℃5000rpm离心20min，获得的上清液经Mira cloth滤膜过滤后，倒入10mL超速离心管中，每管加入9mL上清液，不足9mL时用提取缓冲液进行补充。
3)随后用1mL微量注射器在超速离心管的底部缓慢的加入1mL蔗糖垫。注意该过程不能发生抖动或产生气泡。
4)将步骤3)的离心管用美国Beckman公司的SW40Ti超离转头进行4℃38000rpm超速离心2h。离心结束后，用无菌针头在离心管底部扎一小洞，用一无菌的1.5mL离心管承接最初流出的1～1.3mL溶液，即为粗提液。
5)将步骤4)得到的2个无菌1.5mL离心管中的粗提液倒入1个新的10mL超速离心管中，并加入提取缓冲液，将总体积配至9mL(整个转移过程不得使用移液器)。颠倒混匀后，再用1mL微量注射器在超速离心管的底部缓慢加入1mL蔗糖垫。随后使用SW40Ti超离转头进行4℃38000rpm超速离心2h。
6)超速离心结束后，用针头在离心管底部扎一小洞，弃去最初流出的300μL溶液，并用无菌离心管承接随后流出的400μL病毒提取液，冰上放置备用。
实施例2 柑桔黄化脉明病毒的长期离体保存
在实施例1中获得的柑桔黄化脉明病毒提取液中加入等体积的保护剂，颠倒混合(不能进行斡旋或用移液器混合)后迅速置于液氮中2～3min，然后转移至-80℃超低温冰箱保存；所述保护剂为用PBS缓冲液配制的含15％葡萄糖，5％蛋白胨，以及10％甘油的溶液；所述的用于配制保护剂的PBS缓冲液为：将NaCl 8g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，KCl0.2g，NaN3 0.2g，吐温-20 0.5mL，用1000mL去离子水溶解混匀，高温灭菌后保存备用。
所述保护剂和PBS缓冲液的组分比例在以下范围也可实现本实施例：保护剂为用PBS缓冲液配制的含13～17％葡萄糖，5～7％蛋白胨以及10～30％甘油的溶液；所述的用于配制保护剂的PBS缓冲液为：将NaCl 6.8～8g，Na2HPO4·12H2O 2.2～2.9g，KH2PO4 0.1～0.2g，KCl 0.15～0.2g，NaN3 0.2～0.5g，吐温-20 0.5～1.5mL，用1000mL去离子水溶解混匀，高温灭菌后保存备用。
实施例3 柑桔黄化脉明病毒的接种
接种实施例2中保存的柑桔黄化脉明病毒，操作步骤如下：
1)接种时先将在-80℃超低温冰箱保存了两年的柑桔黄化脉明病毒混合液取出放于冰上解冻。
2)用无菌手术刀在无病毒的尤力克柠檬植株上划开3～5处大小为0.3cm×5cm，且深至韧皮部的伤口，该伤口处的皮仍需保留。
3)用削了头的无菌枪头在每个伤口处滴加步骤1)中溶解后的10μL柑桔黄化脉明病毒混合液，使得该混合液充分润湿伤口处的韧皮部及其相应皮的内侧。将伤口处原有的皮盖住伤口后并用嫁接薄膜将伤口绑紧。接种6株。然后将植株放于20～25℃，光照/黑暗各12h的温室中培养。给植株浇水时避免沾到伤口，其它管理同日常苗木管理。
实施例4 保存的柑桔黄化脉明病毒的侵染性鉴定
将实施例3中接种后在温室管理1个月后的植株按照周常勇等(一种微量、快速抽提柑橘衰退病毒(CTV)核酸应用于RT-PCR扩增的方法，福建农业学报.2001，30(增)：200)的方法提取接种植株的新梢，以及正对照植株(用传统方法嫁接接种CYVCV的尤力克柠檬)的总核酸，然后进行RT-PCR检测。具体操作步骤如下：
1)称取5～10mg植株的皮或叶装入一无菌离心管中，在液氮中研磨后依次加入60μL TES缓冲液和60μL饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)混合液，混匀。
2)70℃水浴5～10min。然后室温下13000rpm离心5min，吸取40μL上清液加入由Sephadex G-50-80构成的微柱中4℃，5000rpm离心4min，用一新无菌离心管收集洗脱液。-20℃保存备用。
3)用PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒对获得的总核酸进行RT-PCR检测，所用引物为陈洪明等(尤力克柠檬上一种新病害的生物学特性及RT-PCR检测，2015)发表的上游引物：5’-TACCGCAGCT ATCCATTTCC-3’和下游引物：5’-GCAGAAATCCCGAACCACTA-3’。反应条件为50℃30min；94℃2min；94℃30sec,55℃30sec,72℃30sec，循环30次；72℃5min。
4)RT-PCR检测结果显示，所有接种植株和正对照均可检测出CYVCV(电泳条带如图1所示，均检测得到一条614bp的条带)。PCR产物纯化后与pMD19-T载体于4℃连接过夜，并转化感受态菌株JM-109。挑取单个的转化菌落，加LB液体培养基培养24h后送阳性克隆进行测序。结果与CYVCV毒株Y1(NCBI号：JX040635.1)相应序列的相似性为100％，进一步证实感染了CYVCV。此外，接种后1个月的尤力克柠檬新梢表现出与正对照植株(用传统方法嫁接接种CYVCV的尤力克柠檬)上相同的黄化、脉明症状。表明本发明的柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法完全可靠，病毒在保存2年以后对植株进行接种仍然具有很强的侵染性。
实施例5 柑桔黄化脉明病毒不同保存方法的比较
采用7种方法A、B、C、D、E、F、G，来进行柑桔黄化脉明病毒不同保存方法效果的比较实验。7种方法具体如下：
方法A：本发明的病毒保存方法。
方法B：在用实施例1的方法获得的柑桔黄化脉明病毒提取液中加入等体积甘油，混匀后-80℃保存。
方法C：在用实施例1的方法获得的柑桔黄化脉明病毒提取液中加入等体积PBS缓冲液，混匀后-80℃保存；所述PBS缓冲液为：将NaCl 8g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，NaN3 0.2g，吐温-20 0.5mL，用1000mL去离子水溶解混匀，高温灭菌后保存备用。
方法D：参照熊克娟等(常见植物病毒冷冻干燥方法的改进与效果观察.华中农业大学学报,1999,18(2)：151-153.)的方法，将冻干机预冷到-40℃，将病毒提取液分装入开盖无菌1.5mL离心管中，上机真空干燥，保持真空腔中压强为2×10-2bar，连续12h。打开真空腔后迅速盖紧盖子，-80℃保存。
方法E：病叶放入一开口的封口袋中，按照方法D进行冷冻干燥处理后，打开真空腔后迅速封死封口袋。-80℃保存。
方法F：参照杨清华等(大豆花叶病毒保存方法的比较研究.2010.大豆科学，29(2)：260-263)的方法，将柑桔黄化脉明病株组织浸入液氮中2min后，超低温保存于-80℃。
方法G：参照熊克娟等(常见植物病毒冷冻干燥方法的改进与效果观察.华中农业大学学报,1999,18(2)：151-153.)的方法，将柑桔黄化脉明病株的幼嫩组织剪成细丝状，迅速放入装有等体积颗粒状无水CaCl2 40mL离心管中，并用封口膜封口，4℃保存。
采用以上7种方法将柑桔黄化脉明病毒提取液或者植物病株组织保存0.5、1、1.5和2年后，在保存第0.5、1、1.5和2年时，将方法E、F、G中保存的冷冻组织取出分别按实施例1的方法提取得到病毒提取液，将得到的病毒提取液和解冻后的方法A、B、C保存的病毒提取液，以及方法D中的干粉用50μL实施例1中的提取缓冲液溶解后，分别接种于1年生无病毒尤力克柠檬、邓肯葡萄柚和甜橙铜水72-1，每种方法的病毒提取液各接种10株。接种3个月后，分别按照实施例4中的方法通过RT-PCR检测植株感染CYVCV的情况，结果表明，采用本发明中的病毒保存方法在保存2年后接种植株的发病率仍为100％，远高于其它病毒保存方法，且尤力克柠檬和铜水72-1等敏感品种均表现出与正对照(常规嫁接接种植株)相同的黄化、脉明症状。接种6个月后的检测结果与3个月时的一致。
表1 不同保存方法CYVCV的侵染性比较
注：表中数据分子为检测为CYVCV阳性的样品数，分母为检测的总样品数。
Claims (5)
1.一种柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法，其特征在于：在有活性的柑桔黄化脉明病毒提取液中加入等体积的保护剂，颠倒混合后迅速置于液氮中2～3min，然后转移至-80℃超低温冰箱保存；所述保护剂为用PBS缓冲液配制的含13～17％葡萄糖，5～7％蛋白胨以及10～30％甘油的溶液；所述的用于配制保护剂的PBS缓冲液为：将NaCl 6.8～8g，Na2HPO4·12H2O 2.2～2.9g，KH2PO4 0.1～0.2g，KCl 0.15～0.2g，NaN3 0.2～0.5g，吐温-200.5～1.5mL，用1000mL去离子水溶解混匀，高温灭菌后保存备用；
所述有活性的柑桔黄化脉明病毒提取液由包括以下步骤的提取方法获得：
1)取柑桔黄化脉明病病株组织5～10g在液氮中研磨，研磨后按照重量/体积比加入2～4倍体积的提取缓冲液进行匀浆；
2)将步骤1)得到的匀浆液在冰上静置3～7min，用纱布过滤，将滤液4℃3000～5000rpm离心15～25min后取上清，将上清液用Miracloth滤膜过滤，滤液倒入超速离心管中，每管分装9mL滤液；
3)在步骤2)中的离心管中从底部缓慢加入1mL蔗糖垫；
4)将步骤3)中的离心管进行4℃36000～40000rpm超速离心2～3h，离心结束后用无菌针头在离心管底部扎小洞，用无菌离心管承接最初流出的1～1.3mL溶液，即为粗提液；
5)将步骤4)得到的2个离心管中的粗提液倒入1个新的超速离心管中，并加入提取缓冲液将总体积配至9mL，颠倒混匀后从离心管底部缓慢加入1mL蔗糖垫，进行4℃36000～40000rpm超速离心2～3h；
6)将步骤5)中的离心管用针头在离心管底部扎小洞，弃去最初流出的300μL溶液，并用无菌离心管承接随后流出的400μL病毒提取液，即得到有活性的柑桔黄化脉明病毒，冰上放置备用；
以上所述提取缓冲液为用pH 7.440mM磷酸盐缓冲液配制的4～6％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT；以上所述蔗糖垫为用pH 7.440mM磷酸盐缓冲液配制的65～75％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT；所述pH 7.440mM磷酸盐缓冲液用K2HPO4、KH2PO4和无菌水制得。
2.如权利要求1所述的柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法，其特征在于：所述保护剂为用PBS缓冲液配制的含15％葡萄糖，5％蛋白胨以及10％甘油的溶液；所述的所述的用于配制保护剂的PBS缓冲液为：将NaCl 8g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，NaN30.2g，吐温-20 0.5mL，用1000mL去离子水溶解混匀，高温灭菌后保存备用。
3.如权利要求1所述的柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法，其特征在于：所述病毒提取方法中的提取缓冲液为用pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的5％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT；所述蔗糖垫为用pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液配制的70％(w/v)的蔗糖溶液，并且含有10mM DTT；所述pH7.4、40mM的磷酸盐缓冲液每升含32.08mL 1M K2HPO4、7.92mL 1MKH2PO4，用无菌水定容至1L。
4.如权利要求1所述的柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法，其特征在于：所述病毒提取方法中的步骤4)中用无菌离心管承接最初流出的粗提液，承接体积为1.0mL。
5.如权利要求1所述的柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法，其特征在于：所述病毒提取方法中的步骤4)、5)中的超速离心转速为38000rpm，离心2h。
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