BR112015002126B1

BR112015002126B1 - Método de purificação das proteínas l1 do papiloma vírus humano

Info

Publication number: BR112015002126B1
Application number: BR112015002126-3A
Authority: BR
Inventors: Hong-Jin Kim; Hyoung Jin Kim
Original assignee: Posvax Co., Ltd
Priority date: 2012-07-30
Filing date: 2013-07-30
Publication date: 2022-10-04
Also published as: CA2880420C; JP6014763B2; EP2881401B1; AU2013297306B2; KR101559622B1; US9994618B2; CA2880420A1; MX2015001413A; JP2015524817A; MX361186B; CN104507956A; CN104507956B; KR20140018794A; EP2881401A4; AU2013297306A1; CL2015000037A1; BR112015002126A2; US20150266927A1; WO2014021604A1; EP2881401A1

Abstract

MÉTODO DE ALTA EFICIÊNCIA PARA A PURIFICAÇÃO DE PARTÍCULAS SEMELHANTE A VÍRUS DO PAPILOMA VÍRUS HUMANO. Proporciona-se um método de purificação das proteínas L1 do papiloma vírus humano (HPV), com elevado grau de pureza e elevada eficiência. De acordo com o método de purificação, a pureza e o rendimento de purificação das proteínas L1 de HPV podem ser consideravelmente aumentados, quando o aquecimento/resfriamento é realizado pelo tratamento de um homogenato de células com um agente redutor. Adicionalmente, as VLPs da proteína L1 de HPV purificadas pelo método de purificação têm excelente antigenicidade e imunogenicidade.

Description

Campo técnico

[001] A presente invenção refere-se a um método de purificação de partículas semelhantes a vírus (VLPs) do vírus do papiloma humano (HPV), tendo excelentes características estruturais e imunológicas com alta eficiência.

Estado da técnica

[002] O HPV é um patógeno causador de aproximadamente 100% dos casos de câncer do colo do útero [1]. Divulga-se que, anualmente, 500 mil mulheres são diagnosticadas com câncer do colo do útero, em todo o mundo, e 250.000 mulheres morrem de câncer cervical [2]. Os tipos 16, 18, 45, 31, 33, 52, 58, 35 e 59 são conhecidos como tipos de HPV de alto risco, que causam câncer do colo do útero, enquanto que os tipos 6 e 11 são conhecidos como tipos de HPV de baixo risco [3, 4]. Em particular, os HPV 16 e HPV 18 são conhecidos por causar 70% de todos os casos de câncer cervical, e, assim sendo, são reconhecidos como os tipos mais importantes na prevenção de câncer de colo do útero [5]. Os tipos de HPV que causam câncer cervical variam em função da região [5]. Na África, Europa, América do Norte e Central e América do Sul, as infecções por HPV 16, HPV 18, HPV 31 e HPV 45 são as principais causas do câncer de colo do útero, e na Ásia, as infecções por HPV 16, HPV 18, HPV 58 e HPV 33 são as principais causas do câncer cervical [5].

[003] Um capsídeo do HPV é composto da proteína L1, como um principal antígeno, e da proteína L2 como um antígeno secundário [6]. Aqui, a proteína L1 tem sido utilizada como um antígeno para vacina profilática de cancro do colo do útero e um antígeno para diagnóstico, uma vez que tem uma propriedade de se auto montar, formando as partículas semelhantes a vírus (VLPs) [6, 27]. A proteína L1 recombinante foi produzida em células Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Lactobacilus casei, ou Spodoptera frugiperda (Sf) ou células vegetais, como células de expressão [7-12, 28]. Atualmente, as vacinas contra o câncer do colo do útero, comercialmente disponíveis, são GardasilTM (Merck) e CervarixTM (GlaxoSmithKline, GSK). O GardasilTM inclui L1 de VLPs como antígenos, em relação aos HPV 16, HPV 18, HPV 11 e HPV 6, e o CervarixTM inclui L1 de VLPs como antígenos, em relação aos HPV 16 e HPV 18 [13].O GardasilTM usa a Saccharomyces cerevisiae como uma célula que expressa antígeno, e CervarixTM usa células Spodoptera frugiperda (Sf), que são células de insetos, como células que expressam antígenos [13,14]. Ambas as vacinas são injetadas por via intramuscular e têm o custo elevado de US$ 120, para uma dose, e US$ 360, para três doses [15]. Devido aos elevados custos da injeção das vacinas contra o câncer do colo do útero, comercialmente disponíveis, estas vacinas têm várias limitações para serem amplamente utilizadas em um país em desenvolvimento, que é uma região em que a incidência de câncer cervical principalmente ocorre [16]. Assim, o desenvolvimento de uma vacina de baixo custo e altamente eficaz contra o cancro do colo do útero ainda continua sendo uma questão importante.

[004] No caso de um fármaco, utilizando proteína recombinante, o custo para o processamento downstream é tão elevado e representa 80% do custo total de produção [17]. Para produzir um antígeno para a vacina contra o cancro do colo do útero, um método é usado de, sequencialmente, aumentar a pureza de um antígeno alvo, através de várias etapas de purificação no processo downstream [18]. No caso das VLPs produzidas com Saccharomyces cerevisiae, para aumentar a pureza da proteína alvo, tem sido principalmente usada uma almofada de sacarose, por ultracentrifugação ou cromatografia de exclusão de tamanho. Para purificar as VLPs, Hofmann et al. usaram uma almofada de sacarose por ultracentrifugação, cromatografia por troca aniônica, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de exclusão de tamanho [19]. Kim et al., sequencialmente, usaram uma almofada de sacarose por ultracentrifugação, cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia por troca catiônica, para purificar as VLPs [7]. Park et al. usaram um método de purificação que inclui precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de exclusão de tamanho, e cromatografia por troca catiônica, os quais foram realizados sequencialmente [20]. De acordo com os métodos, VLPs de alta pureza podem ser obtidas, porém os métodos têm um limite para aumentar uma unidade de purificação, e não são adequados para ser aplicados na produção em larga escala.

[005] Para a produção em larga escala de VLPs do HPV, produzido pela Saccharomyces cerevisiae, foram utilizados os seguintes métodos. Cook et al. usaram um método de, sequencialmente, utilizar microfiltração de fluxo cruzado, cromatografia por troca catiônica, e cromatografia de hidroxiapatita [21]. Kim et al. usaram um método de purificação de VLPs, através de cromatografia de afinidade à heparina ou de cromatografia por troca catiônica, após a remoção das proteínas estranhas, mediante a precipitação de sulfato de amônio, e da etapa de remoção de contaminantes precipitados [22]. A proteína L1 de HPV produzida pela Saccharomyces cerevisiae representa não mais do que 1% de todas as proteínas homogeneizadas conhecidas, e a sua recuperação não é fácil [20]. Para purificar VLPs de HPV, produzidas por um método de preparação de uma proteína recombinante com elevado grau de pureza, várias etapas de precipitação e cromatografia devem ser realizadas e repetida diálise é também necessária. Além disso, uma vez que as VLPs de HPV são facilmente fracionadas, a montagem das VLPs em uma excelente estrutura é considerada muito importante [31]. Embora os pesquisadores tenham feito um grande esforço para desenvolver um processo, que efetivamente remova uma substância estranha em um homogenato de uma célula hospedeira, assim como um sistema de expressão em levedura, a tecnologia para purificar as VLPs, com alta eficiência, definitivamente ainda não progrediu.

[006] Ao longo da descrição, várias publicações e documentos de patentes são mencionados e citações dos mesmos são representadas. O conteúdo das publicações e dos documentos de patentes citados está inserido na descrição como referências, e, assim, o nível da área da tecnologia, incluindo a presente invenção e o seu conteúdo, são explicados de forma mais clara.

Divulgação Problema técnico

[007] Os inventores fizeram um esforço para desenvolver um novo método de purificação de proteínas L1 de HPV, produzidas por uma célula hospedeira que expressa uma proteína L1 de HPV, com elevada pureza e alta eficiência. Como resultado, o fato de que, quando as proteínas L1 do HPV foram purificadas por cromatografia, incluindo o tratamento de um homogenato de célula hospedeira, que expressa a proteína L1 de HPV, com um agente redutor ou tratamento de um homogenato com um agente redutor e a realização do aquecimento e resfriamento, a pureza das proteínas L1 de HPV pode ser notavelmente aumentada e as características estruturais e imunológicas das VLPs montadas das proteínas L1 também podem ser notavelmente aumentadas, foi confirmado por um experimento, e, portanto a presente invenção foi completada.

[008] Por conseguinte, a presente invenção está direcionada para proporcionar um método de purificação da proteína L1 de HPV, com elevada pureza e alta eficiência.

[009] O objeto e vantagens da presente invenção ficam mais aparentes através da descrição detalhada, reivindicações e desenhos da invenção.

Solução técnica

[0010] Em um aspecto da presente invenção, a mesma proporciona um método de purificação de proteínas L1 de HPV, que inclui: (a) cultura de células hospedeiras transformadas, que expressam uma proteína L1 de HPV, colhendo as células hospedeiras cultivadas e fracionando as células; (B) adição de um agente redutor a um homogenato de células hospedeiras; e purificação das proteínas L1 de HPV, por meio da realização de cromatografia do homogenato das células hospedeiras, ao qual é adicionado o agente redutor.

[0011] Em outro aspecto, de acordo com a presente invenção, é proporcionado um método de purificação de proteínas L1 de HPV. O método inclui (i) cultura de células hospedeiras transformadas, que expressam uma proteína L1 de HPV, colhendo as células hospedeiras cultivadas e fracionando as células; (ii) adição de um agente redutor a um homogenato de células hospedeiras; (iii) aquecimento e resfriamento do homogenato de células hospedeiras, ao qual é adicionado o agente redutor; e (iv) purificação das proteínas L1 de HPV por meio da realização de cromatografia ao homogenato aquecido e resfriado das células hospedeiras.

[0012] Como resultado dos esforços para desenvolver um novo método de purificação de proteínas L1 de HPV, produzidas pelas células hospedeiras fabricadas para expressar a proteína L1 de HPV, com elevada pureza e alta eficiência, foi confirmado por um experimento que, quando as proteínas L1 de HPV são purificadas por cromatografia depois de um homogenato de células hospedeiras, que expressam a proteína L1 de HPV, é tratado com um agente redutor, ou um homogenato é aquecido e resfriado depois de ser tratado com um agente redutor, a purificação das proteínas L1 de HPV é notavelmente aumentada, e as características estruturais e imunológicas da VLP, montada pela proteína L1, podem mostrar-se excelentes, e, assim, a presente invenção foi completada.

[0013] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes mediante as seguintes operações: (i) operação de cultura de células hospedeiras transformadas, que expressam proteínas L1 de HPV, colhendo as células hospedeiras cultivadas e fracionando as células.

[0014] O termo "proteína L1 de HPV", aqui utilizado refere-se a uma proteína principal, que constitui a cápside de HPV, que é expressa por um gene L1 de HPV. As proteínas L1 se auto montam unicamente em VLPs ou em combinação com proteínas secundárias, as proteínas L2, para construir as cápsides.

[0015] Papiloma vírus é um vírus genoma de DNA icosaedral, que tem um máximo de oito genes precoces (E) e dois genes tardios (L), e um tamanho de 50 a 60 nm, e nenhum envelope. No gene E, o "E" significa precoce, e no gene L, o "L" significa tardio. O gene E é um gene envolvido na replicação e transformação de vírus. Os genes L1 e L2 codificam uma proteína da cápside do vírus. A proteína L1 é a proteína principal da cápside e tem um peso molecular de 55 a 60 kDa. A proteína L2 é uma proteína secundária da cápside, que tem um peso molecular estimado de 55 a 60 kDa e um peso molecular aparente de 75 a 100 kDa, medido por PAGE.

[0016] No método da presente invenção, um tipo de HPV, do qual a proteína L1 é derivada, pode ser selecionado do, mas não é particularmente limitado a, grupo que consiste de HPV tipo 6a, HPV tipo 6b, HPV tipo 11, HPV tipo 16, HPV tipo 18, HPV tipo 30, HPV tipo 31, HPV tipo 33, HPV tipo 35, HPV tipo 39, HPV tipo 41, HPV tipo 42, HPV tipo 43, HPV tipo 44, HPV tipo 45, HPV tipo 51, HPV tipo 52, HPV tipo 54, HPV tipo 55, HPV tipo 56, HPV tipo 58, HPV tipo 68 e HPV tipo 70, e, ainda mais preferível, a proteína L1, da presente invenção, pode ser derivada de HPV selecionado do grupo que consiste de HPV tipo 6a, HPV tipo 6b, HPV tipo 11, HPV tipo 16, HPV tipo 18, HPV tipo 31, HPV tipo 33, HPV tipo 45 e HPV tipo 58, e, ainda mais preferível, derivada do HPV tipo 16, HPV tipo 18, ou HPV tipo 58.

[0017] Na presente invenção, as células usadas como células hospedeiras são bactérias, células de leveduras, células de insetos, células vegetais ou células animais.

[0018] De acordo com uma forma de realização exemplificativa da presente invenção, a célula de levedura é Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces pombe, Pichia Pastoris, ou Hansenula polymorpha.

[0019] Na presente invenção, as células hospedeiras transformadas, que expressam uma proteína L1 de HPV, são células hospedeiras transformadas por um vetor de expressão, que expressa com sucesso uma proteína L1 de HPV. O vetor de expressão pode incluir um fator regulatório de transcrição ou translação, conhecido na arte, ou um gene marcador. A célula hospedeira transformada, que expressa a proteína L1 de HPV da presente invenção, pode ser facilmente fabricada usando um método conhecido no estado da técnica. (ii) operação de adição de agente redutor no homogenato de células hospedeiras.

[0020] O termo "agente redutor", aqui utilizado, refere-se a um elemento ou composto, que doa elétrons para outras espécies, em uma reação de oxidação-redução, e, de preferência, um composto utilizado para reduzir uma ligação dissulfeto em um peptídeo ou proteína ou estabilizar um grupo sulfidrilo livre.

[0021] Na presente invenção, o agente redutor é selecionado, por exemplo, do grupo que consiste de β-mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetilamina-HCl, tris (2- carboxietil) fosfina (TCEP) e cisteína-HCl, e, de preferência, β-mercaptoetanol ou DTT.

[0022] Na presente invenção, a concentração final do agente redutor no homogenato de células pode ser de 0,1% em peso, ou mais preferível de 0,1% a 20%, em peso, ainda mais preferível de 0,1% a 10%, em peso, adicionalmente mais preferível de 1% a 8%, em peso, ainda mais preferivelmente de 3% a 7%, em peso, e muito mais preferível de 4% a 6%, em peso.

[0023] Na presente invenção, o tempo de reação do agente redutor com o homogenato de células não está limitado a um intervalo de tempo específico, e um perito na técnica pode selecionar um tempo de reação adequado para o método da presente invenção. (iii) operação de aquecimento e resfriamento do homogenato de células hospedeiras, ao qual é adicionado o agente redutor.

[0024] Na presente invenção, o agente redutor é adicionado ao homogenato de células e o aquecimento e resfriamento são realizados. Como se comprovou no resultado de um experimento, em uma forma de realização exemplificativa, quando o homogenato de células, ao qual o agente redutor é adicionado, é aquecido e resfriado, a eficiência na remoção de impurezas do homogenato de células hospedeiras transformadas é notavelmente aumentada, e as VLP montadas de proteínas L1 têm uma preferida característica estrutural e imunológica.

[0025] Na presente invenção, a temperatura de aquecimento do homogenato de células é superior à temperatura ambiente, de preferência, mais do que 25o C, mais preferivelmente maior do que 25o C e menor do que 80o C, ainda mais preferível de 30o C a 65o C, ainda mais preferível de 35oC a 65 o C, e muito mais preferível de 35o C a 60 o C, e a condição de aquecimento ideal é de 35 o C a 55o C.

[0026] Na presente invenção, o tempo de aquecimento do homogenato de células pode ser alterado, de acordo com a temperatura de aquecimento, e pode ser adequadamente selecionado no intervalo de 10 minutos a 72 horas, porém a presente invenção não está limitada a esse intervalo. O tempo de aquecimento é, de preferência, de 30 minutos a 72 horas, mais preferível de 30 minutos a 48 horas, ainda mais preferível de 30 minutos e 24 horas, e muito mais preferível de 30 minutos a 12 horas.

[0027] Na presente invenção, a temperatura de resfriamento é uma temperatura na qual uma amostra de homogenato de células não congela. A temperatura de resfriamento é de 0 a 10o C, de preferência superior a 0o C e inferior a 8 o C, mais preferencialmente, superior a 0o C e inferior a 7o C, ainda mais preferível, superior a 0o C e inferior a 6 o C, e muito mais preferível, superior a 0o C e inferior a 5o C. O tempo de resfriamento pode ser utilizado para selecionar um tempo de resfriamento adequado para o método da presente invenção.

[0028] Entretanto, de acordo com o exemplo, o homogenato de células hospedeiras, aos qual o agente redutor é adicionado, não pode ser aquecido e resfriado, porém sim mantido na temperatura ambiente.

[0029] O termo "temperatura ambiente", aqui utilizado, é uma temperatura atmosférica não aquecida ou não resfriada, que varia de 15o C a 25o C. (iv) operação de purificação de proteínas L1 de HPV, pela realização de cromatografia no homogenato de células hospedeiras, ao qual o agente redutor é adicionado, ou o homogenato aquecido e resfriado das células hospedeiras.

[0030] As proteínas L1 de HPV são purificadas, através da realização de purificação com base em cromatografia no homogenato de células hospedeiras, ao qual o agente redutor é adicionado, ou através da realização de purificação com base em cromatografia em homogenato de células hospedeiras, após a adição de um agente redutor ao homogenato, e aquecimento e resfriamento do homogenato.

[0031] Na presente invenção, a cromatografia disponível é conhecida na técnica, e pode ser, mas não estar limitado a, por exemplo, cromatografia de troca iónica, assim como cromatografia de troca catiónica ou cromatografia de troca aniónica, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia de afinidade. Na presente invenção, a cromatografia de troca iónica, que é a mais apropriada para a separação de uma proteína ou péptido é, de preferência, utilizada, uma vez que a substância a ser separada e purificada é a proteína. Em um exemplo da presente invenção, um tipo de cromatografia de troca catiónica, cromatografia de resina heparina ou cromatografia de troca catiónica, foi usada para separar e purificar com sucesso proteínas L1 de HPV.

[0032] As características e vantagens da presente invenção encontram-se resumidas abaixo: i) a presente invenção proporciona um método de purificação das proteínas L1 de HPV, com elevada pureza e elevada eficiência; ii) o método de purificação da presente invenção é caracterizado pela purificação das proteínas L1, através de cromatografia, após um agente redutor ser adicionado a um homogenato de células hospedeiras transformadas, que expressam proteína L1 de HPV, ou após realizar o aquecimento e resfriamento, depois do tratamento do homogenato de células com o agente redutor; iii) de acordo com o método de purificação da presente invenção, o grau de pureza de purificação da proteína L1 de HPV pode ser notavelmente aumentado; iv) as VLPs das proteínas L1 de HPV purificadas, pelo método de purificação da presente invenção, formam uma estrutura de alta qualidade e têm uma excelente imunogenicidade.

Efeitos vantajosos

[0033] A presente invenção refere-se a um método de purificação de proteínas L1 de HPV, com elevada pureza e elevada eficiência. De acordo com o método de purificação da presente invenção, o grau de pureza de purificação da proteína L1 de HPV pode ser notavelmente aumentado, e uma vez que as VLPs da proteína L1 de HPV purificada formam uma estrutura muito similar àquela original da virião de HPV, as VLPs têm uma excelente imunogenicidade.

Descrição dos desenhos

[0034] A figura 1 mostra um método descrito em um documento do estado da técnica para purificar as VLPs de HPV (doravante referido como um método "T-1") e o método da presente invenção (doravante referido como um método "T-5"). Os documentos do estado da técnica relativos ao método T-1 são os seguintes: - (documento do estado da técnica 1) Kim HJ, Kim SY, Lim SJ, Kim JY, Lee SJ, et al. (2010) Purificação cromatográfica de um estágio da proteína L1 tipo 16 do papiloma vírus humano da Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 70: 68-74; - (documento do estado da técnica 2) Kim HJ, Lim SJ, Kim JY, Kim SY, Kim HJ (2009). Um método para a remoção de proteínas contaminantes durante a purificação de proteína L1 tipo 18 de papiloma vírus humano da Saccharomyces cerevisiae. Arch Pharm Res 32: 1759-1766; - (documento do estado da técnica 3) Patente registrada - vacina contra o câncer cervical, pedido No. 10-2011-0137242 (19/12/2011) Patente No. 1011780560000 (21/08/2012); e - (documento do estado da técnica 4) Patente registrada - vacina contra o câncer cervical, pedido No. 10-2009-0099982 (20/10/2009) Patente No. 1011819070000 (05/09/2012).

[0035] Para realizar o método T-5, as células hospedeiras, Saccharomyces cerevisiae, que expressam proteínas L1 de HPV foram fracionadas, e, então, um agente redutor foi adicionado ao homogenato de células. Após de o agente redutor ser tratado, foram realizados o aquecimento e o resfriamento, para remover as impurezas. As proteínas L1, contidas no homogenato de células com impurezas removidas, foram purificadas por cromatografia de afinidade à heparina. As proteínas L1 purificadas pela primeira purificação foram ainda purificadas por uma segunda cromatografia de afinidade à heparina com alta pureza.

[0036] No método T-1, as proteínas L1 no homogenato da Saccharomyces cerevisiae foram recuperadas mediante a precipitação com sulfato de amônio. As impurezas na fração recuperada foram eliminadas através da remoção de contaminantes precipitados. As proteínas L1 no homogenato processado através do método acima foram purificadas por cromatografia de afinidade à heparina.

[0037] A figura 2 mostra o resultado de purificação, obtido pelo método T-5, incluindo a diálise de um homogenato de células hospedeiras, que expressam as proteínas L1, tratando o resultado dialisado com um agente redutor e realizando o aquecimento e o resfriamento, assim como realizando a primeira cromatografia de afinidade à heparina, e o resultado da cromatografia foi confirmado por SDS-PAGE. Depreende-se que a alta pureza das proteínas L1 de HPV foi recuperada, após a primeira cromatografia de afinidade à heparina. LS indica uma amostra que foi carregada em uma resina de heparina e FT indica um fluxo de passagem, que é uma fração que flui, sem ligação com a resina de heparina. W indica uma lavagem, que é uma fração que flui enquanto a resina é lavada e E indica uma eluição, que é uma fração em que a proteína L1 de HPV é eluída com uma solução tampão que inclui 1M de NaCl.

[0038] A figura 3 mostra um resultado de purificação, obtido pelo método T-5, incluindo o tratamento direto de um homogenato de células hospedeiras, que expressam a proteína L1 de HPV, com um agente redutor, sem diálise do homogenato de células, realizando o aquecimento e o resfriamento, assim como a primeira cromatografia de heparina. O resultado cromatográfico foi confirmado por SDS-PAGE. Semelhante ao resultado da figura 2, proteínas L1 de HPV de alta pureza também foram obtidas, após a primeira cromatografia de afinidade à heparina. LS, FT, W e E são aquelas já descritas na figura 2.

[0039] A figura 4a mostra o resultado da purificação obtido pelo método T-5, incluindo o tratamento de um homogenato de células hospedeiras, que expressam a proteína L1 de HPV, com um agente redutor, realizando o aquecimento e o resfriamento, realizando a primeira cromatografia de afinidade à heparina e realizando a segunda cromatografia de afinidade à heparina. O resultado foi confirmado por SDS-PAGE. LS e FT são aquelas já descritas na figura 2. Os números de 3 a 18 mostrados na parte superior da imagem do SDS-PAGE indicam os respectivos números de frações obtidos na eluição de gradiente linear, usando NaCl.

[0040] A figura 4b mostra o perfil da segunda cromatografia de afinidade à heparina. No fluxo de passagem (FT) do SDS-PAGE da figura 4a, a banda de proteína não foi detectada, considerando que, no FT da figura 4b, confirmou-se que fluiu uma grande quantidade de substâncias contaminantes. Deste modo, o resultado da figura 4b mostra que uma quantidade considerável de substâncias contaminantes foi removida pela segunda cromatografia de afinidade à heparina.

[0041] A figura 5 mostra o resultado do SDS-PAGE da cromatografia de afinidade à heparina, de acordo com o método T-1. O tratamento de uma amostra, antes da cromatografia de afinidade à heparina, foi realizado, conforme mostrado na figura 1. LS indica uma amostra carregada. As proteínas ligadas com a resina de heparina foram eluídas, através de um método de gradiente linear de aumento de NaCl. A eluição de gradiente linear foi realizada para ter um conteúdo de NaCl de 0,325 M a 2 M. No resultado do SDS-PAGE, os números da parte superior indicam os números de frações de eluição. Mostra-se que, em frações de 11 a 14, uma proteína L1 foi eluída com elevado grau de pureza.

[0042] A figura 6a mostra um resultado comparativo entre as purezas das VLPs, purificadas pelo método convencional (Método T-1) e o método T-5. A "VLP HPV16 T-1" é um produto purificado por um método convencional conhecido [Kim et al. (2010) Protein Expr Purif 70: 68-74; Kim et al. (2009) Arch Pharm Res 32: 1759-1766], e a “VLP HPV16 T-5” é um produto purificado pelo método da presente invenção. Na análise de SDS-PAGE das proteínas L1 de HPV, a quantificação da proteína foi realizada e as proteínas foram carregadas a 500 ng, 250 ng, 125 ng e 62 ng por fonte. De forma independente, um experimento foi realizado duas vezes e estes respectivos experimentos foram representados como Painel A e Painel B. De acordo com os resultados obtidos pelos dois experimentos, observou-se que a intensidade de uma banda de proteína das VLPs HPV16 T-5 foi muito mais elevada do que a das VLPs HPV16 T-1.

[0043] A figura 6b é um gráfico que mostra as intensidades das bandas de proteína L1 da VLP HPV16 T-1 e da VLP HPV16 T-5 detectadas nos dois experimentos, mostrados na figura 6a. Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão e a intensidade da banda de proteína L1 da VLP HPV16 T-5, carregada a 500 ng por fonte, foi fixada em 100%. Este resultado mostra que a pureza das VLPs purificadas pelo método T-5 é muito superior àquela das VLPs purificadas pelo método T-1.

[0044] A figura 7 mostra o resultado do SDS-PAGE, em que as VLPs HPV16 T-1 foram carregadas para ter a mesma intensidade de uma banda de proteína L1 como aquela das VLP HPV16 T-5.

[0045] A figura 8 mostra os resultados de microscopia eletrônica para as VLP HPV16 T-1 e do VLP HPV16 T-5. Confirmou-se que as VLPs HPV16 T-1 tinham um tamanho de 20 a 50 nm, e as VLPs HPV16 T-5 tinham um tamanho de 40 a 65 nm. Isto significa que o tamanho das VLPs HPV16 T-1 é mais próximo do tamanho original do HPV (de 50 a 60 nm) [29, 30].

[0046] As figuras 9 e 10 mostram resultados de dispersão dinâmica de luz (DLS). A DLS mede o tamanho da VLP em uma solução. A distribuição de tamanho das VLPs na solução foi analisada, utilizando os sistemas de DLS-700 (figura 9) e de ELS-Z2 (figura 10). Como se mostra nos resultados das figuras 9 e 10, verificou-se que as distribuições de tamanho dos dois tipos de VLPs são diferentes. O resultado mostra que as propriedades físicas das VLPs HPV16 T-5 são diferentes daquelas das VLPs HPV16 T-1.

[0047] A figura 11 mostra a reatividade de anticorpos monoclonais, em relação à VLP HPV16 T-1 e à VLP HPV16 T-5. Para investigar a reatividade dos anticorpos monoclonais anti L1 de HPV16, foram usados os anticorpos monoclonais previamente conhecidos, H16.V5 e H16.E70. O aumento na reatividade das VLPs, em relação aos dois anticorpos, é conhecido por ter uma relação próxima com o aumento na imunogenicidade [26, 32-34]. Confirmou- se que a reatividade das VLPs HPV16 T-5, com relação aos anticorpos H16.V5 e H16.E70, é muito maior do aquela das VLPs HPV16 T-1.

[0048] A figura 12 mostra os resultados obtidos através da análise de imunogenicidades das VLPs HPV16 T-1 e das VLPs HPV16 T-1. Para comparar as imunogenicidades, 1 ng de VLPs foi injetada, de forma subcutânea, em um ratinho, com 200 μg de hidróxido de alumínio. A imunização foi realizada quatro vezes, em intervalos de duas semanas. 10 dias após a terceira e quarta imunizações, títulos de anticorpos IgG anti L1 de HPV 16 foram detectados no soro. Como resultado da titulação de anticorpos IgG anti L1 de HPV 16, confirmou-se que o nível de IgG anti L1 de HPV 16 induzido pelas VLPs HPV16 T-5 é 10 vezes maior do que aquele das VLP HPV16 T-1.

[0049] A figura 13 mostra a atividade de neutralização dos anticorpos anti-HPV16 do soro colhido após a quarta imunização realizada conforme a figura 12. A atividade de neutralização do soro do ratinho imunizado com as VLPs HPV16 T-5 foi de 78%, enquanto que a atividade de neutralização do soro do ratinho imunizado com as VLP HPV16 T-1 foi de 33%.

[0050] A figura 14 mostra a comparação dos graus de pureza de uma proteína L1 de HPV purificada, quando o homogenato não foi tratado (sem tratamento), o homogenato foi tratado com um agente redutor (β-ME), e quando o homogenato foi aquecido e resfriado, após o tratamento com um agente redutor (β-ME + aquecimento e resfriamento). Uma amostra envolvendo cada uma das condições foi eluída por uma primeira cromatografia de afinidade à heparina, e o mesmo volume (5, 2,5 ou 1,2 μl) da proteína, para cada condição, foi tomado da fração de eluição e carregado em um gel para executar o SDS-PAGE e o Western blotting. De acordo com o resultado da figura 14, foi confirmado que a pureza da proteína L1 de HPV, quando o homogenato foi tratado com um agente redutor, aquecido e resfriado (T-5, β-ME + aquecimento e resfriamento), é muito maior do que aquela das outras condições.

[0051] A figura 15 mostra a comparação dos graus de pureza de uma proteína L1 do HPV purificada, quando um homogenato não foi tratado (sem tratamento), quando um homogenato foi tratado com um agente redutor (β-ME) e quando um homogenato foi aquecido e resfriado depois de tratamento com um agente redutor (T-5, β-ME + aquecimento e resfriamento). Uma amostra envolvendo cada uma das condições foi eluída por uma primeira cromatografia de afinidade à heparina, e o mesmo volume (1, 0,5 ou 25 μl) da proteína, para cada condição, foi tomado da fração de eluição e carregado em um gel, para executar o SDS-PAGE e o Western blotting. De acordo com o resultado da figura 15, foi confirmado que a pureza da proteína L1 de HPV, quando um homogenato foi tratado com um agente redutor, aquecido e resfriado (T-5, β-ME + aquecimento e resfriamento), é muito maior do que aquela das outras condições.

[0052] A figura 16 mostra a comparação dos graus de pureza de uma proteína L1 do HPV purificada, quando um homogenato não foi tratado (sem tratamento), quando o homogenato não foi tratado com um agente redutor, mas foi apenas aquecido e resfriado (aquecimento e resfriamento), e quando um homogenato foi tratado com um agente redutor, aquecido e resfriado (T-5, β-ME + aquecimento e resfriamento). Uma amostra envolvendo cada uma das condições foi eluída por uma primeira cromatografia de afinidade à heparina, e o mesmo volume (5, 2,5 ou 1,2 μl) da proteína, para cada condição, foi tomado da fração de eluição e carregado em um gel para executar o SDS-PAGE e o Western blotting. De acordo com o resultado da figura 16, foi confirmado que a pureza da proteína L1 de HPV, quando um homogenato foi tratado com um agente redutor, aquecido e resfriado (T- 5, β-ME + aquecimento e resfriamento), é muito maior do que aquela das outras condições.

[0053] A figura 17 mostra um método de purificação com base em cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), um método de purificação com base em precipitação com sulfato de amônio e um método de purificação através de aquecimento e resfriamento após o tratamento com um agente redutor (T-5, β-ME + aquecimento e resfriamento). Para comparar os efeitos da SEC e da precipitação com sulfato de amônio com os do método realizado por aquecimento e resfriamento após o tratamento com um agente redutor, a etapa de aquecimento e resfriamento, após o tratamento com um agente redutor no método de purificação de T-5, foi substituída pela SEC ou pela precipitação com sulfato de amônio. A SEC e a precipitação com sulfato de amônio (com base no método T-1) foram baseadas em um método descrito em um documento do estado da técnica. 1) Documentos da técnica anterior relativos à SEC: - (documento da técnica anterior 1) Park MA, Kim HJ, Kim HJ (2008) Ótimas condições para a produção e purificação da proteína L1 tipo 16 do papiloma vírus humano da Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 59: 175-181. - (documento da técnica anterior 2) Patente registrada. Métodos de produção e purificação partículas semelhantes a vírus HPV, pedido No. 10-2008-0026586 (21/03/2008), Patente registrada No. 1009591450000 (13/05/2010) 2) Documentos da técnica anterior sobre cromatografia com sulfato de amônio: - (documento da técnica anterior 1) Kim HJ, Kim SY, Lim SJ, Kim JY, Lee SJ, et al. (2010) Purificação cromatográfica de uma etapa da proteína L1, tipo 16, do papiloma vírus humano da Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 70: 68-74. - (documento da técnica anterior 2) Kim HJ, Lim SJ, Kim JY, Kim SY, Kim HJ (2009) Um método para a remoção de proteínas contaminantes durante a purificação da proteína L1, tipo 18, do papiloma vírus humano da Saccharomyces cerevisiae. Arch Pharm Res 32: 1759-1766. - (documento da técnica anterior 3) Patente registrada. Vacina contra o câncer cervical, pedido No. 102011-0137242 (19/19/2011) Patente registrada No. 1011780560000 (21/08/2012) - (documento da técnica anterior 4) Patente registrada. Vacina contra o câncer cervical, pedido No. 10.009-0099982 (20/10/2009) Patente registrada No. 1011819070000 (05/09/2012).

[0054] A figura 18 mostra a diferença entre a precipitação com sulfato de amônio, o método de tratamento com agente redutor (β-ME), e o método de purificação realizado por tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento (T-5, β-Me + aquecimento e resfriamento). A pureza da fração de eluição da primeira cromatografia em cada condição de purificação foi analisada por SDS-PAGE e Western blotting. Como resultado, confirmou- se que a proteína L1 recuperada pelo método que inclui o tratamento com β-ME e aquecimento/resfriamento tem a mais alta pureza.

[0055] A figura 19 mostra os resultados do primeiro método de cromatografia de afinidade à heparina, para o método de purificação de acordo com a precipitação com sulfato de amônio e o método de purificação realizado através de aquecimento e resfriamento após o tratamento com um agente redutor (T-5, β-Me + aquecimento e resfriamento). Igualmente ao resultado mostrado na figura 18, foi confirmado que proteína L1 eluída mediante a primeira cromatografia de afinidade à heparina mostrou um elevado grau de pureza no método realizado por tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento, considerando que uma pluralidade de proteínas contaminantes foi incluída em uma fração de proteína L1 eluída, quando a primeira cromatografia de afinidade à heparina foi realizada, após a precipitação com sulfato de amônio. Como resultado do Western blotting, foi confirmado que a proteína L1 não foi ligada a uma coluna de resina e fluiu, na cromatografia de afinidade à heparina, quando a proteína L1 foi purificada por precipitação com sulfato de amônio, e a proteína L1 não fluiu quando a proteína L1 foi tratada com um agente redutor e aquecida/resfriada.

[0056] A figura 20 mostra os resultados do SDS-PAGE e Western blotting, para as frações de eluição da SEC, no método de purificação, de acordo com a SEC. Entre as frações de 3 a 9, as proteínas L1 foram eluídas com elevado grau de pureza, e, consequentemente, frações foram recolhidas na seção, para efeito de comparação.

[0057] A figura 21 mostra os resultados de SDS-PAGE e Western blotting, para as frações de eluição de proteína L1, obtidas na primeira cromatografia, no método de purificação de acordo com a SEC (SEC), no método de purificação de acordo com a precipitação com sulfato de amônio e no método de purificação realizada por tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento (T-5, β-ME + aquecimento e resfriamento). Para a primeira cromatografia, uma amostra para cada condição foi preparada como mostrado na figura 17. Para a SEC, um homogenato de células foi submetido a uma precipitação com sulfato de amônio e à SEC (primeira cromatografia). Para o método de acordo com a precipitação com sulfato de amônio, o homogenato de células foi submetido ao estágio de remoção de contaminantes precipitados, após a precipitação com sulfato de amônio e, em seguida, submetida à cromatografia de afinidade à heparina (primeira cromatografia). Para o método realizado pelo tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento, o homogenato foi tratado com um agente redutor, aquecido e resfriado, e foi submetido à cromatografia de afinidade à heparina (primeira cromatografia). Para a análise de uma fração de eluição, obtida pela primeira cromatografia, a fração de cada condição foi carregada com o mesmo volume (0,35, 0,17 ou 0,08 μl). De acordo com o resultado da análise, verificou-se que as proteínas L1 obtidas pelo método que inclui o tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento têm a mais alta pureza.

[0058] A figura 22 mostra o resultado obtido por uma purificação adicional da proteína L1 de fração de eluição obtida por meio da primeira cromatografia da figura 21, mediante uma segunda cromatografia. A diferença entre as frações de eluição da proteína L1, após a segunda cromatografia, foi analisada por SDS-PAGE e Western blotting. Para a análise, uma fração de eluição, para cada condição de purificação, foi carregada com o mesmo volume (2, 1 ou 0,5 μl). De acordo com o resultado da análise, verificou-se que o método de purificação que inclui o tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento foi o melhor no que diz respeito à taxa de recuperação da proteína L1.

[0059] A figura 23 mostra a reatividade de um anticorpo monoclonal (H16.E70), em relação às proteínas L1 finalmente purificadas na figura 22, que foi analisada por um ensaio imunoenzimático (ELISA). Para revestir as VLPs L1 HPV16 obtidas em cada condição de purificação na mesma quantidade, proteínas L1 obtidas pelo método de purificação de acordo com a SEC (SEC), um método de purificação de acordo com a precipitação com sulfato de amônio e um método de purificação realizado através de aquecimento e resfriamento, após o tratamento com um agente redutor (β-ME + aquecimento e resfriamento) foram ajustadas para ter a mesma concentração, e uma quantidade de proteínas L1 foi detectada por SDS-PAGE e Western blotting (figura 23A). Posteriormente, a reatividade das VLPs L1 HPV16 para o H16.E70 foi detectada pelo ensaio ELISA (figura 23B). Como resultado, verificou-se a VLP L1 HPV16 purificada pelo tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento (VLP L1 HPV16 T-5) teve a melhor reatividade em relação ao H16.E70. Isto mostra que as VLPs L1 HPV16 obtidas pelo método de purificação, realizado por tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento, têm a melhor característica estrutural [26].

[0060] A figura 24 mostra as análises de imunogenicidades de um método de purificação de acordo com a SEC, um método de purificação de acordo com a precipitação com sulfato de amônio e um método de purificação realizada por tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento. Uma quantidade de proteína L1, antes de um rato ser imunizado com VLP L1 HPV16 T-5, foi ajustada para o que foi detectado na figura 23A. 1 ng de VLPs L1 HPV16 foi misturado com 200μg de hidróxido de alumínio e, em seguida, foi injetada de forma subcutânea no rato. A imunização do rato foi realizada quatro vezes em intervalos de duas semanas. Após a quarta imunização, soros de rato foram obtidos e uma atividade de neutralização de cada grupo de ratos foi detectada, por um método convencionalmente conhecido como método com base em pseudovírus, para medir a atividade do anticorpo neutralizante [26]. Como resultado, verificou-se que a atividade de neutralização de rato imunizado com VLPs L1 HPV16, obtidas pela purificação através de cromatografia de exclusão de tamanho, foi de 16%, a atividade de neutralização do rato imunizado com VLPs L1 HPV16, obtidas pela precipitação com sulfato de amônio, foi 28%, e a atividade de neutralização do rato imunizado com VLPs L1 HPV16 obtidas por meio de purificação realizada por tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento foi de 50%. Portanto, concluiu-se que a habilidade da VLP L1 HPV16, obtida através do método de purificação realizado por tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento, de produzir anticorpos neutralizantes é a melhor.

[0061] A figura 25 mostra um efeito, como uma função da temperatura de aquecimento no processo de aquecimento/resfriamento, após o tratamento com um agente redutor no método T-5. Um homogenato de células foi aquecido, a cada temperatura de aquecimento, durante 15 minutos e resfriado e, em seguida, os precipitados contaminantes foram removidos por centrifugação. O painel A mostra as concentrações de proteínas medida, de acordo com a temperatura de aquecimento. O painel B mostra o resultado do SDS-PAGE para as amostras carregadas nas respectivas temperaturas de aquecimento, com o mesmo volume. O painel C representa um resultado do Western blotting, para analisar as proteínas L1 em amostras carregadas nas respectivas temperaturas de aquecimento, com o mesmo volume. O painel D mostra o resultado do Western blotting, para analisar as proteínas L1 em amostras quantificadas nas respectivas temperaturas de aquecimento, quando as amostras foram carregadas a uma mesma quantidade de proteínas. Por conseguinte, o painel D mostra o grau de pureza das proteínas L1. De acordo com o resultado, confirmou- se que as proteínas L1 de HPV16 permanecem no homogenato de células, a uma temperatura de aquecimento de 60o C, e o grau de pureza da proteína L1 foi aumentado quando o homogenato de células foi aquecido de 35 a 50° C.

[0062] A figura 26 mostra um efeito, em função da temperatura de aquecimento na etapa de aquecimento/resfriamento após o tratamento com um agente redutor, na purificação de proteínas L1 de HPV18 de acordo com o método T-5. As descrições detalhadas de cada painel são as mesmas feitas na figura 25. De acordo com o resultado, confirmou-se que as proteínas L1 de HPV18 permanecem no homogenato de células até uma temperatura de aquecimento de 65° C, e o grau de pureza das proteínas L1 foi aumentado quando o homogenato de células foi aquecido de 45 a 55° C.

[0063] A figura 27 mostra o efeito, da etapa de resfriamento, no aquecimento/resfriamento após o tratamento com um agente redutor, na purificação da VLP L1 HPV16 de acordo com o método T-5. O painel A mostra a diferença na concentração de proteína, entre uma amostra que foi aquecida de 45 a 50° C e resfriada (aquecimento e resfriamento) e uma amostra que não foi resfriada (aquecimento). O painel B mostra as quantidades de proteínas L1 analisadas através do Western blotting, para uma amostra aquecida a 45° C e resfriada e uma amostra que não foi resfriada. O painel C mostra quantidades de proteínas L1 analisadas através do Western blotting, para uma amostra aquecida a 50° C e resfriada e uma amostra que não foi resfriada. Este resultado mostra que proteínas contaminantes foram removidas por precipitação, através da etapa de resfriamento, e, em esta operação, não ocorreu perda das proteínas L1.

[0064] A figura 28 mostra o efeito, da etapa de resfriamento, no aquecimento/resfriamento após o tratamento com um agente redutor, na purificação da VLP L1 HPV16 de acordo com o método T-5. Mostra a diferença entre uma amostra que foi aquecida a 45° C e resfriada (HC) e uma amostra que não foi resfriada (H), o que foi analisado por SDS-PAGE e Western blotting. De acordo com os resultados do SDS-PAGE e do Western blotting, confirmou-se que as proteínas L1 não foram reduzidas após a etapa de resfriamento, ao passo que as proteínas contaminantes foram reduzidas.

[0065] A figura 29 mostra os valores numéricos das intensidades das bandas de proteínas contaminantes, proteína 1, proteína 2 e proteína 3, detectados através do SDS-PAGE da figura 28. Isto mostra que as concentrações das proteínas contaminantes foram reduzidas na etapa de resfriamento.

[0066] A figura 30 mostra os resultados obtidos na purificação das VLPs L1 HPV16 e das VLPs L1 HPV18 a uma temperatura de aquecimento de 60° C, de acordo com o método T- 5. O painel A mostra um resultado do SDS-PAGE para a primeira cromatografia. LS Indica uma amostra carregada em uma coluna, e FT indica uma amostra que flui sem estar ligada a uma coluna. Eluição indica uma fração eluída após a ligação a uma coluna de resina. As setas indicam os locais da L1 de HPV16 e da L1 de HPV18. O painel B mostra os resultados do SDS-PAGE para a L1 de HPV16 e a L1 de HPV18, finalmente purificadas após a realização da primeira e da segunda cromatografia. O painel C é uma microscopia de transmissão eletrônica de um produto finalmente purificado. De acordo com o resultado da microscopia eletrônica, foi confirmado que as proteínas L1 purificadas formam as VLPs.

[0067] A figura 31 mostra um resultado obtido pela purificação da L1 de HPV18, por meio da primeira cromatografia, de acordo com o método T-5. Cada fração foi analisada por SDS- PAGE. LS indica uma amostra carregada, FT indica um fluxo de passagem, W Indica uma fração à medida que uma coluna é lavada e E indica uma fração de proteína que foi ligada a uma coluna, eluída pela adição de uma solução tampão que inclui 1M de NaCl. Mostra-se que a L1 de HPV18 foi purificada por cromatografia com elevado grau de pureza, após o tratamento com um agente redutor e aquecimento/resfriamento.

[0068] A figura 32 mostra um resultado por SDS-PAGE para uma fração de proteína L1 de HPV18, eluída após a segunda cromatografia de troca catiônica que foi realizada usando uma fração de eluição da primeira cromatografia da figura 31. LS, FT e W são os mesmos acima descritos. As proteínas ligadas a uma coluna de resina foram eluídas sequencialmente com uma solução tampão contendo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 M de NaCl. Confirmou-se que as proteínas L1 de HPV18 foram eluídas em frações de 0,9 M e 1 M de NaCl.

[0069] A figura 33 mostra um resultado de DLS para VLPs L1 HPV18 purificadas pelo método T-5. O DLS das VLP L1 HPV16 T-5 foi analisado utilizando um sistema ELS-Z2.

[0070] A figura 34 mostra os resultados obtidos por meio da purificação da L1 de HPV58 pelo método de purificação T-5. O painel A mostra um resultado por SDS-PAGE para uma fração de proteína L1 eluída pela primeira cromatografia. O painel B mostra um resultado por SDS-PAGE para segunda cromatografia. A descrição detalhada do painel B é a mesma descrição feita na figura 32.

[0071] A figura 35 mostra os resultados do SDS-PAGE e do Western blotting para as proteínas L1 de HPV58, finalmente recuperadas pelas primeira e segunda cromatografias, de acordo com o método de purificação T-5. Isto mostra que a L1 de HPV58 pode ser purificada com sucesso através de um método de tratamento com agente redutor seguido da realização das etapas de aquecimento/resfriamento.

[0072] A figura 36 mostra uma sequência de ADN que codifica uma proteína L1 de HPV16 (L1 HPV16 NG2). A Saccharomyces cerevisiae foi transformada com um vetor de expressão que abriga o gene L1 HPV16 NG2. As células transformadas foram utilizadas para expressar e purificar a proteína L1 de HPV16. A sequência de ácido nucleico da L1 de HPV16 foi observada como acesso No. KC792555.1 do GenBank.

[0073] A figura 37 mostra uma sequência de ADN que codifica uma proteína L1 de HPV18 (L1 HPV18 NG3). A Saccharomyces cerevisiae foi transformada com um vetor de expressão que abriga o gene L1 HPV18 NG3. As células transformadas foram utilizadas para expressar e purificar a proteína L1 de HPV18. A sequência de ácido nucleico da L1 de HPV18 foi observada como acesso No. KC792556.1 do GenBank.

[0074] A figura 38 mostra sequências de aminoácidos da L1 de HPV16 e da L1 de HPV18 codificadas por L1 HPV16 NG2 e L1 HPV18 NG3, respectivamente. Formas de realização da invenção

[0075] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes adicionais, fazendo referência a exemplos. Os exemplos são proporcionados meramente para explicar a presente invenção em mais pormenores e o escopo da presente invenção não se limita aos exemplos. Ficará claramente entendido, para os peritos na arte, que o âmbito da presente invenção não está limitado aos exemplos, de acordo com a essência da presente invenção. Exemplos

Método do Experimento 1. Cultura de célula

[0076] A Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) Y2805, que expressa uma proteína L1 de HPV, foi cultivada através de um método convencionalmente conhecido [25]. As células, que expressam a proteína L1 de HPV, foram plaqueadas em um meio completo sintético livre de uracilo, isto é, "SD-ura", e cultivadas durante quatro ou cinco dias. Uma colónia isolada foi inoculada em um meio líquido SD-ura e foi cultivada durante dois dias. Para expressar uma proteína L1 de HPV 16 de um promotor GAL10, as células transformadas cultivadas foram cultivadas em um meio YPDG, contendo 1% de um extrato de levedura (Duchefa, Holanda), 2% de peptona (Duchefa), 7% de glicose (Duchefa) e 1% de galactose (Duchefa). Após a cultura, as células cultivadas foram centrifugadas para remover o meio e lavadas com solução tampão fosfato salino (PBS). As células lavadas foram novamente colhidas por centrifugação e armazenadas a -70° C antes da purificação da proteína.

2. Purificação de VLPs de HPV usando o método T-1

[0077] A purificação das VLPs de HPV, através do método T-1, foi realizada por cromatografia de afinidade à heparina após de que as proteínas em um homogenato foram recuperadas por precipitação com sulfato de amônio, como um pellet, através de um método convencionalmente conhecido [22, 23, 24]. Para a cromatografia de afinidade à heparina, foi usada uma resina de heparina HP, marca HiTrapTM (GE Healthcare, EUA). Uma amostra, recuperada das etapas para remoção do sulfato de amônio e para a remoção de contaminantes precipitados, foi dialisada em PBST, contendo 0,325 M de NaCl, e passada por uma resina de heparina, equilibrada com PBST contendo 0,325 M de NaCl. A resina de heparina foi lavada com cinco volumes de leito de resina do tampão (PBS contendo 0,325 M de NaCl), e as proteínas ligadas com a resina foram eluídas por gradiente linear, para incrementar a concentração de NaCl, de 0,325 para 2 M. Entre as frações de eluição, aquelas que incluem L1 de HPV foram selecionadas por SDS-PAGE. As VLPs de L1 de HPV purificadas foram dialisadas em PBS contendo 0,01% de Tween 80 e 0,33 M de NaCl (PBST).

3. Purificação de VLP de HPV pelo método T-5 (método βme + aquecimento e resfriamento) 3-1. Fracionamento celular, tratamento com agente redutor e aquecimento/resfriamento.

[0078] As células cultivadas, que expressam a proteína L1 de HPV, foram misturadas em uma solução tampão de fracionamento (10 mM de fosfato de sódio dibásico, 150 mM de NaCl, 1,7 mM de EDTA, 0,01% de Tween 80 pH 7,2). A mistura de células foi novamente misturada com esferas de vidro de 0,5 mm (Biospec Product, EUA), e as células foram fracionadas por vortex. Os fragmentos celulares foram removidos por centrifugação a 12000 xg durante 15 minutos. Antes da cromatografia em coluna, os lisados celulares foram preparados por dois métodos diferentes. O primeiro método inclui a adição de β-ME no lisado celular, para ter uma concentração final de β-mercaptoetanol (β-ME, Sigma, EUA) de 4 a 6%, em peso, e ajustando o pH para 7,0 a 7,3. O segundo método inclui a dialise do homogenato de células, em uma solução tampão de fracionamento celular (10 mM de fosfato de sódio dibásico, 150 mM de NaCl, 1,7 Mn de EDTA, 0,01% de Tween 80 pH 7,2), durante 4 a 6 horas, e a adição de β-ME ao lisado celular, para ter uma concentração final de β-ME, variando entre 4 a 6%. Subsequentemente, o lisado celular com adição de β-ME foi mantido em um banho de água, em temperatura constante de 25 a 65° C, durante 30 a 50 minutos, e resfriado em gelo de 30 minutos a 3 horas, ou a 4° C durante 16 horas. O lisado celular resfriado foi centrifugado a 12000 xg durante 15 minutos, para remover os contaminantes precipitados.

3-2 Primeira cromatografia

[0079] Um lisado celular, preparado por aquecimento e resfriamento após o tratamento com agente redutor, foi passado por uma resina de heparina (Heparina HP HiTrap™, GE Healthcare, EUA, ou POROS® 50 HE, Applied Biosystems, EUA) ou por uma resina de troca catiônica (POROS® XS, Applied Biosystems, EUA). Antes do homogenato de células ser passado pela resina heparina ou resina de troca catiônica, a resina foi equilibrada com uma solução tampão de fracionamento (10 mM de fosfato de sódio dibásico, 0,15-0,48 M de NaCl, 1,7 mM de EDTA, 0,01% de Tween 80 pH 7,2), contendo de 4 a 6% de β-ME. O homogenato de células foi carregado em uma resina, e a resina de troca catiônica ou de heparina foi lavada com cinco ou mais de cinco volumes de leito de resina de tampão de lavagem (PBST contendo de 0,35 a 0,48 M de NaCl e 5% de β-ME). As proteínas L1 de HPV ligadas à resina de heparina foram eluídas com PSBT, contendo 1M de NaCl e 5% de β-ME, ou por adição sucessiva de soluções tampão preparadas para ter concentrações de NaCl de 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M e 1 M, em PBST contendo 5% de β-ME. A solução de eluição, que inclui proteínas L1, foi concentrada com o uso de Amicon Ultra (Millipore, EUA), e dialisada em PBST, contendo 1 M de NaCl e 0,2 M de sulfato de amônio, por 20 a 24 horas. 3-3. Segunda cromatografia

[0080] A solução dialisada, depois da primeira cromatografia, foi adicionalmente dialisada em PBST, contendo de 0,3 a 0,42 M de NaCl e passada por resina de heparina ou por resina de troca catiônica, para realizar a segunda cromatografia. A resina de heparina ou a resina de troca catiônica, utilizada para a segunda cromatografia, foi a mesma usada na primeira cromatografia. A resina de heparina/de troca catiônica foi equilibrada com PBST, contendo 0,42 M de NaCl, antes de carregar a amostra. Após o carregamento da amostra, a resina foi lavada com cinco ou mais de cinco volumes de leito de resina de PBST contendo 0,42 M de NaCl. Proteínas L1 de HPV, ligadas com a resina de heparina/de troca catiônica, foram eluídas por aumento da concentração do NaCl de 0,42 a 2,0 M, ou por adição sucessiva de soluções tampão preparadas para ter concentrações de NaCl de 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M e 1 M. Um padrão de eluição para a cromatografia foi monitorado em um comprimento de onda de 280 nm, e coletado por meio de um programa Autochro-2000 (Young Lin Instrument Co., Coréia do Sul). Uma fração da proteína L1 eluída foi recolhida, concentrada com o uso de Amicon Ultra (Millipore, EUA), e dialisada em PBST contendo 0,33 M de NaCl. 4. Método sem tratamento

[0081] Para a purificação sem tratamento, as células foram preparadas por meio de fracionamento, como acima descrito. O homogenato preparado foi dialisado em uma solução tampão (10 mM de fosfato de sódio dibásico, 150 mM de NaCl, 1,7 mM de EDTA, 0,01% de Tween 80 pH 7,2) durante 4 a 6 horas. Os contaminantes precipitados, da amostra dialisada, foram removidos por centrifugação a 12000 xg, durante 10 minutos e, em seguida, a preparação passou pela resina de heparina, equilibrada com a solução tampão acima. Posteriormente, a resina de heparina foi lavada com cinco volumes de leito de resina de PBST, contendo 0,42 M de NaCl, e as proteínas ligadas à resina de heparina foram eluídas com PBST, contendo 1 M de NaCl, após a etapa de lavagem.

5. Método de purificação por tratamento com β-me (método β-me).

[0082] Um método de purificação por tratamento com β-me é o método de purificação que exclui a etapa de aquecimento e resfriamento do método de purificação T-5. Para o método de purificação, por tratamento com β-me, células que expressam a L1 de HPV foram preparadas, conforme acima descrito, e dialisadas em uma solução tampão (10 mM de fosfato de sódio dibásico, 150 mM NaCl, 1,7 mM de EDTA, 0,01% de Tween 80 pH 7,2) durante 4 a 6 horas. O β-me foi adicionado ao lisado dialisado para ter uma concentração final de 4 a 6% de β-me. A resina de heparina foi equilibrada com uma solução tampão (10 mM de fosfato de sódio dibásico, 150 mM de NaCl, 1,7 mM de EDTA, 0,01% de Tween 80 pH 7,2), contendo de 4 a 6% de β-me, e o homogenato preparado passado pela resina. A resina de heparina, através da qual o lisado passou, foi lavada com cinco volumes de leito de resina de PBST, contendo de 4 a 6% de β-I e 0,42 M de NaCl. As proteínas associadas à resina de heparina foram eluídas com PBST, contendo de 4 a 6% de β-I e 1 M de NaCl.

6. Método de aquecimento e resfriamento

[0083] Um método de aquecimento e resfriamento é o método de purificação que exclui o a etapa de tratamento com β-me do método de purificação T-5. Para a purificação das proteínas L1 de HPV, as células foram fracionadas e dialisadas em uma solução tampão (10 mM de fosfato de sódio dibásico, 150 mM de NaCl, 1,7 mM de EDTA, 0,01% de Tween 80 pH 7,2) durante 4 a 6 horas. O lisado dialisado foi tratado em 37 a 45° C durante 30 minutos, e resfriado em gelo de 30 minutos até 3 horas. Os contaminantes precipitados do lisado, sujeito a aquecimento/resfriamento, foram removidos por centrifugação durante 10 minutos a 12000 xg, e passados pela resina de heparina, equilibrada por uma solução tampão (10 mM de fosfato de sódio dibásico, 150 mM de NaCl, 1,7 mM de EDTA, 0,01% de Tween 80 pH 7,2). Posteriormente, a resina de heparina foi lavada com 5 volumes de resina de PBST, contendo 0,42 M de NaCl, e as proteínas ligadas à resina, após a etapa de lavagem, foram eluídas com PBST contendo 1 M de NaCl.

7. Purificação utilizando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC)

[0084] A purificação utilizando SEC foi realizada através de um método convencionalmente conhecido, com uma leve modificação [20]. Leveduras de expressão de L1 de HPV foram preparadas pelo fracionamento acima descrito, e proteínas foram precipitadas pela saturação de 45% de sulfato de amônio. As proteínas precipitadas foram ressuspensas, utilizando o PBST, e dialisadas em uma solução tampão (10 mM de fosfato de sódio dibásico, 0.65m de NaCl, 1,7 mM de EDTA, 0,01% de Tween 80 pH 7,2) durante 4 horas. A purificação da fração dialisada foi realizada por SEC, como primeira cromatografia. A amostra preparada passou pela resina superose-6 (1,5 x 32 cm, GE Healthcare, EUA), equilibrada com PBST, contendo 0,65 M de NaCl (primeira cromatografia) [36]. Um padrão de eluição da SEC foi detectado com um comprimento de onda de 280 nm e coletado, utilizando o programa Autochro-2000 (Young Lin Instrument Co., Coreia do Sul).

[0085] As frações contendo a L1 de HPV foram coletadas, dialisadas em PBST, contendo 0,33 M de NaCl, e passados pela resina de heparina, equilibrada com PBST, contendo 0,33 M de NaCl (segundo cromatografia). Posteriormente, a resina de heparina foi lavada com cinco volumes de leito de resina de PBST, contendo 0,42 M de NaCl. Após a lavagem, as proteínas ligadas à resina heparina foram eluídas através do fluxo sequencial do PBST, contendo 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M e 1 M de NaCl.

8. Purificação usando precipitação com sulfato de amônio (método de precipitação com sulfato de amônio)

[0086] A purificação, utilizando precipitação com sulfato de amônio, é um método em que a etapa de aquecimento e resfriamento, após o tratamento do β-me, no método T-5, é substituído pela precipitação com sulfato de amônio. Antes da cromatografia, foram realizadas a precipitação com sulfato de amônio e a remoção de contaminantes precipitados, através de um método convencionalmente conhecido [22, 24]. As proteínas em um lisado celular foram saturadas com 45% de sulfato de amônio para precipitar, e as substâncias contaminantes foram removidas (remoção de contaminantes precipitados). A amostra acima preparada, antes da cromatografia, foi dialisada em uma solução tampão (10 mM de fosfato de sódio dibásico, 150 mM de NaCl, 1,7 mM de EDTA, 0,01% de Tween 80 pH 7,2) durante 4 horas. A resina de heparina foi equilibrada com a mesma solução tampão acima utilizada, e, em seguida, a amostra dialisada foi passada pela resina (primeira cromatografia). Posteriormente, a resina foi lavada com cinco volumes de leito de resina de PBST, contendo 0,42 M de NaCl, e as proteínas de ligação foram eluídas com PBST, contendo 1 M de NaCl. Para a segunda cromatografia, uma fração de eluição foi dialisada em uma solução tampão contendo 0,33 M de NaCl. Posteriormente, a segunda cromatografia da SEC foi executada do mesmo modo que foi acima descrito.

9. Quantificação de proteína

[0087] A concentração de proteínas foi medida com albumina de soro bovino (BSA; Pierce, EUA), como um padrão por um kit de quantificação de proteína (Bio-Rad Laboratories, EUA). 10. SDS-PAGE e Western blotting

[0088] O SDS-PAGE foi realizado de acordo com o método de Laemmli [35], e o Western blotting foi realizado através de um método conhecido [26]. A proteína desenvolvida em um gel de SDS-PAGE foi visualizada por coloração. A proteína L1 de HPV foi detectada, utilizando um soro de L1 anti-HPV 16 de coelho, como um anticorpo primário e um anticorpo policlonal de IgG anti-coelho conjugado com HRP de cabra (IgG anti-coelho conjugado com HRP de cabra, Bethyl, EUA) como anticorpo secundário [26]. A intensidade da banda foi medida pelo Image J - software de fonte aberta do National Institute Health (NIH) e estimada através de um método conhecido [25].

11. Microscopia Eletrônica

[0089] Proteínas L1 de HPV 16 purificadas foram absorvidas em uma grade revestida de carbono e coloridas com acetato de uranila ou ácido fosfotúngstico. Uma imagem de microscópio eletrônico de transmissão foi feita usando TEM200CX (JEOL, Japão) com uma ampliação final de 150.000X.

12. Dispersão dinâmica de luz (DLS) para VLPs de HPV

[0090] A DLS para as VLPs de HPV foi realizada por um método conhecido [26]. VLPs de HPV purificadas foram diluídas em PBST, contendo 0,13 M de NaCl a fim de ter uma concentração de 0,13 mg/ml, e analisadas fazendo uso do sistema de DLS-700 (Otsuka Electronics, Japão) ou do sistema ELS-Z2 (Otsuka Electronics, Japão).

13. Análise da reatividade do anticorpo monoclonal para as VLPs do HPV

[0091] A reatividade de um anticorpo monoclonal para as VLPs do HPV foi analisada através de um método convencionalmente conhecido [26]. A placa do ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA), de 96 poços, foi revestida com 400 ng de VLPs de HPV purificadas. As VLPs L1 HPV purificadas por métodos diferentes foram usadas como revestimentos, após a realização do SDS-PAGE, para confirmar que a quantidade de proteínas L1 das VLPs L1 HPV purificadas em cada um dos métodos foi quantitativamente a mesma. A placa revestida com VLP foi bloqueada com PBS-T20, contendo 3% de albumina de soro bovino (PBS contendo 0,05% de Tween 20), à temperatura ambiente, durante 2 horas. Os anticorpos monoclonais de L1 anti-HPV16, H16.V5 e H16.E70, foram diluídos com PBS-T20, contendo 0,3% de albumina de soro bovino, para ter as concentrações de 0,25 μg/ml, 0,12 μg/ml, 0,06 μg/ml, 0,03 μg/ml e 0,015 μg/ml, e reagidos com as revestidas VLPs de HPV a 37° C durante 90 minutos. Os anticorpos resultantes foram lavados com PBS-T três vezes, um anticorpo de IgG anti-rato conjugado com HRP (Bethyl, EUA) foi diluído em PBS-T20, contendo 0,3% de albumina de soro de bovino a uma proporção de 1:5000, e reagido em uma placa a 37° C por 40 minutos. A placa foi lavada com PBS-T20 cinco vezes, e uma reação de cor foi realizada. A reação de cor foi realizada usando o-fenilenodiamina (Sigma, EUA), e uma densidade óptica foi detectada a 492 nm.

14. Imunização de rato com VLP L1 HPV purificada e avaliação da imunogenicidade

[0092] Para avaliar a imunogenicidade da L1 de HPV16, um rato albino Balb/c de 6 semanas de idade foi utilizado (Orientbio. Coreia do Sul). Para imunizar camundongos com proteínas L1 de HPV, a pureza e a concentração de uma proteína L1 foram confirmadas através de um método conhecido de quantificação de proteínas e do método SDS-PAGE. O rato foi imunizado através de injeção subcutânea por quatro vezes, em intervalos de duas semanas. Para uma única imunização, 1 ng de proteína L1, em combinação com 200 μg de hidróxido de alumínio (Sigma, EUA), foi injetado por via subcutânea. A quantidade de 1 ng de proteína baseou-se no resultado de quantificação das VLPs L1 HPV16 T-5. A proteína L1 de HPV16, purificada por outro método, foi quantificada utilizando a L1 HPV16 T-5 como uma substância padrão. 10 dias após a terceira e a quarta imunização, sangue foi coletado de uma veia da rabo do rato. Para coletar o soro, o sangue do rato foi centrifugado durante 10 minutos a 12000 xg, para preparar um sobrenadante, e o sobrenadante foi armazenado a - 70° C até a medição do título de anticorpo e a avaliação da atividade de neutralização do anticorpo. O título de um anticorpo de IgG L1 de anti-HPV16 e anti-HPV 16, que neutralizam a atividade no sangue do rato, foi medido utilizando as técnicas de ELISA e a neutralização com base em pseudovírus através de um método conhecido [26].

15. Análise estatística

[0093] A significância estatística da diferença entre os grupos foi determinada pelo teste t de Student bicaudal. P <0,05 foi considerado como uma diferença significativa.

Resultados do experimento 1. Purificação da T-5: resultado de purificação de proteínas L1 através da primeira cromatografia.

[0094] Um processo de purificação da T-5 é mostrado na figura 1. As amostras de carga, para a primeira cromatografia de afinidade à heparina, foram preparadas de duas maneiras, ou seja, o caso em que a diálise foi realizada e o caso em que a diálise não foi realizada. No caso em que a diálise foi realizada, após as células serem fracionadas, a diálise foi realizada em uma solução tampão de fracionamento de células, e, então, um agente redutor (β-ME) foi adicionado, e, quando a diálise não foi realizada, um agente redutor foi diretamente adicionado ao homogenato. Posteriormente, duas amostras foram aquecidas em 37 a 42° C e deixadas no gelo durante 30 a 50 minutos, para resfria-las até aproximadamente 0o C. As substâncias contaminantes precipitadas, resultantes da etapa de aquecimento/resfriamento, foram retiradas e a cromatografia de afinidade à heparina foi realizada. As figuras 2 e 3 mostram os resultados da cromatografia de afinidade à heparina da amostra dialisada e para a amostra não-dialisada, as quais foram analisadas por SDS- PAGE. Depreendeu-se que as proteínas L1 foram obtidas com alta pureza em ambos os casos.

2. Purificação da T-5: resultados da purificação de proteínas L1 através da segunda cromatografia

[0095] A fração de eluição da proteína L1, obtida na primeira cromatografia de afinidade à heparina, foi adicionalmente purificada através de uma segunda cromatografia de afinidade à heparina. A figura 4a mostra o resultado da purificação obtida pela segunda cromatografia de afinidade à heparina. As proteínas L1 ligadas à resina de heparina foram eluídas, para aumentar linearmente o gradiente do NaCl (figura 4b). Como resultado do SDS-PAGE, as proteínas L1 que fluem sem serem ligadas à resina heparina não foram observadas em uma fração de FT. Confirmou-se que as proteínas L1, ligadas à resina de heparina, foram eluídas por um incremento no gradiente linear (frações 11-17). A figura 4b mostra substâncias eluídas, detectadas em um comprimento de onda de 280 nm, na cromatografia de afinidade à heparina. Quando considerado o resultado do SDS-PAGE, as proteínas eluídas não foram observadas no FT (fluxo de passagem), mas, quando detectadas a 280 nm, ficou confirmado que uma quantidade considerável de substâncias fluiu no FT. Consequentemente, confirmou-se que substâncias contaminantes, exceto as proteínas L1, foram removidas pela segunda cromatografia de afinidade à heparina.

3. Análise das purezas das VLPs L1 HPV16 separadas pelos métodos T-1 e T-5

[0096] O grau de pureza da proteína L1, coletada pela segunda cromatografia de afinidade à heparina (VLP L1 HPV16 T-5), foi comparado com o grau de pureza de proteínas L1, purificadas pelo método convencionalmente conhecido [22,24] (VLP L1 HPV16 T-1). O método T-1 de purificação é mostrado na figura 1 e o resultado do SDS-PAGE para a cromatografia de afinidade à heparina do método T-1 de purificação é mostrado na figura 5. Na figura 5, LS indica uma amostra carregada em uma coluna (amostra de carga). De acordo com a cromatografia de afinidade à heparina do método T-1, as proteínas L1 foram eluídas por gradiente linear, para aumentar a concentração de NaCl, de 0,325 M a 2 M, e as proteínas L1 foram eluídas entre as frações de 11 a 15. A figura 6 mostra um resultado comparativo do grau de pureza da VLP L1 HPV16 purificada pelos métodos T-1 e T5. Para analisar a pureza das VLPs, um experimento de purificação, de forma independente, foi realizado duas vezes, e os resultados foram apresentados no painel A e painel B. A VLP L1 HPV16 T-1 e a VLP L1 HPV16 T-5 foram carregadas em 500 ng, 250 ng, 125 ng, e 62 ng por poço, após a quantificação das proteínas, e depois de seu fraccionamento por SDS- PAGE, o resultado foi visualizado por coloração. Nas duas VLPs, a alta pureza da L1 de 55 kDa bandas foi observada. No entanto, verificou-se que a intensidade da banda da L1 da VLP HPV 16 T-5 foi maior do que aquela da VLP HPV 16 T-1. A figura 6b mostra valores dos dois experimentos conduzidos conforme a figura 6a, os quais foram representados como média ± desvio padrão. Para obter o resultado, a intensidade da banda de L1 de VLP HPV 16 T-5 que foi carregada a 500 ng foi fixada em 100%. De acordo com os resultados, foi confirmado que a pureza das VLPs L1 HPV16 T-5 foi maior do que aquelas das VLPs L1 HPV16 T-1.

[0097] Para a microscopia eletrônica, o DLS e a análise da reatividade de anticorpos monoclonais que serão abaixo descritos, a quantidade de L1 da VLP HPV 16 T-1 foi ajustada para ser a mesma da VLP HPV 16 T-5. A figura 7 mostra o resultado por SDS-PAGE de quantidades de L1 dos dois tipos de VLPs, as quais foram ajustadas para serem as mesmas. 4. Microscopia Eletrônica das VLPs L1 HPV16 separadas pelos métodos T-1 e T-5 de purificação

[0098] A figura 8 mostra os resultados de microscopia eletrônica das VLPs HPV16 T-1 e das VLPs HPV16 T-5. Confirmou-se que um tamanho da VLP L1 HPV16 T-5 varia de 40 a 65 nm, e o tamanho da VLP L1 HPV16 T-1 varia de 20 a 50 nm. Por conseguinte, o tipo de VLP L1 HPV 16 purificada pelo método T-5 tem características diferentes daquelas do tipo de VLP L1 HPV 16 purificada pelo método T-1. Sabe-se que o tamanho de um virion HPV de ocorrência natural foi de 50 a 60 nm [29,30]. Este resultado significa que o tamanho da VLP HPV16 T-5 é próximo ao tamanho original do HPV.

5. Análise da DLS das VLPs L1 HPV16 separadas pelos métodos T-1 e T-5

[0099] A DLS é amplamente utilizada para investigar o estado das VLPs presentes em uma solução [31]. A figura 9 mostra um resultado representativo da análise de purificação das VLPs L1 HPV16 T-1 e VLPs L1 HPV16 T-5, utilizando o sistema DLS-700. A figura 10 mostra um resultado representativo de análise das VLPs L1 HPV16, utilizando o sistema ELS-Z2. O tamanho da VLP foi representado como média ± desvio padrão. Na figura 9, as VLPs L1 HPV16 T-1 foram distribuídas entre 29 e 438 nm, e as VLPs L1 HPV16 T-5 foram distribuídas entre 17 e 233 nm. Por conseguinte, as distribuições hidrostáticas, de acordo com os tamanhos dos dois tipos de VLPs, foram diferentes umas das outras. A figura 10A mostra os perfis de intensidade de DLS das duas VLPs. A figura 10B mostra os índices de polidispersão (PI) dos dois tipos de VLPs. Na figura 10B, assim como na figura 10A, ficou confirmado que as VLPs L1 HPV16 T-1 têm uma gama de distribuição de tamanho mais ampla do que aquela das VLPs L1 HPV16 T-5. Foi confirmado que a PI das VLPs L1 HPV16 T-5 foi menor do que aquela das VLPs L1 HPV16 T-1 (figura 10B). Como resultado, confirmou-se que as VLPs L1 HPV16 T-5 estiveram presentes de uma forma uniforme em uma solução, em comparação com as VLPs L1 HPV16 T-1.

6. Análise de reatividade de anticorpo monoclonal das VLPs L1 HPV16 purificadas pelos métodos T-1 e T-5

[00100] A reatividade de um anticorpo monoclonal da L1 anti-HPV 16 para a VLP de HPV 16 é utilizada como um critério importante para avaliar a superioridade estrutural das VLPs L1 HPV16 e a habilidade daquelas em induzir os anticorpos neutralizantes [26, 32-34]. A reatividade das VLPs L1 HPV16 T-1 e das VLPs L1 HPV16 T-5 aos anticorpos monoclonais foi comparada usando anticorpos H16.V5 e H16.E70, os quais são, geralmente, os mais usados para avaliar essa propriedade [26]. Um aumento na reatividade aos dois anticorpos está intimamente relacionado com um aumento na imunogenicidade [26, 36]. Como mostrado na figura 11, confirmou-se que a reatividade das VLPs HPV16 T-5 aos dois tipos de anticorpos é significativamente superior àquela das VLPs HPV16 T-1.

7. Comparação da imunogenicidade das VLPs L1 HPV16 purificadas pelos métodos T-1 e T-5

[00101] Confirmou-se que o grau de pureza das proteínas L1 da VLP L1 HPV16 T-1 é inferior do que aquela da VLP L1 HPV16 T-5 (figura 6A, figura 6b). Para imunizar duas VLPs L1 HPV16 no mesmo valor, a quantidade da VLP L1 HPV16 T-1 foi ajustada para aquela da VLP L1 HPV16 T-5, e as quantidades das proteínas L1 foram avaliadas por SDS-PAGE (figura 7). Para a imunização, 1 ng da VLP L1 HPV16 foi injetado em combinação com hidróxido de alumínio. A quantidade de 1 ng de proteína (o valor obtido do ensaio de proteína de Bradford) quantificada das VLPs L1 HPV16 T-5 foi definida como um padrão. As VLPs L1 HPV16 purificadas pelos métodos de purificação T-1 e T-5 foram injetadas subcutaneamente em camundongos quatro vezes, em intervalos de duas semanas. Os títulos de IgG de L1 de anti-HPV16, em soro, detectados na terceira e quarta imunizações, são mostradas na figura 12. Após a terceira imunização, o grupo das VLPs L1 HPV16 T-5 imunizadas teve um valor médio de 450, ao passo que o grupo das VLPs L1 HPV16 T-1 imunizadas teve um valor médio de 0. Após a quarta imunização, o grupo das VLPs L1 HPV16 T-5 imunizadas teve um valor médio de 4050, ao passo que o grupo das VLPs L1 HPV16 T-1 imunizadas teve um valor médio de 300. Por conseguinte, confirmou-se que as VLPs L1 HPV16 T-5 induziram 10 vezes ou mais de 10 vezes um maior nível de títulos de anticorpos IgG de L1 de anti-HPV16 do que as VLPs L1 HPV16 T-1 o fizeram.

[00102] Após a quarta imunização, atividades de anticorpos neutralizantes anti-HPV16 em um rato foram detectadas (figura 13). O grupo da VLP L1 HPV16 T-5 imunizada teve uma atividade de neutralização (valor médio) de 78%, ao passo que o grupo da VLP L1 HPV16 T-1 imunizada teve uma atividade de neutralização de 33%. Entre os dois grupos, a atividade de neutralização apresentou diferença significativa.

8. Investigação do efeito do aquecimento/resfriamento após o tratamento com o agente redutor (comparação em condições de não-tratamento, tratamento com β-ME e tratamento com aquecimento e resfriamento após o β-ME).

[00103] Como observado nos resultados acima, elevado grau de pureza das proteínas L1 pode ser obtido com a primeira cromatografia de afinidade à heparina. Para especificamente investigar o efeito do aquecimento/resfriamento, após tratamento com um agente redutor, na pureza das proteínas L1, dois tipos de experiências foram realizados. Na primeira experiência, foi comparado o grau de pureza das proteínas L1 após a cromatografia de afinidade à heparina na forma de não-tratamento, quando apenas um agente redutor foi tratado (método de tratamento β-ME), e quando o aquecimento/resfriamento foi realizado após o tratamento com um agente redutor (método de purificação T-5, β-ME + aquecimento e resfriamento). Na segunda experiência, foi comparado o grau de pureza das proteínas L1 após a cromatografia de afinidade à heparina na forma de não-tratamento, quando apenas o aquecimento/resfriamento foi realizado (método de aquecimento e resfriamento), e quando o aquecimento/resfriamento foi realizado após o tratamento com um agente redutor (T-5, β-ME + aquecimento e resfriamento).

[00104] As Tabelas 1 e 2 mostram a quantidade de proteínas e a taxa de remoção de proteínas contaminantes de uma amostra carregada, em cada condição, para a cromatografia de afinidade à heparina obtidas na primeira e na segunda experiência, respectivamente. Como se mostra na Tabela 1, no não-tratamento e quando o agente redutor foi tratado, de 24 a 25% de proteínas foram removidos antes da cromatografia de afinidade à heparina, porém, quando o aquecimento/resfriamento foi realizado, após o tratamento com um agente redutor, 66% de proteínas foram removidos. Na Tabela 2, da mesma forma, no não-tratamento e quando o agente redutor foi tratado, de 34 a 40% de proteínas foram removidos antes da cromatografia de afinidade à heparina, porém quando o aquecimento/resfriamento foi realizado, após o tratamento com um agente redutor, 70% de proteínas foram removidos.

[00105] A figura 14 mostra manchas de Western e de SDS-PAGE de frações obtidas após a primeira cromatografia de afinidade à heparina, quando carregadas com os mesmos volumes (5 μL, 2,5 μL, 1,2 μL). Foi confirmado que, no não-tratamento, a quantidade de proteínas L1 obtida foi consideravelmente reduzida. Confirmou-se também que, uma vez que muitas proteínas estranhas foram incluídas na solução recuperada, o grau de pureza foi também muito baixo. Foi confirmado que, quando apenas um agente redutor, isto é, β- ME, foi tratado, a quantidade de proteínas L1 recuperadas foi aumentada, porém, devido a uma grande quantidade de proteínas contaminantes na solução coletada, o grau de pureza não foi elevado. Entretanto, quando um agente redutor, β-ME, foi tratado e o aquecimento/resfriamento foi realizado, a proteína L1 foi identificada como uma banda maior no SDS-PAGE e no Western blotting, e, assim, a taxa de recuperação, bem como a pureza das proteínas L1, foi também alta.

[00106] Para comparar as purezas das proteínas L1 obtidas nas condições acima, as proteínas na solução colhida foram quantificadas e carregadas nas mesmas quantidades (1 mg, 0,5 mg, 0,25 mg), para confirmação por SDS-PAGE e Western blotting (figura 15). Como pode ser visto nos resultados, a pureza da proteína L1 foi a mais elevada, quando o aquecimento/resfriamento foi realizado,, após a adição de β-ME.

[00107] A figura 16 mostra os resultados do SDS-PAGE de frações de eluição, obtidas na primeira cromatografia de afinidade à heparina no não-tratamento, quando apenas o aquecimento/resfriamento foi realizado (método de aquecimento resfriamento) e quando o aquecimento/resfriamento foi realizado após o tratamento com um agente redutor (T-5, β- ME + aquecimento e resfriamento). As frações colhidas, após a primeira cromatografia de afinidade à heparina, foram carregadas com os mesmos volumes (5 μL, 2,5 μL, 1,2 μL), e analisadas por SDS-PAGE e Western blotting. Como resultado, no não-tratamento e quando apenas o aquecimento/resfriamento foi realizado, as quantidades de proteínas L1 recuperadas foram consideravelmente baixas. Além disso, devido às grandes quantidades de proteínas contaminantes na solução coletada, o grau de pureza também foi muito baixo. Entretanto, quando o aquecimento/resfriamento foi realizado, após o tratamento com um agente redutor, a proteína L1 foi confirmada como a banda maior no SDS-PAGE e no Western blotting, e, assim, a taxa de recuperação bem como a pureza das proteínas L1 foi também elevada.

[00108] Como resultado, quando apenas um agente redutor foi tratado ou quando apenas o aquecimento e resfriamento foi realizado, um elevado grau de pureza das proteínas L1 não pôde ser obtido e, para purificar as proteínas L1 com alta pureza, confirmou-se que o aquecimento/resfriamento, após o tratamento com um agente redutor, é essencial.

9. Investigação do efeito do aquecimento/resfriamento, após o tratamento com um agente redutor (comparação da precipitação com sulfato de amônio, o tratamento com β-ME, o tratamento de aquecimento e resfriamento após β-ME).

[00109] Um processo de purificação, utilizando a precipitação com sulfato de amônio, é mostrado na figura 17. O método de purificação por precipitação com sulfato de amônio é realizado pela substituição da etapa de aquecimento e resfriamento, após o tratamento com β-ME, no método de purificação T-5, pela precipitação com sulfato de amônio, e é distinto do método de purificação T-1 mostrado na figura 1. O método de tratamento com β-ME (método β-ME) é o mesmo descrito no exemplo acima. As proteínas eluídas da cromatografia foram carregadas com os mesmos volumes (10, 5, 2,5 μL) e analisadas por SDS-PAGE e Western blotting (figura 18 e figura 19). Quando o aquecimento e resfriamento foram realizados, após o tratamento com β-ME, a proteínas L1 apresentaram uma excelente pureza na precipitação com sulfato de amônio e no método pelo tratamento somente com β-ME, as proteínas L1 apresentaram baixa pureza (figura 18). De acordo com os resultados da primeira cromatografia, obtidos por precipitação com sulfato de amônio e com o método do aquecimento/resfriamento, após o tratamento com β-ME, confirmou-se que, quando o aquecimento/resfriamento foi realizado após o tratamento com β-ME, todas as proteínas L1 na amostra carregada (LS) foram ligadas à coluna, e quando foi usada a precipitação com sulfato de amônio, uma parte das proteínas L1 da amostra carregada (LS) não se liga à coluna e fluiu (FT) (figura 19).

10. Investigação do efeito do aquecimento/resfriamento após o tratamento com um agente redutor (comparação da SEC, precipitação com sulfato de amônio e aquecimento e resfriamento após tratamento com β-ME).

[00110] O processo de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) é mostrado na figura 17. O método de SEC foi baseado em um método convencionalmente conhecido [20]. A precipitação com sulfato de amônio é a mesma acima descrita. Um resultado representativo da SEC é mostrado na figura 20. As proteínas L1 de HPV16, após a SEC, foram eluídas com elevado grau de pureza nas frações de 3 a 9, e as frações foram utilizadas para comparar a pureza das proteínas L1 da primeira cromatografia (figura 21). As purezas de proteínas L1 nas frações de eluição por SEC, na precipitação com sulfato de amônio, e no aquecimento/resfriamento, após o tratamento com β-ME (β-ME + aquecimento e resfriamento) foram comparadas (figura 21). A fração de eluição obtida em cada um dos métodos foi ajustada em um mesmo volume (7 ml) e a amostra, tendo o mesmo volume (0,35, 0,17, ou 0,08 μL), foi carregada para o SDS-PAGE e Western blotting. Foi confirmado que uma das frações de eluição da primeira cromatografia, que foi obtida pelo tratamento de aquecimento/resfriamento, após o tratamento com β-ME, teve a maior pureza das proteínas L1.

[00111] A figura 22 mostra os resultados por SDS-PAGE e Western blotting para as frações de eluição da segunda cromatografia, a qual foi realizada utilizando uma fração de eluição da primeira cromatografia apresentada na figura 21. A fração de eluição, de cada condição, na segunda cromatografia, foi carregada com o mesmo volume (2, 1, 0,5 μL). De acordo com a análise das frações de eluição da segunda cromatografia, foi confirmado que, quando o aquecimento/resfriamento foi realizado, após o tratamento com β-ME, o rendimento das proteínas L1 foi o mais elevado.

[00112] Para analisar a antigenicidade das VLPs L1 HPV16 purificadas em cada condição, a reatividade do anticorpo monoclonal neutralizante de HPV16, H16.E70, foi comparada pelo teste ELISA (figura 23b). Para revestir a mesma quantidade de VLPs L1 HPV16, as concentrações de VLPs L1 HPV16, purificadas pelo método de purificação com base na SEC e pelo método de precipitação com sulfato de amônio, foram ajustadas à concentração de VLPs L1 HPV16 purificados por meio de aquecimento/resfriamento, após o tratamento com β-ME (VLP L1 HPV16 T-5), antes do revestimento de antígeno. Após o ajuste de concentração, foi confirmado, por SDS-PAGE e Western blotting, que não havia diferença na quantidade de proteínas L1 entre os três tipos de VLPs (figura 23a). Como resultado da análise da reatividade do anticorpo monoclonal neutralizante de HPV16, H16.E70, observou-se que a VLP L1 HPV16 purificada por meio de aquecimento/resfriamento, após o tratamento com β-ME (T-5), teve a melhor reatividade (figura 23b).

[00113] Em conclusão, mostra-se que VLPs geradas pelo método conduzido por aquecimento/resfriamento, após o tratamento com β-ME, têm maior grau de pureza do que aquelas purificadas por um método convencionalmente conhecido, como SEC e precipitação com sulfato de amônio, e que têm uma excelente característica antigênica.

11. Comparação da imunogenicidade das VLPs L1 HPV16 purificadas por SEC, por precipitação com sulfato de amônio e por aquecimento/resfriamento após o tratamento com um agente redutor (T-5).

[00114] Utilizou-se 1 ng de cada um dos três tipos de VLPs L1 HPV16, finalmente purificadas conforme a figura 23, para efeito de imunização. Antes de imunização, conforme mostrado conforme na figura 23A, as VLPs foram ajustadas para ter as mesmas concentrações. Na imunização de camundongos, 1 ng de VLP foi injetado, em combinação com 200 μg de hidróxido de alumínio. A imunização foi realizada quatro vezes, em intervalos de duas semanas. Como resultado da medição da atividade de neutralização no soro de um rato, imunizado quatro vezes, no grupo imunizado com VLPs L1 HPV16 purificadas pelo método com base na SEC, a atividade de neutralização foi de 16%, e no grupo imunizado com VLPs L1 HPV16 purificadas por precipitação com sulfato de amônio, a atividade de neutralização foi de 28%. Por outro lado, no grupo imunizado com VLPs L1 HPV16 purificadas pelo método com base no aquecimento/resfriamento, após o tratamento com um agente redutor (T-5), a atividade de neutralização foi de 50%. Por conseguinte, as VLPs L1 HPV16 purificadas pelo método T-5 apresentaram uma imunogenicidade mais elevada do que aquela das VLPs L1 HPV16 purificadas por um método conhecido.

12. Análise do efeito em função da temperatura de aquecimento após o tratamento com o agente redutor

[00115] As figuras 25 e 26 mostram o efeito da remoção de proteínas contaminantes, de acordo com a temperatura de aquecimento, após o tratamento com um agente redutor, na purificação de VLPs L1 HPV16 e VLPs L1 HPV18. O homogenato foi tratado com β-ME e feito reagir à temperatura ambiente (inicial), 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, ou 65° C, durante 15 minutos. Posteriormente, a amostra foi deixada em gelo durante 1 hora e centrifugada a 12000 xg, para remover os contaminantes precipitados. A concentração de proteínas na amostra resultante, da qual os contaminantes precipitados foram removidos, foi medida e mostrada no painel A. Cada amostra foi carregada com o mesmo volume e os resultados analisados por SDS-PAGE foram apresentados no Painel B. Cada amostra foi carregada com o mesmo volume e uma quantidade de proteínas L1 foi detectada por Western blotting e mostrada no Painel C. Após a concentração das proteínas em cada amostra ter sido medida, a mesma quantidade de proteínas foi carregada e uma quantidade de proteínas L1 foi detectada por Western blotting e mostrada no painel D. Por conseguinte, os resultados do Western blotting mostrados no Painel D indicam a pureza das proteínas L1.

[00116] É evidente que a taxa de remoção de proteínas contaminantes, através de aquecimento, foi significativamente aumentada em 35° C ou mais (figuras 25A, 25B, 26A e 26B). Como mostrado nas figuras 25C e 26C, foi confirmado que as proteínas L1 de HPV16 permanecem no homogenato a uma temperatura de aquecimento de 65° C e 60° C, e as proteínas L1 de HPV18 permanecem no homogenato a uma temperatura de aquecimento de 60° C. De acordo com a análise de pureza das proteínas L1 por temperaturas, a pureza das proteínas L1 de HPV16 foi a mais elevada a uma temperatura que varia de 35 a 50° C (figura 25D) e a pureza das proteínas L1 de HPV18 foi a mais elevada a uma temperatura que varia de 45 a 60° C (figura 26D). Por conseguinte, quando o homogenato foi aquecido à temperatura que varia de 35 a 60° C, as proteínas contaminantes foram removidas, ao passo que as proteínas L1 mantiveram a estabilidade. A estabilidade térmica da proteína L1 pode facilitar a separação das proteínas L1 das proteínas contaminantes, pela etapa de aquecimento, sob a condição de tratamento com agentes redutores.

13. Análise do efeito de resfriamento na operação de aquecimento/resfriamento após o tratamento com um agente redutor

[00117] A figura 27 mostra resultados comparativos entre a condição em que apenas o aquecimento foi realizado, após o tratamento com um agente redutor (aquecimento), e a condição em que o resfriamento foi realizado após o aquecimento (aquecimento e resfriamento). Na figura 27, o painel A mostra as concentrações de proteínas medidas quando apenas o aquecimento foi realizado e quando o resfriamento foi realizado após o aquecimento. Os painéis B e C apresentam resultados de Western blotting, obtidos quando apenas o aquecimento foi realizado a 45° C e 50° C e quando o resfriamento foi realizado após aquecimento (aquecimento e resfriamento). Para o Western blotting, uma amostra para cada condição foi carregada com os mesmos volumes (5, 2,5 e 1,25 μl). Como mostrado no painel A, confirmou-se que a quantidade total de proteínas foi reduzida quando o resfriamento foi realizado após o aquecimento, comparado com quando apenas aquecimento foi realizado. Entretanto, foi confirmado que a quantidade de proteínas L1 não foi reduzida (figuras 27B e 27C). Esses resultados mostram que a pureza de proteínas L1 foi aumentada pelo resfriamento.

[00118] A figura 28 mostra os resultados de SDS-PAGE e Western blotting quando somente o aquecimento foi realizado, após o tratamento com um agente redutor (H), e quando o resfriamento foi realizado após o aquecimento (HC). Para uma análise precisa, cada amostra foi carregada em 2,5 μl e 1,25 μl. As intensidades das bandas de proteínas contaminantes, proteína 1, proteína 2 e proteína 3 foram incrmentadas quando apenas o aquecimento foi realizado, ao passo que as intensidades das bandas das proteínas contaminantes, proteína 1, proteína 2 e proteína 3 foram reduzidas quando o resfriamento foi realizado após o aquecimento (figura 28). Entretanto, concluiu-se que a quantidade de proteínas L1 não apresentou redução pelo resfriamento (resultados do Western blotting na figura 28). A figura 29 mostra intensidades das bandas de proteínas contaminantes, proteína 1, proteína 3 e proteína 3, que foram detectadas por SDS-PAGE, quando apenas o aquecimento foi realizado (somente H) e quando o resfriamento foi realizado após aquecimento (HC).

14. Purificação das VLPs L1 HPV16 e VLPs L1 HPV18 de acordo com tratamento térmico a 60° C

[00119] Os homogenatos de células de levedura que expressam L1 de HPV16 e L1 de HPV18 foram tratados com um agente redutor, aquecido à temperatura de 60° C e resfriado, para realizar a purificação de VLP. O painel A na figura 30 mostra os resultados da análise de SDS-PAGE para a primeira cromatografia. LS e FT indicam a amostra de carregamento e um fluxo de passagem, respectivamente. A eluição indica a fração formada por proteínas L1 eluídas. O painel B mostra os resultados da análise de SDS-PAGE para o produto final da segunda cromatografia. Cada tipo de proteínas L1 foi purificado com elevado grau de pureza. O Painel C mostra os resultados de microscopia eletrônica de transmissão para a purificação do produto final. Foi confirmado que as VLPs foram formadas após a purificação das proteínas L1, depois do aquecimento a 60° C.

15. Purificação das VLPs L1 HPV18 pelo método T-5

[00120] A figura 31 mostra os resultados de SDS-PAGE da primeira cromatografia quando as VLPs L1 HPV18 foram purificadas pelo método T-5. O homogenato de células foi tratado com um agente redutor, antes da primeira cromatografia de afinidade à heparina, aquecido a 45° C, e resfriado em gelo. A figura 31 mostra que as proteínas contaminantes foram efetivamente removidas pela primeira cromatografia de afinidade à heparina. A figura 32 mostra os resultados de SDS-PAGE da segunda cromatografia de troca catiônica. Na segunda cromatografia, as substâncias contaminantes foram eluídas de frações que incluem 0,6 M e 0,7 M de NaCl, e as proteínas L1 foram eluídas de frações que incluem 0,9 M e 1 M de NaCl. Por conseguinte, foi confirmado que as proteínas L1 de HPV18 foram purificadas com um elevado grau de pureza pelo método T-5. A figura 33 mostra os resultados da dispersão dinâmica de luz (DLS), para as VLPs L1 HPV18 T-5 finalmente purificadas.

16. Purificação das VLPs L1 HPV58 pelo método T-5

[00121] A figura 34A mostra os resultados de SDS-PAGE para as frações de L1 de HPV58, separadas pela primeira cromatografia de acordo com o método T-5. De acordo com a primeira cromatografia, a proteína L1 de HPV 58 foi detectada como uma banda maior. A figura 34B mostra os resultados de SDS-PAGE para as VLPs L1 HPV58 separadas pela segunda cromatografia. As proteínas L1 de HPV58 foram eluídas de todas as frações que incluem 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M e 1 M de NaCl. A figura 35 mostra os resultados de SDS-PAGE e Western Blotting para as VLPs L1 HPV58 finalmente purificadas pelo método T-5. De acordo com o método T-5, confirmou-se que as VLPs L1 HPV58 foram purificadas com elevado grau pureza.

[00122] Embora a invenção tenha sido mostrada e descrita com referência a certas formas de realização exemplificativas, deverá ser claramente entendida, pelos peritos na arte, que as descrições detalhadas são meramente formas de realização exemplificativas e que o âmbito da invenção não está limitado às mesmas. Portanto, deverá ser entendido que o efetivo escopo da invenção está definido pelas reivindicações e seus equivalentes aqui anexos.

Aplicação industrial

[00123] A presente invenção refere-se a um método de purificação de proteínas L1 de HPV, com elevada pureza e alta eficiência. De acordo com o método de purificação da presente invenção, o grau de pureza da purificação de proteínas L1 de HPV pode ser consideravelmente aumentado, e as VLPs das proteínas L1 de HPV purificadas formam uma estrutura mais semelhante àquela de um virião de HPV nativo, e, assim, possui uma excelente imunogenicidade.

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Claims

1. Método de purificação das proteínas L1 do papiloma vírus humano (HPV), caracterizado por compreender: (i) cultivar células hospedeiras transformadas, que expressam uma proteína L1 de HPV, colher as células hospedeiras cultivadas e lisar as células; (ii) adicionar um agente redutor, selecionado do grupo que consiste em β- mercaptoetanol, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetilamina-HCl, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) ou cisteína-HCl a um homogenato de células hospedeiras; e (iii) aquecer e resfriar o homogenato de células hospedeiras, ao qual é adicionado o agente redutor, sendo que o aquecimento é realizado a uma temperatura maior que 37 °C e menor que 60 °C por 10 minutos a 16 horas, e o resfriamento é realizado entre 0 e 10 °C; e (iv) purificar as proteínas L1 de HPV, por meio da realização de cromatografia no homogenato de células hospedeiras aquecido e resfriado.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o HPV ser selecionado do grupo que consiste de HPV tipo 6a, HPV tipo 6b, HPV tipo 11, HPV tipo 16, HPV tipo 18, HPV tipo 30, HPV tipo 31, HPV tipo 33, HPV tipo 35, HPV tipo 39, HPV tipo 41, HPV tipo 42, HPV tipo 43, HPV tipo 44, HPV tipo 45, HPV tipo 51, HPV tipo 52, HPV tipo 54, HPV tipo 55, HPV tipo 56, HPV tipo 58, HPV tipo 68 e HPV tipo 70.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as células hospedeiras serem bactérias, células de leveduras, células de insetos, células vegetais ou células animais.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a célula de levedura ser Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris ou Hansenula polymorpha.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente redutor ser β-mercaptoetanol ou DTT.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o β-mercaptoetanol ser adicionado ao homogenato de células hospedeiras, a fim de obter uma concentração final de 0,1% em massa, ou mais.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o DTT ser adicionado ao homogenato de células hospedeiras, a fim de obter uma concentração final de 2 mmol L-1 ou mais.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cromatografia ser cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade à heparina ou cromatografia de afinidade.