JP2015524817A - ヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子の高効率精製方法 - Google Patents
ヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子の高効率精製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015524817A JP2015524817A JP2015525348A JP2015525348A JP2015524817A JP 2015524817 A JP2015524817 A JP 2015524817A JP 2015525348 A JP2015525348 A JP 2015525348A JP 2015525348 A JP2015525348 A JP 2015525348A JP 2015524817 A JP2015524817 A JP 2015524817A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hpv
- protein
- chromatography
- heating
- vlp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 title claims abstract description 293
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 260
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 109
- 239000002245 particle Substances 0.000 title abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 274
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 268
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 144
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 96
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 111
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 95
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 90
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 79
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 78
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 78
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 20
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 20
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 9
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 5
- OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 2-aminoethanethiol;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCCS OGMADIBCHLQMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 3
- 125000000143 2-carboxyethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- WAPPRYMYMNVAFR-UHFFFAOYSA-N 2-sulfanylethanol Chemical compound OCCS.OCCS WAPPRYMYMNVAFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 abstract description 20
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 104
- 230000008569 process Effects 0.000 description 60
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 60
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 52
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 45
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 41
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 41
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 40
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 35
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 description 34
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 28
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 19
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 19
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 19
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 16
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 16
- 101000641175 Human papillomavirus type 18 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 15
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 15
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 15
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 13
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 13
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 13
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 13
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 13
- 238000003453 ammonium sulfate precipitation method Methods 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 11
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 11
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 8
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 229940032077 cervical cancer vaccine Drugs 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 238000010218 electron microscopic analysis Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 229940124957 Cervarix Drugs 0.000 description 3
- 229940124897 Gardasil Drugs 0.000 description 3
- 101000641177 Human papillomavirus type 16 Major capsid protein L1 Proteins 0.000 description 3
- 241000722343 Human papillomavirus types Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229940039096 human papillomavirus type 18 l1 protein Drugs 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 230000005186 women's health Effects 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 108700005307 Human papillomavirus HPV L1 Proteins 0.000 description 1
- 241000341657 Human papillomavirus type 18 Species 0.000 description 1
- 241000701830 Human papillomavirus type 31 Species 0.000 description 1
- 241000701790 Human papillomavirus type 45 Species 0.000 description 1
- 101150075239 L1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 1
- 235000013958 Lactobacillus casei Nutrition 0.000 description 1
- 101710175243 Major antigen Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710157639 Minor capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 1
- 241000235088 Saccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000936049 Vibrio cholerae serotype O1 (strain ATCC 39315 / El Tor Inaba N16961) Outer membrane lipoprotein Blc Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011968 cross flow microfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 229940017800 lactobacillus casei Drugs 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000013021 overheating Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20051—Methods of production or purification of viral material
Abstract
Description
本発明の明細書で用語「HPV L1タンパク質」はHPVのL1遺伝子から発現されるものでHPVのカプシド(capsid)を構成するメジャー(major)タンパク質を意味する。L1タンパク質はカプシドを構成する別のマイナー(minor)タンパク質であるL2タンパク質と共にまたはL1タンパク質単独で、適切な条件の下でウイルス様粒子(Virus-Like Particle、VLP)でセルフアッセンブリー(self-assemble)される特性を有する。
本発明の明細書での用語「還元剤(reducing agent)」は還元−酸化反応(reduction-oxidation reaction)で電子を他の種(species)に供与する元素または化合物を意味して、望ましくはペプチドまたはタンパク質でのジスルフィド結合(disulfide bond)の還元または遊離スルフヒドリル基(free sulfhydryl group)の安定化のために用いられる化合物を意味する。
本発明で上記の細胞の破砕物に還元剤を添加した後、加熱及び冷却(heating and chilling)条件を経る。下記の具体的な一実施例で実験結果として立証されるように、還元剤を添加した細胞の破砕物を加熱及び冷却処理を行えば、形質転換宿主細胞の破砕物の中の不純物の除去効率が大きく増大されるだけでなく、L1タンパク質から組み立てられるVLPが望ましい構造及び免疫特性を有するようになる。
本発明で上記の冷却の温度は細胞の破砕物の試料が凍らないほどの温度を意味して、このような冷却温度では0−10℃の温度であり、望ましくは0℃超過8℃未満の温度であり、より望ましくは0℃超過7℃未満、よりさらに望ましくは0℃超過6℃未満、最も望ましくは0℃超過5℃未満の温度で冷却させる。冷却させる時間は本発明の方法に合うように適合した冷却時間を選択して使用することができる。
還元剤が添加された宿主細胞の破砕物に対してクロマトグラフィー精製方法を行ったり、または上記の宿主細胞の破砕物に還元剤を添加して加熱及び冷却させた後クロマトグラフィー精製方法を行ってHPV L1タンパク質を精製する。
i)本発明はヒトパピローマウイルス(Human Papillomavirus、HPV)L1タンパク質を高純度及び高効率に精製する方法を提供する。
ii)本発明の精製方法はHPVのL1タンパク質が発現される形質転換宿主細胞の細胞の破砕物に還元剤を添加した後、または還元剤を添加して加熱及び冷却(heating and chilling)処理を追加的に行った後、クロマトグラフィーを通じてL1タンパク質を精製することに特徴がある。
iii)本発明の精製方法によれば、HPV L1タンパク質の精製純度を大きく向上させることができる。
iv)本発明の精製方法によって、精製されたHPV L1タンパク質のVLPは良質の構造を形成して免疫原性が非常に優れている。
1.細胞培養
HPV L1タンパク質を発現するサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)Y2805は従来に公知された方法により培養した(参考文献25)。HPV L1タンパク質発現細胞株はウラシル(uracil)がない合成完全培地(complete medium)である「SD-ura」に塗抹して、4日または5日間培養した。単一コロニーをSD-ura液体培地に接種して、2日間培養した。GAL10プロモーターからHPV 16 L1タンパク質を発現させるために、培養した形質転換細胞を1%酵母抽出物(Duchefa、Netherlands)、2%ペプトン(Duchefa)、7%グルコース(Duchefa)及び1%ガラクトース(Duchefa)を含むYPDG培地で培養した。培養完了後、培養した細胞を遠心分離して、培養液を除去して、PBS(phosphate-buffered saline)を用いて洗浄した。洗浄した細胞は再び遠心分離を行って回収して、タンパク質の精製まで−70℃に保管した。
T−1方法を通じたHPV VLPの精製は従来に公知された方法により細胞破砕液内のタンパク質を硫酸アンモニウムの沈澱を通じてpelletで回収した後、ヘパリンクロマトグラフィー(Heparin chromatography)を通じて精製した(参考文献22、23、24)、ヘパリンクロマトグラフィーのためにHiTrapTM Herparin HP(GE Healthcare、USA)樹脂を使用した。硫酸アンモニウムと沈澱物の除去過程を経たサンプルを0.325 M NaClが含まれたPBSTで透析して、0.325 M NaClが含まれたPBSTで平衡化されたヘパリン樹脂に通過させた。ヘパリン樹脂は樹脂の体積の5倍体積の緩衝液(0.325 M NaClを含むPBST)を流して洗浄して、樹脂と結合したタンパク質はNaClが0.325から2Mまで傾斜勾配で増加させるように溶出させた。溶出された分画の中、HPV L1を含む分画をSDS−PAGE分析を通じて選別して集めた。精製完了されたHPV L1 VLPは0.33 M NaClが含まれたPBS+0.01 Tween 80 (PBST)に対して透析した。
3−1.細胞の破砕、還元剤の処理、及び過熱・冷却
培養したHPV L1タンパク質の発現細胞は破砕緩衝液(10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2)に混合させた。上記の細胞混合液を再び0.5 mmガラスビーズ(glass bead、Biospec Product、USA)と混合した後、ボルテックス(vortex)して細胞を破砕した。細胞残余物は12000xgで15分間遠心分離して除去した。カラムクロマトグラフィーを行う前に細胞破砕物は異なる二つの方法を準備した。一つ目の方法は細胞破砕物に最終β−メルカプトエタノール(β−mercaptoethanol、β−ME、Sigma、USA)の濃度が4−6重量%になるようにβ−MEを添加した後、pHを7.0−7.3に調整する方法である。二つ目の方法は細胞破砕物を上記の破砕緩衝液(10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2)に対して4−6時間透析した後に、最終β−ME濃度が4−6%になるようβ−MEを添加する方法である。続いて、β−MEが添加された細胞破砕物を25−65℃の恒温水槽に30−50分間置いた後に、氷に30分−3時間または4℃に16時間置いて冷却させた。冷却された細胞破砕物を12000xgで15分間遠心分離して沈澱物を除去した。
還元剤の処理後、加熱及び冷却過程を通じて用意した細胞破砕物をヘパリン樹脂(HiTrapTM Herparin HP、GE Healthcare、USA または POROS(R) 50 HE、Applied Biosystems、USA)または陽イオン交換樹脂(POROS(R) XS、Applied Biosystems、USA)に通過させた。ヘパリン樹脂または陽イオン交換樹脂は細胞破砕物の通過の前に4−6%のβ−MEが含まれた細胞破砕緩衝液(10 mM sodium phosphate dibasic、0.15−0.48 M NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2)で平衡化させた。細胞破砕物をローディングした後にヘパリン・陽イオン交換樹脂を洗浄緩衝液(0.35−0.48 M NaClと5%β−MEが含まれたPBST)をカラム体積の5倍以上に流して洗浄した。ヘパリン樹脂と結合されたHPV L1タンパク質は1 M NaCl、5%β−MEが含まれたPBSTを流して溶出させるか5%β−MEが含まれたPBSTに最終NaCl濃度が0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1Mが含まれるように用意した緩衝溶液を順次的に流して溶出させた。L1タンパク質を含む溶出液はAmicon Ultra(Millipore、USA)を使用して濃縮した後、1 M NaCl、0.2 M 硫酸アンモニウムが含まれたPBSTに20−24時間の間透析を行った。
上記の1次クロマトグラフィーの後に、透析完了した溶液を0.3−0.42 M NaClが含まれたPBSTに対して追加で透析した後に、ヘパリン樹脂または陽イオン交換樹脂に通過させて2次クロマトグラフィーを行った。2次クロマトグラフィーのために使用されたヘパリン樹脂と陽イオン交換樹脂は1次クロマトグラフィーで用いられた樹脂と同一である。ヘパリン・陽イオン交換樹脂は試料をローディングする前に0.42 M NaClが含まれたPBSTで平衡化させた。試料をローディングして、樹脂にカラム体積の5倍以上の0.42 M NaClが含まれたPBSTを流して洗浄した。ヘパリン・陽イオン交換樹脂と結合したHPV L1タンパク質はNaClの濃度が0.42から2.0 Mまで上昇するようにして溶出させたり、NaCl濃度が0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 Mが含まれるように用意した緩衝溶液を順次的に流して溶出させた。クロマトグラフィーの溶出パターンは280 nmの波長で測定して、Autochro-2000プログラム(Young Lin Instrument Co., South Korea)を使用して収集した。L1タンパク質が溶出された分画を回収した後、Amicon Ultra(Millipore、USA)を用いて濃縮して、0.33 M NaClが含まれたPBSTに透析した。
非処理精製のための細胞は上記で技術したものと同じ方法で破砕されて容易された。用意された細胞破砕液は緩衝液(10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl, 1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2)に4−6時間透析した。透析されたサンプルの沈殿物は12000xgで10分間遠心分離して除去した後、上記の緩衝液で平衡化されたヘパリン樹脂に通過させた。その後ヘパリン樹脂を0.42 M NaClが含まれたPBSTを樹脂体積の5倍に流して洗浄した。洗浄した後ヘパリン樹脂に結合したタンパク質は1 M NaClが含まれたPBSTを流して溶出させた。
β−me処理精製方法は上記のT−5精製方法でheating & chilling過程を省略した精製方法である。β−me処理精製方法のためにHPV L1発現細胞は上記で記述したように用意して、緩衝溶液(10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2)で4−6時間の間透析した。透析された破砕液にβ−meを最終的に4−6%になるように添加した。ヘパリン樹脂は4−6%β−meが含まれた緩衝液(10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01%Tween 80 pH 7.2)で平衡化させた後、容易された細胞破砕液を通過させた。細胞破砕液を通過させたヘパリン樹脂を4−6% β−meと0.42 M NaClを含むPBSTを樹脂体積の5倍に流して洗浄させた。ヘパリン樹脂に付着されたタンパク質は4−6% β−meと1 M NaClを含むPBSTを流して溶出させた。
Heating & chilling処理精製方法はT−5精製方法でβ−meを処理を省略した精製方法である。HPV L1タンパク質精製のために細胞は破砕後、緩衝溶液(10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2)で4−6時間透析した。透析された破砕液を37−45℃で30分間処理して、氷に30分−3時間置いて冷却させた。加熱・冷却過程を経た破砕液の沈殿物を12000xgで10分間遠心分離して除去した後、緩衝液(10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2)で平衡化されたヘパリン樹脂に通過させた。この後、ヘパリン樹脂を0.42 M NaClが含まれたPBSTを樹脂体積の5倍に流して洗浄させた。洗浄の後、樹脂と結合したタンパク質は1 M NaClが含まれたPBSTを流して溶出させた。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いた精製は従来に公知された方法(参考文献20)を少し修正して行った。HPV L1発現酵母を上記と同一に破砕して用意した後、45% 硫酸アンモニウムが飽和されるようにしてタンパク質を沈澱させた。沈澱されたタンパク質をPBSTで再分散(resuspension)させた後、緩衝液に(10 mM sodium phosphate dibasic、0.65 M NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2)4時間の間、透析させた。透析された分画はサイズ排除クロマトグラフィーを1次クロマトグラフィーにして精製が行われた。上記に用意されたサンプルは0.65 M NaClが含まれたPBSTに平衡化されたSuperose-6 resin(1.5x32cm、GE Healthcare、USA)に通過させた(1次クロマトグラフィー)(参考文献36)。サイズ排除クロマトグラフィーの溶出パターンは280 nmの波長で測定して、Autochro−2000プログラム(Young Lin Instrument Co., South Korea)を用いて収集した。
硫酸アンモニウム沈澱を用いた精製は上記のT−5精製方法でβ−me処理後、heating & chilling過程をammonium sulfate沈澱に置換した方法である。クロマトグラフィー段階の前、硫酸アンモニウム沈澱と沈殿物の除去過程は従来に公知された方法により行った(参考文献22、24)。細胞破砕物タンパク質を45%硫酸アンモニウムで飽和させて沈澱させた後、沈澱不純物(removal of precipitated contaminants)を除去した過程を経た。クロマトグラフィーの前、上記に用意されたサンプルを緩衝液に(10 mM sodium phosphate dibasic、150 mM NaCl、1.7 mM EDTA、0.01% Tween 80 pH 7.2)4時間の間透析させた。ヘパリン樹脂を上記緩衝液と同一な緩衝液に平衡化させた後、透析されたサンプルを通過させた(1次クロマトグラフィー)。
タンパク質の濃度はウシ血清アルブミン(BSA; Pierce, USA)を標準物質にしてタンパク質定量キット(Bio-Rad Laboratories、USA)を使用して測定した。
SDS−PAGEはLaemmliの方法により行って(参考文献35)、ウェスタンブロッティングは公知された方法を用いて行った(参考文献26)。SDS−PAGEゲルの上に展開されたタンパク質は銀染色を実施して視覚化した。1次抗体としてウサギの抗−HPV 16 L1血清と、2次抗体としてヤギHRP−コンジュゲートされた抗−ウサギIgGポリクローナル抗体(HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG、Bethyl、USA)を用いてHPV L1タンパク質を検出した(参考文献26)。バンドの強度はNational Institute Health (NIH) open source software Image Jで測定して、公知された方法(参考文献25)により算出した。
精製したHPV 16 L1タンパク質をカーボン・コーティングされたグリッドに吸着させた後、リンタングステン酸(phosphotungstic acid)または酢酸ウラニル(uranyl acetate)で染色した。透過電子顕微鏡写真は150,000Xの最終倍率でTEM200CX(JEOL、Japan)を用いて撮影した(参考文献25)。
HPV VLPの動的光散乱(dynamic light scattering、DLS)分析は既に公知された方法により行った(参考文献26)。精製したHPV VLPは0.13 M NaClが含まれたPBSTを用いて0.13 mg/mlに希釈した後、DLS−700システム(Otsuka Electronics、Japan)またはELS−Z2 system(Otsuka Electronics、Japan)を用いて分析した。
HPV VLPに対する単クローン抗体の反応性は従来に公知された方法により行った(参考文献26)。96−ウェルELISA(enzyme−linked immunosorbent assay)プレートを精製したHPV VLPで400ngずつコーティングした。それぞれ異なる方法で精製されたHPV L1 VLPはコーティングの前、SDS−PAGE分析を通じてそれぞれHPV L1 VLPのL1タンパク質の量が定量的に同一することを確認した後コーティングされた。VLPがコーティングされたプレートは3%ウシ血清アルブミンが含まれたPBS−T20(0.05% Tween 20を含むPBS)で常温で2時間の間ブロッキングした。抗−HPV 16 L1単クローン抗体であるH16.V5とH16.E70を0.3%ウシ血清アルブミンが含まれたPBS−T20を用いて0.25μg/ml、0.12μg/ml、0.06μg/ml、0.03μg/ml、0.015μg/mlになるように希釈させた後、コーティングされたHPV VLPと37℃で90分間反応させた。PBS−Tで3回洗浄した後、HRP付着された抗-ハツカネズミIgG抗体(Bethyl、USA)を0.3%ウシ血清アルブミンが含まれた PBS−T20に1:5000比率で希釈して37℃で40分間プレートに反応させた。プレートをPBS−T20で5回洗浄の後、発色反応を行った。発色はo-phenylenediamine (Sigma, USA)を用いて行って、吸光度は492 nmで測定した。
HPV 16 L1の免疫原性の評価のために6週齢Balb/cマウスを用いた(Orientbio. South Korea)。HPV L1タンパク質をマウスに免疫するために上記で公知されたタンパク質定量法及びSDS−PAGE方法によりL1タンパク質の純度及び濃度を確認した。マウスは皮下注射を通じて免疫されて、2週間隔で4回免疫された。1回免疫のため1ngのL1タンパク質と200ug aluminium hydroxide(Sigma、USA)が皮下に投与された。1ngのタンパク質の量はT−5 HPV 16 L1 VLPの定量結果を基準にする。他の方法で精製されたHPV 16 L1タンパク質はT−5 HPV 16 L1を標準品にして定量された。3次、4次免疫10日後、マウス尻尾静脈を通じて血液を採取した。血清を回収するためにマウス血液を12000xgで10分間遠心分離した後、上澄液を取って、抗体価の測定及び中和抗体の活性評価の前まで−70℃に保管した。マウスの血液内の抗−HPV 16 L1 IgG抗体価と抗−HPV 16中和活性を公知された方法によりEnzyme-linked immnosorbent assay(ELISA)とpseudovirus-based neutralization assayを通じて測定した(参考文献26)。
グループ間の差の統計学的な有意性はtwo tailed Student’s t-testを用いて決定した。P<0.05を有意な差と見なした。
1.T−5精製:1次クロマトグラフィーによるL1タンパク質精製の結果
T−5精製過程は図1に示している。1次ヘパリンクロマトグラフィーのためのローディング試料は透析過程を経た場合と透析過程を経ていない場合に分けて用意した。透析過程を経た場合は細胞破砕後、細胞破砕緩衝液に透析を実施した後、還元剤(β−ME)を添加して、透析過程を経ていない場合は細胞破砕物に直接還元剤を添加した。その後、二つの試料は全て37−42℃に温度を上昇させて30−50分間放置した後、氷において0℃付近まで冷却させた。加熱・冷却過程で沈澱された不純物を除去した後ヘパリンクロマトグラフィーを実施した。図2と図3は透析過程を経た試料と透析過程を経ていない試料のヘパリンクロマトグラフィーの結果をSDS−PAGEで分析した結果である。二つの場合の試料、すべてL1タンパク質が高い純度で回収されたことが分かる。
1次ヘパリンクロマトグラフィーを通じて回収されたL1タンパク質溶出分画は2次ヘパリンクロマトグラフィー通じて追加精製した。図4aは2次ヘパリンクロマトグラフィーを行って精製した結果を示している。ヘパリン樹脂と結合したL1タンパク質はNaClの傾斜勾配の増加により溶出された(図4b)。SDS−PAGEの確認結果ヘパリン樹脂に結合されなく流れ出たL1タンパク質はFT(flow-through)分画で観察されなかった。ヘパリン樹脂に結合したL1タンパク質はNaClの傾斜勾配(linear gradient)の増加により溶出されることが確認された(分画11−17)。図4bは280nmの波長でヘパリンクロマトグラフィーの際に溶出される物質を検出した結果である。SDS−PAGE結果ではFT(flow-through)で溶出されるタンパク質が観察されていないが、280nmで測定するときにFT(flow-through)で相当な量の不純物が流れ出ることが確認された。したがって、2次ヘパリンクロマトグラフィーを通じてL1タンパク質の以外の不純物が除去されたことを確認した。
2次ヘパリンクロマトグラフィーから回収されたL1タンパク質(T−5 HPV 16 L1 VLP)の純度を従来に公知された方法(参考文献22、24)で精製されたL1タンパク質(T−1 HPV 16 L1 VLP)の純度と比較した。T−1精製方法は図1に示されていて、T−1精製方法のヘパリンクロマトグラフィーのSDS−PAGE分析結果は図5に示されている。図5でLSはカラムにローディングしたサンプル(loading sample)を意味する。T−1方法のヘパリンクロマトグラフィーでL1タンパク質はNaCl濃度を0.325 Mから2 Mまで傾斜勾配で上昇するように溶出させて、L1タンパク質は分画11から15番の間に溶出された。図6aはT−1とT−5方法で精製されたHPV 16 L1 VLPの純度を比較した結果である。VLPの純度分析のために独立された2回の精製実験を実施してパネルAとパネルBの結果で提示した。T−1 HPV 16 L1 VLPとT−5 HPV 16 L1 VLPはタンパク質定量の後、ウェル当たり500ng、250ng、125ng、62ngをローディングして、SDS−PAGEの展開の後、銀染色を通じて視覚化した。二つのVLPで55kDaのL1バンドが高い純度で観察された。しかし、T−5 HPV 16 VLPのL1バンドの強度がT−1 HPV 16 VLPのL1バンドの強度より強く現れた。図6bは図6aの2回実験結果の値を平均±標準偏差で表した結果である。結果算出のために500ngがローディングされたT−5 HPV 16 VLPのL1バンドの強度を100%にした。これらの結果によりT−5 HPV 16 L1 VLPの純度がT−1 HPV 16 L1 VLPの純度より高いことが確認できた。
図8はT−1 HPV 16 VLPとT−5 HPV 16 VLPを電子顕微鏡で分析した結果である。T−5 HPV 16 L1 VLPのサイズは40−65nmと確認されたが、T−1 HPV 16 L1 VLPのサイズは20−50nmと確認された。したがって、T−5方法で精製されたHPV 16 L1 VLPの形態はT−1方法で精製されたHPV 16 L1 VLPと形態と区分される特徴を有していた。自然的に発生するHPVビリオン(virion)のサイズは50−60nmであると知られている(参考文献29、30)。したがって、このような結果はT−5 HPV 16 VLPののサイズが本来HPVが有するサイズにより近いことを意味する。
動的光散乱分析はVLPが溶液内に存在する状態を調査する際に、ひろく使われている(参考文献31)。図9は精製したT−1 HPV 16 L1 VLPとT−5 HPV 16 L1 VLPをDLS−700システムを使用して分析した代表結果を見せている。図10はそれぞれHPV 16 L1 VLPをELS−Z2システムを用いて分析した代表結果を見せている。VLPのサイズは平均±標準偏差で示した。図9で、T−1 HPV 16 L1 VLPは29−438nmの間に分布するが、 T−5 HPV 16 L1 VLPは17−233nmの間に分布することになった。したがって、二つのVLPのサイズによる流体分布は相違するように示された。図10AはそれぞれVLPの動的光散乱のIntensity profileをみせる。図10BはそれぞれVLPの多分散指標(polydispersity index, P.I.)を示す。図10Aでも同じくT−1 HPV 16 L1 VLPはT−5 HPV 16 L1 VLPより広い範囲のサイズ分布を示すことと確認された。T−5 HPV 16 L1 VLPの多分散性(P.I.)はT−1 HPV 16 L1 VLPに比べてより低いことで確認された(図10B)。 結論的にT−5 HPV 16 L1 VLPはT−1 HPV 16 L1 VLPに比べて溶液内で均一な形態に存在することで確認された。
HPV 16 VLPに対する抗−HPV 16 L1単クローン抗体の反応性はHPV 16 L1 VLPの構造的な優秀性及び中和抗体の誘導能を評価するのに重要な目安として使用されている(参考文献26、32−34)。このような評価のために最も一般的に使われている抗体であるH16.V5とH16.E70を使用して、T−1 HPV16 L1 VLPとT−5 HPV16 L1 VLPの反応性を比較した(参考文献26)。二つの抗体に対する反応性の増加は 免疫原性の増加と密接な関連がある[26、36]。図11に示すように二つの抗体の反応性は、T−5 HPV 16 VLPがT−1 HPV 16 VLPよりはるかに優れていることを確認した。
T−1 HPV 16 L1 VLPのL1タンパク質の純度はT−5 HPV16 L1 VLPより低いと確認された(図6a、図6b)。二つのHPV 16 L1 VLPを同じ量で免疫するためにT−1 HPV16 L1 VLPの量をT−5 HPV16 L1 VLPの量に調整してSDS−PAGEで L1タンパク質の量を確認した(図7)。1回の免疫のために1 ngのHPV16 L1 VLPをaluminium hydroxideとともに投与した。 1 ngのタンパク質の量はT-5 HPV16 L1 VLPのタンパク質定量値(Bradfordタンパク質定量値)を基準とした。 T-1とT-5精製方法で精製されたHPV16 L1 VLPをマウス皮下で2週間隔4回投与した。 3次免疫と4次免疫を実施した後、血清内の抗-HPV16 L1 IgG力価を測定した結果を図12に示している。 3次免疫後、T-5 HPV16 L1 VLP免疫グループは450の中間値を現わしたが、T-1 HPV16 L1 VLP免疫グループは0の中間値(media value)を示した。 4次免疫後T-5 HPV16 L1 VLP免疫グループは4050の中間値を現わしたが、T-1 HPV16 L1 VLP免疫グループは300の中間値を現わした。 したがって、T-5 HPV16 L1 VLPはT-1 HPV16 L1 VLPより10倍以上高い抗-HPV16 L1 IgG抗体客力価を誘導すると確認された。
4次免疫後、マウス血清の内の抗-HPV16中和抗体活性を測定した(図13)。 T-5 HPV16 L1 VLPの免疫グループは、78%の中和活性(median value)を示したのに対し、T-1 HPV16 L1 VLPの免疫グループは、33%の中和活性を示した。これらの二つのグループの間に中和活性は有意な差を示した。
上記の結果から分かるように、一つ目のヘパリンクロマトグラフィーを通じて、高純度のL1タンパク質を得ることができる。還元剤の処理後、加熱・冷却過程がL1タンパク質の純度への影響を具体的に調査するために二つの種類の実験を行った。一つ目の実験では、何の処理もしていない条件(非処理精製方法、non-treatment)、還元剤のみを処理した条件(β-ME処理精製方法、β-ME treatment method)、および還元剤の処理後、加熱・冷却過程を経た条件(T-5の精製方法。β-ME+ heating&chilling)の間で、ヘパリンクロマトグラフィー後のL1タンパク質の純度を比較した。二つ目の実験では、何の処理もしていない条件(非処理精製方法、non-treatment)、加熱・冷却処理のみした条件(heating&chilling処理精製方法)、および還元剤の処理後、加熱・冷却過程を経た条件(T -5、β-ME+ heating&chilling)の間で、ヘパリンクロマトグラフィーの後のL1タンパク質の純度を比較した。
結論として、還元剤の処理だけした場合、または加熱と冷却だけの場合では、高い純度のL1タンパク質を得ることができなかった。L1タンパク質を高い純度に精製するためには、還元剤の処理後、加熱/冷却を経ることが不可欠であることを確認した。
硫酸アンモニウムの沈澱による精製過程は、図17に示されている。硫酸アンモニウムの沈澱による精製方法は、T-5の精製方法の中でβ-ME処理の後heating&chilling過程をammonium sulfate沈殿に置換したもので、図1のT-1の精製方法と区別される。 β-ME処理(β-ME method)による方法は、上記実施例に示されているものと同じである。 1次クロマトグラフィーの後カラムに結合したタンパク質の溶出分画を同じ体積(10、5、2.5μL)にローディングしてSDS-PAGEとウェスタンブロッティングで分析した(図18、図19)。
サイズ排除クロマトグラフィーによる精製(SEC)の過程は、図17に示されている。サイズ排除クロマトグラフィーの方法は、従来のに公知された方法に基づいた(参考文献20)。硫酸アンモニウムの沈澱による方法は、上記に記述した方法と同様である。サイズ排除クロマトグラフィーによる代表的な結果は、図20に示されている。サイズ排除クロマトグラフィー後、HPV16 L1タンパク質は、分画3 - 9で高い純度で溶出され、この分画を1次クロマトグラフィーによるL1タンパク質の純度の比較に使用した(図21)。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、硫酸アンモニウムの沈澱方法、β-ME処理の後、加熱、冷却(β-ME+ heating&chilling)する方法による1次クロマトグラフィー溶出分画内のL1タンパク質の純度を比較した(図21)。それぞれの方法の溶出分画を同一な体積(7 ml)に合わせた後、同一な体積のサンプル(0.35、0.17、0.08μL)をSDS-PAGEとウエスタンブロッティングで分析のためにローディングした。 1次クロマトグラフィーの溶出分画のうちβ-ME処理の後、加熱、冷却した条件のL1タンパク質の純度が最も高いことが確認された。
図23で、最終に精製された3種類のHPV16 L1 VLPをマウス皮下に1 ngずつ免疫した。免疫の前、図23Aに示すように、それぞれのVLPの濃度は、同じように合わせていた。マウス免疫の際に1 ngのVLPは、200μgのaluminium hydroxideと混合して投与された。免疫は、2週間隔に4回行われた。 4回免疫したマウス血清中の中和活性を測定した結果、サイズ排除クロマトグラフィー基盤の方法(SEC)で精製したHPV16 L1 VLPで免疫されたグループの場合、16%の中和活性を示し、硫酸アンモニウムの沈澱法で精製したHPV16 L1 VLPで免疫されたグループの場合、28%の中和活性を示した。一方、還元剤処理後、加熱、冷却過程を経る方法(T-5)で精製されたHPV16 L1 VLPで免疫されたグループの場合、50%中和活性を示した。結論としては、T-5の方法で精製されたHPV16 L1 VLPは、公知された方法により精製されたHPV16 L1 VLPよりも優れた免疫原性を示した。
図25と図26は、HPV16 L1 VLPとHPV18 L1 VLP精製において還元剤の処理の後、加熱温度による不純物タンパク質の除去効果を示す。細胞破砕物にβ-MEを処理した後、常温(starting)、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃の条件で15分間反応させた。以降、これらのサンプルを氷に1時間放置した後、12000xgで遠心分離して沈殿物を除去した。沈殿物が除去されたそれぞれのサンプルのタンパク質の濃度を測定した結果をパネルAに示した。それぞれのサンプルを同一体積でローディングしてSDS-PAGE上で分析した結果をパネルBに示した。それぞれのサンプルを同一体積でローディングした後、ウェスタンブロッティングでL1タンパク質の量を確認した結果をパネルCに示した。それぞれのサンプルのタンパク質の濃度を測定した後、同じ量のタンパク質をローディングしてウェスタンブロッティングでL1タンパク質の量を確認した結果をパネルDに示した。したがって、パネルDのウェスタンブロッティングの結果は、L1タンパク質の純度を示す。
図27は、還元剤の処理後、加熱のみにした条件(heating)、加熱後の冷却過程を経た条件(heating&chilling)を比較した結果を示す。図27でパネルAは、加熱のみにした条件、加熱後の冷却過程を経た条件のタンパク質濃度を測定結果を示す。パネルBとCは、45℃と50℃の加熱条件で加熱のみにした条件(heating)、加熱後の冷却過程を経た条件(heating and chilling)のウェスタンブロッティングの結果を示す。ウェスタンブロッティング分析のために、それぞれの条件のサンプルは、同一サイズ(5、2.5、1.25μL)にローディングした。パネルAに示すように、加熱のみにした条件よりも加熱後の冷却過程を経た条件で全体のタンパク質の量が減少したことが確認された。一方、L1タンパク質は、減少を見せないことが確認された(図27B、図27C)。これらの結果は、冷却過程を通じてL1タンパク質の純度が増加することを示す。
Pの精製
HPV16 L1とHPV18 L1を発現する酵母細胞の破砕物に還元剤を加えた後、60℃に加熱し、冷却過程を経てVLP精製を試みた。図30のパネルAは、1次クロマトグラフィーのSDS-PAGE分析の結果である。 LSとFTはloadingサンプルとflow-throughを示す。 ElutionはL1タンパク質が溶出された分画を意味する。パネルBは、2次クロマトグラフィー後、最終産物のSDS-PAGEにより分析結果である。それぞれのL1タンパク質は、高純度に精製された。パネルCは、最終的な精製産物を透過電子顕微鏡で分析した結果である。 60℃で加熱した後L1タンパク質を精製した結果、ウイルス様粒子の形状を形成することが確認された。
図31は、T-5の方法でHPV18 L1 VLPを精製の際、1次クロマトグラフィーのSDS-PAGEの結果を示す。 1次ヘパリンクロマトグラフィーの前に還元剤を細胞破砕物に加えた後、45℃に加熱し、氷で冷却した。図31は、1次ヘパリンクロマトグラフィーを通じて不純物タンパク質が効果的に除去されたことを示す。図32は、2次陽イオン交換クロマトグラフィーのSDS-PAGEの結果を示す。 2次クロマトグラフィーで不純物は0.6 Mと0.7 M NaClを含む分画に溶出され、L1タンパク質は、0.9 Mと1 M NaClを含む分画で溶出された。これにより、T-5の方法でHPV18 L1タンパク質を高純度に精製することができることを確認した。図33は、最終的な精製されたT-5 HPV18 L1 VLPの動的光散乱分析の結果を示す。
図34Aは、HPV58 L1 VLPを、T-5の方法で精製の際に1次クロマトグラフィーを通じて分離されたHPV58 L1分画をSDS-PAGEで分析した結果を示す。 1次クロマトグラフィーでHPV58 L1タンパク質は主要バンドで確認された。図34Bは、HPV58 L1 VLPを2次クロマトグラフィーを通じて分離した結果をSDS-PAGEで分析した結果である。 HPV58 L1タンパク質は、0.6 M、0.7 M、0.8 M、0.9 M、1 M NaClを含む分画の全般に溶出された。図35は、T-5の方法で最終的な精製されたHPV58 L1 VLPをSDS-PAGEとウェスタンブロッティングトで分析した結果を示す。 T-5の方法でHPV58 L1 VLPは、高純度に精製したことが確認された。
1.Woodman CB, Collins SI, Young LS (2007) The natural history of cervical HPV infection: unresolved issues. Nat Rev Cancer 7: 11-22.
2.National Cancer Institute (2007) Women's Health Report, Fiscal Years 2005-2006. NCI Women's Health Report FY2005-2006.
3.Burk RD, Chen ZG, Van Doorslaer K (2009) Human Papillomaviruses: Genetic Basis of Carcinogenicity. Public Health Genomics 12: 281-290.
4.de Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, Bernard HU, zur Hausen H (2004) Classification of papillomaviruses. Virology 324: 17-27.
5.Clifford G, Franceschi S, Diaz M, Munoz N, Villa LL (2006) Chapter 3: HPV type-distribution in women with and without cervical neoplastic diseases. Vaccine 24 Suppl 3: S3/26-34.
6.Conway MJ, Meyers C (2009) Replication and assembly of human papillomaviruses. J Dent Res 88: 307-317.
7.Kim SN, Jeong HS, Park SN, Kim H-J (2007) Purification and immunogenicity study of human papillomavirus type 16 L1 protein in Saccharomyces cerevisiae. J Virol Methods 139: 24-30.
8.Li M, Cripe TP, Estes PA, Lyon MK, Rose RC, et al. (1997) Expression of the human papillomavirus type 11 L1 capsid protein in Escherichia coli: characterization of protein domains involved in DNA binding and capsid assembly. J Virol 71: 2988-2995.
9.Hanumantha Rao N, Baji Babu P, Rajendra L, Sriraman R, Pang YY, et al. (2011) Expression of codon optimized major capsid protein (L1) of human papillomavirus type 16 and 18 in Pichia pastoris; purification and characterization of the virus-like particles. Vaccine 29: 7326-7334.
10.Aires KA, Cianciarullo AM, Carneiro SM, Villa LL, Boccardo E, et al. (2006) Production of human papillomavirus type 16 L1 virus-like particles by recombinant Lactobacillus casei cells. Appl Environ Microbiol 72: 745-752.
11.Baek JO, Seo JW, Kim IH, Kim CH (2011) Production and purification of human papillomavirus type 33 L1 virus-like particles from Spodoptera frugiperda 9 cells using two-step column chromatography. Protein Expr Purif 75: 211-217.
12.Maclean J, Koekemoer M, Olivier AJ, Stewart D, Hitzeroth, II, et al. (2007) Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. J Gen Virol 88: 1460-1469.
13.Garland SM, Smith JS (2010) Human papillomavirus vaccines: current status and future prospects. Drugs 70: 1079-1098.
14.Madrid-Marina V, Torres-Poveda K, Lopez-Toledo G, Garcia-Carranca A (2009) Advantages and disadvantages of current prophylactic vaccines against HPV. Arch Med Res 40: 471-477.
15.National Cancer Institute Human Papillomavirus (HPV) Vaccines,
http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/prevention/HPV-vaccine.
16.Mukhopadhyay P, Paul B (2009) Introducing HPV Vaccine in Developing Countries - Addressing the Challenge. Indian J Community Med 34: 370-371.
17.Walsh G (2010) Biopharmaceutical benchmarks 2010. Nat Biotechnol 28: 917-924.
18.Vicente T, Roldao A, Peixoto C, Carrondo MJ, Alves PM (2011) Large-scale production and purification of VLP-based vaccines. J Invertebr Pathol 107 Suppl: S42-48.
19.Hofmann KJ, Cook JC, Joyce JG, Brown DR, Schultz LD, et al. (1995) Sequence determination of human papillomavirus type 6a and assembly of virus-like particles in Saccharomyces cerevisiae. Virology 209: 506-518.
20.Park MA, Kim HJ, Kim H-J (2008) Optimum conditions for production and purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 59: 175-181.
21.Cook JC (2003) Process for purifying human papillomavirus virus-like particles. Merck & Co., Inc.
22.Kim HJ, Kim SY, Lim SJ, Kim JY, Lee SJ, et al. (2010) One-step chromatographic purification of human papillomavirus type 16 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 70: 68-74.
23.Kim HJ, Lee SJ, Kim H-J (2010) Optimizing the secondary structure of human papillomavirus type 16 L1 mRNA enhances L1 protein expression in Saccharomyces cerevisiae. J Biotechnol 150: 31-36.
24.Kim HJ, Lim SJ, Kim JY, Kim SY, Kim H-J (2009) A method for removing contaminating protein during purification of human papillomavirus type 18 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae. Arch Pharm Res 32: 1759-1766.
25.Kim HJ, Kwag HL, Jin Y, Kim H-J (2011) The composition of the carbon source and the time of cell harvest are critical determinants of the final yield of human papillomavirus type 16 L1 protein produced in Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr Purif 80: 52-60.
26.Kim HJ, Lim SJ, Kwag HL, Kim H-J (2012) The choice of resin-bound ligand affects the structure and immunogenicity of column-purified human papillomavirus type 16 virus-like particles. PLoS One 7: e35893.
27.Jin Y, Kim HJ, Yim GW, Tae Kim Y, Chang DY, et al. (2012) A single serum dilution enzyme-linked immunosorbent assay for determining anti-human papillomavirus (HPV) antibody titres in humans immunised with prophylactic HPV vaccines. J Pharm Biomed Anal 66: 352-355.
28.Han JE, Wui SR, Park SA, Lee NG, Kim KS, et al. (2012) Comparison of the immune responses to the CIA06-adjuvanted human papillomavirus L1 VLP vaccine with those against the licensed HPV vaccine Cervarix in mice. Vaccine 30: 4127-4134.
29.Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, Galloway DA (1994) Three-dimensional structure of vaccinia virus-produced human papillomavirus type 1 capsids. J Virol 68: 4503-4505.
30.Baker TS, Newcomb WW, Olson NH, Cowsert LM, Olson C, et al. (1991) Structures of bovine and human papillomaviruses. Analysis by cryoelectron microscopy and three-dimensional image reconstruction. Biophys J 60: 1445-1456.
31.Shi L, Sanyal G, Ni A, Luo Z, Doshna S, et al. (2005) Stabilization of human papillomavirus virus-like particles by non-ionic surfactants. J Pharm Sci 94: 1538-1551.
32.Ryding J, Dahlberg L, Wallen-Ohman M, Dillner J (2007) Deletion of a major neutralizing epitope of human papillomavirus type 16 virus-like particles. J Gen Virol 88: 792-802.
33.Culp TD, Spatz CM, Reed CA, Christensen ND (2007) Binding and neutralization efficiencies of monoclonal antibodies, Fab fragments, and scFv specific for L1 epitopes on the capsid of infectious HPV particles. Virology 361: 435-446.
34.White WI, Wilson SD, Palmer-Hill FJ, Woods RM, Ghim SJ, et al. (1999) Characterization of a major neutralizing epitope on human papillomavirus type 16 L1. J Virol 73: 4882-4889.
35.Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
36. Chang DY, Kim HJ, Kim H-J (2012) Effects of downstream processing on structural integrity and immunogenicity in the Manufacture
of papillomavirus type 16 L1 virus-like particles,
Biotechnol Bioprocess Eng 17: 755-763.
Claims (16)
- 次の段階を含むヒトパピローマウイルス(Human Papillomavirus、HPV)L1タンパク質の精製方法:
(a)HPVのL1タンパク質を発現する形質転換宿主細胞を培養した後、培養された宿主細胞を回収して破砕する段階;
(b)上記の宿主細胞の破砕物に還元剤を添加する段階;及び
(c)上記の還元剤が添加された宿主細胞の破砕物からクロマトグラフィーを行ってHPV L1タンパク質を精製する段階。 - 上記の(b)段階の後、上記の還元剤が添加された宿主細胞の破砕物を常温で維持する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 次の段階を含むヒトパピローマウイルス(Human Papillomavirus、HPV) L1タンパク質の精製方法:
(i)HPVのL1タンパク質を発現する形質転換宿主細胞を培養した後、培養された宿主細胞を回収して破砕する段階;
(ii)上記の宿主細胞の破砕物に還元剤を添加する段階;
(iii)上記の還元剤が添加された宿主細胞の破砕物を過熱した後冷却する段階;
及び
(iv)上記の加熱及び冷却された宿主細胞の破砕物からクロマトグラフィーを行ってHPV L1タンパク質を精製する段階。 - 上記のHPVはHPVタイプ6a、HPVタイプ6b、HPVタイプ11、HPVタイプ16、HPVタイプ18、HPVタイプ30、HPVタイプ31、HPVタイプ33、HPVタイプ35、HPVタイプ39、HPVタイプ41、HPVタイプ42、HPVタイプ43、HPVタイプ44、HPVタイプ45、HPVタイプ51、HPVタイプ52、HPVタイプ54、HPVタイプ55、HPVタイプ56、HPVタイプ58、HPVタイプ68及びHPVタイプ70からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1または請求項3に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記の宿主細胞はバクテリア、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞であることを特徴とする、請求項1または請求項3に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記の酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia Pastoris)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)であることを特徴とする、請求項5に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記の還元剤はβ−メルカプトエタノール(β−mercaptoethanol)、DTT(dithiothreitol)、2-メルカプトエチルアミン塩酸塩(2-mercaptoethylamine-HCl )、TCEP[tris(2-carboxyethyl)phophine]、システイン−HCI(cystein−HCI)からなる群より選択されることを特徴とする、請求項1または請求項3に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記の還元剤はβ−メルカプトエタノール(β−mercaptoethanol)またはDTT(dithiothreitol)であることを特徴とする、請求項1または請求項3に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記のβ−メルカプトエタノール(β−mercaptoethanol)は宿主細胞の破砕物での最終濃度が0.1重量%以上になるよう添加することを特徴とする、請求項8に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記のDTT(dithiothreitol)は宿主細胞の破砕物での最終濃度が2mM以上になるよう添加することを特徴とする、請求項8に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記の段階(iii)での加熱は常温(room temperature)超過の温度で過熱することを特徴とする、請求項3に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記の段階(iii)での常温超過の温度は25℃超過の温度であることを特徴とする、請求項11に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記の段階(iii)での常温超過の温度は25℃超過80℃以下の温度であることを特徴とする、請求項12に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記の段階(iii)での加熱は10分−72時間の間で行うことを特徴とする、請求項3に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記の段階(iii)での冷却は0℃−10℃の温度で冷却させることを特徴とする、請求項3に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
- 上記のクロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー及び親和クロマトグラフィー(affinity chromatography)であることを特徴とする、請求項1または請求項3に記載のHPV L1タンパク質の精製方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2012-0083472 | 2012-07-30 | ||
KR20120083472 | 2012-07-30 | ||
KR1020130085605A KR101559622B1 (ko) | 2012-07-30 | 2013-07-19 | 인유두종바이러스 바이러스 유사입자의 고효율 정제방법 |
KR10-2013-0085605 | 2013-07-19 | ||
PCT/KR2013/006823 WO2014021604A1 (ko) | 2012-07-30 | 2013-07-30 | 인유두종바이러스 바이러스 유사입자의 고효율 정제방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015524817A true JP2015524817A (ja) | 2015-08-27 |
JP6014763B2 JP6014763B2 (ja) | 2016-10-25 |
Family
ID=50266708
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015525348A Active JP6014763B2 (ja) | 2012-07-30 | 2013-07-30 | ヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子の高効率精製方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9994618B2 (ja) |
EP (1) | EP2881401B1 (ja) |
JP (1) | JP6014763B2 (ja) |
KR (1) | KR101559622B1 (ja) |
CN (1) | CN104507956B (ja) |
AU (1) | AU2013297306B2 (ja) |
BR (1) | BR112015002126B1 (ja) |
CA (1) | CA2880420C (ja) |
CL (1) | CL2015000037A1 (ja) |
MX (1) | MX361186B (ja) |
WO (1) | WO2014021604A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR112017004181A2 (pt) * | 2014-09-11 | 2017-12-05 | Cadila Healthcare Ltd | ?gene, vetor, célula hospedeira, partículas similares a vírus, vacina para vírus de papiloma humano, composição imunogênica, adjuvante, método para o preparo de uma vacina de papiloma humano, proteína de capsídeo principal e proteína hpv l1? |
RU2677336C2 (ru) * | 2014-12-26 | 2019-01-16 | Айджин, Инк. | Способ получения вирусоподобных частиц папилломавируса человека |
CN105176934B (zh) * | 2015-10-16 | 2018-09-18 | 西南大学柑桔研究所 | 柑桔黄化脉明病毒长期离体保存方法 |
CN109750050B (zh) * | 2017-11-07 | 2023-08-18 | 上海泽润生物科技有限公司 | 重组人乳头瘤病毒45亚型蛋白表达 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001515922A (ja) * | 1997-09-05 | 2001-09-25 | メディムーン・インコーポレイテッド | パピローマウイルス・ウイルス様粒子(vlp)の解集合/再集合のインビトロ方法 |
JP2002540167A (ja) * | 1999-03-26 | 2002-11-26 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | 分解再構築ウイルス様粒子を含むヒトパピローマウイルスワクチン |
WO2010147268A1 (ko) * | 2009-06-19 | 2010-12-23 | 아이진 주식회사 | 자궁경부암 백신 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7351533B2 (en) | 1997-09-05 | 2008-04-01 | Medimmune, Inc. | In vitro method for disassmbly/reassembly of papillomavirus virus-like particles (VLPs). Homogeneous VLP and cavsomere compositions produced by said methods: use thereof as vehicle for improved purification, and delivery of active agents |
BR9913026A (pt) | 1998-08-14 | 2001-09-25 | Merck & Co Inc | Processo de purificação de partìculas semelhantes a vìrus (vlps) de papilomavìrus recombinante, e, processo de preparação de um produto de vlp de papilomavìrus humano purificado adequado para uso em uma vacina para humano |
US6436402B1 (en) | 1999-10-15 | 2002-08-20 | Merck & Co., Inc. | Process for making human papillomavirus virus-like particles with improved properties |
DE60041889D1 (de) | 1999-12-09 | 2009-05-07 | Medimmune Inc | In-vitro-methode zur zerlegung und zum wiederzusammenfügen von papillomavirusartigen partikeln |
GB0206360D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
CN101153280B (zh) | 2006-09-29 | 2015-08-19 | 厦门大学 | 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 |
CN101139570A (zh) | 2007-04-16 | 2008-03-12 | 马润林 | 一种hpv l1蛋白原核表达的高密度发酵方法 |
EP2907821B1 (en) | 2007-05-29 | 2016-12-28 | Xiamen University | Method for producing a N-terminaly truncated L1 protein of human papillomavirus (HPV) |
KR100959145B1 (ko) | 2008-03-21 | 2010-05-25 | 중앙대학교 산학협력단 | 인유두종바이러스 바이러스 유사 입자의 생산 및 정제 방법 |
NZ590919A (en) | 2008-07-31 | 2012-10-26 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine against hpv |
KR101178056B1 (ko) | 2011-12-19 | 2012-08-28 | 아이진 주식회사 | 자궁경부암 백신 |
-
2013
- 2013-07-19 KR KR1020130085605A patent/KR101559622B1/ko active IP Right Grant
- 2013-07-30 EP EP13824788.7A patent/EP2881401B1/en active Active
- 2013-07-30 JP JP2015525348A patent/JP6014763B2/ja active Active
- 2013-07-30 US US14/418,004 patent/US9994618B2/en active Active
- 2013-07-30 AU AU2013297306A patent/AU2013297306B2/en active Active
- 2013-07-30 BR BR112015002126-3A patent/BR112015002126B1/pt active IP Right Grant
- 2013-07-30 WO PCT/KR2013/006823 patent/WO2014021604A1/ko active Application Filing
- 2013-07-30 CN CN201380040425.9A patent/CN104507956B/zh active Active
- 2013-07-30 MX MX2015001413A patent/MX361186B/es active IP Right Grant
- 2013-07-30 CA CA2880420A patent/CA2880420C/en active Active
-
2015
- 2015-01-08 CL CL2015000037A patent/CL2015000037A1/es unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001515922A (ja) * | 1997-09-05 | 2001-09-25 | メディムーン・インコーポレイテッド | パピローマウイルス・ウイルス様粒子(vlp)の解集合/再集合のインビトロ方法 |
JP2002540167A (ja) * | 1999-03-26 | 2002-11-26 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | 分解再構築ウイルス様粒子を含むヒトパピローマウイルスワクチン |
WO2010147268A1 (ko) * | 2009-06-19 | 2010-12-23 | 아이진 주식회사 | 자궁경부암 백신 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6010002797; ZHANG, W., et al.: Virology 243, 1998, pp.423-431 * |
JPN6016003000; YUAN, Y., et al.: Journal of Chromatography A 816, 1998, pp.21-28 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2880420C (en) | 2018-02-27 |
JP6014763B2 (ja) | 2016-10-25 |
EP2881401B1 (en) | 2018-04-25 |
AU2013297306B2 (en) | 2016-09-29 |
KR101559622B1 (ko) | 2015-10-13 |
US9994618B2 (en) | 2018-06-12 |
CA2880420A1 (en) | 2014-02-06 |
MX2015001413A (es) | 2015-11-18 |
MX361186B (es) | 2018-11-29 |
CN104507956A (zh) | 2015-04-08 |
CN104507956B (zh) | 2018-11-06 |
KR20140018794A (ko) | 2014-02-13 |
EP2881401A4 (en) | 2016-04-13 |
AU2013297306A1 (en) | 2015-02-05 |
CL2015000037A1 (es) | 2015-07-31 |
BR112015002126B1 (pt) | 2022-10-04 |
BR112015002126A2 (pt) | 2017-07-04 |
US20150266927A1 (en) | 2015-09-24 |
WO2014021604A1 (ko) | 2014-02-06 |
EP2881401A1 (en) | 2015-06-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2154147B1 (en) | A truncated l1 protein of human papillomavirus 16 | |
EP2716653B1 (en) | Truncated human papillomavirus type 33 protein l1 | |
RU2642287C2 (ru) | Химерная частица hpv | |
JP6014763B2 (ja) | ヒトパピローマウイルスのウイルス様粒子の高効率精製方法 | |
Pineo et al. | Immunogenic assessment of plant‐produced human papillomavirus type 16 L1/L2 chimaeras | |
Baek et al. | Production and purification of human papillomavirus type 33 L1 virus-like particles from Spodoptera frugiperda 9 cells using two-step column chromatography | |
US10513541B2 (en) | Mutant of L1 protein of human papillomavirus type 11 | |
Chen et al. | Human papillomavirus L1 protein expressed in Escherichia coli self-assembles into virus-like particles that are highly immunogenic | |
Fernández-San Millán et al. | Human papillomavirus-like particles vaccine efficiently produced in a non-fermentative system based on insect larva | |
US20080213293A1 (en) | Prevention and Treatment of Recurrent Respiratory Papillomatosis | |
JP2021526851A (ja) | ヒトパピローマウイルス39型のl1タンパク質の変異体 | |
US10125175B2 (en) | Method for enhancing immunogenicity of epitope peptide of HPV antigen, virus-like particle, and method for preparing HPV vaccine | |
Kwag et al. | The production and immunogenicity of human papillomavirus type 58 virus-like particles produced in Saccharomyces cerevisiae | |
CN107002085A (zh) | 具有优异免疫学特性的优异的人乳头瘤病毒抗原和含有其的疫苗 | |
EP2223933A1 (en) | Genes encoding major capsid protein l1 of human papilloma viruses | |
Kim et al. | Comparison of the size distributions and immunogenicity of human papillomavirus type 16 L1 virus-like particles produced in insect and yeast cells | |
US11213580B2 (en) | Mutant of L1 protein of human papillomavirus type 16 | |
Chang et al. | Effects of downstream processing on structural integrity and immunogenicity in the manufacture of papillomavirus type 16 L1 virus-like particles | |
Wang et al. | Stop codon mutagenesis for homogenous expression of human papillomavirus L1 protein in Escherichia coli | |
RU2546242C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 18 | |
RU2546243C1 (ru) | Рекомбинантная вакцина для профилактики папилломавирусной инфекции человека и способ ее получения | |
Kim et al. | A method for removing contaminating protein during purification of human papillomavirus type 18 L1 protein from Saccharomyces cerevisiae | |
RU2546241C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Hansenula polymorpha - ПРОДУЦЕНТ ГЛАВНОГО КАПСИДНОГО БЕЛКА L1 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА ТИПА 16 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150129 |
|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20150602 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20150603 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160202 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160502 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160913 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160926 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6014763 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |